Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. GS.TSKH. Trần Văn Sung

2. TS. Trần Văn Lộc

HÀ NỘI - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của GS.TSKH. Trần Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc. Các số

liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công

trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Võ Thị Quỳnh Như

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng như

đồng nghiệp, bạn bè và người thân.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến GS. TSKH. Trần

Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận

tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án.

Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ –

Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương

trình đào tạo.

Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường THPT Gio Linh cùng Ban lãnh

đạo Viện Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng

nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án.

Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản của

Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104.01-2012.33 do TS. Trần Văn Lộc làm chủ nhiệm.

Hà nội, ngày tháng năm 2017

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Võ Thị Quỳnh Như

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. v

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... x

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 2

1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và

hoạt tính sinh học của chúng ................................................................................... 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian 2

1.1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 2

1.1.1.2. Phân bố và sinh thái ............................................................................... 2

1.1.1.3. Tác dụng, công dụng ............................................................................. 2

1.1.2. Các thành phần hóa học của cây rau má..................................................... 3

1.1.2.1. Các hợp chất terpenoid .......................................................................... 3

1.1.2.2. Các hợp chất polyphenol ....................................................................... 8

1.1.2.3. Các lớp chất khác .................................................................................. 9

1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban ....................................................................... 9

1.3. Hoạt tính sinh học của cây rau má ................................................................. 15

1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn .............................................................................. 15

1.3.2. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm ........................................................... 15

1.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa ........................................................................... 16

1.3.4. Tác dụng bảo vệ thần kinh ........................................................................ 16

1.4.5. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch .......................................................... 16

1.4. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất ........... 17

1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thƣ .............................................. 17

1.4.2. Hoạt tính làm lành vết thƣơng .................................................................. 19

1.4.3. Hoạt tính chống trầm cảm ........................................................................ 20

1.4.4. Hoạt tính bảo vệ gan ................................................................................. 20

1.4.5. Các hoạt tính khác .................................................................................... 20

1.5. Một số chuyển hóa của asiatic acid ................................................................ 21

1.5.1. Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid............................................. 21

1.5.2. Chuyển hóa bằng phƣơng pháp sinh học .................................................. 29

1.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ................................................................... 30

Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................... 34

2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất và phân lập chất ................................................ 34

2.2. Các phƣơng pháp phổ .................................................................................... 34

2.3. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ ................................................................ 34

2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro ........................................ 35

2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm ............... 35

2.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử) .............................. 35

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 37

3.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 37

3.1.1. Mẫu cây rau má ........................................................................................ 37

3.1.2. Dung môi, hóa chất ................................................................................... 37

3.2. Phân lập chất .................................................................................................. 37

3.2.1. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ

Chí Minh ............................................................................................................. 37

3.2.1.1. Phân lập các chất ................................................................................. 37

3.2.1.2. Các số liệu phổ của các chất phân lập đƣợc ........................................ 38

3.2.2. Nghiên cứu định lƣợng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ .................................... 40

3.2.2.1. Xác định hàm lƣợng asiatic acid bằng phƣơng pháp HPLC ............... 40

3.2.2.2. Xác định hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 42

3.2.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid ........................................................................... 42

3.2.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ...................................................................... 42

3.2.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn ............................................................... 43

3.2.3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết ............................................................ 44

3.2.4. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất ........................................ 44

3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid .................................. 47

3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid .................................................... 47

3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ............................................ 63

3.4. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc .................. 72

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro .............................................................. 72

3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) ....................... 73

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 75

4.1. Phân lập chất .................................................................................................. 75

4.1.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh (RMHCM) ................................................................................................. 75

4.1.2.1. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong một số mẫu rau má bằng phƣơng pháp HPLC ................................................................................. 78

4.1.2.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má bằng

phƣơng pháp CC ............................................................................................... 79

4.2. Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má........................... 80

4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid .............................. 80

4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid ..................................................................... 80

4.3.1.1. Chuyển hóa nhóm COOH (C-28) ........................................................ 80

4.3.1.2. Chuyển hóa vòng A của asiatic acid ................................................... 98

4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid .......................................................... 103

4.4. Thử hoạt tính sinh học .................................................................................. 113

4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ............................................................ 113

4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của asiatic acid . 113

4.4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của madecassic acid ........................................................................................................................ 115

4.5.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) ..................... 118

iii

4.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử) ....................................................................... 119

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 121

5.1. Kết luận ........................................................................................................ 121

5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 122

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................... 123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................. 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 125

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Column Chromatography

Thin Layer Chromatography Sắc ký cột thƣờng Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký bản mỏng

13C-NMR

Các phƣơng pháp sắc ký CC HPLC High Performance Liquid Chromatography TLC Các phƣơng pháp phổ 1H-NMR

GC-MS

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Gas Chromatography-Mass Spectrometry Correlation Spectroscopy COSY

DEPT Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 Sắc ký khí ghép nối khối phổ Phổ tƣơng tác hai chiều 1H-1H Phổ DEPT

ESI-MS

HMBC

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray

HSQC

IR J (Hz) Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Infrared Spectroscopy

hzhz

NOESY Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua một liên kết Phổ hồng ngoại Hằng số tƣơng tác tính bằng Hz Phổ NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Ultraviolet Spectroscopy (ppm = part per million)

Phổ tử ngoại Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu double triplet broad

UV δ (ppm) s d t singlet doublet triplet q quint dd quartet quintet double doublet dt br m multiplet

Các dòng tế bào HeLa HepG2 Ung thƣ gan

Ung thƣ biểu mô

Human cervical adenocarcinoma Ung thƣ cổ tử cung Human hepatocellular carcinoma Human epidermoid carcinoma KB MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thƣ vú MDA-MB-231 Metastatic human breast cancer Ung thƣ vú Lu LTB SIRT1 17β-HSD1 Ung thƣ phổi

Human lung carcinoma Lymphotoxin-beta Enzyme deacetylase sirtuin-1 Enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1

Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% Melting point Asiatic acid Madecassic acid Rau má Sơn Tây Rau má Nam Định

Điểm chảy

4-Dimethylaminopyridine Pyridinium chlorochromate Pyridinium dichromate Công thức phân tử Triethanolamine Dichloromethane Malon dialdehyde n-Butanol Ac Acet

Phenyl Ethyl

Các ký hiệu viết tắt khác IC50 Mp AA MA RMST RMND RMHCM Rau má Hồ Chí Minh DMAP PCC PDC CTPT TEA DCM MDA n- BuOH CHCl3 Chloroform DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethyl acetate MeOH Methanol TBAI TMS AIF tetrabutylammonium iodide Tetramethylsilane apoptosis-inducing factor Bz Benzoyl OMe Methoxy Ph Et Me Methyl THF Tetrahydrofuran TPA 12-O-

tetradecanoylphorbol- 13-acetate

Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên

bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác.

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban ................................................... 3

Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má ................................ 5

Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má ............................... 5

Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ cây rau má .......................................................................................................................... 6

Hình 1. 5. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane đƣợc phân lập từ

cây rau má ................................................................................................................... 7

Hình 1. 6. Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má ......................... 8

Hình 1. 7. Các thành phần hóa học khác đƣợc phân lập từ cây rau má ...................... 9

Hình 1. 8. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Yoshida M phân lập từ cây

rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của chúng ................. 12

Hình 1. 9. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Rumalla phân lập từ cây rau

má trồng tại Mỹ ......................................................................................................... 13

Hình 1. 10. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Weng phân lập từ cây rau

má trồng tai Trung Quốc ........................................................................................... 13

Hình 1. 11. Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má ............................ 17

Hình 1. 12. Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam ............................................. 30

Hình 3. 1. Đƣờng chuẩn asiatic acid ......................................................................... 41

Hình 4. 1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12- ene-28-oic acid (145) ................................................................................................ 83

Hình 4. 2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (147) .................................................................. 84

Hình 4. 3. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol (150) ........................................................................ 86

Hình 4. 4. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-methylhydrazine (154) ............................................................... 87

vii

Hình 4. 5. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-propyl acetate (157) ................................................................ 89

Hình 4. 6. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylacetamide (158) ............................................................ 90

Hình 4. 7. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylacetamide (159) ............................................................. 92

Hình 4. 8. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-trihydroxy-urs- 12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (162) ......................................................................... 94

Hình 4. 9. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-trihydroxy-urs- 12-ene-17-nitrile (170) .............................................................................................. 97

Hình 4. 10. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-hydroxy-3β,23- isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (171) ................................................ 100

Hình 4. 11. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α-succinoyl-3β,23- isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (172) ................................................ 101

Hình 4. 12. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-acetoxy-3β,23- dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (174) ................................................................. 103

Hình 4. 13. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 6β-hydroxy-2α,3β,23- triacetoxy-urs-12-ene-28-amide (180) .................................................................... 106

Hình 4. 14. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(6β-hydroxy- 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (181) ............................... 107

Hình 4. 15. Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO) của hợp chất N,N-(2α,3β,6β,23- tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol (186) ...................................................... 110

viii

Hình 4. 16. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,6β,23- tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine (190) ........................................... 112

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG

Bảng 3. 1. Giá trị HPLC của asiatic acid .................................................................. 41

Bảng 3. 2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết. ........................................... 43

Bảng 3. 3. Ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic acid và

madecassic acid ......................................................................................................... 43

Bảng 3. 4. Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô ................................................ 44

Bảng 4. 1. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phƣơng pháp HPLC ............................................................................ 79

Bảng 4. 2. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má

xác định theo phƣơng pháp CC ................................................................................. 79

Bảng 4. 3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất

tổng hợp của asiatic acid ......................................................................................... 114

Bảng 4. 4. Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid ........................ 117

Bảng 4. 5. Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lô thí nghiệm..... 118

Bảng 4. 6. Khối lƣợng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lô thí nghiệm ..................... 118

Bảng 4. 7. Hàm lƣợng MDA trong gan chuột thí nghiệm ...................................... 119

Bảng 4. 8. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo

phƣơng pháp docking phân tử của asiatic acid ....................................................... 119

Bảng 4. 9. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo

phƣơng pháp docking phân tử của madecassic acid ............................................... 120

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1. 1. Chuyển hóa các dẫn xuất của AA tại vị trí C-2 ...................................... 22

Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp dẫn xuất C2- oxo của asiatic acid ........................................... 22

Sơ đồ 1. 3. Chuyển hóa ở C2 (khử oxy) của asiatic acid .......................................... 23

Sơ đồ 1. 4. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23, C-11 và C-28 của asiatic acid ....... 23

Sơ đồ 1. 5. Tổng hợp dẫn xuất 3-oxo-23-andehyde và các dẫn xuất ........................ 24

Sơ đồ 1. 6. Tổng hợp dẫn xuất C2-benzyloxy, C3,23-diacetoxy của acid methyl

ester. .......................................................................................................................... 24

Sơ đồ 1. 7. Tổng hợp C11-keto asiatic acid. ............................................................. 25

Sơ đồ 1. 8. Tổng hợp C28-hydroxymethyl asiatic acid. ........................................... 26

Sơ đồ 1. 9. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23 của asiatic acid ............................... 26

Sơ đồ 1. 10. Chuyển hóa ở vị trí C2,3,28 của asiatic acid ........................................ 27

Sơ đồ 1. 11. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amino axit từ asiatic acid ........................ 28

Sơ đồ 1. 12. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amide từ asiatic acid ............................... 29

Sơ đồ 1. 13. Tổng hợp một số dẫn xuất của AA bằng con đƣờng sinh học .............. 30

Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban] thu hái

tại Thành phố Hồ Chí Minh ...................................................................................... 38

Sơ đồ 4. 1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (1) ............................................. 81

Sơ đồ 4. 2. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (2) ............................................. 98

Sơ đồ 4. 3. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ........................................ 103

MỞ ĐẦU

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú đã và đang đƣợc sử

dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dƣợc, nông nghiệp và đời sống. Có nhiều loại thuốc hoàn toàn phải dựa vào thiên nhiên để chữa các bệnh thông thƣờng cũng nhƣ

các bệnh hiểm nghèo. Một trong những hƣớng nghiên cứu quan trọng hiện nay

đƣợc các nhà khoa học nƣớc ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất

thiên nhiên ban đầu ngƣời ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ƣu việt hơn những hợp chất ban

đầu. Cách tiếp cận này có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp hơn với cơ thể sống và thân

thiện môi trƣờng hơn.

Trong số các hợp chất thiên nhiên, các triterpene có khung ursane nhƣ nhóm

ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dƣợc lý học. Trong đó hoạt

tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng nhƣ với tế bào bạch cầu

lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức chế phát triển khối u trên da chuột đã đƣợc khẳng định [1].

Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt Nam, chúng tôi

thấy cây rau má, có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán

(Apiaceae), có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane nhƣ: asiatic acid,

asiaticoside, madecassic acid, madecassoside… với hàm lƣợng khá cao có hoạt tính

độc với tế bào ung thƣ [2]. Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên

cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tôi đặt mục đích sử dụng các

triterpene tách đƣợc từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất

mới và thăm dò hoạt tính kháng ung thƣ của các chất thu đƣợc.

Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách,

chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)”. Đề tài đƣợc thực hiện với ba mục tiêu:

1. Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây

rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam.

2. Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập

đƣợc từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng.

3. Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp đƣợc để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tƣơng quan cấu trúc – hoạt tính của chúng.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây

rau má và hoạt tính sinh học của chúng

1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân

gian

- Tên tiếng việt: cây rau má

- Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb., thuộc họ hoa tán (Apiaceae)

- Tên khác: Tích huyết thảo, Liên tiền thảo.

1.1.1.1. Đặc điểm thực vật

Cây rau má là loại cây thảo nhỏ, cao 7-10 cm, thân mảnh, mọc bò, hơi có

lông khi còn non, bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhƣng thƣờng tụ họp 2-5 cái ở

một mấu, phiến lá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo, cuống lá mảnh,

dài 3-5 cm, có khi đến 7-8 cm. Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2-5

cái ở kẽ lá, mỗi tán mang 1-5 hoa (thƣờng là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa

không có cuống, tổng bao có 2-3 mảnh hình trái xoan, nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn

hình mắt chim, bầu hình cầu. Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7-9 cạnh lồi, nhẵn

hoặc có lông, vỏ có vân mạng. Mùa hoa quả: tháng 4-6 [1-3].

1.1.1.2. Phân bố và sinh thái

Rau má thƣờng mọc ở những nơi ẩm ƣớt nhƣ thung lũng, bờ mƣơng vùng

nhiệt đới nhƣ: Việt Nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấn Độ,

Pakistan, và Madagascar [4,5,6].

Ở nƣớc ta, rau má đƣợc trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh duyên hải

miền Trung, nơi khí hậu có độ ẩm cao và có loại đất sét pha cát rất thích hợp cho

loại cây này phát triển.

1.1.1.3. Tác dụng, công dụng

Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng

dƣỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu, thƣờng đƣợc dùng để làm

thuốc bổ dƣỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hƣ, bạch đới, mụn nhọt, rôm

sảy. Dân gian thƣờng dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ đậu, sởi, sốt da

vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm đƣờng tiết niệu, đái dắt, đái buốt,

còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hƣ, bạch đới, giải độc lá ngón [1,2]. 2

Rau má đƣợc dùng ăn sống hoặc ép lấy nƣớc pha đƣờng uống cho mát. Có

thể giã lấy nƣớc uống hoặc sắc uống làm thuốc giải nhiệt hoặc giải độc, lợi tiểu,

cầm máu, trị kiết lỵ, táo bón. Dùng ngoài đắp chữa các vết thƣơng do ngã gãy

xƣơng, bong gân và làm tan mụn nhọt. Rau má (300g) và phèn chua (3g) giã nhỏ,

hoà nƣớc dừa, vắt lấy nƣớc uống trị kinh nguyệt không đều, đau lƣng, tức ngực, đau

bụng máu, khô da, nhức đầu, nóng lạnh, bạch đới. Ngƣời ta đã chế rau má thành

những dạng kem để chữa các vết thƣơng phần mềm cho mau liền da, liền sẹo.

Mặc dù cây rau má đã đƣợc biết đến từ rất lâu, nhƣng hiện nay vẫn có rất

nhiều tài liệu, công trình mới công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học

của nó.

Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban

1.1.2. Các thành phần hóa học của cây rau má

Cây rau má là một trong những cây thảo dƣợc rất phổ biến ở các nƣớc Đông

Á, Đông Nam Á và đã đƣợc ứng dụng trong các bài thuốc dân gian ở nhiều nƣớc để

điều trị bệnh. Có rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm làm sáng tỏ các

thành phần hóa học và mối liên quan với ứng dụng của chúng. Các nghiên cứu đã

xác định đƣợc trong cây rau má có các thành phần hóa học rất phong phú về cấu

trúc cũng nhƣ về tác dụng sinh học.

1.1.2.1. Các hợp chất terpenoid

Các hợp chất terpenoid đƣợc cho là có vai trò chính quyết định ứng dụng của

cây rau má. Một số thành phần chính của lớp chất này nhƣ: monoterpene,

sesquiterpene, triterpene ở dạng tự do hoặc dạng glycoside.

Monoterpenoid, sesquiterpenoid

Ở Nam Phi cây rau má đƣợc dùng để chữa nhiều bệnh. Tinh dầu của cây rau

má Nam Phi có chứa 11 hợp chất monoterpene hydrocarbon (chiếm 20,20% tinh

dầu), 9 hợp chất monoterpene chứa oxy (chiếm 5,46%), 14 hợp chất sesquiterpene

hydrocarbon (68,80%), 5 hợp chất sesquiterpene chứa oxeny (3,90%), một số hợp

chất sesquiterpene chứa lƣu huỳnh (0,76%). Trong số các hợp chất chính của tinh

dầu rau má thì: α-humulene chiếm 21,60%, β-caryophyllene chiếm 19,08%, bicyclo

germacrene chiếm 11,22%, germacrene B chiếm 6,29% và myrcene chiếm 6,55%.

Tinh dầu rau má Nam Phi có hoạt tính kháng khuẩn rộng đối với vi khuẩn Gram-

dƣơng nhƣ Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và vi khuẩn Gram âm nhƣ

Escherichia coli, Pseudoneonas aeruginosa, Shigella sonnei [7]. Theo tài liệu tham

khảo [4] thì hàm lƣợng tinh dầu trong rau má là xấp xỉ 0,1% tính theo khối lƣợng

khô. Thành phần monoterpene chính gồm: α-pinene, β-pinene, myrcene, γ-

terpinene, borneol, bornyl acetate, các sesquiterpene chính gồm: α-copaene, β-

elemene, β-caryophyllene, trans-β-farnesene, germacrene và bicycloelemene.

Các monoterpene tìm thấy trong thành phần tinh dầu rau má tồn tại dƣới

dạng mạch hở, đơn vòng, hoặc hai vòng (bicyclic). Các sesquiterpene cũng có cấu

trúc mạch hở, đơn vòng, hai vòng (bicyclic) và ba vòng (tricyclic). Nhóm tác giả

Qin L.P., Ding R.X. Zhang W.D. và cộng sự đã dùng phƣơng pháp GC - MS để

nghiên cứu thành phần tinh dầu cây rau má, qua đó đã xác định 45 chất có trong

tinh dầu rau má. Caryophyllene, farnesol và elemene là thành phần chính của tinh

dầu rau má [8]. Từ tinh dầu cây rau má sinh trƣởng ở Nam Phi, nhóm tác giả này đã

tìm 11 monoterpenoid, 9 monoterpenoid chứa oxy, 14 sesquiterpenoid, 5

sesquiterpenoid chứa oxy, và 1 sesquiterpenoid sulfid. α-humulen, β-caryophyllene

và bicyclo-germacrene là các chất chính trong tinh dầu cây này [9].

Dƣới đây là một số hợp chất monoterpenoid và sesquiterpenoid thƣờng gặp

trong tinh dầu rau má (Hình 1.2, và 1.3).

Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má

Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má

Triterpenoid

Triterpenoid đƣợc xác định là thành phần quan trọng nhất của cây rau má,

quyết định sự ứng dụng của cây thuốc này trong dân gian. Chất lƣợng của cây rau má

đƣợc đánh giá bởi hàm lƣợng của các triterpenoid có trong cây. Các triterpenoid đƣợc

xác định là các pentacyclic triterpenoid acid dạng tự do và dạng glycoside. Lớp chất

triterpenoid trong rau má chủ yếu có các khung ursane hoặc khung oleanane nhƣ:

asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid, madecassoside, brahmoside, brahmic acid,

brahminoside, thankuniside, isothankuniside, betulinic acid [9,10]

Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ

cây rau má

Hình 1. 5. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane đƣợc phân

lập từ cây rau má

Theo Dƣợc điển Châu Âu, về dƣợc liệu rau má thì phần trên mặt đất sấy khô

của cây rau má phải chứa không dƣới 6,0% triterpenoid tổng số (bao gồm

triterpenoid tự do và triterpenoid glucoside) tính theo asiaticoside (C48H78O19,

M=958) [11]. Theo tài liệu tham khảo [4] thì triterpene saponin trong rau má chiếm

từ 1-8%, trong đó có thành phần chính là asiaticoside, madecassoside, các thành

phần phụ bao gồm centelloside, bramoside, braminoside và centellasaponine B,C,D.

Hình 1.4 và Hình 1.5 trình bày cấu trúc của một số triterpene và triterpene saponin

đƣợc phân lập từ cây rau má.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má cho thấy loài cây này

chứa các thành phần phong phú và phức tạp. Thành phần hóa học của loài Centella

asiatica ở các địa điểm, châu lục khác nhau đều cho thấy triterpenoid là thành phần

chủ đạo. Aziz và cộng sự đã công bố một bài tổng quan về thành phần hóa học của

Centella asiatica trong khoảng thời gian 50 năm trở lại đây [10].

Brinkhaus và cộng sự đã tóm tắt các công thức hóa học của cây rau má trƣớc

năm 2000 [12]. Shukla và cộng sự đã tách đƣợc triterpenoid khung ursane mới từ

cây rau má [13]. Sau đó, Matsuda và cộng sự đã phân lập đƣợc một olean-13-ene

triterpenoid mới, centellasapogenol A,và oligoglycoside từ cây rau má trồng ở Việt

Nam [14,15]. Từ dịch chiết n-BuOH của cây rau má, Jiang và cộng sự đã tách đƣợc

4 triterpenoid glycoside mới là asiaticoside C, D, E, F [16].

Từ cây rau má Centella asiatica (Linn.) Urb., ở Srilanka, nhóm tác giả ngƣời

Nhật (Hisashi Matsuda - Trƣờng đại học Dƣợc, Kyoto-Nhật Bản) đã phân lập đƣợc

8 triterpene glycoside là: centellasaponin A (26), centellasaponin B (13),

centellasaponin C (15), centellasaponin D (31), madecassoside (14), asiaticoside

(3), asiaticoside B (22) và sceffoleoside (5) [13].

Wan-Joo-Kim và các cộng sự - Trƣờng đại học Seoun, Hàn Quốc đã phân

lập đƣợc 4 triterpenoid từ cây rau má của Indonesia là: madecassoside (14),

asiaticoside, asiatic acid (1) và madecassic acid (10), với hàm lƣợng khá cao [17].

Từ cây rau má Yu Q.L. và cộng sự đã phân lập đƣợc một hợp chất mới là 2α,3β-

20,23-tetrahydroxy-urs-12-en-28-oic acid (24) [18].

Năm 2007, nhóm này còn phân lập đƣợc docosyl ferulat, bayogenin,

3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid (33), 3β,6β,23-trihydroxy-urs-12-en-

28-oic acid (24), D-gulonic acid (47). Đây là những chất lần đầu tiên đƣợc tìm thấy

ở cây rau má [19].

Trong một nghiên cứu khác, Y. Quan Lin còn phân lập thêm đƣợc một

triterpene mới là 2α,3β,23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic acid (20) và một saponin

D-glucopyranosyl-(1→6)-O- β -D-glucopyranosyl ester] (21) [20].

mới là dẫn xuất ester của chất 16 - [17: 28-O- β -L-rhamnopyranosyl (1→4)-O- β -

1.1.2.2. Các hợp chất polyphenol

Các nghiên cứu của nhóm tác giả Zainol cho thấy cây rau má cũng chứa các hợp

chất nhóm phenolic nhƣ: quercetin và kaempferol, catechin, rutin và naringin [21].

Các phenolic acid

Một số hợp chất thuộc nhóm phenolic acid trong cây rau má đã đƣợc xác

định nhƣ tannin, phlobatannin, castillicetin, isochlorogenic acid, 3,5-di-O-caffeoyl

quinic acid, 1,5-di-O-caffeoyl quinic acid, 3,4-di-O-caffeoyl quinic acid, 4,5-di-O-

caffeoyl quinic acid, rosmarinic acid, chlorogenic acid, isochlorogenic acid [10].

Các hợp chất flavonoid

Lớp chất flavon đã đƣợc xác định có trong cây rau má ở cả dạng tự do hoặc

gắn kết với các gốc đƣờng qua nhóm chức hydroxyl nhƣ: quercetin-3-O-β-D-

D-glucoside [10].

glucuronid, kaempferol, quercetin, kaempferol-3-O-β-D-glucoside, quercetin-3-O-β-

Hình 1. 6. Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má 8

1.1.2.3. Các lớp chất khác

Ngoài các lớp chất chính đã đƣợc trình bày ở trên, trong cây rau má còn có

các hợp chất dạng polysaccharide, hợp chất polyacetylen (45) [22] olefin, acid béo,

alkaloid, sterol, carotenoid, chlorophyl, pectin, một số khoáng chất nhƣ: phospho,

kali, canxi, magie, mangan, sắt, kẽm, natri, đồng, các amino acid nhƣ: alanin,

prolin, tyrosin, valin, methionin, cystin, isoleucin, leucin, phenylalanin, lysine.

Hình 1. 7. Các thành phần hóa học khác đƣợc phân lập từ cây rau má

1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene

glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban

Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má ngƣời ta thƣờng quan tâm

chủ yếu đến các triterpenoid. Rất nhiều triterpene pentacyclic cũng nhƣ glycoside

của chúng đã đƣợc phân lập từ cây rau má Centella asiatica [23,24], trong đó asiatic

acid (1) và asiaticoside (3) cũng nhƣ madecassic acid (10) và madecassoside

(braminoside) (14) là các triterpene và glycoside chính.

Công dụng chữa bệnh phong của cây rau má đã thu hút sự quan tâm của các

nhà hóa học nhằm làm sáng tỏ vai trò thành phần chính có trong cây. Từ những năm

cuối 1940 và đầu 1950 các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu phân lập và xác định

đƣợc cấu trúc hóa học của asiaticoside cũng nhƣ aglycone của nó [25,26,27,28,29].

Những năm 1967-1969, hai nhóm nghiên cứu của Boiteau và Pinhas ở Pháp

đã công bố một số công trình phân lập và xác định cấu trúc của madecassoside (14)

cùng các madecassic acid (10) và madasiatic acid (17) từ cây rau má thu ở

Madagascar [30,31,32].

Năm 1989, Sahu đã phân lập đƣợc từ rau má Ấn Độ 2 triterpenoid

trisaccharid là asiaticoside A (3) và asiaticoside B (22) [33]. Cấu trúc của

asiaticoside A đƣợc xác định là [O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)]-O-β-D-glucopyranososyl ester của 2α,3β,6α,23-

tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oic acid. Cấu trúc của asiaticoside B đƣợc xác định là

[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-O-β-D-

glucopyranososyl ester của 2α,3β,6β,23-tetrahydroxyolean-12-ene-28-oic acid.

Asiaticoside B đƣợc xác định là hợp chất mới, còn asiaticoside A chính là hợp chất

madecassoside đã biết từ 1969 [10].

Năm 2001 nhóm tác giả Hisashi Matsuda (Trƣờng đại học Dƣợc, Kyoto-

Nhật Bản) từ dịch chiết EtOAc rau má trồng tại Việt Nam, qua sắc ký cột silica gel

và HPLC đã phân lập hợp chất mới khung olean-13-ene là: centellasapogenol A

(32) và các oligoglycoside của chúng centellasaponin A (26), madecassoside (14),

asiaticoside (3). Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã tách đƣợc một số triterpene đã biết

là madecassic acid (10), asiatic acid (1), 2α,3β,23-trihydroxyolean-12-en-28-oic

acid (34) [14].

Cũng trong năm 2001 Hisashi Matsuda đã phân lập đƣợc từ cao chiết nƣớc

cây rau má Sri Lanka một số triterpene oligoglycoside khung ursane và oleanane là

centellasaponin B (13), centellasaponin C (15) và centellasaponin D (31). Cấu trúc

của centellasaponin B đƣợc xác định là madecassic acid 28-O-β-D-

glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid. Cấu trúc của centellasaponin C đƣợc

xác định là madasiatic acid 28-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-β-D-

glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid và cấu trúc của centellasaponin D đƣợc

xác định là 3β,6β,23-trihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid 28-O-α-L-

rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid. Ngoài ra

các tác giả còn phân lập đƣợc các triterpene và triterpene oligoglycoside:

madecassoside (14), asiaticoside (3), asiaticoside B (22), scheffoleoside A (26),

madecassic acid (10), asiatic acid (1) [15].

Năm 2005 Jiang Z.Y. từ dịch chiết n-BuOH của rau má Trung Quốc đã phân

lập đƣợc bốn triterpenoid glycoside mới là asiaticoside C (4), asiaticoside D (5),

asiaticoside E (6) và asiaticoside F (7). Ngoài ra, các tác giả này còn phân lập đƣợc

một số hợp chất đã biết nhƣ asiaticoside (3), madecassoside (14) và scheffurosid B

(21) [16]. Cấu trúc của asiaticoside C đƣợc xác định là O-α-L-rhamnopyranosyl-

(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester của 2α,3β,-

dihydroxy-23-acetyloxy-urs-12-en-28-oic acid. Cấu trúc của asiaticoside D đƣợc

xác định là O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranosyl ester của 2α,3β –dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid. Cấu trúc của

asiaticoside E đƣợc xác định là O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

ester của asiatic acid. Cấu trúc của asiaticoside F đƣợc xác định là O-α-L-

rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

của 3β-23-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid.

Năm 2005, từ rau má trồng tại vƣờn trƣờng Đại Học Fukuoka-Nhật Bản,

Yoshida M và cộng sự đã phân lập đƣợc hợp chất lactone của ursolic acid , usolic

acid (49, 50), pomolic acid (51), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (52), 3-

epimaslinic acid (53), asiatic acid (1), corosolic acid (54) và thử hoạt tính sinh học

nhƣ kháng tế bào ung thƣ dạ dày ngƣời (MK-1), ung thƣ biểu mô tử cung (HeLa),

và các tế bào khối u ác tính ở chuột (B16F10). Các giá trị IC50 tƣơng ứng đƣợc đƣa

trong ngoặc bên cạnh các công thức [34].

Hình 1. 8. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Yoshida M phân lập từ

cây rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của chúng

Từ rau má Trung Quốc Quan-Lin Yu và cộng sự đã phân lập đƣợc một

triterpene mới là 2α,3β,20,23-tetrahydroxyurs-28-oic acid (24) năm 2006 [18].

Năm 2007, từ rau má Malaysia, Govidan và cộng sự đã phân lập đƣợc hợp

chất polyacetylene (55). Cấu trúc hóa học của hợp chất này đƣợc xác định là methyl

5-[(E)-9-hydroxy-1-(1-hydroxyhexyl)-2-methoxyundeca-3,10-diene-5,7-diynyloxy]

pentanoate (cadiyenol). Hợp chất này gây ra sự chết tế bào theo chƣơng trình

(apoptosis) (63%) ở tế bào lympho chuột (P388D1) tại nồng độ 28 µM (IC50 = 24

µM) trong 24 giờ. Hợp chất này cũng làm giảm sản xuất nitric oxide (70 %) ở chuột

tại nồng độ 24 µM mà không gây độc tế bào [22].

Từ rau má trồng tại Pakistan, năm 2007, Siddiqui và cộng sự đã phân lập

đƣợc ba hợp chất là centellin (56), asiaticin (57), và centellicin (58) [35].

là 23-O-acetylmadecassoside

Năm 2010 Rumalla và cộng sự đã phân lập đƣợc từ rau má trồng tại Mỹ hai triterpene glycoside mới (59) và 23-O- acetylasiaticoside B (60). Ngoài ra, một số thành phần khác nhƣ asiatic acid (1), madecassic acid (10), asiaticoside C (4), asiaticoside F (7), asiaticoside (3), madecassoside (14), β-sitosterol 3-O-β-D-glucoside, stigmasterol 3-O-β-glucoside và quercetin-3-O-β-D-glucuronid cũng đƣợc nhóm tác giả phân lập [36].

Hình 1. 9. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Rumalla phân lập từ

cây rau má trồng tại Mỹ

Năm 2010, Rumalla và cộng sự từ rau má trồng tại Mỹ đã phân lập một

triterpene mới là 2α,3β-dihydroxy-23-sulphonyl-urs-12-en-28-oic acid O-α-L-

rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl ester

(61) [37].

Năm 2011, Weng và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết n-BuOH của cây rau

má trồng tại Trung Quốc hai hợp chất saponin khung dammarane là centellosid A

(62) và centellosid B (63), hai hợp chất thiên nhiên mới là ginsenosid Mc (64) và Y

(65) cùng với 11 hợp chất đƣợc biết đến lần đầu tiên tách ra từ chi này [38].

Hình 1. 10. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Weng phân lập từ cây

rau má trồng tai Trung Quốc

Một số kỹ thuật thƣờng đƣợc sử dụng để chiết, tách các triterpene

chính trong rau má

Các đặc trƣng tĩnh (static) về hấp phụ và giải hấp phụ của 5 loại nhựa

macropore là HPD100, HPD300, X-5, AB-8 và D101 đƣợc xác định và so sánh với

nhau trên chế phẩm rau má chứa 80% tổng triterpene saponin (52% madecassoside,

28% asiaticoside). Kết quả cho thấy nhựa HPD100 cho dung lƣợng và tốc độ hấp

phụ và giải hấp phụ lớn nhất, do đó đƣợc chọn làm vật liệu hấp phụ cho quá trình

tách madecassoside và asiaticoside từ các chiết phẩm rau má. Các đặc trƣng động

(dynamic) của quá trình hấp phụ và điều kiện công nghệ tối ƣu cũng đƣợc nghiên

cứu đối với chế phẩm của rau má Trung Quốc chứa 3,9% madecassoside và 2,0%

asiaticoside từ dịch chiết của hỗn hợp ethanol/nƣớc (70/30). Bằng dung môi rửa giải

gradient của ethanol trong nƣớc (0% - 90%), hàm lƣợng madecassoside tăng từ

3,9% trong chế phẩm lên 39,7% trong sản phẩm, hiệu quả thu hồi đạt 70,4%, và

hàm lƣợng asiaticoside tăng từ 2,0% lên 21,5%, hiệu quả thu hồi đạt 72%. Các kết

quả nghiên cứu cho thấy nhựa hấp phụ HPD100 có khả năng tách madecassoside và

asiaticoside tốt. Phƣơng pháp này cũng có thể đƣợc áp dụng để tách các triterpene

saponin thực vật khác [39].

Năm 2008, Gao [40] công bố một nghiên cứu ứng dụng HPLC điều chế để

tách asiaticoside và madecassoside từ chế phẩm rau má của Trung Quốc. Chế phẩm

ban đầu chứa 20% asiaticoside và 45% madecassoside đƣợc hòa trong methanol rồi

đem tách trên cột HPLC pha đảo RP18 (5 µm), kích thƣớc cột là 50 mm x 200 mm.

Điều kiện tách tốt nhất khi sử dụng dung môi rửa giải methanol/nƣớc (60/40, v/v),

lƣu lƣợng dòng 100 mL/min, thể tích mẫu bơm vào cột 1,5 mL (nồng độ 40

mg/mL), bƣớc sóng phát hiện chất là 220 nm. Kết quả, sau 20 phút đã thu đƣợc

asiaticoside và madecassoside với độ tinh khiết đạt 98%. Phƣơng pháp này đã đƣợc

áp dụng để điều chế asiaticoside và madecassoside từ rau má thu tại Trung Quốc.

Năm 2011, Trần Văn Lộc và cộng sự đã phân lập đƣợc 2 triterpene chính:

asiatic acid, madecassic acid và hỗn hợp stigmasterol glucoside-β-sitosterol

glucoside từ cây rau má trồng tại tỉnh Nam Định, Việt Nam [41,42].

Năm 2012, Puttarak và các cộng sự đã nghiên cứu các yếu tố tác động đến

hàm lƣợng triterpene trong rau má và xác định những triterpene pentacyclic trong

việc chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây rau má thu hoạch vào những thời

điểm khác nhau trong năm và trồng ở các môi trƣờng khác nhau [43]. Các bộ phận

riêng biệt của cây rau má đƣợc lựa chọn là lá, cuống lá, hoa, quả, và rễ. Các nguyên

liệu bột khô từ mỗi phần đƣợc chiết xuất với ethanol có hỗ trợ vi sóng. Hàm lƣợng

của 4 triterpene pentacyclic đƣợc xác định bằng HPLC. Ảnh hƣởng của nơi trồng,

thời gian thu hoạch đến hàm lƣợng triterpene pentacyclic trong chiết xuất cũng

đƣợc nghiên cứu. Kết quả là trong số các bộ phận khác nhau của Centella asiatica,

lá chứa hàm lƣợng triterpene pentacyclic cao nhất với tổng hàm lƣợng triterpene

pentacyclic trong bột khô là 19,5 mg/g. Tuy nhiên, hàm lƣợng của các triterpene

pentacyclic trong Centella asiatica là khác nhau theo nơi trồng và thời gian thu

hoạch. Centella asiatica thu thập từ địa điểm Trang, Thái Lan đã cho hàm lƣợng

của tổng triterpene pentacyclic cao nhất (37,2 mg/g bột khô) khi thu hoạch vào

tháng ba, trong khi rau má thu hái từ Songkhla, Thái Lan đã cho giá trị cao nhất vào

tháng mƣời hai (37,4 mg/g bột khô). Centella asiatica thu hái từ

Nakornsrithammarat và Ratchaburi, Thái Lan cho hàm lƣợng tổng triterpene

pentacyclic thấp nhất trong tất cả các giai đoạn thu hoạch thực nghiệm.

Năm 2013 Puttarak [44] công bố công trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm

giàu các triterpene pentacyclic từ rau má Ấn Độ bằng phƣơng pháp chiết xuất có vi

sóng hỗ trợ (microwave-assisted extraction, MAE). Chế phẩm đƣợc tinh chế trên

cột với chất mang là nhựa hấp phụ macropore Daion HP-20 (Mitsubishi), dung môi

rửa giải là ethanol, và sản phẩm đƣợc tẩy màu bằng than hoạt tính. Kết quả cho thấy

kỹ thuật chiết MAE nâng cao hiệu suất chiết một cách rõ rệt. Hàm lƣợng các

triterpene pentacyclic tăng lên khoảng gấp hai lần so với phƣơng pháp chiết xuất

bằng đun hồi lƣu, mặc dù thời gian chiết là cũng ngắn hơn nhiều. Sản phẩm thu

đƣợc có hàm lƣợng các triterpene pentacyclic trên 65%.

1.3. Hoạt tính sinh học của cây rau má

1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2004, Mamtha và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn đƣờng

ruột của dịch chiết của rau má với methanol ở nồng độ 100, 200, 300 và 400 mg/ml.

Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất của dịch chiết rau má

chống lại mầm mống của bệnh đƣờng ruột ở nồng độ 400 mg/ml. Hoạt tính kháng

khuẩn này đƣợc đánh giá tƣơng tự nhƣ một loại thuốc điều trị bệnh tiêu chảy [45].

1.3.2. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm

Nhóm nghiên cứu của Somchit đã nghiên cứu hoạt tính giảm đau của dịch

chiết nƣớc cây rau má với chuột nhắt trắng (10, 30, 100 và 300 mg/kg trọng lƣợng) 15

trên hai mô hình gây đau với acetic acid và đĩa nóng. Đồng thời, hoạt tính kháng

viêm đƣợc nghiên cứu trên chuột cống gây viêm bàn chân bằng prostaglandin E2.

Kết quả cho thấy, hoạt tính giảm đau của dịch nƣớc cây rau má tƣơng tự nhƣ

aspirin, nhƣng yếu hơn morphine. Đáng chú ý, hoạt tính kháng viêm của dịch nƣớc

tƣơng tự nhƣ các thuốc kháng viêm không steroid và meferamic acid [46].

1.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa

Năm 2000, Cheng và Koo đã nghiên cứu ảnh hƣởng của dịch chiết rau má

trong việc phòng, chống tổn thƣơng dạ dày ở chuột gây ra bởi tác nhân ethanol. Với

liều dùng (0,05 g/kg, 0,25 g/kg và 0,50 g/kg) bằng cách cho uống, trƣớc khi dùng

ethanol. Kết quả cho thấy dịch chiết từ rau má ngăn ethanol gây ra tổn thƣơng niêm

mạc dạ dày bằng cách tăng cƣờng các hàng rào niêm mạc và giảm thiểu các tác hại

của các gốc tự do.

Năm 2003, Zainol đã nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết

rau má với methanol so với chất chống oxy hóa tự nhiên α-tocopherol và chất chống

oxy hóa tổng hợp butyl hydroxytoluen (BHT). Kết quả cho thấy hoạt tính chống

oxy hóa của dịch chiết rau má tƣơng đối cao, tƣơng tự nhƣ của α-tocopherol. [21,

47, 48, 49, 50].

1.3.4. Tác dụng bảo vệ thần kinh

Năm 2005, Subathra cùng với các cộng sự đã nghiên cứu về khả năng chống

oxy hóa của dịch chiết từ rau má đối với vùng não của những con chuột già, khi cho

chúng uống với liều (300 mg/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày) trong 60 ngày. Kết quả

cho thấy dịch chiết rau má đã làm giảm nồng độ chất per-oxy hóa lipid (LPO) và

cacbonyl protein (PCO) trong vùng não của chuột [51].

Năm 2008, Gadahad đã sử dụng dịch chiết rau má làm thức ăn cho chuột với

liều lƣợng 6 ml/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày trong 6 tuần. Tác giả kết luận rằng

thành phần có trong dịch chiết lá tƣơi rau má có tác dụng kích thích sự phát triển

của tế bào thần kinh. Những dữ liệu này đƣợc so sánh với những con chuột đối

chứng có độ tuổi phù hợp [52].

1.4.5. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch

Trong bằng độc quyền sáng chế đăng ký tại Hoa Kỳ US 2007/0010459A1,

11/01/2007, nhóm nghiên cứu đã sử dụng asiatic acid hoặc hỗn hợp asiatic

acid/asiaticoside để điều trị bệnh xơ vữa động mạch và xơ vữa phổi trên động vật

thực nghiệm là chó và chuột cống. Các kết quả là rất khả quan [53].

Hiện nay trên thị trƣờng Châu Âu có rất nhiều sản phẩm thuốc có chứa rau

má nhƣ: Ở Bỉ và Pháp có sản phẩm Madecassol® ở dạng kem, dùng bôi ngoài da, ở

Ý có sẩn phẩm Centellase®, ở Tây Ban Nha có sản phẩm Blastoestimulina®. Từ

việc so sánh các thông tin về sản phẩm và thử nghiệm hoạt chất có trong sản phẩm

đã cho thấy rằng tất cả các sản phẩm thuốc nói trên đều sử dụng các hoạt chất đƣợc

chiết xuất từ cây rau má, với hàm lƣợng khoảng 40% asiaticoside và khoảng 60%

các triterpenoic acid nhƣ asiatic acid và madecassic acid [54].

Hình 1. 11. Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má

1.4. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất

Cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu công bố về

các hoạt tính sinh học của các chất đƣợc phân lập từ cây rau má nhƣ: hoạt tính gây

độc tế bào và kháng ung thƣ, hoạt tính chống xơ vữa động mạch, hoạt tính giảm đau

và kháng viêm, rút ngắn thời gian chữa lành vết thƣơng, vết bỏng...[55, 56, 57, 58,

59, 60, 61, 62, 63, 64, 65]. Sau đây là một số hoạt tính chính của các triterpenoic

acid từ cây rau má.

1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thƣ

Ya-ling Hsu và cộng sự ở khoa Dƣợc, trƣờng đại học Y, Cao Hùng, Đài

Loan lần đầu tiên nghiên cứu tác dụng chống ung thƣ của asiatic acid tách từ cây

rau má đối với hai dòng tế bào ung thƣ vú là MCF-7 và MDA-MB-231. Các tác giả

này thấy rằng asiatic acid ức chế mạnh sự phát triển của tế bào thông qua việc làm

ngừng chu trình tế bào và gây ra sự chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) ở giai

đoạn S-G2/M. Quá trình kìm hãm sự phát triển tế bào ung thƣ đƣợc gắn với việc

giảm lƣợng P21/WAF1 và giảm lƣợng cyclin B1, cyclin A, Cdc2 và Cdc25C theo

cách không phụ thuộc vào P53 [66].

Nhóm Yoshinati Ohnishi ở trƣờng đại học Tokushima Nhật Bản đã nghiên

cứu hoạt tính ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ ruột kết HT-29 khi sử dụng

cùng với thuốc chống ung thƣ irinotecan hydrochlorid (CPT-11). Asiatic acid có

độc tính tế bào với HT-29 tuỳ theo liều lƣợng và đẩy nhanh quá trình chết của tế

bào HT-29 thông qua quá trình hoạt hoá enzyme caspase-3. Sử dụng đồng thời

asiatic acid và CPT-11 hoặc asiatic acid trƣớc, sau đó đến CPT-11 sẽ có hoạt tính

tăng theo cấp số cộng. Tác dụng hiệp đồng sẽ có nếu sử dụng CPT-11 trƣớc, sau đó

là asiatic acid. Kết quả này cho thấy asiatic acid có thể đƣợc sử dụng nhƣ một tác

nhân làm tăng độ nhạy của tế bào ung thƣ ruột kết khi điều trị với CPT-11 hoặc nhƣ

một tác nhân làm giảm bớt tác dụng phụ không mong muốn của thuốc CPT-11 [67].

Jung-Ae Kim ở trƣờng đại học Yeungnam, Hàn Quốc đã nghiên cứu hoạt

tính của asiatic acid trong việc ức chế ung thƣ da chuột, gây ra bởi 7,12-

dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) và 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate

(TPA). Sử dụng asiatic acid trƣớc khi dùng TPA sẽ giảm đáng kể ung thƣ da, gây ra

bởi TPA. Các tác giả cũng thấy rằng asiatic acid ức chế sự tạo thành nitric oxit

(NO), enzyme NO-synthase (NOS) và cyclooxygenase (COX-2) gây ra bởi TPA.

Đây là các tác nhân quan trọng cho sự phát triển của tế bào ung thƣ, đặc biệt trong

giai đoạn mới phát sinh. Kết quả này gợi ý rằng, asiatic acid thể hiện hoạt tính

kháng ung thƣ thông qua việc ức chế sản sinh NO và COX-2 [68].

Trong bằng độc quyền sáng chế số US 2004/0097463A1 năm 2004, các tác

giả đã sử dụng asiatic acid hoặc asiaticoside để điều trị ung thƣ. Các loại ung thƣ đã

đƣợc nghiên cứu điều trị bao gồm: ung thƣ biểu mô, ung thƣ vú, ung thƣ túi mật,

ung thƣ bàng quang, ung thƣ não, ung thƣ cổ, ung thƣ nhau thai, ung thƣ dạ dày,

ung thƣ màng tử cung, ung thƣ thực quản, ung thƣ tuỷ xƣơng. Ngoài ra các hợp chất

này còn đƣợc sử dụng điều trị bệnh tăng sinh, ví dụ nhƣ bệnh vảy nến, u mỡ, bệnh

đa u nang thận [69].

Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy các chuyển hóa hóa

học của asiatic acid có thể cải thiện các hoạt tính chống ung thƣ. Ví dụ gắn thêm

nhóm chức amide tại C-28, hoặc thêm nhóm cacbonyl tại C-11, tạo dẫn xuất amide

ở C-28, acetyl hóa ở C-23, hydroxyl hóa tại C-2, C-3... hoạt tính kháng ung thƣ tăng

lên đáng kể. Từ asiatic acid (AA) Bruno và cộng sự đã tổng hợp thành công dẫn

xuất flo, và thử hoạt tính sinh học với dòng tế bào HeLa và HT-29. Các dẫn xuất

cho thấy hoạt tính mạnh hơn asiatic acid. Hợp chất (66) ức chế tế bào ung thƣ bạch

cầu HeLa, kích thích enzyme caspase theo hƣớng-apoptosis với kích hoạt của

caspase-8 và caspase-3 và sự phân cắt của PARP [70]. Lu Ren và cộng sự đã nghiên

cứu hoạt tính chống ung thƣ buồng trứng ở ngƣời của asiatic acid [71]. Trong số các

triterpene khung ursane có trong tự nhiên thì asiatic acid có hoạt tính giảm đáng kể

sự hình thành các khối u ở da. Đồng thời, asiatic acid ức chế chất hoạt hóa

plasminogen mô (TPA), sản sinh NO và biểu hiện của iNOS và COX-2 là các yếu

tố quan trọng trong việc thúc đẩy hình thành khối u.

Bruno M. F. Gonçalves và cộng sự đã tổng hợp một số dẫn xuất của asiatic

acid và đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ HeLa với các giá trị IC50 dao động

từ 0,11 μM đến 0,65 μM [72].

1.4.2. Hoạt tính làm lành vết thƣơng

Năm 1990, Maquart và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu về khả

năng làm lành vết thƣơng bị lở loét của asiaticoside. Dƣợc tính đáng kể của hoạt

chất này là giảm bớt kích thƣớc của vùng vết thƣơng trên da lƣng ở chuột sau 9

ngày thử nghiệm.

Asiatic acid có khả năng làm tăng hoạt tính của thuốc kháng sinh, ví dụ nhƣ

thuốc Ciprofloxacin và Tabramycin với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa [73].

Asiaticoside, asiatic acid hỗ trợ điều trị vết thƣơng qua việc làm tăng hàm

lƣợng hydroxyprolin, thành phần của peptid, tăng độ đàn hồi của cơ da, tăng sinh

tổng hợp collagen, tăng tạo mạch và tạo biểu mô [74].

Asiatic acid và madecassic acid cũng làm tăng lƣợng hydroxyprolin, tăng

tổng hợp collagen ở vết thƣơng. Asiaticoside cũng tạo ra chất chống oxy hoá

(antioxidant) bằng con đƣờng enzyme hoặc không enzyme nhƣ superoxid

dismutase, catalase, glutathion perosidase, vitamin E và ascorbic acid ở các mô mới

hình thành [23,75].

1.4.3. Hoạt tính chống trầm cảm

Kết quả nghiên cứu của Boiteau và cộng sự (2001) cho thấy asiaticoside có

khả năng làm giảm trầm cảm ở chuột. Những thử nghiệm đƣợc tiến hành trên chuột

và những kết quả cho thấy rằng asiaticoside có thể hoạt động giống nhƣ chất chống

trầm cảm, giúp chuột hoạt động, nhận và xử lý thông tin nhanh hơn.

Theo nghiên cứu của nhóm Inhee, các dẫn xuất của asiaticoside có khả năng

bảo vệ thần kinh, chống lại độc tố β-amyloid gây hại đối với nơtron thần kinh.

Các nghiên cứu cũng cho thấy AA có tác dụng bảo vệ thần kinh, làm giảm

bớt khối lƣợng nhồi máu và chuột thiếu máu cục bộ trong mô hình chuột. AA cũng

bảo vệ thần kinh, chống lại độc tính của L-glutamate gây ra trong tế bào thần kinh

vỏ não chính. AA giảm đáng kể nhồi máu khối lƣợng liều thấp t-PA. Điều trị kết

hợp giữa AA và liều thấp t-PA lúc 3 giờ sau khi đột quỵ tắc mạch làm giảm khối

lƣợng vùng nhồi máu, cải thiện kết cục thần kinh và bảo vệ nơron thần kinh. Tác

dụng bảo vệ thần kinh của AA là do giảm AIF và CytoC [76].

1.4.4. Hoạt tính bảo vệ gan

Sheng-Lei Yan và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của asiatic acid ở mức

10 hoặc 20 mg/kg/ngày và kiểm tra khi gan chuột nhiễm mỡ gây ra bởi một chế độ

ăn uống nhiều chất béo (HFD). Trọng lƣợng cơ thể, lƣợng nƣớc, lƣợng thức ăn, chất

béo, và triglyceride trong huyết tƣơng ở gan chuột ăn nhiều chất béo (HFD) khi

điều trị AA giảm có ý nghĩa thống kê (P<0,05). AA là một chất bảo vệ gan mạnh

chống lại tổn thƣơng gan do chế độ HFD gây ra [77].

1.4.5. Các hoạt tính khác

Các thí nghiệm in vivo chỉ ra rằng AA ngăn cản phì đại tim và rối loạn chức

năng gây ra bởi áp lực quá tải. AA giảm đáng kể việc sản xuất quá mức TGF-β1

trong phì đại cơ tim, chặn phosphoryl p38 và ERK1/2 và ức chế sự kích hoạt của

NF-κB. Điều đó cho thấy AA có thể dùng trong trị liệu đối với bệnh phì đại tim. Sự

ức chế TGF-β1 qua tín hiệu trung gian phì đại có thể là cơ chế mà qua đó AA ngăn

ngừa phì đại tim [78].

Nghiên cứu hoạt tính của asiatic acid về tình trạng lƣu lƣợng máu, chức năng

mạch máu, căng thẳng thần kinh, sản sinh nitric oxide (Enos) và sản sinh NADPH

(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), tăng huyết áp chuột. Sau 2 tuần

nghiên cứu cho thấy sự cải thiện đáng kể tình trạng lƣu lƣợng máu và chức năng

mạch máu. Các tác dụng hạ huyết áp của AA có liên quan với nồng độ huyết tƣơng

NOx, cùng với biểu hiện tăng bài xuất của Enos [79].

Bruno và cộng sự đã tổng hợp một số dẫn xuất của asiatic acid và thử hoạt

tính sinh học của chúng với các dòng tế bào HT-29 và HeLa, hầu hết các dẫn xuất

đƣợc thử nghiệm cho thấy hoạt tính chống oxy hoá tốt hơn so với asiatic acid [80].

Ahmad Rather M đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh của asiatic acid

đối với aluminium maltolate (Al(mal)3) gây ra độc tính thần kinh bằng cách đánh

giá khả năng sống sót của tế bào,… thông qua đƣờng truyền tín hiệu AKT / GSK-3β

trong SH-SY 5Y tế bào thần kinh [81].

1.5. Một số chuyển hóa của asiatic acid

Asiatic acid (2α, 3β, 23-trihydroxyurs-12-ene-28-oic acid), là một

triterpenoid có trong cây rau má. Trong y học cổ truyền, rau má dùng để làm đẹp da

[82], AA cũng có tác dụng sinh học khác bao gồm chống khối u [83], chống viêm

[84], bảo vệ gan [85], chống trầm cảm và chống bệnh Alzheimer [86] và các hoạt

tính nhƣ các triterpene khác. Tuy nhiên, hiệu quả của các AA ban đầu là tƣơng đối

thấp. Nhiều nỗ lực đã đƣợc thực hiện để cải thiện điều này. Nhiều nhà nghiên cứu

đã tổng hợp các dẫn xuất AA khác nhau bằng cách thêm các nhóm chức mới để

tăng hoạt tính sinh học của nó [87, 88, 89, 90, 91].

1.5.1. Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid

Để tổng hợp dẫn xuất C2-oxo của asiatic acid (1), từ acetonide (67) hợp chất

này đƣợc oxi hóa bởi PDC trong CH2Cl2 để thu đƣợc chất 72 với hiệu suất 24,1%.

Thủy phân nhóm bảo vệ chất 72 bằng dung dịch HCl 1M thu đƣợc dẫn xuất C2-oxo

của asiatic acid (73) với hiệu suất 95,0% [92].

Sơ đồ 1. 1. Chuyển hóa các dẫn xuất của AA tại vị trí C-2

Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp dẫn xuất C2- oxo của asiatic acid

Để tạo ra các chất có tác dụng bảo vệ gan mới, Jeong và các cộng sự (2007)

đã tiến hành các chuyển hóa hóa học tại vị trí C2, C3, C23 và C28 của AA [93].

Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình tổn thƣơng gan do CCl4 và

galactosamin gây ra cho thấy các hợp chất 85, 88, 91 có hoạt tính bảo vệ gan đáng

kể. Đặc biệt, hợp chất 85 có hoạt tính bảo vệ gan mạnh nhất (mô hình galactosamin:

bảo vệ 66,4% ở nồng độ 50μM, mô hình CCl4: bảo vệ 20,7% ở nồng độ 50μM). Các

quá trình tổng hợp đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Từ chất 68 thêm NaH, carbon disulfide (CS2), và methyl iodide sẽ tạo ra hợp

chất (methylthio) thiocarbonyl (74) hiệu suất 96%. Khử hóa hợp chất 74 bằng

tributyltin hydride (n-Bu3SnH) và 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) trong benzen

sẽ đƣợc chất 75 với hiệu suất 95%, sau đó loại nhóm bảo vệ bằng dung dịch HCl

1M để cho diol (80) với hiệu suất 88%. Chất 76 đƣợc thủy phân với LiI và collidin

tạo ra chất 77 với hiệu suất 65% .

Sơ đồ 1. 3. Chuyển hóa ở C2 (khử oxy) của asiatic acid

Asiatic acid đƣợc methyl hóa với methyl iodide có mặt K2CO3 thu methyl

ester (78) với hiệu suất 88,6 %. Tiếp tục methyl hóa chất 78 với methyl iodide có

mặt NaH tạo thành dẫn xuất 79 với hiệu suất 95,3 %, oxy hóa 79 với Na2Cr2O7 tạo

thành ketone (80) với hiệu suất 71,6 %.

Sơ đồ 1. 4. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23, C-11 và C-28 của asiatic acid

Acetyl hóa chất 81 với anhydride acetic cho chất 82 với hiệu suất 83%, loại

bỏ nhóm bảo vệ ở chất 82 với HCl 1M thu đƣợc chất 83 với hiệu suất 76%. Từ chất

83 thêm PDC hoặc PCC tạo ra dẫn xuất C-23 aldehyde (84) với hiệu suất 46%, tiếp

tục oxi hóa bới PDC thu đƣợc dẫn xuất 3-keto-23- aldehyde (85) với hiệu suất 42%.

Chất 81 thêm MeI và NaH trong THF sau đó loại nhóm bảo vệ với dung dịch

HCl, 1 M tạo ra hợp chất diol (86) với hiệu suất 78,3 %, cho tiếp acetic anhydride

trong DMAP để tạo ra chất 87 với hiệu suất 57,0%. Tƣơng tự hợp chất 88 chứa 2α-

methoxy, 3-oxo và 23–aldehyde thu đƣợc với hiệu suất tổng 24,6 %.

Sơ đồ 1. 5. Tổng hợp dẫn xuất 3-oxo-23-andehyde và các dẫn xuất

Để điều chế chất 91, chất 89 đã phản ứng với dung dịch HCl 1M trong THF

để tạo thành hợp chất diol (90) với hiệu suất 90,2 %, sau đó thêm acetic anhydride

trong DMAP tạo thành chất 91 với hiệu suất 65,8%.

Sơ đồ 1. 6. Tổng hợp dẫn xuất C2-benzyloxy, C3,23-diacetoxy của acid

methyl ester.

Asiatic acid (1), thực hiện acetyl hóa với acetic anhydride tạo ra chất bảo vệ

trung gian 92 với hiệu suất 58,3%. Oxi hóa 92 với Na2Cr2O7 trong acetic acid thu

đƣợc chất 93 với hiệu suất 92,7%. Thủy phân chất 93 bằng K2CO3 trong dung dịch

MeOH và nƣớc thu đƣợc chất 94 với hiệu suất 80,6%.

Sơ đồ 1. 7. Tổng hợp C11-keto asiatic acid.

Đối với việc chuyển hóa tại vị trí C-28 từ chất trung gian (95) khi khử hóa

bởi lithium nhôm hiđrua (LiAlH4) sẽ tạo thành hydroxymethyl (96) với hiệu suất

83,5 %. Loại nhóm bảo vệ acetonide (96) bằng dung dịch HCl 1 M tạo ra chất (97)

với hiệu suất 90,6%, sau đó loại bỏ nhóm bảo vệ Bn bởi H2 xúc tác 10 % Pd/C thu

đƣợc chất 98 với hiệu suất 88,9%. Từ chất 99 thêm acetyl chloride hoặc acetic

anhydride tạo thành 3β, 23–acetoxy (chất 100) với hiệu suất 73,5% hoặc 23–

acetoxy chất (101) với hiệu suất 41,5%.

Từ AA, Zhao và cộng sự đã thực hiện các chuyển hóa hóa học tại các vị trí

C-11, C-28, C-2,3,23 hoặc các nhóm chức tại C2,23,28 và thử nghiệm hoạt tính bảo

vệ gan của chúng [94]. Hầu hết các chất đều có hoạt tính bảo vệ gan, tuy nhiên chất

105 và 108 có hoạt tính bảo vệ gan mạnh với giá trị GaIn lần lƣợt là 54,2% và

46,4% tại nồng độ 50 µM.

Từ chất 102 thêm acetic anhydride hoặc trimethylacetic anhydride trong

DMAP tạo ra chất 103 (3β-, 23- diacetoxy) với hiệu suất 78,6%, và chất 104 (23–

trimethylacetoxy) với hiệu suất 67,3%. Chất 105 khi thêm acetyl chloride và

triethylamine trong THF tạo ra chất 106 với hiệu suất 39,2%. Từ methyl ester (107)

khi bị oxy hóa với PDC trong CH2Cl2 tạo ra chất 108 với hiệu suất 73,8 %, gở nhóm

bảo vệ 108 bằng dung dịch HCl 1M tạo ra hợp chất diol (109) với hiệu suất 89,3 %.

Tiếp tục cho phản ứng với acetyl chloride, propionyl chloride hoặc pivaloyl

chloride trong CH2Cl2 sẽ tạo thành chất 110, 111 hoặc 112 với hiệu suất tƣơng ứng

là 48,5 %, 22,3 % và 48,3 %.

Sơ đồ 1. 8. Tổng hợp C28-hydroxymethyl asiatic acid.

Sơ đồ 1. 9. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23 của asiatic acid

Sơ đồ 1. 10. Chuyển hóa ở vị trí C2,3,28 của asiatic acid

Nhằm tăng cƣờng tính tan và hoạt tính chống ung thƣ, Jing và các cộng sự đã

tổng hợp các dẫn xuất AA mới bằng cách thay thế bảy acid amin khác nhau tại các

vị trí C-28 đồng thời với việc acetyl hóa nhóm OH ở các vị trí C2, C-3 và C-23

(Hình 12) [73]. Kết quả thử nghiệm trên bảy dòng tế bào ung thƣ (HeLa, HepG2,

B16F10, SGC7901, A549, MCF7 và PC3) cho thấy các dẫn xuất thu đƣợc không

chỉ có tăng hoạt tính ức chế sự tăng trƣởng tế bào mà còn tăng tác dụng chống tạo

mạch hơn AA.

Các hợp chất 114-120 các nhóm thế ester có giá trị IC50 thấp hơn so với các hợp chất 121-127, và cũng cho thấy hoạt tính chống khối u lớn hơn hợp chất AA. Những

kết quả này gợi ý rằng:

Các hợp chất với các nhóm hydroxy chỉ đƣợc acetyl hóa ở C-2, C-3 và C-23 có hoạt tính thấp hơn AA.

Các hợp chất chỉ đƣợc gắn nhóm amino acid tại C-28 cũng cho thấy hoạt tính kém

hơn AA.

Các chất đồng thời đƣợc acetyl hóa (với các nhóm OH ở vị trí C-2, C-3 và C-23) và

gắn nhóm amino acid tại C-28 có hoạt tính mạnh hơn AA.

Hoạt tính của các dẫn xuất thay đổi theo cấu trúc mạch nhánh của các amino acid.

Sơ đồ 1. 11. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amino axit từ asiatic acid

Sơ đồ 1. 12. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amide từ asiatic acid

Li J-F và các cộng sự (2015) [95] đã amide hóa acid carboxylic tại C-28.

Acetyl hóa asiatic acid (1) tạo ra 2,3,23-asiatic acid triacetate (92) sau đó tổng hợp

các dẫn xuất của các aniline thế 129-133 với hiệu suất cao. Để đánh giá ảnh hƣởng

của việc sửa đổi cấu trúc trên vòng A nhóm nghiên cứu này đã tổng hợp các chất mới 134-139. Các hợp chất dioxan thu đƣợc khi 128 cho phản ứng với R2COR3 có mặt DMF và HClO4 (Sơ đồ 1.12). Kết quả thử hoạt tính cho thấy các dẫn xuất asiatic acid có hiệu quả trong việc bảo vệ gan do tổn thƣơng do CCl4 gây ra. Các dẫn xuất 129-133 cho thấy số lƣợng carbon lớn hơn thì hoạt tính tốt hơn. Các dẫn

xuất 134-139 với một vòng benzen có hoạt tính tốt hơn, ngoài ra nhóm thu điện tử

trong vòng benzen có thể làm tăng hiệu quả dƣợc lý của dẫn xuất.

1.5.2. Chuyển hóa bằng phƣơng pháp sinh học

Ngoài phƣơng pháp hóa học, nhiều triterpene khung ursane và oleanane có

hoạt tính sinh học quan trọng còn thu đƣợc bằng phƣơng pháp sinh học.

Các chuyển hóa hóa học của AA, và một số các dẫn xuất đã cho thấy hoạt

tính bảo vệ gan và hoạt tính làm lành vết thƣơng mạnh hơn AA [70]. Tuy nhiên, do

các cấu trúc phức tạp hơn các sản phẩm tự nhiên nên các dẫn xuất tổng hợp hóa học

thƣờng bị hạn chế [96]. Do đó việc biến đổi sinh học sẽ tạo ra công nghệ thân thiện

môi trƣờng cho việc điều chế các chất có cấu trúc phức tạp [97]. Hơn nữa, chuyển

hóa sinh học có thể bắt chƣớc các chuyển hóa chất trong cơ thể sống mà con ngƣời

không làm đƣợc [98]. Huang và các cộng sự đã tiến hành chuyển hóa sinh học AA

bằng phƣơng pháp oxy hóa sử dụng enzyme và thu đƣợc hai chất mới (140, 141)

trong đó vị trí C-15 đã đƣợc gắn thêm một nhóm OH một cách bất thƣờng.

Sơ đồ 1. 13. Tổng hợp một số dẫn xuất của AA bằng con đƣờng sinh học

1.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc

Cây rau má rất quen thuộc ở Việt Nam, cây mọc tự nhiên khắp nơi, thƣờng

thành từng đám ở vƣờn, bãi sông suối, nƣơng rẫy, bờ ruộng cao và ven rừng. Nguồn

rau má mọc tự nhiên ở Việt Nam khá dồi dào. Tuy vậy, cây chỉ đƣợc khai thác và

sử dụng tại chỗ, chƣa trở thành mặt hàng thƣơng mại hoá [2].

Nhân dân dùng cả cây rau má tƣơi hoặc phơi khô. Kinh nghiệm dân gian

Việt Nam dùng rau má để chữa sốt, mụn nhọt, bệnh gan vàng da, thổ huyết, chảy

máu cam, táo bón, tả lỵ, tiểu tiện rắt buốt, khí hƣ bạch đới, mất sữa.

Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít các công bố trên các tạp chí khoa học về các

công trình nghiên cứu hóa học và tác dụng dƣợc lý của các triterpenoid của cây rau

má Việt Nam.

Hình 1. 12. Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam

Hiện nay trên thị trƣờng đã xuất hiện rất nhiều loại sản phẩm chiết xuất từ

rau má với công dụng rất tốt nhƣ trà rau má Gotu Kola, bột rau má trong viên nang

mềm Cendital. Khoa Sinh, trƣờng Đại học Đà Lạt cũng đã có công trình nghiên cứu

khả năng giải độc lá ngón bằng rau má. Giáo sƣ Bửu Hội có các công trình nghiên

cứu các tác dụng trị bệnh phong của rau má vào năm 1960. Ngày nay nhiều nhà

khoa học cho là chất asiaticoside của rau má có tác dụng tƣơng đƣơng với dƣợc

phẩm trị phong chính là Dapsone. Ở nƣớc ta TS Phan Quốc Kinh và cộng sự đã

chiết xuất đƣợc asiaticoside và asiatic acid từ cây rau má Việt Nam.

Năm 2007, từ dịch chiết ethyl acetate của cây rau má lá sen (Hydrocotyle

vulgaris), nhóm tác giả Tôn Nữ Liên Hƣơng (Trƣờng Đại Học Cần Thơ) đã phân

lập đƣợc 16 hợp chất là hexenal, (2E)-hexenal, hexen-1-ol, santalen, β-farnesene, β-

cubeben và quercetin 3-O-galactopyranosid (37) [99].

Năm 2008, Công ty cổ phần mỹ phẩm Sao Phƣơng Bắc đã nghiên cứu sản

xuất loại kem bôi da từ dịch chiết rau má có tên là (yoosun rau má) có tác dụng

ngăn ngừa và trị mụn trứng cá, kích thích lên da non giúp mau liền vết thƣơng tránh

để lại sẹo, làm mát da, ngăn ngừa và trị rôm sảy, mẩn ngứa, trị các vết muỗi đốt và

côn trùng cắn, dƣỡng da, tái tạo tế bào da cho làn da luôn tƣơi trẻ. Chứng nhận tiêu

chuẩn sản phẩm số : SĐK: 08974/ 08/ CBMP- QLD.

Năm 2009, PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc cùng với cộng sự Viện Tài nguyên,

Môi trƣờng và Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã chuyển gen LTB (là tiểu đơn vị

liên kết của độc tố đƣờng ruột không bền nhiệt của Escherichia coli) vào cây rau má

với mục đích tạo ra protein kháng nguyên để sản xuất vaccin phòng bệnh cho ngƣời

và động vật đã cho kết quả khả quan và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học

trên thế giới [100].

Năm 2009, Nguyễn Thị Trúc Loan đã khảo sát tinh dầu rau má bằng phƣơng

pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc [101].

Năm 2010, học viên Nguyễn Thị Vân Anh dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của

TS. Trƣơng Thị Minh Hạnh Đại Học Đà Nẵng, thực hiện đề tài: Nghiên cứu điều

kiện chiết tách asiaticoside từ rau má và ứng dụng trong sản xuất trà chức năng từ

rau má. Kết quả đã đƣa ra đƣợc các thông số tối ƣu để chiết tách asiaticoside và sản

xuất thành công trà rau má chức năng túi lọc với qui mô phòng thí nghiệm đạt tiêu

chuẩn về phƣơng diện dinh dƣỡng, cảm quan và vi sinh vật [102].

Lê Thị Huyền (2010) đã nghiên cứu chiết xuất một số hoạt chất saponin từ

rau má (Centella asiatica (L.) Urb.- Apiaceae) [103].

Năm 2010, Nguyễn Thụy Hai, Nguyễn Minh Đức đã nghiên cứu ứng dụng

sắc ký lỏng hiệu năng cao trong điều chế chất chuẩn asiaticoside để điều chế

asiaticoside có độ tinh khiết cao từ bột trích tinh rau má bằng phƣơng pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao và có thể điều chế các chất chuẩn có độ tinh khiết cao một cách

nhanh chóng và hiệu quả [104].

Năm 2011, Viện công nghiệp thực phẩm đã nghiên cứu và đăng ký chất

lƣợng 2 sản phẩm từ cây rau má dƣới dạng sản phẩm chức năng là:

Tinh rau má: Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số: 7303/2011/YT-CNTC

Tinh của rau má tƣơi đã đƣợc sản xuất dƣới dạng bột siêu mịn. Thành phần gồm

đƣờng sacarose, glucose, và tinh rau má. Có tác dụng giải nhiệt, nhuận gan, giải độc

lợi tiểu, chống táo bón. Hỗ trợ làm giảm mụn nhọt, trứng cá, các vết nám vết nhăn,

lão hóa da, ngăn các vết thƣơng hình thành sẹo lồi.

Rau má FOS: Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số : 7304/2011/YT-CNTC

Thành phần gồm đƣờng sacarose, glucose, đƣờng chức năng FOS (Fructose

Oligosacarit) và tinh rau má. Đây là sản phẩm dành cho bệnh nhân tiểu đƣờng, hoặc

ngƣời có nhu cầu giảm béo. Tác dụng tăng cảm giác no, giảm năng lƣợng của mỗi

bữa ăn, thanh nhiệt, lợi tiểu, nhuận gan, nhuận tràng.

Nguyễn Thị Hoài đã nghiên cứu quy trình chiết xuất flavonoid và saponin

trong cây rau má. Từ phần trên mặt đất của cây rau má thu hái tại huyện Phong

Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 10 năm 2009. Nguyễn Thị Hoài bằng các

phƣơng pháp sắc ký đã phân lập đƣợc 2 saponin là asiatic acid và madecasic acid từ

rau má (Centella asiatica (L.) Urb., Apiaceae) thu hái tại Thừa Thiên Huế

[105,106]. Năm 2011 tác giả còn công bố định lƣợng asiaticoside, asiatic acid và

madecasic acid trong rau má bằng HPLC. Từ phần trên mặt đất của cây rau má thu

hái tại Thừa Thiên Huế, bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, ở các điều

kiện khảo sát, đã xác định đƣợc hàm lƣợng 3 hợp chất asiaticoside: 1,63%, acid

asiatic: 0,57% và acid madecassic: 0,48% [107].

Từ rau má đƣợc thu hái tại tỉnh Tiền Giang (năm 2011) nhóm nghiên cứu

Nguyễn Ngọc Hạnh đã tiến hành “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

kháng khuẩn của tinh dầu rau má” theo 3 phƣơng pháp: chƣng cất hơi nƣớc, chiếu

xạ vi sóng có thêm nƣớc và không thêm nƣớc để thu đƣợc tinh dầu. Thành phần hóa

học của tinh dầu đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ

(GC/MS), xác định chỉ số vật lý, hoá học, xác định hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả

thu đƣợc hàm lƣợng tinh dầu rau má trồng tại Tiền Giang thấp (0,015-0,037%),

thành phần gồm 27 chất, thành phần chính là β-farnesen (56,09%), β-cariophilen

(4,56%), β-elemen (4,28%), oxid cariophilen (3,64%). Tinh dầu rau má nguyên chất và tại nồng độ 10-1, có tác dụng kháng khuẩn với tất cả các chủng vi sinh vật thử

nghiệm: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Candida albicans. Tại nồng độ 10-2, vòng vô khuẩn xuất hiện trên các

chủng Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis. Tuy nhiên rau má đang đƣợc trồng

rộng rãi, nên có thể tận dụng lợi thế này và áp dụng các hệ thống chiết tách tinh dầu

trong công nghiệp [108].

Năm 2011, Nguyễn Xuân Nhiệm và cộng sự từ mẫu rau má thu thập tại

Vƣờn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam, đã phân lập triterpene glycoside

mới là , asiaticoside G (143) (2α,3β,23,30-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-

[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]

ester có hoạt tính điều tiết sự sản sinh NO và sự bài tiết TNF-α trong tế bào đƣợc

hoạt hóa RAW-264.7 [109] .

Năm 2012 TS. Trần Văn Lộc và cộng sự Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công Nghệ Việt Nam đã phân lập và tổng hợp một số dẫn xuất của asiatic

acid và đã khảo sát hoạt tính sinh học của chúng, kết quả cho thấy hầu hết các chất

đều có hoạt tính ức chế sự phát triển của 3 dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm là KB

(ung thƣ biểu mô), HepG2 (ung thƣ gan) và Lu (ung thƣ phổi) [110].

Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất và phân lập chất

Sắc ký lớp mỏng: đƣợc thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel

Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm. Quan sát bản mỏng dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc

sóng λ = 254 nm và 365 nm, sử dụng thuốc hiện là dung dịch vanilin/H2SO4 (Vanilin: 1,2 g, H2SO4 đặc: 11 ml, CH3COOH: 25 ml, CH3OH: 200 ml và nung nóng ở khoảng 110 °C cho đến khi nhìn thấy các vết).

Sắc ký cột: sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 0,06-0,2 mm đƣợc dùng cho

cột đầu, 40-63 m đƣợc dùng cho các cột tiếp theo.

Nhiệt độ nóng chảy đƣợc xác định trên máy Boetius, Cộng hòa Liên bang Đức.

2.2. Các phƣơng pháp phổ

Phổ hồng ngoại FT-IR đƣợc đo dƣới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT-

410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức).

Phổ khối ESI- MS và HRESI-MS lần lƣợt đƣợc ghi trên máy Agilent 1100

LC – MSD Trap và FT-ICR-MS Varian 7 Tesla.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR (1D, 2D-NMR) đƣợc ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz cho 1H-NMR với TMS làm chất nội chuẩn và 125 MHz cho 13C-

NMR với tín hiệu dung môi làm chất chuẩn nội.

HPLC đƣợc ghi trên máy Alliance series 2695, detector PDA 2996 của hãng

Waters, USA, Chƣơng trình dung môi gradient với pha động A là H2O + 0,1% formic acid và pha động B là acetonitril, lƣu lƣợng 1mL/phút, Detector PDA, λ =

205 nm.

Các thiết bị nêu trên đặt tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

2.3. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ

Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ đã đƣợc sử dụng bao gồm:

Acetyl hóa asiatic acid hoặc madecassic acid với acetic anhydride và

pyridine khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ.

Nhóm –COOH đƣợc hoạt hóa thành acid chloride bởi phản ứng với oxalyl

chloride trong dung môi DCM khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Amide hóa acid chlorid bằng cách thêm các amin tƣơng ứng và triethylamine

(TEA) làm xúc tác, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ.

Acetyl hóa các nhóm chức –NH2, -OH của các amide thu đƣợc bằng acetyl

chloride (AcCl), DMAP.

Thủy phân để loại bỏ các nhóm chức acetyl bằng KOH 4% trong MeOH.

Tạo acetonide ở vị trí 3-OH và 23-OH của asiatic acid bằng phản ứng với

2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O trong DMF để bảo vệ nhóm 3-OH và 23-OH, sau đó thực hiện các phản ứng este hóa ở nhóm 2-OH, loại bỏ nhóm bảo vệ ở vị trí 3-OH và 23-OH bằng phản ứng thủy phân trong acid HCl ở 90 oC.

2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro

Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp MTT (3-(4,5-

dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium) đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi tác

giả Tim Mosman, 1983 [111,112,113]. Đây là phƣơng pháp đánh giá khả năng sống

sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan

(màu tím đen) bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể. Sản phẩm

formazan đƣợc hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bƣớc sóng 540 nm.

Giá trị OD phản ánh số lƣợng tế bào sống. Nếu chất thử có hoạt tính gây độc tế bào

thì số lƣợng tế bào sống giảm và giá trị OD giảm. Giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào). Phép thử đƣợc thực hiện tại

Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học.

Các dòng tế bào đƣợc thử nghiệm có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn

Hoa kỳ (ATCC) gồm các tế bào: ung thƣ biểu mô KB (CCL -17TM), ung thƣ gan

Hep G2 (HB - 8065TM), ung thƣ phổi LU-1 (HTB - 57TM), ung thƣ vú MCF-7

(HTB - 22TM) và ung thƣ da SK-Mel 2 (HTB - 68TM).

2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm

Hoạt tính bảo vệ gan đƣợc thử nghiệm (in vivo) tại Phòng thí nghiệm thử

hoạt tính Sinh học (Viện Hóa học) kết hợp với Phòng thử nghiệm Sinh học (Viện

Công nghệ Sinh học) theo mô hình chuột BALB/c gây độc gan bằng paracetamol

thông qua việc nghiên cứu sự thay đổi của các chỉ số AST và ALT của các enzyme

chức năng gan, khối lƣợng gan, và hàm lƣợng MDA (malon dialdehyde) trong gan

[114].

2.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng

hợp đƣợc trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử)

Sirtuin 1 (SIRT1) đƣợc biết đến là một enzyme deacetylase sirtuin-1, phụ

thuộc NAD thuộc họ sirtuin protein, đƣợc mã hoá bởi gen SIRT1. Sirtuin là họ các

enzyme histone deacetylase (HDACs) thuộc nhóm III. Nhiều nghiên cứu chứng

minh rằng sự biểu hiện quá mức của SIRT1 liên quan đến nhiều bệnh ung thƣ, nhƣ

ung thƣ da, ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ bạch cầu tủy cấp tính và ung

thƣ ruột kết [115, 116]. Vai trò của SIRT1 trong việc gây tăng trƣởng khối u bằng

cách deacetyl hóa đầu cuối C của acid amin Lys382 nằm ở protein p53, qua đó làm

cho các tế bào tránh khỏi quá trình tự chết (apoptosis) do protein p53 gây ra. Do đó,

Cấu trúc 3D của SIRT1

Ngân hàng dữ liệu protein

(PDB): 4I5I

Độ phân giải: 2.50 Å

Tham khảo: [117]

việc ức chế SIRT1 có thể mang lại hiệu quả trong điều trị một số loại ung thƣ.

Enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (gọi tắt là 17β-HSD1)

đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp estrogen hoạt tính estradiol

(E2), bằng cách khử hóa estrone (E1). E2 kích thích và gia tăng tốc độ phát triển

của tế bào ung thƣ vú [118]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng sự biểu hiện quá

mức của 17β-HSD1 có liên quan đến ung thƣ phổi không tế bào nhỏ (NSCLC, non-

small cell lung cancer) [119]. Do đó, sự ức chế hoạt động của enzyme 17β-HSD1 đã

Cấu trúc 3D của 17β-HSD1

PDB: 3KLM

Độ phân giải: 2.50 Å

Tham khảo: [97]

trở thành một phƣơng pháp có tiềm năng trong điều trị các loại ung thƣ khác nhau.

Trong luận án này chúng tôi đã hợp tác với nhóm nghiên cứu của PGS.TS.

Lê Thị Lý để thực hiện các nghiên cứu docking phân tử 20 dẫn xuất của asiatic acid

và 14 dẫn xuất của madecassic acid tổng hợp đƣợc trên hai loại enzyme trên.

Tất cả các thử nghiệm docking phân tử đƣợc tối ƣu hóa ở mức lý thuyết PM3

bằng cách sử dụng gói phần mềm Gaussian 09 [120].

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.8 và 4.9

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Nguyên liệu

3.1.1. Mẫu cây rau má

Mẫu cây rau má Centella asiatica dùng trong nghiên cứu này đƣợc thu hái

tại Sơn Tây (Hà Nội) và tỉnh Nam Định vào tháng tƣ năm 2010, các mẫu rau má

Thành phố Hồ Chí Minh đƣợc thu thập tháng 5 năm 2013. Tên cây do ThS. sinh

học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội xác định tên khoa học. Các tiêu bản CRM1,

CRM2 và CRM3 đƣợc lƣu giữ tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học.

3.1.2. Dung môi, hóa chất

Các loại dung môi dùng để chạy cột, chiết tách và sắc ký lớp mỏng là n-

hexane, ethyl acetate, methanol, dichloromethane,… đƣợc cất lại trƣớc khi sử dụng.

Các hóa chất khác đƣợc sử dụng: H2SO4, CH3COOH, HCl, pyridine... là hóa

chất tinh khiết.

3.2. Phân lập chất

3.2.1. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành

phố Hồ Chí Minh

3.2.1.1. Phân lập các chất

Mẫu cây rau má đƣợc thu hái tại Thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 5 năm

2013. Từ 1,2 kg rau má khô, đƣợc xay nhỏ và ngâm chiết lần một với 5 lít ethanol 90 % ở nhiệt độ 80 oC trong 2 giờ, lọc qua phễu lọc thu đƣợc 3 lít dịch chiết. Bã

đƣợc chiết thêm 2 lần nữa với ethanol (2 lần x 3 lít). Thời gian rút dịch chiết là 2 giờ/lần. Gộp dịch chiết lại, quay cất dung môi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 oC,

thu đƣợc 158 gam cặn chiết EtOH. Cặn này đƣợc chế thêm nƣớc cất. Sau đó chiết

lần lƣợt với n-hexane, dichloromethane và n-butanol. Các dịch chiết đƣợc cất loại

dung môi cho đến khi khô, thu đƣợc 29 gam cặn n-hexane, 33 gam cặn

dichloromethane và 50 gam cặn chiết n-butanol.

Từ 15 gam cặn chiết n-butanol đƣợc tách bằng sắc ký cột silica gel Merck

(cỡ hạt 0,043-0,063 mm), rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH với tỉ lệ MeOH

tăng dần: 95/5, 90/10, 80/20 và 70/30, đã phân lập đƣợc 6 hợp chất ký hiệu là:

stigmasterol (43), β-Sitosterol (44), asiatic acid (1), madecassic acid (10), hỗn

Rau má khô 1200g

RMHCM

Cao chiết

Bã

n- Hexane, 3×5L, 2h/ lần

n-Hexane, 29g

CH2Cl2 , siêu âm 3×4L, 2h/ lần

Bã

Cao chiết CH2Cl2 , 33g

n- BuOH, siêu âm

3×3L, 2h/ lần

Cao chiết

Bã

n-BuOH, 50g

Silica gel CH2Cl2/MeOH 95:5-70:30

hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (144), madecassoside (14).

β-Sitosterol (44)

asiatic acid (1) 185 mg

Madecassoside (14)

stigmasterol (43)

madecassi c acid (10) 168 mg

Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β- sitosterol glucoside (144)

Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban] thu

hái tại Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.1.2. Các số liệu phổ của các chất phân lập đƣợc

 Stigmasterol (43)

Đƣợc phân lập dƣới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 169-171oC. Phổ IR (KBr) *max (cm-1): 3436,12 (OH); 2936,49; 2872,25; (CH2, CH3); 1060,12 (C-OH); 1464,52; 1377,67. Phổ khối ESI-MS ion dƣơng m/z 395 (100, [M+1-H2O]+). 1H-

NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,70 (3H, s, H-18), 0,79 (3H, d, J = 6,4

Hz, H-26), 0,80 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29), 0,84 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,01 (3H,

s, H-19), 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-21), 3,51 (1H, m, H-3α), 5,02 (1H, dd, J = 4,5,

9,0 Hz, H-22), 5,16 (1H, dd, J = 8,6, 15,2 Hz, H-23), 5,35 (d, J = 5,4 Hz, H-6). 13C-

NMR (CD3Cl, 125 MHz)  (ppm): 140,8, 138,3, 129,3, 121,7, 71,8, 56,9, 56,0,

51,3, 50,2, 42,4, 42,3, 40,5, 39,7, 37,3, 36,6, 31,9, 31,9, 31,9, 31,7, 28,9 , 25,4, 25,4,

21,1, 21,1, 19,4, 19,0, 19,0, 12,2, 12,2.

 β-Sitosterol (44)

Tinh thể, màu trắng, Mp = 134-135 oC. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 5,35 (1H, m, H-6), 3,52 (1H, m, H-3α), 1,01 (3H, s, CH3-19), 0,91 (3H, t, J = 6,4 Hz, CH3-29), 0,85 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-21), 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-26), 0,77 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-27), 0,68 (3H, s, CH3-18).

 Asiatic acid (1)

Chất rắn, màu trắng, Mp = 222-224 oC. IR (KBr) ν* (cm-1): 1003, 1459, 1690 (-COOH), 2866, 2930 (CH2, CH3), 3411 (-OH). ESI-MS m/z: 487 [M-H]-. 1H-NMR

(CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,72 (3H, s), 0,87 (3H, s), 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz),

0,99 (3H, br s), 1,07 (3H, s), 1,16 (3H, s), 2,23 (1H, d, J =11,5 Hz, H-18), 3,29 (1H,

d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 3,52 ( 1H, d, J = 11,0 Hz, H- 23b), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), 5,26 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR

(CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 181,63 (C-28), 139,81 (C-12), 126,66 (C-11), 78,17

(C-3), 69,68 (C-2), 66,31 (C-23), 54,34 (C-18), 48,16, 48,03, 44,18, 43,38, 40,79,

40,40, 38,97, 38,10, 33,63, 31,76, 29,15, 25,30, 24,46, 24,15, 21,58, 19,06, 17,85,

17,67, 13,93.

 Madecassic acid (10)

Chất rắn, màu trắng. Mp = 240-243 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1049, 1236, 1742, 2944, 3539. (+) ESI-MS m/z: 505 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, br s), 1,08 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,12 (3H,

s), 1,39 (3H, s), 2,24 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,31 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-3),

3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,76 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), 5,31 (1H, t, J = 4,5 Hz, H-12). 13C-NMR

(CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 181,64 (C-28), 139,08 (C-13), 127,00 (C-12), 78,14

(C-3), 69,68 (C-2), 68,45 (C-6), 65,86 (C-23), 54,42 (C-18), 50,08, 44,77, 43,82,

41,29, 40,40, 39,96, 38,97, 38,13, 31,79, 31,62, 29,15, 26,50, 25,33, 24,45, 24,20,

23,98, 21,59, 19,19, 19,09, 18,79, 17,65, 15,26.

 Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (144)

Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 5,47 (1H, br s), 5,04 (d, J = 4,5 Hz), 5,01 (1H, d, J = 4,0 Hz), 4,58 (1H, t, J = 6,0 Hz), 4,35 (1H, d, J = 8,0 Hz),

3,76-3,80 (1H, dd, J = 5,0, 10,5 Hz), 3,55-3,61 (1H, m), 3,24-3,28 (1H, m), 3,18

(1H, d, J = 4,5 Hz), 3,14-3,16 (1H, m), 3,03-3,04 (1H, m), 1,15 (3H, d, J = 10,0 Hz,

CH3), 1,11 (3H, s, CH3), 1,04 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3), 0,90-0,96 (6H, 2 x CH3), 0,80 (3H, d, J = 10,0 Hz, CH3).

 Madecassoside (14)

Phổ ESI-MS ion dƣơng: m/z 975 [M+H]+, C48H78O20. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 5,32 (1H, d, J = 8,0 Hz), 5,27 (1H, br s), 4,87 (1H, s),

4,40 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,10 (1H, d, J = 11,0 Hz), 3,99 (1H, m), 2,26 (1H, d, J =

11,0 Hz), 1,29 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,15 (3H, s), 1,08 (3H, s), 0,99 (3H, br s), 0,92 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,86 (3H, s), 0,72 (3H, s). Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 177,95, 139,32, 126,92, 104,44, 102,83, 95,79, 79,50, 78,22, 78,14, 77,84,

76,81, 76,81, 76,67, 75,24, 73,73, 73,73, 72,39, 72,21, 70,98, 70,62, 69,64, 69,64,

66,37, 61,89, 54,06, 49,85, 48,20, 44,10, 43,38, 40,94, 40,37, 40,20, 38,97, 37,58,

33,58, 31,68, 29,26, 25,22, 24,51, 24,01, 21,57, 19,08, 18,06, 17,92, 17,84, 17,65,

13,96.

3.2.2. Nghiên cứu định lƣợng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ

Để lựa chọn mẫu cây rau má có hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid

tổng cao chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu định lƣợng các thành phần trên bằng

phƣơng pháp HPLC và phƣơng pháp sắc ký cột để so sánh. Thực nghiệm đƣợc tiến

hành trên ba mẫu cây rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), Nam Định và Thành phố Hồ

Chí Minh.

3.2.2.1. Xác định hàm lƣợng asiatic acid bằng phƣơng pháp HPLC

 Xây dựng đƣờng chuẩn

Asiatic acid chuẩn (Merck) đƣợc cân chính xác 25 mg cho vào bình định

mức (25 ml) sau đó thêm MeOH để có một dung dịch mẫu với nồng độ 1mg/mL.

Các dung dịch có nồng độ 0,05, 0,1, 0,3, 0,5 và 0,7 mg/ L đƣợc điều chế từ dung

dịch mẫu. Các dung dịch chuẩn bị sẽ đƣợc đƣa ra cho HPLC với cột Sunfire-C18Rp

(4,6 x 150 mm), 5μm. Các kết quả trong Bảng 3.1 là trung bình của ba phép đo.

Bảng 3. 1. Giá trị HPLC của asiatic acid

Số thứ Nồng độ Diện tích pic Thời gian Diện tích pic tự (mg/mL) lý thuyết lƣu (phút)

1 0,05 455177 468410 19,7

2 0,1 969416 996956 19,7

3 0,3 3150939 3111139 19,7

4 0,5 5271350 5225322 19,7

5 0,7 7294451 7339505 19,7

Từ kết quả bảng 3.1, dựa vào phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu (phƣơng

pháp hồi qui tuyến tính một lớp) để xác định các tham số của phƣơng trình hồi qui

(y = ax + b). Nguyên tắc chung của phƣơng pháp này là từ đám mây điểm thực

nghiệm chọn đƣờng hồi qui lý thuyết sao cho tổng bình phƣơng các hiệu sai từ các

trị số quan sát mẫu yi so với trị số lý thuyết của phƣơng trình hồi qui là bé nhất.

Kết quả phân tích phƣơng sai cho thấy hệ số tƣơng quan R = 0,99989992

Phƣơng trình hồi qui tuyến tính đƣợc xác định là :

Y = 10570916. xi - 60136

Xi – nồng độ chất phân tích

Y - diện tích pic

Hình 3. 1. Đƣờng chuẩn asiatic acid

Nhƣ vậy, với sự ổn định của việc lặp lại các lần đo cộng thêm sự tƣơng quan

chặt chẽ giữa nồng độ asiatic acid và diện tích pic thu đƣợc trên phổ HPLC, phƣơng

pháp này tối ƣu cho việc phân tích định lƣợng asiatic acid trong các mẫu nghiên cứu.

 Mẫu đo

Các mẫu rau má tại Sơn Tây, Nam Định, và thành phố Hồ Chí Minh do ông

Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, VAST, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội thu thập.

Mẫu rau má (200 gam) đƣợc sấy khô ở nhiệt độ phòng và đƣợc chiết xuất ba lần với hỗn hợp EtOH/H2O 80:20 (mỗi lần 2 giờ) ở 80 oC. Sau khi lọc và cô quay dung

môi, cặn này đƣợc hòa tan trong 200 mL H2O/MeOH 80:20 và đƣợc chiết xuất với

n-hexane để loại bỏ tinh dầu và chất màu. Sau đó, đƣợc thủy phân bằng NaOH 20% ở 80 oC trong 2 giờ, để nguội, chiết với EtOAc để loại các tạp chất. Sau đó cặn đƣợc

trung hòa với HCl đến pH = 3-4 sẽ có kết tủa. Kết tủa đƣợc lọc qua phễu, rửa sạch

bằng H2O và sấy khô đƣợc sản phẩm thô. Chất này đƣợc dùng để sắc ký cột và để

xác định hàm lƣợng HPLC của asiatic acid và madecassic acid.

3.2.2.2. Xác định hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột

Cặn thu đƣợc sau khi thủy phân với NaOH đƣợc cho vào sắc ký trên cột

silica gel, rửa giải bằng dung môi CH2Cl2/MeOH 95: 5 → 90:10 để tách asiatic acid

và madecassic acid.

3.2.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả

thu hồi asiatic acid và madecassic acid

Chúng tôi đã khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ, nồng độ dung môi, thời gian

chiết đến hiệu suất thu hồi asiatic acid và madecassic acid từ mẫu rau má.

3.2.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ

Từ mẫu rau má Centella asiatica (80 gam) khô, nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết

3 lần trong bình cầu 500 ml có sinh hàn hồi lƣu với EtOH/H2O (80%) ở ba nhiệt độ khác nhau (60, 70 và 80 oC). Sau khi lọc, dung môi đƣợc cất loại trên bộ quay cất

chân không dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn. Cặn này đƣợc hòa trong H2O/ MeOH

(80/20) và đƣợc chiết với n-hexane để loại tinh dầu và chất màu. Sau đó đƣợc thủy phân bằng NaOH 20% ở 80 oC trong thời gian là 2 giờ, để nguội, chiết với EtOAc

để loại các tạp chất. Sau đó dịch cặn lại đƣợc trung hòa với HCl đến pH = 3-4 sẽ có

kết tủa. Kết tủa đƣợc lọc qua phễu, rửa với H2O, sấy khô thu đƣợc sản phẩm thô và

sản phẩm thô đƣợc tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH với tỉ lệ MeOH tăng dần: 95/5 và 90/10, đã phân lập đƣợc 2

triterpene chính: asiatic acid và madecassic acid. Khối lƣợng của các chất thu đƣợc

đƣợc trình bày trên Bảng 3.2.

Bảng 3. 2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết.

Lƣợng mẫu Nồng độ asiatic acid madecassic acid

Nhiệt độ (oC) (g) EtOH (%) (g) (g)

60 80 80 0,297 (0,37%) 0,448 (0,56%)

70 80 80 0,298 (0,37%) 0,449 (0,56%)

80 80 80 0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%)

3.2.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn

Nghiên cứu chiết mẫu rau má với ba nồng độ cồn là 70, 80 và 90% ở 80 oC.

Mẫu rau má (80 gam) khô, nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết 3 lần trong bình cầu 500 ml

có sinh hàn hồi lƣu với 3 nồng độ dung môi khác nhau (EtOH/H2O: 70, 80 và 90%) ở nhiệt độ 80 oC. Sau khi lọc, dung môi đƣợc cất loại trên bộ quay cất chân không

dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn. Cặn này đƣợc hòa trong H2O/ MeOH = 80/20 và

đƣợc chiết với n-hexane để loại tinh dầu và chất màu. Sau đó đƣợc thủy phân bằng NaOH 20% ở 80 oC trong thời gian là 2 giờ, để nguội, chiết với EtOAc để loại các

chất tạp chất. Sau đó dịch cặn lại đƣợc trung hòa với HCl đến pH = 3-4 sẽ có kết

tủa. Kết tủa đƣợc lọc qua phễu, rửa với H2O, sấy khô thu đƣợc sản phẩm thô và

đƣợc tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH với

tỉ lệ MeOH tăng dần: 95/ 5 và 90/10 kết quả thể hiện trên Bảng 3.3.

Bảng 3. 3. Ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic

acid và madecassic acid

Nồng độ Lƣợng Cặn chiết Cặn thô sau asiatic acid madecassic acid EtOH mẫu (g) (g) thủy phân (g) trong mẫu (g) (g) (%)

80 70 13,95 0,310 (0,39%) 0,465 (0,58%) 1,12

80 80 13,21 0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%) 1,36

80 90 11,05 0,262 (0,32%) 0,390 (0,48%) 0,98

3.2.3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết

Sau khi chọn đƣợc nồng độ dung môi chiết tốt nhất là ethanol/nƣớc 80% và nhiệt độ chiết là 80 oC. Chúng tôi khảo sát ba khoảng thời gian chiết là: 1 giờ, 2 giờ

và 3 giờ. Mẫu rau má (80 gam) khô, nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết 3 lần trong bình

cầu 500 ml có sinh hàn hồi lƣu với EtOH/H2O (80%) ở khoảng thời gian chiết khác nhau: 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ với nhiệt độ 80 oC. Sau khi lọc, dung môi đƣợc cất loại

trên bộ quay cất chân không dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn. Cặn này đƣợc hòa

trong H2O/ MeOH = 80/20 và đƣợc chiết với n-hexane để loại tinh dầu và chất màu. Sau đó đƣợc thủy phân bằng NaOH 20% ở 80 oC trong thời gian là 2 giờ, để nguội,

chiết với EtOAc để loại các chất tạp chất. Sau đó dịch cặn lại đƣợc trung hòa với

HCl đến pH = 3-4 sẽ có kết tủa. Kết tủa đƣợc lọc qua phễu, rửa với H2O, sấy khô

thu đƣợc sản phẩm thô và đƣợc tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ

dung môi CH2Cl2/MeOH với tỉ lệ MeOH tăng dần: 95/ 5 và 90/10, kết quả thể hiện

trên Bảng 3.4.

Bảng 3. 4. Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô

Nồng độ Thời gian Lƣợng mẫu K.L (g) K.L (g) K.L (g) Tổng cặn EtOH chiết Lần 1 Lần 2 Lần 3 chiết (g) (g) (%) (giờ)

80 1 5,41 3,64 1,31 10,36 80

80 2 8,45 4,25 0,51 13,21 80

80 3 8,51 4,26 0,47 13,24 80

3.2.4. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella

asiatica (L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất

Mẫu rau má đƣợc phơi khô trong bóng râm, hoặc sấy ở 45 oC trong tủ sấy, để

nguội, xay nhỏ và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau nhƣ n-hexane,

dichloromethane, methanol và n-butanol.

Cây rau má sau khi đã sấy khô và xay nhỏ đƣợc cân chính xác và chiết với

các dung môi có độ phân cực khác nhau theo hai cách:

Cách thứ nhất: Ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng. Rút dịch chiết và

thêm dung môi mới 3 lần, mỗi lần ngâm từ 2 - 4 giờ. Cất loại dung môi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ 45 oC (bằng máy quay cất chân không). Cặn thu đƣợc đƣợc chế 44

thêm nƣớc cất. Sau đó chiết lần lƣợt với n-hexane, dichloromethane. Các dịch chiết

đƣợc cất loại dung môi cho đến khi khô sẽ thu đƣợc các dịch chiết tƣơng ứng để

nghiên cứu tiếp.

Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô đƣợc chiết lần lƣợt với các loại dung môi n-

hexane, dichloromethane và methanol ở nhiệt độ phòng. Với mỗi loại dung môi

đƣợc rút dịch chiết và thêm dung môi mới ba lần. Mỗi lần ngâm ba tiếng, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ 45 oC cho tới khô (sử dụng máy quay cất

chân không) sẽ thu đƣợc các cặn dịch chiết tƣơng ứng để nghiên cứu tiếp.

Các cặn dịch chiết trong các dung môi khác nhau thu đƣợc đƣợc tách và tinh

chế bằng phƣơng pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp.

Sắc kí cột (SKC) gồm sắc kí cột thƣờng và sắc kí cột nhanh (flash chromatography)

sử dụng silica gel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH20 hoặc

pha đảo RP18. Trƣờng hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng

phƣơng pháp kết tinh phân đoạn để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các

chất cũng nhƣ kiểm tra quá trình chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) với nhiều

hệ dung môi khác nhau để xác định Rf tối ƣu (Rf = 0,4-0,6).

Rau má tƣơi (8 kg) đƣợc sấy ở 45 oC, thu đƣợc 900 gam khô, xay nhỏ và ngâm chiết lần một với 2,5 lít MeOH ở nhiệt độ 80 oC trong 2 giờ, lọc qua phễu lọc

thu đƣợc 1,5 lít dịch chiết. Bã đƣợc chiết thêm 2 lần nữa với MeOH (2 lần x 1,5 lít).

Thời gian rút dịch chiết là 2 tiếng/lần. Gộp dịch lại, quay cất dung môi dƣới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 oC, thu đƣợc 120 gam cặn MeOH. Cặn chiết MeOH thu đƣợc

đƣợc chế thêm nƣớc cất. Sau đó chiết lần lƣợt với n-hexane, dichloromethane và

dịch nƣớc. Các dịch chiết đƣợc cất loại dung môi cho đến khi khô sẽ thu đƣợc các

dịch chiết tƣơng ứng 20 gam cặn n-hexane, 25 gam cặn dichloromethane và 35 gam

cao dịch chiết nƣớc.

Cặn dịch chiết nƣớc (35 gam) đƣợc hòa tan trong 300ml MeOH, sau đó cho 300 ml dung dịch NaOH 10% và đƣợc đun nóng ở 80 oC trong 2 giờ, dung dịch đƣợc làm lạnh xuống 10 oC bằng nƣớc đá. Sau đó đƣợc trung hòa bằng acid HCl

5% đến pH = 4, lọc kết tủa qua phễu lọc hút chân không, sấy khô thu đƣợc 12,5

gam chất rắn.

Phần dịch chiết methanol đƣợc khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng silica gel

Merck 60 F254 dày 0,25 mm tráng sẵn trên nền nhôm và thuốc hiện là CeSO4. Sau

khi thử nghiệm với các hệ dung môi khác nhau để tìm hệ dung môi thích hợp cho

sắc ký cột, đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là CH2Cl2/MeOH.

Cặn dịch chiết MeOH (12,5 gam) đƣợc hòa tan vừa đủ bằng MeOH và trộn

với 22 gam silica gel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất

hấp phụ đều trên silica gel. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này đƣợc sử dụng để đƣa

lên cột sắc ký.

Silica gel Merck (cỡ hạt 0,043- 0,063 mm, 400 gam) đƣợc nhồi vào cột sắc

ký có kích thƣớc 3,5 cm x 90 cm theo phƣơng pháp nhồi ƣớt với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH = 95/5. Sau khi cột đƣợc nén bằng máy nén khí đã tƣơng đối ổn

định, bột silica gel tẩm dịch chiết đƣợc đƣa lên cột, và giải hấp với hệ dung môi rửa

giải là CH2Cl2/MeOH có độ phân cực tăng dần. Quá trình rửa giải chúng tôi thu

đƣợc 150 phân đoạn khác nhau, mỗi phân đoạn là 15 ml.

150 phân đoạn này đƣợc kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng và gộp thành 5

nhóm (F1-F5) theo kết quả kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng nhƣ sau.

F1 = (1-20) F4 = (73-126)

F2 = (21-40) F5 = (127-150)

F3 = (65-72)

Nhóm F1 bao gồm phân đoạn từ 1-20 đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất

giảm, thu đƣợc 185 mg, gồm hỗn hợp nhiều tạp chất vì thế nên chúng tôi không tinh

chế phân đoạn.

Nhóm F2 bao gồm phân đoạn từ 21-65 đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất

giảm, thu đƣợc 4,6 gam cặn và đƣợc tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột nhanh,

hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH = 90/10, cất loại dung môi, kết tinh trong

CH2Cl2/MeOH, thu đƣợc 3,4 gam (0,37%) chất sạch là asiatic acid.

Nhóm F3, F4 bao gồm phân đoạn từ 66-126 đƣợc cất loại dung môi dƣới áp

suất giảm, thu đƣợc 4,1gam cặn và đƣợc tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột

nhanh, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH = 90/10. Cất loại dung môi, kết tinh

trong CH2Cl2/MeOH, thu đƣợc 3,04 gam (0,337%) chất sạch là madecassic acid.

Nhóm F5 bao gồm phân đoạn từ 127-150 đƣợc cất loại dung môi dƣới áp

suất giảm, thu đƣợc 1,4 gam cặn gồm hỗn hợp nhiều chất.

Từ sản phẩm thuỷ phân của dịch chiết MeOH của cây rau má đã phân lập

đƣợc 2 triterpene chính là asiatic acid và madecassic acid với hàm lƣợng cao dùng

để điều chế các dẫn xuất của chúng.

3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid

3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid

 Tổng hợp chất 145: 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oic acid

Asiatic acid (1) (1,464 mg, 3 mmol) trong pyridine (10 mL) đƣợc thêm acetic

anhydride (10 mL). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 12 h, rồi đƣợc

pha loãng với ethyl acetate (40 mL) và trung hòa với HCl (1N) đến pH = 6, dung

dịch NaHCO3 (10%) và nƣớc muối bão hòa, và làm khan với Na2SO4. Dung môi

đƣợc cất loại và tinh chế qua cột silica gel (n-hexane/ethyl acetate, 2/1) thu đƣợc hợp chất (145) là chất rắn, màu trắng (1,474 mg, 80%), Mp = 160-163 oC. IR (KBr) ν* (cm-1): 1041, 1237 (-CO-acetate), 1698 (-COOH), 1746 (-CO- este), 2875, 2953 (CH2, CH3). ESI-MS m/z: 555 [M+1-CH3COOH]+ , 495 [M+1-2CH3COOH]+. 1H-

NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,69 (3H, s), 0,78 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,81 (3H,

s), 0,86 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,00 (3H, s), 1,03 (3H, s), 1,92 (3H, s, -CH3-CO), 1,96

(3H, s, -CH3-CO), 2,02 (3H, s, -CH3-CO), 2,12 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,51

(1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,78 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,09 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2), 5,17 (1H, t-like, H-12). 13C-NMR

(CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 183,68 (C-28), 170,83 (CH3CO-), 170,48 (CH3CO-),

170,37 (CH3CO-), 138,01 (C-12), 125,18 (C-12), 74,77 (C-3), 69,88 (C-2), 65,21

(C-23), 52,40 (C-18), 47,86, 47,52, 47,44, 43,67, 41,86, 39,44, 38,93, 38,73, 37,75,

36,58, 32,36, 31,87, 30,52, 29,64, 29,30, 27,82, 23,90, 23,39, 23,27, 22,64, 21,17,

21,04, 17,50, 16,88, 14,08, 13,86.

Quy trình chung tổng hợp 2,3,23-triacetylasiatic-28-amide (hợp chất

147-156)

A

A -NH(CH2)7NH2

A -N(CH2CH2OH)2

150

147

153

156 A

A -NH(CH2)9NH2

-NHNH2

-NHNHCH3

151

148

154 A

A -NH(CH2)10NH2

A -NHCH(CH3)2

152

149

155

Từ acid 145 (307 mg, 0,5 mmol) hoà tan trong CH2Cl2 (15 mL) khan đƣợc

thêm nhỏ giọt oxalyl chloride (0,25 ml, 3 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở

nhiệt độ phòng 24 giờ. Sau đó, CH2Cl2 và oxalyl chloride dƣ đƣợc cất loại bỏ, chất

rắn còn lại đƣợc hoà tan trong CH2Cl2 (20 mL) và thêm nhỏ giọt triethylamine (3

mmol) và hợp chất amine (1,2 mmol). Phản ứng khuấy ở nhiệt độ phòng 20 giờ, rồi

đƣợc rửa với HCl loãng và H2O, làm khan bằng Na2SO4. Dung môi đƣợc cất loại và

chất rắn đƣợc tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc thu đƣợc

các sản phẩm sạch (147-156).

147: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine. Chất rắn, màu trắng, (261 mg, 68%), Mp = 122-127 °C, ESI-MS m/z (%): 727 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,85 (3H, s), 0,94 (6H, br s), 0,99 (3H, d, J

= 5,5 Hz), 1,16 (3H, s), 1,71 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,17

(1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-1‟), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz,

2H-7‟), 3,66 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,86 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,05

(1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,20 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t-like, H- 12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,00 (C-28), 172,43, 172,21 (2C),

140,26 (C-13), 126,47 (C-12), 76,30 (C-3), 71,04 (C-2), 66,04 (C-23), 54,11 (C-18),

44,79, 43,34, 43,21, 40,97, 40,93 (2C), 40,80, 40,58, 40,27, 39,02, 38,78, 33,59,

31,89, 30,70, 30,24, 29,93, 29,22, 28,90, 27,96, 27,49, 25,11, 24,40, 23,99, 21,56

(C2), 20,97, 20,75, 20,72 (2C), 18,93, 17,94, 17,72, 17,49, 14,25.

148: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine. Chất rắn, màu trắng, Mp = 115-119 °C, (245 mg, 74%). ESI-MS m/z (%): 755 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,84 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,94 (3H, d, J =

6,0 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,16 (3H, s), 1,17 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,04 (3H,

s), 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,17 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,94 (2H, t, J = 7,5

Hz, 2H-1‟), 3,12-3,14 (2H, m, 2H-9‟), 3,66 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,87 (1H,

d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,06 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,18 (1H, dt, J = 3,5, 10,5 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm):

180,01 (C-28), 172,48, 172,33, 172,24, 140,36 (C-13), 132,40 (C-12), 76,28 (C-3),

71,12 (C-2), 66,25 (C-23), 54,19 (C-18), 44,78, 43,37, 43,23, 40,96, 40,85, 40,69,

40,27, 40,18, 39,05, 38,77, 33,60, 31,89, 30,56, 30,41, 30,34, 30,23, 30,13, 28,91,

28,72, 28,27, 27,51, 25,13, 24,96, 24,43, 23,98, 21,55, 20,99, 20,74, 20,71, 18,94,

17,99, 17,70, 17,54, 14,38, 14,24.

149: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine. Chất rắn, màu trắng, (238 mg, 62%). ESI-MS m/z (%): 769 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500

MHz)  (ppm): 0,85 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J =

6,0 Hz), 1,16 (3H, s), 1,17 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,17 (1H,

d, J = 11,0 Hz, H-18), 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1‟), 3,14-3,11 (2H, m, 2H-10‟),

3,66 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,87 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,06 (1H, d, J =

10,5 Hz, H-3), 5,20 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 179,98 (C-28), 172,43, 172,26, 172,19,

140,36 (C-13), 126,46 (C-12), 76,30 (C-3), 71,07 (C-2), 66,09 (C-23), 54,19 (C-18),

44,82, 43,38, 43,23, 41,09, 40,96, 40,84, 40,73, 40,27, 39,05, 38,76, 33,61, 31,90,

30,68, 30,52, 30,50, 30,44, 30,33, 29,46, 28,52, 28,29, 27,56, 26,19, 25,14, 24,43,

23,98, 23,66, 21,55, 20,97, 20,74, 20,71, 18,94, 18,01, 17,71, 17,54, 14,40, 14,26.

150: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol.

(272 mg, 81%), chất rắn, màu trắng, Mp = 121-123 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1037, 1237 (-CO- acetate), 1629, 1740, 2867, 2923, 3381. ESI-MS m/z: 672 [M+H]+. 1H-NMR

(CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,79 (3H, s), 0,86 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,89 (3H, s),

0,96 (3H, br s), 1,10 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,08 (3H, s),

3,11-3,16 (1H, m, H-1‟a), 3,53-3,63 (3H, m, H-1‟b, 2H-3‟), 3,59 (1H, d, J = 12,0

Hz, H-23a), 3,84 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,08 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 5,16

(1H, dt, J = 4,5, 10,0 Hz, H-2), 5,32 (1H, t-like, H-12), 6,18 (1H, t, J = 5,5 Hz, - NH-amide). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 179,42 (C-28), 170,73,

170,42, 170,30, 139,76 (C-13), 125,16 (C-12), 74,77 (C-3), 69,86 (C-2), 65,25 (C-

23), 59,26 (C-3‟), 53,72 (C-18), 47,81, 47,57, 47,49, 43,76, 42,45, 41,90, 39,71,

39,58, 39,01, 37,74, 37,45, 36,09, 32,41, 32,21, 30,80, 27,72, 24,72, 23,42, 23,13,

21,15, 21,00, 20,78, 20,70, 17,83, 17,15, 17,00, 16,81, 13,85.

151: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-hydrazide. IR (KBr) ν* (cm-1): 1043, 1235 (-CO-acetate), 1377, 1476, 1742 (acetate), 2929, 3418 (-NH2). ESI-MS m/z: 629 [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,77 (3H, s),

0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,89 (3H, s), 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,05 (3H, s), 1,08

(3H, s), 1,98 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,09 (3H, s), 2,24 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-18),

3,58 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,86 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,09 (1H, d, J =

10,5 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,25 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 177,38 (C-28), 170,81, 170,40, 170,33,

138,31 (C-13), 124,96 (C-12), 74,87 (C-3), 69,91 (C-2), 65,29 (C-23), 52,82 (C-18),

47,82, 47,62, 47,51, 43,79, 42,06, 41,89, 39,60, 39,05, 38,83, 37,78, 36,56, 32,55,

30,65, 29,66, 29,33, 27,87, 24,08, 23,37, 23,32, 22,66, 21,15, 21,04, 20,83, 17,89,

17,02, 16,94, 14,20, 14,08, 13,90.

152: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-glycine ethyl ester. Chất rắn, màu trắng (300 mg, 86%), Mp = 115–118 °C, ESI-MS m/z: 700 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,72 (3H, s), 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,86

(3H, s), 0,96 (3H, br s), 1,09 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,29 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-2‟‟),

1,98 (3H, s), 2,02 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,58 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,84 (1H,

d, J = 12,0 Hz, H-23b), 3,83 (1H, dd, J = 4,0, 18,5 Hz, H-1‟a), 4,05 (1H, dd, J = 5,0,

18,5 Hz, H-1‟b), 4,21 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1‟‟), 5,08 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3),

5,15 (1H, dt, J = 5,0, 11,0 Hz, H-2), 5,41 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-12), 6,48 (1H, t, J = 4,0 Hz, -NH-amide). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 170,47 (3AcO),

139,21 (C-13), 125,78 (C-12), 74,83 (C-3), 69,89 (C-2), 65,29 (C-23), 61,48 (C-

1‟‟), 53,68 (C-18), 47,72, 47,64, 43,79, 42,34, 41,93, 41,74, 39,69, 39,61, 39,01,

37,76, 36,96, 32,22, 30,90, 30,81, 27,74, 24,80, 23,48, 23,25, 21,18, 21,06, 20,85,

20,76 (2C), 17,87, 17,13 (2C), 17,05, 16,43, 14,15, 13,89.

153: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-imidazol. Chất rắn, màu trắng, (279 mg, 84%), ESI-MS m/z (%): 665,4 (64) [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500

MHz)  (ppm): 0,70 (3H, s), 0,89 (3H, s), 0,91 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,01 (3H, d, J =

6,0 Hz), 1,09 (3H, s), 1,12 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,46 (1H,

d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,59 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,82 (1H, d, J = 11,5 Hz,

H-23b), 5,06 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2), 5,25 (1H, br s, H-12), 7,03 (1H, s, H-2‟), 7,54 (1H, s, H-1‟), 8,26 (1H, s, H-3‟). 13C-

NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 174,67 (C-28), 170,82, 170,43, 170,40, 137,14

(C-13), 137,08 (C-3‟), 129,74 (C-1‟), 126,16 (C-12), 117,94 (C-2‟), 74,85 (C-3),

69,88 (C-2), 65,33 (C-23), 54,18 (C-18), 47,56 (2C), 43,82, 41,16, 41,93, 39,52,

39,29, 38,72, 37,78 (2C), 35,58, 32,36, 30,41, 27,71, 25,02, 23,48, 23,41, 21,07,

21,04, 20,87, 20,78, 17,82, 17,06 (2C), 16,77, 13,91.

154: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-methylhydrazide. Chất

rắn, màu nâu (218 mg, 68%). Mp = 121-125 °C, ESI-MS m/z (%): 643,4 (70) [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,75 (3H, s), 0,86 (3H, d, J = 6,0

Hz), 0,89 (3H, s), 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,98 (3H, s),

2,02 (3H, s), 2,09 (3H, s), 3,17 (3H, s, -NH-CH3), 3,57 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a),

3,86 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,12 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3), 4,36 (0,5H,

q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3), 5,08 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,0, 10,5

Hz, H-2), 5,22 (1H, t-like, H-12).

155: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-isopropyl. (242 mg, 74%), Chất rắn, màu trắng, Mp = 252-253 °C. ESI-MS m/z (%): 678 (91) [M+Na]+. IR (KBr) ν* (cm-1): 1042, 1232, 1639, 1739, 2923, 3412. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)

 (ppm): 0,76 (3H, s), 0,84 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,88 (3H, s), 1,09 (3H, d, J = 6,5

Hz), 1,10 (3H, s), 1,12 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,94 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,02 (3H, s),

3,65 (1H, d, J = 12,5 Hz, H-23a), 3,79 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 3,92 (1H, hept,

J = 7,0 Hz, H-1‟), 4,93 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 10,5 Hz, H-2), 5,49 (1H, br s, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 176,56 (C-28),

170,32, 170,25, 169,91, 138,72 (C-13), 124,91 (C-12), 74,30 (C-3), 69,41 (C-2),

65,02 (C-23), 54,01 (C-18), 47,68, 47,42, 46,43, 45,78, 43,09, 41,19, 39,52, 39,65,

38,97, 37,38, 34,58, 31,48, 30,65, 28,98, 27,68, 27,12, 25,45, 24,34, 23,49, 23,01,

22,84, 22,55, 21,59, 20,93, 20,74, 17,02, 14,56, 14,54, 13,92.

156: N,N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol. Chất rắn, màu trắng, (266mg, 76%), Mp = 221-223 °C, ESI-MS m/z (%): 702,5 (81) [M+H]+. IR (KBr) ν* (cm-1): 1049, 1391, 1468, 1605, 1647, 2923, 3356. 1H-NMR (CD3OD,

500 MHz)  (ppm): 0,86 (3H, s), 0,93 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,94 (3H, s), 1,00 (3H,

br s), 1,16 (3H, s), 1,17 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,43 (1H,

d, J = 11,0 Hz), 3,66 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,86 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-

23b), 3,72 (4H, br s, 2H-2‟), 5,04 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,21 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2), 5,24 (1H, br s, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm):

179,00 (C-28), 172,48, 172,27, 172,20, 76,41 (C-3), 71,07 (C-2), 66,28 (C-3),

60,87 (C-2‟), 52,73 (C-18), 44,88, 43,23 (2C), 40,87 (2C), 40,13, 39,07 (2C),

31,64, 24,37 (2C), 21,63 (2C), 20,96 (2C), 20,74 (2C), 20,71 (2C), 18,97, 18,09

(2C), 17,79 (2C), 17,51, 14,24 (2C).

Quy trình chung tổng hợp các amide 157-161

Các amide tƣơng ứng (147-150, 156) (1 equiv.) và DMAP (1 mol%) trong

dung môi DCM (10 mL) đƣợc thêm acetyl chloride (2 equiv.) và CH2Cl2 (20 mL).

Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 2 giờ, sau đó hỗn hợp đƣợc

trung hòa với 10% NaHCO3. Hỗn hợp đƣợc chiết với DCM, dịch chiết đƣợc rửa với

H2O, nƣớc muối và làm khan với Na2SO4. Dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất

đƣợc các sản phẩm sạch 157-161.

thấp, và sản phẩm đƣợc tinh chế trên cột silica gel hệ dung môi n-hexane/EtOAc thu

157

159

161

-NH(CH2)9NHAc

-N(CH2CH2OAc)2

158

160

-NH(CH2)7NHAc

-NH(CH2)10NHAc

157: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propyl acetate. 150

(336 mg, 0,5 mmol) tổng hợp 157 (292 mg, 82%), là chất rắn, màu trắng, Mp = 218-220 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1034, 1238, 1369, 1527, 1632, 1741, 2923, 3381. ESI-MS m/z: 712 [M-H]-. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,76 (3H, s), 0,87

(3H, d, J = 6,5 Hz), 0,89 (3H, s), 0,96 (3H, br s), 1,10 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,98

(3H, s), 2,02 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,09 (1H, m, H-1‟a), 3,39 (1H, m,

H-1‟b), 3,58 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,85 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 4,10

(2H, t, J = 6,0 Hz, H-3‟), 5,08 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,0, 10,5 Hz, H-2), 5,33 (1H, t-like, H-12), 6,05 (1H, t, J = 5,0 Hz, -NH-amide). 13C-NMR

(CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 177,90 (C-28), 171,12, 170,73, 170,40, 170,29, 139,81

(C-13), 125,08 (C-12), 74,81 (C-3), 69,86 (C-2), 65,28 (C-23), 62,05 (C-3‟), 53,82

(C-18), 47,71, 47,60, 47,52, 43,78, 42,71, 41,92, 39,69, 39,60, 39,06, 37,78, 37,33,

36,21, 32,30, 30,20, 29,65, 28,63, 27,76, 24,69, 23,44, 23,17, 22,64, 21,01, 20,92,

20,80, 20,72, 17,87, 17,15, 17,00, 16,92, 13,88.

158: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylacetamide. 147

(360 mg, 0,5 mmol) tổng hợp 158 (306 mg, 82%) là chất rắn, màu nâu. ESI-MS m/z: 769 (72%) [M+H]+. IR (KBr) ν* (cm-1): 1040, 1242, 1541, 1642, 1747, 2858, 2938, 3183, 3392, 3557. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,79 (3H, s), 0,87

(3H, d, J = 6,5 Hz), 0,89 (3H, s), 0,96 (3H, br s), 1,09 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,98

(3H, s), 1,99 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,00 (1H, m, H-1‟a), 3,30 (1H, m,

H-1‟b), 3,23 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-7‟), 3,58 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,85 (1H,

d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,08 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,5, 10,0

Hz, H-2), 5,30 (1H, br s, H-12), 5,61 (1H, br s, 1‟-NH-amide), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz, 7‟-NH-). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 177,84 (C-28), 170,82,

170,51, 170,37, 170,08, 140,08 (C-13), 124,96 (C-12), 74,79 (C-3), 69,94 (C-2),

65,29 (C-23), 53,96 (C-18), 47,70, 47,62, 47,53, 43,79, 42,55, 41,95, 39,78, 39,61,

39,54, 39,32, 39,10, 37,80, 37,26, 32,32, 30,89, 29,53, 29,23, 28,75, 27,79, 26,88,

26,72, 24,80, 23,49, 23,35, 23,56, 21,22, 21,09, 20,87, 20,78, 17,89, 17,21, 17,09,

16,95, 15,93.

159: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylacetamide. 148

(363 mg, 0,5 mmol) tổng hợp 159 (288 mg, 78%) là chất rắn, màu nâu. ESI-MS m/z (%): 797 (84) [M+H]+, 795 [M-H]- (100). IR (KBr) ν* (cm-1): 701, 1054, 1114, 53

1256, 1500, 1637, 1723, 2873, 2935, 3161, 3393. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 

(ppm): 0,79 (3H, s), 0,87 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,90 (3H, s), 0,96 (3H, br s), 1,10 (3H,

s), 1,11 (3H, s), 1,97 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,01 (1H, m,

H-1‟a), 3,29 (1H, m, H-1‟b), 3,22 (2H, m, H-9‟), 3,59 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a),

3,85 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,09 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,15 (1H, dt, J =

4,0, 10,5 Hz, H-2), 5,31 (1H, br s, H-12), 5,88 (t, J = 5,0 Hz, 1‟-NH-amide), 5,96 (1H, br s, 9‟-NH-amide). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 177,66 (C-28),

170,68, 170,45, 170,23, 170,01, 140,06 (C-13), 124,81 (C-12), 74,61 (C-3), 69,90

(C-2), 65,15 (C-23), 53,85 (C-18), 47,57, 47,48, 47,40, 43,64, 42,43, 41,83, 39,65,

39,57, 39,48, 39,31, 38,98, 37,68, 37,12, 32,21, 30,78, 29,49, 29,34, 29,13, 29,10,

29,08, 27,66, 27,00, 26,81, 24,65, 23,37, 23,17, 23,04, 21,11, 20,98, 20,75, 20,66,

17,77, 17,10, 16,97, 16,84, 13,82.

160: N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylacetamide. 149

(377 mg, 0,5 mmol) tổng hợp 160 (294 mg, 75%) là chất rắn, màu trắng. ESI-MS m/z: 811 [M+H]+. ESI-MS m/z: 833 [M+Na]+ (100). IR (film) ν* (cm-1): 1031, 1119, 1237, 1371, 1503, 1554, 1467, 1723, 2864, 3029, 3236, 3554. 1H-NMR (CDCl3,

500 MHz)  (ppm): 0,79 (3H, s), 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,89 (3H, s), 0,96 (3H, br

s), 1,10 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,97 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,08 (3H, s),

3,02 (1H, m, H-1‟a), 3,28 (1H, m, H-1‟b), 3,22 (2H, m, H-10‟), 3,59 (1H, d, J =

12,0 Hz, H-3), 3,85 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,09 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3),

5,15 (1H, dt, J = 4,5, 10,0 Hz, H-2), 5,30 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-12), 5,71 (1H, br s, 10‟-NH-acetyl), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz, 1‟-NH-amide). 13C-NMR (CDCl3, 125

MHz)  (ppm): 177,74 (C-28), 170,78, 170,53, 170,31, 170,01, 140,18 (C-13),

124,88 (C-12), 74,72 (C-3), 69,93 (C-2), 65,24 (C-23), 53,97 (C-18), 47,66, 47,57,

47,47, 43,75, 42,52, 41,90, 39,74, 39,65, 39,57, 39,42, 39,07, 37,75, 37,19, 32,29,

30,85, 29,59, 29,43, 29,37 (2C), 29,24, 29,18, 27,74, 27,08, 26,85, 24,74, 23,45,

23,29, 23,11, 21,18, 21,06, 20,83, 20,74, 17,85, 17,18, 17,05, 16,91, 13,90.

161: N,N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethylacetate. 156 (350

mg, 0,5 mmol) tổng hợp 161 (312 mg, 80%) là chất rắn, màu trắng. Mp = 190-192 oC, ESI-MS m/z: 786 (91) [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,81

(3H, s), 0,94 (6H, br s), 1,00 (3H, d, J = 5,0 Hz), 1,16 (3H, s), 1,17 (3H, s), 1,99

(3H, s), 2,04 (3H, s), 2,07 (6H, s), 2,08 (3H, s), 2,43 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18),

3,66 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,86 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,25 (4H, br s,

2H-2‟), 5,05 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 5,21 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2), 5,26

(1H, br s, H-12).

Quy trình chung tổng hợp chất 162-166

162

165

-NH(CH2)7NH2

-NHNHCH3

163

166

-NH(CH2)9NH2

-N(CH2CH2OH)2

164

-NH(CH2)10NH2

Hợp chất 2,3,23-triacetyl asiatic acid-28-amide (0,5 mmol) trong MeOH (15

mL) đƣợc thêm nhỏ giọt 2 mL KOH 4N và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Dung

môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm, sản phẩm rắn đƣợc hoà tan trong nƣớc (15

mL) và acid hóa với HCl 5% đến pH = 7. Hỗn hợp đƣợc chiết bằng CH2Cl2 (3x30

mL). Dịch chiết đƣợc rửa với nƣớc, làm khan bằng Na2SO4 và đƣợc quay cô dƣới

áp suất thấp. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên cột silica gel (CH2Cl2/MeOH, 95/5)

thu đƣợc sản phẩm 162-166.

162: N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine. 147 (182

mg, 0,25 mmol) tổng hợp 162 (105 mg, 70%) là chất rắn, màu trắng. Mp = 140-145 oC. ESI-MS m/z: 601 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,72

(3H, s), 0,83 (3H, s), 0,93 (3H, d, J = 5,0 Hz), 0,98 (3H, d, J = 5,0 Hz), 1,06 (3H, s),

1,16 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-18), 2,86 (2H, t, J = 10,0 Hz, H-1‟), 3,14

(2H, m, H-7‟), 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b),

3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,10 (C-28), 140,32 (C-

13), 126,80 (C-12), 78,20 (C-3), 69,64 (C-2), 66,35 (C-23), 54,21 (C-18), 44,12

(2C), 43,49 (2C), 41,18, 40,92, 40,84, 40,61, 40,30, 38,98, 33,54, 31,92, 30,24,

29,99, 29,90, 28,92, 28,01, 27,57, 25,20, 24,50, 24,09, 21,57 (2C), 19,04, 18,08,

17,72, 17,70 (2C), 13,92.

163: N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine. 148 (189

mg, 0,25 mmol) tổng hợp 163 (91 mg, 58%) là chất rắn, màu trắng. Mp = 130-135 oC. ESI-MS m/z: 629 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,73

(3H, s), 0,83 (3H, s), 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s),

1,16 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1‟), 3,13

(2H, t, J = 6,5 Hz, H-9‟), 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz,

H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, br s, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 179,91 (C-28), 140,32

(C-13), 126,74 (C-12), 78,16 (C-3), 69,59 (C-2), 66,34 (C-23), 54,19 (C-18), 48,13,

47,96, 44,09 (2C), 43,47 (2C), 42,49, 40,89 (2C), 40,83, 40,71, 40,24, 38,95, 38,72,

33,59, 33,53, 31,94, 30,75, 30,59, 30,51, 30,33, 28,91, 28,31, 28,05, 25,19, 24,51,

24,45, 21,66, 19,04, 18,12, 17,78, 13,98.

164: N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine. 149 tổng

hợp 164 với hiệu suất 74% là chất rắn, màu trắng. Mp = 128-130 °C. ESI-MS m/z: 643 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,72 (3H, s), 0,83 (3H,

s), 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,07 (3H, s), 1,16 (3H, s), 2,16

(1H, d, J = 10,0 Hz, H-18), 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1‟), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz,

H-10‟), 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,53 (1H,

d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,00 (C-28), 140,36 (C-13),

126,76 (C-12), 78,17 (C-3), 69,61 (C-2), 66,34 (C-23), 54,23 (C-18), 48,14, 47,97,

44,11, 43,49, 41,97 (2C), 40,91, 40,85, 40,74, 40,26, 38,98, 38,74, 33,54, 32,12

(2C), 31,94, 30,73, 30,65 (2C), 30,54, 30,32, 28,93, 28,32, 27,89, 25,21, 24,52,

24,12, 21,62, 19,05, 18,14, 17,78, 17,75, 13,96.

165: N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-methylhydrazide. 154

(360 mg, 0,5 mmol) thu đƣợc 165 (215 mg, 75%). ESI-MS m/z (%): 517 (76) [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,77 (3H, s), 0,88 (3H, s), 0,89

(3H, d, J = 6,0 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,10 (3H, s), 1,47 (3H, s), 2,06 (1H, d,

J = 10,0 Hz, H-18), 3,15 (3H, s, H-1‟), 3,34 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,54 (1H,

d, J = 11,5 Hz, H-23b), 4,16 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-), 4,24 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -

NH-), 5,06 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,37 (1H, dt, J = 4,0, 10,5 Hz, H-2), 5,42 (1H,

t-like, H-12).

166: N,N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol. 156 tổng hợp 166 với hiệu suất 74% là chất rắn, màu trắng. IR (KBr) ν* (cm-1): 1049, 1391, 1468, 1605, 1647, 2923, 3356. ESI-MS m/z: 576 [M+H]+ (100).

Tổng hợp chất 167: 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-amide

Acid 145 (307 mg, 0,5 mmol, 1 equiv.) hoà tan trong CH2Cl2 (15 mL) khan

đƣợc thêm nhỏ giọt oxalyl chloride (3,0 mmol, 6 equiv.). Hỗn hợp phản ứng đƣợc

khuấy ở nhiệt độ phòng 24 giờ. Sau đó, CH2Cl2 và oxalyl chloride dƣ đƣợc loại cất

loại bỏ, chất rắn còn lại đƣợc hoà tan trong CH2Cl2 (20 mL) và thêm nhỏ giọt dung

dịc ammonic 30% (2 mL). Phản ứng khuấy ở nhiệt độ phòng 20 giờ, rồi đƣợc rửa với

HCl loãng và H2O, làm khan bằng Na2SO4. Dung môi đƣợc cất loại và chất rắn

đƣợc tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc thu đƣợc sản

phẩm sạch 167 (270 mg, hiệu suất 88%).

167: 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-amide. (270 mg, 88%), chất rắn, màu nâu, Mp = 148 – 149 °C, IR (KBr) ν* (cm-1): 1039, 1244, 1376, 1462, 1662, 1740, 2874, 2929, 3220, 3467. ESI-MS m/z: 615 [M+2H]2+ (100). 1H-NMR

(CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,87 (3H, s), 0,90 (3H, d, J = 8,0 Hz), 0,91 (3H, s),

0,96 (3H, br s), 1,10 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,04 (3H, s),

3,58 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,85 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,08 (1H, d, J =

10,0 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,5, 10,0 Hz, H-2), 5,32 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12), 5,48 (1H, br s, -NH2) và 5,83 (1H, br s, -NH2). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) 

(ppm): 181,01 (C-28), 170,80, 170,46, 170,36, 139,85 (C-13), 125,18 (C-12), 74,78

(C-3), 69,90 (C-2), 65,27 (C-23), 54,19 (C-18), 47,95, 47,58, 47,51, 43,77, 42,49,

41,91, 39,70, 39,44, 39,03, 37,77, 37,12, 32,32, 30,81, 27,77, 24,75, 23,43, 23,12,

21,17, 21,09, 21,05, 20,84, 20,75, 17,86, 17,15, 17,04, 13,90.

Tổng hợp chất 168: 2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-amide

2,3,23-Triacetyl asiatic acid-28-amide (167) 613 mg (1 mmol) đƣợc hòa tan

trong 40 ml MeOH, cho 2 ml KOH 4N vào hỗn hợp phản ứng và khuấy ở nhiệt độ

phòng 16 giờ. Sau đó cất loại dung môi dƣới áp suất giảm, cặn còn lại đƣợc hoà tan

trong 15 ml nƣớc cất và trung hoà bằng HCl 5% đến pH = 7, chiết bằng CH2Cl2 ba

lần (3x20 mL), dịch chiết đƣợc rửa với nƣớc, làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung

môi thu đƣợc sản phẩm thô. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên cột silica gel với hệ

trihydroxy-urs-12-ene-28-amide) (350 mg, 72%).

dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH = 95:5, nhận đƣợc hợp chất 168 (2α,3β,23-

167 (613 mg, 1 mmol) thu đƣợc 168 (asiatic acid 28-amide) (350 mg, 72%) là chất rắn, màu trắng. IR (KBr) ν* (cm-1): 1043, 1235, 1373, 1464, 1664, 1738, 2925, 3477. ESI-MS m/z: 488 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,72 (3H, s), 0,90 (3H, s), 0,93 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,99 (3H, d, J = 5,5 Hz),

1,06 (3H, s), 1,17 (3H, s), 2,10 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-18), 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz,

H-23a), 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125

MHz)  (ppm): 183,59 (C-28), 140,15 (C-13), 126,94 (C-12), 78,21 (C-3), 69,68

(C-2), 66,35 (C-23), 54,48 (C-18), 49,85, 48,02, 44,12, 43,49, 40,85, 40,77, 40,32,

38,98, 38,71, 33,54, 31,91, 28,97, 25,29, 24,49, 24,08 (2C), 21,58, 19,05, 17,88,

17,71, 17,68 (2C), 13,91.

Tổng hợp chất 169: 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-17-nitrile

Hợp chất 167 (307 mg, 0,5 mmol) và DMAP (0,01 mmol) trong CH2Cl2 (20

mL) đƣợc thêm nhỏ giọt acetyl chloride (1 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở

nhiệt độ phòng 2 giờ. Sau đó, hỗn hợp đƣợc trung hòa với dung dịch NaHCO3

(10%). Dịch chiết đƣợc rửa với nƣớc, làm khan bằng Na2SO4, cất loại dƣới áp suất

thấp. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế bằng cột silica gel hệ dung môi n-hexane/ethyl

acetate thu đƣợc sản phẩm sạch chất rắn, màu trắng (hợp chất 169) (252 mg, 85%). Mp = 215-217 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1032, 1230, 1370, 1460, 1739, 2228 (-CN), 2931. ESI-MS m/z: 618 [M+Na]+ . 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,84 (3H,

d, J = 6,5 Hz), 0,91 (3H, s), 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,09 (6H, s), 1,17 (3H, s), 1,98

(3H, s), 2,03 (3H, s), 2,09 (3H, s), 3,59 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,87 (1H, d, J =

11,5 Hz, H-23b), 5,09 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,18 (1H, dt, J =4,5, 10,5 Hz, H- 2), 5,37 (1H, br s, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 170,38 (C-28),

136,92 (C-13), 126,92 (C-12), 122,41 (-CN), 78,14 (C-3), 69,66 (C-2), 66,27 (C-

23), 56,76 (C-18), 44,13, 43,69, 41,21, 40,93, 39,96, 39,89, 38,97, 37,62, 33,90,

30,95, 29,66, 26,46, 24,51, 23,57, 21,17, 19,03, 18,19, 17,80, 17,42, 13,95.

Tổng hợp chất 170: 2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-17-nitrile

170 : 595 mg (1 mmol) hợp chất 169 đƣợc hòa tan trong 40 ml MeOH, cho 2

ml KOH 4N vào hỗn hợp phản ứng và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Sau đó cất

loại dung môi dƣới áp suất giảm, cặn còn lại đƣợc hoà tan trong 15 ml nƣớc cất và

trung hoà bằng HCl 5% đến pH = 7, chiết bằng CH2Cl2 ba lần, dịch chiết đƣợc rửa

với nƣớc, làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi thu đƣợc sản phẩm thô. Sản 59

phẩm thô đƣợc tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH =

95:5, nhận đƣợc hợp chất 170 (368 mg, 74%) là chất rắn, màu trắng. Mp = 252-253 °C, IR (KBr) ν* (cm-1): 1062, 1251, 1471, 1553, 1633, 1741, 2861, 2936. ESI-MS m/z: 505 [M+HCl]- . 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,74 (3H, s), 0,90

(3H, d, J = 6,5 Hz), 0,98 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,10 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,18 (3H, s),

3,30 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-3), 3,74 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,42 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 138,61 (C-13), 128,32 (C-12), 126,41 (-

CN, C-28), 78,14 (C-3), 69,66 (C-2), 66,27 (C-23), 56,76 (C-18), 48,16, 48,08,

44,13, 43,69, 41,21, 40,93, 39,96 (2C), 39,89, 38,97, 37,62, 33,90, 30,95, 29,66,

26,46, 24,51, 23,57, 21,17, 19,03, 18,19, 17,80, 17,42, 13,95.

Tổng hợp chất 171: 2α-hydroxy-3β,23-isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-

oic acid

Acid 1 (4,88 g, 10 mmol) và TsOH.H2O (0,01 equiv) trong DMF (50 ml)

đƣợc thêm nhỏ giọt 2,2-dimethoxypropane (1,15 g, 11 mmol). Phản ứng đƣợc

khuấy ở nhiệt độ phòng 5 giờ rồi trung hòa bằng dung dịch NaOH 5% đến pH = 8.

Hỗn hợp phản ứng đƣợc thêm ethyl acetate (100 mL) và rửa với H2O (3x50 ml),

làm khan bằng Na2SO4 và quay cất đến khô. Sản phẩm 171 là chất rắn, màu trắng,

(4,82 gam, 88%) đạt đƣợc bằng sắc ký cột silica gel hệ dung môi CH2Cl2/MeOH = 20/1. Mp = 195-197 oC. IR (KBr) ν* (cm-1): 960, 1033, 1190, 1391, 1454, 1552, 1648, 1689, 2871, 2939, 3199, 3466. ESI-MS m/z: 527 [M-H]-. 1H-NMR (CD3OD,

500 MHz)  (ppm): 0,68 (3H, s), 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,93 (3H, br s), 1,08 (6H,

s), 1,27 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,48 (3H, s), 2,23 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,40

(1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 3,50 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,56 (1H, d, J = 10,5

Hz, H-23b), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2), 5,26 (1H, br t, J = 3,5 Hz, H-12).

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 181,43 (C-28), 139,69 (C-13), 126,47 (C-

12), 100,72 (C-31), 83,03 (C-3), 73,66 (C-23), 66,15 (C-2), 54,30 (C-18), 52,27 (C-

5), 43,31, 40,84, 40,39, 40,36, 39,22, 38,29, 38,04, 33,68, 31,75, 30,74, 30,09 (2C),

29,18, 25,29, 24,28, 24,24 (2C), 21,60, 19,65, 18,52, 18,38, 17,67 (2C), 14,09.

Tổng hợp chất 172: 2α-succinoyl-3β,23-isopropylidenedioxy-urs-12-ene-

28-oic acid

Hợp chất 171 (264 mg, 0,40 mmol) trong CH2Cl2 (10 ml) và triethylamine

(mL, 1 mmol) đƣợc thêm succinic anhydride (50 mg, 0,5 mmol). Hỗn hợp phản ứng

đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 12h, rồi thêm ethyl acetate (20 mL) và rửa với HCl

(1N), dung dịch NaHCO3 (10%), dung dịch đƣợc rửa với nƣớc muối, và đƣợc làm

khan bằng Na2SO4. Cất loại dung môi, chạy cột silica gel (n-hexane/ethyl acetate, 2/1) thu đƣợc hợp chất 172 (186 mg, 74%). Chất rắn, màu trắng, Mp = 194-196 oC. IR (KBr) ν* (cm-1): 965, 1044, 1165, 1391, 1459, 1648, 1713, 2931, 3450. ESI-MS m/z: 627 [M-H]- (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,76 (3H, s), 0,84 -

0,86 (6H, m), 0,94 - 0,95 (3H, chồng lấp), 1,09 - 1,10 (6H, chồng lấp), 1,50 (3H, s,

H-32), 1,52 (3H, s, H-33), 2,57 - 2,71 (4H, m, H-35, H-36), 3,54 (1H, d, J = 9,5 Hz,

H-3), 3,48 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,53 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), 5,03 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), 5,23 (1H, br s, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) 

(ppm): 184,02 (C-28), 178,04 (C-37), 171,71 (C-34), 138,00 (C-13), 125,38 (C-12),

99,41 (C-31), 78,89 (C-3), 72,67 (C-23), 69,13 (C-2), 52,67 (C-18), 51,15 (C-5),

47,95, 47,58, 44,68, 42,02, 39,63, 39,00, 38,36, 38,32, 37,50, 36,58, 32,32 (2C),

30,56, 29,70, 28,99, 27,91, 23,96, 23,73, 23,71, 21,14, 19,22, 17,77, 17,45, 16,99,

16,67, 13,51.

 Tổng hợp chất 173: 2α-O-acetyl-3β,23-isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-

oic acid

Hợp chất 171 (264 mg, 0,40 mmol) trong pyridine (10 ml) và acetic

anhydride (76 mg, 0,74 mmol) đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 12 h. Hỗn hợp đƣợc

pha loãng với ethyl acetate (20 mL) và rồi đƣợc rửa với dung dịch HCl (1N) đến pH

= 6, dung dịch NaHCO3 (10%), dung dịch đƣợc rửa với nƣớc muối bão hòa và làm

khan bằng Na2SO4. Dung môi đƣợc cất loại và sản phẩm đƣợc tinh chế trên cột

silica gel (n-hexane/ethyl acetate, 2/1) thu đƣợc chất rắn, màu trắng, hợp chất 173 (234 mg, 82%), Mp = 155-157 oC. IR (KBr) ν* (cm-1): 868, 967, 1033, 1243, 1373, 1460, 1694, 1737, 2867, 2942. ESI-MS m/z: 569 [M-H]- (100). 1H-NMR (CDCl3,

500 MHz)  (ppm): 0,75 (3H, s), 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz),

1,09 (6H, s), 1,11 (3H, s), 1,41 (3H, s), 1,43 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,18 (1H, d, J =

11,5 Hz, H-18), 3,47 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,53 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b),

3,54 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 4,99 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2), 5,23 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 183,15 (C-28), 170,62 (CH3-

CO-), 137,92 (C-13), 125,39 (C-12), 99,37 (C-31), 78,96 (C-3), 72,68 (C-23), 68,73

(C-2), 52,53 (C-18), 51,17 (C-5), 47,92, 47,62, 44,83, 42,02, 39,60, 39,05, 38,81,

38,32, 37,49, 36,65, 32,36, 30,61, 29,75, 29,70, 27,98, 24,03, 23,64, 23,22, 21,29,

21,15, 19,22, 17,69, 17,42, 16,93, 13,54.

Tổng hợp chất 174: 2α-acetoxy-3β,23-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid

Hợp chất 173 (570 mg, 1 mmol) trong MeOH (10 ml) đƣợc nhỏ giọt HCl 1N

(2 ml), và đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 4 giờ. Dung môi đƣợc cất dƣới áp suất

giảm, cặn còn lại đƣợc hoà tan trong H2O (15 ml). Hỗn hợp đƣợc chiết bằng CH2Cl2

(3x30 mL). Dịch chiết đƣợc rửa với nƣớc, làm khan bằng Na2SO4, và quay cất đến

khô. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-

hexane/EtOAc = 7/3, nhận đƣợc hợp chất 174 là chất rắn, màu trắng (477 mg, 90%). Mp = 195-197 oC. IR (KBr) ν* (cm-1): 1042, 1240, 1374, 1464, 1740, 2393, 3533. ESI-MS m/z: 531 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm):

0,75 (3H, s), 0,87 (3H, s), 0,90 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,12

(3H, s), 1,16 (3H, s), 2,07 (3H, s, CH3-CO), 2,22 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-18), 3,31

(1H, H-23a chồng lấp dung môi), 3,64 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-3), 5,03 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), 5,25 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 181,55 (C-28), 173,05 (-CO), 139,83 (C-

13), 126,55 (C-12), 74,73 (C-3), 74,24 (C-2), 65,81 (C-23), 54,34 (C-18), 47,93,

44,92, 44,55, 43,39, 40,82, 40,41, 40,39, 39,12, 38,08, 33,57, 31,76, 30,72, 29,17,

25,30, 24,42, 24,17 (2C), 21,56, 21,32, 19,01, 17,80, 17,67, 17,48, 13,88.

3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid

 Tổng hợp chất 175: 6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oic acid

Madecassic acid (10) (502 mg, 0,996 mmol) trong pyridine (10 mL) đƣợc

thêm nhỏ giọt acetic anhydride (300 mg, 2,921 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc

khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm rồi đƣợc thêm ethyl acetate (60 mL) và rửa với các

dung dịch HCl (1N), NaHCO3 (10%), nƣớc muối bão hòa và làm khan bằng

Na2SO4. Dung môi đƣợc cất loại đến khô và sản phẩm thô đƣợc tinh chế qua cột

silica gel với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (2/1) thu đƣợc hợp chất 175 (533,4 mg, 85%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 189-192 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1037, 1245, 1374, 1458, 1734, 2867, 2941, 3222, 3534. (-) ESI-MS m/z: 629 [M-H]-, (+)

ESI-MS m/z: 653 [M+Na]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,85 (3H, d, J

= 6,5 Hz), 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,98 (3H, s), 1,03 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,06

(3H, s), 1,96 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,21 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18),

3,72 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,33 (1H, br s,

H-6), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2), 5,31-5,32 (1H, m, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 183,46 (C-28), 170,85,

170,46, 170,42, 137,20 (C-13), 125,58 (C-12), 74,96 (C-3), 69,88 (C-2), 67,99 (C-

6), 65,40 (C-23), 52,43 (C-18), 48,24, 47,89, 46,47, 45,84, 47,12, 40,67, 39,06,

38,79, 38,65, 37,43, 36,59, 30,66, 29,67, 27,92, 24,06, 23,50, 23,36, 21,13, 21,06,

20,87, 18,64, 18,49, 18,16, 16,90, 15,32.

Qui trình chung tổng hợp chất 177-185

177

180

183

-N(CH2CH2OH)2

- NH2

-NH(CH2)10NH2

178

181

184

-NHCH2CH2CH2OH

-NH(CH2)7NH2

-NHCH2COOEt

179

182

185

-NHCH(CH3)2

-NH(CH2)9NH2

Acid 175 (1 mmol) trong dung môi khan CH2Cl2 (20 mL) đƣợc thêm nhỏ

giọt oxalylchloride (0,5 ml, 6 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ

phòng 24 giờ. Sau đó, cất loại CH2Cl2 và oxalylchloride dƣ dƣới áp suất giảm. Sản

phẩm thu đƣợc đƣợc hoà tan trong CH2Cl2 (20 mL) và thêm triethyl amine (TEA, 6

mmol) cùng các hợp chất amin (1,5 mmol). Phản ứng đƣợc khuấy 20 giờ ở nhiệt độ

phòng, rồi đƣợc rửa với dung dịch HCl loãng và H2O. Dịch chiết đƣợc làm khan

bằng Na2SO4, rồi cất loại dung môi dƣới áp suất giảm. Chất rắn đƣợc tách trên cột

silica gel với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate thu đƣợc các sản phẩm amide

177-185 sạch.

177: N,N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol

Acid 175 (630 mg, 1 mmol) thu 177 (570 mg, 81%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 230-233 °C. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,96 (3H, d, J = 6,5

Hz), 1,00 (3H, br s), 1,11 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,99 (3H,

s), 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,44 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,53-3,56 (2H, br s,

H-2'), 3,73 (4H, br s, H-2', -OH), 3,77 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,92 (1H, d, J =

11,5 Hz, H-23b), 4,32 (1H, br s, H-6), 4,98 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24-5,28 (2H, m, H-2, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 178,96 (C-28),

172,58, 172,28, 172,18, 140,00 (C-13), 126,50 (C-12), 76,62 (C-3), 71,18 (C-2),

67,95 (C-23), 66,29 (C-6), 61,53 (C-2'), 60,91 (C-2'), 52,82 (C-18), 46,98, 43,75,

40,16, 40,05, 39,84, 38,78, 38,68 (2C), 33,38, 31,67, 31,24, 24,45, 24,36, 24,02,

21,63, 20,98 (2C), 20,74 (2C), 18,97 (2C), 18,26, 18,74, 18,07, 15,72, 15,69, 14,58.

178: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol

Acid 175 (500 mg, 0,794 mmol) thu 178 (470 mg, 86%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 170-172 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1051, 1378, 1454, 1584, 1640, 1722, 2922, 3379, 3500. (+) ESI-MS m/z: 688 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94

(3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,10 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,31 (3H, s),

1,51 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-

18), 3,18-3,22 (1H, m, H-1'), 3,27-3,36 (1H, m, H-1'), 3,61 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3'),

3,78 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,92 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,32 (1H, br s,

H-6), 4,98 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 5,27 (1H, dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,40 (1H, t-like, H-12), (7,31 (t, J = 5,5 Hz) và 7,39 (t, J = 5,5 Hz) –NH đồng phân). 13C-

NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,28 (C-28), 172,98, 172,56, 172,28,

139,37 (C-13), 127,06 (C-12), 76,62 (C-3), 71,19 (C-2), 67,91 (C-6), 66,31 (C-23),

61,52 (C-3'), 54,29 (C-18), 48,49, 46,99, 43,77 (2C), 43,39, 42,65, 41,26, 40,90,

40,35, 40,17, 38,73, 38,66, 38,28, 38,19, 32,90, 32,85, 31,93, 28,94, 25,06, 24,40,

24,07, 21,54, 20,96, 20,72, 18,83, 17,70, 15,72.

179: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-isopropyl

Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 179 (483 mg, 72%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 176-178 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1040, 1237, 1372, 1525, 1627, 1735, 2936, 3428. (+) ESI-MS m/z: 672 [M+H]+(100). 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,83

(3H, d, J = 6,5 Hz), 0,87 (3H, br s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s), 1,25 (3H,

s), 1,45 (3H, s), 1,94 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,02 (3H, s), 3,67 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-

23a), 3,84-3,88 (1H, m, H-1'), 3,92 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,31 (1H, br s, H-

6), 4,97 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,19 (1H, dt, J = 5,0, 11,0 Hz, H-2), 5,30 (1H, br s, H-12), 5,59 (1H, d, J = 7,0 Hz, -NH). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm):

176,81 (C-28), 170,82, 170,34, 170,30, 138,86 (C-13), 125,29 (C-12), 74,89 (C-3),

69,93 (C-2), 67,22 (C-23), 65,27 (C-6), 47,77, 47,48, 45,89, 43,05, 42,36, 41,26,

40,54, 39,75, 39,00, 38,72, 37,31 (2C), 30,85, 27,75, 24,55, 23,48, 23,39, 23,03,

22,75, 22,13, 21,10, 20,99, 20,79, 20,69, 18,61, 18,55, 17,05, 15,18 (2C).

180: 6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-amide

Acid 175 (630 mg, 1 mmol) thu 180 (553 mg, 88%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 166-169 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1041, 1242, 1373, 1459, 1660, 1736, 2935, 3478. (+) ESI-MS m/z: 652 [M+Na]+ (100). 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,87

(3H, d, J = 6,0 Hz), 0,96 (3H, br s), 1,07 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,29 (3H, s), 1,47

(3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,06 (3H, s), 3,73 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a),

3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,36 (1H, br s, H-6), 5,02 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-

3), 5,25 (1H, m, H-2), 5,33 (1H, br s, H-12), 5,83 (1H, br s, -NH2), 6,34 (1H, br s, - NH2). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 181,36 (C-28), 170,80, 170,39 (2C),

138,99 (C-13), 125,56 (C-12), 74,88 (C-3), 69,87 (C-2), 67,45 (C-6), 65,34 (C-23),

54,38 (C-18), 47,79, 45,95, 43,05, 42,47, 39,80, 39,04, 38,57, 37,35, 37,08, 30,87,

30,71, 27,79, 25,60, 24,75, 23,50, 23,16, 21,45, 21,07, 20,86, 20,76, 18,67, 18,56,

18,29, 17,11, 15,35.

181: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine

Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 181 (557 mg, 75%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 145-148 °C. (+) ESI-MS m/z: 743 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,10 (3H, s), 1,14 (3H, s),

1,31 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,98 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-18), 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,12-3,15 (2H, m, H-7‟), 3,77 (1H, d,

J = 11,5 Hz, H-23a), 3,92 (1H, d, J = 11,5 Hz, H23b), 4,32 (1H, br s, H-6), 4,98

(1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,26 (1H, dt, J = 5,0, 11,0 Hz, H-2), 5,23-5,29 (1H, br s, H-12). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 180,02 (C-28), 172,56, 172,27,

172,20, 139,63 (C-13), 126,83 (C-12), 76,57 (C-3), 71,17 (C-2), 67,87 (C-6), 66,29

(C-23), 54,26 (C-18), 49,85, 47,52, 46,98, 43,81, 43,75, 42,26, 40,91, 40,74, 41,31,

40,30, 40,17, 38,79, 38,66, 31,95, 30,30 (2C), 28,94, 28,22, 28,18, 27,92, 25,21,

24,44, 24,04 (2C), 21,56, 20,99, 20,74 (2C), 19,14, 19,03, 17,69, 15,74.

182: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine

Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 182 (523 mg, 68%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 140-143 °C. (+) ESI-MS m/z: 771 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,11 (3H, s), 1,16 (3H, s),

1,31 (3H, s), 1,50 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,17 (1H, d, J =

10,0 Hz, H-18), 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,09-3,20 (2H, m, H-9‟), 3,77 (1H, d,

J = 12,0 Hz, H-23 a), 3,92 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,32 (1H, br s, H-6), 4,98

(1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,26 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2), 5,41 (1H, br s, H- 12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 179,99 (C-28), 172,54, 172,23 (2C),

139,68 (C-13), 126,79 (C-12), 76,51 (C-3), 71,19 (C-2), 67,86 (C-6), 66,28 (C-23),

54,29 (C-18), 46,95, 43,81, 43,74, 41,73, 40,91, 40,74, 40,27, 40,16, 38,77, 38,66,

31,94, 31,62, 31,38, 30,63, 30,57, 30,47, 30,44, 30,39, 30,31, 28,92, 28,29, 27,79,

24,44, 24,25, 24,04, 24,00, 21,56, 21,00, 20,74, 20,73, 19,45, 19,09, 17,69, 15,75.

183: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine

Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 183 (613 mg, 78%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 138-141 °C. (+) ESI-MS m/z: 785 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 

(ppm): 0,92 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,93 (3H, s), 0,98 (3H, br s), 1,13 (3H, s), 1,27

(3H, s), 1,31 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,13-2,39 (1H, m, H-

1‟), 2,55-2,57 (1H, m, H-1‟), 3,02-3,09 (1H, m, H-10‟), 3,25-3,22 (1H, m, H-10‟),

3,61 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3.90 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,23 (1H, s, H-

6), 5,14 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,30 (1H, dt, J = 4,0, 11,0 Hz, H-2), 5,56 (1H, br s, H-12), 5,89-5,92 (1H, m, -NH). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 180,00

(C-28), 172,55, 172,25 (2C), 139,71 (C-13), 126,83 (C-12), 76,55 (C-3), 71,18 (C-

2), 67,88 (C-6), 66,29 (C-23), 54,31 (C-18), 47,55, 46,98, 43,83, 43,76, 41,97,

41,31, 40,94, 40,79, 40,30, 40,18, 40,01, 38,79, 38,74, 38,68, 32,02, 31,95, 30,71,

30,65, 30,52, 30,30, 28,94, 28,32, 27,85, 26,41, 25,22, 24,46, 24,03, 21,55, 20,98,

20,72 (2C), 19,16, 19,09, 17,68, 15,75.

184: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-glycine ethyl ester

Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 184 (600 mg, 84%). Chất rắn, màu trắng. (+) ESI- MS m/z: 716 [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,0

Hz), 0,99 (3H, br s), 1,10 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,26 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,31 (3H, s),

1,51 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,15 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-

18), 3,19-3,20 (1H, m, H-1‟a), 3,29-3,30 (1H, m, H-1‟b), 3,63-3,68 (2H, m, H-2, -

OH), 3,77 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23a ), 3,92 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 4,12 (2H,

q, J = 7,0 Hz, H-1‟‟), 4,32 (1H, br s, H-6), 5,08 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,26 (1H, t-like, H-12), 5,41 (1H, t-like, -NH). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm):

180,56 (C-28), 172,57, 172,28, 172,19, 177,40, 139,13 (C-13), 127,26 (C-12), 76,59

(C-3), 71,17 (C-2), 67,96 (C-6), 66,29 (C-23), 62,20 (C-1‟‟), 54,28 (C-18), 48,66,

48,49, 43,75, 43,69, 41,19, 40,85, 40,34, 40,12, 38,71, 38,64, 38,40, 31,88, 31,62,

28,87, 26,43, 25,34, 24,38, 24,11, 21,55, 20,98, 20,73, 18,84, 18,53, 17,71, 15,72,

14,49.

185: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-imidazol

Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 185 (550 mg, 81%). Chất rắn, màu trắng. (-) ESI- MS m/z: 715 [M+Cl]-, (+) ESI-MS m/z: 681 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500

MHz)  (ppm): 0,69 (3H, s), 0,88 (3H, s), 0,91 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,00 (3H, d, J =

6,5 Hz), 1,09 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,97 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,47 (1H,

d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,57 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,83 (1H, d, J = 11,5 Hz,

H-23b), 4,35 (1H, br s, H-6), 5,06 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,5,

11,0 Hz, H-2), 5,24 (1H, t-like, H-12), 7,04 (1H, s, H-4‟), 7,52 (1H, s, H-2‟), 8,24 (1H, s, H-5‟). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 176,17 (C-28), 172,55,

172,27, 172,16, 138,68 (C-13), 138,05 (C-2‟), 129,87 (C-5‟), 127,69 (C-12), 119,37

(C-4‟), 76,57 (C-3), 71,13 (C-2), 67,78 (C-6), 66,27 (C-23), 52,36 (C-18), 47,87,

47,06, 43,74, 43,44, 41,12, 41,00, 40,51, 39,98, 39,77, 38,72, 36,48, 31,45, 31,29,

28,84, 28,65, 26,29, 25,67, 24,36, 23,98, 20,97, 20,72, 18,93, 18,40, 17,62, 15,70.

Quy trình chung thủy phân nhóm acetyl

Chất 177-185 (1 mmol) trong MeOH (10 mL) đƣợc thêm dung dịch KOH 4N

(2 mL) và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất

giảm, cặn còn lại đƣợc hoà tan trong H2O (15 mL) và acid hóa với HCl 5% đến pH

≈ 4. Hỗn hợp đƣợc chiết với CH2Cl2 (3x50 mL). Dịch chiết đƣợc rửa với nƣớc, làm

khan bằng Na2SO4 và cất loại dung môi đến khô. Sản phẩm thu đƣợc qua sự tinh

chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (95/5).

186: N,N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol

177 (250 mg, 0,122 mmol) thu đƣợc 186 (60 mg, 83%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 219-221 °C. (+) ESI-MS m/z: 592 [M+H]+ (100). 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)

 (ppm): 0,83 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,90 (6H, s), 0,93 (3H, s), 0,99 (3H, s), 1,28 (3H,

s), 2,34 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,10–3,11 (2H, m, H-1‟), và 3,19-3,20 (2H, m,

H-1‟), 3,47-3,49 (4H, m, H-2‟), 4,00-4,04 (3H, m, H-23a, H-23b,-OH), 4,16-4,17

(1H, m, H-2), 4,24 (1H, br s, H-6), 4,31 (1H, br s, H-3), 4,72 (2H, br s, -OH), 5,12

(1H, br s, H-12). 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz)  (ppm): 175,12 (C-28), 130,00

(C-13), 125,00 (C-12), 75,77 (C-3), 67,48 (C-2), 65,96 (C-6), 63,72 (C-23), 59,78

(C-2‟), 58,89 (C-2‟), 51,53 (C-18), 49,20, 48,93, 47,54, 47,40, 47,17, 46,81, 46,64,

43,12, 38,28, 36,97, 36,87, 32,77, 30,19, 30,04, 23,88, 23,06, 21,18, 20,77, 18,28,

18,15, 18,10, 17,48, 14,99, 14,90.

187: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol

178 (240 mg, 0,35 mmol) thu đƣợc 187 (145 mg, 75 %). Chất rắn, màu trắng. (+) ESI-MS m/z: 562 [M+H]+. IR (KBr) ν* (cm-1): 1051, 1147, 1378, 1451, 1584, 1640, 2922, 3379, 3500. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,0

Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,42 (3H, s),

3,16-3,22 (1H, m, H-1‟), 3,28-3,31 (1H, m, H-1‟), 3,32-3,33 (H-3‟ chồng lấp), 3,45

(1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,59-3,63 (3H, m, H-3, H-23b, H-3‟), 3,73-3,76 (1H,

m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), 5,41 (1H, t, J = 4,0 Hz, H-12), 7,28 (t, J = 5,5 Hz, - NH), 7,36 (t, J = 5,5 Hz, -NH). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,38

(C-28), 139,41 (C-13), 127,38 (C-12), 78,19 (C-3), 69,67 (C-2), 68,43 (C-6), 65,91

(C-23), 61,02 (C-3‟), 54,37 (C-18), 50,24, 44,80, 43,93, 40,91, 40,36, 40,13, 38,82,

38,57, 38,36, 32,90, 31,62, 28,94, 24,19, 24,14, 23,99, 21,56, 19,13, 19,05, 17,70,

15,24.

188: 2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-amide

Chất 180 (429 mg, 0,68 mmol) thu 188 (240 mg, 70%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 270-273 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1047, 1374, 1454, 1557, 1648, 2864, 2926, 3245, 3422. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,99 (3H,

d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,17 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,13 (1H, d, J =

10,0 Hz, H-18), 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a),

3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,79 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), 5,40 (1H, t, J = 4,0 Hz, H-12). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 183,65 (C-28),

78,19 (C-3), 69,69 (C-2), 68,39 (C-6), 65,91 (C-23), 54,63 (C-18), 50,26, 47,59,

44,80, 43,96, 41,21, 40,97, 40,34, 39,99, 39,82, 38,74, 38,56, 38,51, 31,96, 31,62,

28,98, 26,48, 25,34, 24,49, 24,10, 21,57, 19,21, 19,07, 17,68, 15,24.

189: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine

181 (200 mg, 0,27 mmol) thu đƣợc 189 (113 mg, 68%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 150-153 °C. (+) ESI-MS m/z: 617 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s),

1,13 (3H, s), 1,40 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 2,95 (2H, t, J = 7,5 Hz,

H-1‟), 3,12-3,19 (2H, m, H-7‟), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,74 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-23b), 3,30 (H-3 trùng với dung môi ), 4,55 (1H, br s, H-6), 5,41 (1H, br s, H-12), (7,14 (t, J = 5,5 Hz) và 7,20 (t, J = 5,5 Hz) – NH, đồng phân). 13C-NMR

(CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,28 (C-28), 139,70 (C-13), 127,25 (C-12), 78,16

(C-3), 69,86 (C-2), 68,39 (C-6), 65,90 (C-23), 54,39 (C-18), 50,20, 47,61, 44,80,

43,98, 43,59, 41,22, 40,91, 40,75 (2C), 40,34, 40,15, 38,53, 31,96, 31,62, 30,24,

29,87, 28,94, 28,59, 27,94, 27,39, 26,47, 24,52, 24,09, 21,54, 19,33, 19,26, 19,09,

17,68, 15,25.

190: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine

182 (125 mg, 0,162 mmol) thu đƣợc 190 (68 mg, 65%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 145-148 °C. (+) ESI-MS m/z: 645 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s),

1,13 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,76 (2H, t, J = 7,0 Hz,

H-1‟), 3,09-3,18 (2H, m, H-9‟), 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0

Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), (5,41 (br s) và 5,44 (br s), - NH, đồng phân). 13C-NMR (CD3OD, 125

MHz)  (ppm): 180,11 (C-28), 139,71 (C-13), 127,15 (C-12), 78,16 (C-3), 69,65

(C-2), 68,35 (C-6), 65,91 (C-23), 54,39 (C-18), 50,22, 47,57, 44,78, 43,98, 41,81,

41,21, 40,92, 40,74, 40,29, 40,13, 38,77, 38,51, 31,95, 31,61, 30,57, 30,53, 30,42

(2C), 30,35, 30,27, 28,92, 28,25, 27,78, 25,27, 24,52, 24,10, 21,56, 19,32, 19,30,

17,68, 15,26.

191: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine

183 (150 mg, 0,191 mmol) thu đƣợc 191 (82 mg, 65%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 142-145 °C. (+) ESI-MS m/z: 659 [M+H]+ (100). 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) 

(ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s),

1,13 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,15 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz,

H-1‟), 3,09-3,19 (2H, m, H-10‟), 3,33 (H-3, trùng dung môi), 3,45 (1H, d, J = 11,0

Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,73-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), (5,41 (br s, 1H, -NH) và 5,44 (br s, -NH), đồng phân). 13C-NMR (CD3OD,

125 MHz)  (ppm): 180,14 (C-28), 139,69 (C-13), 127,16 (C-12), 78,16 (C-3),

76,55 (C-2), 69,88 (C-6), 68,35 (C-23), 54,36 (C-18), 50,23, 47,70, 44,79, 43,75,

43,81, 41,75, 40,91, 40,70, 40,31, 40,17, 38,81, 38,66, 38,53, 33,52, 31,94, 31,62,

31,55, 30,36, 30,27, 28,93, 28,31, 27,75, 26,40, 25,20, 24,52, 24,09, 24,00, 21,55,

20,97, 20,72, 17,68, 15,73.

3.4. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro

Phép thử đƣợc thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội.

Các dòng tế bào

Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC)

gồm: ung thƣ biểu mô biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thƣ gan Hep G2 (HB -

8065TM), ung thƣ phổi LU-1 (HTB - 57TM), ung thƣ vú MCF-7 (HTB - 22TM) và

ung thƣ da SK-Mel 2 (HTB - 68TM).

Nguyên lí

Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp MTT (3-(4,5-

dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium) đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi tác

giả Tim Mosman, 1983. Đây là phƣơng pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào

qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím đen)

bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể. Sản phẩm formazan đƣợc

hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bƣớc sóng 540 nm. Giá trị OD

phản ánh số lƣợng tế bào sống. Nếu chất thử có hoạt tính gây độc tế bào thì số

lƣợng tế bào sống giảm và giá trị OD giảm. Giá trị thể hoạt tính là IC50 (nồng độ

chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào).

Chuẩn bị thí nghiệm

Dòng tế bào đƣợc lƣu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi

trƣờng dinh dƣỡng nhƣ DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME

(Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine

Serum) và một số thành phần thiết yếu khác. Tế bào đƣợc nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37 oC, vô trùng tuyệt đối) và đƣợc cấy chuyển 1-2 lần trƣớc khi thí nghiệm. Tế bào phát triển ở pha log sẽ đƣợc sử dụng để

thử độc tính.

Mẫu thử đƣợc hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20

mg/ml. Tiến hành pha loãng 2 bƣớc trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao 72

xuống thấp lần lƣợt là 2564, 640, 160, 40 và 10 µg/ml. Nồng độ chất thử trong đĩa

thử nghiệm tƣơng ứng là 128, 32, 8, 2 và 0,5 µg/ml. Chất tham chiếu Ellipticine pha

trong DMSO với nồng độ 0,01mM.

Tiến hành thí nghiệm

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế

bào. Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trƣờng sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng dòng tế bào).

Lấy vào mỗi giếng 10 µl chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µl dung dịch tế

bào. Đối chứng dƣơng của thí nghiệm là môi trƣờng có chứa tế bào, đối chứng âm

chỉ có môi trƣờng nuôi cấy.

Đĩa thí nghiệm đƣợc ủ ở điều kiện tiêu chuẩn trong 72 giờ.

Mỗi giếng thí nghiệm đƣợc tiếp tục ủ với 10 µl MTT (5 mg/ml) trong 4h.

Sau khi loại bỏ môi trƣờng, tinh thể formaran đƣợc hòa tan bằng 100 µl DMSO

100%.

Kết quả thí nghiệm đƣợc xác định bằng giá trị OD đo ở bƣớc sóng 540 nm

trên máy quang phổ Genios Tecan. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

Xử lý kết quả thực nghiệm

Giá trị IC50 đƣợc xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và

phần mềm máy tính Rawdata.

% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng

(-)) x 100%

(Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ

thấp, HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp ).

Giá trị IC50 ≤ 20 µl/ml (với dịch chiết thô) và IC50 ≤ 20 µM (với chất sạch)

đƣợc đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào đáng quan tâm, có khả năng ức chế

hoặc diệt tế bào ung thƣ. Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí

nghiệm ± độ lệch chuẩn (SD) [111, 112, 113].

3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo)

Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Thử hoạt tính Sinh học – Viện Hóa học kết hợp với Phòng Thử nghiệm Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học.

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chất asiatic acid trên mô hình chuột BALB/c

gây độc gan bằng paracetamol thông qua các chỉ tiêu:

Nghiên cứu sự thay đổi chỉ số AST và ALT (Sự thay đổi enzyme chức năng gan)

Nghiên cứu sự thay đổi khối lƣợng gan Nghiên cứu sự thay đổi hàm lƣợng MDA trong gan

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Hoá chất: Thiobarbituric acid (TBA, Sigma), potassium chloride solution (KCl),

acetic acid (pH=3,5) and sodium dodecyl sulfate (SDS), các hóa chất cần thiết khác v.v. Dụng cụ: panh, kéo, sirange, kim uống, đĩa 96 giếng

Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, đƣợc nuôi tại khu nuôi động

vật của Viện Công nghệ sinh học. Chuột đƣợc cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nƣớc

uống tự do.

Hoạt tính bảo vệ gan đƣợc thử nghiệm tại Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo mô hình gây

độc gan thực nghiệm bằng paracetamol [114]. Việc làm tiêu bản vi thể tế bào gan,

quan sát tiêu bản và nhận dạng những thay đổi đƣợc thực hiện tại Bộ môn giải phẫu

bệnh, Bệnh viện 103. Chuột nhắt trắng thuần chủng BALB/c, không phân biệt

giống, khỏe mạnh có khối lƣợng 22±2 g đƣợc chia thành 5 lô (6 con/lô) nhƣ sau:

Lô 1 (đối chứng sinh lý): uống nƣớc cất (0,2-0,3 ml/ con/ ngày).

Lô 2 (đối chứng bệnh lý): uống nƣớc cất (0,2-0,3 ml/ con/ lô ngày) +

paracetamol

Lô 3 (đối chứng tham khảo): uống silymarin liều 50 mg/ kgP/ ngày.

Lô 4 (thử mẫu): uống asiatic acid liều 20mg /kgP/ngày.

Lô 5 (thử mẫu): uống asiatic acid liều 4mg /kgP/ ngày.

Chuột đƣợc uống liên tục 7 ngày trƣớc và 2 ngày sau khi gây độc cho gan, mỗi ngày

uống 1 lần vào buổi sáng. Ngày thứ 7 sau uống mẫu 1 giờ, chuột nhịn đói 14-16 giờ trƣớc đó, gây độc gan bằng cách cho uống paracetamol đƣợc pha trong dung dịch CMC 1% với thể tích 0,2ml/kg (chỉ cho các lô 2,3,4,5) với liều 400mg/ kgP một lần

duy nhất. Sau 48 giờ uống paracetamol, lấy máu làm xét nghiệm hóa sinh chức năng gan qua

định lƣợng AST, ALT, quan sát đại thể và vi thể mô bệnh học của gan, xác định khối lƣợng gan và hàm lƣợng MDA (malon dialdehyde) trong gan. Hàm lƣợng MDA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu.

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập chất

4.1.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố

Hồ Chí Minh (RMHCM)

Cao chiết n-BuOH của rau má RMHCM đƣợc tách theo phƣơng pháp trình

bày ở mục 3.2.1. Bằng cách kết hợp các phƣơng pháp sắc ký, tổng cộng có 6 hợp

chất đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc gồm: stigmasterol (43), β-sitosterol (44),

asiatic acid (1), madecassic acid (10), hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol

glucoside (1:1) (144), và madecassoside (14). Điều chú ý ở đây là hợp chất

asiaticoside có hàm lƣợng rất ít trong mẫu RMHCM.

 Hợp chất Stigmasterol (43)

Hợp chất stigmasterol (43) đƣợc phân lập dƣới dạng tinh thể màu trắng, điểm

nóng chảy 169-171oC.

Phổ 1H-NMR cho thấy có hai nhóm methyl với các tín hiệu singlet tại H =

0,70 ppm (3H, s, H-18) và H = 1,01 ppm (3H, s, H-19), ba nhóm methyl gắn với –

CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,79 ppm (3H, d, J = 6,4 Hz, H-26), 0,84 (3H,

d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-21) và một nhóm methyl gắn với –

CH2 với tín hiệu triplet tại: H = 0,80 ppm (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29). Ở vùng trƣờng

thấp cho tín hiệu cộng hƣởng của một olefin proton  = 5,35 ppm (1H, br s, H-6) và

hai olefin proton  = 5,02 ppm (1H, dd, J = 8,7, 15,2 Hz, H-22) và 5,16 (1H, dd, J =

8,6, 15,2 Hz, H-23), một proton cacbinol:  = 3,51 ppm (1H, m, H-3) chứng minh cho nhóm β-OH ở vị trí C-3. Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hƣởng của

29 carbon, trong đó có 3 carbon bậc bốn, 11 carbon bậc ba, 9 carbon bậc hai và 6 nhóm methyl. Phổ 13C-NMR cũng cho tín hiệu cộng hƣởng của hai liên kết đôi ở vị

trí C-5 = C-6: ( = 140,8 và 121,7) và vị trí C-22 = C-23: ( = 138,3 và 129,3 ppm).

Phổ khối ESI-MS cho pic ion tại m/z 395 [M- H2O+H]+. Pic này là pic cơ bản, hình

thành do tạo thành dẫn xuất liên hợp (3,5-dien) sau khi phân tử bị tách một phân tử nƣớc. Kết hợp các dữ kiện phổ ESI-MS, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT và so

sánh với số liệu trong tài liệu [9] cho phép xác định cấu trúc của hợp chất là

stigmasterol.

 Hợp chất β-Sitosterol (44)

Hợp chất β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của

chúng với số liệu trong tài liệu [121].

 Hợp chất asiatic acid (1)

Hợp chất asiatic acid đƣợc phân lập từ cặn chiết n-BuOH dƣới dạng tinh thể

màu trắng (CH2Cl2/MeOH), điểm nóng chảy Mp = 222-224 oC.

Phổ hồng ngoại: cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng của nhóm hydroxyl (3411 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930 và 2866 cm-1). Phổ 1H-NMR cho thấy có 6 nhóm methyl

trong đó có 4 nhóm methyl gắn với carbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,72,

0,87, 1,07, 1,16 và hai nhóm methyl gắn với CH với một tín hiệu doublet tại H =

0,92 (J = 6,5 Hz) và một tín hiệu singlet tù tại H = 0,99 ppm. Ngoài ra, trên phổ có

tín hiệu một nhóm -CH2 gắn với -OH ở H = 3,29 (d, J = 11,0 Hz, H-23a), H = 3,53

(d, J = 11,0 Hz, H-23b), 2 nhóm hydroxy gắn với -CH ở  = 3,38 (d, J = 9,5 Hz, H-

3) và 3,71 (m, H-2) và 1 tín hiệu của nối đôi ở  = 5,26 (br s, H-12). Phổ 13C-NMR

và DEPT của hợp chất asiatic acid có mặt của 30 carbon trong đó có 6 nhóm

methyl, 9 nhóm carbon bậc 2, 8 nhóm carbon bậc 3 và 7 nhóm carbon bậc 4, nhóm

cacboxylic với C = 181,6 ppm và tín hiệu nối đôi C-12 = C-13 ( = 139,8, 126,6 76

ppm). Phổ H-H-COSY cho thấy có sự tƣơng tác giữa hai proton ở H: 3,29 (d, J =

11,0 Hz), 3.53 (d, J = 11,0 Hz) gắn trực tiếp với carbon ở vị trí C-23, proton ở  =

3,38 (J = 9,5 Hz, H-3) tƣơng tác với proton ở  = 3,71 (m, H-2). Phổ HSQC cho

thấy rõ giữa H-2 (3,72 ppm) và C-2 (69,7 ppm), giữa C-3 (72,2 ppm) và H-3 (3,38

ppm), tƣơng tác giữa C-12 (126,6 ppm) và H-12 (5,26 ppm). Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z 487 [M-H]-. So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-

NMR của hợp chất asiatic acid với số liệu của asiatic acid trong tài liệu [122, 123],

thấy hoàn toàn trùng khớp.

Hợp chất madecassic acid (10)

Phổ hồng ngoại của hợp chất madecassic acid cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng của nhóm hydroxyl (3416 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930 và 2867 cm-1). Phổ 1H-NMR

cho thấy có 4 methyl singlet, hai methyl doublet tại 0,92 và 1,10 ppm. Ngoài ra trên

phổ có các tín hiệu của nhóm hydroxymethine (-CHOH) tại H: 3,31 (d, J = 9,5 Hz,

H-3), 4,40 (m, H-6), tín hiệu ở H = 5,31 ppm đặc trƣng cho nhóm methine

olephinic (=CH) và 2 tín hiệu doublet đặc trƣng cho nhóm -CH2 gắn với -OH tại H:

3,46 và 3,61 ppm. Sự có mặt của các nhóm này đƣợc củng cố bởi các tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C: 69,6 ppm (C-2), 78,2 (C-3), 68,4 (C-6), 126,9 và 139,0 ppm (C- 12 và C-13). Phổ 1H và 13C- NMR của hợp chất madecassic acid gợi ý rằng hợp

chất madecassic acid có cùng khung carbon với hợp chất asiatic acid.

Phổ khối (ESI-MS) ion dƣơng cho pic ion giả phân tử tại m/z 505 [M+H]+. Các số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất madecassic acid hoàn toàn phù hợp

với số liệu của madecassic acid trong [13].

Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (144)

Hỗn hợp stigmasterol glucoside+β-sitosterol glucoside đƣợc phân lập dƣới

dạng tinh thể màu trắng, Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH = 85:15).

So sánh các dữ kiện phổ ESI-MS m/z 575 và 577 [M+H]+, phổ 1H, 13C-NMR

và DEPT với tài liệu của hỗn hợp stigmasterol glucoside + β-sitosterol glucoside

[53], cho phép xác định đây là hỗn hợp stigmasterol glucoside + β-sitosterol

glucoside. Tỷ lệ giữa hai hợp chất này trong hỗn hợp là 1:1, đƣợc xác định thông qua tích phân trong phổ 1H-NMR.

 Hợp chất Madecassoside (14)

Hợp chất madecassoside đƣợc tách ra dƣới dạng bột màu trắng, có Rf trùng

với Rf của madecassoside chuẩn tách từ cây rau má trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất madecassoside chứa các tín hiệu cộng

hƣởng nhƣ đã đƣa trong phần thực nghiệm tại mục 3.2.1.2 và hoàn toàn phù hợp với

tài liệu tham khảo [13].

4.1.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong cây rau má bằng

phƣơng pháp CC và HPLC

4.1.2.1. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong một số mẫu rau má bằng phƣơng pháp HPLC

Với cách tiến hành đƣợc mô tả trong phần thực nghiệm tại mục 3.2.2.1, các

mẫu rau má thu thập ở Sơn Tây, Hà Nội (RMST), Nam Định (RMND) và

Thành phố Hồ Chí Minh (RMHCM) đã đƣợc phân tích. Kết quả của phƣơng pháp sắc ký HPLC đƣợc trình bày trong bảng 4.1.

Các sản phẩm thô từ ba mẫu rau má đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp HPLC. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và acid madecassic trong sản phẩm thô thu

đƣợc sau khi thủy phân cũng nhƣ tính cho mẫu khô (Centella asiatica) đƣợc xác

định bằng phƣơng pháp HPLC đƣợc cho trong bảng 4.1.

Bảng 4. 1. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau

má xác định theo phƣơng pháp HPLC

RMST 4,25 g RMND 4,20 g RMHCM 1,67 g Thành phần % Diện % trong % Diện % trong % Diện % trong

tích pic mẫu khô tích pic mẫu khô tích pic mẫu khô

Asiatic acid 33,81 0,718 30,49 0,615 28,92 0,241

Madecassic 41,93 0,891 43,02 0,865 28,61 0,239 acid

4.1.2.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má bằng

phƣơng pháp CC

Với cách tiến hành đƣợc mô tả trong phần thực nghiệm tại mục 3.2.2.2, các

mẫu rau má thu thập ở Sơn Tây, Hà Nội (RMST), Nam Định (RMND) và Thành

phố Hồ Chí Minh (RMHCM) đã đƣợc phân tích. Kết quả của phƣơng pháp sắc ký

cột đƣợc trình bày trong bảng 4.2.

Bảng 4. 2. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phƣơng pháp CC

Cặn thô sau Madecassic acid Lƣợng Asiatic acid Cặn chiết (g) mẫu Mẫu thủy phân (g) (g) (% trong (g) (g) mẫu khô) (% trong mẫu khô)

200 30,12 RMST 1,02, (0,51) 1,54, (0,77) 4,25

200 29,25 RMND 0,92, (0,46) 1,58, (0,79) 4,02

RMHCM 200 25,0 0,43, (0,21) 0,49, (0,25) 1,67

Bảng 4.1 cho thấy, trong cả ba mẫu rau má, tổng hàm lƣợng madecassic acid

cao hơn asiatic acid. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid của rau má

thu thập ở Sơn Tây, Hà Nội (RMST) là cao nhất, và ở Thành phố Hồ Chí Minh

(RMHCM) là thấp nhất.

So với số liệu ở bảng 4.1 và bảng 4.2, có thể kết luận rằng hàm lƣợng asiatic

acid và madecassic acid thu đƣợc bằng phƣơng pháp sắc ký cột thấp hơn theo

phƣơng pháp HPLC, lần lƣợt là khoảng 71% và 86% phƣơng pháp HPLC .

Sử dụng phƣơng pháp HPLC và sắc ký cột này đã kiểm tra hàm lƣợng asiatic

acid và madecassic acid của 3 mẫu rau má thu đƣợc tại thành phố Sơn Tây, tỉnh

Nam Định và thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy hàm lƣợng triterpenic acid

trong mẫu rau má Sơn Tây cao hơn và trong mỗi mẫu thì hàm lƣợng madecassic

acid cao hơn asiatic acid.

4.2. Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má

Bằng các phƣơng pháp phân tích với 9 mẫu thí nghiệm khảo sát, chúng tôi đã

xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu để thực hiện qui trình chiết, tách asiatic acid và

madecassic acid từ cây rau má. Các điều kiện đó nhƣ sau:

Nồng độ dung môi chiết là ethanol (80%)

Thời gian chiết là 2 giờ cho một lần (chiết 2 lần). Nhiệt độ chiết là 80 oC

Từ kết quả khảo sát này, chúng tôi áp dụng để nghiên cứu qui trình chiết, qui

mô phòng thí nghiệm.

4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid

4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid

Asiatic acid là một pentacylic triterpene thiên nhiên đƣợc tách ra từ cây rau

má với hàm lƣợng trên 0,71%. Asiatic acid có chứa các nhóm chức OH ở vòng A

(vị trí 2, 3 và 23), và nhóm cacboxylic acid ở vị trí 28. Do đó, nghiên cứu về

tƣơng quan hoạt tính cấu trúc của hợp chất này chúng tôi chủ yếu tập trung vào

các vị trí này.

4.3.1.1. Chuyển hóa nhóm COOH (C-28)

Nhƣ đƣợc trình bày trong sơ đồ 4.1, asiatic acid đƣợc chuyển hóa thành các

dẫn xuất amide bằng phản ứng với các hợp chất amin bậc 1 và bậc 2 khác nhau.

Sơ đồ 4. 1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (1)

Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%, b) oxalyl

chloride, DCM, rt., 24 h, c) RNH2, DCM, rt, 24 h, (75-92%), d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%,

e) KOH, MeOH, rt, 16 h, 72-80%, f) acetyl chloride, DMAP, rt, 85%.

Trong dãy phản ứng chuyển hóa asiatic acid (1) thành các amide, các nhóm

OH vòng A trƣớc hết đƣợc bảo vệ với nhóm acetyl. Asiatic acid đƣợc xử lý với

acetic anhydride trong pyridine tạo thành asiatic acid triacetate (145) với hiệu suất

80%. Cấu trúc của hợp chất 145 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ IR, ESI-MS và 1D-NMR. Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 145 cho thấy ngoài các tín hiệu tƣơng

ứng của hợp chất 1 đã xuất hiện 3 tín hiệu của 3 nhóm acetyl CH3 tại H (ppm): 1,92

(3H, s, -CH3-CO), 1,96 (3H, s, -CH3-CO), 2,02 (3H, s, -CH3-CO) và C (ppm):

170,83 (CH3CO-), 170,48 (CH3CO-), 170,37 (CH3CO-). Các tín hiệu H-2β, H-3α và

H-23 đƣợc dịch chuyển về phía trƣờng thấp hơn ở δH (ppm) 3,51 (1H, d, J = 11,5

Hz, H-23a), 3,78 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3α) và

5,09 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2β) so với các tín hiệu tƣơng ứng [δH (ppm) 3,29

(1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,38 (1H, d, J = 9,5

Hz, H-3α), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2β)] của hợp chất 1. Nhƣ vậy cả 3 nhóm

OH đều đã đƣợc acetyl hóa. Điều này đƣợc chứng minh thêm bởi phổ FT-IR của

hợp chất 145 với đỉnh hấp phụ đặc trƣng cho acetate tại 1746,26 và 1237,00, 1698,88 (-COOH) và phổ khối ESI-MS ion dƣơng tại m/z 615 [M+H]+. Dữ liệu phổ

của hợp chất 145 giống với tài liệu tham khảo [124].

Hình 4. 1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α,3β,23-triacetoxy-urs-

12-ene-28-oic acid (145)

Hợp chất 145 đƣợc chuyển hóa thành asiatic acid chloride triacetate (146)

bằng phản ứng với oxalyl chloride. Sản phẩm trung gian này, không cần tách và

tinh chế, đƣợc phản ứng với các amin tƣơng ứng trong sự có mặt của triethylaminee

làm xúc tác bắt acid HCl. Các phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng với hiệu

suất cao từ 75-92% so với nguyên liệu đầu 145 (Sơ đồ 4. 1).

Hợp chất 147 cho thấy trong phổ 1H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của

các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-1‟), 3,13

(2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-7‟) và các tín hiệu của 7 nhóm methylene mạch nhánh. Các

kết quả trên phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 727 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp hợp chất 147. Nhƣ vậy

phản ứng amide hóa của hợp chất 145 với 1,7-heptadiamin đã thành công.

Hình 4. 2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,23- triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (147)

Hợp chất 148 cho thấy trong phổ 1H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của

các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1‟), 3,12-

3,14 (2H, m, 2H-9‟). Cấu trúc của hợp chất 148 cũng đƣợc khẳng định qua phổ ESI- MS ion dƣơng với pic ion giả phân tử tại m/z 755 [M+H]+ tƣơng ứng với CTPT

C47H74N2O7 của hợp chất 148 nhƣ trong phản ứng.

Hợp chất 149: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm

methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1‟), 3,14-3,11 (2H, m, 2H-10‟). Trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 30,33-30,68 và

40,73-41,09 của nhóm methylene mạch nhánh. Kết quả này cũng đƣợc khẳng định thêm qua phổ ESI-MS ion dƣơng với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+, cho

thấy hợp chất 149 phù hợp với CTPT C46H76N2O7 nhƣ trong phƣơng trình phản

ứng.

Hợp chất 150: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm

methylene mạch nhánh tại H (ppm): 3,11-3,16 (1H, m, H-1‟a), 3,53-3,63 (3H, m,

H-1‟b, 2H-3‟). Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 672 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8.

Hình 4. 3. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-

triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol (150)

Hợp chất 151 cho thấy đỉnh hấp thụ tại ν* (cm-1): 1742 và 1235 của các

nhóm acetate và nhiều đỉnh hấp thụ xung quanh vùng 3418 của nhóm -NHNH2. Phổ

khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C36H56N2O7 chứng minh rằng phản ứng của hợp chất

145 với hydrzine đã tạo thành sản phẩm mong muốn 151.

Trên phổ 1H-NMR của amide 152 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm):

6,48 (1H, t, J = 4,0 Hz, -NH-amide), đặc trƣng cho liên kết amide. Ngoài các tín

hiệu phổ của 145, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,83 (1H, dd, J = 4,0, 18,5

Hz, H-1‟a), 4,05 (1H, dd, J = 5,0, 18,5 Hz, H-1‟b), 4,21 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1‟‟),

1,29 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-2‟‟) nhóm tín hiệu và hằng số tƣơng tác này đặc trƣng cho độ dịch chuyển hóa học của glycine. Trong phổ 13C-NMR có các tín hiệu của

nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 61,48

ppm. Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 700 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO9.

Trên phổ 1H-NMR của amide 153 ngoài các tín hiệu của 145, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole tƣơng ứng ở δ (ppm): 7,03 (1H, s, H-2‟), 7,54 (1H, s, H-1‟), 8,26 (1H, s, H-3‟). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh ở δ (ppm): 137,08 (C-3‟), 129,74 (C-1‟), 117,94 (C-2‟).

Amide 154: quan sát trên phổ 1H-NMR của hợp chất 154 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 4,12 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3), 4,36 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3).

Hình 4. 4. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-

triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-methylhydrazine (154)

Amide 155: quan sát trên phổ khối ESI-MS ion dƣơng có xuất hiện ion giả phân tử tại m/z 672 [M+ H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8 của hợp chất này. Phổ 1H-NMR của hợp chất 155 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 3,92 (1H,

hept, J = 7,0 Hz, H-1‟) cùng với tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 2 xuất hiện chồng lấp với các nhóm methyl của khung asiatic acid từ 1,12-1,05 ppm. Phổ 13C-NMR có

chứa các tín hiệu của nhóm isopropyl trong mạch nhánh ở vùng trƣờng cao chồng

lấp với các tín hiệu khác của khung. Nhƣ vậy cấu trúc của hợp chất 155 đã đƣợc

khẳng định nhƣ trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1).

Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 156 xuất hiện thêm tín hiệu tại H (ppm):

3,72 (4H, br s, 2H-2‟) và C (ppm): 60,87 (C-2‟).

Các hợp chất 147-156 đã đƣợc chứng minh qua các số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS. Kết quả hoàn toàn phù hợp với công thức nhƣ trong sơ đồ phản

ứng (Sơ đồ 4. 1).

Các phản ứng acetyl hóa mạch nhánh

Các nhóm chức -NH2 và -OH mạch nhánh của các hợp chất 147-150, 156

đƣợc acetyl hóa bằng phản ứng với acetyl chloride (CH3COCl) với sự xúc tác của

DMAP trong dung môi dichloromethane (DMC) ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2

giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng nhƣ trong phần thực nghiệm 3.3.1 cho các sản

phẩm tƣơng ứng 157-161 với hiệu suất từ 75-80%.

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 157 cho các tín hiệu tại H (ppm): 6,05 (1H,

t, J = 5,0 Hz, -NH-amide), 4,10 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3‟), 3,09 (1H, m, H-1‟a), 3,39

(1H, m, H-1‟b) cùng với một tín hiệu methyl singlet mới tại H (ppm): 2,1 bên cạnh

nhóm methylene còn lại của mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của nhóm -CH2-

khác trong khung cho thấy mạch nhánh đã đƣợc gắn vào vị trí C-28. Tín hiệu H-3'

trong hợp chất 157 xuất hiện ở dạng một triplet ở δH 4,10 ppm (J = 6,0 Hz) so với

tín hiệu hợp chất gốc 150 là multiplet ở δH 3,53 -3,63 ppm, chồng lấp với H-23a, H-

2'a. Các tín hiệu -NH của 157 cũng dịch chuyển về phía trƣờng cao tại δH 6,05 (t, J

= 5,0 Hz) so với δH 6,18 (t, J = 5,5 Hz) trong hợp chất 150. Điều này đƣợc chứng minh thêm qua phổ 13C-NMR với sự xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 62,05 (C-3‟)

(CH2OAc) so với tín hiệu tại C 59,26 ppm (C-3‟) của hợp chất 150. Các kết quả

trên cho thấy phản ứng acetyl hóa đã đƣợc thực hiện nhƣ trong Sơ đồ 4. 1.

Hình 4. 5. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-

triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propyl acetate (157)

Hợp chất 158 cho thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hƣởng sau đây so

với hợp chất 147 H (ppm): 5,61 (1H, br s, 1‟-NH-amide), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz,

7‟-NH-), 3,00 (1H, m, H-1‟a), 3,30 (1H, m, H-1‟b), 3,23 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-7‟)

bên cạnh các tín hiệu của những nhóm methylene còn lại của mạch nhánh trùng lặp

với các nhóm methylene trong khung xuất hiện ở dạng multiplet trong vùng từ 1,98-

1,38 (ppm), phù hợp với phổ 1H-NMR. Đặc biệt ở đây tín hiệu H-7‟ có dạng quartet do tƣơng tác với 2H-6‟ và –NH-Ac tƣơng đƣơng về từ. Phổ 13C-NMR cũng cho

thêm một tín hiệu của nhóm acetate tại C: 170,82 ppm và các tín hiệu của nhóm –

CH2 mạch nhánh trong vùng từ 44,0-21,0 ppm trùng lặp với các nhóm methylene

trong khung. Điều này đƣợc khẳng định qua phổ qua phổ ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H72N2O8 của hợp chất 158.

Hình 4. 6. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylacetamide (158)

Hợp chất 159: Tƣơng tự nhƣ vậy phổ 1H-NMR của hợp chất 159 có xuất

hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 5,88 (t, J = 5,0 Hz, 1‟-NH-amide), 5,96 (1H, br

s, 9‟-NH-amide) bên cạnh các tín hiệu tại H (ppm): 3,01 (1H, m, H-1‟a), 3,29 (1H,

m, H-1‟b), 3,22 (2H, m, H-9‟), 1,99 (3H, s) cùng với các tín hiệu của nhóm

methylene khác trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene khác của khung. Phổ 13C-NMR có thêm một tín hiệu của nhóm acetyl tại 170,68 ppm cùng

với các nhóm methylene trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene

trong khung. Điều này đƣợc khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS ion âm với pic ion giả phân tử tại m/z 795 [M-H]- tƣơng ứng với CTPT C47H76N2O8 của hợp chất

159 nhƣ trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1).

Hình 4. 7. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-

triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylacetamide (159)

Hợp chất 160: Tƣơng tự nhƣ hợp chất 158, 159 cấu trúc của hợp chất 160 đƣợc chứng minh qua việc xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh trong phổ 1H- NMR, 13C-NMR và khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 811 [M+H]+ với CTPT C48H78N2O8.

Hợp chất 161: Phổ 1H-NMR của hợp chất 161 xuất hiện thêm 2 tín hiệu

methyl singlet của nhóm acetyl tại H (ppm): 2,07 và 2,08. Bên cạnh đó, các nhóm

methylene mang oxy (-CH2OAc) tại H (ppm): 4,25 (4H, br s, 2H-2‟) và các tín hiệu

của nhóm methylene khác trong mạch nhánh trùng lặp với nhóm methylene của hợp

chất ban đầu. Trong hợp chất 161, tín hiệu của H-2' ở δH 4,25 (4H, br s) thay vì δH

3,72 (4H, br s) trong hợp chất 156. Phổ khối của hợp chất 161 cho pic ion giả phân tử tại m/z 786 [M+H]+ phù hợp với CTPT C44H67NO11 của hợp chất 161.

Tƣơng tự nhƣ trên cấu trúc của các hợp chất 157-161 cũng đƣợc khẳng định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS đúng nhƣ các công thức ở sơ đồ (Sơ đồ

4.1).

 Phản ứng thủy phân nhóm acetyl ở vòng A

Để so sánh hoạt tính giữa các sản phẩm amide có nhóm OH vòng A bị khóa

bởi nhóm aceyl và các nhóm OH tự do, một số sản phẩm 147-156 đƣợc lựa chọn để

loại bỏ nhóm Acetyl bằng phản ứng thủy phân trong dung dịch KOH ở nhiệt độ 92

phòng, khuấy trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng nhƣ thƣờng quy (phần thực

nghiệm 3.3.1) thu đƣợc các sản phẩm tƣơng ứng với hiệu suất cao từ 72-80%. Cấu

trúc của các sản phẩm dãy 162-166 đƣợc khẳng định thông qua phân tích phổ ESI- MS và 1H-NMR, 13C-NMR.

Hợp chất 162: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 162 đã không còn các tín

hiệu của các nhóm acetyl. Ngoài ra, thấy có sự chuyển dịch hóa học của các nhóm

methyl gắn dị tố oxy về phía trƣờng cao tạiH (ppm): 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-

23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt,

J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12) và H (ppm): 2,86 (2H, t, J =

10,0 Hz, H-1‟), 3,14 (2H, m, H-7‟). Kết quả này cũng đƣợc khẳng định thêm qua phổ 13C-NMR với sự vắng mặt của tín hiệu của các nhóm acetyl carbonyl ở vùng

170 ppm và các nhóm methyl của acetyl ở vùng trƣờng cao. Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 601 [M+H]+ phù hợp với

CTPT C39H64N2O5 của hợp chất 162 nhƣ trong Sơ đồ 4. 1.

Hình 4. 8. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-

trihydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (162)

Hợp chất 163: Tƣơng tự nhƣ hợp chất 162, trong phổ 1H-NMR của hợp chất

163 đã không còn các tín hiệu cộng hƣởng của các nhóm acetyl tại vị trí C-2, C-3,

C-23. Đồng thời các tín hiệu của nhóm oxy-methine cũng bị đẩy về phía trƣờng cao

hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5

Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và

2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1‟), 3,13 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9‟) của mạch nhánh. Phù hợp với số liệu này phổ 13C-NMR cũng thấy vắng mặt các tín hiệu của nhóm acetyl

carbonyl ở vùng C: 170 ppm và acetyl methyl ở vùng trƣờng cao. Các kết quả này

đƣợc minh chứng thêm bởi phổ ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 163 với pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H68N2O4 của 163 nhƣ trong Sơ

đồ 4. 1.

Hợp chất 164: Cũng tƣơng tự nhƣ hợp chất 162, 163 trong phổ 1H-NMR của

hợp chất 164 cũng không còn các tín hiệu cộng hƣởng của các nhóm methyl acetyl.

Đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxy methyl cũng dịch chuyển về phía trƣờng

cao hơn, xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-

2) và 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1‟), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-10‟) của mạch nhánh. 94

Phổ 13C-NMR cũng vắng mặt các tín hiệu cộng hƣởng của nhóm acetyl ở vùng

khoảng 170 ppm và vùng trƣờng cao. Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cũng cho kết quả phù hợp với pic ion giả phân tử tại m/z 643 [M+H]+ tƣơng ứng với

CTPT C40H70N2O4 của 164 nhƣ trong Sơ đồ 4. 1.

Cấu trúc của các hợp chất 165, 166 cũng đƣợc chứng minh tƣơng tự nhƣ trên

thông qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chúng.

Hợp chất 167

Nhằm tạo ra dẫn xuất amide bậc 1 của asiatic acid, hợp chất 146 đã đƣợc

phản ứng với dung dịch amoniac đặc ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ. Xử lý phản ứng

nhƣ trong phần thực nghiệm 3.3.1 thu đƣợc hợp chất 167 với hiệu suất 88%. Cấu

trúc của hợp chất 167 đƣợc khẳng định nhƣ sau:

Phổ 1H-NMR của hợp chất 167 có mặt nhóm –NH2-amide tại H (ppm): 5,48 (1H, br s, -NH2) and 5,83 (1H, br s, -NH2). Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 167 phù hợp với tài liệu [95]. Phổ 13C-NMR có tín hiệu của nhóm chức –

CONH2 tại C: 181,01 ppm. Trong phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 167 có pic ion giả phân tử tại m/z 615 [M+2H]2+ phù hợp với CTPT C36H55NO7.

Tƣơng tự nhƣ với dãy hợp chất 162-166, hợp chất 167 đƣợc loại bỏ nhóm

acetyl bằng phản ứng với dung dịch KOH trong MeOH và khuấy ở nhiệt độ phòng

16 giờ. Xử lý sản phẩm phản ứng nhƣ trong phần thực nghiệm thu đƣợc hợp chất 168 với hiệu suất 72%. Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 168 không còn xuất hiện

tín hiệu của 3 nhóm methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của

các nhóm oxymethine và oxymethylene đã dịch chuyển về phía trƣờng cao hơn và

xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz,

H-23b), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự mất đi của tín hiệu các nhóm

acetyl (CH3CO-). Phổ khối ion âm ESI-MS của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 523 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H49NO4 của hợp chất 168. Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 168 phù hợp với tài liệu [95]. Điều đó chứng

tỏ rằng phản ứng amide hóa triacetate của asiatic acid và thủy phân dẫn xuất amide

để thu đƣợc dẫn xuất 28-amide đã đƣợc thực hiện nhƣ trong sơ đồ phản ứng.

Trong một hƣớng nghiên cứu khác để đánh giá hoạt tính của nhóm COOH

(C-28), amide 167 đƣợc dehydrat hóa thành nitrile 169 trong sự có mặt của acetyl 95

chloride, và DMAP trong DCM ở nhiệt độ phòng. Acetyl chloride đóng vai trò loại

nƣớc. Sản phẩm của phản ứng là acetic acid và HCl. DMAP có vai trò bắt acid HCl

tạo thành trong phản ứng này (vai trò xúc tác). Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng và

tinh chế sản phẩm đã thu đƣợc dẫn xuất nitrile 169. Trên phổ hồng ngoại của 169 thấy xuất hiện tín hiệu ở 2228,9 cm-1 đặc trƣng cho nhóm -CN. Phổ 1H-NMR trong

cùng dung môi CDCl3 không thấy xuất hiện tín hiệu của các proton amide bậc 1 ở 5,83 và 5,47 ppm nhƣ trong chất 168. Đặc biệt, phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu ở

122,95 ppm đặc trƣng cho nhóm -CN. Điều đó chứng tỏ, phản ứng dehydrat hóa

xẩy ra khá dễ dàng với hiệu suất cao. Cơ chế hình thành dẫn xuất 169 có thể đƣợc

biểu diễn nhƣ sau:

Hợp chất 169 cũng đƣợc thủy phân nhóm acetyl trong KOH và MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ thu đƣợc hợp chất 170 với hiệu suất 74%. Phổ 1H-

NMR của hợp chất 170 không thấy xuất hiện các tín hiệu methyl singlet của các

nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các proton gắn với cacbon mang oxi cũng

xuất hiện về phía trƣờng thấp hơn so với hợp chất 169 ở H (ppm): 3,30 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,74 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của

hợp chất 170 cũng không còn các tín hiệu của các carbon trong nhóm acetyl tại

vùng khoảng 170 ppm và vùng trƣờng cao của nhóm methyl. Tín hiệu của nhóm – CN trong phổ 13C-NMR của chất 170 xuất hiện tại C: 126,41 ppm. Phổ khối ESI-

MS ion âm có pic ion giả phân tử tại m/z 505 [M+HCl]- phù hợp với CTPT

C30H47NO3.

Hình 4. 9. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-

trihydroxy-urs-12-ene-17-nitrile (170)

4.3.1.2. Chuyển hóa vòng A của asiatic acid

Sơ đồ 4. 2. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (2)

Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) 2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O, rt., 7 h, 88%, b)

succinic anhydride, DMAP, TEA, rt. 12 h, 74%, c) (CH3CO)2O, pyridine, rt. 12 h, 82%, d) 5%

HCl, rt. 4h, 90%.

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của các nhóm chức 2-, 3-, 23-hydroxyl đến hoạt

tính sinh học của asiatic acid, một số phản ứng hóa học nhằm tạo ra các dẫn xuất có

sự thay đổi ở vòng A đã đƣợc thực hiện nhƣ Sơ đồ 4. 2. Asiatic acid (1) đƣợc phản

ứng đóng vòng với 2,2-dimethoxypropane có sự xúc tác của p-toluensulphonic acid

(PTSA) ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng (xem phần

thực nghiệm 3.3.1) thu đƣợc hợp chất 3,23-dioxo 171 với hiệu suất cao (88%). Hợp

chất 171 khi tác dụng với succinic anhydride trong triethylamine (TEA) và

dimethylaminopyridine (DMAP) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ thì cho hợp chất

172 có nhóm chức succinate ở vị trí C-2 với hiệu suất 74% sau khi tinh chế. Mặt

khác, khi cho hợp chất 171 tác dụng với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ

phòng trong 12 giờ sẽ thu đƣợc hợp chất 3,23-dioxo-2-acetate 173 với hiệu suất

82%. Thủy phân hợp chất 173 trong acid hydrochloric ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ

sẽ cho dẫn xuất 2-O-acetyl-3,23-dihydroxyasiatic acid (174) với hiệu suất cao

(90%).

Cấu trúc của các hợp chất 171-174 đƣợc khẳng định thông qua phân tích phổ

MS và NMR của chúng.

Hợp chất 171: Hợp chất này cho phổ 1H-NMR và 13C-NMR tƣơng tự nhƣ phổ của asiatic acid (1) ngoại trừ việc trong phổ 1H-NMR của hợp chất 171 có thêm

2 tín hiệu methyl singlet của nhóm dimethyldioxo mới tạo thành xuất hiện tại H

(ppm): 1,42 (3H, s), 1,48 (3H, s), đồng thời tín hiệu cộng hƣởng của H-23a, H-23b

đƣợc dịch chuyển về phía trƣờng thấp hơn so với 1 và xuất hiện tại 3,50 ppm (1H,

d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,56 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), so với 3,29 (1H, d, J =

11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b) do ảnh hƣởng của nhóm dioxo

mới tạo thành. Đối với proton H-3α sự dịch chuyển về phía trƣờng thấp hơn là 0,04 ppm so với asiatic acid và xuất hiện tại H : 3,56 ppm. Trong phổ 13C-NMR của hợp

chất 171 xuất hiện thêm tín hiêu của nguyên tử carbon bậc 4 của nhóm dioxo tại C :

100,72 ppm (C-31). Thông qua sự hình thành ketal, tín hiệu C-3, C-23 đƣợc chuyển

sang trƣờng thấp hơn và xuất hiện ở δC 83,03 và 73,66 ppm thay vì ở δC 69,68 và

66,31 trong asiatic acid (1) trong khi tín hiệu C-2 đƣợc chuyển sang trƣờng cao hơn

và xuất hiện ở δC 66,15 so với δC 78,17 ppm trong hợp chất 1. Phổ NMR của hợp chất 171 tƣơng tự nhƣ tài liệu tham khảo [122]. Phù hợp với kết quả từ phổ 1H- NMR và 13C-NMR, phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 171 cho pic ion giả phân tử tại m/z 527 [M-H]- ứng với CTPT C35H52O5 nhƣ trong sơ đồ phản ứng. Nhƣ vậy

phản ứng đã thực hiện nhƣ dự đoán.

Hình 4. 10. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-hydroxy-

3β,23-isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (171)

Để có đƣợc một dẫn xuất succinate, đƣợc cho là có hoạt tính sinh học, hợp

chất 171 đã phản ứng với anhydrit succinic trong DMAP và TEA ở nhiệt độ phòng

để tạo ra succinat 172.

Hợp chất 172: Phổ 1H-NMR của hợp chất 172 tƣơng tự nhƣ phổ của hợp

chất 171 và có xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hƣởng phù hợp với nhóm succinate

mới đƣợc gắn vào, thể hiện ở tín hiệu tại H (ppm): 2,57 - 2,71 (4H, m, H-35, H-36). Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 172 có sự xuất hiện thêm 2 tín hiệu carbon

cacboxylic tại C (ppm): 178,04 (C-37) và 171,71 (C-34) của nhóm succinat cùng

với tín hiệu của 2 nhóm methylene ở vùng trƣờng cao trùng lặp với các tín hiệu

trong khung. Phổ ESI-MS ion âm của hợp chất 172 cho pic ion giả phân tử tại m/z 627 [M-H]- phù hợp với CTPT C37H56O8 nhƣ trong Sơ đồ 4. 2 cho hợp chất 172.

100

Điều đó chứng tỏ phản ứng tạo succinat đã thành công.

Hình 4. 11. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α-succinoyl-

3β,23-isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (172)

101

Hợp chất 173: Phổ 1H-NMR của hợp chất 173 có thêm một tín hiệu methyl singlet của nhóm 2-O-acetyl xuất hiện tại H (ppm): 2,01 so với phổ 1H-NMR của hợp chất 171. Phổ 13C-NMR thêm một tín hiệu cộng hƣởng của nhóm carbonyl ở C 170,62 ppm (CH3COO-) đồng thời xuất hiện thêm một tín hiệu –CH3 tại vùng

trƣờng cao C: 21,15 ppm. Phổ khối ESI-MS ion âm m/z 569 [M-H]- phù hợp với CTPT C35H54O6 nhƣ trong sơ đồ phản ứng 4.2.

Hợp chất 174: Phổ 1H-NMR của hợp chất 174 có thêm 1 tín hiệu methyl singlet của nhóm 2α-O-acetyl tại H (ppm): 2,07 (3H, s, CH3-CO) so với phổ 1H- NMR của asiatic acid (1), đồng thời tín hiệu cộng hƣởng của H-2β cũng bị dịch

chuyển về phía trƣờng thấp hơn và xuất hiện tại H (ppm): 5,03 (1H, dt, J = 4,5,

11,5 Hz, H-2β) trong khi ở asiatic acid ghi trong cùng dung môi thì H-2β xuất hiện

tại H (ppm): 3,71 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), ΔH = 5,03-3,71= 1,32 ppm. Phù hợp với dẫn xuất acetate tại C-2, phổ 13C-NMR có xuất hiện thêm 2 tín hiệu thuộc

nhóm acetyl tại C (ppm): 78,89 (C-2), 170,62 (CH3COO-). Phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 174 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 531 [M-H]- phù hợp với

102

CTPT C32H50O6. Nhƣ vậy cấu trúc của hợp chất 174 đã đƣợc khẳng định.

Hình 4. 12. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-acetoxy-

3β,23-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (174)

4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid

Sơ đồ 4. 3. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid

Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%; b) oxalyl

chloride, DCM, rt., 24 h, c) RNH2, DCM, rt, 24 h; d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%; e) KOH,

MeOH, rt, 16 h.

103

Madecassic acid (10) đƣợc acetyl hóa với acetic anhydride trong pyridine ở

nhiệt độ phòng trong 12 giờ, xử lý hỗn hợp sau phản ứng nhƣ thƣờng quy (xem

phần thực nghiệm 3.2.2) sẽ cho madecassic acid 2,3,23-triacetate (175), hiệu suất

85%. Trong phản ứng này nhóm α-hydroxy ở vị trí C-6 không bị acetyl hóa do sự

che chắn không gian của các nhóm C-24, C-25, C-26. Trên mô hình Dreiding của

madecassic acid, nhóm 6β-hydroxyl có cấu hình axial. Nhóm 6β-hydroxy bị che

chắn không gian bởi ba nhóm methyl axial trong các vị trí 4β, 8β và 10β-. Cấu trúc

này tạo thành ba nhóm 1,3-diaxial với các nhóm 6β-hydroxy. Do đó nhóm 6β-

hydroxy bị cản trở không gian lớn nên khó bị acetyl hóa. Điều đó đƣợc chứng minh nhƣ sau: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 175 ta thấy xuất hiện tín hiệu của 3

nhóm acetyl methyl đồng thời các methyl proton ở C-2, C-3, C-23 đã đƣợc dịch

chuyển nhiều về phía trƣờng thấp và xuất hiện tại H (ppm): 3,72 (1H, d, J = 12,0

Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24

(1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2). So với phổ của madecassic acid (10) các tín hiệu

tƣơng ứng xuất hiện tại 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz,

H-23b), 3,76 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), và H-23b bị chồng lấp với tín hiệu

dung môi methanol. Trong khi tín hiệu của H-6α trong hợp chất 175 hầu nhƣ không

thay đổi và xuất hiện tại H (ppm): 4,34 (s), và ở 10 tín hiệu này là 4,40 (br s). Điều đó

chứng tỏ nhóm 6-β-OH không bị acetyl hóa. Phù hợp với kết quả này phổ hồng ngoại của hợp chất 175 vẫn cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy ở 3534 cm-1 bên cạnh 2 đỉnh hấp thụ mạnh ở 1734 cm-1 và 1245 cm-1 của nhóm acetate. Phổ khối ion âm ESI- MS của 175 cho pic ion giả phân tử tại m/z: 629 [M-H]-.

Hợp chất 175 đƣợc cho tác dụng với oxalyl chloride trong DCM ở nhiệt độ

phòng để tạo thành acid chloride 176. Hợp chất 176 không cần tách và tinh chế

đƣợc cho phản ứng luôn với các amin tƣơng ứng ở nhiệt độ phòng. Sau khi xử lý

hỗn hợp phản ứng nhƣ trong phần thực nghiệm 3.3.2 thu đƣợc các amide tƣơng ứng

177-185. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 177-185 đƣợc khẳng định thông qua phổ khối, phổ 1H- và 13C-NMR của chúng.

Hợp chất 177: Phổ 1H-NMR của hợp chất 177 có chứa thêm các tín hiệu của

mạch nhánh amide thông qua các tín hiệu cộng hƣởng của 4 proton trong nhóm –

104

CH2-OH tại H (ppm): 3,73 (4H, br s, H-2', -OH) và tín hiệu của 4 proton của nhóm

–NCH2 tại 3,53-3,56 (2H, br s, H-2'), các tín hiệu khác trùng hợp với phổ của 175. Ở phổ 13C-NMR của hợp chất 177 có xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm –CH2OH ở

mạch nhánh tại C ppm = 61,53 (C-2'), 60,91 (C-2').

Hợp chất 178: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu của

nhóm –NH-CH2- tại H: (7,31 (t, J = 5,5 Hz, –NH) và 7,39 (t, J = 5,5 Hz, –NH)

đồng phân) bên cạnh các tín hiệu tại 3,61 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3', -CH2-OH), 3,27-

3,36 (1H, m, H-1', -CH2-NH-), 3,18-3,22 (1H, m, H-1', -CH2-NH-). Tín hiệu của

nhóm –CH2 còn lại của mạch nhánh xuất hiện trùng với các tín hiệu của khung trong vùng trƣờng cao hơn. Phổ 13C-NMR của hợp chất này xuất hiện các tín hiệu

của nhóm methylene xen lẫn với các tín hiệu khác của khung madecassic acid trong

vùng trƣờng cao và tín hiệu của -CH2-OH tại C: 61,52 (C-3'). Phổ hồng ngoại của

hợp chất này có chứa cụm tín hiệu mạnh của nhóm –OH liên kết cầu hydro tại 3500 và 3379 cm-1 cùng với đỉnh hấp thụ tại 1584 cm-1. Điều đó chứng tỏ hợp chất 178

đã đƣợc tạo thành nhƣ trong sơ đồ phản ứng.

Hợp chất 179: So với phổ 1H-NMR của hợp chất 175 thì trong phổ 1H-NMR

của hợp chất 179 xuất hiện thêm các tín hiệu của hai methyl doublet của nhóm

isopropyl chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid triacetate trong

vùng H: 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s) cùng với các tín hiệu khác của mạch

nhánh tại H: 5,59 (1H, d, J = 7,0 Hz, -NH), 3,84-3,88 (1H, m, H-1', -NH-CH- (CH3)2). Phù hợp với phổ 1H-NMR, ở phổ 13C-NMR của hợp chất 179 có chứa các

tín hiệu cộng hƣởng của carbon tƣơng ứng trong mạch nhánh. Hợp chất 180: Phổ 1H-NMR của hợp chất 180 thấy xuất hiện thêm tín hiệu của

nhóm –NH2 amide tại H (ppm): 5,83 (1H, br s, -NH2) và 6,34 (1H, br s, -NH2) so

với hợp chất 175. Phổ hồng ngoại của hợp chất 180 có đỉnh hấp thụ mạnh tại 3478 cm-1 (-NH2) cùng với đỉnh hấp thụ tại 1660 cm-1 (-CN). Trong phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 180 có pic m/z 652 [M+Na]+ phù hợp với CTPT của hợp chất

105

180 là C36H55NO8. Nhƣ vậy phản ứng đã xảy ra nhƣ dự kiến ở Sơ đồ 4. 3.

Hình 4. 13. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 6β-hydroxy-

2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-amide (180)

Hợp chất 181: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 181 thấy xuất hiện thêm

các tín hiệu cộng hƣởng của mạch nhánh tại H: 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,12-

106

3,15 (2H, m, H-7‟). Các tín hiệu của các proton còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các proton khác trong khung ở vùng trƣờng cao. Phổ 13C-NMR của chất này có

xuất hiện các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu

carbon của khung. Trong phổ khối ESI-MS ion dƣơng thấy xuất hiện mảnh ion tại m/z 743 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp chất 181. Điều đó chứng

minh phản ứng xảy ra nhƣ dự kiến.

Hình 4. 14. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(6β-hydroxy-

2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (181)

107

Hợp chất 182: Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 182 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 771 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H74N2O8 của hợp chất 182. Phù hợp với kết quả này trên phổ 1H-NMR của hợp chất 182 xuất hiện cụm tín

hiệu tại H: 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,09-3,20 (2H, m, H-9‟). Các tín hiệu

khác của nhóm methylene mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid trong vùng trƣờng thấp. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện

thêm các tín hiệu của nhóm methylene mạch nhánh xen lẫn trong vùng tín hiệu của

khung. Nhƣ vậy cấu trúc của hợp chất 182 đã đƣợc khẳng định.

Hợp chất 183: Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 183 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 785 [M+H]+ phù hợp với CTPT C46H76N2O8 của hợp chất 183. Phổ 1H-NMR của chất này có các tín hiệu của nhóm –CH2-NH2 tại H: 2,13-

2,39 (1H, m, H-1‟), 2,55-2,57 (1H, m, H-1‟), 3,02-3,09 (2H, m, H-10‟). Các tín hiệu

proton của các nhóm CH2 khác chồng lấp với các proton của khung trong vùng trƣờng cao. Phổ 13C-NMR cũng phù hợp với cấu trúc trên khi có chứa các tín hiệu

của nhóm methylene xuất hiện trùng với các tín hiệu khác của khung. Điều đó

chứng tỏ phản ứng tổng hợp 183 đã xảy ra nhƣ dự kiến (Sơ đồ 4. 3).

Trên phổ 1H-NMR của amide 184 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm):

5,41 (1H, t-like, -NH) đặc trƣng cho liên kết amide. Ngoài các tín hiệu phổ của 175,

còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,19-3,20 (1H, m, H-1‟a), 3,29-3,30 (1H, m,

H-1‟b), 4,12 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1‟‟) nhóm tín hiệu và hằng số tƣơng tác này đặc trƣng cho độ dịch chuyển hóa học nhóm methylene của glycine. Trong phổ 13C-

NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh

xuất hiện tại C : 62,20 ppm (C-1‟‟). Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 716 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO10.

Trên phổ 1H-NMR của amide 185 ngoài các tín hiệu của 175, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole ở δ (ppm): 7,04 (1H, s, H-4‟), 7,52 (1H, s, H-2‟), 8,24 (1H, s, H-5‟). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh imidazole ở δ (ppm): 138,05 (C-2‟), 129,87 (C-5‟), 119,37 (C-4‟).

108

Hợp chất 186-191: Từ các hợp chất 177-183 đƣợc thủy phân trong dung dịch KOH trong MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp phản ứng nhƣ trong phần thực nghiệm 3.3.2. Sau khi tinh chế sản phẩm thu đƣợc các hợp chất

186-191 với hiệu suất từ 75-90%. Cấu trúc của các hợp chất 186-191 cũng đƣợc

khẳng định khi phân tích phổ IR, MS, NMR của chúng.

Hợp chất 186: Phổ khối ESI-MS của hợp chất 186 có pic ion giả phân tử tại m/z 592 [M+H]+ phù hợp với CTPT C34H57NO7 của hợp chất 186. Phổ 1H-NMR của

hợp chất này không thấy sự có mặt của các nhóm methyl singlet của acetyl quanh vùng H khoảng 2 ppm. Thêm vào đó phổ 1H-NMR có các pic của proton gắn với

carbon mang oxy tại vị trí C-2, C-3, C-23, C-6 xuất hiện tại H (ppm): 4,00-4,04

(3H, m, H-23a, H-23b,-OH), 4,16-4,17 (1H, m, H-2), 4,24 (1H, br s, H-6), 4,31 (1H,

br s, H-3) ngoài ra còn thấy các tín hiệu cộng hƣởng của nhóm –OH tại H là 4,72

(2H, br s, -OH) và 4,03 (1H, br s) bên cạnh các tín hiệu xuất hiện tại H từ 3,10–

3,11 (2H, m, H-1‟), và 3,19-3,20 (2H, m, H-1‟), 3,47-3,49 (4H, m, H-2‟). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng không chứa các tín hiệu cộng

hƣởng của nhóm acetyl carbonyl quanh vùng 170 ppm cũng nhƣ các tín hiệu acetyl

methyl ở vùng trƣờng cao. Các kết quả trên phù hợp với sản phẩm tạo thành theo Sơ

109

đồ 4. 3.

Hình 4. 15. Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO) của hợp chất N,N-(2α,3β,6β,23- tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol (186)

Hợp chất 187: Trên phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 187 có chứa các đỉnh hấp thụ mạnh của các nhóm –OH liên kết cầu hydro từ 3500-3379 cm-1, đỉnh hấp thụ của nhóm chức acetate cũng không xuất hiện trong phổ IR. Trong phổ 1H-

NMR không xuất hiện các tín hiệu methyl singlet tại H trong khoảng 2ppm đồng

thời xuất hiện tín hiệu tại 7,28 (t, J = 5,5 Hz, -NH), 7,36 (t, J = 5,5 Hz, -NH), các tín

hiệu của H-2, H-3, H-23a và H-23b đã dịch chuyển về phía trƣờng cao và xuất hiện

tại H: 3,32-3,33 (H-3‟ chồng lấp), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,59-3,63 (3H,

m, H-3, H-23b, H-3‟), 3,73-3,76 (1H, m, H-2). Điều đó chứng tỏ phản ứng thủy

phân đã xảy ra hoàn toàn.

Hợp chất 188: Phổ 1H-NMR của hợp chất 188 có chứa các tín hiệu của

proton gắn với carbon mang oxi chuyển dịch về phía trƣờng cao xuất hiện tại H

(ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H,

d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,79 (1H, m, H-2) trong khi tín hiệu của H-6α không thay đổi xuất hiện tại H: 4,40 ppm (1H, s). Phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng

không có các tín hiệu cộng hƣởng của nhóm acetyl carbonyl trong vùng khoảng 170

ppm, và các nhóm acetyl methyl ở vùng trƣờng cao. Chứng tỏ hợp chất 188 đã đƣợc tạo thành. Phổ ESI-MS ion dƣơng cho mảnh ion tại m/z là 488 (100, [M+3-H2O]3+). 110

Phổ hồng ngoại cho thấy cụm đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxyl liên kết cầu hydro trong vùng 3500-3245 cm-1. Nhƣ vậy cấu trúc của hợp chất này đã đƣợc khẳng định

phù hợp với CTPT là C30H49NO5.

Hợp chất 189: Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất này có pic ion giả phân tử tại m/z là 617 (100, [M+H]+) phù hợp với CTPT C37H64N2O5 của nó. Phổ 1H-NMR có tín hiệu của nhóm –NH2 tại H: 7,14 (t, J = 5,5 Hz, – NH) và 7,20 (t, J

= 5,5 Hz, – NH) và các tín hiệu proton gắn với carbon mang oxy cũng bị dịch

chuyển về phía trƣờng cao xuất hiện tại H (ppm): 3,30 (H-3 trùng với dung môi) và

3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,74 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), các tín hiệu của

methylene mạch nhánh xuất hiện trong khoảng từ H (ppm): 2,95 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,12-3,19 (2H, m, H-7‟). Phổ 13C-NMR của hợp chất này không chứa các tín

hiệu của acetyl carbonyl trong vùng C khoảng 170 ppm, và acetyl methyl trong

vùng trƣờng cao khoảng 17-19 ppm. Điều này chứng tỏ hợp chất 189 đã đƣợc hình

thành nhƣ sơ đồ phản ứng.

Hợp chất 190: Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 190 có pic ion giả phân tử tại m/z là 645 ([M+H]+) phù hợp với CTPT C39H68N2O5. Phổ 1H-NMR của

hợp chất này cho thấy rõ ràng các tín hiệu của proton gắn với carbon mang oxy xuất

hiện tại H (ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a),

3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6) cùng

với các tín hiệu của mạch nhánh tại H: 2,76 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1‟), 3,09-3,18

(2H, m, H-9‟). Các tín hiệu của nhóm methylene mạch nhánh còn lại chồng lấp với các tín hiệu của khung. Phổ 13C-NMR cho thấy không còn các tín hiệu của acetyl

carbonyl quanh vùng C: 170 ppm và acetyl methyl quanh vùng từ 19,07-19,32

111

ppm. Nhƣ vậy hợp chất 190 đã đƣợc tạo thành nhƣ trong sơ đồ phản ứng.

Hình 4. 16. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,6β,23-

tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine (190)

Hợp chất 191: Phổ khối ESI-MS ion dƣơng của hợp chất 191 cho pic ion giả phân tử tại m/z 659 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H70N2O5 của hợp chất 191. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy các tín hiệu của proton gắn với carbon

mang oxy tại H (ppm): 3,33 (H-3, trùng dung môi), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-

112

23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,73-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-

6). Các nhóm –CH2 của mạch nhánh xuất hiện tại H (ppm): 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz,

H-1‟), 3,09-3,19 (2H, m, H-10‟). Các tín hiệu methylene còn lại của mạch nhánh

xuất hiện trong vùng trƣờng cao hơn chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid. Phổ 13C-NMR cũng cho các kết quả phù hợp với cấu trúc của hợp

chất 191.

Các dữ liệu cấu trúc trên chứng tỏ phản ứng thủy phân 183 tạo thành 191 xảy

ra hoàn toàn.

4.4. Thử hoạt tính sinh học 4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro

4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của asiatic acid

Asiatic acid (1) phân lập từ cây rau má Việt Nam cùng với 28 dẫn xuất tổng

hợp đƣợc, gồm dẫn xuất triacetyl 145, các hợp chất 147-160, 162-165 và 171-174

đã đƣợc thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thƣ ngƣời là

KB (ung thƣ biểu mô, human epidermoid carcinoma), HepG2 (ung thƣ gan,

hepatocellular carcinoma) and Lu (ung thƣ phổi, lung cancer), với đối chứng dƣơng

là ellipticine. Trừ dẫn xuất triacetyl 145, 167, 168, 171, tất cả 25 hợp chất tổng hợp

đƣợc đều là hợp chất mới.

Kết quả thử nghiệm hoạt tính là rất khả quan. Cụ thể nhƣ sau:

8 hợp chất (152, 154, 155, 157, 158, 159, 160, và 167) có hoạt tính gây độc tế bào

rất mạnh (IC50 < 2 µM) đối với ít nhất một dòng tế bào thử nghiệm.

8 hợp chất, gồm 151, 152, 153, 155, 158, 159, 160 và 167 thể hiện hoạt tính mạnh

(IC50 < 10 µM) trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm. Các hợp chất có hoạt tính mạnh

gồm 155, 160 và 167 với các giá trị IC50 trên các dòng tế bào KB, Hep G2 và Lu lần

lƣợt là 155: 1,31, 1,33, 0,85; 160: 1,11, 1,09, 1,27 và 167: 0,67, 0,82, 9,30 µM, các

giá trị IC50 tƣơng ứng của dẫn xuất 145 lần lƣợt là 36,32, 39,77, 89,32 và của hợp

chất đối chứng dƣơng ellipticine là 1,42, 1,83 và 2,15 µM.

Hai hợp chất (169 và 157) thể hiện hoạt tính mạnh trên 2 dòng tế bào ung thƣ KB

µM).

và HepG2 với các giá trị IC50 lần lƣợt là: 154 (1,95 và 8,50 µM), 157 (0,70 và 0,70

Một hợp chất (148) thể hiện hoạt tính mạnh trên 1 dòng tế bào ung thƣ KB (IC50

113

8,74 µM).

Các hợp chất còn lại đƣợc coi nhƣ có hoạt tính trung bình, không mạnh hoặc

không đáng kể (IC50 > 10 µM). Hai hợp chất 165 và 162 không thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm trong nghiên cứu này. Các kết quả

đƣợc trình bày ở Bảng 4.3.

Bảng 4. 3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn

xuất tổng hợp của asiatic acid

IC50 (µM)

Hợp chất

HepG2

Hợp chất

61,9

65,57

120,3

1

160 1,11

1,09

1,27

36,32

39,77

89,32

n.d

145

161

23,70

81,25

69,49

n.a

147

162

122,10 186,80 103,02

148 8,74

32,12

42,04

163

35,93

192,22

80,40

149 4,16

12,74

8,84

164

n.a

23,67

21,58

74,68

150

165

n.a

151 4,03

3,06

3,85

166

152 1,39

1,99

4,14

167 0,67

0,82

9,30

153 4,89

6,52

8,05

168 3,51

2,75

17,54

29,18

31,48

33,29

154 1,95

8,50

86,31

169

38,93

42,22

42,62

155 1,31

1,33

0,85

170

n.a

33,86

109,13 142,41

156

171

94,62

203,82 125,78

157 0,70

37,39

172

20,46

28,40

34,05

158 1,78

1,54

2,33

173

50,94

144,36 151,85

159 1,34

1,17

2,51

174

1,42

1,83

2,15

Ellipticine

*n.a: không có hoạt tính

*n.d: không thử

Các kết quả thử nghiệm hoạt tính nêu trên cho phép đƣa ra các nhận xét sau:

Trong hầu hết các trƣờng hợp, chuyển hóa nhóm 28-COOH của hợp chất

triacetyl asiatic acid (145) thành các dẫn xuất amide đều làm tăng hoạt tính gây độc

tế bào trên ba dòng ung thƣ thử nghiệm (147-155, trừ hợp chất 156).

Acetyl hóa các nhóm OH và NH ở mạch nhánh amide ở C-28 sẽ làm tăng

hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (157-160).

Thủy phân các nhóm acetyl ở vị trí C-2α, C-3β, C-23 của vòng A sẽ làm giảm

114

mạnh hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (162-165).

Chuyển hóa nhóm amide ở C-28 thành nhóm nitrile không làm tăng đáng kể

hoạt tính gây độc tế bào (169 và 170).

Khi nhóm 28-COOH đƣợc giữ nguyên thì việc chuyển hóa các nhóm OH ở

vòng A không có tác động đáng kể đến hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào

ung thƣ thử nghiệm (171-174).

Jing và các cs. đã tổng hợp đƣợc 15 dẫn xuất của asiatic acid với các amino

acid và amino acid ester và xác định hoạt tính chống khối u và hoạt tính chống tạo

mạch (antiangiogenic activity) của chúng [92]. Các tác giả này cũng dùng asiatic

acid làm chất đầu, tiến hành các phản ứng acetyl hóa với acetic anhydride/pyridine,

sau đó cho phản ứng tiếp với oxalyl chloride, thu đƣợc acyl chloride. Phản ứng của

các acyl chloride thu đƣợc với các amino acid methyl ester hydrochloride cho các

amide tƣơng ứng với hiệu suất cao. Cũng theo con đƣờng này, Li J-F và các cs.

(2015) đã điều chế đƣợc một loạt các dẫn xuất của các aniline thế với 11-oxo-asiatic

acid và 2,3,23-triacetyl-11-oxoasiatic acid với hiệu suất cao. Các tác giả này nhận

thấy các dẫn xuất giữa 2,3,23-triacetyl asiatic acid và amino acid methyl ester thu

đƣợc có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn nhiều so với các hợp chất 2,3,23-

trihydroxyl tƣơng ứng cũng nhƣ so với bản thân asiatic acid [95]. Các kết quả thử

nghiệm hoạt tính của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với kết quả của các công bố này.

4.4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của madecassic

acid

Trong tổng số 17 dẫn xuất mới của madecassic acid tổng hợp đƣợc thông qua

việc tạo liên kết amide ở vị trí C-28 có 13 dẫn xuất đƣợc thăm dò hoạt tính kháng ung

thƣ trên ba dòng tế bào ung thƣ thực nghiệm là: ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ gan

(HepG2), ung thƣ phổi (Lu-1). Ellipticine đƣợc dùng làm chất đối chứng dƣơng. Các

kết quả về hoạt tính kháng tế bào ung thƣ có thể đƣợc tổng kết lại nhƣ sau:

Tất cả các dẫn xuất đƣợc thử nghiệm đều cho hoạt tính kháng ít nhất một, hai

hoặc cả ba dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm cao hơn, thậm chí một vài hợp chất cao

hơn gấp gần một trăm lần madecassic acid (thể hiện ở giá trị IC50). Cụ thể nhƣ sau:

tế bào ung thƣ KB, HepG2 và Lu-1 so với giá trị IC50 của hợp chất 175 (2α,3β,23-

Hợp chất 179 có giá trị IC50 lần lƣợt là 1,28, 1,30 và 0,83 µM đối với các dòng

115

triacetoxy madecassic acid) là 43,81, 121,44 và 127,75 tƣơng ứng.

tế bào ung thƣ tƣơng ứng.

Hợp chất 184 có giá trị IC50 lần lƣợt là 0,85, 1,12 và 2,01 µM đối với các dòng

bào ung thƣ tƣơng ứng. Các kết quả cụ thể đƣợc trình bày ở Bảng 4.4.

Hợp chất 185 có giá trị IC50 lần lƣợt là 1,25, 1,62, 2,01 µM đối với các dòng tế

Tƣơng tự nhƣ ở các dẫn xuất asiatic acid, khi thủy phân các nhóm chức

acetate ở vị trí C-2, C-3, C-23 của các dẫn xuất 28-amide thì hoạt tính kháng tế bào

ung thƣ thực nghiệm đều giảm đi so với các dẫn xuất 2,3,23-acetyl. Tuy nhiên, hoạt

tính của chúng vẫn còn mạnh hơn hoạt tính của madecassic acid (trƣờng hợp các

hợp chất 188, 190, 191)

Kết luận chung:

Vị trí C-28 và C-2, C-3, C-23 của madecassic acid có vai trò quan trọng đối

với hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của madecassic acid.

Các dẫn xuất 28-amide và 2α,3β,23-triacetyl của madecassic acid đều có

116

hoạt tính mạnh hơn madecassic acid rất nhiều.

Bảng 4. 4. Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid

IC50 (µM)

Hợp chất

HepG2

Lu-1

157,30

178,77

160,52

10

43,81

121,44

127,75

175

n.d

177

79,46

186,32

178

179 1,28

1,30

0,83

180 5,41

10,68

11,92

181 3,13

4,00

3,92

182 2,66

3,06

3,70

183 1,70

2,07

2,61

184 0,85

1,12

2,01

185 1,25

1,62

2,01

n.d

186

n.d

187

48,11

53,20

44,81

188

33,25

175,80

190,94

189

14,75

74,07

15,90

190

191 7,31

8,00

5,86

Ellipticine

1,42

1,83

2,15

n.d: không thử

Các kết quả thử nghiệm hoạt tính nêu trên cho phép đƣa ra các nhận xét sau:

Trong hầu hết các trƣờng hợp, chuyển hóa nhóm 28-COOH thành amide làm

tăng hoạt tính gây độc tế bào (hợp chất 179-185, trừ hợp chất 178).

Thủy phân các nhóm acetyl ở vòng A làm giảm mạnh hoạt tính gây độc tế

bào (hợp chất 188-189).

Qua kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất của

madecassic acid chúng tôi thấy:

Trong 12 hợp chất tổng hợp đƣợc thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 3

dòng tế bào ung thƣ ngƣời là KB (ung thƣ biểu mô, human epidermoid carcinoma),

HepG2 (ung thƣ gan, hepatocellular carcinoma) và Lu (ung thƣ phổi, lung cancer),

117

chứng dƣơng là ellipticine.

8 trong số các hợp chất thử nghiệm (179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 và

191) thể hiện hoạt tính mạnh trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm là KB, HepG2 và Lu

11 hợp chất (179-185, 188-191) có hoạt tính mạnh hơn rõ rệt so với

madecassic acid (10) và dẫn xuất 2,3,23-triacetyl (175) của nó.

Acetyl hóa các nhóm 2,3,23-trihydroxy hoặc/và acetyl hóa mạch nhánh

amide ở C-28 làm tăng đáng kể hoạt tính so với các hợp chất có các nhóm OH

hoặc/và NH2 tự do tƣơng ứng.

4.5.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo)

Asiatic acid chiết tách từ cây rau má đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên mô

hình gây độc gan bằng paracetamol. Sự sai khác về các giá trị ở lô thử mẫu so với lô

đối chứng bệnh lý là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) đối với AST, ALT và khối

lƣợng gan chuột. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.5, 4.6, 4.7 nhƣ sau:

Bảng 4. 5. Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lô thí nghiệm

Lô 1

Lô 2

Lô 3

Lô 4

Lô 5

Lô TN

Chỉ tiêu

AST 84,25 508,25 272,83 320,50±14,97 337,00±19,44

±9,53 ±6,99 ±15,31

47,52 ALT 325,25 201,35±8,42 232,75±12,45 242,50±13,38

±11,77 ±4,92

Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy asiatic acid ở liều 20mg/kgP/ ngày và liều 4mg/

kgP/ngày đều có tác dụng bảo vệ gan. Sự sai khác so với các lô đối chứng là có ý

nghĩa thống kê (P < 0,05).

Bảng 4. 6. Khối lƣợng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lô thí nghiệm

Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5

0,86±0,17 1,55±0,17 0,92±0,11 1,18±0,15 1,18±0,17

Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy ở lô đối chứng bệnh lý (Lô 2) khối lƣợng gan là

lớn nhất. Ở các lô sử dụng hợp chất bảo vệ (lô 3, 4, 5) khối lƣợng gan nhỏ hơn. Sự

118

sai khác này có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng bệnh lý (P < 0,05)

Kết quả kiểm tra trực quan tổn thƣơng gan cho thấy: ở lô đối chứng bệnh lý

gan nhạt màu, nhu mô gan to, nổi rõ, ở các lô khác gan bình thƣờng, nhu mô gan

đồng nhất.

Bảng 4. 7. Hàm lƣợng MDA trong gan chuột thí nghiệm

Lô TN Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5

MDA (nmol/ml 304,77 ± 420,31 ± 330,27 ± 400,69 ±

đồng thể) 6,66 27,36 7,45 8,15 397,78 ± 24,78

Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy hàm lƣợng MDA ở các lô có sử dụng hợp chất

bảo vệ đều thấp hơn lô đối chứng bệnh lý.

4.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng

hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử)

SIRT 1 (Sirtuin 1, NAD-dependent deacetylase sirtuin type 1) và 17β-HSD1

(17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1) là hai enzyme có liên quan đến một số

quá trình xúc tiến ung thƣ. Khả năng tƣơng tác về lý thuyết giữa các hợp chất tổng

hợp đƣợc với hai enzyme này đã đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp docking phân tử

và phân tích pharmacophore. Kết quả docking phân tử cho thấy năng lƣợng liên kết

của các hợp chất với SIRT1 (ID: 4151) nằm trong khoảng từ -6,6 đến -8,5 Kcal/mol

(asiatic acid: -7,7 Kcal/mol) và năng lƣợng liên kết với 17β-HSD1 (ID: 3KLM) nằm

trong khoảng từ -8,2 đến -10,1 Kcal/mol (asiatic acid: -8,6 Kcal/mol).

Bảng 4. 8. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp

theo phƣơng pháp docking phân tử của asiatic acid

Năng lƣợng liên kết của dẫn xuất của asiatic acid

Năng lƣợng liên kết (kcal/mol)

Hợp chất

SIRT1 (ID: 4I5I)

17β-HSD1 (ID: 3KLM)

-7,7

-8,6

1

-7,3

-8,8

145

-7,0

-9,3

150

-7,5

-8,5

151

-7,4

-8,7

154

-7,4

-8,4

147

119

Năng lƣợng liên kết của dẫn xuất của asiatic acid

Năng lƣợng liên kết (kcal/mol)

Hợp chất

SIRT1 (ID: 4I5I)

17β-HSD1 (ID: 3KLM)

-7,4

-8,5

161

-7,5

-8,9

158

-7,3

-9,1

158

-7,6

-8,2

159

-7,7

-8,2

160

-6,6

-8,6

162

167 -7,2

-9,2

-7,9

-9,1

168

-7,3

-9,3

169

-8,1

-9,5

170

-8,5

-10,1

171

-8,3

-9,7

172

-8,4

-9,9

173

-7,9

-9,5

174

Bảng 4. 9. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp

theo phƣơng pháp docking phân tử của madecassic acid

Năng lƣợng liên kết của dẫn xuất của madecassic acid

Năng lƣợng liên kết (kcal/mol)

Hợp chất

SIRT1 (ID: 4I5I)

17β-HSD1 (ID: 3KLM)

-7,6

-8,7

10

-7,0

-8,6

175

-6,9

-8,7

177

-7,2

-8,8

178

-7,5

-8,9

179

-7,0

-8,6

180

-7,2

-8,2

186

-7,1

-8,2

187

-7,0

-8,6

188

120

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

1. Đã tiến hành xác định hàm lƣợng của hai hợp chất triterpene chính là

asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh

Nam Định và thành phố Hồ Chí Minh bằng phƣơng pháp sắc ký cột và phƣơng

pháp HPLC. Kết quả cho thấy hàm lƣợng của hai triterpene trên trong mẫu rau má

Sơn Tây là cao nhất: asiatic acid là 0,72%, madecassic acid là 0,89% so với nguyên

liệu khô.

Rau má thu tại Sơn Tây đã đƣợc lựa chọn làm nguyên liệu để chiết suất

asiatic và madecassic acid phục vụ cho các chuyển hóa hóa học.

2. Đã tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 29 dẫn xuất của asiatic acid thông

qua việc tạo ra các amide ở vị trí C-28 và chuyển hóa các nhóm hydroxy ở vị trí C-

2, C-3, C-23. Trong số các hợp chất tổng hợp đƣợc có 25 hợp chất mới, chƣa đƣợc

công bố trong tài liệu (chất 147-166, 169-170, 172-174).

3. Từ madecassic acid đã tổng hợp đƣợc 17 dẫn xuất mới thông qua việc tạo

ra các amide ở vị trí C-28 và acetyl hóa các nhóm hydroxy ở C-2, C-3 và C-23 của

madecassic acid (chất 175-191).

Cấu trúc của tất cả các dẫn xuất tổng hợp đƣợc khẳng định thông qua phân

tích các phổ FTIR, MS và NMR một chiều và hai chiều của chúng.

4. Đã thăm dò hoạt tính bảo vệ gan của asiatic acid chiết tách từ cây rau má

trên mô hình gây độc gan chuột bằng paracetamol. Kết quả cho thấy asiatic acid có

hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng.

5. Đã thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên ba dòng là KB (ung thƣ

biểu mô), HepG2 (ung thƣ gan) và Lu-1 (ung thƣ phổi) của 28 dẫn xuất của asiatic

acid và 14 dẫn xuất của madecassic acid tổng hợp đƣợc. Hầu hết dẫn xuất tổng hợp

đều có hoạt tính cao hơn đáng kể so với hợp chất đầu. Có nhiều hợp chất có hoạt

tính cao hơn hợp chất đầu từ 60 đến gần 100 lần trên cả ba dòng tế bào ung thƣ thử

nghiệm. Kết quả này hứa hẹn khả năng tìm ra hợp chất mới có hoạt tính kháng ung

121

thƣ cao, góp phần phát triển ngành Hóa dƣợc.

5.2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các dẫn xuất tổng

122

hợp đƣợc trên các dòng tế bào khác và trên động vật thực nghiệm.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

 Đã tiến hành định lƣợng hai hợp chất triterpene chính là asiatic acid và

madecassic acid trong ba mẫu rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh Nam

Định và thành phố Hồ Chí Minh bằng phƣơng pháp sắc ký cột và phƣơng

pháp HPLC. Kết quả cho thấy hàm lƣợng của hai triterpene trên trong mẫu

rau má Sơn Tây là cao nhất: asiatic acid là 0,72%, madecassic acid là 0,89%

so với nguyên liệu khô. Mẫu rau má này đƣợc lựa chọn làm nguyên liệu để

chiết suất asiatic và madecassic acid phục vụ cho các chuyển hóa hóa học.

 Đã đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của asiatic acid chiết tách từ cây rau má

trên mô hình gây độc gan chuột bằng paracetamol. Kết quả cho thấy asiatic

acid có hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng.

 Đã tổng hợp 29 dẫn xuất của asiatic acid bằng biến đổi hóa học tạo amide ở

vị trí C-28, và chuyển hóa các nhóm hydroxy ở vị trí C-2, C-3, C-23. Trong

số các chất tổng hợp đƣợc có 25 hợp chất mới, chƣa đƣợc công bố trong tài

liệu.

 Từ madecassic acid đã tổng hợp đƣợc 17 dẫn xuất mới thông qua việc tạo ra

các amide ở vị trí C-28 và acetyl hóa các nhóm hydroxy ở C-2, C-3 và C-23

của madecassic acid.

 Các hợp chất đƣợc tổng hợp (28 dẫn xuất của asiatic acid và 14 dẫn xuất của

madecassic), đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ƣng

thƣ: KB (ung thƣ biểu mô), HepG2 (ung thƣ gan) và Lu-1 (ung thƣ phổi).

Hầu hết dẫn xuất tổng hợp đều có hoạt tính cao hơn chất đầu. Có nhiều chất

có hoạt tính cao hơn chất đầu từ 60 đến gần 100 lần trên cả ba dòng tế bào

ung thƣ thử nghiệm. Kết quả này hứa hẹn khả năng tìm ra chất mới có hoạt

tính kháng ung thƣ cao, góp phần phát triển ngành hóa dƣợc.

 Đã rút ra đƣợc kết luận về mối tƣơng quan hoạt tính-cấu trúc của các dẫn

xuất của asiatic acid và madecassic acid. Amide hoá nhóm 28-COOH làm

tăng hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng ung thƣ thử nghiệm, và acetyl hóa

nhóm 2-OH, 3-OH và 23-OH cũng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ung

123

thƣ.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Loc Tran Van, Quynh Nhu Vo Thi, Chien Tran Van, Phuong Thao Tran

Thi, Thanh Nguyen Tuan, Thu Ha Le Thi, Sung Tran Van, Synthesis of asiatic acid

derivatives and their cytotoxic activity, 2017, bản thảo gởi Natural product

research.

2. Loc Tran Van, Quynh Nhu Vo Thi, Chien Tran Van, Phuong Thao Tran

Thi, Thu Ha Le Thi, Sung Tran Van, Synthesis of madecassic acid derivatives and

their cytotoxic activity, 2017, bản thảo gởi Zeitschrift für Naturforschung B.

3. Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Lê Thị Thu Hà, Trần Thị Phƣơng Thảo, Trần Văn

Lộc, Hoạt tính bảo vệ gan của axit asiatic tách từ cây rau má Centella asiatica (L.)

Urban, 2016, Tạp chí Hóa học, T. 54 (5), 540-541.

4. Vo Thi Quynh Nhu, Tran Thi Phuong Thao, Tran Van Sung, Tran Van

Loc, Screening for the main triterpenic acids in Centella asiatica samples from

north and south of Vietnam, Vietnam Journal of Chemistry, International Edition,

2016, T. 54 (4), 416-418.

5. Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Trần Văn Lộc, Trần Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn

Tuấn Thành, Lê Thị Thu Hà, Trần Văn Sung, Thành phần hóa học của cây rau má

Centella asiatica (L.) Urban thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh, 2016, Tạp chí Hóa

học, T. 54 (3), 373-376.

6. Trần Văn Lộc, Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Lê Thị Thu Hà, Nguyễn Minh Thƣ,

Trần Văn Sung , Tổng hợp một số dẫn xuất của axit madecassic phân lập từ cây rau

má (Centella asiatica (L.) Urban) của Việt Nam, 2014, Tạp chí Hóa học, T. 52 (4),

124

508-513.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lã Đình Mỡi (chủ biên), Trần Minh Hợi, Dƣơng Đức Huyến, Trần Huy Thái,

Ninh Khắc Bản, 2005, Tài nguyên thực vật Việt Nam, Những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, tập I, trang 267, NXB Nông Nghiệp.

2 . Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, 1996, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội,

Việt Nam, trang 189, 293, 295.

3. Đỗ Huy Bích và cs, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, 2003, Nhà xuất bản KH và KT Hà Nội, tập II, trang 582-593.

4. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 1995, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, trang 791-793.

5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, 2000, Quyển II, trang 477, Nxb. Trẻ.

6. Provital Group, natural efficacy, Exclusive NA Dist. Interchem. Inc., Norwalk,

CT06850, www.centerchem.com. V02-08-06.

7. O. A. Oydefi, A. J. Afolayan, Chemical composition and Antibacterial activity of the Essential oil of Centella asiatica Growing in South Africa, 2005, Pharmaceutical Biology, Vol.43(3), 249-252.

8. L. P. Qin, R. X. Ding, W.D. Zhang, et al, Essential oil from Centella asiatica and

its antidepressant activity, 1998, Di Er Jun Yi Da Xue Xue Bao, 19 (2), 186-187.

9. C. Zheng, L. Qin, Chemical components of Centella asiatica and their

bioactivities, 2007, Journal of Chinese Integrative Medicine, 5, 3, 348-351.

10 . N. J. Chong, Z. Aziz, A systematic review on the chemical constituents of Centella asiatica, 2011, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2(3), 445-459, ISSN: 0975-8585.

11. European Pharmacopoeia 5.0, p.1236-1237.

12. B. Brinkhaus, M. Lindner, D. Schuppan, Chemical pharmacological and clinical profile of the East Asian medical plant Centella asiatica, 2000, Phytomedicine, 7 (5), 427-448.

13. Y. N. Shukla, R. Srivastava, A. K. Tripathi, et al, Characterization of an ursane triterpenoid from Centella asiatica with growth inhibitory activity against Spilarctia bliqua, 2000, Pharm. Biol, 38(4), 262-267.

125

14. H. Matsuda, T. Morikawa, H. Ueda, et al, Inhibitors of aldose reductase and new triterpene and its oligoglycoside, centellasapogenol A and centellasaponin A,

from Centella asiatica (Gotu Kola), 2001, Medicinal foodstuffs, XXVI,

Heterocycles, 55(8), 1499-1504.

15. H. Matsuda, T. Morikawa, H. Ueda, et al, Saponin constituents of gotu kola(2):

structures of new ursane and oleanane type triterpene oligoglycosides,

centellasaponins B, C and D from Centella asiatica cultivated in Sri Lanka, 2001,

Medicinal foodstuffs, XXVII, Chem. Pharm. Bull. ( Tokyo), 49(10), 1368-1371.

16. Z. Y. Jiang, X. M. Zhang, J. Zhou, New triterpenoid glycosides from Centella

asiatica, 2005, Helv Chim Acta, 88(2), 297-303.

17. W. J. Kim, Jaehoonkim, B. Veriansyah, J. Kim, Extraction of bioactive

components from Centella asiatica using subcritical water, 2009, J. of supercritical

Fluids, 48, 211-216.

18. Q. L. Yu, H. Q. Duan, Y. Takaishi, W. Y Gao, A novel triterpene from Centella

asiatica, 2006, Molecules, 4, 11(9):661-5.

19. Q. L. Yu, W. Y. Gao, Y. W. Zhang, J. Teng, H. Q. Duan, Studies on chemical

constituents in herb of Centella asiatica, 2007, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,

32(12):1182-4.

20. Y. Q. Lin, D. H. Quan, G. Wen-Yuan, Studies on chemical constituents in herb

of Centella asiatica, 2007, Chinese Chemical Letter, 18, 62.

21. M. K. Zainol, A. Abd-Hamid, S. Yusof, et al., Antioxidative activity and total

phenolic compounds of leaf, root and petiole of four accessions Centella asiatica (L.) Urban, 2003, Food Chem., 81 (4), 575 – 581.

22. G. Govindan et al., A Bioactive Polyacetylene Compound Isolated from

Centella asiatica, 2007, Planta Med. Georg. Thieme Verlag KG Stuttgart. New

York., DOI 10.1055/s-2007-981521. Published online 2007. ISSN 0032-0943.

23. J. T. James, I. A. Dubery, Pentacyclic triterpenoids from the medicinal herb,

Centella asiatica (L.) Urban., 2009, Molecules, 9;14(10), 3922-41.

24. W. Tang, G. Eisenbrand, Chinese Drugs of Plant Origin: Chemistry, Pharmacology, and Use in Traditional and Modern Medicine, 2013, Springer

Science & Business, 273-276.

25. J. Tisseuil, L'hydrocotyle asiatica (vieux remède de la lèpre), 1946, Rev. Med.

Fr., 27:14.

26. J. Polonsky, Sur la Constitution chimique de l'acide asiatique, aglycone de l'asiaticoside. Rattachement de l'acide asiatique a la serie de l'α-amyrine; formule

126

developpee de l'acide asiatique, 1953, Bull. Soc. Chim. Fr., 173-180.

27. P. Boiteau, A. Buzas, et al., Derivatives of Centella asiatica used against

leprosy, 1949, Nature 12;163(4137), 258-60.

28. P. Boiteau, Ar. Ratsimamanga, Asiaticoside extracted from Centella asiatica

and its therapeutic uses in cicatrization of experimental and refractory wounds

leprosy, cutaneous tuberculosis and lupus, 1956, Therapie. 11(1), 125-49.

29. Polonsky, J. et al., Sur la Constitution chimique de la partie glucidique de de l'asiaticoside, 1959, Bull. Soc. Chim. Fr., 880-887.

30. P. Boiteau, M. Chanez, Isolation of a new triterpenic acid from Centella asiatica

(L.) Urb. of Madagascar: madecassic acid, 1967, C. R. Acad. Sci. Hebd. Seances

Acad Sci. D, Jan 9;264(2):407-10.

31. H. Pinhas, et al., Structure de l'acide madecassique, nouveau triterpene de Centella asiatica de Madagascar, 1967, Bull. Soc. Chim. Fr., 1888-1890 and 1890-

1895.

32. H. Pinhas, Structure de l'acide madasiatique, nouvel acide triterpenique isole' de

Centella asiatica L., 1969, Bull. Soc. Chim. Fr., 3592-3595.

33. N.P. Sahu, K.S. Roy, B. Shashi, Mahato, Spectroscopic determination of

structures of triterpenoid trisaccharides from Centella asiatica, 1989,

Phytochemistry, 28(10), 2852-2854.

34. M. Yoshida, M. Fuchigami, T. Nagao, H. Okabe, K. Matsunaga, J. Takata, Y.

Karube, R. Tsuchihashi, J. Kinjo, K. Mihashi, T. Fujioka, Antiproliferative constituents from Umbelliferae plants VII. Active triterpenes and rosmarinic acid

from Centella asiatica, 2005, Biol. Pharm. Bull., 28(1):173-5.

35. B. S. Siddiqui , H. Aslam , S. T. Ali , S. Khan, S. Begum, Chemical constituents

of Centella asiatica, 2007, Journal of Asian Natural Products Research, 9:4, 407-

414, DOI: 10.1080/10286020600782454

36. C. S. Rumalla, Z. Ali, A. D. Weerasooriya, T. J. Smillie, I. A. Khan, Two new triterpene glycosides from Centella asiatica, 2010, Planta Med., 76(10):1018-21.

37. C. S. Rumalla, Z. Ali, A. D. Weerasooriya, T. J. Smillie, I. A. Khan, A new

triterpene glycoside from Centella erecta, 2010, Fitoterapia, 81(7):751-4.

38. X. X. Weng, Y. Shao, Y. Y. Chen, W. Gao, L. Cheng, D. Y. Kong, Two new

127

dammarane monodesmosides from Centella asiatica, 2011, J Asian Nat Prod Res, 13(8):749-55.

39. Jia G., Lu X., Enrichment and purification of madecassoside and asiaticoside

from Centella asiatica extracts with macroporous resins, 2008, J Chromatogr A, 6,

1193(1-2):136-41. doi: 10.1016/j.chroma.2008.04.024. Epub 2008 Apr 16.

40. M. Gao, X. Yuan, H. Xiao, Preparation of asiaticoside and madecassoside from

the extract of Centella asiatica (L.) Urb. using preparative high performance liquid

chromatograph, 2008, Article in Chinese, 26(3):362-5.

41. Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung và Phạm Đức Thắng, Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban.], 2011,

Tuyển tập các báo cáo toàn văn Hội nghị khoa học Viện Hóa học, Tr 34-38.

42. Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung, Phạm Đức Thắng, Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của cây rau má, 2012, Tạp chí hoá học, T.50 (2B), tr. 18 – 22.

43. P. Puttarak, P. Panichayupakaranant, Factors affecting the content of pentacyclic

triterpenes in Centella asiatica raw materials, 2012, Pharm Biol., 50(12), 1508-12.

44. P. Puttarak, P. Panichayupakaranant, A new method for preparing pentacyclic triterpene rich Centella asiatica extracts, 2013, Nat Prod Res, 27(7):6, 84-6.

45. B. Mamtha, K. Kavitha, K. K. Srinivasan, P. G. Shivananda, An in vitro study

of the effect of Centella asiatica [Indian pennywort] on enteric pathogens, 2004,

Research Letter, Indian J Pharmacol , Vol 36, Issue 1, 41-44.

46. M. N. Somchit et al, Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Centella

asiatica, 2004, Indian J. Pharmacology, 36 (6), 377-380.

47. C. L. Cheng, M. W. L. Koo, Effects of Centella asiatica on ethanol induced

gastric mucosal lesions in rats, 2000, Life Sciences, 67, 2647–2653.

48. Hashim P., Sidek H., Helan M. H. M, Sabery A., Palanisamy U. D., Ilham M.,

Triterpene Composition and Bioactivities of Centella asiatica, 2011, Molecules, 16:

1310-1322.

49. Tabassum R., Vaibhav K., Shrivastava P., Khan A., Amed M. E., Javed H.,

Islam F., Amad S., Siddiqui M. S., Salhi M. M., Islam F., Centella asiatica attenuates the neuro behavioral, neuro chemical and histological changes in transient focal middle cerebral artery occlusion rats, 2013, Neuro Sci.34: 925-933.

128

50. Orhan I. E., Centella asiatica (L.) Urban: From Traditional Medicine to Modern Medicine with Neuroprotective Potential, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, Hindawi Publishing Corporation, Volume 2012.

51. M. Subathra, S. Shila, M. A. Devi, C. Panneerselvam, Emerging role of

Centella asiatica in improving age-related neurological antioxidant status, 2005, Experimental Gerontology, 40 , 707–715.

52. M. R. K. Gadahad, M. Rao, G. Rao, Enhancement of Hippocampal CA3

Neuronal Dendritic Arborization by Centella, 2008, J. Chin. Med. Assoc., 71(1):6–

13.

53. Garo et al, Asiatic acid and Corosolic acid Enhance the Susceptibility of

Pseudomonas aeruginosa Biofilm to Tobramycin, 2007, Antimicrobial Agents and

chemotherapy, 51, 5, 1813-1817.

54. WHO monographs on selected medicinal plants, Vol.1.1999.

55. Wu F., Bian D., Xia Y., Gong Z., Tan Q., Chen J., Dai Y, Identification of Major Active Ingredients Responsible for Burn Wound Healing of Centella asiatica

Herbs, 2012, Hindawi Publishing Corporation, Evidence Based Complementary and

Alternative Medicine, Vol. 2012, Article ID 848093, 13 pages, doi:

10.1155/2012/848093.

56. Hsu Y. M., Hung Y. C. R., Hu L., Lee Y., Yin M., Anti–Diabetic Effects of Madecassic Acid and Rotundic Acid, Nutrients, 2015, 7:10065-10075; doi: 10.3390/7125512.

57. Won J. H., Shin J. S., Park H. J., Jung H. J. et al., Anti-inflammatory Effects of Madecassic Acid via Suppression of NF-kB Pathway in LPS-Induced RAW 264.7

Macrophage Cells, 2010, Planta Med. ;76:251-257.

58. Wang T., Wei Z., Dou Y., Yang Y. et al, Intestinal interleukin-10 mobilization as a contributor to the anti-arthritis effect of orally administered madecassoside: A

unique action mode of saponin compounds with poor bioavailability, 2015,

Biochemical pharmacology, 94:30-38.

59. Xia Y., Xia Y.-F., Lv Qi, Yue M.-F. et al, Madecassoside ameliorates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice through promoting the generation of hepatocyte growth factor via PPAR-y in colon, 2016, British Journal of

Pharmacology, 173:1219-1235.

60. Yang B., Xu Y., Luo Y., et al, Madecassic acid protects against hypoxia- induced oxidative stress in retinal microvascular endothelial cells via ROS-mediated endoplasmic reticulum stress, 2016, Biomedicine & Pharmacotherapy, 84:845-852.

129

61. Xu X., Wang Y., Wei Z., Wei W. et el, Madecassic acid, the contributor to the anti-colitis effect of madecassoside, enhances the shift of Th17 toward Treg cells

via the PPARy/ AMPK/ ACC1 pathway, 2017, Cell Death and Disease, 8(3):e2723; doi: 10.1038/cddis. 2017.150.

62. Kamble S. M., Patil C. R., Asiatic Acid Ameliorates Doxorubicin-Induced Cardiac and Hepato-Renal Toxicities with Nrf2 Transcriptional Factor Activation in Rats, 2017, Cardiovasc Toxicol. 2017 Aug 30. doi: 10.1007/s12012-017-9424-0.

63. Hao C., Wu B., Hou Z., Xie Q., Liao T., Wang T., Ma D., Asiatic acid inhibits LPS-induced inflammatory response in human gingival fibroblasts, 2017, Int Immunopharmacol. 2017 Sep;50:313-318. doi: 10.1016/j.intimp.2017.07.005.

64. Chaisawang P., Sirichoat A., Chaijaroonkhanarak W., Pannangrong W., Sripanidkulchai B., Wigmore P., Welbat J. U., Asiatic acid protects against

cognitive deficits and reductions in cell proliferation and survival in the rat

hippocampus caused by 5-fluorouracil chemotherapy, 2017, PLoS One. 2017 Jul 10;12(7):e0180650. doi: 10.1371/journal.pone.0180650.

65. Wu T., Geng J., Guo W., Gao J., Zhu X., Asiatic acid inhibits lung cancer cell growth in vitro and in vivo by destroying mitochondria, 2017, Acta Pharm Sin B. 2017 Jan;7(1):65-72. doi: 10.1016/j.apsb.2016.04.003.

66. Y. L. Hsu, P. L. Kuo, L. T. Lin, C. C. Lin, Asiatic acid, a Triterpene, Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest through Activation of Extracellular Signal-

Regulated Kinase and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways in Human

Breast Cancer Cells, 2005, The Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, 313, 1, 333-344.

67. Y. Ohnishi et al., Inhibitory effects of asiatic acid and CPT-11 on growth of HT-

29 cells, 2005, the Journal of Medical investigation, 52, 65-72.

68. J. A. Kim et al., Inhibitory Effects of Asiatic Acid on 7,12-Dimethyl

benz[a]anthracene and 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-Acetate-Induced Tumor

Promotion in Mice, 2007, Biological & pharmaceutical bulletin, 30 (1), 176-179.

69. Je-Kyung Oh et al., Use of asiatic acid or asiaticoside for treatment of cancer, United States patent, 0097463A1, 20, 2004.

70. M. F. Bruno, Gonçalves, A. R. Jorge, Salvador, Silvia Marín, Marta Cascante, Synthesis and anticancer activity of novelfluorinated asiatic acid derivatives, 2016,

European Journal of Medicinal Chemistry, 114, 101-117.

130

71. L. Ren, Q. X. Cao, F. R. Zhai, S. Q. Yang & H. X. Zhang, Asiatic acid exerts in human ovarian cancer cells via suppression of anticancer potential

DOI: PI3K/Akt/mTOR Pharmaceutical signalling, Biology, 2016,

10.3109/13880209.2016.1156709.

72. Bruno M. F. Gonçalves, Jorge A. R. Salvador, Silvia Maríncd and Marta

Cascante, Synthesis and biological evaluation of novel asiatic acid derivatives with

anticancer activity, 2016, RSC Adv.,6, 3967-3985, 10.1039/C5RA19120C.

73. Jew S. S., Park H. G., Kim H. D., Joung H. J., Kim J. C., Kim H. P., Lee M. K., Choi H. S., Lee E. S., Yoo C. H., Lim D. Y., Kim J. H., Seo S. K., Nam T. G., Han

D., Shim P. J., Jung J. E., Beom H. J., Asiatic acid dervatives having modified A-

ring, 2000, United States patent 6:071-898.

74. Mei Liu et al, Madecassoide isolated from Centella asiatica Herbs Facilitates

Burn Wound Healing in Mice, 2008, Planta Medica, 74, 809-815.

75. X. L. Tang, X. Y. Yang, H. J. Jung, S. Y. Kim, S. Y. Jung, D. Y. Choi, W. C.

Park, and Hyun Park, Asiatic Acid Induces Colon Cancer Cell Growth Inhibition

and Apoptosis through Mitochondrial Death Cascade, 2009, Biol. Pharm. Bull,

32(8), 1399-1405.

76. K. Y. Lee, O. N. Bae, S. Weinstock, M. Kassab, A. Majid, Neuroprotective Effect of Asiatic Acid in Rat Model of Focal Embolic Stroke, 2014, Biol. Pharm.

Bull., 37(8) 1397–1401.

77. S.L.Yan, H.T.Yang, Y.J. Lee, C.C. Lin, M.H. Chang, M.C. Yin, Asiatic Acid

in Mice Ameliorates Hepatic Lipid Accumulation and Insulin Resistance Consuming a High-Fat Diet, 2014, dx.doi.org/10.1021/jf501165z|, J. Agric. Food

Chem., 62, 4625−4631.

78. L. Si, J. Xu, C. Yi, X. Xu, F. Wang, W. Gu, Y. Zhang, X. Wang, Asiatic acid

attenuates cardiac hypertrophy by blocking transforming growth factor-β1-mediated

hypertrophic signaling in vitro and in vivo, 2014, International jounal of molecular medicine 34: 499-506.

79. S. Bunbupha, P. Pakdeechote, U. Kukongviriyapan, P. Prachaney, V. Kukongviriyapan, Asiatic Acid Reduces Blood Pressure by Enhancing Nitric Oxide Bioavailability with Modulation of eNOS and p47phox Expression in L-NAME-

induced Hypertensive Rats, 2014, Phytother. Res.28: 1506–1512.

80. Bruno M. F. Gonçalves, Jorge A. R. Salvador, Diana S. M. Santos, Silvia Maríncd and Marta Cascante, Design, synthesis, and biological evaluation of novel

131

asiatic acid derivatives as potential anticancer agents, 2016, Issue 45, Issue in Progress, RSC Adv, 6, 39296-39309.

81. Ahmad Rather M., Justin Thenmozhi A., Manivasagam T., Nataraj J., Mohamed

Essa M., Chidambaram S. B., Asiatic acid nullified aluminium toxicity in in vitro model of Alzheimer's disease, 2018, Front Biosci (Elite Ed), 10:287-299.

82. J. Somboonwong, M. Kankaisre, B. Tantisira, M. H. Tantisira, Wound Healing

Activities of Different Extracts of Centella asiatica in Incision and Burn Wound

Models: An Experimental Animal Study, BMC Complement, 2012, Altern Med Rev., 12, 103.

83. B. C. Park, K. O. Bosire, E. S. Lee, Y. S. Lee, J. A. Kim, Asiatic acid induces

apoptosis in SK-MEL-2 human melanoma cells, 2005, Cancer Lett., 218, 81–90.

84. Y. M. Fan, L. Z. Xu, J. Gao, Y. Wang, X. H. Tang, X. N. Zhao, Z. X. Zhang,

Phytochemical and antiinflammatory studies on Terminalia catappa., 2004, Fitoterapia., 75, 253–260.

85. J. Gao, X. Tang, H. Dou, Y. Fan, X. Zhao, Q. Xu, Hepatoprotective activity of

Terminalia catappa L. leaves and its two triterpenoids, 2004, J. Pharm. Pharmacol,

56, 1449–1455.

86. S. S. Jew, C. H. Yoo, D. Y. Lim, H. Kim, I. Mook-Jung, M. Whan Jung, H.

Choi, Y.H. Jung, H. Kim, H.G. Park, Structure–activity relationship study of asiatic

acid derivatives against beta amyloid (Aβ)-induced neurotoxicity, 2000, Bioorg.

Med. Chem. Lett, 10, 119–121.

87. Li J. F., Huang R. Z., Yao G. Y., Ye M. Y., Wang H. S., Pan Y. M., Xiao J. T., Synthesis and biological evaluation of novel aniline-derived asiatic acid derivatives

as potential anticancer agents, 2014, Eur. J. Med. Chem., 86:175-188.

88. Jing Y., Wuang G., Ge Y., Xu M., Tang S., Gong Z. AA-Pme, A novel asiatic acid derivative, induces apoptosis and suppresses proliferation, migration, and

invasion of gastric cancer cell, 2016, Onco Targets and Therapy. 9: 1605-1621.

89. Jew S. S., Kim H. D., Jung J. H., Park J. H., Seo S. K., Nam T. G, Hahn D. K., Park J. H., Sim P. J, Lim M. J., Lin K. H, Asiatic acid derivatives its manufacturing method and dermatological agent containing it, 1998, United States patent, 5:834- 437.

90. Jeong B. S., Structure-Activity Relationship Study of Asiatic acid Derivatives for New Wound Healing Agent, 2006, Arch Pharm Res, 29 (7): 556-562.

132

91. Dong M. S., Jung S. H., Kim H. J., Kim J. R., Zhao L. X., Lee E. S., Lee E. J., Yi J. B., Lee N., Cho Y. B., Kwuk W.J., Park Y.I, Structure-Related Cytotoxicity

and Anti-hepatofibric Effect of asiatic acid Derivatives in Rat Hepatic Stellate cell-

line, HSC-T6, 2004, Archives of Pharmacal Research, 27:512-517.

92 . Yue Jing, Gang Wang, Ying Ge, Minjie Xu and Zhunan Gong, Synthesis, Anti- Tumor and Anti-Angiogenic Activity Evaluations of Asiatic Acid Amino Acid Derivatives, 2015, Molecules, 20, 7309-7324; doi:10.3390/molecules20047309.

93. Jeong B., Kim Y.C., Lee E., Modification of C2,3,23,28 Functional Groups on

Asiatic Acid and Evaluation of Hepatoprotective Effects, 2007, Bull. Korean Chem. Soc, 28: 977-982.

94. Zhao L.X., Park H., Jew S., Lee M. K., Kim Y. C., Thapa P., Karki R., Jahng

Y., Jeong B., Lee E., Modification of C11, C28, C2,3,23 or C2,23,28 Functional Groups on Asiatic Acid and Evaluation of Hepatoprotective Effects, 2007, Bull.

Korean Chem. Soc., 28: 970-976.

95 . Li J., Yuan M., Jiang L., Yuan L., Zhang X., Zhang X., Li Y., Dong L., Bao X.,

Yin S., Synthesis and evaluation of asiatic acid derivatives as anti-fibrotic agents:

Structury activity studues, 2015, Steroids 96, 44-49.

96. Kita Y., Zasshi Y., Development of novel synthetic organic reactions: synthesis

of antitumor natural products and leading compounds for new pharmaceuticals,

2002, Article in Japanese, 122, 1011.

97. Marumoto S., Miyazawa M., Biotransformation of isoimperatorin and

imperatorin by Glomerella cingulata and beta-secretase inhibitory activity, 2010,

Bioorg. Med. Chem.,18, 455.

98. Muffler K., Leipolda D., Schellera M.C., Haasb C., Stingroewerb J., Bleyb T.,

Neuhausc H.E., Miratad M.A., Schraderd J., Ulbera R., 2011, Process Biochem.46.

99. Ton Nu Lien Huong, Nguyen Kim Phi Phung, Nguyen Ngoc Suong,

Contribution to the study on Chemical constituents of Hydrocotyle vulgaris (L.),

Apiaceae, 2009, Tạp chí phát triển KH&CN, tập12, Số 10, tr.29-32.

100. Nguyễn Hoàng Lộc, Phan Thị Á Kim, Nguyễn Hoàng Bách, Trƣơng Thị Bích Phƣợng, TaeGeum Kim, TaeJin Kang, MoonSik Yang, “Biểu Hiện LTB (escherichia coli heatlabile enterotoxin b subunit) trong cây rau má (Centella

asiatica (L.) Urban)”, 2009, Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(3A), pp.2-5.

133

101. Nguyễn Thị Trúc Loan , Ly trích tinh dầu của cây rau má (hydrocotyle asiatica), 2009, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Đồng Tháp.

102. Nguyễn Thị Vân Anh, Nghiên cứu điều kiện chiết tách asiaticoside từ rau má

(Centella asiatica) và ứng dụng trong sản xuất trà chức năng từ rau má, 2010, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Đà Nẵng.

103. Lê Thị Huyền, Nghiên cứu chiết xuất một số hoạt chất saponin từ rau má (Centella asiatica (L.) Urb.- Apiaceae), 2010, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Huế, Trƣờng Đại học Khoa học, Huế.

104. Nguyễn Thụy Hai, Nguyễn Minh Đức, ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong điều chế chất chuẩn asiaticosid, Y Hoc TP. Ho Chi Minh, 2010, Vol. 14 -

Supplement of No 1 - 2010: 59-63, ISSN 1859-1779.

105. Nguyễn Thị Hoài, Bế Thị Thuấn, Chu Đình Kính, Phân lập và xác định cấu trúc của Asiaticoside chiết xuất từ rau má, 2004, TC Dược liệu, 9, 51-55.

106. Nguyễn Thị Hoài, Phân lập acid asiatic và acid madecasic từ rau má (Centella

asiatica (L.) Urb., Apiaceae) thu hái tại Thừa Thiên Huế, 2011, Tạp chí Dược học,

T. 51, S. 8, ISSN: 0866-7861.

107. Nguyễn Thị Hoài, Định lƣợng asiaticosid, acid asiatic và acid madecasic trong

rau má (Centella asiatica (L.) Urb., Apiaceae) bằng HPLC, 2011, Tạp chí Dược

học, T. 51, S. 10, ISSN: 0866-7861.

108. Nguyễn Ngọc Hạnh, Lê Ngọc Thạch, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt

tính kháng khuẩn của tinh dầu rau má (Centella asiatica (L.) Urban), 2011, Tạp chí

Dược học, T51, S12, tr 27-30, ISSN: 0866-7861.

109. Nhiem N .X., Tai B .H., Quang T. H., Kiem P. V., Minh C. V., Nam N. H.,

Kim J. H., Im L.R, Lee YM, Kim YH, A new ursane-type triterpenoid glycoside

from Centella asiatica leaves modulates the production of nitric oxide and secretion

of TNF-α in activated RAW 264.7 cells, 2011, Bioorg, Med. Chem. Lett., 15,

21(6):1777-81.

110. Phạm Đức Thắng, Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis T.H. Nguyen & Kiew) và cây rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban], 2012, Luận án Tiến sỹ Hóa học.

111. Tim Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:

Application to proliferation and cytotoxicity assay, 1983, Journal of immunological methods, 65: 55-63.

112. Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S.,

134

Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R., Evaluation of a soluable

tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using

human and other tumor cell lines, 1988, Cancer Reseach, 48: 4827-4833.

113. Cos P., Vlietinck A. J., Vanden B. D., Maes LAnti-infective potential of nature

products: How to develop a stronger in vitro „proof-of-concept‟, 2006, Journal of

Ethnopharmacology, 106(3): 290-302.

114. Blazka M. E., Germolec D. R., Simeonava P. P., Bruccoleri A., Pennypacker K. R., Luster M. I., Acetaminophen-induced hepatoxicity is associated with early

changes in NF-kB and NF-IL6 DNA binding activity, 1996, J. Inflammation, 47,

138-150 .

115. Haigis M. C., Sinclair D. A., Mammalian sirtuins: biological insights and

disease relevance, 2010, Annual review of pathology, 5:253.

116. Jung M., Neugebauer R. C., Sippl W., Inhibitors of NAD+ dependent histone

deacetylases (sirtuins), 2008, Current pharmaceutical design, 14(6):562-73.

117. Zhao X., Allison D., Condon B., Zhang F., Gheyi T., Zhang A., et al, The 2.5

A crystal structure of the SIRT1 catalytic domain bound to nicotinamide adenine

dinucleotide (NAD+) and an indole (EX527 analogue) reveals a novel mechanism

of histone deacetylase inhibition, 2013, J Med Chem., 56(3):963-9.

118. Aka J. A., Mazumdar M., Chen C. Q., Poirier D., Lin S. X., 17β-

Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Stimulates Breast Cancer by

Dihydrotestosterone Inactivation in Addition to Estradiol Production, 2010, Molecular Endocrinology, 24(4):832-45.

119. Drzewiecka H., Gałęcki B., Jarmołowska-Jurczyszyn D., Kluk A.,

Dyszkiewicz W., Jagodziński P. P., Increased expression of 17-beta-hydroxysteroid

dehydrogenase type 1 in non-small cell lung cancer, 2015, Lung Cancer, 87(2):107-

16.

120. Frisch M. J. T., et al., Gaussian 09, Revision A.1 ed. Wallingford CT: Gaussian, Inc., 2009.

121. Su K., Gong M., Zhou J., Deng S., Study on chemical composition of Nauclea officinalis leaves, 2009, International Journal of Chemistry, 1(2), 77-81.

122. Jeong B. S., Kyeong M., Kim Y. C., Lee E. S., Modification of C2 Functional

135

Group on Asiatic Acid and the Evaluation of Hepatoprotective Effects, 2007, Arch Pharm Res, 30(3), 282-289.

123. Bisoli E., Garcez W. S., Hamerski L., Tieppo C., Garcez F. R., Bioactive

Pentacyclic Triterpenes from the Stems of Combretum laxum, 2008, Molecules, 13, 2717-2728.

124. Zhang L., Chen J., GongY., Liu J., Zhang L., Hua W., Sun H., Synthesis and

Biological Evaluation of Asiatic Acid Derivatives as Inhibitors of Glycogen

136

Phosphorylases, 2009, Chemistry and Biodiversity, 6: 864-874.

MỤC LỤC PHỤ LỤC PHỔ

PL 1

Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất 1 (2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid) .............................................................................................................................. 11 Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất 10 (2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-en-28-oic acid) ...................................................................................................................... 16 Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất madecassoside (14).......................................... 20 Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất 145 (2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oic acid) ...................................................................................................................... 24 Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất 147 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-heptylamine) .............................................................................................. 26 Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất 148 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-nonylamine) .............................................................................................. 28 Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất 149 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-decylamine) ............................................................................................... 31 Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất 150 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-propanol) ................................................................................................... 34 Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất 151 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-hydrazide) ..................................................................................................... 37 Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất 152 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-glycine ethyl ester) ....................................................................................... 41 Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất 153 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-imidazol) ....................................................................................................... 44 Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất 154 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-methylhydrazide) .......................................................................................... 46 Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất 155 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-isopropyl) ...................................................................................................... 47 Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất 156 (N,N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-ethanol) ......................................................................................................... 50 Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất 157 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-propyl acetate) ........................................................................................... 52 Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất 158 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-heptylacetamide) ....................................................................................... 54 Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất 159 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-nonylacetamide) ........................................................................................ 56 Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất 160 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-decylacetamide) ........................................................................................ 61 Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất 161 (N,N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28- oyl) ethyl acetate) ................................................................................................. 64 Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất 162 (N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-heptylamine) .............................................................................................. 66 Phụ lục 21. Các phổ của hợp chất 163 (N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-nonylamine) .............................................................................................. 68 Phụ lục 22. Các phổ của hợp chất 164 (N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28- oyl)-n-decylamine) ............................................................................................... 71

PL 2

Phụ lục 23. Các phổ của hợp chất 166 (N,N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28- oyl)-ethanol) ......................................................................................................... 74 Phụ lục 24. Các phổ của hợp chất 167 (2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-amide) .............................................................................................................................. 75 Phụ lục 25. Các phổ của hợp chất 168 (2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28- amide) ................................................................................................................... 78 Phụ lục 26. Các phổ của hợp chất 169 (2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-17-nitrile) .............................................................................................................................. 81 Phụ lục 27. Các phổ của hợp chất 170 (2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-17- nitrile) ................................................................................................................... 85 Phụ lục 28. Các phổ của hợp chất 171 (2α-hydroxy-3β,23-isopropylidenedioxy- urs-12-ene-28-oic acid) ........................................................................................ 88 Phụ lục 29. Các phổ của hợp chất 172 (2α-succinoyl-3β,23-isopropylidenedioxy- urs-12-ene-28-oic acid) ........................................................................................ 91 Pụ lục 30. Các phổ của hợp chất 173 (2α-O-acetyl-3β,23-isopropylidenedioxy- urs-12-ene-28-oic acid) ........................................................................................ 93 Phụ lục 31. Các phổ của hợp chất 174 (2α-acetoxy-3β,23-dihydroxy-urs-12-ene- 28-oic acid) ........................................................................................................... 96 Phụ lục 32. Các phổ của hợp chất 175 (6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12- ene-28-oic acid) .................................................................................................... 98 Phụ lục 33. Các phổ của hợp chất 177 (N,N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-ethanol) ............................................................................... 102 Phụ lục 34. Các phổ của hợp chất 178 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-n-propanol)................................................................................ 105 Phụ lục 35. Các phổ của hợp chất 179 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-isopropyl) .................................................................................. 109 Phụ lục 36. Các phổ của hợp chất 180 (6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12- ene-28-amide) .................................................................................................... 111 Phụ lục 37. Các phổ của hợp chất 181 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-n-heptylamine) .......................................................................... 112 Phụ lục 38. Các phổ của hợp chất 182 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-n-nonylamine) ........................................................................... 114 Phụ lục 39. Các phổ của hợp chất 183 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-n-decylamine) ........................................................................... 117 Phụ lục 40. Các phổ của hợp chất 184 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-glycine ethyl ester) .................................................................... 120 Phụ lục 41. Các phổ của hợp chất 185 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs- 12-ene-28-oyl)-imidazol) ................................................................................... 123 Phụ lục 42. Các phổ của hợp chất 186 (N,N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12- ene-28-oyl)-ethanol) ........................................................................................... 127 Phụ lục 43. Các phổ của hợp chất 187 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene- 28-oyl)-n-propanol) ............................................................................................ 129 Phụ lục 44. Các phổ của hợp chất 188 (2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28- amide) ................................................................................................................. 133 Phụ lục 45. Các phổ của hợp chất 189 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene- 28-oyl)-n-heptylamine) ...................................................................................... 136

PL 3

Phụ lục 46. Các phổ của hợp chất 190 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene- 28-oyl)-n-nonylamine) ....................................................................................... 139 Phụ lục 47. Các phổ của hợp chất 191 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene- 28-oyl)-n-decylamine) ........................................................................................ 140 Phụ lục 48. Mô hình docking phân tử giữa một số dẫn của asiatic acid, madecassic acid với emzyme Sirtuin 1 (SIRT 1) và 17β-hydroxy steroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1). ................................................................... 143 Phụ lục 49. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất của chúng ...................................................................................... 147

MỤC LỤC HÌNH

PL 4

Hình 1. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất asiatic acid (1) ............................ 11 Hình 2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1 .................. 11 Hình 3. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1 .................. 12 Hình 4. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1 .................. 12 Hình 5. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1 ................. 13 Hình 6. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1 ................ 13 Hình 7. Phổ H-H-COSY của hợp chất asiatic acid (1) ........................................ 14 Hình 8. Phổ HSQC của hợp chất asiatic acid (1) ................................................. 14 Hình 9. Phổ HMBC của hợp chất asiatic acid (1) ................................................ 15 Hình 10. Phổ HMBC của hợp chất asiatic acid (1) .............................................. 15 Hình 11. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất madecassic acid (10) ................ 16 Hình 12. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 10 ........................................................ 16 Hình 13. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 10 ............................. 17 Hình 14. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 10 ............................. 17 Hình 15. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 10 ............................. 18 Hình 16. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 10 ............................ 18 Hình 17. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 10 ............................ 19 Hình 18. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 10 ........................... 19 Hình 19. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) .... 20 Hình 20. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) .... 21 Hình 21. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) .... 21 Hình 22. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) ... 22 Hình 23. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) ... 22 Hình 24. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) ... 23 Hình 25. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14) .. 23 Hình 26. Phổ hồng ngoại FT-IR của hợp chất 145 .............................................. 24 Hình 27. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 145 ............................. 24 Hình 28. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 145 ............................ 25 Hình 29. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 145 ........................... 25 Hình 30. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 147 ...................................................... 26 Hình 31. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 147 ........................... 26 Hình 32. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 147 .......................... 27 Hình 33. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 147 ......................... 27 Hình 34. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 148 ...................................................... 28 Hình 35. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 148 ........................... 28 Hình 36. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 148 ........................... 29 Hình 37. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 148 ........................... 29 Hình 38. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 148 .......................... 30 Hình 39. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 148 ......................... 30 Hình 40. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 149 ...................................................... 31 Hình 41. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 149 ........................... 31 Hình 42. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 149 ........................... 32 Hình 43. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 149 ........................... 32

PL 5

Hình 44. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 149 .......................... 33 Hình 45. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 149 .......................... 33 Hình 46. Phổ hồng ngoại FT-IR của hợp chất 150 .............................................. 34 Hình 47. Phổ ESI-MS của hợp chất 150 .............................................................. 34 Hình 48. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 150 ............................. 35 Hình 49. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 150 ............................ 35 Hình 50. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 150 ............................ 36 Hình 51. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 150 ........................... 36 Hình 52. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 151............................................ 37 Hình 53. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 151 ...................................................... 37 Hình 54. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 151 ............................. 38 Hình 55. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 151 ............................. 38 Hình 56. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 151 ............................. 39 Hình 57. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 151 ............................ 39 Hình 58. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 151 ............................ 40 Hình 59. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 151 ........................... 40 Hình 60. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 152 ...................................................... 41 Hình 61. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 152 ............................. 41 Hình 62. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 152 ............................. 42 Hình 63. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 152 ............................. 42 Hình 64. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 152 ............................ 43 Hình 65. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 152 ............................ 43 Hình 66. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 153 ............................. 44 Hình 67. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 153 ............................. 44 Hình 68. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 153 ............................ 45 Hình 69. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 153 ............................ 45 Hình 70. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 154 ............................. 46 Hình 71. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 154 ............................. 46 Hình 72. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 155............................................ 47 Hình 73. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 155 ............................. 47 Hình 74. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 155 ............................. 48 Hình 75. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 155 ............................. 48 Hình 76. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 155 ............................ 49 Hình 77. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 155 ........................... 49 Hình 78. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 156 ........................... 50 Hình 79. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 156 .......................... 50 Hình 80. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 156 ........................... 51 Hình 81. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 156 .......................... 51 Hình 82. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 157............................................ 52 Hình 83. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 157 ...................................................... 52 Hình 84. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 157 ............................. 53 Hình 85. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 157 ............................. 53 Hình 86. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 158............................................ 54 Hình 87. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 158 ............................. 54 Hình 88. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 158 ............................ 55 Hình 89. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 158 ........................... 55

PL 6

Hình 90. Phổ FT-IR của hợp chất 159 ................................................................. 56 Hình 91. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 159 ............................. 56 Hình 92. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 159 ............................ 57 Hình 93. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 159 ........................... 57 Hình 94. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159 ........................ 58 Hình 95. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159 ........................ 58 Hình 96. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159 ........................ 59 Hình 97. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159 ........................ 59 Hình 98. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HSQC của hợp chất 159 ......................... 60 Hình 99. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HSQC của hợp chất 159 ......................... 60 Hình 100. Phổ hồng ngoại của hợp chất 160 ....................................................... 61 Hình 101. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 160 .................................................... 61 Hình 102. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 160 ........................... 62 Hình 103. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 160 ........................... 62 Hình 104. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 160 ........................... 63 Hình 105. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 160 ......................... 63 Hình 106. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 161 ......................... 64 Hình 107. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 161 ......................... 64 Hình 108. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 161 ......................... 65 Hình 109. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 162 .................................................... 66 Hình 110. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 162 ......................... 66 Hình 111. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 162 ........................ 67 Hình 112. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 162 ....................... 67 Hình 113. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 163 .................................................... 68 Hình 114. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 163 ......................... 68 Hình 115. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 163 ......................... 69 Hình 116. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 163 ......................... 69 Hình 117. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 163 ........................ 70 Hình 118. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 163 ....................... 70 Hình 119. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 164 .................................................... 71 Hình 120. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 164 ......................... 71 Hình 121. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 164 ......................... 72 Hình 122. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 164 ......................... 72 Hình 123. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 164 ........................ 73 Hình 124. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 164 ....................... 73 Hình 125. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 166.......................................... 74 Hình 126. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 166 .................................................... 74 Hình 127. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 167.......................................... 75 Hình 128. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 167 .................................................... 75 Hình 129. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 167 ........................... 76 Hình 130. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 167 ........................... 76 Hình 131. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 167 ........................... 77 Hình 132. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 167 ......................... 77 Hình 133. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 168.......................................... 78 Hình 134. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 168 .................................................... 78 Hình 135. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 168 ......................... 79

PL 7

Hình 136. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 168 ......................... 79 Hình 137. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 168 ......................... 80 Hình 138. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 168 ....................... 80 Hình 139. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 169.......................................... 81 Hình 140. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 169 .................................................... 81 Hình 141. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 169 ........................... 82 Hình 142. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 169 ........................... 82 Hình 143. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 169 ........................... 83 Hình 144. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 169 .......................... 83 Hình 145. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 169 ......................... 84 Hình 146. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 170.......................................... 85 Hình 147. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 170 .................................................... 85 Hình 148. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 170 ......................... 86 Hình 149. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 170 ......................... 86 Hình 150. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 170 ........................ 87 Hình 151. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 170 ....................... 87 Hình 152. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 171.......................................... 88 Hình 153. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 171 .................................................... 88 Hình 154. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 171 ......................... 89 Hình 155. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 171 ......................... 89 Hình 156. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 171 ........................ 90 Hình 157. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 171 ....................... 90 Hình 158. Phổ hồng ngoại FT-IR của hợp chất 172 ............................................ 91 Hình 159. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 172 .................................................... 91 Hình 160. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 172 ........................... 92 Hình 161. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 172 ......................... 92 Hình 162. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 173.......................................... 93 Hình 163. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 173 .................................................... 93 Hình 164. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 173 ........................... 94 Hình 165. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 173 ........................... 94 Hình 166. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 173 ........................... 95 Hình 167. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 173 ......................... 95 Hình 168. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 174.......................................... 96 Hình 169. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 174 .................................................... 96 Hình 170. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 174 ......................... 97 Hình 171. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 174 ....................... 97 Hình 172. Phổ hồng ngoại IR (KBr) của hợp chất 175 ........................................ 98 Hình 173. Phổ khối (-) ESI-MS của hợp chất 175 ............................................... 98 Hình 174. Phổ khối (+) ESI-MS của hợp chất 175 .............................................. 99 Hình 175. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 175 ........................... 99 Hình 176. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 175 ......................... 100 Hình 177. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 175 ......................... 100 Hình 178. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 175 ........................ 101 Hình 179. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 175 ....................... 101 Hình 180. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 177 ....................... 102 Hình 181. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 177 ....................... 102

PL 8

Hình 182. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 177 ....................... 103 Hình 183. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 177 ...................... 103 Hình 184. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 177 ...................... 104 Hình 185. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 177 ..................... 104 Hình 186. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 178........................................ 105 Hình 187. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 178 .................................................. 105 Hình 188. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 178 ....................... 106 Hình 189. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 178 ....................... 106 Hình 190. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 178 ....................... 107 Hình 191. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 178 ...................... 107 Hình 192. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 178 ...................... 108 Hình 193. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 178 ..................... 108 Hình 194. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 179 ......................... 109 Hình 195. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 179 ......................... 109 Hình 196. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 179 ......................... 110 Hình 197. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 179 ....................... 110 Hình 198. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 180........................................ 111 Hình 199. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 180 ......................... 111 Hình 200. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 181 .................................................. 112 Hình 201. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 181 ....................... 112 Hình 202. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 181 ...................... 113 Hình 203. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 181 ...................... 113 Hình 204. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 182 .................................................. 114 Hình 205. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 182 ....................... 114 Hình 206. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 182 ....................... 115 Hình 207. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 182 ....................... 115 Hình 208. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 182 ...................... 116 Hình 209. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 182 ...................... 116 Hình 210. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 183 .................................................. 117 Hình 211. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 183 ......................... 117 Hình 212. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 183 ......................... 118 Hình 213. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 183 ......................... 118 Hình 214. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 183 ........................ 119 Hình 215. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 183 ....................... 119 Hình 216. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 184 .................................................. 120 Hình 217. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 184 ....................... 120 Hình 218. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 184 ....................... 121 Hình 219. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 184 ....................... 121 Hình 220. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 184 ...................... 122 Hình 221. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 184 ...................... 122 Hình 222. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 185 .................................................. 123 Hình 223. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 185 .................................................. 123 Hình 224. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 185 ......................... 124 Hình 225. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 185 ......................... 124 Hình 226. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 185 ......................... 125 Hình 227. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 185 ...................... 125

PL 9

Hình 228. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 185 ...................... 126 Hình 229. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 185 ...................... 126 Hình 230. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 186 .................................................. 127 Hình 231. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 186 ......................... 127 Hình 232. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 186 ........................ 128 Hình 233. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 186 ....................... 128 Hình 234. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 187........................................ 129 Hình 235. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 187 .................................................. 129 Hình 236. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 187 ....................... 130 Hình 237. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 187 ....................... 130 Hình 238. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 187 ....................... 131 Hình 239. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 187 ...................... 131 Hình 240. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 187 ...................... 132 Hình 241. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 187 ..................... 132 Hình 242. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 188........................................ 133 Hình 243. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 188 ....................... 133 Hình 244. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 188 ....................... 134 Hình 245. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 188 ....................... 134 Hình 246. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 188 ...................... 135 Hình 247. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 188 ..................... 135 Hình 248. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 189 .................................................. 136 Hình 249. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 189 ....................... 136 Hình 250. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 189 ....................... 137 Hình 251. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 189 ....................... 137 Hình 252. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 189 ...................... 138 Hình 253. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 189 ..................... 138 Hình 254. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 190 ....................... 139 Hình 255. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 190 ...................... 139 Hình 256. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 191 .................................................. 140 Hình 257. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 191 ....................... 140 Hình 258. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 191 ....................... 141 Hình 259. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 191 ....................... 141 Hình 260. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 191 ...................... 142 Hình 261. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 191 ..................... 142 Hình 262. Mô hình liên kết một số dẫn xuất của của asiatic acid, madecassic acid với emzyme Sirtuin 1 (SIRT 1). Các thụ thể nhận hydro (Hydrogen Bond Acceptor) được hiển thị dưới dạng vectơ màu xanh lá cây, các chất cho hydro (Hydrogen Bond Donor) được hiển thị dưới dạng vectơ màu đỏ. Phần ưa nước (Hydrophobic) được hiển thị dưới dạng hình cầu màu vàng. ............................ 144 Hình 263. Mô hình liên kết một số dẫn xuất của của asiatic acid, madecassic acid với emzyme 17β-HSD1. Các hợp chất giống như thí nghiệm với SIRT1. Các thụ thể nhận hydro (Hydrogen Bond Acceptor) được hiển thị dưới dạng vectơ màu xanh lá cây, các chất cho hydro (Hydrogen Bond Donor) được hiển thị dưới dạng vectơ màu đỏ. Phần ưa nước (Hydrophobic) được hiển thị dưới dạng hình cầu màu vàng. ........................................................................................................... 146

PL 10

Hình 264. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của asiatic acid và các dẫn xuất (1) ....................................................................................................................... 147 Hình 265. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của asiatic acid và các dẫn xuất (2) ....................................................................................................................... 148 Hình 266. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của madecassic acid và các dẫn xuất ..................................................................................................................... 149

Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất 1 (2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-oic

acid)

Hình 1. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất asiatic acid (1)

PL 11

Hình 2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1

Hình 3. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1

PL 12

Hình 4. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1

Hình 5. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1

PL 13

Hình 6. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất hợp chất 1

Hình 7. Phổ H-H-COSY của hợp chất asiatic acid (1)

PL 14

Hình 8. Phổ HSQC của hợp chất asiatic acid (1)

Hình 9. Phổ HMBC của hợp chất asiatic acid (1)

PL 15

Hình 10. Phổ HMBC của hợp chất asiatic acid (1)

Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất 10 (2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-en-28-

oic acid)

Hình 11. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất madecassic acid (10)

PL 16

Hình 12. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 10

Hình 13. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 10

PL 17

Hình 14. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 10

Hình 15. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 10

PL 18

Hình 16. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 10

Hình 17. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 10

PL 19

Hình 18. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 10

Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất madecassoside (14)

PL 20

Hình 19. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

Hình 20. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

PL 21

Hình 21. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

Hình 22. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

PL 22

Hình 23. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

Hình 24. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

PL 23

Hình 25. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất madecassoside (14)

Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất 145 (2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oic

acid)

Hình 26. Phổ hồng ngoại FT-IR của hợp chất 145

PL 24

Hình 27. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 145

Hình 28. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 145

PL 25

Hình 29. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 145

Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất 147 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-heptylamine)

Hình 30. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 147

PL 26

Hình 31. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 147

Hình 32. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 147

PL 27

Hình 33. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 147

Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất 148 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-nonylamine)

Hình 34. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 148

PL 28

Hình 35. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 148

Hình 36. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 148

PL 29

Hình 37. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 148

Hình 38. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 148

PL 30

Hình 39. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 148

Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất 149 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-decylamine)

Hình 40. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 149

PL 31

Hình 41. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 149

Hình 42. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 149

PL 32

Hình 43. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 149

Hình 44. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 149

PL 33

Hình 45. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 149

Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất 150 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-propanol)

Hình 46. Phổ hồng ngoại FT-IR của hợp chất 150

PL 34

Hình 47. Phổ ESI-MS của hợp chất 150

Hình 48. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 150

PL 35

Hình 49. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 150

Hình 50. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 150

PL 36

Hình 51. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 150

Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất 151 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-hydrazide)

Hình 52. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 151

PL 37

Hình 53. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 151

Hình 54. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 151

PL 38

Hình 55. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 151

Hình 56. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 151

PL 39

Hình 57. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 151

Hình 58. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 151

PL 40

Hình 59. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 151

Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất 152 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-glycine ethyl ester)

Hình 60. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 152

PL 41

Hình 61. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 152

Hình 62. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 152

PL 42

Hình 63. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 152

Hình 64. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 152

PL 43

Hình 65. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 152

Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất 153 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-imidazol)

Hình 66. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 153

PL 44

Hình 67. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 153

Hình 68. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 153

PL 45

Hình 69. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 153

Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất 154 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-methylhydrazide)

Hình 70. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 154

PL 46

Hình 71. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 154

Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất 155 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-isopropyl)

Hình 72. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 155

PL 47

Hình 73. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 155

Hình 74. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 155

PL 48

Hình 75. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 155

Hình 76. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 155

PL 49

Hình 77. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 155

Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất 156 (N,N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-

28-oyl)-ethanol)

Hình 78. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 156

PL 50

Hình 79. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 156

Hình 80. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 156

PL 51

Hình 81. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 156

Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất 157 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-propyl acetate)

Hình 82. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 157

PL 52

Hình 83. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 157

Hình 84. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 157

PL 53

Hình 85. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 157

Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất 158 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-heptylacetamide)

Hình 86. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 158

PL 54

Hình 87. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 158

Hình 88. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 158

PL 55

Hình 89. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 158

Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất 159 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-nonylacetamide)

Hình 90. Phổ FT-IR của hợp chất 159

PL 56

Hình 91. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 159

Hình 92. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 159

PL 57

Hình 93. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 159

Hình 94. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159

PL 58

Hình 95. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159

Hình 96. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159

PL 59

Hình 97. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC của hợp chất 159

Hình 98. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HSQC của hợp chất 159

PL 60

Hình 99. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HSQC của hợp chất 159

Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất 160 (N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

oyl)-n-decylacetamide)

Hình 100. Phổ hồng ngoại của hợp chất 160

PL 61

Hình 101. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 160

Hình 102. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 160

PL 62

Hình 103. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 160

Hình 104. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 160

PL 63

Hình 105. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 160

Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất 161 (N,N-(2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-

28-oyl) ethyl acetate)

Hình 106. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 161

PL 64

Hình 107. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 161

PL 65

Hình 108. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 161

Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất 162 (N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-

28-oyl)-n-heptylamine)

Hình 109. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 162

PL 66

Hình 110. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 162

Hình 111. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 162

PL 67

Hình 112. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 162

Phụ lục 21. Các phổ của hợp chất 163 (N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-

28-oyl)-n-nonylamine)

Hình 113. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 163

PL 68

Hình 114. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 163

Hình 115. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 163

PL 69

Hình 116. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 163

Hình 117. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 163

PL 70

Hình 118. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 163

Phụ lục 22. Các phổ của hợp chất 164 (N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-

28-oyl)-n-decylamine)

Hình 119. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 164

PL 71

Hình 120. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 164

Hình 121. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 164

PL 72

Hình 122. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 164

Hình 123. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 164

PL 73

Hình 124. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 164

Phụ lục 23. Các phổ của hợp chất 166 (N,N-(2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-

28-oyl)-ethanol)

Hình 125. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 166

PL 74

Hình 126. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 166

Phụ lục 24. Các phổ của hợp chất 167 (2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-

amide)

Hình 127. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 167

PL 75

Hình 128. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 167

Hình 129. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 167

PL 76

Hình 130. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 167

Hình 131. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 167

PL 77

Hình 132. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 167

Phụ lục 25. Các phổ của hợp chất 168 (2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-28-

amide)

Hình 133. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 168

PL 78

Hình 134. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 168

Hình 135. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 168

PL 79

Hình 136. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 168

Hình 137. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 168

PL 80

Hình 138. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 168

Phụ lục 26. Các phổ của hợp chất 169 (2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-17-

nitrile)

Hình 139. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 169

PL 81

Hình 140. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 169

Hình 141. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 169

PL 82

Hình 142. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 169

Hình 143. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 169

PL 83

Hình 144. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 169

PL 84

Hình 145. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 169

Phụ lục 27. Các phổ của hợp chất 170 (2α,3β,23-trihydroxy-urs-12-ene-17-

nitrile)

Hình 146. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 170

PL 85

Hình 147. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 170

Hình 148. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 170

PL 86

Hình 149. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 170

Hình 150. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 170

PL 87

Hình 151. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 170

Phụ lục 28. Các phổ của hợp chất 171 (2α-hydroxy-3β,23-

isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid)

Hình 152. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 171

PL 88

Hình 153. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 171

Hình 154. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 171

PL 89

Hình 155. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 171

Hình 156. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 171

PL 90

Hình 157. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 171

Phụ lục 29. Các phổ của hợp chất 172 (2α-succinoyl-3β,23-

isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid)

Hình 158. Phổ hồng ngoại FT-IR của hợp chất 172

PL 91

Hình 159. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 172

Hình 160. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 172

PL 92

Hình 161. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 172

Pụ lục 30. Các phổ của hợp chất 173 (2α-O-acetyl-3β,23-

isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid)

Hình 162. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 173

PL 93

Hình 163. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 173

Hình 164. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 173

PL 94

Hình 165. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 173

Hình 166. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 173

PL 95

Hình 167. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 173

Phụ lục 31. Các phổ của hợp chất 174 (2α-acetoxy-3β,23-dihydroxy-urs-12-

ene-28-oic acid)

Hình 168. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 174

PL 96

Hình 169. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 174

Hình 170. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 174

PL 97

Hình 171. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 174

Phụ lục 32. Các phổ của hợp chất 175 (6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-

12-ene-28-oic acid)

Hình 172. Phổ hồng ngoại IR (KBr) của hợp chất 175

PL 98

Hình 173. Phổ khối (-) ESI-MS của hợp chất 175

Hình 174. Phổ khối (+) ESI-MS của hợp chất 175

PL 99

Hình 175. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 175

Hình 176. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 175

Hình 177. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 175

100

Hình 178. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 175

Hình 179. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 175

101

Phụ lục 33. Các phổ của hợp chất 177 (N,N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-

triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol)

Hình 180. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 177

Hình 181. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 177

102

Hình 182. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 177

Hình 183. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 177

103

Hình 184. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 177

Hình 185. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 177

104

Phụ lục 34. Các phổ của hợp chất 178 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol)

Hình 186. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 178

Hình 187. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 178

105

Hình 188. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 178

Hình 189. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 178

106

Hình 190. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 178

Hình 191. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 178

107

Hình 192. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 178

Hình 193. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 178

108

Phụ lục 35. Các phổ của hợp chất 179 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-isopropyl)

Hình 194. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 179

Hình 195. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 179

109

Hình 196. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 179

Hình 197. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 179

110

Phụ lục 36. Các phổ của hợp chất 180 (6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-

12-ene-28-amide)

Hình 198. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 180

Hình 199. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 180

111

Phụ lục 37. Các phổ của hợp chất 181 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine)

Hình 200. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 181

Hình 201. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 181

112

Hình 202. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 181

Hình 203. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 181

113

Phụ lục 38. Các phổ của hợp chất 182 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine)

Hình 204. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 182

Hình 205. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 182

114

Hình 206. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 182

Hình 207. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 182

115

Hình 208. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 182

Hình 209. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 182

116

Phụ lục 39. Các phổ của hợp chất 183 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine)

Hình 210. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 183

Hình 211. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 183

117

Hình 212. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 183

Hình 213. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 183

118

Hình 214. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 183

Hình 215. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 183

119

Phụ lục 40. Các phổ của hợp chất 184 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-glycine ethyl ester)

Hình 216. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 184

Hình 217. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 184

120

Hình 218. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 184

Hình 219. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 184

121

Hình 220. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 184

Hình 221. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 184

122

Phụ lục 41. Các phổ của hợp chất 185 (N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-

urs-12-ene-28-oyl)-imidazol)

Hình 222. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 185

Hình 223. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 185

123

Hình 224. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 185

Hình 225. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 185

124

Hình 226. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 185

Hình 227. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 185

125

Hình 228. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 185

Hình 229. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 185

126

Phụ lục 42. Các phổ của hợp chất 186 (N,N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-

12-ene-28-oyl)-ethanol)

Hình 230. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 186

Hình 231. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 186

127

Hình 232. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 186

Hình 233. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CDCl3) của hợp chất 186

128

Phụ lục 43. Các phổ của hợp chất 187 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-

ene-28-oyl)-n-propanol)

Hình 234. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 187

Hình 235. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 187

129

Hình 236. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 187

Hình 237. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 187

130

Hình 238. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 187

Hình 239. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 187

131

Hình 240. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 187

Hình 241. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 187

132

Phụ lục 44. Các phổ của hợp chất 188 (2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-

28-amide)

Hình 242. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất 188

Hình 243. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 188

133

Hình 244. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 188

Hình 245. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 188

134

Hình 246. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 188

Hình 247. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 188

135

Phụ lục 45. Các phổ của hợp chất 189 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-

ene-28-oyl)-n-heptylamine)

Hình 248. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 189

Hình 249. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 189

136

Hình 250. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 189

Hình 251. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 189

137

Hình 252. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 189

Hình 253. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 189

138

Phụ lục 46. Các phổ của hợp chất 190 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-

ene-28-oyl)-n-nonylamine)

Hình 254. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 190

Hình 255. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 190

139

Phụ lục 47. Các phổ của hợp chất 191 (N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-

ene-28-oyl)-n-decylamine)

Hình 256. Phổ khối ESI-MS của hợp chất 191

Hình 257. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 191

140

Hình 258. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 191

Hình 259. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 191

141

Hình 260. Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 191

Hình 261. Phổ 13C DEPT (125 MHz, CD3OD) của hợp chất 191

142

Phụ lục 48. Mô hình docking phân tử giữa một số dẫn của asiatic acid,

madecassic acid với emzyme Sirtuin 1 (SIRT 1) và 17β-hydroxy steroid

dehydrogenase type 1 (17β-HSD1).

Asiatic acid (1)

168

171

172

173

174

143

Madecasic acid (10)

Hình 262. Mô hình liên kết một số dẫn xuất của của asiatic acid, madecassic

acid với emzyme Sirtuin 1 (SIRT 1). Các thụ thể nhận hydro (Hydrogen

Bond Acceptor) được hiển thị dưới dạng vectơ màu xanh lá cây, các chất

cho hydro (Hydrogen Bond Donor) được hiển thị dưới dạng vectơ màu đỏ.

Phần ưa nước (Hydrophobic) được hiển thị dưới dạng hình cầu màu vàng.

Asiatic acid (1)

145

167

150

144

169

168

157

154

171

152

172

173

145

170

174

158

155

10

187

Hình 263. Mô hình liên kết một số dẫn xuất của của asiatic acid, madecassic

acid với emzyme 17β-HSD1. Các hợp chất giống như thí nghiệm với SIRT1.

Các thụ thể nhận hydro (Hydrogen Bond Acceptor) được hiển thị dưới dạng

vectơ màu xanh lá cây, các chất cho hydro (Hydrogen Bond Donor) được

hiển thị dưới dạng vectơ màu đỏ. Phần ưa nước (Hydrophobic) được hiển

thị dưới dạng hình cầu màu vàng.

146

Phụ lục 49. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của asiatic acid, madecassic

acid và các dẫn xuất của chúng

Hình 264. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của asiatic acid và các dẫn

xuất (1)

147

Hình 265. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của asiatic acid và các dẫn

xuất (2)

148

Hình 266. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của madecassic acid và các

dẫn xuất

149