Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với Dihydroartemisinin piperaquin phosphate ở một số vùng sốt rét lưu hành tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

ĐỖ MẠNH HÀ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

GEN K13 VÀ ĐÁP ỨNG CỦA Plasmodium falciparum VỚI

DIHYDROARTEMISININ-PIPERAQUIN PHOSPHATE

Ở MỘT SỐ VÙNG SỐT RÉT LƢU HÀNH TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Hà Nội, 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

ĐỖ MẠNH HÀ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN

TỬ GEN K13 VÀ ĐÁP ỨNG CỦA Plasmodium falciparum VỚI

DIHYDROARTEMISININ-PIPERAQUIN PHOSPHATE Ở

MỘT SỐ VÙNG SỐT RÉT LƢU HÀNH TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Chuyên ngành: Dịch tễ học

Mã số: 972.01.17

1. PGS.TS. Bùi Quang Phúc

2. TS. Trƣơng Văn Hạnh

Hà Nội, 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng với các

nghiên cứu viên đồng thực hiện tại các xã của các huyện trọng điểm sốt rét

thuộc tỉnh Bình Phƣớc, Ninh Thuận, Khánh Hòa, Quảng Trị và Gia Lai và các la

bô của Khoa Nghiên cứu lâm sàng và Thực nghiệm, Khoa Sinh học phân tử

thuộc Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng. Tôi đƣợc phép sử

dụng số liệu cho luận án này.

Các số liệu về kết quả nêu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chƣa

từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Đỗ Mạnh Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án này tôi đã nhận đƣợc sự

giúp đỡ của Thầy cô, các bạn đồng nghiệp và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn

sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:

PGS.TS. Bùi Quang Phúc và TS. Trƣơng Văn Hạnh là hai Thầy giáo - Hƣớng

dẫn khoa học đã dành nhiều thời gian định hƣớng, tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến

thức, giúp đỡ, chỉnh sửa toàn bộ đề cƣơng và luận án, cũng nhƣ động viên tôi trong

quá trình học tập.

Trân trọng cảm ơn đến thầy cô thuộc Viện Sốt rét-KST-CT Trung ƣơng, Phòng

khoa học đào tạo đã giúp đỡ cho hoàn thiện chƣơng trình Nghiên cứu sinh tiến sỹ,

đồng thời đã dành mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu; Xin cảm ơn các anh chị

đồng nghiệp trong Khoa Nghiên cứu lâm sàng và Thực nghiệm, Viện Sốt rét-KST-CT

TƢ luôn tạo điều kiện, tham gia tích cực và phân tích kết quả trong luận án một thời

gian dài để có đầy đủ số liệu luận án hoàn chỉnh.

Trân trọng cảm ơn PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng, PGS.TS. Cao Bá Lợi, PGS.TS.

Nguyễn Thị Hƣơng Bình, TS.BS. Nguyễn Quang Thiều, TS.BS. Trần Quang Phục,

TS.BS. Huỳnh Hồng Quang, TS.BS. Nguyễn Vân Hồng, TS. Phạm Vĩnh Thanh đã

đóng góp các ý kiến quý báu từng bƣớc cho chuyên đề, tiểu luận tổng quan và luận án.

Chân thành cảm ơn các cán bộ Y tế từ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật các tỉnh,

TTYT các huyện và trạm y tế xã, y tế thôn bản đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

thực hiện đề tài tại thực địa.

Kính trân trọng cảm ơn cha mẹ hai bên gia đình - những ngƣời luôn mong muốn

các con mình tiến bộ, là động lực mạnh mẽ; Vợ và các con gánh vác việc gia đình cho

tôi yên tâm học tập.

Cuối cùng, tôi xin trân trọng cảm ơn đến tất cả bệnh nhân sốt rét đã đồng thuận, chia

sẻ thông tin và mẫu bệnh phẩm để số liệu nghiên cứu luận án đạt đƣợc nhƣ hôm nay.

Tác giả luận án

Đỗ Mạnh Hà

iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ACTs

Artemisinin based Combination Therapies

Phối hợp thuốc điều trị sốt rét có artenmisinin hoặc dẫn chất của artemisinin

ACPR

Artemether/Lumefantrine

Artemether/Lumefantrin

A/L

Artemisinine

Artemisinin

ART

Artesunate

Artesunat

AS/AQ

Artesunate + amodiaquine

Artesunat + amodiaquin

AS+MQ

Artesunate + mefloquine

Artesunat + mefloquin

Adequate Clinical and Parasitological Response Đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ

Blood Medium Mixed Môi trƣờng nuôi cấy BMM

Bệnh nhân sốt rét BNSR

cộng sự cs.

Chloroquine chloroquin CQ

CTQGPCSR

Chƣơng trình quốc gia phòng chống sốt rét

Day Ngày D

DHA-PPQ

Dihydroartemisinine - Piperaquine phosphate

Dihydroartemisinin - Piperaquin phosphat

Dihydroartemisinin DHA

Early Treatment Failure Thất bại điều trị sớm ETF

Fever clearance time Thời gian cắt sốt FCT

Greater MeKong subregion Tiều vùng sông Mê Kông GMS

Hồng Cầu

Hematocrit Tốc độ máu lắng HCT

Hemoglobin Huyết sắc tố Hb

Infected red blood cell Hồng cầu nhiễm iRBC

50 Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế 50% sự phát IC50

triển của KST

Ký sinh trùng KST

t1/2

Haft-life parasite clearance time

Thời gian sạch 50% ký sinh trung thể vô tính

IQR

Interquatile Range

Khoảng phân vị

K13 propeller

Vùng cánh quạt trên nhiễm sắc thể số 13 của P. falciparum

Ký sinh trùng sốt rét KSTSR

Late Clinical Failure Thất bại lâm sàng muộn LCF

Polymerase Chain Reaction

PCR

Late Parasitological Failure Thất bại ký sinh trùng muộn LPF

RPMI

Roswell Park Memorial Institute-1640

Phản ứng chuỗi polymerase

Mật độ MĐ

Mật độ ký sinh trùng MĐKST

NIMPE

Viện sốt rét - Ký sinh trùng – côn trùng Trung ƣơng

National Institute of Malariology, Parasitology and Entomology

Piperaquine phosphate Piperaquin phosphat PPQ

Primaquine Primaquin PQ

Phòng chống sốt rét PCSR

PCT

Parasite clearance time Thời gian sạch ký sinh trùng

PBS Phosphate Buffer Saline

QN Quinine Quinin

SR Sốt rét

SRAT Sốt rét ác tính

SNP

Tính đa hình đơn nucleotide

Single Nucleotide Polymorphism

SRLH Sốt rét lƣu hành

TNLS Thử nghiệm lâm sàng

TES Therapeutic efficacy study Nghiên cứu hiệu lực điều trị

WWARN

WHO

The World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

WorldWide Antimalarial Resistance Network Mạng lƣới kháng thuốc sốt rét toàn cầu

MỤC LỤC Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ .................. ......................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3

1.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam ........................................... 3

1.1.1. Sốt rét và một số yếu tố liên quan dịch tễ bệnh sốt rét ................................ 3

1.1.2. Tình hình mắc sốt rét trên thế giới và Việt Nam...................... . ..................4

1.1.3. Tình hình tử vong do sốt rét trên thế giới và Việt Nam................... ............6

1.2. Các thuật ngữ và định nghĩa liên quan tới kháng thuốc .................................. 8

1.3. Đột biến gen K13 ..... .................................................................................... 10

1.4. Tình hình ký sinh trùng Plasmodium falciparum kháng thuốc sốt rét .......... 13

1.4.1. Trên thế giới .......... .................................................................................... 13

1.4.2. Tại Việt Nam ......... .................................................................................... 16

1.5. Hiệu lực điều trị, tính dung nạp và độ an toàn của DHA-PPQ ........................ 18

1.5.1. Tính dung nạp của phối hợp thuốc DHA-PPQ..........................................18 1.5.2. Hiệu lực điều trị và độ an toàn của phối hợp DHA-PPQ... ........................ 19

1.6. Các kỹ thuật đánh giá kháng thuốc do quần thể P. falciparum .................... 26

1.6.1. Kỹ thuật in vivo đánh giá nhạy - kháng thuốc trên lâm sàng ..................... 26

1.6.2. Kỹ thuật in vitro đánh giá ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc ........ 28

1.6.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử .................................................................... 31

1.7. Một số yếu tố thuận lợi cho KSTSR phát triển và hình thành kháng .......... 33

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 34

2.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13.......... .. .........34

2.1.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu.................................... .... ........34

2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 37

2.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum ........... 43

2.2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu ................................................ 43

2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 45

2.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum..... ...56

vii

2.3.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu ................................................ 56

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 57

3.1. Mô tả đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 .................................... 63

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 63

3.1.1.Đặc điểm chung của bệnh nhân nhiễm Plasmodium falciparum ................ 63

3.1.2. Phân tích đặc điểm các vị trí đột biến trên gen K13 của P. falciparum .... 64

3.1.3. Đặc điểm về đột biến gen K13 của quần thể P. falciparum ......................... 68

3.1.4. Tỷ lệ đột biến gen K13 của 5 tỉnh thực hiện nghiên cứu .............................. 77

3.1.5. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 của các quần thể P. falciparum ............... 81

3.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với ..... 82

3.2.1. Đặc điểm chung về dân số của nhóm nghiên cứu ...................................... 82

3.2.2. Tỷ lệ, đặc điểm đột biến gen K13 của nhóm nghiên cứu in vivo ............... 83

3.2.3. Thời gian làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt sau điều trị DHA-PPQ ......... 85

3.2.4. Hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong điều trị sốt rét do P. falciparum ......... 88

3.3.1 Đặc điểm đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum .................. 91

3.3. Đánh giá nhạy cảm của P. falciparum với thuốc sốt rét trên in vitro ........... 91

3.3.2. Đánh giá nhạy cảm của P. falciparum với thuốc sốt rét ............................ 93

3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen k13 của ký sinh trùng P. falciparum....... 96

Chƣơng 4. BÀN LUẬN . ....................................................................................... 99

4.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của

Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh có sốt rét lƣu hành nặng ................................ 99

4.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu ........ 115

4.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng P. falciparum với một số thuốc sốt rét

trên thử nghiệm in vitro tại Gia Lai ................................................................... 125

KẾT LUẬN ...................... ..................................................................................... 133

KHUYẾN NGHỊ ............. ..................................................................................... 135

TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI ......................................................................... 136

viii

MỘT SỐ ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ..................................... 137

NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN.. ................................. 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 139

PHỤ LỤC ........................ .................................................................................. 154

DANH MỤC HÌNH

TT

Tên Hình

Trang

1.1 Phân bố ký sinh trùng sốt rét năm 2016 tại Việt Nam.

1.2 Cấu trúc gen K13 của ký sinh trùng Plasmodium falciparum

1.3 Tình hình kháng thuốc artemisinin P. falciparum tại Tiểu vùng Mê

1.4 Tình hình kháng thuốc ACT do P. falciparum tại Tiểu vùng Mê

Kông từ 2008-2012

1.5 Tình hình ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc artemisinin tại

Kông từ 2016-2018

1.6 Thử nghiệm đánh giá kháng thuốc và ƣu thế từng kỹ thuật

2.1 Địa điểm nghiên cứu đƣợc thực hiện tại vùng sốt rét lƣu hành nặng

2.2 Lấy lam máu gọt mỏng và giọt dày làm thử nghiệm in vivo

một số vùng của Việt Nam

60 2.3 Thu hoạch mẫu máu sau thời gian nuôi cấy thành công invitro

65 3.1 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định vị trí đột biến

1739 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm Bioedit

V.7.0.5.3.

32 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến 65

C580Y trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

3.3 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định đột biến nucleotit 66

ở vị trí 1658 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm

Bioedit V.7.0.5.3.

3.4 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến 66

P553L trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

3.5 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định đột biến nucleotit 67

ở vị trí 1406 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm

Bioedit V.7.0.5.3.

3.6 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến 67

C469F trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.V.7.0.5.3

3.7 Bản đồ phân bố tỷ lệ đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. 78

falciparum tại các điểm nghiên cứu

3.8 Biểu đồ so sánh tỷ lệ đột biến gen K13 phát hiện đƣợc tại các điểm 81

nghiên cứu

3.9 Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá phác đồ DHA-PPQ tại 89

Bình Phƣớc

3.10 Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá phác đồ DHA-PPQ tại 89

Gia Lai

3.11 Hình ảnh điện di phân tích tái phát, tái nhiễm 90

3.12 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc artesunat 93

3.13 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc 94

dihydroartemisinin

3.13 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc chloroquin 94

3.14 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc piperaquin 95

STT

DANH MỤC BẢNG

Tên bảng

Trang

1.1 Các đột biến gen K13 xác định kháng và K13 ứng viên/ hoặc liên

1.2 Các gen đa hình và trình tự mồi phân tích tái phát và tái nhiễm

2.1

quan

2.2 Cỡ mẫu ƣớc tính dựa vào tỷ lệ thất bại lâm sàng (p) ở quần thể

2.3 Quy trình theo dõi bệnh nhân uống thuốc Arterakin

2.4

Bảng liều thuốc Arterakin sử dụng cho bệnh nhân nghiên cứu

2.5 Các biến số, định nghĩa biến số

3.1 Đặc điểm chung của bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu

32 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Bình Phƣớc

3.3 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Bình Phƣớc

3.4 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Bình Phƣớc

3.5 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Gia Lai

3.6 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Gia Lai

3.7 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Gia Lai

3.8 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Ninh Thuận

3.9 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Ninh Thuận

3.10 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Ninh Thuận

3.11 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Khánh Hòa

3.12 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Khánh Hòa

3.13 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Khánh Hòa

3.14 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Quảng Trị

3.15 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Quảng Trị

3.16 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Quảng Trị

3.17 Tổng hợp kết quả tỷ lệ đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu

3.18 Đặc điểm đột biến gen K13 của 5 tỉnh nghiên cứu

3.19 Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo giới tính của 5 tỉnh

Phân loại đánh giá hiệu quả điều trị theo TCYTTG, 2009

xii

3.20 Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo nhóm tuổi của 5 tỉnh

3.21 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu

3.22 Tỷ lệ đột biến gen K13 của các mẫu đƣa vào nghiên cứu in vivo

3.23 Đặc điểm đột biến gen K13 của bệnh nhân nghiên cứu in vivo

3.24 Hiệu lực làm sạch ký sinh trùng P. falciparum và cắt sốt

3.25 Tỷ lệ tồn tại ký sinh trùng thể vô tính sau 72 giờ hoặc ngày D3

3.26 So sánh ký sinh trùng ngày D3 với các điểm đột biến gen K13 tại

3.27 Đặc điểm kiểu gen của những bệnh nhân có ký sinh trùng ngày

các điểm nghiên cứu.

3.28 Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét do P.falciparum

3.29 So sánh thất bại điều trị và đạp ứng lâm sàng đầy đủ với các điểm

tại các tỉnh nghiên cứu

3.30 Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu đƣa vào thử thuốc

3.31 Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu nuôi cấy thành công

3.32 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các

đột biến gen K13 có liên quan đến kháng artemisinin.

3.33 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquin trên các

mẫu nuôi cấy

3.34 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc dihydro artemisinin

mẫu nuôi cấy

3.35 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc piperaquin trên các

trên các mẫu nuôi cấy

mẫu nuôi cấy

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, do ký sinh trùng Plasmodium spp.

của ngƣời gây nên. Bệnh lây theo đƣờng máu, do muỗi Anopheles spp. truyền

bệnh. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2021), trên toàn thế giới

năm 2020 ƣớc tính có khoảng 241 triệu ca mắc sốt rét, 627.000 ngƣời tử vong.

Số mắc sốt rét tăng khoảng 14 triệu ca bệnh và tăng khoảng 69.000 ngƣời tử

vong so với năm 2020, trong đó có khoảng 47.000 ngƣời chết liên quan đến việc

bị gián đoạn cung cấp các biện pháp phòng chống, chẩn đoán, điều trị bệnh trong

rét trên thế giới [107], [108].

bối cảnh đại dịch Covid. Khu vực châu Phi chiếm 90% số ca mắc và tử vong sốt

Ở Việt Nam theo số liệu chƣơng trình phòng chống sốt rét năm 2015 cả

nƣớc có 9331 bệnh nhân sốt rét trong đó tập chung chủ yếu ở ven biển Miền

Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ [28]. Một trong những khó khăn và là một

trong những thách thức trong lộ trình loại trừ sốt rét là ký sinh trùng sốt rét

(KSTSR) đã kháng với hầu hết các thuốc đang dùng, ngoại trừ một số thuốc phối

hợp có gốc artemisinin và dẫn chất [103].

Artemisinin và dẫn chất là thành phần quan trọng trong thuốc phối hợp

(ACTs) để điều trị sốt rét Plasmodium falciparum (P. falciparum) kháng thuốc

[28]. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo sử dụng các loại thuốc ACTs

tại nhiều nƣớc, kể cả Việt Nam [103]. Tuy nhiên, đến năm 2005, WHO đã ghi

nhận P. falciparum giảm nhạy với ACTs và đến cuối năm 2008 thì báo cáo P.

falciparum biểu hiện kháng artemisinin tại tỉnh Pailin, Campuchia - nơi giáp

biên giới với Thái Lan, từ đó lan rộng kháng ra 5 nƣớc thuộc Tiểu vùng sông Mê

Kông (Lào, Thái Lan, Myanmar, Việt Nam) [103]. Ở Việt Nam thuốc phối hợp

dihydroartemisinin- piperaquin (DHA-PPQ) đƣợc lựa trọn đƣa vào điều trị sốt

rét do P. falciparum, giai đoạn từ 2005-2010 tỷ lệ đáp ứng lâm sàng đầy đủ

(ACPR) từ 97,8% đến 100%, nhƣng sau đó thời gian cắt ký sinh trùng ngày càng

kéo dài, ký sinh trùng ngày D3 đã tăng lên nhanh chóng, năm 2012 là 30,6%,

năm 2014 là 36% (Bình Phƣớc) [16], Gia Lai 24,1% (2015) [12], Khánh Hòa

17,4% D3 (2014) [17].

Gần đây, một số đột biến trong gen K13 đã đƣợc xác định nhƣ các chỉ điểm

phân tử liên quan chặt chẽ kháng thuốc artemisinin của P. falciparum trong các

nghiên cứu lâm sàng cũng nhƣ tại các chủng tại phòng thí nghiệm [40]. Việc kết

hợp dữ liệu phân tích chỉ điểm phân tử đột biến gen K13 và hiệu lực thuốc

dihydroartemisinin-piperaquin phosphate trên các bệnh nhân là cần thiết, góp

phần đánh giá chính xác tình hình P. falciparum kháng thuốc tại các vùng sốt rét

lƣu hành. Ngoài thử nghiệm in vivo và tìm chỉ điểm phân tử, thử nghiệm in vitro

đóng vai trò quan trọng giám sát nhạy-kháng trên các mẫu phân lập P.

falciparum thu thập tại thực địa, giúp nhận định tình hình kháng chính xác và

quan trọng trong thay đổi chính sách thuốc [40].

Với ý tƣởng kết hợp giữa phân tích các đột biến gen K13 và theo dõi hiệu

quả điều trị của thuốc sốt rét dihydro artemisinin - piperaquin trên bệnh nhân là

cần thiết, góp phần đánh giá chính xác hơn tình hình P. falciparum kháng

artemisinin thuốc tại các vùng sốt rét lƣu hành. Để đánh giá tình hình nhạy-

kháng thuốc trên in vivo, in vitro và các chỉ điểm phân tử K13 liên quan kháng

trên quần thể P. falciparum, đề tài luận án “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ

học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với

dihydroartemisinin-piperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lƣu hành tại Việt

Nam” đƣợc thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của

Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh

2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

Thuận, Quảng Trị năm 2016 – 2018.

3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu.

thuốc sốt rét bằng kỹ thuật in vitro tại Gia Lai.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam

1.1.1. Sốt rét và một số yếu tố liên quan dịch tễ bệnh sốt rét

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm lan truyền qua đƣờng máu gây nên bởi ký

sinh trùng Plasmodium spp. thông qua muỗi Anopheles cái đốt qua da và truyền

các thoa trùng ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) vào máu. Bệnh sốt rét tồn tại trong

cộng đồng cần có 3 yếu tố: Tác nhân gây bệnh KSTSR, muỗi Anopheles spp.

truyền và quần thể ngƣời trong cộng đồng. Ngoài ra, còn một số yếu tố khác ảnh

hƣởng đến sự tồn tại và phát triển của bệnh nhƣ môi trƣờng, kinh tế, xã hội.

Trong đó, nguồn bệnh là bệnh nhân sốt rét (BNSR), ngƣời mang KSTSR lạnh

hay không triệu chứng. Sốt rét lan truyền từ ngƣời này qua ngƣời khác nhờ trung

gian truyền bệnh, đó là muỗi Anopheles spp., có nhiều loại muỗi Anopheles spp.

nhƣng hiện nay có ít nhất 62 loài có khả năng truyền bệnh sốt rét ở các vùng trên

thế giới [4].

Theo tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) hiện nay có ít nhất 5 loài

Plasmodium spp. gây bệnh cho ngƣời đƣợc ghi nhận, trong đó nghiêm trọng nhất

là P. falciparum, số còn lại P. vivax, P. malariae, P. ovale và P. knowlesi có thể

gây thể bệnh nhẹ hơn và thƣờng ít dẫn đến tử vong (WHO, 2009) [101]. Việt

Nam, có 2 loài chủ yếu P. falciparum chiếm 60-70% trong cơ cấu, thƣờng gây

sốt rét nặng, đa biến chứng và tử vong. Loài P. vivax chiếm 30-40%, gây sốt rét

cách nhật, tái phát xa, loài P. malariae và P. ovale có tỷ lệ thấp, riêng P.

knowlesi mới phát hiện vào năm 2008 [4].

Tại Việt Nam có 3 vector chính gồm An. minimus, An. dirus, An. epiroticus

và một số vector phụ nhƣ An. maculatus, An. aconitus, An. jeyporiensis An.

varuna, An. jeyporiensis An. sinensis, An. vagus, An. subpictus, An. campestris.

Muỗi đốt ngƣời có KST thể giao bào, tiếp đó giao bào phát triển thành thoa trùng

trong cơ thể muỗi, khi đó muỗi đốt ngƣời và thoa trùng sẽ từ tuyến nƣớc bọt của

muỗi qua ngƣời [4]. Cơ thể cảm thụ gồm ngƣời lành, chƣa có miễn dịch sốt rét

hoặc đã có miễn dịch nhƣng đã giảm thấp.

1.1.2. Tình hình mắc sốt rét trên thế giới và Việt Nam

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính năm 2019 có khoảng 229

triệu trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét ở 87 quốc gia có sốt rét lƣu hành, giảm 3,78%

so với năm 2000 (229/238 triệu). Tỷ lệ mắc bệnh sốt rét trên 1.000 dân số nguy

cơ giảm từ 80 (năm 2000) xuống 58 (năm 2015) và 57 (năm 2019). Từ năm 2000

đến năm 2015, tỷ lệ mắc bệnh sốt rét toàn cầu đã giảm 27,00% và từ năm 2015

đến năm 2019 số mắc giảm dƣới 2,00%, cho thấy tốc độ giảm đã chậm hơn sau

năm 2015. Toàn cầu có 29 quốc gia có số mắc cao nhất chiếm 95,00%, trong đó

có 5 quốc gia chiếm cao nhất nhƣ Nigeria (27,00%), Cộng hòa Congo (12,00%),

Uganda (5,00%), Mozambique (4,00%) và Niger (3,00%) chiếm khoảng 51,00%

tất cả các trƣờng hợp trên toàn cầu [107], [108].

Tại Khu vực Châu Phi ƣớc tính có khoảng 215 triệu trƣờng hợp bệnh sốt rét

năm 2019 chiếm khoảng 94,00%; Mặc dù năm 2019 có số mắc thấp hơn so với

năm 2000 (204 triệu) và tỷ lệ mắc bệnh sốt rét giảm từ 363 (năm 2000) xuống

225 trƣờng hợp (năm 2019) trên 1000 dân số nguy cơ; Tuy nhiên sự phức tạp về

thay đổi lây truyền bệnh một cách nhanh chóng đó chính là sự gia tăng dân số.

Dân số sống ở Khu vực Châu Phi tăng từ khoảng 665 triệu năm 2000 lên 1,1 tỷ

ngƣời trong năm 2019 [107], [108].

Ở Khu vực Đông Nam Á có số mắc sốt rét chiếm khoảng 3,00% gánh

nặng trên toàn cầu. Số trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét giảm 73,00%, từ 23 triệu

năm 2000 xuống còn khoảng 6,3 triệu năm 2019. Tỷ lệ mắc bệnh ở khu vực này

giảm 78,00%, từ khoảng 18 trƣờng hợp trên 1000 dân số chung năm 2000 còn 4

trƣờng hợp trong năm 2019 [107].

Ấn Độ đóng góp mức giảm tuyệt đối lớn từ 20 triệu trƣờng hợp năm 2000

xuống còn 5,6 triệu trƣờng hợp năm 2019. Sri Lanka đƣợc chứng nhận không có

bệnh sốt rét trong năm 2015 và Timor-Leste báo cáo không có sốt rét trong năm

2018 và 2019 [107], [108].

Các trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét ở Khu vực Đông Địa Trung Hải giảm

26,00%, từ khoảng 7 triệu ngƣời năm 2000 xuống còn 5 triệu trƣờng hợp mắc

bệnh sốt rét năm 2019. Khoảng một phần tƣ số trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét năm

2019 là P.vivax, chủ yếu ở Afghanistan và Pakistan.

Trong giai đoạn 2000 - 2019, tỷ lệ mắc bệnh sốt rét ở Khu vực Đông Địa

Trung Hải giảm từ 20 xuống 10 trên 1.000 dân số nguy cơ. Sudan là nƣớc đóng

góp hàng đầu cho bệnh sốt rét ở khu vực này, chiếm khoảng 46,00% trƣờng hợp.

Quốc gia Iran không có sốt rét nội địa trong năm 2018 và 2019.

Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng ƣớc tính có khoảng 1,7 triệu trƣờng hợp

vào năm 2019, giảm 43,00% (1,7/3 triệu trƣờng hợp) so với năm 2000. Trong

cùng kỳ, tỷ lệ mắc bệnh sốt rét giảm từ 5 xuống còn 2 trƣờng hợp trên 1000 dân

số chung. Quốc gia Papua New Guinea chiếm gần 80% tổng số các trƣờng hợp

bệnh ở khu vực này vào năm 2019. Trung Quốc không có trƣờng hợp mắc bệnh

sốt rét nội địa từ năm 2017. Malaysia đã không có trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét

trong năm 2018 và 2019 [108].

Tại Khu vực Châu Mỹ, số trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét giảm 40,00% (từ

1,5 triệu xuống 0,9 triệu) và tỷ lệ mắc bệnh giảm 57,00% (từ 14 xuống 6). Tiến

bộ của khu vực trong những năm gần đây đã bị sự gia tăng số mắc sốt rét ở

Venezuela, nơi có khoảng 35.500 trƣờng hợp (năm 2000) tăng lên hơn 467.000

(năm 2019). Brazil, Colombia và Venezuela chiếm hơn 86,00% tổng số mắc sốt

rét ở khu vực này [107].

Việt Nam năm 2016 cả nƣớc có 4.161 bệnh nhân sốt rét , năm 2017 có

4.548 bệnh nhân, năm 2018 có 4813 bênh nhân và năm 2019 có 4.665 bệnh

nhân đến năm 2020 số bệnh nhân mắc sốt rét giảm mạnh chỉ còn 1.422 bênh

nhân. Tỷ lệ cơ cấu ký sinh trùng P. falciparum tại tỉnh Bình Phƣớc năm 2016 có

715 trƣờng hợp chiếm 64,41%, tỉnh Khánh Hòa năm 2016 có 294 trƣờng hợp

bệnh nhân P. falciparum chiếm 69,67%. tỉnh Gia Lai năm 2016 có 269 trƣờng

hợp P. falciparum chiếm 67,27%, tỉnh Ninh Thuận có 252 bệnh nhân P.

falciparum chiếm 79,52%, tỉnh Quảng Trị có 46 bệnh nhân P. falciparum chiếm

70,41%.

Quảng trị

Gia Lai

Khánh Hòa

Bình phƣớc

Ninh Thuận

Hình 1.1. Phân bố ký sinh trùng sốt rét năm 2016 tại Việt Nam

1.1.3. Tình hình tử vong do sốt rét trên thế giới và Việt Nam

Trên toàn cầu, tử vong do mắc sốt rét đã giảm trong giai đoạn 2000–2019,

từ 736.000 (năm 2000) còn 409.000 (năm 2019). Tỷ lệ tử vong do mắc sốt rét ở

trẻ em dƣới 5 tuổi chiếm 84,00% (năm 2000) và 67,00% (năm 2019).

Trên toàn cầu, tỷ lệ tử vong do mắc sốt rét trên 100.000 dân số nguy cơ

giảm từ 25 (năm 2000) xuống còn 12 (năm 2015) và 10 (năm 2019), nhƣ vậy tốc

độ giảm đã chậm hơn trong những năm gần đây [106], [107].

Có 95,00% trƣờng hợp tử vong do mắc sốt rét trên toàn cầu ở 31 quốc gia,

trong đó Nigeria (23,00%), Congo (11,00%), Tanzania (5,00%), Mozambique

(4,00%), Niger (4,00%) và Burkina Faso (4,00%) chiếm khoảng 51,00% tổng số

tử vong do mắc sốt rét trên toàn cầu năm 2019.

So với năm 2000, năm 2019 số tử vong do mắc sốt rét ở Khu vực Châu Phi

giảm 44,00%, từ 680.000 xuống 384.000 (2019), tỷ lệ tử vong do mắc sốt rét

giảm 67,00% từ 121 xuống 40 (2019) trƣờng hợp tử vong do mắc sốt rét trên

100.000 dân số chung [108].

Tại Khu vực Đông Nam Á, tử vong do mắc sốt rét giảm 74,00%, từ khoảng

35.000 trƣờng hợp năm 2000 xuống còn 9.000 trƣờng hợp (2019).Tại Khu vực

Đông Địa Trung Hải, tử vong do mắc sốt rét giảm 16,00%, từ khoảng 12.000

năm 2000 xuống 10.100 trƣờng hợp năm 2019 và tỷ lệ tử vong do mắc sốt rét

giảm 50,00%, từ 4/100.000 xuống 2/100.000 dân số chung [108].

Tại Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, tử vong do mắc sốt rét giảm 52,00%,

từ 6.600 trƣờng hợp năm 2000 xuống còn 3.200 trong năm 2019 và tỷ lệ tử vong

giảm 60,00%, từ 1 xuống 0,4/100.000 dân số chung. Papua New Guinea chiếm

hơn 85,00% số trƣờng hợp tử vong do sốt rét vào năm 2019.

Tại Khu vực Châu Mỹ số tử vong do mắc sốt rét giảm 39,00% (từ 909

xuống 551) và tỷ lệ tử vong do mắc sốt rét giảm 50,00% (từ 0,8 - 0,4). Hơn

70,00% số trƣờng hợp tử vong do sốt rét trong năm 2019 ở khu vực này tại

Venezuela.

Việt Nam số tử vong do sốt rét trong giai đoạn 2015-2020 là 11 trƣờng hợp,

đặc biệt năm 2019 không có bệnh nhân sốt rét tử vong. Mặc dù tình hình sốt rét

trong 5 năm gần đây ở nƣớc ta đã giảm thấp, song một số tỉnh thuộc khu vực

miền Trung-Tây Nguyên, Nam bộ và nguy cơ tái phục hồi, cơ cấu KSTSR với

loài P. falciparum chiếm ƣu thế, dân di biến động quy mô lớn nên khó có biện

pháp phòng chống hiệu quả, đặc biệt tình trạng đa kháng thuốc lan rộng, dẫn đến

bệnh diễn tiến nặng, tái phát cao, tỷ lệ chuyển sốt rét ác tính và tử vong có thể

phức tạp hơn [13],[16].

1.2. Các thuật ngữ và định nghĩa liên quan tới kháng thuốc

Đến nay TCYTTG đã chính thức công nhận kháng thuốc đối với 3 trong số

5 loại KSTSR gây bệnh cho ngƣời. Đó là P. falciparum, P. vivax, P. malariae,

trong đó đáng kể nhất là P. falciparum kháng đa thuốc và là loài duy nhất đã

giảm nhạy cảm và kháng với artemisinin và dẫn chất. Tuy nhiên, trên thực hành

lâm sàng vẫn còn nhầm lẫn giữa thuật ngữ “Kháng thuốc” và “Thất bại điều trị”

[106].

Theo định nghĩa của TCYTTG thì “Kháng thuốc là khả năng một chủng

KST có thể sống sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã đƣợc điều trị và hấp thụ

một liều lƣợng thuốc bằng hoặc cao hơn liều thông thƣờng nhƣng vẫn trong khả

năng chịu đựng đƣợc của ngƣời bệnh”. Kháng thuốc có thể là tƣơng đối nếu nhƣ

tăng liều trong giới hạn dung nạp của bệnh nhân, có thể diệt đƣợc KST. Kháng

thuốc có thể là tuyệt đối nếu nhƣ dùng liều thuốc vƣợt quá khả năng dung nạp

của con ngƣời vẫn không diệt hết KSTSR [50]. Định nghĩa này có ƣu điểm trong

việc áp dụng lâm sàng nhƣng tính hữu dụng của nó phụ thuộc vào sự thống nhất

về liều lƣợng [106].

“Thất bại điều trị” là một thuật ngữ sử dụng nhiều trong nghiên cứu hiệu lực

thuốc gần đây và đƣợc định nghĩa: “Thất bại điều trị là tình trạng một thuốc mất

khả năng làm sạch KST trong máu hoặc xuất hiện các triệu chứng nặng lên mặc

dù đã đƣợc điều trị đủ liều theo qui định”. Hiện tƣợng thất bại điều trị không

phải lúc nào cũng đồng nghĩa với kháng thuốc. Thất bại điều trị còn do nguyên

nhân khác nhƣ thuốc giả, thuốc quá hạn, uống không đủ liều, dung nạp thuốc

kém, đáp ứng miễn dịch [50].

“Kháng chéo” là tình trạng KSTSR kháng lại các thuốc có cấu trúc hoá học

hoặc cách tác động tƣơng tự nhƣ nhau với các thuốc cùng nhóm.

“Đa kháng” là khi một chủng KSTSR có khả năng kháng lại từ 2 thuốc

khác nhau về cấu trúc hoá học và cơ chế tác động trở lên (các thuốc khác nhóm

nhƣ Chloroquin (CQ) và artemisinin (ART).

Năm 2011, trƣớc tình hình kháng artemisinin lan rộng tại một số nƣớc

Đông Nam châu Á, TCYTTG đã đƣa ra định nghĩa về kháng thuốc artemisinin:

+ Nghi ngờ kháng artemisinin: Khi số ca sốt rét đƣợc điều trị với thuốc sốt rét

phối hợp có artemisinin (ACTs) mà tỷ lệ ký sinh trùng ngày D3 còn dƣơng tính

> 10%;

+ Xác định kháng artemisinin: Thất bại điều trị sau uống artemisinin hoặc dẫn

chất đơn thuần, mà ký sinh trùng còn tồn tại đến D7 hoặc còn dƣơng tính ở ngày

D3 và tái phát lại trong vòng 28/42 ngày mặc dù đủ nồng độ thuốc sốt rét trong

máu.

Năm 2014, đột biến gen K13 đã đƣợc chứng minh có liên quan đến thời

gian sạch KSTSR trong theo dõi in vivo và in vitro [40]. Xác định đột biến K13

có thể đƣợc áp dụng để đánh giá xác định kiểu hình kháng artemisinin của P.

falciparum ở mức độ phân tử. Tuy nhiên, số lƣợng các vị trí đột biến kháng

artemisinin vẫn tiếp tục đƣợc phát hiện thêm nên định nghĩa về kháng thuốc dựa

trên đột biến gen cần tiếp tục đƣợc cập nhật. Định nghĩa KSTSR kháng

artemisinin mới theo TCYTTG [104]:

+ Nghi ngờ kháng đƣợc xác định bằng tỷ lệ bệnh nhân có KST dƣơng tính kéo

dài cao (D3 > 10%), hoặc tỷ lệ đột biến kháng của gen K13 cao (>5%);

+ Khẳng định kháng: Trên một bệnh nhân có đột biến kháng gen K13 và có

KSTSR dƣơng tính kéo dài.

Năm 2018, định nghĩa kháng một phần artemisinin (artemisinin partial

resistance) đƣợc đƣa ra bởi TCYTTG khi có sự chậm làm sạch KSTSR, do

kháng một phần của artemisinin trên thể nhẫn. Tuy nhiên, phần lớn các bệnh

nhân có hiện tƣợng chậm làm sạch KSTSR vẫn sạch KSTSR sau khi điều trị

bằng thuốc ACTs vì bên trong vẫn có vai trò của thuốc đi kèm (partner drug)

vẫn còn hiệu quả kéo dài đến 7 ngày [105].

+ Nghi ngờ khu vực kháng: ≥ 10% ngƣời bệnh có thời gian giảm ½ số lƣợng

KST ≥ 5 giờ sau điều trị với ACT hoặc AS đơn trị liệu hoặc ≥ 5% số ngƣời bệnh

mang đột biến gen K13 xác định kháng artemisinin hoặc; ≥ 10% ngƣời bệnh có

thời gian cắt KST chậm sau 72h (± 2h) hoặc ngày D3;

+ Xác định khu vực kháng artemisinin: ≥ 5% số ngƣời bệnh mang đột biến gen

K13 xác định kháng artemisinin, tất cả ngƣời bệnh này có thời gian cắt KST

chậm xác định bằng KHV vào ngày D3 hoặc có thời gian giảm ½ số lƣợng KST

≥ 5 giờ sau điều trị.

1.3. Đột biến gen K13

- Đặc điểm cấu trúc gen PF3D7_1343700 (gen K13) của P. falciparum và cơ chế

kháng artemisinin. Gen K13 đƣợc xem là một chỉ điểm di truyền liên quan đến

KSTSR P. falciparum kháng artemisinin và dẫn xuất. Về cấu trúc, gen K13 là

một đoạn exon mã hóa protein Kelch 13 với chiều dài 726 axit amin. Các dữ liệu

phân tích protein cho thấy gen K13 sản sinh protein ở tất cả giai đoạn phát triển

của P. falciparum từ thể vô tính (thể nhẫn, tƣ dƣỡng, giao bào và các thể hoa thị)

và thể hữu tính trong máu (thể giao bào) và liên quan đến quá trình tăng

phosphoryl hóa.

- Bằng phƣơng pháp giải trình tự DNA, so sánh trình tự thu đƣợc giữa các

chủng nhạy và các phân lập từ bệnh nhân thử nghiệm in vivo, các chủng nuôi cấy

in vitro đã phát hiện đƣợc nhiều đột biến điểm tƣơng quan chặt chẽ với tỷ lệ sống

sót của P. falciparum trong in vitro và giảm tỷ lệ sạch KSTSR trên in vivo.

Hình 1.2. Cấu trúc gen K13 của ký sinh trùng Plasmodium falciparum.

- Về mặt cơ chế kháng artemisinin, đến nay còn nhiều tranh luận, tuy vậy có

sự trùng hợp giữa kết quả của nhiều nghiên cứu độc lập trên các phân lập từ bệnh

nhân và phòng thí nghiệm cho rằng gen K13 hoạt động nhƣ là một bộ phận điều

khiển kiểm soát mức độ sản sinh protein PfPI3K trong phức hợp với enzyme gắn

E3, thay đổi mức độ tới mức hoàn toàn biến mất sự sao chép gen PfPI3K. Ở các

chủng nhạy, protein K13 liên kết với enzym thủy phân PfPI3K và làm giảm hoạt

tính protein này, trong khi ở chủng đột biến không có sự liên kết này dẫn đến

tăng nồng độ PfPI3K và dẫn đến tăng sản sinh lƣợng lipid PfPI3P. Sự gia tăng

lipid PfPI3P làm tăng hiệu quả kháng artemisinin.

- Mối liên quan giữa đột biến gen K13 propeller đối với kháng artemisinin

đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm. Sự liên quan chặt chẽ giữa alen đột biến

với tỷ lệ sống sót trong thử nghiệm in vitro và hiện tƣợng chậm làm sạch KSTSR

trên in vivo, cho thấy các điểm đột biến K13 propeller xuất hiện là một dấu ấn

quan trọng trong xác định kháng artemisinin (Federic và cs., 2014).

- Đa hình đột biến gen K13 đƣợc ứng dụng nhƣ một chỉ điểm phân tử để xác

định kháng artemisinin trong các thử nghiệm in vivo và in vitro vì một số lý do:

 Có sự biến mất liên tiếp những chủng KSTSR mang kiểu gen hoang dại

ở phía Tây Campuchia suốt giai đoạn bắt đầu có sự kháng artemisinin;

 Kiểu KSTSR đột biến tăng lên về tần số tại các vùng kháng thuốc của

Campuchia và xuất hiện rất ít ở những nơi khôngkháng artemisinin là phổ

biến;

 Những đột biến đa dạng trên K13-propeller phản ánh chọn lọc dƣơng, tăng

lên theo thời gian;

 Những đột biến xảy ra ở vùng gen có tính bảo tồn cao của P. falciparum;

 Tần xuất xuất hiện của những allen đột biến tƣơng quan chặt với tỷ lệ

KSTSR dƣơng tính ngày D3 ở bệnh nhân sau khi điều trị bằng thuốc ACTs.

- Đến nay trong tổng số 186 đột biến trên gen K13 đƣợc phát hiện, đã xác

định một số đột biến có nghĩa làm thay đổi biểu hiện gen và kiểu hình cá thể. Tại

một số nƣớc thuộc Tiểu vùng sông Mê Kông nhƣ Campuchia, Lào và Việt Nam,

các đột biến kháng phát hiện đƣợc là C580Y, R539T, Y493H và I543T. Trung

Quốc, Myanmar, Thái Lan các đột biến kháng là P446L, N458Y, P574L và

R561H [36]. Tại châu Phi, các kết quả nghiên cứu đƣợc báo cáo tại Cameroon,

Trung Phi, Comoros, Congo, Gabon cho thấy các đột biến K13 khá đa dạng

nhƣng lại hiếm khi xuất hiện các đột biến có ý nghĩa xác định kháng artemisinin,

đột biến phổ biến nhất đƣợc quan sát tại khu vực này là A578S. Không phải tất

cả các đột biến trên gen K13 đƣợc báo cáo đều xác định sự nổi lên của kháng

artemisinin. Có đột biến đại diện cho kiểu gen “passer-by”, chúng không dẫn đến

sự chọn lọc kiểu gen đột biến K13. Theo TCYTTG (2018) [105], đột biến có giá

trị xác định kháng artemisinin khi có đột biến đó có liên quan chặt với thời gian

chậm làm sạch KST trong nghiên cứu lâm sàng và giảm độ nhạy với thuốc trong

thử nghiệm in vitro (nghiên cứu RSA0-3h), hoặc giảm độ nhạy cảm trong thử

nghiệm chuyển gen đột biến K13 trên động vật thực nghiệm. Các đột biến chỉ có

liên quan đến thời gian làm chậm sạch KST nhƣng không có liên quan đến giảm

nhạy cảm trong test in vitro thì đƣợc xác định có liên quan đến kháng

Đến 2015, dựa trên kết quả nghiên cứu tại nhiều quốc gia, WHO tổng

kết và phân loại các vị trí đột biến gen K13 liên quan đến xác định kháng

artemisinin. Trong đó bốn vị trí đột biến đƣợc xác định kháng artemisinin là

493H, 539T, 543T và 580Y. Các vị trí đột biến này đƣợc khẳng định lƣu hành

phổ biến ở khu vực Tiểu vùng Sông Mêkông [104].

artemisinin.

- Cho đến nay dựa trên kết quả nghiên cứu phát hiện đột biến K13 từ các

phân lập từ bệnh nhân và thử nghiệm in vitro trong phòng thí nghiệm tại nhiều

quốc gia, Báo cáo của TCYTTG (WHO, 2018)[105] đã khẳng định: 9 vị trí đột

biến gen K13 có giá trị xác định kháng artemisinin và 11 vị trí đột biến có giá trị

xác định có liên quan đến kháng artemisinin (Bảng 1.1)

Bảng 1.1. Các vị trí đột biến gen K13 liên quan đến kháng artemisinin.

Các chỉ điểm K13 kháng xác định Các chỉ điểm K13 ứng viên/ liên quan

F446I P553L P441L G538V

N458Y R561H G449A V568G

M476I C580Y C469F P574L

Y493H A481V F673I

R539T P527H A675V

I543T N537I

Ngoài ra có hai đột biến đã đƣợc báo cáo thƣờng xuyên gặp trên các thử

nghiệm lâm sàng là K189T và E252Q, mặc dù sự hiện diện của E252Q liên quan

đến nghiên cứu chậm làm sạch KSTSR nhƣng không thể hiện xác định kháng

trên in vitro.

1.4. Tình hình ký sinh trùng Plasmodium falciparum kháng thuốc sốt rét

1.4.1. Trên thế giới

Tình hình KSTSR kháng thuốc diễn biết rất phức tạp đã có 73/95 quốc gia

và vùng lãnh thổ thông báo có P. falciparum kháng thuốc. Tần số, mức độ P.

falciparum kháng thuốc cao nhất ở vùng có dịch tễ phức tạp nhƣ Thái Lan,

Campuchia, Việt Nam [59]. Một số nƣớc Trung Mỹ, Haiti [93].

1.4.1.1. Kháng artemisinin và dẫn chất

Đã có nhiều báo cáo về phác đồ đơn trị liệu artesunat (AS) với liệu trình 3

ngày, 4 ngày hoặc 5 ngày đƣợc thử nghiệm tại Thái Lan, Tanzania cho tỷ lệ khỏi

hay đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (Adequate Clinical and

Parasitological Response-ACPR) từ 72-100% [103]. Từ cảnh báo đó, TCYTTG

yêu cầu các hãng dƣợc phẩm dừng tiếp thị và bán thuốc dạng đơn trị liệu [104]

và dữ liệu gần đây chỉ ra kháng thuốc artemisinin qua mô hình kháng thực

nghiệm trên động vật gặm nhấm (P. yoelii hoặc P. berghei kháng artemisinin và

artemether hoặc P. chabaudi kháng với artesunat) [39],[103]. Riêng kháng

artemisinin và dẫn chất, tại Campuchia, dựa trên các phân tích chỉ ra rằng kháng

artemisinin bắt đầu từ năm 2001, trƣớc khi ACTs đƣợc dùng rộng rãi; ca kháng

lâm sàng đầu tiên đƣợc xác định vào năm 2006 [103].

1.4.1.2. Ký sinh trùng P. falciparum giảm nhạy và kháng các thuốc ACTs

Tỷ lệ thất bại điều trị cao với thuốc artesunat-mefloquin bắt đầu ở tỉnh Pailin

năm 2008 và lan rộng vào năm 2010 [103]. Sau khi Campuchia tiến hành Dự án

ngăn chặn kháng thuốc từ năm 2009, số BNSR nhiễm P. falciparum giảm, tuy

vậy tỷ lệ bệnh nhân điều trị DHA-PPQ còn thể vô tính vào ngày D3 vẫn tăng từ

26% (2010) đến 46% (2013) [45]. Ariey F. và cộng sự (2013) đánh giá trên 886

phân lập từ BNSR tại 6 tỉnh của Campuchia trong thời gian (2001-2012) xác

định đƣợc 17 vị trí đột biến trên gen K13 trong đó có 3 vị trí với tần xuất đột

biến > 5% (C580Y, R539T và Y493H). Tần xuất của các alen kiểu hoang dại

Hình 1.3.Tình hình kháng thuốc artemisinin P. falciparum tại Tiểu vùng sông Mê

Kông từ 2008-2012 ( nguồn The Southeast J Trop Med and Public Health; 2013).

giảm dần theo thời gian xảy ra tại 3 tỉnh phía Tây Campuchia [37], [38], [93].

Điểm quan trọng là tần xuất của các alen kiểu đột biến có tƣơng quan chặt với

các bệnh nhân có KSTSR dƣơng tính ngày D3 sau điều trị với thuốc ACTs. Một

nghiên cứu khác tại Campuchia của Pharath Lim và cộng sự (2013) cho biết

trong khi P. falciparum đa kháng thuốc có mặt phổ biến ở khu vực phía Tây và

phía Bắc Campuchia, điều này cũng xảy ra tƣơng tự ở Thái Lan. Pharath Lim và

cộng sự cũng lần đầu tiên nghiên cứu liệu sự gia tăng số lƣợng bản sao của

„X5r‟- một vùng nằm trên nhiễm sắc thể số 5, là chỉ điểm di truyền dòng

P. falciparum PPQR4 đƣợc chọn lọc với nồng độ PPQ IC50 cao, có tƣơng quan

với việc giảm tính nhạy cảm PPQ của KSTSR trong thử nghiệm lâm sàng in vivo

[104]. Kết quả nghiên cứu đề xuất rằng tất cả các ca kháng artemisinin sau khi

điều trị ACTs tại Campuchia tại thời điểm nghiên cứu chủ yếu là do kháng

artermisinin [59], [62].

Tại Lào, nghiên cứu tại tỉnh Champasack cho thấy 22,2% bệnh nhân còn

KST ngày D3 sau điều trị với thuốc artemether-lumefantrine đã xác định có đột

biến K13 trong các quần thể KSTSR. Tại Myanmar, kháng artemisinin đƣợc ghi

nhận vào năm 2008, số liệu nghiên cứu năm 2009 cho thấy kháng artemisinin đã

xảy ra ở 5 vùng và tiểu bang thuộc Đông nam Myanmar với cả 3 thuốc phối hợp

ACTs gồm artemether-lumefantrine (AL), dihydroartemisinin-piperaquin

phosphat (DHA-PPQ), artesunat-mefloquin (ASMQ) [74]. Tại Thái Lan, từ năm

2008 đã ghi nhận tỷ lệ thất bại điều trị với ASMQ trên 10%. Tỷ lệ thất bại điều

trị cao đƣợc chứng minh do có tỷ lệ kháng cao với thành phần MQ (loại thuốc đã

đƣợc sử dụng nhiều năm tại đây). Tuy vậy, đến 2012 với AL đƣợc dùng thay thế

đã xác định có 2 tỉnh có tỷ lệ thất bại điều trị đạt khoảng 10% [52], [59], [62].

Nghiên cứu của Myat Phone Kyaw tại Kawthaung thuộc Myanmar năm

2009 (n=80), điều trị bằng DHA + PIP tỷ lệ KST dương tính ngày D3 cao tới

18,7% tỷ lệ ACPR vẫn đạt 95%, năm 2010 (n=83) tỷ lệ KST dương tính ngày

Hình 1.4. Tình hình kháng thuốc ACT do P. falciparum tại Tiểu vùng Mê Kông

D3 20,5% nhưng tỷ lệ ACPR vẫn cao 97,4%[74].

từ 2016-2018 (Nguồn: WHO, 2016-2018)

1.4.2. Tại Việt Nam

Lịch sử kháng thuốc cho thấy bức tranh toàn cảnh về tình hình và quy mô

KSTSR kháng thuốc, đặc biệt loài P. falciparum, các thông tin cập nhật về

nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc sốt rét, cũng chứng minh rằng dùng thuốc

đơn trị liệu trong phạm vi rộng và thời gian dài là một trong những nguyên nhân

làm P. falciparum phát triển kháng với hầu hết các thuốc SR [29], [103].

Artemisinin là một chất chiết suất từ cây Thanh hao hoa vàng (Qinghaosu)

cấu trúc sequiterpen lacton chiết xuất từ lá của cây thanh hao hoa vàng, đƣợc sử

dụng hơn 1000 năm trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị sốt và có mặt

trong ít nhất 52 bài thuốc cổ truyền Trung Quốc. Artemisinin có tác động và diệt

nhanh từ thể tƣ dƣỡng trẻ đến thể phân liệt già và có thể ức chế hình thành giao

bào qua trung gian làm giảm các giai đoạn khác nhau trong chu kỳ Plasmodium

spp. Dihydroartemisinin (DHA) là một dẫn xuất và chất chuyển hóa chính của

artemisinin có hiệu lực tƣơng đƣơng với artemisinin và artesunat [4].

Bên cạnh đó, các bằng chứng góp phần củng cố hơn về hiện tƣợng kháng

artemisinin và dẫn chất với KST P. falciparum trên in vitro giảm đáng kể, nồng

độ ức chế (IC50) tăng lên gấp 2-3 lần so với trƣớc, giảm hiệu lực artemisinin từ

nghiên cứu in vivo quy mô đa quốc gia với tỷ lệ tái phát sớm cao và giảm hiệu

lực thuốc từ những báo cáo ca bệnh lâm sàng đơn lẻ [29]. Một số kinh nghiệm

cho thấy tình trạng kháng có thể rút ngắn “tuổi thọ” thuốc. Nếu không có kế

hoạch giám sát tình hình kháng thì việc đầu tƣ tiền vào phát triển một thuốc mới

sẽ lãng phí lớn.

Phát minh ra một loại thuốc mới cần đầu tƣ nhiều công sức, tiền của và

không kể đến nguy cơ thất bại nếu nhƣ không thực hiện hai mặt của một vấn đề

nêu trên. Do vậy, trong khi chờ đợi một thuốc mới, việc cần làm ngay trong thời

điểm này chính là kéo dài tuổi thọ thuốc bằng cách bảo vệ không để tăng đột biến

kháng và dùng các ACTs điều trị P. falciparum là trọng tâm. Các ACTs nhƣ

Coartem, CV-8, Artecom, Coarsucam, Artemodi, Artequick, Artekin, Arterakin,

CV-artecan đã đƣợc nghiên cứu tại Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Việt Nam,

Trung Quốc, Myanmar cùng các nƣớc châu Phi nhằm đƣa ra giải pháp tốt nhất đối

với kháng thuốc.

Các nghiên cứu về KSTSR kháng thuốc và hiệu lực phác đồ chống kháng

tại một số khu vực miền Trung-Tây Nguyên của lý Bá lộc và cộng sự (2006) cho

thấy hiệu lực thuốc artesunate đơn trị liệu và thuốc phối hợp ACTS vẫn còn cao

và chƣa có biểu hiện thất bại điều trị, tuy nhiên có một số trƣờng hợp tái phát

sớm trong 28 ngày theo dõi trên các bệnh nhân sống trong vùng SRLH nặng

[13]. Đến năm 2009 đã xuất hiện ca thất bại sớm đầu tiên của P. falciparum với

Arterakin tại xã Đăk Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phƣớc và sau đó tại huyện

Phú Thiện, Gia Lai năm 2010 [29]. Giám sát thƣờng xuyên hiệu lực điều trị của

DHA-PPQ đã phát hiện thêm nhiều điểm có tỷ lệ thể vô tính ngày D3≥ 10% là

Gia Lai (2010), Đăk Nông và Quảng Nam (2012) [4], [15]. Nghiên cứu của

Huỳnh Hồng Quang (2014) tại huyện Hàm Thuận Nam tỉnh Bình Thuận trên

bệnh nhân sốt rét P. falciparum điều trị bằng DHA-PPQ thấy hiệu quả điều trị vẫn

còn cao 95%, nghiên cứu của Bùi Quang Phúc (2015) điều trị sốt rét P.

falciparum bằng DHA-PPQ tại xã Sơn Thái và Khánh Thƣợng, huyện Khánh

Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa thấy tỷ lệ KST thể vô tính ngày D3 cao đến 17,4% [16],

[17].

Tại Quảng Nam, nghiên cứu của Kamala Thriemer và cộng sự (2015) [66]

từ 2012-2013 tỷ lệ tồn tại thể vô tính P. falciparum ngày D3 gần 30%, điểm theo

dõi của Nam Trà My, Quảng Nam cùng với điểm theo dõi liên tục các xã của

huyện Phú Thiện (tỉnh Gia Lai) đƣợc TCYTTG đánh giá có thể là những vùng

đầu tiên của miền Trung và Tây Nguyên của Việt Nam không có giao lƣu biên

giới nghi ngờ xuất hiện kháng thuốc artemisinin [89], [90].

Năm 2015, tác giả Bùi Quang Phúc và cộng sự đã báo cáo tình trạng thất bại

điều trị P. falciparum với thuốc DHA-PPQ tại Bình Phƣớc [86] và sau đó một số

tỉnh khác giáp biên nhƣ Đăk Nông (2018), kế đến là Gia Lai (2019) [19] và Đăk

Lăk (2019) cũng lần lƣợt báo cáo thất bại điều trị và các trƣờng hợp nhƣ thế có

kèm theo chỉ điểm phân tử đột biến gen K13 tỷ lệ trên 50% tại các điểm nghiên

cứu này và phải thay đổi chính sách thuốc tại các tỉnh từ năm 2020 sau khi đã

thử nghiệm thành công thuốc Pyramax có thể thay thế chống kháng [87].

Hình 1.5. Tình hình ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc artemisinin tại một

số vùng của Việt Nam (nguồn WHO 2014)

1.5. Hiệu lực điều trị, tính dung nạp và độ an toàn của phối hợp DHA-PPQ

1.5.1. Tính dung nạp của phối hợp thuốc DHA-PPQ

Liệu pháp thuốc phối hợp ACTs đƣợc khuyến cáo lựa chọn ƣu tiên trong

điều trị P. falciparum trên toàn cầu và phối hợp cố định liều dùng. Các ACTs

khác nhằm mục đích đạt đƣợc hoạt tính diệt thể phân liệt trong máu nhanh bằng

cách lựa chọn phối hợp có artemisinin cùng với một thuốc có hiệu lực kéo dài hơn

liên quan đến cơ chế tác động khác nhau và thời gian bán hủy cũng khác nhau khi

lựa chọn các thuốc đi kèm. DHA-PPQ với nhiều biệt dƣợc khác nhau nhƣ Artekin,

CV-Artecan, Eurartesim, Duo-Cotecxin là một trong 5 phối hợp ACTs đƣợc

khuyến cáo của TCYTTG [30], [103].

DHA là 1 sesquiterpen lacton với cầu nối endoperoxide, có tác dụng rất

quan trọng đối với KST vì diệt thể phân liệt, nhƣng thực tế không có tác dụng

trên thể ngoại HC, thể thoi trùng, thể giao bào. DHA, với vai trò là một chất

chuyển hoá chính có hoạt tính sinh học của artesunat và artemether, đã đƣợc sử

dụng rất lâu trên BNSR khắp thế giới. Cơ chế tác dụng của DHA hiện chƣa biết

thấu đáo. Một vài nghiên cứu cho rằng thuốc tập trung có tính chọn lọc vào tế

bào nhiễm và tác động với hemozoin dẫn đến tiêu diệt KST, trên in vitro, phản

ứng này sinh ra các gốc tự do độc hại có thể phá huỷ các màng KST. Thuốc đi

cùng PPQ-dẫn xuất thuộc 4-aminoquinolein, loại biquinolin có cơ chế tác dụng

tƣơng tự nhƣ nhóm quinolein, đƣợc dùng thay cho CQ và đóng vai trò quan

trọng trong PCSR trên thế giới trong những năm của thập kỷ 80. Thành phần

PPQ có tác dụng tốt trên các thể trong HC của P. vivax, P. malariae và P.

falciparum, ngoại trừ giao bào. Các dữ liệu về hiệu lực từ các nghiên cứu tiến

hành từ 2005-2008 với việc thay đổi liều khác nhau và hiệu lực tƣơng tự nhƣ trong

các báo cáo ở tổng hợp. DHA-PPQ có thể xem là “đa trị liệu” [39], [92]. Một

trong những vấn đề chính của 2 thuốc trên khi dùng đơn trị liệu là tỷ lệ kháng

thuốc và/ hoặc tái phát rất cao sau khi ngừng điều trị. Nghiên cứu gần đây khẳng

định DHA-PPQ là một phối hợp ACTs hiệu quả cao và an toàn đối với các thể

SR, kể cả BNSR do P. falciparum đa kháng. Phác đồ DHA-PPQ khắc phục

nhƣợc điểm của cả 2 thuốc khi dùng đơn trị liệu, cũng nhƣ có khả năng làm

chậm sự kháng thuốc PPQ[103]. 1.5.2. Hiệu lực điều trị và độ an toàn của phối hợp DHA-PPQ

DHA-PPQ đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng (TNLS) pha 3 tiến hành theo

nghiên cứu đa trung tâm của TCYTTG trên các ca nhiễm P. falciparum. Thử

nghiệm thứ nhất tiến hành trên trẻ em và BNSR châu Á và nghiên cứu thứ hai trên

các trẻ em châu Phi. Thử nghiệm pha 3 tại châu Á là thử nghiệm ngẫu nhiên, có

đối chứng đánh giá hiệu lực và tính an toàn DHA-PPQ so với phác đồ AS-MQ

trên BNSR trẻ em và ngƣời lớn bị P. falciparum. Tổng số 769 ca điều trị DHA-

PPQ và 381 ca dùng AS-MQ. Phân tích chỉ ra tỷ lệ ACPR vào ngày D63 trƣớc và

sau hiệu chỉnh PCR ở hai thử nghiệm lần lƣợt là 97% (với DHA-PPQ) và 95,3%

(với AS-MQ) và 98,7% (với DHA-PPQ) và 97% (với AS+MQ) [56]. Ngoài ra,

phân tích hiệu lực theo dõi D63 cho thấy giảm nguy cơ nhiễm mới qua ƣớc tính

Kaplan-meier về tỷ lệ nhiễm mới ngày D63 là 22,7% (với DHA-PPQ) và 30,3%

(với AS-MQ). Thử nghiệm pha 3 tại châu Phi trên trẻ em nhiễm P. falciparum

không biến chứng với thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng để đánh giá hiệu lực

và tính an toàn DHA-PPQ so với A/L [56]. Quần thể nghiên cứu chọn ngẫu nhiên gồm 1.039 trẻ em điều trị DHA-PPQ và 514 trẻ em với phác đồ A/L. Kết quả cho thấy tỷ lệ chữa khỏi vào D28 là 92,7% (với DHA-PPQ) và 94,8% (với AL) và 95,7% đối với cả 2 phác đồ DHA-PPQ và AL. Kết quả cho thấy cả hai ACTs đều

cho hiệu lực tƣơng tự, thêm vào đó, phân tích theo dõi 42 ngày cho thấy DHA-

PPQ giảm nguy cơ nhiễm mới đáng kể so với A/L (Kaplan-meier ƣớc tính tỷ lệ

bệnh nhân nhiễm mới vào ngày D42 là 13,6% đối với DHA-PPQ và 24% đối với

A/L) [56]. Hiệu quả này góp phần do thời gian bán hủy của PPQ và xem nhƣ đó là

một tác động quan trọng tại các vùng SRLH. Dữ liệu về hiệu lực cũng đã đƣợc

đánh giá trên 2 nghiên cứu dƣợc động học với bệnh nhân sốt rét do P.

falciparum không biến chứng [100]. Một TNLS ở Burkina Faso, 32 trẻ em điều

trị bằng DHA-PPQ, tỷ lệ chữa khỏi sau khi hiệu chỉnh PCR là 87,5% và 93,3%

trên nhóm chƣa hiệu chỉnh PCR. Một TNLS tƣơng tự về dƣợc động học tại

Thái Lan với 25 ca ngƣời lớn bị P. falciparum điều trị DHA-PPQ, tỷ lệ chữa

khỏi ngày D90 là 100% [64].

Trong thử nghiệm pha 3 tại châu Á, tỷ lệ xuất hiện ít nhất 1 tác dụng không

mong muốn trên nhóm DHA-PPQ (69,4% ) so với nhóm AS-MQ (72,4%) là

tƣơng tự. Vào thời điểm đƣa BNSR vào nghiên cứu có giảm nhẹ tiểu cầu. Trong

suốt nghiên cứu, các thay đổi về xét nghiệm đều hằng định cho đến khi hồi phục.

Khoảng QTc trên điện tâm đồ kéo dài đã đƣợc báo cáo nhƣ một tác dụng ngoại ý

5,4% (DHA-PPQ) so với 4,2% (AS-MQ). Thay đổi khoảng QTc từ số liệu ban

đầu đến D2 giữa điều trị có ý nghĩa thống kê. Vào ngày D7, khoảng QT kéo dài

hoàn toàn đƣợc giải quyết [33], [52]. Trong nghiên cứu pha 3 tại châu Phi, tỷ lệ

BNSR có ít nhất một tác dụng không mong muốn tƣơng tự giữa hai nhóm; DHA-

PPQ (79,3%) so với A/L (80,6%). Sốt (29% so với 32%) và xuất hiện lại KST P.

falciparum (19% so với 25,9%) đã đƣợc báo cáo thƣờng gặp hơn trên nhóm dùng

A/L, không thấy trƣờng hợp nào rối loạn nhịp [103]. Theo sau nghiên cứu pha 3,

một nghiên cứu thiết kế thích hợp hơn nhắm vào khoảng QTc kéo dài đã đƣợc tiến

hành cho thấy sự kéo dài khoảng QTc vào thời điểm cuối điều trị DHA-PPQ khi

chỉ định dùng với chế độ ăn giàu calo, song giảm đi đáng kể khi thuốc chỉ định

dùng lúc đói với nƣớc bình thƣờng. Hiệu lực và độ an toàn DHA-PPQ trên các trẻ

em tuổi < 6 tháng và các trẻ cân nặng nhỏ hơn 5 kg chƣa đƣợc đánh giá.

Liệu pháp thuốc hiện tại đang dùng đồng thời sử dụng hai hay nhiều thuốc

diệt thể phân liệt trong máu theo các cơ chế tác động riêng biệt. Điều này cải

thiện hiệu lực và trì hoãn phát triển kháng với ACTs. Để chống lại sự phát triển

kháng, TCYTTG khuyến cáo các liệu pháp đơn trị liệu phải đƣợc loại bỏ và các

trƣờng hợp SR nên điều trị với ACTs. Các dẫn suất artemisinine làm giảm nhanh

tải lƣợng KSTSR, trong khi có sự hiện diện của thuốc thứ hai với cơ chế tác động

khác sẽ làm giảm đi khả năng xuất hiện chủng kháng. TCYTTG khích lệ phát

triển các phiên bản thuốc phối hợp ACTs, hơn là chế phẩm cùng vỉ vì có thể dẫn

đến dùng nhầm để hỗ trợ cho đơn trị liệu artemisinine [46], [56].

Trong một số nghiên cứu về DHA-PPQ đều cho kết quả chữa khỏi trên 95%

với tính dung nạp tốt trong điều trị trên cả trẻ em và ngƣời lớn và tác dụng ngoại

ý thấp [46], [52]. DHA-PPQ cũng đƣợc nghiên cứu với cỡ mẫu lớn tại Southern

Papua, Indonesia và không có sự khác biệt có ý nghĩa trong tái phát thật sự

đƣợc phát hiện trong nhóm DHA-PPQ và A/L. Cả hai thuốc cho thấy dung nạp

tốt, tác dụng ngoại ý thoáng qua. DHA-PPQ giảm đi tái phát thật sự có ý nghĩa

(4,8%) so với ASAQ (16%) và dung nạp tốt. Hầu hết bệnh nhân (97%) sạch KST

trong vòng 48 giờ, chỉ ra tốc độ làm sạch KSTSR do thuốc DHA rất nhanh.

Tại Việt Nam, từ những năm 1990 đã có nhiều TNLS các artemisinin và

dẫn chất artesunat, dihydroartemisinin và đầu năm 2000, tác giả Đoàn Hạnh

Nhân và cộng sự của Viện Sốt rét - KST - CT Trung ƣơng và Quy Nhơn thử

nghiệm đầu tiên với thuốc ACTs nhƣ CV-8 và sau đó là DHA-PPQ [26], [27],

artemisinin-piperaquin, ASAQ, ASMQ bƣớc đầu cho hiệu lực rất cao, nhiều thử

nghiệm cho hiệu lực lên đến 100%. Nhìn chung, các phác đồ thuốc ACTs trên

đều cho hiệu lực cao từ 97-100%, một số ít có tỷ lệ thất bại điều trị vì nhiều lý

do, chỉ khoảng 1-3%, song nhìn chung các phác đồ đƣợc dùng phổ biến và rộng

rãi tại các nƣớc và tập trung vào DHA-PPQ, AS-AQ [22], [29].

Một nghiên cứu đánh giá và giám sát P. falciparum kháng thuốc ART và

AS tại tỉnh Bình Phƣớc, Việt Nam từ 1998 - 2009. Đây là một công trình phối

hợp giữa khoa y, đại học Melbourne, Bệnh viện Royal Melbourne, Victoria (Úc)

và Viện Sốt rét-KST-CT TƢ, Việt Nam tiến hành. Các dẫn chất của ART đã

đƣợc dùng tại Việt Nam từ 1989, đã làm giảm số mắc và tử vong đáng kể từ năm

1991-2006 [26], [29], [31]. Hƣớng dẫn cũng nhƣ chính sách hiện tại của quốc

gia đang khuyến cáo dùng các liệu pháp thuốc sốt rét phối hợp ACTs, dù AS vẫn

đang còn có sẵn tại hệ thống y tế tƣ nhân [11]. Các báo cáo gần đây cho thấy

hiệu quả của ACTs và liệu pháp AS đơn trị liệu có giảm tại phía tây Campuchia.

Nghiên cứu này nhằm đánh giá mô hình kháng do P. falciparum qua 10 năm tại

một tỉnh phía nam Việt Nam với BNSR đƣợc điều trị bằng các thuốc phối hợp có

artemisinin [21], [27].

Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại hai xã của huyện Phƣớc Long, tỉnh Bình

Phƣớc. Lựa chọn này nhƣ một vùng có khả năng xuất hiện kháng ART vì tỷ lệ

SR do P. falciparum cao ở đây, thời gian dùng thuốc ART và dẫn xuất tại đây

cũng rất lâu. Các giám sát dựa vào kỹ thuật in vivo và in vitro đối với tính nhạy

của P. falciparum với các thuốc qua giai đoạn (1998-2009). Các bệnh nhân xác

định nhiễm P. falciparum đƣợc đƣa vào điều trị liệu pháp artemisinine 5 ngày

(1998 và 2001) hoặc 7 ngày AS. Trong 4 TNLS, có 270 ca vào điều trị. Thời

gian làm sạch KST khác nhau giữa các năm 1998, 2001 và 2004, 2005 (1,8; 2,3

và 2,1 ngày) nhƣng giữa 1998 và 2008/2009. Thời gian làm sạch KSTSR trung

bình có có liên quan đến mật độ KSTSR ngày D0 (r = 0,4; p < 0,001). Tỷ lệ thất

bại điều trị sau khi hiệu chỉnh PCR lần lƣợt là 13,8%; 2,9%; 1,2% và 0%. Độ

nhạy P. falciparum với artemisinine trên in vitro ổn định trong thời gian theo

dõi, ngoại trừ có tăng EC90 và EC99 vào năm 2001 [11], [27], [29].

Nghiên cứu này chỉ ra mức độ nhạy P. falciparum ổn định đối với

artemisinin tại 2 vùng qua thời gian theo dõi 10 năm. Việc triển khai các ACTs

trong vùng năm 2003 có thể bảo vệ chống lại phát sinh kháng artemisinine. Sự

phối hợp giữa hƣớng dẫn của Việt Nam và phiên bản mới nhất của TCYTTG

khuyến cáo ACTs nhƣ liệu pháp đầu tay tại tất cả vùng SRLH và giám sát liên

tục dọc theo biên giới Việt Nam-Campuchia là cần thiết để ngăn ngừa lan rộng

kháng. Nhìn chung, DHA-PPQ là thuốc hiệu lực cao đa chống kháng [27]. Tuy

nhiên, DHA không thể là một dẫn xuất phù hợp nhất của dẫn xuất artemisinin

trong các phối hợp ACTs vì tính ổn định với nhiệt đô kém khi phối hợp. Phối

hợp artesunate-piperaquin có thể là một thay thế tốt hơn do lợi điểm tăng ổn

định với nhiệt độ hơn DHA. Phối hợp nên có hiệu lực tƣơng đƣơng vì AS là

chuyển hóa nhanh thành DHA sau uống. Điểm tồn tại trong nghiên cứu về

cung cấp thông tin mới đặc tính dƣợc động học PPQ, bao gồm cả các nghiên

cứu in vivo lâm sàng và phi lâm sàng và cung cấp thêm cho vấn đề sử dụng PPQ

nhƣ một thuốc đi cùng trong ACTs tại các vùng SRLH. Có thể nói rằng liệu

pháp phối hợp DHA-PPQ nhƣ công cụ sống còn trong LTSR. Các ACTs làm

tăng tỷ lệ ACPR cũng nhƣ giúp giảm quá trình lựa chọn áp lực thuốc để xuất

hiện kháng với các thuốc [27], [29].

Tỷ lệ D3 thay đổi ở tỉnh Gia Lai này cũng phù hợp với một số nghiên cứu đa

trung tâm ở Việt Nam trong thời gian 5 năm gần đây [12], [25], [33], chẳng hạn

ở Bình Phƣớc nghiên cứu đánh giá hiệu lực và tính an toàn của thuốc DHA-PPQ

tại nhiều điểm theo dõi liên tục về diễn tiến về hiệu lực sau thời gian sử dụng

rộng rãi đã cho thấy thuốc có xu hƣớng giảm hiệu lực và dần dần xác định

kháng thuốc thật sự biểu hiện qua tỷ lệ thất bại đơn phần DHA hay cả thành

phần thuốc đi kèm PPQ tại một số điểm thuộc huyện Bù Gia Mập và Bù Đăng,

tỉnh Bình Phƣớc thấy rằng năm 2007, số ca theo dõi nghiên cứu là 25 ca, hiệu

lực ACPR là 100% và tỷ lệ KST ngày D3 là 4% (n = 25; 100% và D3 = 4%), sau

đó hai năm thì hiệu lực thuốc thay đổi ở năm 2009 (n = 46; 97,8 và D3 = 15,3%),

tiếp đó năm 2010 (n = 55; 100% và D3 = 22%), năm 2012 (n = 53; 100% và D3

= 30,6%), năm 2013 (n = 50; 100% và D3 = 36%) và đến năm 2015 thì hiệu lực

giảm rõ ràng với tỷ lệ ACPR chỉ là 68,2%, kèm theo tỷ lệ thất bại điều trị cao

(50%), kèm theo 90% số ca có đột biến gen K13 propeller xác định C580Y và có

cả đột biến Plasmepsin 2/3 có liên quan đến kháng thuốc đi kèm piperaquin

phosphate (n = 44; 68,2% và D3(+) 50%) [4], [15], [16]. Tuy nhiên, đến 2016,

sau khi điều trị bằng DHA-PPQ mới ra có điều chỉnh liều dùng cao hơn so với

phác đồ năm 2013 thì nghiên cứu cũng cho thấy kết cục không khả quan khi hiệu

lực chỉ còn 37% nhƣng tỷ lệ KST thể vô tính ngày D3 giảm từ 36% còn 19,4% (n

= 48; 37% và D3 = 19,4%), hay nhƣ nghiên cứu ở xã Ma Nới, huyện Ninh Sơn,

tỉnh Ninh Thuận từ năm 2015 có tỷ lệ KST thể vô tính ngày D3 là 10,9% thì năm

2017 chỉ còn D3 (+) là 3%, hay nghiên cứu ở tỉnh Đăk Nông cũng vậy, nghiên

cứu tại huyện Tuy Đức năm 2014 có 60 ca, đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ

là 100% và tỷ lệ KSTSR ngày D3 là 26,7% nhƣng đến năm 2016 với số ca

nghiên cứu là 13, đáp ứng ACPR là 84,6% và tỷ lệ D3 dƣơng tính cũng chỉ còn

23,1% [12], [25], [33].

Với hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong nghiên cứu này trình bày ở trên cho

thấy với phác đồ mới DHA-PPQ theo hƣớng dẫn mới của Bộ Y tế (2016) với

tổng liều 9 viên hoặc 12 viên tùy theo cân nặng của bệnh nhân nhƣ hiện nay, có

thể hiệu lực cao hơn so với nhóm bệnh nhân trên in vivo với thuốc DHA-PPQ

liệu trình tổng liều 8 viên của hƣớng dẫn chẩn đoán và điều trị của Bộ Y tế

(2013) vì nghiên cứu năm 2014 đó có tỷ lệ ACPR là 100% và tỷ lệ tồn tại thể vô

tính ngày D3 là 11,5% nhƣng nghiên cứu 2016 lại không thấy tồn tại D3. Số liệu

này tƣơng tự nhƣ nghiên cứu in vivo đánh giá hiệu lực thuốc AS hay DHA-PPQ

tại huyện Thuận Bắc và Ninh Sơn (Ninh Thuận) từ năm 2008, 2009, 2010, 2011

cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ là 100%, chƣa có ca nào D3 dƣơng

tính, song đến năm 2013 cho tỷ lệ ACPR dƣới 100% và D3 (+) là 8% (n = 51;

ACPR = 100% và D3 là 8%) và đến năm 2015 cho tỷ lệ chữa khỏi cũng là 100%

nhƣng tỷ lệ làm sạch KSTSR có tăng lên qua tỷ lệ D3 (n = 40; ACPR = 100% và

D3 là 11%) [4]. Tuy nhiên, ở các điểm Ninh Thuận cũng cho thấy có tỷ lệ đột

biến gen đa hình K13 propeller với tỷ lệ dao động 20%, trên nhóm bệnh nhân

ngƣời Răglay, đặc biệt có đột biến C580Y mà loại này khá phổ biến ở khu vực

tiểu vùng sông Mê Kông (Nguyễn Thanh Thùy Nhiên và cs., 2017) [29], [75].

Tất cả dẫn liệu dựa trên bằng chứng, đặc biệt là đột biến gen K13 và thay đổi tỷ

lệ dao động K13 đóng vai trò nhƣ chỉ điểm cảnh báo kháng thuốc phù hợp với

định nghĩa của TCYTTG (WHO, 2017), cần tiếp tục theo dõi và giám sát hiệu

lực thêm để thay đổi kịp thời chính sách thuốc quốc gia [107].

Nhiều nghiên cứu của Tạ Thị Tĩnh và cộng sự (2011) [29], Bùi Quang Phúc

và cộng sự (2013-2015) [15], [16] và Trần Tịnh Hiền và cộng sự (2014) [60],

[61] tại Bù Đăng (Bình Phƣớc) và Huỳnh Hồng Quang và cộng sự (2014-2017)

[21], [22], [23] tại Tuy Đức (Đăk Nông), Phú Thiện (Gia Lai), Nam Trà My

(Quảng Nam) với tỷ lệ ACPR từ 91,2-100%, song tỷ lệ tồn tại KST thể vô tính

ngày D3 dao động 14,7 - 44% qua nghiên cứu in vivo và in vivo cải tiến, rút ngắn

ngày theo dõi, đánh giá giám sát chỉ điểm K13 liên quan kháng. Song song,

nghiên cứu tại Gia Lai cũng cho diễn tiến tƣơng tự nhƣ hai tỉnh Bình Phƣớc và

Đăk Nông nhƣng tại các vùng không có đƣờng biên giới và nhóm bệnh nhân

không có giao lƣu biên giới Campuchia, có xu hƣớng đáp ứng lâm sàng và

KSTSR đầy đủ giảm và tỷ lệ KSTSR ngày D3 dƣơng tính tăng dần nhƣ năm

2007-2008 cho thấy tỷ lệ đáp ứng ACPR là 100%, không có D3 dƣơng tính, sang

năm 2010 tại các điểm Phú Thiện cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KST giảm còn

94,8% và D3 (+) là 11,7%, năm 2010 với 34 ca tại điểm Konch‟ro cho đáp ứng

lâm sàng và KST đầy đủ là 100% và D3 (+) là 3%. Đặc biệt, từ 2012-2016 tại

huyện Phú Thiện và Krông Pa cho tỷ lệ đáp ứng ACPR giảm và tỷ lệ D3 tăng lần

lƣợt 23%; 26,4%, 44,2% và 29,4% [15], [18], [29].

Một số nghiên cứu tại các tỉnh khác dọc ven biển miền Trung nhƣ huyện

Nam Trà My, Quảng Nam với 89 ca nhiễm P. falciparum theo dõi liên tục cũng

cho thấy đáp ứng ACPR là 97,7% và tỷ lệ D3 (+) là 29,2% (Thriemer K và cs.,

2014) [66] hay tại huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa từ năm 2011 trên 30 ca

cho thấy ACPR là 100% và không có D3 (+), đến năm 2014 nghiên cứu trên 46

ca cho tỷ lệ ACPR là 100% nhƣng có tỷ lệ D3 là 17,4% và đến năm 2016 trên 29

ca, cho tỷ lệ ACPR là 96,5% và tỷ lệ D3 (+) là 6,8% [24].

1.6. Các kỹ thuật đánh giá ký sinh trùng Plasmodium falciparum kháng

thuốc

1.6.1. Kỹ thuật in vivo đánh giá nhạy - kháng thuốc trên lâm sàng

- Kỹ thuật in vivo đƣợc TCYTTG khuyến cáo sử dụng nghiên cứu đánh giá

hiệu lực điều trị của một thuốc sốt rét, hoặc đáp ứng điều trị của một phác đồ

thuốc. Theo hƣớng dẫn TCYTTG áp dụng phƣơng pháp 7, 14, 28, hay 42 ngày

(thậm chí có nhiều nghiên cứu kéo dài thời gian theo dõi đến 63 ngày) tuỳ theo

thời gian bán hủy của từng loại thuốc và điều kiện thực tiễn thử nghiệm [101],

Hình 1.6. Thử nghiệm đánh giá kháng thuốc và ƣu thế từng kỹ thuật

[104].

- Năm 1973, nhóm chuyên gia nghiên cứu TCYTTG đƣa ra test in vivo 7 ngày.

Bệnh nhân nhiễm P. falciparum đƣợc điều trị thuốc chloroquin 25mg base/kg/3

ngày. Hàng ngày lấy máu đánh giá mật độ KSTSR. Trên thực tế một số trƣờng

hợp sạch KSTSR ngày thứ 7 nhƣng sau đó lại tái phát KST trong vũng 3 tuần

- Thử nghiệm in vivo 28 ngày (WHO, 1981), TCYTTG đƣa ra kỹ thuật test in

vivo 28 ngày để đánh giá P. falciparum xem xét mức độ nhạy hoàn toàn hay các

mức độ kháng khác nhau:

 Nhạy (S): Sạch KSTSR trong máu ngoại vi trong 7 ngày đầu (kể từ ngày

đầu uống thuốc) và không tái phát 3 tuần tiếp theo;

 Kháng độ 1 (RI): KSTSR tái phát trong phạm vi 3 tuần sau

 Kháng độ 2 (RII): Mật độ KSTSR ngày thứ 7 (D7) giảm so với ngày D0

 Kháng độ 3 (RIII): Mật độ KSTSR không giảm mà tăng so với ngày D0.

- Đến năm 1982, P. falciparum kháng cao với CQ, để bảo đảm an toàn cho điều

trị, nhóm chuyên gia TCYTTG lại bổ sung thêm theo dõi sau 48 giờ (ngày D2),

nếu KSTSR không giảm ít nhất 75% so với trƣớc khi điều trị (D0) là kháng RIII

và cần phải thay thuốc điều trị để bảo đảm an toàn cho bệnh nhân.

- Thử nghiệm in vivo 42/63 ngày (WHO, 2009) [101]:, khi giới thiệu và đƣa vào

áp dụng các thuốc ACTs gồm các thành phần thuốc đi kèm có thời gian bán hủy

thuốc dài hơn so với artemisinine và dẫn suất, thì kỹ thuật test in vivo đánh giá P.

falciparum kháng thuốc chuyển sang thử nghiệm 42 ngày theo dõi KSTSR vào

ngày D0, D1, D2, D7, D14, D21, D28, D35 và D42. Thử nghiệm này đƣợc

khuyến cáo vì nó cung cấp đƣợc nhiều thông tin hơn, tách đƣợc nhạy và kháng

độ 1, nhƣng mất nhiều thời gian theo dõi hơn. Thử nghiệm này đều phải tuân

theo quy trình chọn bệnh nhân đúng tiêu chuẩn đề ra (bệnh nhân đơn nhiễm do

P. falciparum chƣa bị biến chứng, chƣa uống thuốc sốt rét, mật độ KSTSR thể

vô tính trong máu đạt 1000 KST/mL trở lên, cho bệnh nhân uống thuốc theo

phác đồ chuẩn của từng loại thuốc, theo dõi xét nghiệm KSTSR theo thời gian

quy định, ngăn ngừa tái nhiễm để xác định tái phát chính xác. Trong quá trình

thực hiện quy trình ngoài việc theo dõi đáp ứng KSTSR cần theo dõi đáp ứng

lâm sàng trên ngƣời bệnh.

- Tiêu chuẩn phân loại kết quả thử nghiệm đánh giá trên test in vivo 42 ngày:

Thất bại điều trị sớm (ETF-Early treatment failure)

 Có dấu hiệu nguy hiểm hay SRAT ngày D1, D2 hay D3 và có KST trong máu;

 Mật độ KST ngày D2 cao hơn ngày D0, bất luận nhiệt độ cơ thể nhƣ thế nào;

 Có KST trong máu ở ngày D3 với thân nhiệt ≥ 37,5ºC;

 Mật độ KST ngày D3 ≥ 25% so với ngày D0.

Thất bại điều trị muộn gồm có:

Thất bại lâm sàng muộn (LCF-Late clinical failure)

 Có dấu hiệu nguy hiểm hay sốt rét nặng có sự hiện diện KSTSR trong máu

vào bất cứ ngày nào từ D4 đến D28 (D42) trên các bệnh nhân không hội đủ bất

kỳ tiêu chuẩn nào của thất bại điều trị sớm (ETF);

 Có mặt KST vào bất cứ ngày nào từ ngày D4 đến D28/D42) với thân nhiệt ≥

37,5ºC trên các bệnh nhân không hội đủ tiêu chuẩn ETF trƣớc đó.

Thất bại KSTSR muộn (LPF-Late parasitological failure)

 Có KSTSR vào bất cứ ngày nào từ D7 đến D28 (D42) kèm theo thân nhiệt <

37,5ºC trên các bệnh nhân không hội đủ tiêu chuẩn ETF hay LCF trƣớc đó.

Đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ hay chữa khỏi (ACPR-Adequate clinical

and Parasitological Response)

- Không có KST trong máu vào ngày D28/D42), bất luận nhiệt độ nách nhƣ

thế nào, trên các bệnh nhân không hội đủ tiêu chuẩn ETF, LCF hay LPF.

- Ngoài ra, khi bệnh nhân tham gia thử nghiệm, tùy thuộc nghiên cứu còn có

thể theo dõi biến cố bất lợi, tác dụng phụ thuốc tùy thuốc hiện dùng hay thuốc

mới.

1.6.2. Kỹ thuật in vitro đánh giá ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc

Về nguyên tắc, giám sát đáp ứng của KSTSR với thuốc sốt rét theo kỹ thuật

in vivo và in vitro cần làm thƣờng xuyên hàng năm. Giám sát in vivo về hiệu lực

điều trị là phƣơng pháp quan trọng nhất để quyết định phác đồ điều trị, phát triển

và tổng kết chính sách thuốc sốt rét Quốc gia. Việc giám sát in vitro độ nhạy cảm

của ký sinh trùng với thuốc sẽ cung cấp những dấu hiệu dự báo sớm kháng thuốc

và sự cần thiết thay đổi chiến lƣợc thuốc trên địa bàn. Trên toàn cầu, những hiểu

biết về sự thay đổi linh hoạt về độ nhạy thuốc sẽ rất quan trọng trong việc ra

quyết định về việc triển khai thuốc ở các nƣớc chƣa từng sử dụng. Hiện nay,

nhiều nƣớc trên thế giới đã nghiên cứu đánh giá KSTSR với thuốc bằng kỹ thuật

in vitro và in vivo.

1.6.2.1. Kỹ thuật Micro test (1978)

- Năm 1978, test in vitro khác đƣợc đƣa ra là micro test (Rieckmann – 1978)

và trở thành phƣơng pháp chuẩn của WHO từ năm 1980 đến nay. Kỹ thuật này

dựa trên nguyên tắc nuôi cấy P. falciparum trong môi trƣờng RPMI 1640 của

W. Trager và B. Jensen (1976) Bộ micro test KIT của WHO có các nồng độ

thuốc đƣợc gắn trên các giếng của phiến nhựa 96 giếng, chia làm 12 hàng, mỗi

hàng 8 giếng có 1 giếng chứng và 7 giếng có nồng độ thuốc khác nhau tùy thuộc

mỗi loại thuốc thử nghiệm. Quy trình này để xác định sự nhạy cảm in vitro của

P. falciparum với thuốc sốt rét tại thực địa [99].

1.6.2.2. Kỹ thuật test in vitro 48 giờ

- Kỹ thuật này tƣơng tự nhƣ kỹ thuật microtest. Trong microtest sử dụng 10%

HC trong môi trƣờng nuôi cấy P. falciparum RPMI 1640, trong kỹ thuật 48 giờ

chỉ dùng 4% HC, nên không cần thay môi trƣờng, mà nuôi KSTSR 48 giờ mới

lấy và thu hoạch. Thử nghiệm thông qua rửa sạch cánh tay bệnh nhân bằng xà phòng, dùng cồn ethylic 700 sát trùng một vùng rộng cánh tay bệnh nhân nơi

định lấy máu, lấy 2 ml máu tĩnh mạch đƣa vào tube có sẵn chất chống đông, lắc

nhẹ để tránh đông. Dùng pipett eppendof lấy 200 l máu cho vào tube đã có sẵn

1800 l môi trƣờng cho thử nghiệm in vitro microtest. Dùng pipett Eppendorf,

lấy 50 l hỗn dịch BMM nhỏ vào từng giếng từ giếng A (chứng) đến các giếng

thuốc từ thấp đến cao (BH). Trong khi cho máu vào các giếng chú ý lắc nhẹ

tube để đảm bảo máu và môi trƣờng đƣợc phân bố đều ở mỗi giếng. Mỗi bệnh

nhân dùng 1 đầu tip riêng.

- Đậy nắp phiến nhựa, dùng bút dạ ghi tên bệnh nhân hoặc số hiệu và ngày giờ

thử. Lắc phiến nhựa một cách nhẹ nhàng để trộn đều máu, môi trƣờng và thuốc.

Đặt phiến nhựa vào bình nuôi cấy, đốt nến, đợi khi nến gần tắt, khoá vòi của

bình nuôi lại và đặt bình vào tủ ấm 370C  0,5 trong vòng 24-30 giờ. Sau khi ủ

ấm, lấy phiến nhựa ra khỏi bình nuôi, dùng pipett hút hết môi trƣờng (phần nổi),

lấy cặn (HC và KSTSR) để làm tiêu bản lam giọt dày theo thứ tự các giếng:

Giếng A  Giếng B  Giếng C  Giếng D

Giếng E  Giếng F  Giếng G  Giếng H

Giếng chứng Giếng chứa sẵn thuốc

Số phân liệt Số phân liệt % phân liệt so với chứng

/200 KSTSR /200 KSTSR ( chứng=100%)

98 49 49/98 x 100 (50% )

Đánh giá sự đáp ứng của P. falciparum với thuốc sốt rét:

Nhạy cảm với thuốc Kháng thuốc

Thuốc thử Ức chế hoàn toàn thể phân Phân liệt vẫn phát triển

liệt tại nồng độ tại nồng độ

Mefloquine 16 pmol hoặc thấp hơn 32 pmol hoặc cao hơn

Quinin 128 pmol hoặc thấp hơn 256 pmol hoặc cao hơn

Amodiaquine 2 pmol hoặc thấp hơn 4 pmol hoặc cao hơn

Halofantrine 1,5 pmol hoặc thấp hơn 5 pmol hoặc cao hơn

Artemisinin Chƣa xác định Chƣa xác định

- Để lam khô tự nhiên, sau 24-48 giờ nhuộm lam với dung dịch giêm sa và

dung dịch đệm với độ pH 6,8. Đọc kết quả dựa trên đếm số phân liệt  3 nhân

trở lên trong tổng số 200 KSTSR (gồm tất cả thể) ở mỗi giếng và so sánh với

giếng chứng (A). Các mẫu đủ tiêu chuẩn để đánh giá khi số phân liệt đếm đƣợc ở

giếng chứng phải  10% (20 thể phân liệt trong 200 KSTSR).

- Các số liệu đƣợc nhập vào máy tính với phần mềm Probit của Wernsdorfer

(Wernsdorfer và cs., 1995).

- Về ƣu điểm, phƣơng pháp này rất có ích để đánh giá nhạy-kháng với CQ so

sánh với các thuốc, kể cả thuốc mới nhƣ artemisinin và các dẫn chất. Kỹ thuật

chủ động đánh giá nhạy-kháng của P. falciparum. Song, nhƣợc điểm là trong

48 giờ thể phân liệt vỡ ra xâm nhập vào các HC mới, nên phải đếm số

KSTSR/10.000 HC.

1.6.3. Kỹ thuật sinh học phân tử

1.6.3.1. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu phân biệt tái phát - tái nhiễm

- Nếu phát hiện KSTSR ở các thời điểm trong suốt quá trình theo dõi 28/42

ngày đƣợc coi là một tiêu chuẩn của thất bại điều trị thì vấn đề đặt ra là KSTSR

này là do nhiễm mới hay do tái phát. Kỹ thuật nhuộm giêm sa không thể phân

biệt đƣợc tái nhiễm và tái phát. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử đã có thể nhận

biết đƣợc tái phát hay tái nhiễm nhờ xác định kiểu gen ở trên ba locus khác nhau

PfMSP1, PfMSP2, PfGLURP của KSTSR.

- Phân tích kiểu gen dựa trên tính đa dạng di truyền của những kiểu gen

KSTSR loài P. falciparum nhƣ SMP1 (merozoite surface protein 1), SMP2

(merozoite surface protein 2) và GLURP (glutamate-rich protein) hay viết tắt là

msp1, msp2 và glurp [65]. Dữ liệu kiểu gen các dòng KSTSR trƣớc và sau đƣợc

so sánh theo cặp.

- Giấy thấm Whatman 3MM đƣợc dùng để thu mẫu máu bệnh nhân tại các

thời điểm D0 và D ngày xuất hiện lại KST hay thời điểm nghi thất bại điều trị.

Bảng 1.2. Các gen đa hình và trình tự mồi phân tích tái phát và tái nhiễm

Gen Ký hiệu

Trình tự mồi (Primers)

Mục đích

5‟-CTAGAAGCTTTAGAAGATGCAGTATTG-3‟

M1- OF

5‟-CTTAAATAGTATTCTAATTCAAGTGGATCA-3‟

M1- OR

i á t

à v

5‟-AAATGAAGAAGAAATTACTACAAAAGGTGC-3‟

M1-2KF

5‟-GCTTGCATCAGCTGGAGGGCTTGCACCAGA-3‟

t á h p

M1-2KR

m ễ i

5‟-AAATGAAGGAACAAGTGGAACAGCTGTTAC-3‟

M1-2MF

1 P S M

h n

i á t t ệ i

5‟-ATCTGAAGGATTTGTACGTCTTGAATTACC-3‟

M1-2MR

5‟-TAAAGGATGGAGCAAATACTCAAGTTGTTG-3‟

M1-2RF

b n â h P

5‟-CATCTGAAGGATTTGCAGCACCTGGAGATC-3‟

M1-2RR

5‟-ATGAAGGTAATTAAAACATTGTCTATTATA-3‟

M2-0F

5‟-CTTTGTTACCATCGGTACATTCTT-3‟

M2-0R

5‟-AGAAGTATGGCAGAAAGTAAkCCTYCTACT-3‟

M2-ICF

5‟-GATTGTAATTCGGGGGATTCAGTTTGTTCG-3‟

M2-ICF

2 P S M

5‟-AATACTAAGAGTGTAGGTGCARATGCTCCA-3‟

M2-FCF

5‟-TTTTATTTGGTGCATTGCCAGAACTTGAAC-3‟

M2-FCR

5‟-TGAATTTGAAGATGTTCACACTGAAC-3‟

G-OF

5‟-GTGGAATTGCTTTTTCTTCAACACTAA-3‟

G-OR

P R U L G

5‟-GTGTCACACTGAACAATTAGATTTAGATCA-3‟

G-FN

Phân tích so sánh kiểu gen và alen giữa các mẫu giấy thấm của bệnh nhân

thu nhận vào ngày D0 với ngày mà xuất hiện lại KSTSR trong suốt quá trình

theo dõi 42 ngày. Xác định tái phát khi kiểu gen và alen ở ngày D0 giống hệt

kiểu gen ngày có KST tái xuất hiện và tái nhiễm khi kiểu gen và alen ở D0 khác

ngày D xuất hiện lại KST. Xác định dạng phối hợp tái phát cùng với tái nhiễm

khi D tái phát vừa có kiểu gen hoặc alen mới và cũ giống nhau ngày D0.

1.6.3.2.Giải trình tự ADN xác định đột biến gen K13 liên quan kháng

artemisinin

- Tách ADN bằng bộ kít QIAamp Blood DNA Mini Kit theo hƣớng dẫn của

nhà sản xuất.

- Phản ứng PCR nhân bản gen K13 với trình tự mồi đƣợc thiết kế bởi Ariey

và cs 2014 và giải trình tự gen K13 theo phƣơng pháp Sanger [40].

của Ariey và cs 2013.

+ Tinh sạch sản phẩm PCR sau nhân bội bằng bộ kít Norgen theo hƣớng

dẫn của nhà sản xuất.

+ Đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ nanophotometer.

+ Thực hiện phản ứng PCR Sequencing.

+ Giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự ABI 3500

+ Thực hiện kỹ thuật PCR lồng nhân bội đoạn gen K13 theo phƣơng pháp

- Đọc và phân tích trình tự gen K13 bằng phần mềm tin sinh học Bioedit

V.7.0.5.3 với trình tự gen chủng 3D7 tham khảo trên ngân hàng gen NBCI với

mã số >XM_001350122.1

1.7. Một số yếu tố thuận lợi cho ký sinh trùng sốt rét phát triển và hình

thành kháng thuốc

Thuốc kháng ở một giai đoạn của KSTSR thƣờng dẫn đến kháng các giai

đoạn khác nhau, khi KST kháng thuốc bất kỳ thì chúng có khả năng duy trì, dễ

phát sinh kháng chéo trong cùng một nhóm thuốc hoặc có khả năng gây cho

muỗi tăng nhiễm KST kháng. Nguyên nhân phát sinh, phát triển KSTSR kháng

có thể do:

- Áp lực thuốc: Khi dùng một loại thuốc trong thời gian dài ở phạm vi rộng,

nhất là vùng SRLH cao, sẽ tạo thuận lợi cho chủng biến dị, kháng tự nhiên

tăng, thay thế những chủng nhạy bị diệt từ từ do sàng lọc cạnh tranh dƣới áp

lực thuốc);

- Gen nhạy và kháng của P. falciparum là một phức hợp đã đƣợc chứng minh

nếu đơn dòng thì sẽ có đáp ứng khác nhau với thuốc (hay dòng nhạy/dòng

kháng). Khi dùng một loại thuốc thời gian dài ngoài sự kiểm soát, không đủ

liều mà mật độ KST cao sẽ khó diệt tận gốc, thì chủng KSTSR dễ thích nghi

dần với thuốc;

- Sinh thái ngƣời di biến động: KSTSR thƣờng phát sinh và phát triển ở những

nơi có nhiều nguồn bệnh, mật độ KSTSR cao ở quần thể chƣa có miễn dịch

mới vào vùng SRLH nặng có thể làm KSTSR kháng thuốc do nguồn bệnh di

chuyển;

- Sự đột biến gen phân tử cũng gây ra kháng thuốc. Tần suất thay đổi nội sinh

về mặt di truyền xảy ra khi phát triển của KSTSR. Mức độ kháng thay đổi do

đột biến di truyền cũng nhƣ thay đổi cơ chế kháng. Tỷ lệ KSTSR phơi nhiễm

với thuốc cũng nhƣ nồng độ thuốc mà tại thời điểm đó KSTSR đã phơi nhiễm;

Chƣơng 2

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của

Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh

Thuận, Quảng Trị năm 2016 - 2018

2.1.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu máu giấy thấm đƣợc thu thập từ bệnh nhân sốt rét do P. falciparum đơn

thuần chƣa biến chứng

Tiêu chuẩn chọn bệnh

 Nhiễm đơn thuần P. falciparum;

 Không phân biệt độ tuổi, giới tính, dân tộc;

 Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu thông qua bản chấp thuận tham gia.

Tiêu chuẩn loại trừ

 KSTSR P. falciparum nhiễm phối hợp với các loài khác

2.1.1.2. Thời gian

Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2016 đến năm 2018

2.1.1.3. Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu tại thực địa: Đƣợc tiến hành tại 5 tỉnh gồm: Bình Phƣớc, Gia Lai,

- Bình Phƣớc: là một tỉnh nằm ở phía Đông Nam bộ, phía Bắc và Tây Bắc

Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị

giáp Campuchia. Đa số ngƣời dân tại Bình Phƣớc sống dựa vào trồng cây công

nghiệp nhƣ cao su, điều, cà phê, mì (sắn), khai thác lâm sản. Đây cũng là tỉnh có

sự giao lƣu dân cƣ lớn, tỉnh có tốc độ tăng trƣởng dân số bình quân cao thứ tƣ

toàn quốc. Bình Phƣớc là tỉnh có tình hình SR phức tạp nhất cả nƣớc. Trong

nghiên cứu này, chọn 2 xã là Bù Gia Mập và Đắk Ơ, huyện Bù Gia Mập tỉnh

Bình Phƣớc nơi có Vƣờn quốc gia Bù Gia Mập và có đƣờng biên giới giáp với

Campuchia dài 60 km, phía đông tiếp giáp với huyện Tuy Đức, tỉnh Đắk Nông.

- Gia Lai là một tỉnh miền núi có diện tích lớn thứ hai Việt Nam nằm ở phía

Bắc khu vực Tây Nguyên, gồm 14 huyện, 2 thị xã, 1 thành phố. Đây là 1 trong

hai tỉnh có tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất so với cả nƣớc, với tỷ lệ BNSR 5 năm

(2011-2015) cao, đối tƣợng mắc sốt rét chủ yếu là có tham gia khai thác lâm thổ

sản, săn bắt thú và có hoạt động ngủ rẫy qua đêm. Trong nghiên cứu này, chọn

xã Chƣ Rcăm huyện Krông Pa của tỉnh Gia Lai nơi có giáp ranh với một số tỉnh

Bình Định, Phú Yên, Đăk Lăk. Đây là xã thuộc vùng SRLH nặng, chủ yếu P.

falcipparum, đồng thời là các vùng sốt rét trọng điểm của tỉnh Gia Lai với số

BNSR và số KSTSR chiếm cao.

- Khánh Hòa là một tỉnh ở vùng duyên hải cực Nam Trung Bộ, nằm trong khu

vực khí hậu nhiệt đới xavan. Song khí hậu Khánh Hòa có những nét biến dạng

độc đáo với các đặc điểm riêng biệt, khí hậu ở Khánh Hòa tƣơng đối ôn hòa hơn

do mang tính chất của khí hậu đại dƣơng. Thƣờng chỉ có 2 mùa rõ rệt là mùa

mƣa và mùa khô. Khánh Vĩnh có địa hình chủ yếu là đồi núi và phân thành 2

khu vực chính, là huyện có tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất của tỉnh Khánh Hòa trong

đó bệnh nhân chủ yếu tập chung ở xã Sơn Thái do vậy trong nghiên cứu này

chúng tôi đã chọn xã Sơn Thái là địa điểm nghiên cứu.

- Ninh thuận là một tỉnh ven biện thuộc duyên hải Nam Trung Bộ của Việt

Nam. Tỉnh Ninh Thuận có 7 đơn vị hành chính cấp huyện trực thuộc, bao gồm 1

thành phố và 6 huyện; 65 đơn vị hành chính cấp xã, bao gồm 47 xã, 15 phƣờng

và 3 thị trấn, là một tỉnh có nhiều xã năm trong vùng sốt rét lƣu hành nặng, tỷ lệ

mắc sốt rét trong 5 năm (2005-2010) khá cao chủ yếu ở 2 huyện là Bắc Ái và

Ninh sơn. Trong nghiên cứu này chọn xã Phƣớc Thắng huyện Bắc Ái và xã Ma

Nới huyện Ninh Sơn, là 2 xã có tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất của tỉnh Ninh Thuận.

- Quảng Trị nằm ở phía Nam của Bắc Trung Bộ, trọn vẹn trong khu vực nhiệt

đới ẩm gió mùa, là vùng chuyển tiếp giữa hai miền khí hậu là cận nhiệt đới gió

mùa và nhiệt đới gió mùa. Hƣớng Hóa là một huyện miền núi của Quảng Trị nơi

đây có Cửa khẩu Quốc tế Lao Bảo nằm trên trục Quốc lộ 9A thông thƣơng

với Lào. Hƣớng Hóa cũng là huyện có tình hình sốt rét phức tạp nhất của tỉnh do

có đƣờng biên giới dài 156 km thuộc 11 xã tiếp giáp với Lào, nơi thƣơng xuyên

có sự giao lƣu giữa biên giới 2 nƣớc, trong 11 xã của huyện có 2 xã tỷ lệ mắc sốt

Hƣớng Hóa, Quảng Trị

Krong Pa Gia Lai

Khánh Vĩnh, Khánh Hòa

Bù Gia Mập, Bình Phƣớc

Bắc Ái; Ninh Sơn, Ninh Thuận

rét cao nhất là xã Xy và xã Thanh, đây cũng là 2 xã đƣợc chọn vào nghiên cứu.

Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu đƣợc thực hiện tại vùng sốt rét lƣu hành nặng

Nghiên cứu phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm: Tại phòng thí nghiệm

sinh học phân tử, Khoa sinh học phân tử, Viện Sốt rét - KST – CTTƢ.

2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.1.2.1. Thiết kế phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả đột biến gen K13 của P. falciparum tại phòng thí nghiệm.

2.1.2.2.Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

- Cỡ mẫu: Vì tỷ lệ mắc sốt rét tại các vùng lƣu hành của mỗi tỉnh thay đổi khác

nhau, nên số mẫu thu thập trong cùng thời gian cũng khác nhau. Do đó, cỡ mẫu

điều tra tỷ lệ trƣờng hợp nhiễm P. falciparum phát hiện đột biến gen K13 trên các

bệnh nhân sốt rét nhiễm đơn thuần P. falciparum trong cộng đồng đƣợc tính toán

tổng số chung theo công thức sau:

Trong đó:

n: Là cỡ mẫu tối thiểu cần điều tra phát hiện đột biến gen K13.

α: Xác suất sai lầm loại I với α = 0,05 độ tin cậy 95%;

Z(1-α/2) = 1,96 với Z là giá trị phân phối chuẩn;

p: Là tỷ lệ số mẫu P. falciparum tại các tỉnh có đột biến gen K13 qua các

nghiên cứu đơn lẻ trƣớc đây điểm đột biến gen K13 tại mỗi tỉnh Quảng Trị, Ninh

Thuận, Gia Lai, Khánh Hòa và Bình Phƣớc là khác nhau, trong đó tỷ lệ mẫu

trong quần thể P. falciparum có đột biến gen K13 thấp nhất là Ninh Thuận là

5%(hay p = 0,05) và tỷ lệ mẫu trong quần thể có đột biến gen K13 cao nhất là

Bình Phƣớc là 45% (hay p = 0,45), nên trong nghiên cứu này chúng tôi chọn là

tỷ lệ tỷ lệ mẫu trong quần có đột biến là 25% (hay p = 0,25),

d: độ chính xác tuyệt đối, chọn d = 0,05

mẫu

Thay các giá trị vào công thức trên, tính đƣợc cỡ mẫu n = 288 mẫu tại 5 tỉnh.

Cụ thể nghiên cứu này thu thập đƣợc tổng cộng 292 mẫu P. falciparum từ 5

tỉnh, trong đó tại từng tỉnh Bình Phƣớc 39 mẫu, Gia Lai 108 mẫu, Khánh Hòa 52

mẫu, Ninh Thuận 44 mẫu, Quảng Trị 49 mẫu.

- Phƣơng pháp chọn mẫu: Mẫu đƣợc thu thập không ngẫu nhiên, từ các bệnh

nhân sốt rét P. falciparum đơn thuần tại các điểm nghiên cứu đƣợc kỹ thuật viên

thu thập vào trên giấy thấm Whatman 3MM chuyên dụng để khô và sau đó bỏ

vào trong túi nilon có khóa và gói hút ẩm, bảo quản trong tủ lạnh âm cho đến khi

phân tích.

2.1.2.3. Nội dung nghiên cứu

- Sàng lọc những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu

 Phát hiện chủ động: Bằng cách điều tra cắt ngang xét nghiệm phát hiện

bệnh nhân có KST để đƣa vào nghiên cứu.

 Phát hiện thụ động: Xét nghiệm KSTSR những bệnh nhân có sốt tới khám

tại các cơ sở Y tế.

- Thu thập mẫu: Thu thập các mẫu máu của bệnh nhân nhiễm KST P.

falciparum trên giấy thấm Whatman 3MM.

- Thực hiện phân tích giải trình tự gen K13 bằng phƣơng pháp Sanger.

- Phân tích kết quả xác định các vị trí điểm đột biến.

2.1.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:

- Thu thập mẫu máu bệnh nhân sốt rét nhiễm P. falciprum vào giấy thấm

Whatman 3MM theo quy trình của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng

Trung ƣơng NIMPE 03.PP/03 [5].

- Tách ADN bằng bộ kít QIAamp Blood DNA Mini Kit theo hƣớng dẫn của

nhà sản xuất.

- Phản ứng PCR nhân bản gen K13 với trình tự mồi đƣợc thiết kế bởi Ariey và

cs 2014 và giải trình tự gen K13 theo phƣơng pháp Sanger [40]. Quy trình

thực hiện theo quy trình củaViện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung

ƣơng NIMPE. HD 03 PP 12. Các nội dung thực hiện chính trong quy trình

giải trình tự gen K13 gồm:

Bƣớc 1: Thực hiện kỹ thuật PCR lồng nhân bội đoạn gen K13 theo

+ Phản ứng PCR 1

phƣơng pháp của Ariey và cs 2013 [40].

Sử dụng 2 mồi K13_PCR_F và K13_PCR_R có trình tự nhƣ sau:

K13_PCR_F: 5‟- CGGAGTGACCAAATCTGGGA - 3‟

K13_PCR_R: 5‟- GGGAATCTGGTGGTAACAGC - 3‟

Thành phần hóa chất cho 1 ống phản ứng thể tích 25µl:

Nƣớc cất khử ion 11 µl

PCR buffer 10X 2,5 µl

2,5 µl MgCl2 25mM

2,5 µl dNTPs (2,5 mM)

Mồi K13_PCR_F (10µM) 0,625 µl

Mồi K13_PCR_R (10µM) 0,625 µl

0,25 µl Taq DNA polymerase (hot-start,1 đơn vị/µl)

5 µl ADN

+ Phản ứng PCR 2:

Điều kiện tối ƣu phản ứng PCR1: Bƣớc 1: 950C trong 15 phút, bƣớc 2 có 30 chu kỳ: 950C trong 30giây, 580C trong 2 phút, 720C trong 2 phút và bƣớc cuối cùng: 720C trong 10 phút.

Sử dụng 2 mồi K13_N_F và K13_N_R có trình tự nhƣ sau:

K13_N_F: 5‟- GCCAAGCTGCCATTCATTTG - 3‟

K13_N_R: 5‟- GCCTTGTTGAAAGAAGCAGA - 3‟

Thành phần hóa chất cho 1 ống phản ứng có thể tích 50µl:

Nƣớc cất khử ion 27,1 µl

PCR buffer 10X 5µl

5µl MgCl2 25mM

5 µl dNTPs (2,5 mM)

Mồi K13_N_F (10µM) 1,25 µl

Mồi K13_N_R (10µM) 1,25 µl

0,4 µl Taq DNA polymerase (hot-start,1 đơn vị/µl)

5 µl ADN

Điều kiện tối ƣu cho phản ứng PCR2:

Bƣớc 1: 950C trong 15 phút, bƣớc 2 có 35 chu kỳ: 950C trong 30 giây, 580C trong 1 phút, 720C trong 1 phút và bƣớc cuối cùng: 720C trong 10 phút.

Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 2% và

nhuộm ethidium bromide 10 mg/1ml. Chụp ảnh điện di và đọc kết quả. Kích

thƣớc sản phẩm PCR đặc hiệu cho đoạn gen K13 đƣợc nhân bội là 849 bp.

Bƣớc 2: Tinh sạch sản phẩm PCR sau nhân bội bằng bộ kít Norgen theo hƣớng

dẫn của nhà sản xuất, đƣợc mô tả trong quy trình củaViện Sốt rét – Ký sinh

trùng – Côn trùng Trung ƣơng NIMPE. HD 03 PP 12.

Bƣớc 3: Đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ nanophotometer

Bƣớc 4: Thực hiện phản ứng PCR Sequencing

Theo hƣớng dẫn của bộ sinh phẩm Bigdye v3.1

Thành phần của phản ứng trong tổng thể tích 20 µl gồm:

Ready Reaction Premix (2,5X) 4 µl

Bigdye Sequencing Buffer (5X) 2 µl

Mồi 0,5 µl

ADN khuôn 1 µl

Nƣớc khử ion vừa đủ 20 µl

Chu kỳ nhiệt của phản ứng: 960C-1 phút; 25 chu kỳ của 960C-1 phút; 500C-5 giây; 600C-4 phút; giữ ở 40C cho đến khi lấy mẫu ra khỏi máy.

+ Ly tâm nhanh ống mẫu PCR ở tốc độ 8.000 vòng/1 phút trong 15 giây.

+ Hút 20 µl dung dịch sản phẩm PCR Sequencing vào ống 1,5 ml.

+ Thêm 5 µl EDTA 0,125M, pH8.0.

+ Thêm 60 µl cồn Ethanol tuyệt đối lạnh.

+ Trộn nhẹ, để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút. + Ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/1 phút trong 30 phút và ở 400C.

+ Hút bỏ dịch nổi. + Thêm 60µl cồn Ethanol 700C lạnh. + Ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/1 phút trong 15 phút và ở 400C.

+ Hút bỏ dịch nổi.

+ Làm khô hoặc để khô tự nhiên.

+ Thêm 20µl Hi-di formamide, trộn nhẹ.

+ Hút 10 µl sản phẩm đã có Hi-Di vào Plate 96 giếng, những giếng ko có

Bƣớc 5: Tinh sạch sản phẩm phản ứng Sequencing bằng phƣơng pháp tủa cồn

+ Đóng nắp cao su (Strip). + Đặt Plate vào máy PCR để biến tính ADN ở 950C trong 2 phút.

+ Đặt ngay Plate vào khay đá khoảng 2 phút.

+ Lắp Plate vào giá đựng Plate và đặt vào máy ABI 3500.

mẫu thì cho Hi-Di.

+ Mở phần mềm giải trình tự tại biểu tƣợng 3500 Series 2 trên màn hình máy

Bƣớc 6: Giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự ABI 3500

tính và khai báo thông tin mẫu, thiết lập chƣơng trình chạy và cho máy hoạt

+ Chọn chƣơng trình giải trình tự cho bộ sinh phẩm Bigdye terminatorV3.1

động theo Hƣớng dẫn kiểm soát hệ thống ABI 3500.

Std_Seq_Assay_POP7.

+ Khi kết thúc chƣơng trình chạy, máy báo tín hiệu kết thúc.

+ In hoặc xuất file kết quả giải trình tự.

2.1.2.5. Các chỉ số đánh giá:

- Tỷ lệ bệnh nhân theo giới, theo nhóm tuổi tham gia nghiên cứu.

- Tỷ lệ đột biến gen K13, các kiểu đột biến ở các điểm nghiêm cứu.

- Tỷ lệ đột biến gen K13, các kiểu đột biến theo nhóm tuổi, theo giới tại các

điểm nghiêm cứu.

- So sánh tỷ lệ đột biến, kiểu đột biến giữa các điểm nghiên cứu

So sánh tỷ lệ đột biến, kiểu đột biến theo giới, nhóm tuổi, giữa các điểm nghiên

cứu

- Đọc và phân tích trình tự gen K13 bằng phần mềm tin sinh học Bioedit

2.1.2.6. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

V.7.0.5.3 với trình tự gen chủng 3D7 tham khảo trên ngân hàng gen NBCI với

- Số liệu đƣợc nhập và phân tích thống kê bằng phần mền Excel. SPSS 2.0.

mã số >XM_001350122.1

2.1.2.7. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu:

- Tập huấn cán bộ trƣớc khi triển khai nghiên cứu

- Tuân thủ các quy trình kỹ thuật chuẩn

- Không đƣa vào kết quả nghiên cứu các mẫu máu khô bị mốc, không đủ lƣợng

máu và nhân bản PCR, hoặc giải trình tự không thành công.

2.1.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu:

- Nghiên cứu đƣợc thông qua Hội đồng phê duyệt Đạo đức Y sinh học và phê

duyệt đề cƣơng của Viện Sốt rét-KST-CT Trung ƣơng;

- Bất kỳ sự thay đổi nào cũng phải xin ý kiến chấp thuận của Hội đồng Đạo đức

và Hội đồng Khoa học trƣớc khi thực hiện thay đổi trong nghiên cứu;

- Nghiên cứu viên chính có trách nhiệm tuân theo các đánh giá của các Hội

đồng y đức về quá trình thực hiện nghiên cứu đƣợc xem là thích hợp.

2.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphate tại các điểm nghiên cứu

2.2.1. Đối tƣợng, thời gian địa điểm nghiên cứu

2.2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Các bệnh nhân đƣợc chẩn đoán là sốt rét do P. falciparum chƣa biến chứng

có đủ các tiêu chuẩn tuyển chọn dƣới đây đƣợc đƣa vào đối tƣợng nghiên cứu

thử nghiệm in vivo [101].

Tiêu chuẩn chọn bệnh

 Bệnh nhân mắc sốt rét chƣa biến chứng từ 2 tuổi đến 70 tuổi;

 Không phân biệt giới tính, dân tộc;

 Nhiễm đơn thuần P. falciparum với mật độ từ 1000 đến dƣới 100.000/µL

máu.

 Nhiệt độ nách ≥ 37,5°C hoặc có tiền sử sốt trong vòng 24 giờ;

 Bệnh nhân có khả năng uống đƣợc thuốc;

 Chƣa dùng thuốc sốt rét trong thời gian 2 tuần gần đây;

 Không mắc các bệnh mãn tính về gan, thận, tim mạch cũng nhƣ mắc phối hợp

các bệnh nhiễm trùng cấp tính khác, không suy gan, suy thận.

 Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu thông qua bản chấp thuận tham gia.

Tiêu chuẩn loại trừ

 Bệnh nhân sốt rét là phụ nữ mang thai (tét Beta HCG dƣơng tính) hoặc phụ

nữ đang có ý định mang thai trong thời gian nghiên cứu;

các thành phần của thuốc;

 Không có khả năng uống đƣợc thuốc hoặc Bệnh nhân có tiền sử dị ứng với

 Bệnh nhân bị rối loạn tiêu hóa hoặc bất dung nạp đƣờng uống;

 Có biểu hiện suy dinh dƣỡng mức độ nặng đối với trẻ dƣới 60 tháng tuổi;

 Bệnh nhân không đồng ý tham gia vào nghiên cứu hoặc không chịu theo lịch

khám và theo dõi trong suốt 42 ngày của quy trình đề cƣơng.

Thuốc nghiên cứu

Thuốc dihydroartemisinin – piperaquin (Arterakin) với nghiên cứu in vivo.

Dạng viên nén bao phin, mỗi viên arterakin chứa 40 mg dihydroartemisinin

(DHA) và 320 mg piperaquin (PPQ) do xí nghiệp dƣợc phẩm trung ƣơng I sản

xuất, thuốc đang đƣợc sử dụng trong chƣơng trình PCSR Việt Nam hiện nay.

 Số lô: 16001 Ngày sản xuất: 06/03/2016

 Hạn dùng: đến 05/03/2020

 Tiêu chuẩn chất lƣợng : đạt chất lƣợng cơ sở. Cách sử dụng theo bảng

dƣới đây:

Bảng 2.1. Bảng liều thuốc Arterakin sử dụng cho bệnh nhân nghiên cứu [2]

Cân nặng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

½ viên ½ viên ½ viên ≤ 8kg

1 viên 1 viên 1 viên 8 - ≤ 17 kg

17 - ≤ 25 kg 1 ½ viên 1 ½ viên 1 ½ viên

2 viên 2 viên 2 viên 25 - ≤ 36kg

3 viên 3 viên 3 viên 36 - ≤ 60kg

4 viên 4 viên 4 viên ≥ 60kg

Chú ý:Thuốc primaquine phosphate (PQ) sẽ không đƣợc sử dụng trong suốt quá

trình theo dõi điều trị và đánh giá hiệu lực thuốc, đến sau ngày D42 mới chỉ định

liều đơn duy nhất PQ trƣớc khi kết thúc liệu trình theo dõi.

2.2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại: Huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phƣớc; huyện

Krông Pa, tỉnh Gia Lai; huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa;huyện Ninh Sơn,

tỉnh Ninh Thuận; huyện Hƣớng Hóa, tỉnh Quảng Trị,.

2.2.1.3. Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện từ năm 2016 đến năm 2018

2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng không ngẫu nhiên, không đối chứng.

2.2.2.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

- Cỡ mẫu cho nghiên cứu:

 Dựa trên tỷ lệ thất bại lâm sàng của nghiên cứu trƣớc đó với thuốc DHA-

PPQ là dƣới 10 % do vậy tỷ lệ 10% đƣợc chọn để xác định tính cỡ mẫu cho

nghien cứu này.

 Với khoảng tin cậy CI 95%, độ chính xác tuyệt đối 10% (d); tỷ lệ bệnh nhân

mất theo dõi và rút khỏi nghiên cứu khoảng 10%

 Khi đó cỡ mẫu tính đƣợc dựa vào bảng xác định cỡ mẫu của WHO, 2009

[101].

 Khi giá trị p = 0,10 (10%), d = 10%, bệnh nhân mất theo dõi và rút khỏi

nghiên cứu khoảng 10% thì sẽ cần cỡ mẫu tối thiểu là 35 + 4 = 39 bệnh nhân.

Do vậy cơ mẫu chung cho cả nghiên cứu 5 tỉnh sẽ là 39 bệnh nhân x 5 tỉnh =

195 bệnh nhân

Bảng 2.2. Cỡ mẫu ƣớc tính dựa vào tỷ lệ thất bại lâm sàng (p) ở quần thể [101]

Tỷ lệ thất bại lâm sàng trên quần thể (p) với độ tin cậy 95%

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 d

0,05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384

0,10 49 61 72 81 87 92 95 96 18 35

2.2.2.3. Nội dung nghiên cứu

- Sàng lọc đối tƣợng đủ điều kiện để đƣa vào nghiên cứu (phụ lục 2).

 Điều tra, thu thập bệnh nhân từ các cơ sở y tế

 Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu.

 Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu và tuân thủ theo quy trình

nghiên cứu.

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng

 Khi bệnh nhân đã có đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân hoặc

cha mẹ bệnh nhân (nếu là trẻ em) đƣợc thông báo về nội dung nghiên cứu

sau đó tự nguyện ký vào tờ cam kết nghiên cứu (phụ lục 3).

 Khám lâm sàng, đo nhiệt độ.

 Điều trị liều đầu (0 giờ) theo phác đồ của Bộ Y tế 2016

 Điền thông tin vào mẫu báo cáo. Hoàn chỉnh chi tiết tiền sử bệnh án,

thông tin nhân khẩu học và địa chỉ liên hệ vào thời điểm bắt đầu.

 Bệnh nhân đƣợc uống thuốc dƣới sự giám sát của cán bộ y tế. Nếu bệnh

nhân nôn trong vòng 30 phút sau khi uống phải cho bệnh nhân uống lại.

Nếu bệnh nhân nôn >2 lần /ngày, phải loại bệnh nhân khỏi nghiên cứu.

 Các bệnh nhân đƣợc giữ lại trạm y tế xã tối thiểu trong 3 ngày đầu để theo

dõi uống thuốc, các diễn biến lâm sàng và mật độ KST trong máu.

 Theo dõi các chỉ số sinh tồn và biểu hiện lâm sàng vào các ngày D0, D1,

D2, D3, D7, D14, D21, D28, D35, D42 hoặc bất cứ ngày nào khi bệnh

nhân sốt.

 Ghi lại các thông tin vào sổ và phiếu theo dõi (bao gồm địa chỉ cụ thể, số

điện thoại....)

- Nghiên cứu cận lâm sàng

 Thử test nƣớc tiểu phát hiện có thai (que thử)

 Trích máu đầu ngón tay làm 3 lam máu (2 lam giọt dầy và 1 lam giọt

mỏng) để xác định mật độ KST trƣớc khi uống thuốc : 1 lam đếm mật độ

KST, 1 lam gửi kiểm tra, lam giọt mỏng để xác định chủng loại KST)

 Lấy 2 giọt (1 x 50l) máu vào giấy thấm Whatman 3MM để phân tích

PCR. Ghi số hiệu bệnh nhân, ngày lấy. Để khô tự nhiên, sau đó cho vào

túi dán mép kín (mỗi bệnh nhân 1 túi) [5].

 Thuốc Arterakin: Viên nén chứa 40 mg dihydroartemisinin (DHA) và 320 mg

piperaquin phospate (PPQ) do Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Trung ƣơng I

(Pharbaco) sản xuất cung ứng. Các bệnh nhân dùng cùng lô thuốc và thuốc đƣợc

kiểm tra chất lƣợng tại Viện Kiểm nghiệm Trung ƣơng trƣớc khi thử nghiệm;

Liều lƣợng và thời gian dùng thuốc: Theo quyết định của Bộ Y tế ban hành 2016

Tất cả các bệnh nhân đƣợc uống dƣới sự giám sát của cán bộ có chuyên môn.

Trong trƣờng hợp bệnh nhân điều trị thất bại thì điều trị thay thế bằng phác

đồ: Quinin sulfate 30 mg/kg phối hợp doxycyclin 3 mg/kg/ ngày (7 ngày) hoặc

Quinin sulfate 30 mg/kg phối hợp clindamycin 15mg/kg/ngày (7 ngày)

2.2.2.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

- Kỹ thuật lấy lam máu, lam máu giọt dày và giọt mỏng, nhuộm giêm sa 5%

- Kỹ thuật đếm mật độ KSTSR:

 Mật độ KST đƣợc xác định bằng số lƣợng KST đếm đƣợc trên 200 bạch cầu

(pH =7,2) trong vòng 40 phút. Xác định loài Plasmodium spp.[6].

đƣợc tính dựa trên sự phân chia số lƣợng KST thể vô tính trên số lƣợng

bạch cầu đếm đƣợc và đƣợc hiệu chỉnh dựa trên số lƣợng bạch cầu ƣớc

tính (8000 bạch cầu/µl máu).

Số lượng KSTSR đếm được x 8000 KSTSR/mm 3 = -------------------------------------------------

Số lượng bạch cầu đếm được

 Khi số lƣợng KST thể vô tính đếm đƣợc nhỏ hơn 10 trên 200 bạch cầu

đếm trên máy đếm tay. Mật độ KST là số lƣợng KST thể vô tính/µl máu,

trên lam máu theo dõi, số lƣợng KST phải đƣợc tiếp tục đếm cho đến khi

tại đó 500 bạch cầu đƣợc đếm). Lam máu đƣợc coi là âm tính khi số

lƣợng bạch cầu đếm đƣợc là 1000 mà không có sự hiện diện của KST

thể vô tính.

 Tất cả các lam máu phải đƣợc đọc bởi 2 kỹ thuật viên có kinh nghiệm

số lƣợng bạch cầu đạt đƣợc ít nhất là 500 bạch cầu (vi trƣờng đầy đủ mà

theo phƣơng pháp mù đôi để xác định thời gian sạch KST. Trong

trƣờng hợp kết quả soi lam là không phù hợp nhau (khác nhau về kết

quả chủng KST, MĐKST sai khác hơn 25%), lam máu phải đƣợc đọc

lại bởi kỹ thuật viên thứ 3. Kết quả cuối cùng của mật độ KST đƣợc

tính bằng trung bình cộng của hai kết quả gần nhau nhất.

Hình 2.2. Lấy lam máu gọt mỏng và giọt dày làm thử nghiệm in vivo

- Quy trình kỹ thuật và theo dõi bệnh nhân

 Sau khi đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu, bệnh nhân đƣợc điều trị bằng

thuốc DHA-PPQ (Arterakin) qua đƣờng uống liều lƣợng thuốc theo phác

đồ của Bộ Y tế (2016). Đối với trẻ em, viên thuốc đƣợc nghiền nát và cho

uống bằng thìa. Việc uống thuốc đƣợc giám sát và bệnh nhân đƣợc giữ lại ở

nơi nghiên cứu trong 60 phút sau khi uống thuốc để theo dõi dung nạp

thuốc. Trong trƣờng hợp bệnh nhân nôn trong vòng 30 phút, cho bệnh nhân

uống lại đủ liều, nếu nôn xảy ra trong vòng 30-60 phút: uống lại nửa liều;

 Sau giai đoạn điều trị ngày D0, D1, D2 D3 bệnh nhân đƣợc đánh giá lại vào

ngày, D7, D14, D21, D28, D35 và ngày D42. Mỗi lần bệnh nhân đến điểm

nghiên cứu, bệnh nhân đƣợc khám lâm sàng và làm lam máu giọt dày và

giọt mỏng;

 Lấy máu bệnh nhân vào giấy thấm Whatman 3MM mỗi giọt có đƣờng kính

khoảng 1,5 cm, mỗi lần lấy 2 giọt trên cùng giấy thấm, lấy giấy thấm tất cả

những ngày theo dõi và trong trƣờng hợp xuất hiện lại loài P. falciparum

trong máu thì thu thập mẫu máu giấy thấm cùng thời điểm lấy lam máu;

 Nếu bệnh nhân không đến khám lại theo lịch hẹn thì nghiên cứu viên đến

nhà để khám lâm sàng và lấy mẫu máu (lam, giấy thấm, nhiệt độ) và bệnh

nhân đƣợc xếp vào nhóm bỏ theo dõi nếu nhƣ bệnh nhân đƣợc khám lại và

lấy lam máu và giấy thấm vào ngày thứ 42;

 Bệnh nhân bị loại trong trƣờng hợp nếu uống không đủ liều Arterakin, dị

ứng Arterakin và phải dùng điều trị khác thay thế (nổi mày đay, ngứa, trong

lúc theo dõi nôn 2 lần sau khi uống thuốc;

 Theo dõi một số biến cố bất lợi của thuốc bằng hỏi và thăm khám lâm sàng

vào các ngày uống thuốc và sau uống thuốc.

Bảng 2.3. Quy trình theo dõi bệnh nhân uống thuốc Arterakin (DHA-PPQ)

Ngày

D0 D1 D2 D3 D7 D14 D21 D28 D35 D42

Ngày theo dõi bất kỳ

Triệu chứng LS x x x x x x x x x x x

Nhiệt độ x x x x x x x x x x x

Lam máu x x x x x x x x x x x

Thử nƣớc tiểu x

Lấy giấy thấm x x x x x x x x x x (x)

- Kỹ thuật sinh học phân tử phân biệt tái phát, tái nhiễm kiểu gen của KST vào

ngày KST xuất hiện trở lại đƣợc xác định bằng cách mô tả gen MSP1, MSP2

và GLURP, gen đơn bản sao trong hệ gen của Plasmodium falciparum đã

đƣợc công bố trƣớc đây [65]. Phản ứng PCR khuếch đại ADN từ một KST

đơn dòng duy nhất trong một khuyếch đại đơn sản phẩm. Cho ba gen, mỗi sản

phẩm PCR khuếch đại có kích thƣớc khác nhau đƣợc coi là bản sao từ những

đơn dòng của P. falciparum , phản ánh sự khác nhau trong hệ gen. Chiều dài

đa hình, số lƣợng các bands trong mỗi phản ứng PCR và kích thƣớc tƣơng

ứng của MSP1, MSP2 và GLURP đƣợc ghi nhận từ các mẫu máu thu thập

trong ngày D0 và ngày KST xuất hiện trở lại. Kết quả sẽ đƣợc phân loại nhƣ

 Tái phát: Cho mỗi marker (MSP1, MSP2 và GLURP), ít nhất một chiều dài

đa hình đƣợc tìm thấy trong các mẫu thu thập vào ngày D0 cũng xuất hiện

vào ngày KST xuất hiện trở lại.

 Nhiễm mới: Cho ít nhất một marker, chiều dài đa hình có sự khác biệt giữa

mẫu thu thập vào ngày D0 và mẫu thu thập vào ngày KST xuất hiện trở lại.

 Không xác định: Mẫu không xác định đƣợc do không khuyếch đại đƣợc

ADN vào ngày D0 hoặc ngày KST xuất hiện trở lại.

2.2.2.6. Xác định và đo lường các chỉ số, biến số trong nghiên cứu

- Thời gian sạch KSTSR đƣợc tính từ khi bệnh nhân uống liều thuốc đầu tiên

đến khi sạch hoàn toàn KST thể vô tính trên lam máu 2 lần liên tiếp;

- Thời gian hết/ cắt sốt đƣợc tính từ khi bệnh nhân uống liều thuốc đầu tiên đến

khi nhiệt độ cơ thể dƣới 37,50C và duy trì ít nhất 48 giờ tiếp theo;

- Những trƣờng hợp xuất hiện KST trở lại, dùng kỹ thuật sinh học phân tử cho

phép phân biệt rõ tái nhiễm hay tái phát;

- Những trƣờng hợp có KSTSR trở lại, khi phân tích kiểu gen thấy kiểu gen

khác với mẫu gen ban đầu, thất bại đƣợc coi là tái nhiễm (nhiễm mới) KST;

- Trƣờng hợp cùng với kiểu gen ban đầu, thất bại đƣợc gọi là tái phát KSTSR;

- Tỷ lệ tái phát sau khi có kết quả PCR;

- Bệnh nhân đƣợc phân loại về kết quả điều trị theo phân loại củaTCYTTG

(2009). Bảng 2.3

Bảng 2.4. Phân loại đánh giá hiệu quả điều trị theo tiêu chuẩn TCYTTG, 2009

Thất bại điều trị sớm (ETF_Early Treatment Failure)

- Xuất hiện các dấu hiệu của sốt rét nguy hiểm hoặc nghiêm trọng vào ngày D1,

D2 hoặc D3, kèm có mặt KSTSR trong máu;

- KSTSR vào ngày D2 cao hơn D0 bất kể thân nhiệt;

- Có KSTSR trong máu vào ngày D3 đi kèm thân nhiệt ≥ 37.5ºC;

- KSTSR trong máu vào ngày D3 ≥ 25% so với MĐKSTSR ngày D0.

Thất bại điều trị muộn (LTF_Late Treatment Failure), chia làm hai loại:

Thất bại lâm sàng muộn (LCF_Late Clinical Failure)

- Xuất hiện các dấu hiệu sốt rét nặng và nguy hiểm vào bất kỳ ngày nào từ D4

đến D28/D42 với sự có mặt của KSTSR trong máu, không có tiêu chuẩn nào

của ETF trƣớc đó;

- Có mặt KSTSR trong máu và thân nhiệt ≥ 37,5ºC hoặc có tiền sử sốt trong

vùng sốt rét lan truyền thấp đến trung bình ở bất kỳ ngày nào từ D4 đến

D28/D42, không có bất kỳ dấu hiệu nào của ETF trƣớc đó;

Thất bại ký sinh trùng muộn (LPF_Late Parasitological Failure)

- Có mặt KSTSR trong máu vào bất kỳ ngày nào từ D7 đến D28/D42 và thân

nhiệt < 37,5ºC, không có bất kỳ tiêu chuẩn nào của ETF và LCF trƣớc đó.

Đáp ứng về lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR_Adequate Clinical and

Parasitological Response)

- Không xuất hiện KSTSR trong máu vào D28/D42, bất luận nhiệt độ nách bệnh

nhân thế nào và không có bất kỳ tiêu chuẩn nào của thất bại ETF, LCF và LPF

trƣớc đó.

Bảng 2.5. Các biến số, định nghĩa biến số

Biến số Loại Phƣơng pháp TT Định nghĩa biến số nghiên cứu biến thu thập

Thông tin về đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu

1 Tuổi Là tuổi của bệnh nhân đƣợc Liên Căn cƣớc công

tính theo biến liên tục tục dân/thẻ bảo hiểm

y tế

2 Giới Là giới tính của bệnh nhân Phân phỏng vấn

phân theo nam, nữ loại

3 Địa điểm Nơi bệnh nhân đang sinh sống Phân phỏng vấn

cƣ trú và làm việc theo thôn, bản,… loại

4 Dân tộc Là nhóm dân tộc phân theo Phân phỏng vấn

các dân tộc đang có mặt tại loại

chỗ

5 BNSR là phụ Là bệnh nhân đang mang thai Phân phỏng vấn/ que

nữ mang thai bất luận thai kỳ nào có mắc loại thử nhanh

Thông tin về đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm của bệnh nhân nghiên cứu

Thời gian từ Thời gian mà BNSR từ khi có Phân phỏng vấn

khi mắc bệnh triệu chứng đầu tiên đến khi loại 1 đến khi tiếp đến khám ở nhóm NC

cận y tế

Là trƣờng hợp BNSR có sử Phân phỏng vấn Dùng thuốc 2 dụng thuốc sốt rét trƣớc khi loại trƣớc đó vào nhóm nghiên cứu

Phân đo thân nhiệt bằng 3 Sốt Là các BNSR có thân nhiệt tại thời điểm nghiên cứu ≥ 37,50C loại nhiệt kế thủy ngân

4 Tiền sử có sốt Là các BNSR có biểu hiện sốt Phân phỏng vấn

trong vòng 48 giờ trƣớc NC loại

Lam máu Là lam máu XN của BNSR có Phân xét nghiệm lam

5 dƣơng tính đủ thể vô tính (+) trong máu mật loại máu

tiêu chuẩn độ đủ tiêu chuẩn nghiên cứu.

Số ngày điều Là thời gian BNSR đƣợc dùng Liên Cho bệnh nhân 6 trị phác đồ thuốc theo phác đồ quy định tục uống thuốc

Là kết quả sau khi BNSR Phân Phân loại theo

Kết quả phân đƣợc điều trị theo phác đồ loại bảng phân loại 7 loại BYT đƣợc đánh giá về mặt LS điều trị của WHO

và KSTSR (2009)

2.2.2.6. Nhập và phân tích xử lý số liệu

- Số liệu nghiên cứu thu thập đƣợc tổng hợp, phân tích và xử lý theo phần mềm

in vivo phiên bản 7.1 Pascal Ringwald, WHO (2009) [101].

- Phân tích dữ liệu gồm:

+ Tất cả ca bệnh đƣợc đánh giá tạithời điểm 42 ngày;

+ Số lƣợng và tỷ lệ ca rút khỏi hoặc mất theo dõi trong quá trình nghiên cứu;

+ Số lƣợng và tỷ lệ thất bại điều trị trƣớc hiệu chỉnh PCR và sau khi hiệu chỉnh

PCR với độ tin cậy 95% qua theo dõi đến 42 ngày. Số lƣợng, tỷ lệ có hiệu

chỉnh PCR và chƣa hiệu chỉnh PCR có độ tin cậy 95% qua theo dõi đến D42,

gồm thất bại điều trị sớm (ETF), thất bại lâm sàng muộn (LCF), thất bại KST

muộn (LPF), đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR);

+ Thời gian sạch KSTSR (đƣợc định nghĩa là khoảng thời gian tính bằng giờ

kể từ liều điều trị đầu tiên cho đến khi XN có 2 lam máu âm tính;

+ Phân tích theo phƣơng pháp Kaplan-Meier không những để đánh giá mất

mẫu và rút khỏi nghiên cứu, mà còn đánh giá số trƣờng hợp và tỷ lệ tái

nhiễm vào thời điểm kết thúc liệu trình theo dõi 42 ngày;

- Quản lý dữ liệu.

 Nghiên cứu viên chính phải đảm bảo toàn bộ dữ liệu và hồ sơ bệnh án phải

đúng theo báo cáo ca bệnh;

 Các hồ sơ bệnh án phải thƣờng xuyên đƣợc mang ra kiểm tra, bổ sung thông

tin hàng ngày về lâm sàng và KSTSR cũng nhƣ các thay đổi (nếu có) để đảm

bảo các phần dữ liệu luôn đầy đủ;

 Dữ liệu lâm sàng và xét nghiệm phải đƣợc ghi lại hàng ngày vào hồ sơ bệnh

án. Tất cả dữ liệu nguồn phải giữ nguyên vẹn nếu có sao chép để đối chiếu;

 Tất cả mọi thay đổi hoặc sửa chữa trong hồ sơ bệnh án đều phải giải thích,

ghi lại thời gian và ký tên (không đƣợc dùng bút xóa, ghi đè lên);

 Sau khi hoàn tất dữ liệu của hồ sơ bệnh án, số liệu đƣợc nhập vào máy tính

độc lập với hai ngƣời khác nhau.

2.2.2.7. Phương pháp khống chế nhiễu và hạn chế sai số

- Trƣớc khi tiến hành nghiên cứu, nghiên cứu viên chính phải nhắc lại và tập

huấn lại trình tự các khâu tiến hành nghiên cứu;

- Trong quá trình khảo sát số liệu: Nghiên cứu viên đƣợc chọn và tập huấn

trƣớc khi triển khai điều tra tại thực địa;

- Chọn đối tƣợng nghiên cứu chặt chẽ theo tiêu chí nghiên cứu;

- Trong quá trình phân tích số liệu và viết báo cáo: Giám sát chặt chẽ việc thu

thập số liệu tại thực địa, làm sạch số liệu trên các bảng câu hỏi đã hoàn thành,

mã hóa và loại bỏ các số liệu không tin cậy.

2.2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu

- Nghiên cứu đƣợc thông qua Hội đồng phê duyệt Đạo đức Y sinh học và phê

duyệt đề cƣơng của Viện Sốt rét-KST-CT Trung ƣơng.

- Thử nghiệm hiệu lực của phác đồ điều trị đƣợc tiến hành dƣới sự giám sát

trực tiếp của các cán bộ chuyên môn. Tất cả thời điểm, tính an toàn và sự bồi

hoàn phải luôn đảm bảo cho bệnh nhân tối đa, quản lý thích hợp mỗi bệnh

nhân và ƣu tiên cho thử nghiệm;

- Bất kỳ sự thay đổi nào cũng phải xin ý kiến chấp thuận của Hội đồng Đạo

đức và Hội đồng Khoa học trƣớc khi thực hiện thay đổi trong nghiên cứu;

- Nghiên cứu viên chính có trách nhiệm tuân theo các đánh giá của các Hội

đồng y đức về quá trình thực hiện nghiên cứu đƣợc xem là thích hợp.

- Nghiên cứu viên tham gia thử nghiệm này đều tham dự khóa tập huấn thực

hành lâm sàng tốt (GCPs) do Bộ Y tế hoặc TCYTTG tập huấn, cấp chứng

chỉ;

- Cam kết tham gia nghiên cứu thông qua ký bản chấp thuận

 Bệnh nhân hoặc ngƣời nhà đồng ý ký vào mẫu đơn chấp thuận theo phụ lục

trƣớc khi tham gia nghiên cứu;

 Tất cả câu hỏi của bệnh nhân hoặc thân nhân đều phải đƣợc nhóm nghiên cứu

trả lời rõ ràng, cụ thể. Nghiên cứu viên chính phải ghi nhận tất cả mọi đồng ý

của trẻ em và đi kèm theo chấp thuận của ngƣời giám hộ hoặc cha mẹ;

 Giải thích về lợi ích, quyền lợi và cả nguy cơ có thể xảy ra sau uống thuốc

(các tác dụng không mong muốn);

- Bảo mật thông tin và số liệu nghiên cứu

 Tất cả thông tin liên quan đến BN nghiên cứu sẽ đƣợc bảo mật và chỉ chia sẻ

với các thành viên trong nhóm nghiên cứu;

 Trƣởng nhóm nghiên cứu phải đảm bảo cất giữ tài liệu nguồn, hồ sơ giấy tờ

liên quan, bệnh án và sản phẩm nghiên cứu (lam, giấy thấm) đƣợc giữ cẩn

trọng.

- Chăm sóc y tế

 Chăm sóc y tế hoàn toàn miễn phí về bệnh trong suốt quá trình nghiên cứu và

theo dõi bệnh nhân, nhất là theo dõi tác dụng không mong muốn để nhập viện

xử trí;

 Mọi sự bồi hoàn phải thực hiện trong khả năng của nhóm nghiên cứu. Nếu có

vấn đề y tế khác không liên quan sốt rét, nghiên cứu viên chính có trách

nhiệm chuyển cho bệnh nhân điều trị trong khả năng tốt nhất;

 Nếu vì một lý do nào đó, bệnh nhân rút khỏi nghiên cứu hoặc vi phạm đề

cƣơng trƣớc khi kết thúc nghiên cứu, thì nghiên cứu viên chính cần phải cho

đủ liệu trình thuốc sốt rét theo hƣớng dẫn của Bộ Y tế mới nhất.

2.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc sốt rét bằng kỹ thuật in vitro tại Gia Lai

2.3.1. Đối tƣợng, thời gian địa điểm nghiên cứu

2.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Các bệnh nhân đƣợc chẩn đoán là sốt rét do P. falciparum chƣa biến chứng

có đủ các tiêu chuẩn tuyển chọn dƣới đây đƣợc đƣa vào đối tƣợng nghiên cứu

in vitro [102].

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân để lấy mẫu máu thử nghiệm in vitro

 Nhiễm KST sốt rét P. falciparum đơn thuần;

 Mật độ KST tể vô tính từ 2000 đến 80.000 KST/L máu;

 Chƣa dùng thuốc sốt rét trong vòng 2 tuần.

 Đồng ý tham gia nghiên cứu qua phiếu chấp thuận.

Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân để lấy mẫu máu test in vitro

 P. falciparum phối hợp nhiều loại KSTSR cùng lúc;

 Mật độ KSTSR thể vô tính > 2.000 hoặc < 80.000 KST/L máu;

 Bệnh nhân đã sử dụng thuốc sốt rét;

- Thuốc nghiên cứu

 Bột Artesunat;

 Bột dihydroartemisinin;

 Bột piperaquin phosphat;

 Bột chloroquin phosphat.

Các thuốc sử dụng cho nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi WHO.

2.3.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Do kinh phí có giới hạn và nghiên cứu in vitro đòi hỏi phải đƣợc trang bị nhiều

trang thiết bị y tế, cơ sỏ vật chất nên trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến

hành đƣợc tại 1 điểm nghiên cứu là huyện KrongPa, tỉnh Gia Lai.

2.3.1.3. Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện từ năm 2016 đến 2018

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu phân tích in vitro đánh giá hiệu lực thuốc tại labo thực địa.

2.3.2.2. Cỡ mẫu và phƣơng pháp chọn mẫu

- Cỡ mẫu tính cho nghiên cứu in vitro là các mẫu đủ tiêu chuẩn chọn để thực

hiện thử thuốc trên in vitro tại thực địa từ các bệnh nhân tham gia vào nghiên

cứu in vivo tại các xã có số BNSR của huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai. Cỡ mẫu tối

thiểu là 30.

2.3.2.3. Nội dung nghiên cứu

- Sàng lọc đối tƣợng đủ điều kiện để đƣa vào nghiên cứu (phụ lục 2).

 Điều tra, thu thập bệnh nhân từ các cơ sở y tế

 Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu.

 Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu và tuân thủ theo quy trình

nghiên cứu.

- Nghiên cứu cận lâm sàng

 Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào trong ống nghiệm có chứa EDTA/ACD.

 Nuôi cấy KSTSR P. falciparum theo quy trình thử thuốc 48h tại thực địa

2.3.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Xác định độ nhạy cảm của KST SR với thuốc sốt rét (in vitro) [57],[92],[98]

Cách tiến hành

- Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào trong ống nghiệm có chứa EDTA/ACD.

Mẫu máu đƣợc ly tâm, tách phần huyết tƣơng thu lấy cặn hồng cầu. Cặn

hồng cầu đƣợc rửa 2 lần trong môi trƣờng nuôi cấy RPMI và rửa lại trong

môi trƣờng nuôi cấy đầy đủ (RPMI 1640 LPLF) để có đƣợc hồng cầu với

hematocrite là 50% (BMM).

- Đánh giá độ nhạy cảm của KST với thuốc sốt rét trong phòng thí nghiệm. Quy

trình đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của WHO “Xác định sự nhạy cảm của

KST sốt rét với các thuốc sốt rét trong phòng thí nghiệm tại thực địa” nhằm

đánh giá sự đáp ứng của P. falciparum với artemisinins”[57],[92][102].

Tóm tắt quy trình nhƣ sau:

 Phiến nhựa đƣợc nhỏ thuốc tại NIMPE theo quy trình pha thuốc và nhỏ

thuốc phiến nhựa của WHO [4],[102].

 Nồng độ thuốc nhỏ phiến nhựa là Artesunat (từ: 0.25 – 16 nmol/ml),

dihydroartemisinin (từ 0.25 – 16 nmol/ml), piperaquin (từ 12.5 –

800nmol/ml ), chloroquin (từ 25 -1600 nmol/ml), phiến nhựa đƣợc vận

chuyển và bảo quản ở 4°C tại điểm nghiên cứu. Phiến nhựa có DHA sẽ

đƣợc chuẩn bị 2 tuần 1 lần.

 Chất lƣợng của phiến nhựa có thuốc đƣợc đảm bảo bằng độ nhạy cảm của

chủng KST nhạy và kháng với Chloroquine đƣợc nuôi cấy liên tục trong

phòng thí nghiệm của NIMPE.

 Các thuốc sử dụng cho nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi WHO.

 Hồng cầu của bệnh nhân (BMM) đƣợc pha loãng giảm xuống hematocrite

2% sau đó đƣợc chuyển nhanh vào các phiến nhựa có chứa thuốc, ủ trong tủ

ấm từ 24 đến 48 giờ. Mỗi một bệnh nhân sử dụng 1 cột của phiến nhựa 96

giếng đƣợc chia thành 8 giếng nhỏ (A- H) với nồng độ thuốc tăng dần, giếng

A là giếng chứng (không có thuốc).

 Dùng pipet eppendorf, nhỏ 50 l hỗn dịch máu môi trƣờng vào mỗi giếng

thử, bắt đầu từ giếng A và đi theo trình tự, cuối cùng là giếng H (có thể dùng

một đầu típ). Luôn lắc tube để đảm bảo dịch treo nhƣ nhau;

 Đậy nắp phiến nhựa, ghi số hiệu bệnh nhân, thời gian bắt đầu nuôi trên nắp

theo đúng cột tƣơng ứng, lắc nhẹ phiến nhựa;

Lưu ý: Nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vô trùng, không có thuốc để

thăm dò sự phát triển của KSTSR trƣớc khi thu hoạch.

 Lấy bình nến ra ngoài tủ ấm, đặt phiến nhựa vào bình nến, đặt một đĩa nhựa

có miếng bông thấm nƣớc cất vào bình (làm giảm sự bay hơi của môi

trƣờng), đốt nến, đậy nắp bình nến, khi nến gần tắt, đóng khoá;

 Đặt bình nến vào tủ ấm, ủ ấm ở 37°C (± 0.5°C);

 Thời gian thu hoạch: Dựa vào quan sát hình thể KSTSR lúc đƣa vào nuôi cấy,

KST thể tƣ dƣỡng trẻ: ủ ấm từ 33-35 giờ, KST thể tƣ dƣỡng ở tuổi trung

bình thì ủ ấm từ 28-32 giờ, KST thể tƣ dƣỡng già thì ủ ấm 23-25 giờ;

 Thăm dò trƣớc khi thu hoạch (nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vô

trùng không có thuốc).

- Thu hoạch, nhuộm lam và xét nghiệm lam sau nuôi cấy [92],[98]

 Dùng pipet eppendorf hút bỏ dịch nổi, hồng cầu (HC) còn lại đƣợc làm thành

những giọt máu dày, 2 dãy theo mô hình dƣới đây:

lam máu giọt dày cho mỗi nồng độ thuốc. Mỗi lam kính có 8 giọt máu dày

tƣơng ứng với các nồng độ thuốc khác nhau theo một qui định. Ghi nhãn

với mã bệnh nhân, tên thuốc, thời gian thu hoạch.

 Để các phiến nhựa nghiêng 450 trên 5 phút, nhẹ nhàng hút bỏ dịch nổi. Lấy

 Nhuộm lam: Lam máu phải đƣợc làm khô cẩn thận, để ở nhiệt độ phòng

trong 10 giờ hoặc trong tủ ấm 37,50C qua đêm;

 Nhuộm lam máu giọt dày đƣợc kéo từ mỗi giếng thử nghiệm và nhuộm

Giemsa 5% trong 30 phút;

 Xét nghiệm viên nên thăm dò nồng độ giêm sa và thời gian nhuộm thích hợp

để đánh giá các thể và số lƣợng cho chính xác;

 Đếm KSTSR: Một mẫu thử đƣợc đánh giá là thành công khi số lƣợng thể

phân liệt ở giếng chứng phải bằng hoặc lớn hơn 10% trong tổng số 200 KST

thể vô tính.

 Đếm số lƣợng phân liệt có từ 3 nhân trở lên trong tổng số 200 KST thể vô

Hình 2.3. Thu hoạch mẫu máu sau thời gian nuôi cấy thành công in vitro

tính (bao gồm cả thể phân liệt và thể tƣ dƣỡng).

Chú ý: nếu thu hoạch từ giếng A-H thì đầu tip phải đƣợc đổi sau mỗi giếng,

có thể dùng chỉ 1 đầu tip để thu hoạch mẫu máu từ giếng H-A (từ nồng độ

thuốc cao nhất đến thấp nhất);

- Tỷ lệ phần trăm thể phân liệt bị ức chế ở mỗi thuốc và mỗi nồng độ thuốc

so với tỷ lệ phần trăm thể phân liệt tại giếng chứng.

2.3.2.5. Các biến số chỉ số trong nghiên cứu

- Xác định nồng độ thuốc ức chế 50% (Inhibitor Concentration hay IC50), sự

phát triển của KSTSR với các thuốc sốt rét dihydroartemisinin, piperaquin

phosphat, artesunat, chloroquin phosphat.

- Đánh giá sự đáp ứng của P. falciparum với thuốc sốt rét:

2.3.2.6. Nhập và phân tích xử lý số liệu

bằng cách sử dụng phần mềm phân tích và phƣơng pháp báo cáo (IVART)

đƣợc phát triển trực tuyến bởi WWARN.

- Xác định nồng độ ức chế 50%(IC50), sự phát triển của KST sẽ đƣợc tính toán

2.3.2.7. Phương pháp khống chế nhiễu và hạn chế sai số

- Trƣớc khi tiến hành nghiên cứu, nghiên cứu viên chính phải nhắc lại và tập

huấn lại trình tự các khâu tiến hành nghiên cứu;

- Chọn đối tƣợng nghiên cứu chặt chẽ theo tiêu chí nghiên cứu;

- Trong quá trình phân tích số liệu và viết báo cáo: Giám sát chặt chẽ việc thu

thập số liệu tại thực địa, làm sạch số liệu trên các bảng câu hỏi đã hoàn thành,

mã hóa và loại bỏ các số liệu không tin cậy.

2.3.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu

 Đề tài đƣợc thông qua Hội đồng phê duyệt Đạo đức nghiên cứu và phê duyệt

đề cƣơng của Viện Sốt rét-KST-CT Trung ƣơng;

 Bệnh nhân hoặc ngƣời nhà đồng ý ký vào mẫu đơn chấp thuận theo phụ lục

trƣớc khi tham gia nghiên cứu;

- Bảo mật thông tin và số liệu nghiên cứu

 Tất cả thông tin liên quan đến BN nghiên cứu sẽ đƣợc bảo mật và chỉ chia sẻ

với các thành viên trong nhóm nghiên cứu;

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu đột biến gen K13

Bệnh nhân sốt rét đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu đột biến gen K13 (n=292)

Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đƣa vào NC in vitro (n=54)

Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đƣa vào NC in vivo (n=201)

Bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn đƣa vào NC in vivo và in vitro

Phân tích tỷ lệ, tần xuất, vị trí đột biến gen K13

Thời gian cắt sốt

Nuôi cấy thành công

Nuôi cấy không thành công

Điều trị sốt rét theo phác đồ của BYT

Thời gian cắt KST

Đánh giá hiệu quả điều trị

Thất bại điều trị sớm

Xác định nồng độ IC50

Thất bại điều trị muộn

Đáp ứng lâm sàng đầy đủ

Sàng lọc bệnh nhân sốt rét

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Qua thời gian tiến hành nghiên cứu từ năm 2016-2018 về phân tích các chỉ

điểm phân tử đột biến gen K13 liên quan đến kháng thuốc artemisinin tại các

vùng sốt rét lƣu hành (SRLH) và các thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu lực

thuốc trên in vivo, in vitro của các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Ninh Thuận,

Khánh Hòa, Quảng Trị.

3.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của

Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh

Thuận, Quảng Trị có sốt rét lƣu hành nặng năm 2016 - 2018

3.1.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân nhiễm P. falciparum đƣa vào phân

tích đột biến gen K13

- Tổng số 292 phân lập từ bệnh nhân sốt rét nhiễm đơn thuần P. falciparum

đƣợc thu thập từ 5 tỉnh Bình Phƣớc (n= 39 mẫu), Gia Lai (n=108 mẫu), Ninh

Thuận (n=44 mẫu), Khánh Hòa ( n=52 mẫu) và Quảng Trị (n=49 mẫu). Các

mẫu máu của bệnh nhân đƣợc thu thập vào ngày D0, thu trên giấy thấm

Whatman 3MM, để khô tự nhiên, bảo quản trong túi plastic có mép dính, có bổ

sung túi hạt silicagel để chống ẩm mốc, mẫu đƣợc thu thập bằng điều tra cắt

ngang phát hiện bệnh nhân sốt rét chủ động và từ các bệnh nhân đến khám, xét

nghiệm qua theo dõi dọc thụ động tại trạm y tế xã trong khoảng thời gian từ năm

2016-2018. Các mẫu máu khô đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích

gen K13 bằng phƣơng pháp giải trình tự gen. Đặc điểm chung của nhóm đối

tƣợng tham gia nghiên cứu (Bảng 3.1)

Bảng 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu

Bình

Khánh

Ninh

Gia Lai

Quảng Trị

Đặc điểm

Phƣớc

Hòa

Thuận

n=108

N=49

n=39

n=52

N= 44

Giới tính

SL (%)

Nam

26 (66,6)

97 (89,8)

35 (67,3)

41 (93,2)

31 (63,3)

Nữ

13 (33,4)

11(10,2)

17 (32,4)

3 (6,8)

18(26,7)

Nhóm tuổi

SL (%)

< 15 tuổi

5 (12,8)

12(11,11)

21(40,4)

11 (25,0)

11 (22,4)

≥ 15 tuổi

34 (87,2)

96(88,89)

31 (59,6)

33 (75,0)

38 (77,6)

Tuổi trung

26,8 ± 12,4

26,9± 9,9

25,9 ± 18,2 26,8 ± 14,3 27,1 ± 16,8

bình

Nhận xét:

Phân tích đặc điểm của nhóm bệnh nhân nghiên cứu ta thấy bệnh nhân nam

chiếm đa số cao nhất là Ninh Thuận chiếm 93,2% và thấp nhất là Quảng Trị

63,3%. Độ tuổi trung bình (TB) tham gia vào nghiên cứu giữa các tỉnh tƣơng đối

25,9 ± 18,2. Bệnh nhân tham gia nghiên cứu ở độ tuổi lớn hơn hoặc bằng 15 tuổi

chiếm đa số, cao nhất là Gia Lai (88,89%) và thấp nhất là Khánh Hòa (59,6%).

đồng đều độ tuổi TB cao nhất là Quảng Trị 27,1 ± 16,8 và thấp nhất là Khánh Hòa

3.1.2. Phân tích đặc điểm các vị trí đột biến trên gen K13 của

P. falciparum trên các mẫu phân tích

Tổng có 292 mẫu máu bệnh nhân sốt rét nhiễm đơn P. falciparum thu thập từ

5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Ninh Thuận, Khánh Hòa, Quảng Trị đƣợc sử dụng

để phân tích giải trình tự xác định đột biến K13 đƣợc giải trình tự ADN thành

công và đƣa vào phân tích đột biến gen. Trình tự ADN của mẫu bệnh nhân đƣợc

so sánh với trình tự gen tham khảo của chủng 3D7 mang gen kiểu dại (wild-

type), là chủng chuẩn nhạy với artemisinin đƣợc công bố trên ngân hàng gen

NBCI với mã số >XM_001350122.1, sử dụng thuật toán ClustalW của phần

mềm Bioedit V.7.0.5.3. Kết quả phân tích xác định đƣợc 8 kiểu đột biến gen

K13 gồm 02 điểm đột biến xác định kháng artemisinin (P553L, C580Y), 01

điểm đột biến liên quan đến kháng artemisinin (C469F) và 05 điểm đột biến

(H384Q, K503N, Y511H, G638E, G639D) chƣa xác định tính kháng với

artemisinin.

3.1.2.1. Kiểu đột biến gen tại vị trí C580Y

Đây là kiểu đột biến phát hiện đƣợc ở cả 5 tỉnh nghiên cứu. Đột biến C580Y

là đột biến có giá trị khẳng định kháng ART. Kiểu đột biến này xảy ra tại vị trí

1739 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen K13 làm thay thế nucleotide G

(Guanin) bằng nucleotide A (Adenin). Đột biến nucleotide này dẫn tới sự thay

đổi axit amin từ cysteine (C) thành tyrosine (Y) trong trình tự axit amin trong

chuỗi polypeptid tại vị trí 580 (Hình 3.1 và 3.2).

Hình 3.1. Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định vị trí đột biến 1739

trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

Hình 3. 2. Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến

C580Y trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

3.1.2.2. Kiểu đột biến gen ở vị trí P553L

Vị trí đột biến gen P553L đƣợc phát hiện có mặt ở 2 tỉnh Gia Lai và Khánh

Hòa, đây là vị trí đột biến xác định kháng ART của P. falciparum. Kiểu đột biến

này xảy ra tại vị trí 1658 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen K13, đột biến

thay thế nucleotide C (Cytosine) thành T (Thymine), kết quả dẫn tới sự thay đổi

axit amin từ P (Proline) thành L (Leucine) trong trình tự axit amin trong chuỗi

polypeptid tại vị trí 553 (Hình 3.3. và 3.4).

Hình 3.3. Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định đột biến nucleotit ở

P553L

vị trí 1658 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

Hình 3. 4. Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến

P553L trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

3.1.2.3.Kiểu đột biến gen ở vị trí C469F

Vị trí đột biến C469F phát hiện đƣợc trên mẫu phân lập ở tỉnh Gia Lai. Đây

là vị trí đột biến đƣợc xem là có liên quan đến kháng ART của P. falciparum.

Đột biến xảy ra tại vị trí nucleotit 1406 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen

K13, thay thế nucleotide G (Guanine) thành T (Thymine), kết quả dẫn tới sự

thay đổi axit amin từ C (Cytosine) thành F (Phenylalanine) trong trình tự axit

amin trong chuỗi polypeptid tại vị trí 469 (Hình 3.5. và 3.6).

Hình 3.5. Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định đột biến nucleotit ở

C469F

vị trí 1406 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

Hình 3.6. Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến

C469F trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.

3.1.2.4.Các vị trí đột biến gen khác

Kết quả nghiên cứu đã phát hiện 5 vị trí đột biến gen khác bao gồm H384Q,

K503N, Y511H, G638E, G639D, đây là các vị trí đột biến chƣa có các báo cáo

đánh giá mối liên quan với tính kháng artemisinin của P. falciparum tại Việt

Nam.

3.1.3. Đặc điểm về đột biến gen K13 của quần thể P. falciparum tại các tỉnh

nghiên cứu

3.1.3.1. Đặc điểm về đột biến gen K13 trên P. falciparum tại tỉnh Bình Phước

Bảng 3.2. Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Bình Phƣớc (n=39)

Kiểu gen Số lƣợng Tỷ lệ Phân loại

Đột biến P553L 0 0% Xác định kháng

Đột biến C580Y 38 Xác định kháng 97,44%

Đột biến C469F 0 Liên quan/ứng viên 0%

Đột biến H384Q 0 Chƣa xác định vai trò 0%

Đột biến Y511H 0 Chƣa xác định vai trò 0%

Đột biến K503N 0 Chƣa xác định vai trò 0%

Đột biến G638E 0 Chƣa xác định vai trò 0%

Đột biến G639D 0 Chƣa xác định vai trò 0%

Kiểu hoang dại 1 Nhạy với ART 2,56%

Tổng 39 100%

Nhận xét:

Tổng số 39 phân lập P. falciparum đƣợc phân tích giải trình tự gen K13. Kết

quả phân tích phát hiện có 01 đột biến xác định kháng artemisinin tại vị trí

C580Y với tần suất đột biến rất cao chiếm 97,44%, chỉ có 2,56% số mẫu mang

kiểu gen nhạy với artemisinin

Bảng 3.3. Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Bình Phƣớc

Nam (n=26) Nữ (n= 13) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

Đột biến P553L 0 0 0 0

Đột biến C580Y 26 12 100 92,3

Đột biến C469F 0 0 0 0

Đột biến H384Q 0 0 0 0

Đột biến Y511H 0 0 0 0

Kiểu hoang dại 0 1 0 7,7

Tổng 26 13 100 100

Nhận xét:

Tất cả đột biến gen K13 trên bệnh nhân nam và nữ đều là loại đột biến C580Y,

trên bệnh nhân nam tỷ lệ là 100% và trên bệnh nhân nữ là 92,3% còn lại 7,7% là

kiểu gen hoang dại.

Bảng 3.4. Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Bình Phƣớc

≥ 15 tuổi (n=34) <15 tuổi (n=5) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

Đột biến P553L 0 0 0 0

Đột biến C580Y 5 33 100 97,06

Đột biến C469F 0 0 0 0

Đột biến H384Q 0 0 0 0

Đột biến Y511H 0 0 0 0

Kiểu hoang dại 0 1 0 2,4

Tổng 5 34 100 100

Nhận xét:

Nhóm ≥ 15 tuổi chiếm đa số có 34/39 bệnh nhân tỷ lệ đột biến của nhóm này là

97,6%, nhóm dƣới 15 tuổi có 5 bệnh, tỷ lệ đột biến gen K13 ở nhóm này là

100%.

3.1.3.2. Đặc điểm về đột biến gen K13 trên P. falciparum tại tỉnh Gia Lai

Bảng 3.5. Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Gia Lai (n=108)

Kiểu gen Số lƣợng Tỷ lệ % Phân loại

6 5,56 Xác định kháng Đột biến P553L

49 45,37 Xác định kháng Đột biến C580Y

5 4,63 Liên quan/ứng viên Đột biến C469F

0 0,00 Chƣa xác định vai trò Đột biến H384Q

2 1,85 Chƣa xác định vai trò Đột biến Y511H

5 4,63 Chƣa xác định vai trò Đột biến K503N

0 0,00 Chƣa xác định vai trò Đột biến G638E

0 0,00 Chƣa xác định vai trò Đột biến G639D

31 28,70 Nhạy với ART Kiểu hoang dại

100 108 Tổng

Nhận xét:

Kết quả phân tích 108 phân lập P. falciparum, xác định có 67/108 mẫu

mang đột biến gen K13 với 5 điểm đột biến đƣợc phát hiện gồm C469F, K503N,

Y511H, P553L, C580Y. Trong đó hai đột biến xác định kháng artemisinin là

C580Y chiếm tỷ lệ 45,37% (49/108) và P553L chiếm tỷ lệ 5,56% (6/108); có 01

đột biến điểm liên quan hoặc là ứng viên kháng artemisinin là C496F với tỷ lệ

4,63% (5/108); Hai đột biến điểm Y511H chiếm tỷ lệ 4,63% và K503N chiếm tỷ

lệ 1,85%, đây là điểm đột biến mới, chƣa có các báo cáo đánh giá xác định vai

trò liệu có liên quan hay là đột biến vô nghĩa với artemisinin.

Bảng 3.6. Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Gia Lai

Nam (n=97) Nữ (n=11) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

Đột biến P553L 6 0 6,19 0

Đột biến C580Y 43 6 44,33 54,55

Đột biến C469F 4 1 4,12 9,09

Đột biến Y511H 5 0 5,15 0

Đột biến K503N 2 0 2,06 0

Kiểu hoang dại 37 4 38,14 36,36

Tổng 97 11 100 100

Nhận xét: Tỷ lệ đột biến gen K13 ở bệnh nhân nam (61,86%) và bệnh nhân nữ (63,64) gần tƣơng tự nhau, ở nhóm bệnh nhân nam phát hiện 5 điểm đột biến (P553L, C580Y, C496F, Y511H, K503N), trên nhóm bênh nhân nữ chỉ phát hiện đƣợc 2 điểm đột biến (C580Y, C496F).

Bảng 3.7. Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Gia Lai

<15 tuổi (n=12) ≥ 15 tuổi (n=96) Kiểu gen

Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%)

Đột biến P553L 0 6 0 6,25

Đột biến C580Y 9 40 75,00 41,67

Đột biến C469F 0 5 0% 5,21

Đột biến Y511H 0 5 0% 5,21

Đột biến 1K503N 0 2 0% 2,08

Kiểu hoang dại 3 38 25 39,58

Tổng 96 12 100 100

Nhận xét:

Trong số 108 bệnh nhân nghiên cứu có 12 bệnh nhân dƣới 15 tuổi tỷ lệ đột biến

ở nhóm bệnh nhân dƣới 15 tuổi là 75,00%, bệnh nhân ≥ 15 tuổi có 96 bệnh nhân

tỷ lệ đột biến ở nhóm bệnh nhân là 58/96 (60,42%). Còn lại là kiểu gen hoang

dại

3.1.3.3. Đặc điểm về đột biến gen K13 trên P. falciparum tại tỉnh Ninh Thuận

Bảng 3.8. Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Ninh Thuận (n=44)

Tỷ lệ (%) Kiểu gen Số lƣợng Phân loại

Đột biến P553L 0 Xác định kháng 0

Đột biến C580Y 3 6,82 Xác định kháng

Đột biến C469F 0 Liên quan/ứng viên 0

Đột biến H384Q 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến K503N 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến Y511H 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến G638E 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến G639D 0 Chƣa xác định vai trò 0

41 Kiểu hoang dại 93,18 Nhạy với ART

44 Tổng 100

Nhận xét:

Phân tích trình tự gen K13 của 44 phân lập P. falciparum cho thấy phần lớn

quần thể ký sinh trùng P. falciparum tại Ninh Thuận có kiểu gen hoang dại còn

nhạy với artemisinin với tỷ lệ 93,18%, chỉ phát hiện có 3/44 mẫu (6,82%) có đột

biến gen K13 tại vị trí C580Y còn lại 93,18 % là kiểu gen hoang dại.

Bảng 3.9. Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Ninh Thuận

Nam (n=41) Nữ (n=3) Kiểu gen Số lƣợng Tỷ lệ Số lƣợng Tỷ lệ

0 0 Đột biến P553L 0 0

7,32 0 Đột biến C580Y 3 0

0 0 Đột biến C469F 0 0

0 0 Đột biến H384Q 0 0

0 0 Đột biến Y511H 0 0

92,68 100 Kiểu hoang dại 38 3

100 100 Tổng cộng 41 3

Nhận xét:

Tỷ lệ đột biến gen K13 trên nhóm bện nhân nam 3/41 (7,32%), trên nhóm

bênh nhân nữ không phát hiện đƣợc điểm đột biến nào có thể do số lƣợng mẫu

bệnh nhân nữ nhỏ nên ta chƣa phát hiện đƣợc.

Bảng 3.10. Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Ninh Thuận

≥ 15 tuổi (n=33) <15 tuổi (n=11) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ Số lượng Tỷ lệ

Đột biến P553L 0 0 0 0

Đột biến C580Y 9,09 6.06 1 2

Đột biến C469F 0 0 0 0

Đột biến H384Q 0 0 0 0

Đột biến Y511H 0 0 0 0

Kiểu hoang dại 90,91 93,94 10 31

Tổng 100 100 11 33

Nhận xét:

Trong số 44 bệnh nhân của Ninh Thuận có 11 bệnh nhân dƣới 15 tuổi và 33

bệnh nhân ≥ 15 tuổi. Nhóm dƣới 15 tuổi có 1/11 (9,09%) bệnh nhân có đột biến

K13 cao hơn nhóm bệnh nhân ≥ 15 tuổi 6,06% (2/33).

3.1.3.4. Đặc điểm về đột biến gen K13 trên P. falciparum tại tỉnh Khánh Hòa

Bảng 3.11. Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Khánh Hòa (n=52)

Số lƣợng Tỷ lệ Kiểu gen Phân loại n=52 %

Đột biến P553L 11 21,16 Xác định kháng

Đột biến C580Y 3 5,77 Xác định kháng

Đột biến C469F 0 0 Liên quan/ứng viên

Đột biến H384Q 1 1,92 Chƣa xác định vai trò

Đột biến K503N 0 0 Chƣa xác định vai trò

Đột biến Y511H 0 0 Chƣa xác định vai trò

Đột biến G638E 1 1,92 Chƣa xác định vai trò

Đột biến G639D 1 1,92 Chƣa xác định vai trò

Kiểu hoang dại 35 67,31 Nhạy với ART

100 Tổng 52

Nhận xét:

Phân tích tổng số 52 phân lập P. falciparum xác định có 17/52 mẫu mang

đột biến gen K13 với 5 vị trí đột biến điểm gồm H384Q, P553L, C580Y, G638E,

G639D. Trong đó có hai loại đột biến xác định kháng artemisin là C580Y chiếm

tỷ lệ 5,77% (3/52) và kiểu đột biến P553L chiếm tỷ lệ 21,15% (11/52), còn có ba

loại đột biến khác gồm H384Q (1,92%), G638E (1,92%), G639D (1,92%) hiện

chƣa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay đột biến vô

nghĩa.

Bảng 3.12. Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Khánh Hòa

Nam (n=35) Nữ (n=17) Kiểu gen Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ%

14,29 35,29 Đột biến P553L 5 6

5,71 5,89 Đột biến C580Y 2 1

2,86 0 Đột biến H384Q 1 0

2,86 0 Đột biến G638E 1 0

2,86 0 Đột biến G639D 1 0

71,43 58,82 Kiểu hoang dại 25 10

100 100 Tổng 35 17

Nhận xét: Trên nhóm bệnh nhân nam phát hiện đƣợc 5 điểm đột biến (P553L, C580Y, H384Q, G638E, G639D ), trên nhóm bệnh nhân nữ có 2 điểm đột biến (P553L, C580Y).Tỷ lệ đột biến của bệnh nhân nam (28,57%) thấp hơn tỷ lệ đột biến trên nhóm bệnh nhân nữ (41,18%).

Bảng 3.13. Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Khánh Hòa

<15 tuổi (n=21) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ ≥ 15 tuổi (n=31) Tỷ lệ Số lượng

28,57% 16,13% Đột biến P553L 6 5

14,29% 0% Đột biến C580Y 3 0

0% 3,23% Đột biến H384Q 0 1

0% 3,23% Đột biến G638E 0 1

0% 3,23% Đột biến G639D 0 1

57,14 74,19 Kiểu hoang dại 12 23

100 100 Tổng 21 31

Nhận xét: Trên nhóm bệnh nhân dƣới 15 phát hiện đƣợc 2 điểm đột biến (P553L, C580Y), trên nhóm ≥15 tuổi phát hiện đƣợc 4 điểm đột biến(P553L, H384Q, G638E, G639D ). Tỷ lệ đột biến gen K13 trên nhóm bệnh nhân dƣới 15 tuổi cao hơn nhóm bệnh nhân ≥15 tuổi.

3.1.3.5. Đặc điểm về đột biến gen K13 trên P. falciparum tại tỉnh QuảngTrị

Bảng 3.14. Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Quảng Trị (n=49)

Kiểu gen Tình trạng phân loại Số lƣợng N = 49 Tỷ lệ %

Đột biến P553L Xác định kháng 0 0

Đột biến C580Y 20,41 Xác định kháng 10

Đột biến C469F 0 Liên quan/ứng viên 0

Đột biến H384Q 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến K503N 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến Y511H 0 Chƣa xác định vai trò 0

Đột biến G638E 0 Chƣa xác định vai trò 0

Kiểu hoang dại 79,59 Nhạy với ART 39

100 Tổng 49

Nhận xét: Tổng số 49 phân lập P. falciparum đƣợc phân tích đột biến gen K13 cho thấy chỉ phát hiện có kiểu đột biến C580Y với tỷ lệ 20,41% (10/49), số phân lập mang kiểu gen hoang dại còn nhạy với artemisinin chiếm tỷ lệ 79,59%.

Bảng 3.15. Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Quảng Trị

Nam (n=31) Nữ (n=18) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

Đột biến P553L 0 0 0 0

Đột biến C580Y 12,90 33,33 6 4

Đột biến C496F 0 0 0 0

Đột biến H384Q 0 0 0 0

Đột biến Y511H 0 0 0 0

Kiểu hoang dại 87,10 66,67 12 27

100 100 Tổng 18 31

Nhận xét: Tỷ lệ đột biến gen K13 trên bệnh nhân nam 12,90% (4/31)thấp hơn bệnh nhân nữ 33,33% (6/18).

Bảng 3.16. Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Quảng Trị

≥15 tuổi (n=38) <15 tuổi (n=11) Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ%

0 0 Đột biến P553L 0 0

36,36 15,39 Đột biến C580Y 6 4

0% 0 Đột biến C496F 0 0

0% 0 Đột biến H384Q 0 0

0% 0 Đột biến Y511H 0 0

63,64 84,61 Kiểu hoang dại 32 7

100 100 Tổng 38 11

Nhận xét:

Quảng trị chỉ phát hiện đƣợc 1 vị trí đột biến gen K13 (C580Y), tỷ lệ đột biến

gen K13 ỏ nhóm bệnh nhân dƣới 15 tuổi (36,36%) cao hơn nhóm ≥15 tuổi

(15,39%).

3.1.4. Tỷ lệ đột biến gen K13 của 5 tỉnh thực hiện nghiên cứu

Bảng 3.17. Tổng hợp kết quả tỷ lệ đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu

Mẫu có đột biến gen Mẫu phân K13 TT Tỉnh P tích SL %

39 38 97,44 1 Bình Phƣớc

108 67 62,04 2 Gia Lai

52 17 32,69 0,00063 3 Khánh Hòa

44 3 6,82 4 Ninh Thuận

49 10 20,41 5 Quảng Trị

46,23 Tổng số 292 135

Nhận xét:

Từ kết quả phân tích giải trình tự xác định vị trí và tần suất đột biến K13 của

P. falciparum tại 5 tỉnh nghiên cứu với 292 mẫu phân lập. Kết quả tổng hợp thu

đƣợc tỷ lệ đột biến gen K13 chung là 135/292 (46,23%). Tỷ lệ có đột biến gen

K13 của P. falciparum giữa các tỉnh nghiên cứu có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê p < 0,05, cao nhất ở Bình Phƣớc với tỷ lệ 94,44% và thấp nhất là Ninh Thuận

với tỷ lệ 6,82% (Bảng 3.16, Hình 3.7)

Hình 3.7. Bản đồ phân bố mức độ đột biến gen K13 của ký sinh trùng P.

falciparum tại các điểm nghiên cứu

Bảng 3.18. Đặc điểm đột biến gen K13 của 5 tỉnh nghiên cứu

Kiểu gen Số lƣợng Tỷ lệ% Phân loại

18 6,16 Xác định kháng Đột biến P553L

103 Xác định kháng Đột biến C580Y 35,27

4 Liên quan/ứng viên Đột biến C469F 1,37

1 Chƣa xác định vai trò Đột biến H384Q 0,34

5 Đột biến Y511H 1,71 Chƣa xác định vai trò

2 Đột biến K503N 0,68 Chƣa xác định vai trò

1 Đột biến G638E 0,34 Chƣa xác định vai trò

1 Đột biến G639D 0,34 Chƣa xác định vai trò

157 Kiểu hoang dại 53,77 Nhạy với ART

292 Tổng 100%

Nhận xét:

Trong các điểm đột biến gen K13 kiểu đột biến C580Y chiếm tỷ lệ cao nhất

35,27% (103/292), tiếp đến là điểm P553L chiếm 6,16% (18/292) đây cũng là 2

điểm đƣợc xác định là kháng ART, điểm đột biến có liên quan đến kháng ART

C496F chỉ phát hiện đƣợc với tỷ lệ nhỏ (1,37%). Ngoài ra còn phát 5 vị trí đột

biến khác chƣa xác định đƣợc vai trò có liệu có khẳng định kháng hay liên quan

hay vô nghĩa với tỷ lệ rất nhỏ.

Bảng 3.19. Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo giới tính của 5 tỉnh

Mẫu có đột biến gen K13 Tỉnh Mẫu phân tích Nam Nữ

39 Bình Phƣớc

108 Gia Lai

44 Ninh Thuận

52 Khánh Hòa

49 Quảng Trị

292 Tổng số 26/26 (100%) 60/97 (61,86%) 3/41 (7,32%) 10/35 (28,57%) 4/31 (12,90%) 103/230 (44,78%) 12/13 (92,31%) 7/11 (63,64%) 0 (0%) 7/17 (41,18%) 6/18 (33,33%) 32/62 (51,61%)

Nhận xét:

Tỷ lệ đột biến chung của bệnh nhân nam 44,78% thấp hơn bệnh nhân nữ

51,61%, trong đó tỷ lệ đột biến của bệnh nhân nam cao nhất là ở Bình Phƣớc

chiếm tỷ lệ 100% và thấp nhất ở Ninh Thuận 7,32%. Ở bệnh nhân nữ tỷ lệ đột

biến gen K13 cao nhất Bình Phƣớc và thấp nhất ỏ Ninh Thuận, tỷ lệ này cũng

phù hợp với tỷ lệ đột biến chung của các điểm nghiên cứu.

Bảng 3.20. Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo nhóm tuổi của 5 tỉnh

Mẫu có đột biến gen K13 Tỉnh Mẫu phân tích

<15 tuổi ≥ 15 tuổi

39 Bình Phƣớc

108 Gia Lai

44 Ninh Thuận

52 Khánh Hòa

49 Quảng Trị

292 Tổng số 5/5 (100%) 9/12 (75,00%) 1/11 (9,09%) 9/21 (42,86%) 4/11 (36,36%) 25/58 (43,10%) 33/34 (97,06%) 58/96 (60,42%) 2/33 (6,06%) 8/31 (25,81%) 6/38 (15,79%) 110/234 (47,00%)

Nhận xét:

Tỷ lệ đột biến chung ở nhóm ≥ 15 tuổi (47,00%) cao hơn dƣới tuổi 15

(43,10%), tỷ lệ đột biến cao nhất của nhóm ≥15 cao nhất là Bình Phƣớc, thấp

nhất ỏ Ninh Thuận, Sự khác biệt đột biến gen K13 giữa nhóm ≥ 15 và nhóm

dƣới 15 tuổi có ý nghĩa thống kê (p = 0,004).

3.1.5. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 của các quần thể P. falciparum tại các

điểm nghiên cứu.

Hình 3.8. Biểu đồ so sánh tỷ lệ đột biến gen K13 phát hiện đƣợc tại các điểm nghiên cứu

Hình 3.8 cho thấy đột biến kháng artemisinin C580Y phát hiện đƣợc ở cả 5 tỉnh nghiên cứu, cao nhất tại Bình Phƣớc với tần suất kiểu gen đột biến chiếm 97,44% (38/39 mẫu) và phát hiện với tỷ lệ thấp tại Khánh Hòa 5,77 % (3/52 mẫu) tại Ninh Thuận chiếm tỷ lệ 6,82% (3/44 mẫu), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,001. Đột biến kháng artemisinin P553L phát hiện đƣợc tại 2 tỉnh là Gia Lai 5,56% (6/108 mẫu) và ở Khánh Hòa với tỷ lệ 21,15% (11/52 mẫu). Đột biến C496F chỉ phát hiện đƣợc ở tỉnh Gia Lai với tỷ lệ 4,63% (5/108 mẫu). Một số đột biến chƣa xác định tính kháng khác phát hiện đƣợc ở Gia Lai nhƣ K503N với tỷ lệ 1,85% (2/108 mẫu), Y511H với tỷ lệ 4,63% (5/108 mẫu), các đột biến H384Q, G638E, G639D chỉ phát hiện đƣợc ở tỉnh Khánh Hòa với tỷ lệ thấp 1,92% (1/52 mẫu).

3.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphate tại các điểm nghiên cứu Trong tổng số 292 bệnh nhân KSTSR P. falciparum thu thâp đƣợc từ 5 tỉnh nghiên cứu đƣợc đƣa vào phân tích gen K13, có 201 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đƣợc lựa chọn đƣa vào nghiên cứu đánh giá đáp ứng của KST P. falciparum với thuốc DHA-PPQ với số lƣợng từng tỉnh nhƣ sau: Tỉnh Bình Phƣớc 39 bệnh nhân, tỉnh Gia Lai 48 bệnh nhân, tỉnh Ninh Thuận 40 bệnh nhân, tỉnh Khánh Hòa 43 bệnh nhân và Quảng Trị 31 bệnh nhân kết quả nhƣ sau:

3.2.1. Đặc điểm chung về dân số của nhóm nghiên cứu

Bảng 3.21. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu

Bình

Khánh

Ninh

Quảng

Gia Lai

Đặc điểm

Phƣớc

Hòa

Thuận

Trị

n=48

n= 39

n= 43

n=40

n=31

Giới tính

SL(%)

26 (66,7)

46 (95,8)

29 (67,4)

38 (95)

18 (58,1)

Nam

13 (33,3)

2 (4,2)

14 (32,6)

2 (5)

13 (41,9)

Nữ

Nhóm tuổi

Mean±SD

Trung bình

26,8 ± 12,4

27,6 ± 9

26,3 ±18,0

26,9 ± 14,8

25,1 ± 16,9

1(2,4)

1 (2,5)

2 (6,4)

≥ 5 - < 15

5 (12,8)

1 (2,1)

17 (39,5)

9 (22,5)

6 (19,4)

34 (87,2)

47 (97,9)

25 (58,1)

30 (75,0)

23 (74,2))

≥ 15

- Nhiệt độ (0C)

38,7 ± 0,6

38,7 ± 0,9

38,8 ± 0,9

38,9 ± 0,4

38,8 ± 0,8

- Cân nặng (kg)

51 ± 10,7

53,4 ± 8,2

37,6 ± 13,4

42,8 ± 13,8

40,4 ± 12,7

8.030/L

10.770/L

11.736/L

26.530/L

11.087/L

Mật độ KST

(1128-97764)

(1019-98765)

(1020- 99555)

(3111-97666)

(1441 -98234)

Nhận xét:

- Phân tích các đặc điểm dân số học của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên

cứu TES đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ trong điều trị bệnh nhân sốt rét

nhiễm P. falciparum chƣa biến chứng cho thấy nam chiếm cao hơn nữ trong cơ

cấu tại tất cả điểm thực hiện TES, lần lƣợt nam chiếm 66,7%; 95,8%; 67,4%;

95% và 58,1% tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị.

- Phần lớn bệnh nhân đều là ngƣời lớn trƣởng thành (≥ 15 tuổi) tại Bình

Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị lần lƣợt là

87,2%; 97,9; 58,1%, 75,0% và 74,2%.

- Tại thời điểm vào nghiên cứu và chƣa dùng thuốc sốt rét, thân nhiệt trung

bình của nhóm bệnh nhân tại các tỉnh nghiên cứu Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị tham gia lần lƣợt là (38,7 ± 0,6)0C; (38,7 ± 0,9)0C; (38,8 ± 0,9)0C; (38,9 ± 0,4)0C và (38,8 ± 0,8)0C và cân nặng

trung bình lần lƣợt là (51 ± 10,7) kg; (53,4 ± 8,2) kg; (37,6 ± 13,4) kg; (42,8 ±

13,8) kg và (40,4 ± 12,7) kg.

- Mật độ KSTSR thể vô tính P. falciparum trung bình tại các tỉnh dao động từ

8030 đến 26530/L trong máu ngoại vi, không có trƣờng hợp nào dƣới 1000 hay

trên 100.000/L, phù hợp tiêu chuẩn chọn bệnh.

3.2.2. Tỷ lệ, đặc điểm đột biến gen K13 của nhóm nghiên cứu in vivo

Bảng 3.22. Tỷ lệ đột biến gen K13 của các mẫu đƣa vào nghiên cứu in vivo

Mẫu có p Mẫu phân đột biến gen K13 Tỉnh tích SL %

Bình Phƣớc 38 39 97,44

Gia Lai 28 48 58,33 0,00056 Ninh Thuận 2 40 5,00

Khánh Hòa 16 43 37,21

Quảng Trị 10 31 32,26

Tổng số 94 201 46,77

Nhận xét:

Tổng số 201 mẫu phân lập P. falciparum thu thập, số mẫu có đột biến gen

K13 chung là 94/201 (46,77%). Trong đó, tỷ lệ có đột biến gen K13 tại các tỉnh

Bình Phƣớc là cao nhất chiếm 97, 44% và thấp nhất tại Ninh Thuận chiếm 5%.

Tỷ lệ đột biến gen K13 giữa các tỉnh khác nhau có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

Bảng 3.23. Đặc điểm đột biến gen K13 của bệnh nhân nghiên cứu in vivo

Bình Gia Khánh Ninh Quảng

Kiểu gen Phƣớc Lai Hòa Thuận Trị Phân loại

n=39 n =48 n =43 n =40 n =31

(0 %)

(6,25%)

(25,58%)

(0 %)

Đột biến 0 3 11 0 Xác định 0

P553L kháng

(97,44%)

(43,75%)

4,65%

(5,0%)

(32,26%)

2 Đột biến 38 21 10 Xác định 2

kháng C580Y

(4,17%)

(0 %)

0 Đột biến 2 0 0 Liên quan/ 0

C496F ứng viên

(2,32%)

(0 %)

1 Đột biến 0 0 0 Chƣa xác 0

H384Q định vai trò

(0 %)

0 Đột biến 0 0 0 Chƣa xác 0

Y511H định vai trò

(0 %)

(4,17%)

(0 %)

0 Đột biến 2 0 0 Chƣa xác 0

K503N định vai trò

(0 %)

(2,32%)

(0 %)

1 Đột biến 0 0 0 Chƣa xác 0

G638E định vai trò

(0 %)

(2,32%)

(0 %)

1 Đột biến 0 0 0 Chƣa xác 0

G639D định vai trò

Nhận xét:

- Qua phân tích mẫu giấy thấm của máu bệnh nhân P. falciparum trong

nghiên cứu in vivo phát hiện đƣợc 7 kiểu đột biến gen (C580Y, P553L, C469F,

H384Q, K503N, G638E, G639D) không phát hiện đƣợc kiểu Y511H. Trong đó

đột biến gen K13 liên quan đến kháng ART C580Y trên quần thể P. falciparum là

phổ biến nhất với tỷ lệ lần lƣợt 97,44%; 43,75%; 32,26%%; 5,00%; 4,65 tại

Bình Phƣớc, Gia Lai, Quảng Trị, Ninh Thuận, Khánh Hòa. Đột biến P553L cũng

là chỉ điểm xác định kháng ART chỉ phát hiện đƣợc ở Khánh Hòa, Gia Lai mà

chƣa phát hiện đƣợc ở các tỉnh khác với tỷ lệ lần lƣợt là 21,15% và 5,56%.

- Kiểu đột biến C469F có thể liên quan đến kháng ART, phát hiện ở Gia Lai

với tỷ lệ thấp 4,17%.

Ngoài ra, còn có 4 loại đột biến K13 khác:Khánh Hòa 3 đột biến gồm có

H384Q (2,32%), G638E (2,32%), G639D (2,32%) và Gia Lai 1 đột biến, K503N

(4,17%), hiện chƣa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay

vô nghĩa.

3.2.3. Thời gian làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt sau điều trị DHA-PPQ

Bảng 3.24. Hiệu lực làm sạch ký sinh trùng P. falciparum và cắt sốt

Bình Gia Khánh Ninh Quảng Nội dung phân tích Phƣớc Lai Hòa Thuận Trị

8030 10770 11736 26530 11087 Mật độ KSTSR/l ngày D0

52,1 45,5 38,1 31,2 24,6 Thời gian sạch KST (giờ) ± 20,1 ± 22,2 ± 16,6 ± 11,1 ± 1,5

38,7 38,7 38,8 38,9 38,8 Nhiệt độ ngày D0 (0C) ± 0,6 ± 0,9 ± 0,9 ± 0,4 ± 0,8

30,2 33,3 31,4 30 34,2 Thời gian cắt sốt (giờ) ± 12,7 ± 14,9 ± 11,5 ± 11,5 ± 12,8

Nhận xét:

Sau điều trị thuốc DHA-PPQ cho thấy thời gian sạch KST trung bình của

các tỉnh lần lƣợt là: Bình Phƣớc 52,1 ± 20,1 giờ; Gia Lai 45,5 ± 22,2 giờ; Khánh

Hòa 38,1 ± 16,6 giờ; Ninh Thuận 31,2 ± 11,1 giờ; Quảng Trị 24,6 ± 1,5 giờ.thời

gian sạch KSTtrung bình giữa các tỉnh khác nhau có ý nghĩa thống kê (p <0,05).

Song song đó, thời gian cắt sốt trung bình lần lƣợt là: Bình Phƣớc 30,2±12,7 giờ,

Gia Lai 33,3 ± 14,9 giờ, Khánh Hòa 31,4 ± 11,5 giờ; Ninh Thuận 30 ± 11,5 giờ

và Quảng Trị 34,2 ±12,8 giờ.

Bảng 3.25. Tỷ lệ tồn tại ký sinh trùng thể vô tính 72 giờ hoặc ngày D3

Thời gian sạch KSTSR

Bình Phƣớc

Gia Lai

Khánh Hòa

Ninh Thuận

Quảng Trị

Mật độ KSTSR/l ngày D0

8030 10770 11736 26530 11087

Số ca còn thể vô tính 35/39 38/48 37/43 17/40 6/31

(89,7%) (79,2%) (86,1%) (42,5%) (19,4%) ngày D1

Số ca còn thể vô tính 27/39 24/48 25/43 1/40 0/31

(69,2%) (50,0%) (58,1%) (2,5%) (0,0%) ngày D2

Số ca còn thể vô tính 16/39 7/48 8/43 0/40 0/31

(41,0%) (14,6%) (18,6%) (0%) (0%)

ngày D3 Nhận xét:

Phân tích về tỷ lệ tồn tại KST thể vô tính sau điều trị DHA-PPQ ở ngày D3

kể từ liều thuốc DHA-PPQ đầu tiên cho thấy tại các điểm theo dõi của tỉnh Bình

Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, tỷ lệ KST ngày D3 >10% lần lƣợt là 41,0% (16/39),

14,6% (7/48), 18,6% (8/43).Ninh Thuận và Quảng Trị không có trƣờng hợp nào

còn KST ngày D3.

Bảng 3.26. So sánh ký sinh trùng ngày D3 với đột biến gen K13 tại các điểm

nghiên cứu.

Đột biến gen K13 Tổng cộng

Tỉnh

Bình Phƣớc n=39 Gia Lai n=48 Khánh Hòa n= 43 Ninh Thuận n=40 Quảng Trị n=31

Có KST D3(%) 16 41% 7 14,6% 8 18,6% 0 0% 0 0% 31 Không Có KST D3 22 56,4% 21 43,7% 8 18,6% 2 5,0% 10 32,6% 63

Tổng cộng 94 94

Nhận xét:

Trong số 201 bệnh nhân theo dõi đến ngày D3 của 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia

Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị có tất cả 31 bệnh nhân có KST ngày

D3 đều có điểm đột biến gen K13 xác định kháng ART (24.C580Y, 7.P553L)

lần lƣợt tại các tỉnh là Bình Phƣớc 41%, Khánh Hòa 18,6% và Gia Lai14,6 % và

63/94 bệnh nhân có đột biến gen K13 nhƣng không có KST ngày D3. Nhƣ vậy

các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa có tỷ lệ KST ngày D3 lớn hơn 10%

kết hợp với đột biến K13 ở những vị trí xác định kháng ART > 5% đƣợc xác

định là vùng kháng ART.

Bảng 3.27. Đặc điểm kiểu gen của những bệnh nhân có ký sinh trùng ngày D3

Bình Gia Khánh

Kiểu gen Tổng Phân loại Phƣớc Lai Hòa

n=16 n =7 n =8

(0 %)

(14,28%)

(87,5%)

Xác định 0 1 7 8 Đột biến P553L kháng

(100%)

(85,72%)

12,5%

Xác định 16 6 1 23 Đột biến C580Y kháng

(0%)

(0 %)

Liên quan/ 0 0 0 0 Đột biến C496F ứng viên

(0%)

(0 %)

Chƣa xác định 0 0 0 0 Đột biến Khác vai trò

Nhận xét:

Trong số 31 bệnh nhân có KST ngày D3 và có điểm đột biến gen K13 có 23

mẫu có đột biến C580Y (Bình Phƣớc 16 mẫu, Gia Lai 6 mẫu và Khánh Hòa

1mẫu), 8 mẫu có đột biến P553L (Khánh Hòa 7 mẫu và Gia Lai1 mẫu). Tất cả

các đột biến này đều đƣợc phân loại là xác định kháng artemisinin.

3.2.4. Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét P. falciparum

Bảng 3.28. Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét do P. falciparum

tại các tỉnh nghiên cứu

Bình

Gia

Khánh

Ninh

Quảng

Hiệu lực phác đồ

Phƣớc

Lai

Hòa

Thuận

Trị

DHA-PPQ

SL(%)

0 0 0 0 0 Thất bại điều trị sớm (ETF) (0%) (0%) (0%) (0%) (0%)

1 0 0 0 2 Thất bại LS muộn (LCF) (6,1%) (2,2%) (0%) (0%) (0%)

0 1 0 0 4 Thất bại KST muộn (LPF) (12,2%) (0%) (2,6%) (0%) (0%)

27 44 38 33 26 Đáp ứng LS và KST (ACPR) (81,8%) (97,8%) (97,4%) (100%) (100%)

Tổng số phân tích 45 39 33 26 33

3 4 7 5 6 Mất theo dõi/rút nghiên cứu (15,4%) (6,3%) (9,3%) (17,5%) (16,1%)

39 Tổng số nghiên cứu 48 43 40 31

Nhận xét:

Trong số 201 ca bệnh tham gia nghiên cứu TES, có đến 25/201 (12,4%) ca

mất theo dõi hoặc rút khỏi nghiên cứu chỉ còn 176 bệnh nhân đƣợc theo dõi đánh

giá đầy đủ. Kết quả chỉ ra đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ (ACPR) tại hai

tỉnh Ninh Thuận và Quảng Trị đều 100%, tại tỉnh Khánh Hòa và Gia Lai hiệu

lực vẫn còn trên 95% lần lƣợt 96,4% và 97,4%, trong khi đó tại Bình Phƣớc tỷ lệ

ACPR này chỉ còn 81,8% (< 90%) và tỷ lệ thất bại trên 10%, kèm theo thất bại

lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại KST muộn (LPF) là 4 ca (12,2%).

Đặc biệt, tại cả 5 tỉnh chƣa có trƣờng hợp nào thất bại điều trị sớm (ETF), riêng

ở Khánh Hòa và Gia Lai có 1 trƣờng hợp thất bại muộn.

Hình 3.9. Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá tại Bình Phƣớc

Phân tích đƣờng cong Kaplan Meier tại Bình Phƣớc cho phép ta ƣớc tính đƣợc

số bệnh nhân tham gia trong suốt quá trình điều trị và ca thất bại trong quá trình

theo dõi tại những ngày D14, D21, D28 đƣờng cong đi xuống tƣơng ứng với

những ngày xuất hiện bệnh nhân thất bại điều trị.

Hình 3.10. Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá tại Gia Lai

Tất cả 8 bệnh nhân thất bại điều trị đều đƣợc lấy mẫu máu giấy thấm để phân

tích tái phát, tái nhiễm kết quả cả 8 mầu này đều là tái phát không có mẫu nào

nhiễm mới.

Hình 3.11. Hình ảnh điện di phân tích tái phát, tái nhiễm

Đây là hình ảnh tái phát vì chiều dài của các marker ngày xuất hiện lại KST trùng khớp với ngày D0. Bảng 3.29.So sánh thất bại điều trị và đáp ứng lâm sàng đầy đủ với các điểm đột biến gen K13 có liên quan đến kháng artemisinin.

Thất bại điều trị Đáp ứng lâm sàng đầy đủ Tổng

Tỉnh cộng Có đột biến Không đột Có đột biến Không đột

K13 biến K13 K13 biến K13

Bình Phƣớc 6 0 26 1 33

Gia Lai 1 0 25 19 45

Khánh Hòa 1 0 12 26 39

Ninh Thuận 0 0 2 31 33

Quảng Trị 0 0 10 16 26

Tổng cộng 8 0 75 93 176

Nhận xét:

Trong số 201 bệnh nhân đƣa vào theo dõi có 176 bệnh nhân theo dõi đủ 42 ngày. Trong 5 tỉnh, có 3 tỉnh xuất hiện bệnh nhân thất bại điều trị muộn là Bình Phƣớc 6 bệnh nhân, Gia Lai 1 bệnh nhân, Khánh Hòa 1 bệnh nhân, tất cả những bệnh nhân này đều có điểm đột biến gen K13 xác định hoặc liện quan đến kháng ART. Đáp ứng lâm sàng đầy đủ là 168 bệnh nhân trong đó có 75 bệnh nhân có điểm đột biến gen K13 xác định hoặc liện quan đến kháng ART và 93 bệnh nhân không có đột biến gen K13.

3.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét bằng kỹ thuật invitro tại Gia Lai

- Nghiên cứu thử nghiệm thuốc SR với các phân lập thu thập tại thực địa trên in vitro nhằm phát hiện sớm các dấu hiệu của sốt rét P. falciparum kháng thuốc và đánh giá độ nhạy cảm những thuốc mới có khả năng thay thế những thuốc đã bị kháng. Trong 292 ca đƣa vào phân tích đột biến gen K13 thu thập đƣợc 54 phân lập P. falciparum tại Gia Lai để đánh giá nhạy cảm của KSTSR với với một số thuốc sốt rét. Trong đó 54 mẫu tiến hành nuôi cấy, tỷ lệ KST phát triển thành thể phân liệt ở giếng chứng trên 10% là 42/54 mẫu (77,7%). 3.3.1 Đặc điểm đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum trên các mẫu đƣa vào thử thuốc sốt rét

Bảng 3.30. Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu đƣa vào thử thuốc

TT Kiểu gen Tình trạng phân loại

Số lƣợng n=54 3 Đột biến P553L Tỷ lệ % 5,56 Xác định kháng 1

Đột biến C580Y 26 48,15 Xác định kháng 2

Đột biến C496F 3 5,56 Liên quan/ứng viên 3

Đột biến H384Q 0 0 Chƣa xác định vai trò 4

Đột biến Y511H 5 9,26 Chƣa xác định vai trò 5

Đột biến K503N 0 0 Chƣa xác định vai trò 6

Đột biến G638E 0 0 Chƣa xác định vai trò 7

Đột biến G639D 0 0 Chƣa xác định vai trò 8

Kiểu hoang dại 17 31,48 Nhạy với ART 9

100 Tổng 54

Nhận xét:

- Qua phân tích có 37/54 (68,52%) mẫu phát hiện có đột biến gen K13: Kiểu

đột biến C580Y chiếm 48,15% (26/54), P553L là 5,56% (3/54) là hai đột biến

xác định kháng artemisinin và Liên quan,ứng viên C496F là 5,56% (3/54)

Ngoài ra còn phát hiện vị trí đột biến Y511H là 9,26% (5/54) hiện chƣa xác

định vai trò.

Bảng 3.31. Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu nuôi cấy thành công

TT Kiểu gen Tình trạng phân loại

Số lƣợng n=42 2 Tỷ lệ % 4,76 Đột biến P553L Xác định kháng 1

Đột biến C580Y 20 47,62 Xác định kháng 2

Đột biến C496F 7,14 Liên quan/ứng viên 3 3

Đột biến H384Q 0 0 4 Chƣa xác định vai trò

Đột biến Y511H 4 9,52 5 Chƣa xác định vai trò

Đột biến K503N 0 6 0 Chƣa xác định vai trò

Đột biến G638E 0 7 0 Chƣa xác định vai trò

Đột biến G639D 0 8 0 Chƣa xác định vai trò

Kiểu hoang dại 13 9 30,95 Nhạy với ART

Nhận xét:

Tổng 42 100

- Qua phân tích có 29/42 mẫu phát hiện nhiều đột biến: Kiểu đột biến C580Y

chiếm 47,62% (20/42), P553L là 4,76% (2/42) là hai đột biến xác định kháng

artemisinin và đột biến ứng viên C496F 7,14% (3/42). Đột biến gen K13 vị trí

Y511H là 9,52% (4/42) hiện chƣa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay

liên quan hay vô nghĩa.

3.3.2. Đánh giá nhậy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum

với một số thuốc sốt rét

Tỷ lệ (%)

Nồng độ (nmol/l)

3.3.2.1. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với artesunat

Hình 3.12. Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc artesunat

- Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 trung bình của AS đối với 42 mẫu phân

lập P. falciparum là IC50 là 3,06 ± 3,10 nmol/L. Trong đó, giá trị IC50 thấp nhất là

0,41 nmol/L và cao nhất 14,55 nmol/L.

3.3.2.2. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với dihydroartemisinin

- Tƣơng tự nhƣ thuốc artesunat (AS), hiện nay dẫn suất diydroartemisinin

(DHA) là một trong những dẫn suất và là thành phần thuốc sốt rét quan trọng

trong các viên thuốc phối hợp có thành phần (ACTs).

- Dữ liệu cho thấy tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của DHA ở nồng độ

2 nmol/L là 38,6%, tƣơng ứng ở nồng độ 4 nmol/L là 67,8%, ở nồng độ 8

nmol/L là 87,2%, ở nồng độ 16 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 94% sự phát

triển thành thể phân liệt của P. falciparum nhƣng nồng độ thuốc cao gấp 2 lần

(32 nmol/L) cũng chƣa đủ để toàn bộ KST phát triển thành thể phân liệt.

Tỷ lệ (%)

Nồng độ (nmol/l)

Hình 3.13. Tỷ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc Dihydroartemisinin

- Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 trung bình của DHA đối với 42 phân lập

P. falciparum là IC50 là 2,95 ± 2,19 nmol/L. Giá trị IC50 thấp nhất là 0,52 nmol/L

và cao nhất là 9,94 nmol/L.

Tỷ lệ (%)

Nồng độ (nmol/l)

3.3.2.3. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với chloroquin

Hình 3.14. Tỷ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc Chloroquin

- Kết quả cho thấy ở nồng độ thuốc CQ là 100 nmol/L (nồng độ xác định

kháng CQ) ức chế đƣợc 76,5% số KST P. falciparum phát triển thành thể phân

liệt, ở nồng độ thuốc CQ là 200 nmol/L ức chế đƣợc trên 95% KST, ở nồng độ

thuốc cao nhất đƣợc thử nghiệm là 800 nmol/L ức chế đƣợc 100% KST phát

triển thành thể phân liệt. Giá trị IC50 trung bình thu đƣợc 67,7± 53,1 nmol/L.

- Giá trị IC50 thấp nhất là 12,3 nmol/L và cao nhất là 338,3 nmol/L. Trong đó,

có 21,4% (9/42) số mẫu ở bệnh nhân có IC50 >100 nmol/L (xác định kháng CQ).

Tỷ lệ (%)

Nồng độ (nmol/L)

Hình 3.15. Tỷ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc piperaquin

3.3.2.4. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với piperaquin

- Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình trên cho thấy tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể

phân liệt của PPQ ở nồng độ 50 nmol/L là 43,7%, tƣơng ứng ở nồng độ 100

nmol/L là 94,5%, ở nồng độ 200 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 95% sự phát

triển thành thể phân liệt của KST P. falciparum nhƣng nồng độ thuốc cao gấp 2

lần (32 nmol/L) cũng chƣa đủ để toàn bộ KST phát triển thành thể phân liệt.

- Giá trị IC50 trung bình thu đƣợc 43,5 ± 24,9 nmol/L, giá trị IC50 thấp nhất là

4,66 nmol/L và cao nhất là 105,8 nmol/L.

3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum

với một số thuốc sốt rét trên in vitro tại Gia Lai

3.3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các mẫu nuôi cấy

Bảng 3.32. So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các mẫu nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy Kiểu gen P (n=42) IC50 (nmol/L)

Có đột biến K13 liên quan đến 25/42 3,50 kháng ART

0,0034 Kiểu hoang dại hoặc đột biến

K13 không liên quan đến 17/42 2,18

kháng ART

Nhận xét:

Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột

biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50 của thuốc artesunat trung bình là 3,50 nmol/L và có 17/42 mẫu Không có đột biến

K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số

IC50 trung bình là 2,18 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có đột biến là 3,50. Sự khác biệt của 2 nhóm này có ý nghĩa thống kê với (p < 0,05)

3.3.3.2. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquine trên các mẫu nuôi cấy

Bảng 3.33. So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquin trên các mẫu nuôi cấy

Kiểu gen Mẫu nuôi cấy (n=42) IC50 (nmol/L)

25/42 75,23 Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART

17/42 52,99 Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART

Nhận xét:

Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột

biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, trong đó có 6/25 mẫu có chỉ số

các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình của thuốc chloroquine là 75,23 nmol/L

trong đó có 6/25 mẫu có chỉ số IC50 >100nmol/L. Có 17/42 mẫu Không có đột

biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ

số IC50 trung bình là 52,99 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có đột biến trong 17

mẫu này có 3/17 mẫu có chỉ số IC50 >100nmol/L (IC50 trên 100nmol/L là nồng

độ kháng CQ).

3.3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC50 của thuốc dihydro

artemisinin trên các mẫu nuôi cấy

Bảng 3.34. So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc dihydro artemisinin trên

các mẫu nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy IC50 Kiểu gen P (n=42) (nmol/L)

Có đột biến K13 liên quan đến 25/42 3,53 kháng ART 0,0062 Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 17/42 2,37 không liên quan đến kháng ART

Nhận xét:

Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột

biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50

trung bình của thuốc dihydro artemisinin là 3,53 nmol/L và có 17/42 mẫu

Không có đột biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các

mẫu này có chỉ số IC50 trung bình là 2,37 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có

đột biến. Sự khác biệt của 2 nhóm này có ý nghĩa thống kê với (p < 0,05).

3.3.3.4 Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC50 của thuốc piperaquine trên

các mẫu nuôi cấy

Bảng 3.35. So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc piperaquin trên các mẫu

nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy IC50 (95% CI) Kiểu gen (n=42) nmol/L

Có đột biến K13 liên quan đến 25/42 41,81 kháng ART

Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 17/42 44,30 không liên quan đến kháng ART

Nhận xét:

Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13

liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình của

thuốc piperaquine là 41,81 nmol/L và có 17/42 mẫu Không có đột biến K13

hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số IC50

trung bình là 44,30 nmol/L cao hơn so với các mẫu có đột biến.

Chƣơng 4

BÀN LUẬN

Sau thời gian tiến hành nghiên cứu từ năm 2016-2018 thu thập 292 mẫu

phân lập nhiễm đơn thuần P. falciparum phân tích các chỉ điểm phân tử đột biến

gen K13 liên quan đến kháng thuốc artemisinin và thử nghiệm lâm sàng đánh giá

hiệu lực thuốc trên in vivo, in vitro tại các vùng sốt rét lƣu hành nặng của 5 tỉnh

Bình Phƣớc, Gia Lai, Ninh Thuận, Khánh Hòa, Quảng Trị chúng tôi có một số

bàn luận sau:

4.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của

Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh

Thuận, Quảng Trị có sốt rét lƣu hành nặng năm 2016 - 2018

Theo Tổ chức Y tế Thế giới đến năm 2019 trên thế giới vẫn còn khoảng

một nửa dân số có nguy cơ mắc sốt rét với số trƣờng hợp mắc sốt rét khoảng 229

triệu ngƣời. So với năm 2010 thì số bệnh nhân sốt rét sau 10 năm giảm khoảng

8,8% (năm 2010 có 251 triệu bệnh nhân sốt rét). Bệnh nhân mắc sốt rét chủ yếu

thuộc khu vực Châu Phi, năm 2019 số bệnh nhân sốt rét ở khu vực này chiếm tới

94% tổng số bệnh nhân sốt rét toàn. Có 5 loài KSTSR thuộc giống Plasmodium

gồm: P. falciparum, P. knowlesi, P. vivax, P. malariae, P. ovale và P. ovale. Sự

phát triển các công cụ phân tử mới cũng nhƣ áp dụng các kỹ thuật giải trình tự

thế hệ mới (next generation sequencing-NGS) và tiếp cận sinh học hiện đại đã

cải tiến về phân tích dữ liệu dịch tễ học, chẩn đoán, điều trị, giám sát và phát

triển vaccine. Từ khi lần đầu tiên bộ gen của P. falciparum đƣợc giải trình tự vào

năm 2002, việc điều tra khía cạnh di truyền và mức độ phân tử trong các quần

thể P. falciparum khác nhau cùng với các nghiên cứu về protein (tập trung vào

việc xác định cấu trúc ba chiều của protein, sự tƣơng tác và chức năng của nó) và

nghiên cứu về bộ phiên mã - tập hợp đầy đủ các bản sao RNA đƣợc tạo ra bởi bộ

gen (transcriptomics)cho thấy tầm quan trọng của các tiếp cận phân tử này trong

lộ trình loại trừ sốt rét (José Antonio Garrido-Cardenas và cs., 2019) [63].

100

Nghiên cứu bộ gen đã phát hiện ra các đột biến điểm trên gen kelch13 liên

quan đến quá trình làm chậm sạch KST thể vô tính sau điều trị thuốc ACTs trên

các bệnh nhân. Đột biến trên các domain β-propeller và BTB/POZ của protein

giống kelch đã đƣợc mã hóa là PF3D7_1343700 trên nhiễm sắc thể số 13

(Cheeseman và cs., 2012; Ariey và cs., 2014) [40]. Các thuốc này hiện nay đƣợc

coi là các thuốc đầu tay để điều trị sốt rét kháng thuốc và giúp làm giảm tỷ lệ

mắc và tử vong. Tuy nhiên, kháng artemisinin ở P. falciparum đƣợc cho là một

vấn đề nghiêm trọng trong lộ trình LTSR. Ít nhất 20 đột biến gen K13 đƣợc xác

định có liên quan đến quá trình chậm làm sạch KSTSR sau điều trị và ảnh hƣởng

này có liên quan đến protein kelch13 (Miotto O và cs., 2015) [72].

Phần lớn các đa hình đơn nucleotid (SNPs), dù có tần số cao hay thấp đều

có liên quan đến một hiện tƣợng tự về thời gian bán thải sạch KST. Hầu hết các

đột biến xuất hiện ở vùng từ acid amino 440 về phía trƣớc trong đó kiểu C580Y

phổ biến và phân bố rộng nhất, sự xuất hiện này không lệ thuộc vào các vùng địa

lý khác nhau (Ajogbasile FV và cs., 2022) [42].

Mối liên quan giữa hiện tƣợng chậm sạch KST này với các đột biến gen

K13 đã đƣợc chứng minh trên mô hình các thử nghiệm in vitro và /hoặc in vivo.

Do vậy, giám sát KSTSR là cần thiết để cảnh báo về hiệu lực artemisinin và dẫn

suất bị suy giảm dƣới 90% (WHO, 2016) vì những gì mà chúng ta đang chú ý về

các đột biến này trƣớc hết là vị trí địa lý và sau đó đã đƣợc xác định. Trong khi

các hình thức kháng artemisinin liên quan đến đột biến K13 đã xuất hiện tại Việt

Nam, Thái Lan, Campuchia và Myanmar và hiếm khi thực hiện in vitro tại các

ƣớc Đông Nam Á nhƣ Lào, Bangladesh cũng nhƣ các nƣớc châu Phi [95]. Các

chỉ điểm cơ bản gồm arps10 và mdr2 trên nhiễm sắc thể 14, fd trên nhiễm sắc

thể số 13 và crt trên nhiễm sắc thể số 7 (Miotto O và cs., 2015), đồng thời ngƣời

ta phỏng đoán mỗi chỉ điểm phân tử đóng một vai trò khác nhau dù ý nghĩa chƣa

đƣợc biết chính xác [72].

Hơn thập niên qua, hầu hết các nƣớc có lƣu hành sốt rét P. falciparum đã

thay đổi chính sách điều trị của quốc gia dùng ACTs dù nhiều nƣớc vẫn chƣa

101

làm nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc (TES). Sự phát triển kháng artemisinin

là một thành phần thuốc quan trọng trong viên ACTs là một mối quan tâm y tế

công cộng.

Kháng thuốc xảy ra nhƣ một hậu quả của nhiều yếu tố, kể cả khâu thực

hành điều trị kém, sai, bệnh nhân tuân thủ dùng thuốc kém với toàn bộ liệu trình

và dùng rộng rãi liệu pháp thuốc đơn trị liệu đƣờng uống thời gian dài và đột

biến gen trên quần thể KSTSR P. falciparum tại Đông Nam Á [13], [21], [87].

Áp dụng giải trình tự toàn bộ bộ gen của dòng KST kháng artemisinin tại

châu Phi [61] và các phân lập lâm sàng thu thập từ Campuchia [70], các đột biến

PF3D7_1343700 trên domain vùng cánh quạt („K13-propeller‟) với kháng

artemisinin trên in vitro và in vivo là có liên quan. Tính đa hình vùng gen K13

góp phần nhƣ chỉ điểm phân tử hữu ích để giám sát diện rộng hơn, ngăn chặn

kháng artemisinin tại khu vực GMS va ngăn chặn lan rộng ra toàn cầu [104].

Trình tự DNA của các phân lập đƣợc so sánh với trình tự gen tham khảo

chủng 3D7 P. falciparum mang gen kiểu hoang dại (wildtype-WT), đây là chủng

chuẩn, nhạy cảm với thuốc artemisinin và dẫn suất sẵn có dữ liệu trên ngân hàng

gen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) với mã số XM_001350122.1, sử dụng thuật

toán ClustalW trên Bioedit V.7.0.5.3 phân tích. Trên cơ sở gen K13 đƣợc nhân

bản bằng kỹ thuật PCR lồng với các cặp mồi đƣợc thiết kế theo đề cƣơng của tác

giả Ariey và cộng sự (2014), phân tích giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger

trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3500 (Mỹ) [40].

Tổng số 292 mẫu phân lập P. falciparum thu thập trên bệnh nhân sốt rét

vào giấy thấm Whatman 3MM, trong số này tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm đa số

trong đó tỷ lệ cao nhất là Ninh Thuận (93,2%), thấp nhất là quảng trị (63,3%).

Đa số bệnh nhân tham gia nghiên cứu ở độ tuổi ≥ 15 tuổi, tỷ lệ này cao nhất ở

Gia Lai (88,9%) và thấp nhất ỏ Khánh Hòa (59,6%), đây cũng là độ tuổi tƣơng

đối trƣởng thành bắt đầu tham gia vào lực lƣợng lao động phụ giúp gia đình. Tỷ

lệ này cũng phù hợp với báo cáo về tình hình mắc sốt rét tại Việt Nam chủ yếu là

nam giới ở độ tuổi trên 15 tuổi có liên quan đến đi rừng, ngủ dẫy [28]. Tất cả các

102

mẫu đƣợc phân tích đầy đủ để tìm đột biến gen K13 và số mẫu có đột biến gen

K13 chung là 135/292 (46,23%). Trong đó, tỷ lệ số mẫu có đột biến gen K13 tại

mỗi tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Quảng Trị và Ninh Thuận, lần lƣợt là

97,44% (38/39), 62,03% (67/108), 32,75% (17/52), 20,41% (10/49) và 6,82%

(3/44). Bình Phƣớc là tỉnh có tỷ lệ đột biến gen K13 cao nhất cũng là tỉnh có tiếp

giáp với Campuchia là tỉnh có báo cáo kháng thuốc ART đầu tiên[103] và số liệu

này tƣơng tự nhƣ một phân tích về các chỉ điểm phân tử đột biến gen K13 tại

Bình Phƣớc năm 2017-2018 của Trƣơng Văn Hạnh và cộng sự (2017) [10].

Nghiên cứu này cho thấy tất cả mẫu có đột biến gen K13 tại vùng sốt rét

tỉnh Bình Phƣớc đều là loại đột biến C580Y, chiếm 97,44% (38/39) và đây cũng

là loại đột biến phổ biến nhất trên quần thể P. falciparum tại các nƣớc Tiểu vùng

Sông Mê Kông có kháng thuốc ghi nhận. Tƣơng tự, các mẫu thu thập tại các

vùng SRLH của tỉnh Gia Lai với 28/48 mẫu biểu hiện nhiều loại đột biến, trong

đó loại C580Y chiếm 43,75% (21/48) là chủ yếu, tiếp đến là P553L với 6,25%

(3/48) là các loại đột biến xác định kháng artemisinin và 1 loại đột biến ứng viên

hay chỉ liên quan C496F là 4,17% (2/48). Kiểu đột biến tại vị trí 1739 trên chuỗi

trình tự nucleotide của gen K13, thay nucleotide G (Guanine) bằng A (Adenin).

Đột biến dẫn tới sự thay đổi axit amin từ Cysteine (C) thành Tyrosine (Y) trong

trình tự a.a trong chuỗi polypeptide tại vị trí 580, riêng kiểu đột biến C469F cũng

là đột biến liên quan kháng artemisinine của quần thể P. falciparum. Đột biến

này xuất hiện với tỷ lệ thấp và chỉ phát hiện đƣợc tại Gia Lai. Đột biến tại vị trí

1406 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen K13, thay nucleotide G (Guanine)

thành T (Thymine), dẫn tới sự thay đổi a.a từ C (Cytosine) thành F

(Phenylalanine) trong trình tự a.a trong chuỗi polypeptid tại vị trí 469 qua hình

ảnh mô tả dịch mã ADN trên gen K13 ở vị trí đột biến 469 trên chuỗi

polypeptide [40].

Tại Ninh Thuận, phân tích cho thấy chỉ có 3/44 ca (6,82%) chỉ phát hiện

đƣợc có 1 điểm đột biến là C580Y, là đột biến xác định kháng thuốc artemisinin

103

và cũng là tỉnh có tỷ lệ đột biến gen K13 thấp nhất trong 5 tỉnh nghiên cứu. Bệnh

nhân tham gia nghiên cứu chủ yếu là nam (93,2%) có độ tuổi trên 15 tuổi

(75%). Kết quả này cũng tƣơng ứng với kết quả nghiên cứu trƣớc đó năm 2012

[22].

Tại huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa, với tổng số 52 mẫu phân tích đột

biến gen K13 cho thấy ngoài hai loại đột biến xác định kháng là C580Y chiếm

5,77% (3/52) và P553L là 21,15% (11/52). Ngoài ra, phân tích các mẫu tại tỉnh

Khánh Hòa còn có ba loại đột biến khác gồm kiểu hình H384Q, G638E, G639D

có tỷ lệ 5,77% (3/52) hiện chƣa xác định vai trò vì các đột biến này hiện các nhà

khoa học chƣa đánh giá trên cả in vitro cũng nhƣ đo nồng độ thuốc, nên chƣa thể

xác định vai trò liệu có thể khẳng định kháng hay có liên quan/ đột biến ứng viên

hoặc đột biến vô nghĩa. Đồng thời, tại các điểm của tỉnh Quảng Trị, có 49 mẫu

thu thập phân tích đột biến gen K13 cho thấy chỉ có loại đột biến loại C580Y là

20,41% (10/49) và chƣa xác định thêm kiểu đột biến K13 nào khác.

Mẫu phân lập P. falciparum chỉ ra đột biến gen K13 phổ biến liên quan

kháng artemisinine là C580Y trên quần thể P. falciparum với tỷ lệ lần lƣợt

97,44%; 43,75%; 6,82%; 5,77% và 20,41% tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Quảng Trị,

Khánh Hòa và Ninh Thuận. Điểm đột biến P553L cũng là chỉ điểm xác định

kháng artemisinin chỉ phát hiện ở Gia Lai, Khánh Hòa mà chƣa thấy ở các tỉnh

khác với tỷ lệ lần lƣợt là 65,56% và 21,15%. Kiểu đột biến P553L cũng là đột

biến có vai trò quan trọng nằm trong nhóm đột biến gen K13 khẳng định kháng

artemisinine. Kiểu đột biến P553L xảy ra tại vị trí 1658 trên chuỗi trình tự

nucleotide gen K13, thay nucleotide C (Cytosine) thành T (Thymine), dẫn tới

thay đổi acid amin từ P (Proline) thành L (Leucine) trong trình tự acid amin

trong chuỗi polypeptid tại vị trí 553.

Loại đột biến C469F cũng là đột biến liên quan kháng artemisinine của

quần thể P. falciparum. Đột biến này xuất hiện với tỷ lệ thấp và chỉ phát hiện

đƣợc tại Gia Lai. Đột biến tại vị trí 1406 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen

K13, thay nucleotide G (Guanine) thành T (Thymine), dẫn tới sự thay đổi acid

104

amin từ C (Cytosine) thành F (Phenylalanine) trong trình tự acid amin trong

chuỗi polypeptid tại vị trí 469 qua hình ảnh mô tả dịch mã ADN trên gen K13 ở

vị trí đột biến 469 trên chuỗi polypeptide và C469F có thể liên quan đến kháng

chỉ có ở Gia Lai với tỷ lệ 4,17% và kiểu đột biến P553L hiện chỉ phát hiện ở

huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa và các huyện Ia Pa và Krông Pa của tỉnh

Gia Lai, mà chƣa thấy ở các vùng SRLH của tỉnh khác.

Về cơ sở phân tử kháng thuốc, thuốc hoạt động trên các vị trí đích nội bào

khác nhau. Phần lớn chúng can thiệp vào các không bào tiêu hóa (digestive

vacuole-DV) trong khi một số khác ảnh hƣởng đến các bào quan khác nhƣ bào

tƣơng, ty thể, apicoplast và màng KSTSR. Sự phân bố nội bào của KSTSR dựa

vào khả năng hòa tan, khả năng thấm qua màng tế bào và ái lực liên kết với các

chất vận chuyển điều hòa việc vận chuyển thuốc qua các ngăn nội bào. Đối với

Plasmodium spp, hai loại chất vận chuyển làm trung gian vận chuyển

xenobiotics đến DV: Chất vận chuyển liên quan đến p-glycoprotein (bao gồm

Pfmdr-1 (P.falciparum đa kháng thuốc 1), Pfmdr-2 và Pfmrp (protein liên quan

đến kháng đa thuốc của P. falciparum) và hệ thống vận chuyển chất chuyển hóa

thuốc (drug metabolite transporter-DMT) đƣợc đại diện bởi Pfcrt (chất vận

chuyển của P. falciparum kháng CQ) [47], [94].

Các cơ chế kháng thuốc đƣợc mô tả cho đến nay là đột biến hoặc thay đổi

số lƣợng bản sao gen liên quan đến các vị trí đích của thuốc (ví dụ: Pfdhfr) hoặc

các protein vận chuyển (ví dụ: Pfmdr) ảnh hƣởng đến nồng độ của thuốc. Các

đột biến khác nhau đƣợc quan sát thấy ở các chủng P. falciparum khác nhau.

Các chất vận chuyển đột biến làm tăng hiệu quả của thuốc miễn là chúng đƣợc

trộn vào vị trí đích của chúng. Nói cách khác, nếu mục tiêu của thuốc là

intracytosolic, thì hiệu lực của nó sẽ tăng lên khi các chất vận chuyển ngăn cản

sự tích tụ của nó trong khoang ống tiêu hóa [47]. Các khía cạnh di truyền tạo ra

kháng thuốc mà không gây tổn hại nghiêm trọng đến KSTSR là tự phát và hiếm

gặp, chúng xảy ra độc lập với thuốc nhƣng sau đó đƣợc chọn lọc bởi thuốc giết

chết chủng P. falciparum nhạy cảm nhƣng không giết chết chủng kháng thuốc.

105

Việc kháng artemisinin đe dọa lộ trình LTSR tại châu Á vào năm 2030 và

làm thất bại các thành quả của PCSR trong các vùng SRLH khác. Việc nghiên

cứu đột biến gen K13 kháng artemisinin trên P. falciparum sẽ giúp cho các nhà

làm chính sách thay đổi chính sách thuốc. Một phân tích tổng hợp theo mô hình

giám sát các chỉ điểm phân tử theo không gian và thời gian của Mạng lƣới kháng

thuốc sốt rét toàn cầu (WWARN) liên quan cơ sở dữ liệu kháng artemisinin từ

năm 1991-2021. Dữ liệu thu thập từ 72 nghiên cứu gồm chỉ điểm gen K13 từ

16.613 mẫu máu từ 18 quốc gia. Hầu hết các mẫu từ Myanmar 3.842 (23,1%),

Campuchia 3.804 (22,9%) và Việt Nam 2.663 (16%), có sự gia tăng từ từ tỷ lệ

đột biến gen K13, thấp nhất là 4,3% năm 2005 (n=47) và cao nhất la 62,9% năm

2018 (n=264). Tổng thể cho thấy tỷ lệ đột biến C580Y tăng từ 48,9% năm 2002

lên 84,9% năm 2018, số liệu cũng chỉ ra có sự tăng từ từ ở các vùng địa lý và tỷ

lệ bệnh nhân có chỉ điểm xác định kháng artemisinin, tuy nhiên các dữ liệu y văn

đƣợc báo cáo theo hƣớng khác nhau, không thống nhất dẫn đến khó khăn trong

gộp số liệu và phiên giải kết quả (Frank M Kagoro và cs., 2022) [54].

So sánh với một số nghiên cứu phân tích di truyền liên quan kháng thuốc

artemisinine và dẫn suất khác nhau (artesunat hay dihydroartemisinins), số liệu

đột biến gen K13 liên quan kháng artemisinine trên tất cả phân lập P. falciparum

có dùng thuốc DHA-PPQ hay artesunat đơn thuần để điều trị sốt rét do P.

falciparum thấy đột biến có ý nghĩa gồm nhiều loại khác nhau, khá đa dạng.

Số liệu phân tích các đột biến liên quan kháng artemisinin và dẫn suất cho

thấy, ngoại trừ đột biến hoang dại (wild type) và trong các phân lập thì loại đột

biến có ý nghĩa xác định kháng chiếm ƣu thế và nổi trội là loaị C580Y và đây

cũng là loại đột biến chiếm tỷ lệ cao nhất tại các vùng SRLH có kháng thuốc

artemisinin ở các nƣớc trong Tiểu vùng Sông Mê Kông mở rộng (WHO,

2018)[105] và là một trong 5 loại đột biến quan trọng xác định kháng

artemisinine đã đƣợc minh chứng. Đặc biệt, các ca tồn tại thể vô tính P.

falciparum đến ngày D3 đều có đột biến gen K13 kiểu C580Y đã đƣợc công

nhận và chứng minh nhƣ ở Campuchia, Myanmar.

106

Một nghiên cứu phân tử giám sát sự đa hình đơn nucleotide (SNPs) của quần

thể P. falciparum kháng thuốc artemisinin tại phía Nam Pakistan (Najia Karim

Ghanchi và cs., 2021)[79] cho thấy tính đa hình của gen K13 là chỉ điểm phân tử

hữu ích để truy tìm sự xuất hiện và lan rộng kháng artemisinin trên quần thể P.

falciparum. Tính đa hình đƣợc báo cáo ở Campuchia có quá trình xâm nhập nhanh

vào trong quần thể và hầu nhƣ cố định ở Đông Nam Á [79]. Phân tích số liệu ở

phía Nam Pakistan cho thấy qua 249 mẫu từ bệnh nhân nhiễm P. falciparum đến

khám tại Bệnh viện đại học Aga Khan từ 2015-2018. ADN đƣợc tách chiết theo

quy trình QIAmp DNA blood kit. Gen cánh quạt K13 đƣợc khuếch đại bằng

nested-PCR. Giải trình tự double-strand cho sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp giải

trình tự Sanger và trình tự đƣợc phân tích bằng chƣơng trình MEGA 6 và phần

mềm Bio-edit để xác định các phối hợp đa hình đơn nucleotide đặc biệt. Tất cả

phân lập đƣợc phân tích để đánh giá các alen K13 trên các mẫu sau khi điều trị

ACT tại Pakistan.

Kiểu biến thể C580Y, A675V, Y493H và R539T liên quan đến giảm tính

nhạy với thuốc ACTs không tìm thấy trong nghiên cứu này. Tần số các đa hình đột

biến M476I và C469Y tìm thấy thấp liên quan có ý nghĩa thống kê với kháng

artemisinin. Các tần số các đa hình đồng nghĩa và không đồng nghĩa quan sát trên

các phân lập P. falciparum lƣu hành tại Pakistan thấp. Sự thiếu vắng các chỉ điểm

phân tử kháng artemisinin trong vùng này giúp giải thích cho hiệu lực thuốc ACTs

vẫn còn cao. Giám sát kháng thuốc để phát hiện sự xuất hiện và lan rộng là cần

thiết.

Nghiên cứu phân tử đột biến gen K13 liên đới kháng thuốc artemisinin trên

loài P. falciparum tại Nigeria (Fehintola V. Ajogbasile và cs., 2022) [53] để giám

sát đột biens gen K13 (Pfk13) liên quan đến kháng artemisinin là rất cần thiết để

hiểu biết về sự xuất hiện và lan rộng của KSTSR kháng thuốc tại các vùng SRLH.

Trong nghiên cứu này, đánh giá hồ sơ di truyền của gen Pfk13 liên quan đến kháng

artemisinin trên P. falciparum trên các trẻ em Nigeria thông qua giải trình tự đích

của gen Pfk13. Tách chiết DNA từ 332 mẫu máu khô trên giấy thấm (DBS) từ ba

107

bang của Nigeria [53]. Gen Pfk13 đƣợc khuếch đại qua PCR lồng và amplicon để

phát hiện các đa hình đã biết và đa hình mới trên gen. Giải trình tự các mẫu dựa

trên dữ liệu trên Trung tâm thông tin sinh tin quốc gia Mỹ (National Center for

Biotechnology Information-NCBI).

Tất cả có 13 đa hình đơn nucleotide (SNPs) đƣợc phát hiện trên gen Pfk13, 5

kiểu đột biến (F451L, N664I, V487E, V692G và Q661H) chƣa từng đƣợc báo cáo

tại các vùng SRLH của nƣớc khác nên đây có lẽ là kiến thức tốt cho nghiên cứu.

Ba kiểu đột biến V692G, N664I và Q661H và một đa hình không mới là C469C

liên đới đến thất bại KSTSR muộn tại 2 bang Enugu và Plateau. Không có loại đột

biến xác định kháng artemisinin trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, một sự liên quan

của nghiên cứu với các kiểu hình in vivo và in vitro cần thiết để thiết lập vai trò

chức năng của các chỉ điểm kháng artemisinin tại Nigeria [53].

So sánh số liệu của Nguyễn Thị Minh Trinh và cộng sự (2016) [32] và

Nguyễn Thị Liên Hạnh và cộng sự (2017) [9] với 55 ca nhiễm đơn thuần P.

falciparum ngày D0 về đột biến gen đơn nucleotide đa hình (SNP) vùng cánh

quạt của K13 cho tỷ lệ 28/55 ca (50,9%) có đột biến K13, trong đó loại đột biến

C580Y chiếm ƣu thế 21/28 ca (75%) và P553L là 8 ca (14,5%). Trong khi đó các

đột biến khác chƣa xác định vai trò là P574L 2 ca (3,6%). Đồng thời so sánh các

kết quả phân tích phân lập thu thập qua các nghiên cứu TES đa trung tâm áp

dụng thuốc DHA-PPQ điều trị sốt rét do P. falciparum chƣa biến chứng tại các

điểm SRLH của các huyện Krông Pa (Gia Lai), huyện Tuy Đức và Cƣ Jut (Đăk

Nông), huyện Nam Trà My (Quảng Nam), huyện Bù Đăng và Bù Gia Mập (Bình

Phƣớc) và các nghiên cứu đa trung tâm đánh giá mặt dịch tễ học di truyền gen

kháng thuốc 8 tỉnh Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Ninh Thuận, Khánh Hòa,

Quảng Nam, Quảng Bình, Quảng Trị hợp tác nghiên cứu giữa Viện Sốt rét-KST-

CT Quy Nhơn với Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU-

Anh), nhóm nghiên cứu cũng đã phân tích đột biến liên quan hay có ý nghĩa phù

hợp với kháng artemisinin [75] và điểm đặc biệt trong năm 2021 và đầu năm

108

2022 có sƣ thay đổi về tỷ lệ các đột biến sau khi Việt Nam đã chuyển đổi chính

sách thuốc dùng Pyramax thay thế cho DHA-PPQ đã bị kháng [111].

Số liệu cho thấy các mẫu máu trên giấy thấm của bệnh nhân nhiễm đơn

thuần P. falciparum về đột biến gen đơn nucleotide đa hình (SNP) vùng cánh

quạt của K13 propeller cho tỷ lệ 135/292 ca P. falciparum (46,23%) có đột biến

gen K13, đột biến có ý nghĩa liên quan xác định kháng thuốc ART C580Y

(35,27%) và P553L (6,16%), đột biến có liên quan đến kháng ART C496F

(1,37%) các đột biến chƣa rõ vai trò (K503N, Y511H, H348Q, G638E, G639D).

Điều này phù hợp với số liệu phân tích quy mô toàn quốc trên quần thể ký sinh

trùng P. falciparum tại các vùng lƣu hành sốt rét ở Việt Nam từ năm 2009-2016

(Nguyễn Thanh Thùy Nhiên và cs., 2017) [75] ghi nhận sự lan rộng của chủng

P. falciparum kháng với artemisinine đƣợc coi là mối de dọa quan trọng cho

những sáng kiến toàn cầu về Phòng chống và Loại trừ sốt rét đang thực hiện.

DHA-PPQ thuốc duy nhất ACTs tại Việt Nam đƣợc lựa chọn điều trị cho P.

falciparum [2], nếu các bằng chứng sinh học phân tử kết hợp với dữ liệu về hiệu

lực thuốc DHA-PPQ suy giảm trên test in vivo đến mức cảnh báo thì phải thay

đổi phác đồ tại các vùng kháng thuốc này bằng loại ACTs khác, hiện tại một số

tỉnh ở Việt Nam ở những vùng đã có bằng chứng về kháng thuốc đã phải chuyển

sang sử dụng Pyramax điều trị cho P. falciparum [3].

Vùng gen K13 là một chỉ điểm phân tử liên đới đến kháng artemisinin đƣợc

WHO công nhận đã đƣợc giải trình tự trên 1.060 phân lập P. falciparum của 3

điểm nóng sốt rét tại Việt Nam. Số liệu cho thấy đột biến gen K13 gồm T474I,

T493H, A539T, I543T, P553L, V568G, P574L và loại C580Y có và chƣa liên

quan đến kháng artemisinin cũng đƣợc tìm thấy. Tần suất đột biến K13 từ 29%

(222/767), 6% (11/188) và 43% (45/105) lần lƣợt ở vùng SRLH thuộc các tỉnh

Bình Phƣớc, Ninh Thuận và Gia Lai [10],[32],[84]. Đột biến C580Y trở thành

kiểu gen nổi trội trong những năm gần đây với tỷ lệ 79,1% (34/43) phân lập ở

Bình Phƣớc năm 2015 [75] và 63% (17/27) phân lập ở Gia Lai [75]. Đồng thời,

nghiên cứu đột biến gen K13 cũng có liên quan đến tính nhạy của thể tƣ dƣỡng

109

nhẫn của P. falciparum với thành phần dihydroartemisinin (DHA) trên thử

nghiệm in vitro và thời gian làm sạch KSTSR kéo dài trên test in vivo. Tiếp đó,

một phân tích cánh haplotyp K13 cũng chỉ ra hiện diện của đa chủng có tính đa

dạng đột biến C580Y hơn là đơn chủng (strain) trên khắp 3 vùng khảo sát của

nghiên cứu đa trung tâm này [75].

Tỷ lệ quần thể P. falciparum có đột biến K13 ở Ninh Thuận và Gia Lai qua

phân tích 188 mẫu phân lập thu thập tại xã Phƣớc Thắng, huyện Bác Ái, tỉnh

Ninh Thuận giữa từ năm 2013-2016 cho thấy đột biến K13 chỉ có 11/188 phân

lập (6%) bào gồm các đột biến trên các alen khác nhau (T493H, I543T, C580Y).

Tại vùng này, các đột biến T493H dƣờng nhƣ bị thay thế bởi đột biến C580Y

qua ba lần thu thập mẫu. Tuy nhiên, tần suất xuất hiện các đột biến không thay

đổi tăng có ý nghĩa qua ba lần [75]. Riêng tại tỉnh Gia Lai, tổng số 105 phân lập

thu thập, trong đó tại xã Iato, huyện Ia Grai trong thời gian 2011-2012 và tại

TTYT huyện Krông Pa từ năm 2014-2016, phân tích kết quả cho thấy không có

đột biến ở trên 21 mẫu thu thập trong thời gian (2011-2012), ngƣợc lại đột biến

K13 chiếm tỷ lệ cao tìm thấy trên quần thể P. falciparum trong thời gian thu thập

mẫu (2014-2015) với 14/57 (24,6%) phân lập mang đột biến C580Y, 9/57 mẫu

(15,8%) phân lập mang đột biến P553L và 5/57 (8,8%) phân lập mang đột biến

với tần suất thấp hơn, gồm các loại A539T, V568G, P574L [75].

Trong giai đoạn (2015-2016), đột biến C580Y là loại đột biến K13 duy nhất

đƣợc phát hiện trên 63% số phân lập (17/27). Tần suất chung đột biến K13 tại

Gia Lai là 45/105 (43%). Mối liên quan giữa đột biến K13 với sự làm sạch 50%

tải lƣợng KST trên lâm sàng đƣợc xác lập và hầu hết bệnh nhân nhiễm P.

falciparum có đột biến với K13 alen có thời gian làm 50% lƣợng KST là 5 giờ,

trong khi thời gian này ở nhóm không có đột biến K13 mà chỉ có đột biến hoang

dại, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) [75].

Một nghiên cứu khác tại xã Ma Nới huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận có

phân tích di truyền tìm đột biến gen K13 này có phần tƣơng tự một số phân lập

thu nhận ở các tỉnh khác trong khu vực miền Trung-Tây Nguyên, đánh giá đột

110

biến điểm trên gen mã hóa cho protein Kelch-13. Dữ liệu cho thấy nhiều kiểu đột

biến khác nhau kể cả loại hoang dại, loại đột biến có liên quan hoặc không liên

quan đến kháng thuốc (P553L, A481V, V568G) và loại đã xác định liên đới chặt

chẽ với kháng thuốc (C580Y) theo phân loại của WHO [22].

Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 200 đột biến không đồng nghĩa

trên vùng gen K13 đã đƣợc báo cáo [44]. Các alen riêng biệt có đột biến K13 có

nguồn gốc xuất hiện khác nhau ở các quốc gia Đông Nam Á. Dự án nghiên cứu

về đánh giá đột biến gen K13 liên quan kháng thuốc artemisinin (K13

Artemisinin Resistance Multicenter Assessment Consortium- dự án KARMA) để

thiết lập bản đồ kháng phân tử toàn cầu (Global mapping of antimalarial

resistance) tại Viện Pasteur Campuchia sau khi phân tích số lƣợng mẫu, báo cáo

tần suất các đột biến gen K13 loại C580Y, R539T, Y493H và I543T ở vùng phía

đông của Tiểu vùng Sông Mê Kông (gồm Campuchia, Lào, Việt Nam) và tần

suất các đột biến F446L, N458Y, P574L và R561H có mặt ở phía tây của Tiểu

vùng sông Mê Kông (Trung Quốc, Myanmar, Thái Lan) và alen P553L đƣợc tìm

thấy ở cả hai vùng [44], [107].

Bằng chứng về khả chọn lọc khắp Tiểu vùng sông Mê Kông hiện tại thấy

rằng đột biến K13 loại đột biến C580Y có thể tìm thấy nhƣ là di truyền kiểu gen

đơn bội khắp khu vực tiểu vùng sông mê kông (GMS) [107]. Tỷ lệ của một đột

biến K13 C580Y kiểu gen đơn bội đặc biệt đang gia tăng, thay bằng một kiểu

gen đơn bội khác ở bờ tây Campuchia, đông bắc Thái Lan và phía nam Lào. Tuy

nhiên, tần suất K13 loại C580Y thay đổi khác nhau từng vùng và không có kiểu

gen đơn bội nổi trội khắp các vùng của GMS (WHO, 2017) [104].

Một nghiên cứu hồi cứu giám sát phân tử đột biến gen K13 và chỉ điểm

Pfcrt về kháng artemisinin trên các phân lập của P. falciparum đã đƣợc báo cáo

ở phía Đông Trung Quốc từ 2015-2019 (Xiangli Kong và cs., 2022) [114] phân

tích tỷ lệ và sự phân bố các chỉ điểm phân tử này trên các mẫu phân lập nhiễm P.

falciparum ngoại lai ở tỉnh Shandong [114]. Thông tin dịch tễ từng cá nhân đƣợc

điều tra trên 425 mẫu P. falciparum phân tích thấy có 7,3% (31/425) mẫu mang

111

đột biến gen K13. Ngoài các phân lập mang đột biến K13, còn có 54,8% (17/31)

mẫu có tính đa hình không đồng nghĩa. Các alen đột biến A578S, Q613H,

C469C và S549S trên gen K13 thƣờng có mặt hơn, tỷ lệ các đột biến là nhƣ nhau

0,7% (3/425). Các alen C580Y có mối liên quan chặt chẽ với kháng artemisinin

là 0,5% (2/425) mẫu từ Campuchia đi sang. Khoảng 45,2% (14/31) phân lập P.

falciparum có đột biến K13 giống với các đột biến ở Tây Phi. Đối với gen Pfcrt,

trong đó T76T356 và T76 chiếm tỷ lệ cao hơn trong số 13 kiểu gen đơn bội với

tỷ lệ 4,7% (20/425) và 4,2% (18/425) trên tổng số 77 phân lập (18,1%; 77/425)

và các số liệu này chỉ ra tỷ lệ thấp đột biến gen K13, trên các phân lập ngoại lai

từ châu Phi [114], trong khi đó các đột biến liên quan đến kháng PPQ vẫn ở mức

độ ổn định, nên giám sát phân tử liên tục các đột biến Pfcrt và giám sát tính nhạy

in vitro liên quan đến kháng PPQ là cần thiết [114].

Tại Palawan, Philippines, một nghiên cứu sự thay đổi về mặt không gian

của các đột biến Pfmdr1, Pfcrt, Pfdhfr, Pfdhps, K13, Pvmdr1, Pvdhfr, Pvdhps liên

quan kháng thuốc trên quần thể P. falciparum và P. vivax (Alison Paolo N.

Bareng và cs., 2021) [36], số liệu chỉ ra tính đa hình đơn nucleotide (SNPs) liên

quan đến kháng. Xu hƣớng không gian có khả năng đột biến ƣớc tính nhƣ một

chức năng sử dụng mô hình tuyến tính, tất cả mẫu đƣợc giải trình tự để đánh giá

P. falciparum kháng. sự thay đổi mô hình kháng khác nhau là các chỉ đểm

Pfdhps, Pfdhfr, chƣa thấy đột biến gen K13 liên quan đến chỉ điểm kháng

artemisinin [34]. Đối với P. vivax, các chỉ điểm Pvmdr1, Pvdhfr, Pvdhps đƣợc

tìm thấy nhƣ các chỉ điểm tiềm năng kháng thuốc. Nghiên cứu này chỉ ra các

thuốc hiện dùng vẫn còn hiệu quả, xu hƣớng không gian đã rõ ràng về sự phân

bố các chỉ điểm phân tử. Các chỉ điểm Pfcrt và Pfmdr đƣợc phát hiện trong 15

năm qua cùng với sự thay đổi chính sách thuốc và có thể giảm đi áp lực chọn lọc

thuốc trên quần thể KSTSR [36].

Tại châu Phi, các đột biến không đồng nghĩa K13 vẫn còn hiếm và đa dạng

cao. Một tỷ lệ rất thấp các đột biến này đã đƣợc báo cáo ở Angola, Burkina Faso,

Cameroon, Trung Phi, Comoros, Congo, Bờ Biển Ngà, Guinea, Ethiopia, Gabon,

112

Gambia, Kenya, Liberia, Madagascar, Malawi, Mali, Mozambique, Niger,

Nigeria, Rwanda, Senegal, Sierra Leone, Togo, Uganda và Zambia [103], [105],

[106].

Các biến thể khác ít gặp hơn đƣợc báo cáo có liên quan đến sự chậm làm

sạch ký sinh trùng nhƣng không có ý nghĩa thống kê do số ca phân tích ít nhƣ

D452E, C496Y, K479I, R515K, S522C, N539D, R575K, M579I, D584V,

P667T và H719N. Đến nay, WHO đã cập nhật khoảng 200 đột biến vô nghĩa hay

nói đúng hơn là đột biến không làm thay đổi protein hay kiểu hình gì cả (non-

synonymous mutations) trên gen K13, các alen khác có nguồn gốc từ các nơi

khác nhau độc lập tại Đông Nam Á. Giám sát các kiểu gen của KSTSR, nhất là

trong dự án đánh giá kháng thuốc với chỉ điểm phân tử K13 đa trung tâm (K13

Artemisinin Resistance Multicenter Assessment - KARMA) đã vẽ bản đồ kháng

artemisinin và có bằng chứng phân định hai vùng dịch tễ kháng thuốc phân tử

riêng biệt tại Tiểu vùng Sông Mê Kông: Vùng phía Tây của GMS gồm Vân

Nam-Trung Quốc, Myanmar [49] và phía Tây Thái Lan giáp biên giới Myanmar

và vùng Đông của GMS gồm Campuchia, Lào, Việt Nam và phía đông của Thái

Lan giáp biên giới Campuchia và Lào [49], [50].

Thống kê cho thấy có tổng số 5 kiểu đột biến K13 khác đã đƣợc tìm thấy

với tỷ lệ cao nhất là F446I, R539T, I543T, P574L và C580Y. Một số đột biến chỉ

đƣợc tìm thấy trong một vùng đặc biệt. Chẳng hạn, kiểu đột biến I543T chỉ có

phát hiện ở phía Đông của GMS, ngƣợc lại F446I chỉ tìm thấy ở phía Tây của

GMS. Đột biến F446I dƣờng nhƣ liên quan đến một tỷ lệ trung gian với sự làm

sạch KST sau điều trị. Hiện tại, đột biến C580Y tìm thấy trên một số nền tảng di

truyền haplotype trên khắp các nƣớc thuộc GMS [38], [49],[107]. Tần suất các

kiểu gen đơn bội của C580Y trên gen K13 khác nhau giữa các vùng và không có

kiểu gen đôn bội đơn nổi trội tại các nƣớc thuộc GMS. Tỷ lệ loại đột biến nổi

trội nhất kiểu gen đơn bội C580Y cho thấy đang gia tăng và dần thay thế các

kiểu gen đơn bội khác ở vùng Đông của GMS. Điều này chỉ ra có sự chọn lọc

các đột biến trong vùng khác nhau của GMS và loại đột biến C580Y đạt đến cố

113

định trong vùng ở Campuchia, nơi mà hầu hết các dòng ký sinh trùng kháng tìm

thấy có đột biến đặc biệt này và tỷ lệ các phân lập có đột biến C580Y lên đến

70% tại các vùng biên giới của Thái Lan-Myanmar [49], [107]. Tuy nhiên, đột

biến dƣờng nhƣ đạt đến mức cố định ở các phần khác của GMS. Các nghiên cứu

cũng chỉ ra loại đột biến K13 nổi trội tìm thấy ở Myanmar dƣờng nhƣ không

thấy lan rộng đến Campuchia, nhƣng có thể gia tăng một cách độc lập. Đột biến

gen K13 vẫn còn rất hiếm hoặc không liên quan đến kháng một phần artemisinin

tại Bangladesh và khu vực Đông Bắc Ấn Độ [49].

Loại kiểu gen đơn bội C580Y cũng đƣợc báo cáo tại các vùng Guinea và

Ghana trên các ngƣời Trung Quốc du lịch hoặc di dân đến các nƣớc này. Dù

không có điều tra, nguồn gốc các KSTSR bị đột biến, song các đột biến này có

thể đã xuất hiện tại châu Phi. Tƣơng tự, đột biến C580Y đã đƣợc tìm thấy trên

các mẫu thu thập tử Papua New Guinea và Guyana và ngƣời ta tin rằng các

chủng này là tại chỗ. Không có nƣớc nào trong số 4 nƣớc đã báo cáo có thất bại

điều trị với ACTs có liên quan đến đột biến C580Y [114].

Hầu hết tần suất alen tìm thấy ở châu Phi là loại A578S, dù không liên quan

đến kháng thuốc artemisinin trên lâm sàng hoặc in vitro. Một số đột biến khác,

gồm các đột biến liên quan đến chậm làm sạch KSTSR tại khu vực GMS, nhất là

loại đột biến C580Y đã đƣợc báo cáo tại châu Phi. Tuy nhiên, nhiều đột biến báo

cáo tại châu Phi chƣa lan rộng ra các quần thể KSTSR tại châu Phi cần giám sát

cẩn thận. Một số nghiên cứu về chỉ điểm phân tử cũng chỉ ra có tồn tại nhiều

kiểu đột biến trên một phân lập P. falciparum và xu hƣớng trình diện gen liên

quan đến kháng artemisinine qua trung gian đột biến gen K13 ở P. falciparum

(Mukul Rawat và cs., 2022) [73]. Với sự xuất hiện các chủng kháng hoặc đa

kháng thuốc artemisinin dẫn đến nhiều thách thức trong phòng chống và LTSR.

Các nghiên cứu đa thành phần trong phân tích di truyền sinh học của KSTSR đã

cung cấp sơ bộ gợi ý về các khía cạnh di truyền và cơ chế kháng artemisinin,

cũng nhƣ xác định đột biến kháng trên gen K13 nhƣ một chỉ điểm phân tử đáng

tin cậy liên quan đến kháng. Qua nhiều năm, hàng ngàn bộ gen và bản phiên mã

114

của các phân lập nhạy/ hay kháng artemisinin đã đƣợc phân tích cụ thể theo

hƣớng tiếp cận đích [112].

Nghiên cứu đã sử dụng tính đa hình đơn nucleotid của các từ 2517 phân lập

thu đƣợc từ 15 nƣớc theo Dự án Malaria GEN Network (2015-2022) để mô tả rõ

hơn về tỷ lệ, phân bố địa lý và mô hình cùng tồn tại nhiều đột biến di truyền xác

định hoặc có thể liên quan đến kháng artemisinin. Đặc biệt, nghiên cứu này đã

nhận ra các đột biến gen K13 cùng tồn tại đi kèm che dấu α-ß hydrolase và vùng

giả định HECT domain chứa các gen protein với với số lƣợng tối đa SNPs. Đồng

thời, các nhà nghiên cứu cũng đã khám phá ra các bộ dữ liệu bộ phiên mã để xác

định gen từ các con đƣờng sinh học liên quan đến điều hòa gen, có thể góp phần

yếu tố sinh học vào cơ chế kháng của KSTSR [110].

Điều ngạc nhiên là các con đƣờng glycolytic và pentose phosphate song

hành trong cơ chế điều hòa ngƣợc ở các KST kháng thuốc artemisinin. Do đó,

điểm sáng của phân tích đặc điểm về bộ phiên mã di truyền của KST kháng

thuốc sẽ giúp ngoại suy kháng thuốc rõ ràng hơn trong thời gian đến.

Những năm gần đây đã có đủ thông tin về KSTSR, vector trong cách ứng

phó tiến tới LTSR và dựa trên các kinh nghiệm vốn có từ châu Âu và Bắc Mỹ

với số ca tồn lƣu trên cả hai vùng này, nhƣng vấn đề là các nƣớc đó - sốt rét thật

sự là một vấn đề y tế công cộng và mô hình khác xa so với các nƣớc châu Phi và

điều cần thiết trong lộ trình LTSR ngày nay là phải phối hợp nhiều công cụ khoa

học sẵn có và một trong những công cụ đó là kiến thức khoa học về di truyền

phân tử. Hiểu biết thông tin về phân tích di truyền của KSTSR giúp chúng ta có

thể tiếp cận tốt hơn LTSR. Các công cụ phân tử trong những năm gần đây nhƣ

giải trình tự thế hệ mới (next-generation sequencing-NGS) sẽ hiểu sâu hơn về cơ

chế kháng thuốc. Cách tiếp cận thông tin từ sinh tin (bioinformatics approaches)

sẽ rất có giá trị mang tính chất đƣa ra quyết định [108].

Phát hiện các gen liên quan đến kháng thuốc hay các kiến thức có tính thời

sự về phân tử trong chu kỳ của KSTSR giúp ích ít nhiều trong LTSR, nhất là gen

của Plasmodium spp. và lẽ đƣơng nhiên không thể đảm bảo rằng các khía cạnh

115

về gen học có thể dẫn đến chấm dứt lan truyền sốt rét mà nó đóng vai trò quan

trọng trong bộ công cụ LTSR hiệu quả hơn.

Nếu có sự thay đổi lớn trong di truyền KSTSR, chu kỳ của chúng sẽ phức

tạp hơn và chƣa đủ kiến thức đáp ứng miễn dịch giải thích tại sao và cơ chế nào

kháng thuốc. Tuy nhiên, bằng chứng từ việc xuất hiện các đột biến gen K13 liên

quan kháng artemisinin của P. falciparum đã dẫn đến thất bại điều trị trên khắp

Đông Nam Á [43]. Tại châu Phi, kiểu gen K13 đột biến đƣợc xác định là R561H

tại Rwanda và một số kiểu hoang dại. Kiểu đột biến gen K13 loại R561H cùng

với C580Y và M579I đi cùng với kết quả kháng thuốc artemisinine biểu hiện

trên in vitro đang gia tăng tại một số nƣớc châu Phi và làm thay đổi tính nhạy với

thuốc (Barbara H Stokes và cs., 2021) [43].

4.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu

Trong số 292 ca nhiễm P. falciparum đƣa vào phân tích gen K13 có 201

bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu in vivo. Phân tích các đặc điểm dân

số học của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu TES đánh giá hiệu lực

thuốc DHA-PPQ trong điều trị bệnh nhân sốt rét nhiễm P. falciparum chƣa biến

chứng cho thấy nam chiếm cao hơn nữ trong cơ cấu tại tất cả điểm thực hiện

TES, lần lƣợt nam giới chiếm ƣu thế với tỷ lệ 66,7%; 95,8%; 66,4%; 95,0% và

58,1% tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng

Trị. Tại thời điểm vào nghiên cứu và chƣa dùng thuốc sốt rét, thân nhiệt trung bình của nhóm bệnh nhân tham gia lần lƣợt là (38,7 ± 0,6)0C; (38,7 ± 0,9)0C; (38,8 ± 0,9)0C; (38,9 ± 0,4)0C và (38,8 ± 0,8)0C và cân nặng trung bình lần lƣợt

là (51 ± 10,7) kg; (53,4 ± 8,2) kg; (37,6 ± 13,4) kg; (42,8 ± 13,8) kg và (40,4 ±

12,7) kg tại các tỉnh nghiên cứu Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận,

Khánh Hòa và Quảng Trị.

tuổi) trong độ tuổi lao động tại các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh

Đồng thời, phần lớn bệnh nhân sốt rét đều là ngƣời lớn, trƣởng thành (≥ 15

Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị lần lƣợt là 87,2%; 97,95; 58,1%, 75,0% và

116

74,2%. Hầu hết bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu in vivo làm nghề liên quan

đến đi rừng, ngủ rẫy, khai thác rừng lấy măng rừng, phong lan rừng hay mật ong,

đi rẫy và ngủ rẫy và làm nông lúa rẫy, trồng rẫy lúa và bắp, đậu xanh, củ mì, hạt

điều, trồng keo làm nguyên liệu giấy, mía đƣờng, một số bệnh nhân ở Bình

Phƣớc cho biết đi lại giữa các vùng biên giới Việt Nam - Campuchia và bản thân

họ cũng đang sống trong vùng có giao lƣu biên giới này. Bệnh nhân sốt rét có

thể làm nghề nghiệp liên quan đến đi rừng hợp pháp (cán bộ kiểm lâm và bảo vệ

rừng), hoặc không hợp pháp (khai thác rừng, lấy măng rừng, phong lan rừng hay

mật ong, săn bắn, lấy gỗ để bán) và phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã

từng ghi nhận ở khu vực SRLH ở miền Trung-Tây Nguyên và Nam Bộ-Lâm

Đồng [12], [25], [33].

Tổng số 201 bệnh nhận từ 5 tỉnh đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu TES, có

đến 25/201 (12,4%) ca mất theo dõi hoặc rút khỏi, nên chỉ còn lại 176 ca P.

falciparum đƣợc đánh giá, phân tích đầy đủ về hiệu lực DHA-PPQ. Mật độ

KSTSR thể vô tính P. falciparum trung bình tại các tỉnh dao động từ 8030 đến

26530/L trong máu ngoại vi, không có trƣờng hợp nào dƣới 1000 hay trên

100.000/L, phù hợp tiêu chuẩn chọn bệnh và tránh tiêu chuẩn loại trừ, hạn chế

chuyển nặng hoặc sang ác tính trong quá trình nghiên cứu. Tuy nhiên, mật độ

trung bình thể vô tính từng tỉnh khác nhau, sự khác biệt giữa các tỉnh, lần lƣợt ở

Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị là

8030; 10770; 10087; 11736 và 26530/L, sự khác biệt giữa các tỉnh có ý nghĩa

thống kê (p < 0,05).

Trong số 176 ca bệnh tham gia nghiên cứu TES in vivo đủ 42 ngày cho kết

quả nhƣ sau: Thời gian sạch KST trung bình lần lƣợt là 52,1 ± 20,1 giờ; 45,5 ±

22,2 giờ; 38,1 ± 16,6 giờ; 31,2 ± 11,1 giờ; 24,6 ± 1,5 giờ. Song song đó, thời

gian cắt sốt cải thiện trên lâm sàng lần lƣợt 30,2 ± 12,7 giờ, 33,3 ± 14,9 giờ, 31,4

± 11,5 giờ và 34,2 ±12,8 giờ tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận

và Quảng Trị. Phân tích chi tiết về tỷ lệ tồn tại KSTSR thể vô tính P. falciparum

sau điều trị thuốc phối hợp DHA-PPQ sau 72 giờ hay vào ngày D3 kể từ khi

117

dùng liều thuốc DHA-PPQ đầu tiên cho thấy tại các điểm theo dõi liên tục của

các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị lần lƣợt là

41% (16/39), 14,6% (7/48), 18,6% (8/43), 0% (0/40) và 0% (0/31). Tỷ lệ thể vô

tính P. falciparum dƣơng tính trên 10% ở các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh

Hòa đóng vai trò nhƣ các chỉ điểm lâm sàng gián tiếp liên quan kháng thuốc

artemisinine một phần và để làm rõ tình trạng kháng này cần kết hợp thêm dữ

liệu của nghiên cứu in vitro và chỉ điểm phân tử. Đáp ứng lâm sàng và KSTSR

đầy đủ (ACPR) tại hai tỉnh Ninh Thuận và Quảng Trị đều 100%, tại tỉnh Khánh

Hòa và Gia Lai hiệu lực vẫn còn trên 95% lần lƣợt 96,4% và 97,4%, trong khi đó

tại Bình Phƣớc tỷ lệ ACPR này chỉ còn 81,8% (< 90%) và tỷ lệ thất bại trên

10%, kèm theo thất bại lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại KST muộn

(LPF) là 4 ca (12,2%).

Đặc biệt, tại cả 5 tỉnh chƣa có trƣờng hợp nào thất bại điều trị sớm (ETF),

riêng ở Khánh Hòa có 1 trƣờng hợp thất bại KST muộn (2,6%). Dù chƣa có thất

bại điều trị sớm tại cả 5 tỉnh, song tại tỉnh Bình Phƣớc có ACPR < 90% kèm

theo thất bại lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại ký sinh trùng muộn

(LPF) là 4 ca (12,2%) nhƣ các dấu cảnh báo giảm nhạy và gián tiếp kháng thuốc

một phần trong viên phối hợp ACTs đang xuất hiện tại các tỉnh có biên giới với

ba tỉnh Mondulkiri, Kratie, T‟boung Khmum của Campuchia. Campuchia là

nƣớc đã và đang ghi nhận chủng P. falciparum đa kháng thuốc nghiêm trọng,

nay lại biểu hiện kháng artemisinin từ cuối năm 2008, nên việc chuyển dịch

chủng kháng qua khâu giao lƣu biên giới trên quần thể dân di biến động của hai

nƣớc là khó tránh khỏi [19].

Một số nghiên cứu khác trong khu vực Tiểu vùng Sông Mê Kông cũng nhƣ

tại một số điểm theo dõi liên tục về hiệu lực thuốc ở Việt Nam đã từng chỉ ra có

mối liên quan giữa sự chậm làm sạch thể vô tính P. falciparum sau điều trị thuốc

artesunat hoặc ACTs với các kiểu đột biến gen K13 xác định kháng[9], [16],

[69]. Trong nghiên cứu này cũng đã chỉ ra môi liên quan tƣơng tự ở ba tỉnh Gia

Lai và Bình Phƣớc, Khánh Hòa. Trong đó, tỷ lệ đột biến gen K13 kiểu xác định

118

kháng artemisinin trên quần thể P. falciparum có tƣơng quan tuyến tính với tỷ lệ

KSTSR thể vô tính còn tồn tại dƣơng tính ngày D3, với hệ số tƣơng quan r =

0,411 có ý nghĩa thống kê (p < 0,001)

So sánh với các dữ liệu cập nhật về hiệu lực thuốc sốt rét từ các thử nghiệm

TES in vivo của WHO cho thấy tại Campuchia, kháng một phần artemisinin

(partial artemisinine resistance) lần đầu tiên báo cáo trên vào năm 2008, song các

số liệu phân tích hồi cứu về chỉ điểm phân tử chỉ ra kháng một phần artemisinin

đã từng xuất hiện trƣớc năm 2001 và lan rộng kháng ACTs [62], [94], [103]. Do

tỷ lệ thất bại điều trị cao với artesunate-mefloquine (ASMQ) là một loại thuốc

điều trị đầu tay sốt rét do P.falciparum chƣa biến chứng nên sau đó đã thay đổi

từ dạng đóng gói trên cùng vỉ thuốc sang thành viên cố định liều dùng tại DHA-

PPQ từ năm 2008, sau đó áp dụng cả nƣớc vào năm 2010. Không lâu sau khi

chính sách điều trị này và gia tăng thất bại điều trị với DHA-PPQ qua các nghiên

cứu TES. ASMQ đƣợc dùng trở lại vào năm 2014, nhƣng độ bao phủ cả nƣớc

chỉ đạt vào năm 2017. Trong số 12 nghiên cứu thuốc ASMQ tiến hành năm

2014-2018, tất cả báo cáo có tỷ lệ đáp ứng lâm sáng và KST đầy đủ (ACPR) trên

98%, ngay cả khi 95% số ca đều mang đột biến gen K13 loại C580Y [70], [94].

Trong khi đó, tại các vùng SRLH của Lào có ba thử nghiệm từ giai đoạn

2013-2017 thấy thất bại với artemether-lumefantrine tỷ lệ từ 10-17,2%. Tuy

nhiên, cỡ mẫu cho các nghiên cứu này vẫn còn nhỏ, hiệu lực DHA-PPQ cũng

đƣợc giám sát đánh giá để đƣa thuốc này vào trong danh mục thuốc của nƣớc

này, song tỷ lệ thất bại sau đó cũng trên 15%, nên nay đang theo dõi thử nghiệm

loại artesunat-pyronaridin (Pyramax) và artesunat-mefloquin (ASMQ) [107].

Tại các điểm theo dõi liên tục hiệu lực thuốc ở Myanmar, kháng một phần với

artemisinin có thể đã xuất hiện từ lâu dọc theo biên giới Thái Lan-Myanmar từ

năm 2001, nhƣng đến năm 2008 mới đƣợc làm rõ [69], [103]. Từ năm 2009, các

dữ liệu phân tích chỉ ra thời gian làm sạch KST chậm trên những ca điều trị

ACTS có ý nghĩa. Dù có tình trạng chậm làm sạch KSTSR xảy ra đối với tất cả

ba loại ACTs (artemether-lumefantrin, ASMQ và DHA-PPQ) đã từng dùng ở

119

Myanmar, song hiệu lực cả ba loại thuốc trên vẫn còn cao. Thái Lan dùng liệu

trình 2 ngày ASMQ nhƣ một lựa chọn ƣu tiên và sau đó chuyển sang liệu trình 3

ngày từ năm 2009, thất bại điều trị với ASMQ tăng trên 10% ở các tỉnh

Ubonratchathani, Kanchanaburi, Ranong, Tak. Số thất bại điều trị cao đƣợc tìm

thấy ở Thái Lan sau khi điều trị ASMQ có thể do một phần kháng mefloquin

trƣớc đó trên phạm vi rộng, bên cạnh tình trạng kháng artemisinine một phần.

Áp lực thuốc mefloquin đƣợc xem xét vài chục năm qua, đồng thời Thái Lan đã

từng dùng liệu pháp mefloquin (15-25 mg/kg) đơn trị liệu hoặc phối hợp với

artesunate. Hiệu lực artemether-lumefantrin đƣợc đánh giá tại hai tỉnh vào năm

2012, với tỷ lệ thất bại điều trị từ 6-10%. Năm 2015, thuốc DHA-PPQ đƣợc lựa

chọn nhƣ một thuốc đầu tay và hiện đang đánh giá theo chƣơng trình giám sát

hiệu lực thuốc lồng ghép hay tích hợp (integrated Drug Efficacy Surveillance-

iDES) [107].

Tại châu Phi, hiệu lực thuốc ACTs hiện đang đƣợc giám sát tại các nƣớc có

SRLH. Một số báo cáo cho thấy hiện tƣợng chậm làm sạch KSTSR trong các thử

nghiệm TES với thuốc ACTs. Tuy nhiên, số liệu này chƣa đƣợc đánh giá theo

thời gian. Artemether-lumefantrine và artesunat-amodiaquin là hai loại thuốc ƣu

tiên điều trị trong chính sách tại các quốc gia châu Phi, cũng nhƣ bổ sung thêm

thuốc DHA-PPQ vào danh mục gần đây. Từ năm 2010-2016, hiệu lực trung bình

của thuốc DHA-PPQ, artesunat-amodiaquin, artemether-lumefantrin lần lƣợt

98,7%; 98,3% và 97,9% [107].

Sự hiện diện tình trạng tăng số bản sao Plasmepsin 2/3 tại một số nƣớc nhƣ

Comoros, Mali, Mozambique, Uganda nhƣ một mối quan tâm quan trọng, dù đột

biến này chƣa phải là ƣu thế nhƣ một chỉ điểm hợp lệ liên quan kháng PPQ trên

các chủng P. falciparum tại châu Phi. Song song đó, tại Nam Mỹ có một số

nghiên cứu tiến hành cho thấy hiệu lực ACTs còn cao. Chloroquin vẫn là thuốc

ƣu tiên trong điều trị tại Mesoamerica, Hispaniola. Tại Guatemala, Haiti,

Honduras và Nicaragua, các chỉ điểm phân tử Pfcrt (liên quan đến kháng CQ) đã

đƣợc tiến hành song song với thử nghiệm TES từ năm 2010-2015, hơn 1000 mẫu

120

đƣợc phân tích và hiếm đột biến tìm thấy, hai TES thực hiện tại Haiti ghi nhận

thất bại điều trị, song các phân tích phân tử chƣa làm để loại trừ tái nhiễm và

không có đột biến Pfcrt tìm thấy trên những ca thất bại này [101], [103].

Tại Trung Đông và Ấn Độ, tỷ lệ thất bại artesunat-sulfadoxin/pyrimethamin

cao tìm thấy ở Somalia và Sudan. Điều này đã nhanh chóng thay đổi chính sách

điều trị bằng thuốc artemether-lumefantrin nhờ vào cả thử nghiệm in vivo và chỉ

điểm phân tử 3 hoặc 4 đột biến Pfdhps và Pfdhfr. Tại Afghanistan, Iran, Pakistan

và Yemen, tỷ lệ thất bại với thuốc artesunat-sulfadoxin/pyrimethamin thấp hơn

10%. Tại Ấn Độ, ba nghiên cứu thực hiện năm 2012 ghi nhận thất bại trên10%

với artesunat-sulfadoxin/pyrimethamin và chƣa phát hiện thấy tình trạng kháng

một phần artemisinin. Điều này dẫn đến thay đổi chính sách điều trị với

artemether-lumefantrin tại vùng Đông Bắc của nƣớc này [107].

Nhìn chung, dù đáp ứng chậm với artemisinin tại một số vùng GMS, song

thuốc ACTs vẫn còn hiệu lực trong điều trị sốt rét do P. falciparum. Phần lớn

bệnh nhân có hiện tƣợng chậm làm sạch KST đều đƣợc chữa khỏi vì vai trò của

thuốc đi kèm vẫn còn hiệu quả. Giám sát thƣờng quy cần phải tiếp tục để đảm

bảo rằng các thuốc ACTs đang đƣợc khuyến cáo còn hiệu quả và kịp thời thay

đổi chính sách thuốc khi đến ngƣỡng quy định. Đánh giá đột biến gen K13 hỗ trợ

quan trọng trong truy vết kháng artemisinin một phần khi chúng đang dần nổi

lên. Trong bối cảnh đa kháng thuốc tại GMS, việc loại trừ P. falciparum là vấn

đề đặt ra ƣu tiên. Vai trò kháng artemisinin trong phát triển hoặc chọn lọc kháng

thuốc một phần cần đánh giá hơn nữa trong thời gian đến [107].

Tại Việt Nam, tiến trình chậm sạch KSTSR sau dùng thuốc DHA-PPQ lần

đầu tiên phát hiện tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phƣớc năm 2009. Giám sát

thƣờng quy hiệu lực thuốc DHA-PPQ cũng đã cho thấy các ổ bệnh khác cũng

tƣơng tự nhƣ tại huyện Phú Thiện, tỉnh Gia Lai (2010), huyện Tuy Đức va Cƣ

Jut, tỉnh Đăk Nông (2011), huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam (2012), huyện

Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa (2014) và huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận

(2015) [12], [25], [33].

121

Các TES thực hiện với thuốc DHA-PPQ từ năm 2010-2014 cũng đã tìm

thấy hiệu lực điều trị trên 95% dù tỷ lệ thể vô tính ngày D3 dƣơng tính lên đến

36%. Tuy nhiên, một nghiên cứu năm 2015 tại Bình Phƣớc báo cáo rằng tỷ lệ

thất bại cao trên 10% sau điều trị DHA-PPQ và đã đƣợc TCYTTG khẳng định có

sự xuất hiện kháng thuốc piperaquin. Năm 2016, tỷ lệ thất bại cao với DHA-PPQ

đã đƣợc báo cáo tại tỉnh Đăk Nông. Gần đây, các nghiên cứu chỉ ra tình trạng

thất bại điều trị nghiêm trọng hơn và kèm theo các chỉ điểm phân tử kháng cả

artemisinin và thuốc đi kèm piperaquin tại các tỉnh lân cận từ “vết dầu loang”

kháng này. Trong năm 2016-2017, tỷ lệ thất bại điều trị muộn tại Đăk Nông và

Bình Phƣớc lần lƣợt là 27% và 56% [86]. Các dữ liệu nghiên cứu từ huyện

Krông Pa, Gia Lai và huyện Krông Năng, Ea Kar, tỉnh Đăk Lăk cũng cho thấy tỷ

lệ cao các chỉ điểm phân tử đối với kháng artemisinin và piperaquin và TES

2019 cho thấy thất bại điều trị muộn sau khi hiệu chỉnh PCR lần lƣợt là 34% và

68% tại Gia Lai và Đăk Lăk [19].

So sánh với một số nghiên cứu khác gần đây thực hiện tại khu vực miền

Trung-Tây Nguyên, chẳng hạn nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ

đối với P. falciparum tại huyện Cƣ Jut, tỉnh Đăk Nông cho thấy dù tỷ lệ đáp ứng

lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ là 100%, hiệu lực rất cao trong điều trị, song

đáng chú ý sự tồn tại ký sinh trùng P. falciparum thể vô tính đƣợc đánh giá sau

mỗi 12 giờ sau khi dùng thuốc DHA-PPQ, cho thấy tỷ lệ tồn tại ngày D3 là

15,5% và sau D3 còn là 7,04%-nhƣ một chỉ điểm lâm sàng nghi ngờ kháng thuốc

tại vùng này [24], trƣớc khi khẳng định có kháng thuốc thì cần có phân tích thêm

về mặt gen học, phát hiện đột biến đơn điểm K13 propeller theo quy định và

định nghĩa kháng thuốc của WHO 2015.

So sánh và đối chiếu với các nghiên cứu in vivo gần đây, nhƣ ở Phú Yên

cho hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong điều trị sốt rét do P. falciparum chƣa biến

chứng cho thấp đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR) là 100%,

không có trƣờng hợp thất bại điều trị sớm hoặc muộn, tổng số ca mất theo dõi do

nhiều lý do là 3 (8,11%) và đặc biệt chƣa có ca nào còn tồn tại KSTSR ngày D3

122

sau điều trị [24]. Một số nghiên cứu khác thực hiện tại khu vực miền Trung-Tây

Nguyên, chẳng hạn nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ đối với P.

falciparum tại huyện Cƣ Jut, tỉnh Đăk Nông cho thấy dù tỷ lệ đáp ứng lâm sàng

và ký sinh trùng đầy đủ là 100%, hiệu lực rất cao trong điều trị, song đáng chú ý

sự tồn tại ký sinh trùng P. falciparum thể vô tính đƣợc đánh giá sau mỗi 12 giờ

sau khi dùng thuốc DHA-PPQ, cho thấy tỷ lệ tồn tại ngày D3 là 15,5% và sau D3

còn là 7,04% - nhƣ một chỉ điểm lâm sàng nghi ngờ kháng thuốc tại vùng này,

trƣớc khi khẳng định có kháng thuốc thì cần có phân tích thêm về mặt gen học,

phát hiện đột biến đơn điểm K13 propeller theo quy định và định nghĩa kháng

thuốc của WHO năm 2014 [9].

Một nghiên cứu của Huỳnh Hồng Quang và cộng sự tiến hành tại các

điểm xã Hàm Cần, huyện Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận năm 2014 cho tỷ lệ đáp

ứng lâm sàng và KST đầy đủ là 100% và chƣa có tình trạng chậm làm sạch KST

hay D3 dƣơng tính [23].

Nhiều nghiên cứu của tác giả Tạ Thị Tĩnh và cộng sự (2011) [29] hay của

Bùi Quang Phúc và cộng sự (2014) [16] và Trần Tịnh Hiền và cộng sự (2014)

[75] tại Bù Đăng (Bình Phƣớc) và Huỳnh Hồng Quang và cộng sự (2014) [24]

Tuy Đức (Đăk Nông), Phú Thiện (Gia Lai), Nam Trà My (Quảng Nam) với hiệu

lực đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ từ 91,2-100%, song tỷ lệ tồn tại

KST thể vô tính ngày D3 dao động 14,7-44% qua các nghiên cứu hiệu lực trên in

vivo theo dõi giám sát chỉ điểm (marker) K13 có liên quan đến kháng thuốc [29],

[66].

Song song, các nghiên cứu tại các điểm ở Gia Lai cũng cho diễn tiến

tƣơng tự nhƣ hai tỉnh Bình Phƣớc và Đăk Nông nhƣng tại các vùng không có

đƣờng biên giới và nhóm bệnh nhân không có giao lƣu biên giới Campuchia, có

xu hƣớng đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ giảm và tỷ lệ KSTSR ngày D3

dƣơng tính tăng dần nhƣ năm 2007-2008 cho thấy tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và

KST là 100%, không có D3 dƣơng tính, sang năm 2010 tại các xã của huyện Phú

Thiện (tỉnh Gia Lai) cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KST giảm còn 94,8% và D3

123

dƣơng tính là 11,7%, năm 2010 với 34 ca tại điểm Konch‟ro cho đáp ứng lâm

sàng và KST đầy đủ là 100% và D3 dƣơng tính là 3% [29], [30]. Đặc biệt, tại

huyện Krông Pa cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng giảm và tỷ lệ D3 tăng lần lƣợt 23%;

26,4%, 44,2% và 29,4% [16], [24].

Một số nghiên cứu trong các tỉnh khác dọc theo các tỉnh ven biển miền

Trung nhƣ tại huyện Nam Trà My, Quảng Nam với 89 ca nhiễm đơn thuần P.

falciparum chƣa biến chứng theo dõi liên tục cũng cho thấy đáp ứng lâm sàng và

KST đầy đủ là 97,7% và tỷ lệ D3 dƣơng tính là 29,2% (Nguyễn Vân Hồng và

cs., 2014) [66] hay nghiên cứu tại huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa từ năm

2011 trên 30 ca cho thấy đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ 100% và không có

D3, đến năm 2014 nghiên cứu trên 46 ca cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KST đầy

đủ là 100% nhƣng có tỷ lệ D3 là 17,4% [17] và đến năm 2016, nghiên cứu trên

29 ca, cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KST là 96,5% và tỷ lệ D3 dƣơng tính là

6,8% [20].

So với dữ liệu công bố từ nghiên cứu trong khu vực Tiểu vùng sông Mê

Kông gần đây, cho hiệu lực cao sau đó bắt đầu giảm dần nhất là tại nhiều tỉnh

Campuchia, Myanmar và tỉnh Champasack của Lào. Chẳng hạn, số liệu này

tƣơng tự nhƣ một số nghiên cứu đa trung tâm do Sigma Tau tổng hợp qua 14 thử

nghiệm lâm sàng về thuốc phối hợp DHA-PPQ (WHO, 2011) [103]. Tổng số

2.636 bệnh nhân điều trị bằng thuốc DHA-PPQ trong điều trị SR chƣa biến chứng

do P. falciparum. Hiệu lực từ các nghiên cứu này về DHA-PPQ trên SR đa kháng

thuốc do P. falciparum rất tuyệt vời, với tỷ lệ chữa khỏi sau 28 ngày theo dõi là

98% tại Trung Quốc, Campuchia, Myanmar, Lào, Thái Lan [112]. Bổ sung vào đó

là số liệu từ nghiên cứu so sánh hiệu lực của DHA-PPQ của MQ/AS và nó tốt hơn

liệu pháp artesunat-amodiaquin. Từ 2007-2010, một loạt nghiên cứu (Grande T và

cs., 2007; Karunajeewa HA và cs., 2008; Arinaitwe E và cs., 2009; Adam I và cs.,

2010) [34] cho kết quả tƣơng tự với tỷ lệ chữa khỏi sau hiệu chỉnh PCR của thuốc

phối hợp DHA-PPQ là cao hơn so với các phối hợp có thành phần artemisinin và

dẫn suất khác (AS/MQ, A/L và AS/AQ), chỉ ra một tỷ lệ nhiễm mới thấp hơn so

124

với các phối hợp thuốc khác qua liệu trình theo dõi 42 ngày hoặc 63 ngày. Kết quả

nghiên cứu này tƣơng tự nhƣ kết quả trong một số thử nghiệm trên thế giới tại các

vùng lƣu hành sốt rét; chẳng hạn, DHA-PPQ đã đƣợc thử nghiệm nhiều nghiên

cứu lâm sàng ở pha III tiến hành theo nhóm nghiên cứu vệ tinh của WHO trên các

bệnh nhân sốt rét P. falciparum.

Thử nghiệm đầu tiên tiến hành bởi Sigma tau (2010) [56] trên trẻ em và bệnh

nhân châu Á và nghiên cứu thứ hai trên các trẻ em châu Phi (≥ 6 tháng, ≤ 5 tuổi).

Thử nghiệm pha 3 tại châu Á [56] là một thử nghiệm ngẫu nhiên, đối chứng đánh

giá hiệu lực và tính an toàn của DHA-PPQ so sánh với ASMQ trên trẻ em và

ngƣời lớn. Tổng số 769 ca điều trị bằng DHA-PPQ và 381 ca dùng ASMQ. Kết

quả chỉ ra tỷ lệ chữa khỏi vào ngày 63 có hiệu chỉnh PCR là 97,0% đối với DHA-

PPQ và 95,3% đối với AS-MQ, và 98,7% đối với DHA-PPQ và 97,0% đối với

AS+MQ, chỉ ra các kết quả cao ngang nhau về hiệu lực điều trị của hai thuốc.

Nghiên cứu thử nghiệm pha 3 tại châu Phi [92] với đánh giá hiệu lực và tính an

toàn của DHA-PPQ so với artemether-lumefantrin. Quần thể chọn ngẫu nhiên gồm 1.039 trẻ em điều trị bởi DHA-PPQ và 514 trẻ em khác bởi thuốc artemether-

lumefantrin. Kết quả thấy tỷ lệ chữa khỏi sau hiệu chỉnh PCR vào D28 là 92,7% đối với thuốc DHA-PPQ và ACPR là 94,8% đối với phác đồ AL và 95,7% đối với cả phác đồ DHA-PPQ và AL cho thấy cả ACTs đều cho hiệu lực tƣơng tự.

Nghiên cứu này thực hiện mục tiêu phân tích phát hiện đột biến gen K13

trên tất cả mẫu thu thập từ tất cả bệnh nhân nhiễm P. falciparum đơn thuần trong

suốt quá trình nghiên cứu, trong khi nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc DHA-

PPQ điều trị sốt rét do P. falciparum trên nhóm bệnh nhân tiêu chuẩn chọn phù

hợp TES, nên chƣa thể phân tích mối liên quan đột biến K13 với sự chậm làm

sạch KSTSR P. falciparum trên các bệnh. Việc nhận định tính giảm nhạy và

kháng thuốc do P. falciparum với thuốc DHA-PPQ trong nghiên cứu này mới

chỉ tập trung vào một vế của thành phần dihydroartemisinin là dẫn suất của thuốc

artemisinin, trong khi tính nhạy kháng của P. falciparum với thành phần

piperaquine (PPQ) thì ở đây chƣa đề cập và phân tích cả về mặt khía cạnh phân

125

tử chỉ điểm tăng số bản sao Plasmepsine2/3, do vậy theo định nghĩa của

TCYTTG thì đây mới gọi là kháng thuốc một phần artemisinin, các nghiên cứu

tiếp theo cần mở rộng và đánh giá tổn thể các đột biến và chỉ điểm phân tử liên

quan đến cả hai thành phần thuốc phối hợp, khi đó mới có kết quả thấu đáo nhất.

Với dữ liệu này đối với kết quả thử nghiệm thuốc DHA-PPQ có tỷ lệ tồn tại

KSTSR ngày D3 >10% và tỷ lệ đột biến gen K13 ở những vị trí đã đƣợc xác

định là kháng ART lớn hơn 5% thì 3 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa đƣợc

xác định là tỉnh kháng với ART nghĩa là P. falciparum đã kháng với artemisinin

và dẫn chất.

4.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng P. falciparum với thuốc sốt rét

trên thử nghiệm in vitro tại Gia Lai

Nghiên cứu thử nghiệm in vitro đánh giá tính nhạy với thuốc của phân lập

P. falciparum thu thập tại thực địa nhằm phát hiện sớm các dấu hiệu của ký sinh

trùng sốt rét P. falciparum kháng thuốc và đánh giá độ nhạy cảm với thuốc mới

có khả năng thay thế những thuốc đã bị kháng trong tƣơng lai [91], [100]. Đánh

giá đáp ứng trên in vitro trên 54 trong số 108 mẫu phân lập P. falciparum thu

đƣợc tại Gia Lai năm 2016-2017 đƣa vào phân tích đột biến gen K13 với một số

thuốc sốt rét. Trong số 54 mẫu đƣa vào nuôi cấy tỷ lệ mẫu có đột biến gen K13

chiếm 68,52%, trong đó kiểu đột biến C580Y chiếm đa số với tỷ lệ 48,15%

(26/54), kiểu đột biến P553L chiếm tỷ lệ 5,56% (3/54) đây là 2 điểm đột biến

xác định kháng artemisinin và dẫn chất. Trong 54 mẫu đó tỷ lệ P. falciparum

phát triển thành thể phân liệt ở các giếng (well) chứng là 42 mẫu chiếm 77,7%

(42/54 ca có > 10% thể phân liệt ở giếng chứng), tỷ lệ đột biến gen K13 trong

nhƣng mẫu nuôi cấy thành công là 30,95%, tỷ lệ đột biến này giống với nhóm

đƣa vào nuôi cấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Về tính nhạy cảm của các phân lập P. falciparum với thuốc artesunat (AS),

kết quả nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của AS ở mức

nồng độ 2 nmol/L là 47,1%, tiếp theo tƣơng ứng ở nồng độ 4 nmol/L là 72,6%, ở

nồng độ 8 nmol/L là 91,1%, ở nồng độ 16 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên

126

95% sự phát triển thành thể phân liệt của P. falciparum, nhƣng nồng độ thuốc

cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chƣa đủ để toàn bộ KSTSR phát triển thành thể

phân liệt. Trong nhiều năm qua, AS là một trong những thuốc đầu tiên đƣợc đƣa

vào để điều trị P. falciparum ở Việt Nam, mới đầu với liều AS 3 ngày sau đó

tăng lên 5 ngày, 7 ngày [11], đến nay do tình trạng KST kháng AS cũng nhƣ

ART nên AS khoong đƣợc dùng dƣới dạng đơn chất mà phải dùng trong phối

hợp thuốc điều trị chống kháng rất tốt đối với chủng P. falciparum đa kháng tại

Việt Nam. Hiện tại, phác đồ điều trị của Bộ Y tế khuyến cáo AS phối hợp với

pyronaridin (viên Pyramax) để chống kháng đối với P. falciparum kháng DHA-

PPQ đã giảm hiệu quả [3]. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ ức chế IC50

trung bình của AS đối với 42 mẫu phân lập P. falciparum là IC50 là 3,06 ± 3,10

nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,41 nmol/L và giá trị cao nhất là 14,55

nmol/L. Kết quả này cao hơn so với kết quả nghiên cứu 2004 tại Bù Gia Mập

Bình Phƣớc IC50 trung bình của AS là 1,3 ± 0,6 nmol/L [27]. Kết quả này cũng

cao hơn nhiều so với nghiên đa trung tâm cứu tại phía tây Campuchia giai đoạn

2001-2007 trên 495 mẫu thử với thuốc AS kết quả cụ thể từng năm nhƣ sau, năm

2001 IC50 trung bình 1,1 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,1 nmol/L và

giá trị cao nhất là 9,9 (n=74); năm 2002 IC50 trung bình 1,0 nmol/L, trong đó giá

trị IC50 thấp nhất là 0,2 nmol/L và giá trị cao nhất là 6,4 (n=102); năm 2003 IC50

trung bình 1,2 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,2 nmol/L và giá trị cao

nhất là 11,1 (n=130); năm 2004 IC50 trung bình 1,8 nmol/L, trong đó giá trị IC50

thấp nhất là 0,3 nmol/L và giá trị cao nhất là 7,1 (n=48); năm 2005 IC50 trung

bình 1,6 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,7 nmol/L và giá trị cao nhất

là 7,2 (n=51); năm 2006 IC50 trung bình 0,6 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp

nhất là 0,1 nmol/L và giá trị cao nhất là 1,6 (n=27); năm 2007 IC50 trung bình

1,7 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,4 nmol/L và giá trị cao nhất là 6,7

(n=63) [83]. So với nghiên cứu tại Gabon Châu Phi cũng cao hơn IC50 trung bình

2,08 nmol/L (n=34) [55]. So với nghiên cứu tại Pháp tổng cộng 181 bệnh nhân

P. falciparum đƣợc thu thập từ tháng 4 năm 2008 đến tháng 4 năm 2010 từ các

127

bệnh nhân nhập viện tại Pháp với bệnh sốt rét nhập khẩu từ các nƣớc lƣu hành

bệnh sốt rét (Angola, Benin, Burkina Faso, Cameroon, Comoros, Congo, Bờ

Biển Ngà, Gabon, Gambia , Ghana, Guinea, Ấn Độ, Madagascar, Mali,

Mozambique, Niger, Cộng hòa Trung Phi, Senegal, Thái Lan, Togo, Zambia)

[41], IC50 trung bình 1,1 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,1 nmol/L và

giá trị cao nhất là 20,6 (n=179), kết quả này thấp hơn nhiều so với kết quả

nghiên cứu cuả chúng tôi. Nghiên cứu tại thái lan trên những bệnh nhân P.

falciparum đƣợc thu thập từ 2016-2017 giá trị IC50 trung bình là 3,06 ± 3,10

nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,6 nmol/L và giá trị cao nhất là 9,7

(n=116) [67] kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ kết quả tại Gia Lai năm 2016-2017.

Trong số 42 mẫu phân tích ivitro có 59,5% (25/42) mẫu có đột biến gen

K13 xác định, liên quan đến kháng ART, 40,5 % ( 17/42) mẫu không có đột

biến hoặc đột biến không liên quan đến kháng ART IC50 trung bình của 2 nhóm

này lần lƣợt là 3,50 nmol/L và 2,18 nmol/L, nồng độ IC50 trung bình của 2 nhóm

này khác nhau có ý nghĩa thống kê (p <0,05) kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ kết

quả nghiên cứu tại thái lan năm 2018 [67]

Dihydroartemisinin (DHA) là một trong ba dẫn suất quan trọng (artesunat,

dihydroartemisinin, artemether) của artemisinin, nghiên cứu này đã đánh giá tính

nhạy cảm của P. falciparum với DHA và vì nó là loại thƣờng dùng trong các

viên phối hợp ACTs khá phổ biến, nên việc đánh giá chúng có vai trò tƣơng tự

nhƣ thuốc AS, kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy tỷ lệ ức chế tạo thành thể phân

liệt của DHA ở nồng độ 2 nmol/L là 38,6%, tƣơng ứng ở nồng độ 4 nmol/L là

67,8%, ở nồng độ 8 nmol/L là 87,2%, ở nồng độ 16 nmol/L đã có tác dụng ức

chế trên 94% sự phát triển thành thể phân liệt của P. falciparum, nhƣng nồng độ

thuốc cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chƣa đủ để toàn bộ KSTSR phát triển

thành thể phân liệt. Nồng độ ức chế IC50 trung bình của DHA đối với 42 phân

lập P. falciparum là 2,95 ± 2,19 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,52

nmol/L và giá trị cao nhất là 9,94 nmol/L. Kết quả này cao hơn so với nghiên

cứu tại Cameroon năm 1999 IC50 trung bình là 1,11 nmol/L, trong đó giá trị IC50

128

thấp nhất là 0,25 nmol/L và giá trị IC50 giá trị cao nhất là 4,56 nmol/L [92].

Nghiên cứu tại Pháp tổng cộng 181 bệnh nhân P. falciparum đƣợc thu thập từ

tháng 4 năm 2008 đến tháng 4 năm 2010 từ các bệnh nhân nhập viện tại Pháp

với bệnh sốt rét nhập khẩu từ các nƣớc lƣu hành bệnh sốt rét (Angola, Benin,

Burkina Faso, Cameroon, Comoros, Congo, Bờ Biển Ngà, Gabon, Gambia ,

Ghana, Guinea, Ấn Độ, Madagascar, Mali, Mozambique, Niger, Cộng hòa Trung

Phi, Senegal, Thái Lan, Togo, Zambia) [41], IC50 trung bình của DHA là 1,3

nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,1 nmol/L và giá trị cao nhất là 21,2

(n=181), kết quả này thấp hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu cuả chúng tôi

[41]. Nghiên cứu tại Kenyan năm 2008 nồng độ ức chế IC50 trung bình của

DHA đối với 115 phân lập P. falciparum là 2,0 ± 1,0 nmol/L [80]. Nghiên cứu tại

Thái Lan năm 2017 nồng độ ức chế IC50 trung bình của DHA đối với 113 phân

lập P. falciparum là 2,1 ± 1,2 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,2

nmol/L và giá trị cao nhất là 56 nmol/L [67]. Kết quả này thấp hơn kết quả

nghiên cứu chủa chúng tôi tại Gia Lai với IC50 trung bình của DHA là 2,95 ± 2,19

nmol/L.

Trong số 42 mẫu phân tích ivitro có 59,5% (25/42) mẫu có đột biến gen

K13 xác định, liên quan đến kháng ART, 40,5 % ( 17/42) mẫu không có đột

biến hoặc đột biến không liên quan đến kháng ART IC50 trung bình của DHA ở

2 nhóm này lần lƣợt là 3,50 nmol/L và 2,18 nmol/L, nồng độ IC50 này khác nhau

có ý nghĩa thống kê (p <0,05) kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ kết quả đã đƣợc

WHO công bố trƣớc đây tại GMS [108]

Đồng thời, trong nghiên cứu này cũng đã đánh giá tính nhạy cảm của P.

falciparum với chloroquine (CQ), dữ liệu phân tích chỉ ra ở nồng độ thuốc CQ là

100 nmol/L (100 nmol/L là nồng độ xác định kháng CQ theo quy định của WHO

2009) ức chế đƣợc 76,5% số P. falciparum phát triển thành thể phân liệt, ở nồng

độ thuốc CQ là 200 nmol/L ức chế đƣợc trên 95% KST, ở nồng độ thuốc cao

nhất đƣợc thử nghiệm là 800 nmol/L ức chế đƣợc 100% KST phát triển thành

thể phân liệt. Giá trị IC50 trung bình thu đƣợc 67,7 ± 53,1 nmol/L, trong đó giá

129

trị IC50 thấp nhất là 12,3 nmol/L và cao nhất là 338,3 nmol/L. Trong đó, có

21,4% (9/42) số mẫu ở bệnh nhân có IC50 >100 nmol/L (nồng độ xác định kháng

CQ). Một nghiên cứu in vitro tại Ấn Độ trên 44 phân lập (22 mẫu P. falciparum

và 22 mẫu P. vivax) tìm thấy kháng CQ ở P. falciparum rất cao 68,18% (15/22).

Có sự phát triển của KSTSR (hình thành thể phân liệt trƣởng thành) ở nồng độ

thuốc 8 pmol/L chỉ ra là kháng với CQ và kết quả này tƣơng tự kết quả của

nhóm tác giả Shrivastava SK và cộng sự đã từng báo cáo P. falciparum kháng

cao CQ 86,96% tại vùng Assam, Ấn Độ. Fatima Shujatullah và cộng sự ở

Aligarh và Anupkumar R Anvikar và cộng sự ở New Delhi báo cáo kháng CQ

thấp hơn, lần lƣợt 24,1% và 44,4%. Việc giải thích lý do tại sao P. falciparum

kháng CQ cao có thể là do CQ đã từng đƣợc chỉ định trên tất cả bệnh nhân có sốt

tại các vùng lƣu hành nhƣ một liệu pháp dự phòng và tiếp sau đó kháng CQ lan

rộng do chúng phát triển một vài cơ chế kháng CQ. Kháng CQ trên in vitro đã

từng đƣợc báo cáo tại các nƣớc khác nhƣ Nigeria là 88,9%; 80% và 51%

(Peletiri I và cs; Oyedeji Segun Isaac và cs; Olasehinde GI và cs., 2005) hay ở

Mali từ 60-79% (Halima Kaddouri và cs., 2005), ở Cameroon 62,2% (Pascal

Ringwald và cs., 2007), ở Trung Phi là 37% (Didier Menard và cs., 2007).

Kháng amodiaquine là 18,2% (Anupkumar R. Anvikar và cs.,) tại New Delhi.

Các bệnh nhân ở các nƣớc khác cũng ghi nhận kháng amodiaquine từ 13% ở

Nigeria (Olasehinde GI và cs., 2005) đến 44,4% (Peletiri I và cs., 2007). Nghiên

cứu tại Kenyan năm 2008 nồng độ ức chế IC50 trung bình của CQ đối với 115

phân lập P. falciparum là 158 ± 75 nmol/L [80] nồng độ này cao hơn rất nhiều so

với nghiên cứu của chúng tôi thu đƣợc có thể do P. falciparum kháng cao tai

Kenyan. Nghiên cứu tại Pháp tổng cộng 181 bệnh nhân P. falciparum đƣợc thu

thập từ tháng 4 năm 2008 đến tháng 4 năm 2010 từ các bệnh nhân nhập viện tại

Pháp với bệnh sốt rét nhập khẩu từ các nƣớc lƣu hành bệnh sốt rét [41], IC50

trung bình của CQ là 79,8 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 5,0 nmol/L

và giá trị cao nhất là 1918 nmol/L (n=181), kết quả này cao hơn so với kết quả

nghiên cứu tại Gia Lai. Nghiên cứu tại Thái Lan năm 2017 trên bệnh nhân nhiễm

130

P. falciparum đơn thuần nồng độ ức chế IC50 trung bình của CQ là 90,7 ± 43,4

nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 18,2 nmol/L và giá trị cao nhất là 230,3

nmol/L (n=117) [67].

Ngoài ra, thuốc piperaquin phosphat (PPQ) là một đồng phân của

chloroquin, thuộc nhóm thuốc 4-aminoquinolin, tuy nhiên chúng có thời gian

bán hủy dài hơn nên đƣợc dùng kết hợp và PPQ đóng vai trò nhƣ một thuốc đi

kèm (partner drug) trong viên phối hợp DHA-PPQ. Thử nghiệm đánh giá tính

nhạy cảm của P. falciparum với PPQ chỉ ra tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt

của thuốc PPQ ở nồng độ 50 nmol/L là 43,7%, tƣơng ứng ở nồng độ 100 nmol/L

là 94,5%, ở nồng độ 200 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 95% sự phát triển

thành thể phân liệt của các phân lập P. falciparum nhƣng nồng độ thuốc cao gấp

2 lần (32 nmol/L) cũng chƣa đủ để ức chế toàn bộ KST phát triển thành thể phân

liệt. Giá trị IC50 trung bình thu đƣợc 43,5 ± 24,9 nmol/L, trong đó giá trị IC50

thấp nhất là 4,66 nmol/L và giá trị cao nhất là 105,8 nmol/L. Nghiên cứu tại

Pháp tổng cộng 181 bệnh nhân P. falciparum đƣợc thu thập từ các bệnh nhân

nhập viện tại Pháp với bệnh sốt rét nhập khẩu từ các nƣớc lƣu hành bệnh sốt rét

[41], IC50 trung bình của PPQ là 66,8 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là

11,8 nmol/L và giá trị cao nhất là 217,3 nmol/L (n=181), kết quả này cao hơn so

với kết quả nghiên cứu tại Gia Lai. Nghiên cứu tại biên giới giữa Thái Lan và

Campuchia, Myanmar năm 2016 trên bệnh nhân nhiễm P. falciparum đơn thuần

nồng độ ức chế IC50 trung bình của PPQ là 16,7± 6,3 nmol/L, trong đó giá trị

IC50 thấp nhất là 6,4nmol/L và giá trị cao nhất là 33,7 nmol/L (n=132)[68],

Nghiên cứu tại Thái Lan năm 2017 trên bệnh nhân nhiễm P. falciparum đơn

thuần nồng độ ức chế IC50 trung bình của PPQ là 18,4 ± 8,4 nmol/L, trong đó giá

trị IC50 thấp nhất là 6,4nmol/L và giá trị cao nhất là 55,5 nmol/L (n=114) [67].

Nghiên cứu tại Kenyan năm 2008 nồng độ ức chế IC50 trung bình của PPQ đối

với 115 phân lập P. falciparum là 42 ± 10 nmol/L [80], kết quả này tƣơng tự nhƣ

kết quả nghiên cứu của chung tôi.

131

Sự phát triển kháng thuốc có thể đƣợc xem xét ở hai phần: Sự kiện di

truyền hiếm gặp ban đầu tạo ra đột biến kháng thuốc và tiếp theo là quá trình

chọn lọc, trong đó khả năng sống sót trong quá trình điều trị bằng thuốc chống

sốt rét dẫn đến việc truyền các đột biến kháng thuốc và lan truyền kháng thuốc

[111]. Với điều kiện các đột biến chƣa đƣợc cố định (nghĩa là trong khi các

KSTSR kiểu hoang dã vẫn còn phổ biến) thì có thể làm giảm tỷ lệ kháng thuốc

khi loại bỏ áp lực chọn lọc.

Điều này đã xảy ra ở Malawi khi CQ bị rút khỏi phác đồ điều trị một thời

gian thì tính nhạy cảm trở lại của P. falciparum với chloroquin. KSTSR kháng

với một loại thuốc thì có thể chọn lọc để kháng với các thuốc khác khi cơ chế

kháng thuốc tƣơng tự nhau (đề kháng chéo).

Trong các mô hình thí nghiệm, các đột biến kháng thuốc có thể đƣợc lựa

chọn mà không cần truyền qua muỗi (tức là trong quá trình phân chia tế bào)

bằng cách phơi nhiễm một lƣợng lớn KSTSR (trong ống nghiệm, ở động vật

hoặc trên ngƣời tình nguyện) với nồng độ thuốc điều trị dƣới mức, dẫn đến sự

phát triển đột biến kháng tự phát và ngăn chặn phần lớn quần thể KSTSR nhạy

cảm. Hiện tại, giám sát hiệu lực thuốc trên in vitro đƣợc nhìn nhận rất có giá trị

trong đánh giá kháng thuốc sốt rét và là cơ sở quan trọng để thiết lập và công

nhận một số chỉ điểm kháng thuốc phân tử [57], [63], tuy nhiên vẫn còn rất ít và

ít quốc gia thực hiện thử nghiệm in vitro bởi nhiều lý do khó khăn và thách thức

cũng nhƣ cần có các cán bộ kinh nghiệm chuyên nuôi cấy và thử thuốc in vitro

này, nên các tiếp cận đánh giá hiệu lực thuốc trên in vivo kết hợp phân tích phân

tử các chỉ điểm liên quan hoặc xác định kháng thuốc phổ biến hơn và mang lại

nhiều kết quả trong thay đổi chính sách thuốc [63], [69].

Các yếu tố trong tự nhiên tƣơng tự thử nghiệm trong ống nghiệm sẽ làm cơ

sở cho việc chọn lọc đề kháng trong quần thể KSTSR. Điều này cũng giải thích

tại sao không đƣợc điều trị kịp thời đối với những ngƣời mắc bệnh có mật độ

KSTSR cao lại là một “nguồn kháng thuốc” mạnh.

132

Khi mật độ KSTSR cao, khả năng kiểm soát nhiễm không đầy đủ và tỷ lệ

tái phát sau khi điều trị cao. Do sử dụng thuốc kém chất lƣợng, tuân thủ điều trị

kém, dƣợc động học bất thƣờng và đáp ứng miễn dịch không đầy đủ là đặc điểm

vật chủ, có khả năng liên quan đến mỗi lần tái phát nhiễm KSTSR.

Ngăn chặn kháng thuốc tại Đông Nam Á và phòng ngừa sự lan rộng kháng

từ châu Á sang châu Phi và xa hơn nữa là một vấn đề ƣu tiên y tế công cộng toàn

cầu. Kế hoạch hành động ngăn chặn kháng artemisinin toàn cầu của WHO

(WHO Global Action Plan for Artemisinin Resistance Containment-GPARC) đã

và đang đƣa ra các khuyến cáo thích hợp nhằm ngăn chặn kháng từ năm 2011,

tuy nhiên dƣới sự thay đổi mô hình sốt rét và nhiều quốc gia, nhiều vùng vẫn còn

biến động phức tạp, đối mặt nhiều thách thức, bên cạnh các thuận lợi trong 20

năm qua đã đạt đƣợc các thành quả [108], song vẫn còn nhiều tỉnh thành hiện

chƣa thể đạt đích để loại trừ sốt rét do P. falciparum ở Việt Nam qua rà soát số

liệu và lộ trình có thể đẩy lùi ra phía sau một vài năm nữa [28].

Việc tiếp tục giám sát kháng tại các vùng sốt rét lƣu hành cùng với nghiên

cứu các yếu tố góp phần khác sẽ hỗ trợ các cơ quan y tế và thầy thuốc ngăn chặn

hiệu quả lan rộng kháng hơn, nhất là trong bối cảnh nguy cơ sốt rét quay trở lại

tại nhiều nƣớc, trong đó có khu vực Tiểu vùng Sông Mê Kông [109]. Tại Đông

Nam Á - nơi mà mức lan truyền sốt rét thấp, thì chƣơng trình ngăn chặn nhằm

vào đẩy mạnh loại trừ ký sinh trùng P. falciparum là lý tƣởng nhất để làm dừng

lan rộng kháng toàn bộ và tại các vùng lan truyền cao thì để giảm nguy cơ lan

rộng kháng có thể tăng các nổ lực phòng chống tốt nhất.

133

KẾT LUẬN

1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của

Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh

Thuận, Quảng Trị có sốt rét lƣu hành nặng năm 2016 – 2018

Tỷ lệ có đột biến gen K13 chung tại 5 tỉnh là 46,23% (135/292). Trong đó, đột

biến K13 tại Bình Phƣớc là 97,44% (38/39), Gia Lai 62,03% (67/108), Khánh

Hòa 32,69% (17/52), Ninh Thuận 6,82% (3/44), Quảng Trị 20,41% (10/49); Tất

cả đột biến gen K13 tại Bình Phƣớc, Ninh Thuận và Quảng Trị đều là kiểu

C580Y chiếm lần lƣợt Bình Phƣớc 97,44%; Ninh Thuận 6,82% và Quảng Trị

20,41%; Tại Gia Lai kiểu đột biến K13 đa dạng hơn, trong đó kiểu C580Y chiếm

45,37% và P553L là 5,56% là hai kiểu đột biến xác định kháng artemisinin và

loại đột biến liên quan C496F là 4,63% ngoài ra còn có 2 đột biến chƣa xác định

vai trò là K503N và Y511H chiếm 6,48%;Tại Khánh Hòa có 2 đột biến xác định

kháng là C580Y là 5,77%, kiểu P553L là 21,15% và ba kiểu khác H384Q,

G638E, G639D là 5,77%.

2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphate tại các điểm nghiên cứu

- Thời gian sạch KST trung bình là: Bình Phƣớc 52,1 ± 20,1 giờ; Gia Lai

45,5 ± 22,2 giờ; Khánh Hòa 38,1 ± 16,6 giờ; Ninh Thuận 31,2 ± 11,1 giờ; Quảng

Trị 24,6 ± 1,5 giờ. Thời gian cắt sốt trung bình lần lƣợt là: Bình Phƣớc

30,2±12,7 giờ, Gia Lai 33,3 ± 14,9 giờ, Khánh Hòa 31,4 ± 11,5 giờ; Ninh Thuận

30 ± 11,5 giờ và Quảng Trị 34,2 ±12,8 giờ.

- Đáp ứng lâm sàng và KST đầy đủ (ACPR) của P. falciparum với thuốc

DHA-PPQ tại Ninh Thuận và Quảng Trị đều là 100%, ACPR tại tỉnh Khánh Hòa

97,4% và Gia Lai 97,8%.Trong khi ở Bình Phƣớc, tỷ lệ ACPR là 81,8% (<

90%), thất bại lâm sàng muộn (LCF) 2 (6,1%), thất bại KST muộn (LPF) là 4 ca

(12,2%), chƣa có thất bại điều trị sớm tại cả 5 tỉnh; với tỷ lệ thất bại tại Bình

Phƣớc cần phải tìm một phối hợp ACTs khác thay thế.

134

- Tỷ lệ tồn tại KST thể vô tính sau điều trị DHA-PPQ ở ngày D3 tại các

điểm theo dõi là: Bình Phƣớc 41% (16/39), Gia Lai 14,6% (7/48), Khánh Hòa

18,6% (8/43), Ninh Thuận 0% (0/40) và Quảng Trị 0% (0/31). Tỷ lệ D3 > 10 %

ở các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, kết hợp với đột biến gen K13 ở các

tỉnh là Bình Phƣớc 97,44%, Gia Lai 58,33%, Khánh Hòa 37,21%, khẳng định 3

tỉnh này KST P. falciparum đã kháng với ART.

- Tất cả những 31 bệnh nhân có KST ngày D3 đều có đột biến gen K13, có

23 mẫu có đột biến C580Y (Bình Phƣớc 16 mẫu, Gia Lai 6 mẫu và Khánh Hòa

1mẫu), 8 mẫu có đột biến P553L (Khánh Hòa 7 mẫu và Gia Lai1 mẫu). Tất cả

các đột biến này đều đƣợc phân loại là xác định kháng artemisinin.

3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với

thuốc sốt rét bằng kỹ thuật in vitro tại Gia Lai.

- Tỷ lệ KST phát triển thành thể phân liệt ở giếng chứng trên 10% là 42/54

mẫu (77,7%).

- IC50 trung bình của AS đối với P. falciparum là 3,06 ± 3,10 nmol/L. IC50

trung bình của DHA đối với P. falciparum là IC50 là 2,95 ± 2,19 nmol/L. Giá trị

IC50 trung bình của CQ là 67,7± 53,1 nmol/l Trong đó, 21,4% (9/42) số mẫu có

IC50 >100 nmol/L (ngƣỡng xác định kháng CQ);Giá trị IC50 trung bình PPQ là

43,5 ± 24,9 nmol/L.

- IC50 trung bình của AS và DHA ở nhóm có đột biến gen K13 cao hơn ở

nhóm không có đột biến, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

135

KHUYẾN NGHỊ

1. Vai trò đột biến gen K13 góp phần nhƣ một chỉ dấu cảnh báo sớm và là yếu tố

bổ sung cho định nghĩa kháng thuốc artemisinin có giá trị, truy vết sự lan rộng

kháng sang các vùng, nên tiếp tục giám sát chỉ điểm phân tử trên quần thể P.

2. Khi đã xác định đƣợc đột biến gen K13 có liên quan đến P. falciparum kháng

falciparum để cảnh báo kháng;

artemisinin, nên tiến hành nghiên cứu sự phân bố của đột biến gen K13 trên

3. Cần phải theo dõi và quản lý chặt chẽ quá trình điều trị đặc biệt đối với bệnh

tất cả các tỉnh có SRLH nặng và nghi ngờ kháng với artemisinin;

nhân sốt rét do P. falciparum, phát hiện kịp thời các trƣờng hợp thất bại sớm

để điều trị thuốc sốt rét thay thế, đồng thời có kế hoạch khống chế tình trạng

4. Nên nghiên cứu phân tích chỉ điểm phân tử Pfplasmepsine 2/3 và

KST kháng với loại thuốc mang tính chiến lƣợc này.

PfExoE415G liên quan đến kháng thành phần piperaquin phosphat (PPQ)

trong viên phối hợp DHA-PPQ, để thể đánh giá một cách thấu đáo thực trạng

kháng thuốc DHA-PPQ tại thời điểm đó.

TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI

- Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phát hiện đƣợc 8 điểm đột biến gen K13

trong đó có 2 điểm đột biến xác định kháng artemisinin (C580Y và P553L),

một điểm liên quan (C496F) và 5 điểm đột biến chƣa xác định đƣợc vai trò

(H384Q, G638E, G639D, Y511H, K503N) với tỷ lệ thấp có những điểm lần

đầu tiên phất hiện tại Việt Nam. Nghiên cứu này đã phát hiện đƣợc 3 tỉnh

xác định kháng ART là Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa (có D3 > 10% và

K13 ở vị trí xác định kháng ART > 5%) và 1 tỉnh cần thay thuốc là Bình

Phƣớc (ACPR dƣới 90%). Hiện tại cả 3 tỉnh này đã đƣợc thay thuốc DHA-

PPQ bằng Pyramax.

- Việc xác định sự phân bố các kiểu gen đột biến K13 ở các tỉnh có sốt rét lƣu

hành nặng là một khía cạnh mới trong kế hoạch ngăn chặn sự lan rộng của

quần thể P. falciparum kháng artemisinin và đƣợc xem nhƣ là một vấn đề y

tế ƣu tiên toàn cầu, bởi kháng artemisinine đang là mối đe dọa chính lên các

thành quả đạt đƣợc từ kết quả PCSR trên toàn cầu cũng nhƣ ở Việt Nam;

- Đây là một trong số rất ít nghiên cứu về sự phân bố đột biến gen K13 tại

nhiều vùng sốt rét lƣu hành nặng kết hợp với theo dõi hiệu lực của thuốc trên

invivo và nuôi cấy thử độ nhạy cảm của thuốc trên invitro. Nghiên cứu này

đã phát hiện đƣợc 3 tỉnh xác định kháng ART là Bình Phƣớc, Gia Lai,

Khánh Hòa (có D3 > 10% và K13 ở vị trí xác định kháng ART > 5%) và 1

tỉnh cần thay thuốc là Bình Phƣớc (ACPR dƣới 90%).

MỘT SỐ ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN

- Nghiên cứu mới tiến hành đƣợc trên phạm một số xã nên chƣa đánh giá hết

đƣợc sự phân bố đột biến gen K13 của P. falciparum, mà chỉ có thể xác định

đƣợc sự phân bố đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu, nên muốn đa dạng

cần tiến hành trên quy mô rộng hơn;

- Nghiên cứu in vitro mới tiến hành đƣợc ở Gia Lai tỉnh nên chƣa đánh giá

đƣợc tính nhạy cảm của KST P. falciparum với thuốc sốt rét của 4 tỉnh còn lại

là Bình Phƣớc, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị.

NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ

1. Đỗ Mạnh Hà, Trƣơng Văn Hạnh, Bùi Quang Phúc và cs. Tần suất đột biến

gen K13 liên quan đến kháng artemisinin của quần thể P. falciparum tại một số

vùng sốt rét lƣu hành nặng ở Việt Nam năm 2016-2018.Tạp chí phòng chống

bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng. Số 3 (129)/2022. Trang 36-43.

2. Đỗ Mạnh Hà, Trƣơng Văn Hạnh, Bùi Quang Phúc và cs. . Hiệu lực điều trị

của Dyhidroartemisinin – piperaquin phosphat trên bệnh nhân nhiễm

Plasmodium falciparum chƣa biến chứng giai đoạn 2016-2018. Tạp chí phòng

chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng. Số 3 (129)/2022. Trang 21-29.

3. Đỗ Mạnh Hà, Trƣơng Văn Hạnh, Bùi Quang Phúc, Huỳnh Quốc Phòng và

cs. Hiệu lực điều trị của Dyhidroartemisinin – piperaquin phosphat trên bệnh

nhân nhiễm Plasmodium falciparum chƣa biến chứng tại Bình Phƣớc năm 2017.

Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng. Số 3 (129)/2022.

Trang 63-69.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Y tế (2011). Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng TƢ. Cẩm nang kỹ

thuật Phòng chống sốt rét. Nhà xuất bản Y học, 2011.

2. Bộ Y tế (2016). Hƣớng dẫn Chẩn đoán và Điều trị bệnh sốt rét. Quyết định số

4845/QĐ-BYT của Bộ trƣởng Bộ Y tế ra ngày 08/9/2016.

3. Bộ Y tế (2020). Hƣớng dẫn Chẩn đoán và Điều trị bệnh sốt rét. Quyết định số

2699/QĐ-BYT của Bộ trƣởng Bộ Y tế ra ngày 26/69/2020.

4. Viện Sốt rét ký sinh trùng côn trùng trung ƣơng (2020). Bệnh sốt rét: Dịch

tễ, bệnh học, lâm sàng, điều trị và phòng chống . Nhà xuất bản Y học, Hà Nội

2020. Mã số Sách tiêu chuẩn Quốc tế ISBN:978-604-66-4689-1.

5. Viện Sốt rét ký sinh trùng côn trùng trung ƣơng (2017).Quy trình ký thuật

thu mẫu máu ngoại vi trên giấy thấm Whatman 3MM đống gói bảo quản và

vận chuyển mẫu. Quy trình xét nghiệm chuẩn sốt rét ký sinh trùng côn trùng

tập 2, Nhà xuất bản Y học , trang 21-26. Mã số Sách tiêu chuẩn Quốc tế

ISBN:978-604-66-1908-6

6. Viện Sốt rét ký sinh trùng côn trùng trung ƣơng (2019).Quy trình làm lam

máu giọt dầy và giọt mỏng để phát hiện ký sinh trùng sốt rét. Quy trình xét

nghiệm chuẩn sốt rét ký sinh trùng côn trùng tập 3, Nhà xuất bản Y học,

trang 39-45. Mã số Sách tiêu chuẩn Quốc tế ISBN:978-604-66-2436-3.

7. Viện Sốt rét ký sinh trùng côn trùng trung ƣơng (2019).Quy trình kỹ thuật

gắn thuốc sốt rét lên phiến nhựa 96 giếng sử dụng trong đánh giá độ nhạy

cảm của ký sinh trùng sốt rét. Quy trình xét nghiệm chuẩn sốt rét ký sinh

trùng côn trùng tập 6, Nhà xuất bản Y học 2019, trang 24-32. Mã số Sách

tiêu chuẩn Quốc tế ISBN:978-604-66-4037-0.

8. Nguyễn Thị Liên Hạnh, Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Chƣơng, Nguyễn

Doãn Khôi, Nguyễn Đức Hồng, Phan Văn Trọng (2016). Nghiên cứu đột biến

gen K13 và tình trạng chậm làm sạch ký sinh trùng Plasmodium falciparum

tại Đăk Nông và Gia Lai. Báo cáo khoa học toàn văn. Hội nghị Ký sinh trùng

học toàn quốc lần thứ 43, Buôn Ma Thuột, Đăk Lăk, 01.04.2016. NXB Khoa

học Tự nhiên và Công nghệ. ISBN:978-604-913-442-5, trang 87-93.

9. Nguyễn Thị Liên Hạnh, Huỳnh Hồng Quang (2017). Nghiên cứu đột biến gen

K13 và tình trạng chậm làm sạch P. falciparum sau điều trị tại miền Trung-

Tây Nguyên (2014-2016). Tạp chí Phòng chống Bệnh sốt rét và Các bệnh ký

sinh trùng, Số đặc biệt (96)/2017, ISSN 0868-3735, tr.79-85.

10. Trƣơng Văn Hạnh, Ngô Đức Thắng, Nguyễn Thị Hƣơng Bình và cs., (2018).

Xác định vị trí và tần suất đột biến gen K13 kháng artemisinin của quần thể P.

falciparum tại Bình Phƣớc, năm 2017-2018, Tạp chí Phòng chống bệnh Sốt

rét và các bệnh ký sinh trùng, số 4, tr 21-27.

11. Nguyễn Mạnh Hùng và cộng sự (2010). Hiệu lực điều trị của artesunat tại

một số vùng của Việt Nam (2008-2009). Tạp chí phòng chống sốt rét và các

bệnh Ký sinh trùng, số 2 năm 2010 tr.14-18.

12. Nguyễn Doãn Khôi, Huỳnh Hồng Quang (2017). Đánh giá đáp ứng của

KSTSR với dihydroartemisinin-piperaquin phosphate ở bệnh nhân sốt rét

Plasmodium falciparum chƣa biến chứng tại huyện Krông Pa, Gia Lai. Tạp

chí Phòng chống Bệnh sốt rét và Bệnh ký sinh trùng, Số (96)/2017, ISSN

0868-3735, tr.228-235.

13. Lý Bá Lộc, Nguyễn Xuân Thành, Lê Quang Tạo (2006). Nghiên cứu KSTSR

kháng thuốc và đánh giá hiệu lực một số phác đồ chống kháng tại một số khu

vực miền Trung-Tây Nguyên. Công trình NCKH, Báo cáo tại hội nghị khoa

học toàn quốc chuyên ngành SR-KST-CT (2001-2005), NXB Y học, tr.80-95.

14. Nguyễn Đình Phúc (2011). Kỹ thuật thử thuốc 48 giờ trong phòng thí

nghiệm. Cẩm nang kỹ thuật phòng chống bệnh sốt rét. Nhà xuất bản Y học,

tr.78-79.

15. Bùi Quang Phúc, Tạ Thị Tĩnh, Huỳnh Hồng Quang và cs., (2013). Hiệu lực

điều trị của artesunate và dihydroartemisinin-piperaquin phosphate đối với

sốt rét Plasmodium falciparum chƣa biến chứng, 2013. Tạp chí Y học thành

phố Hồ Chí Minh, ISSN 1859-1779, tập 17, phụ bản Số 1, Chuyên đề KST,

tr.31-35.

16. Bùi Quang Phúc, Huỳnh Hồng Quang, Trần Thanh Dƣơng (2015). Hiệu lực

điều trị của Dihydroartemisinin-piperaquin phosphate đối với sốt rét

Plasmodium falciparum chƣa biến chứng. Công trình NCKH, Báo cáo tại Hội

nghị khoa học Toàn quốc chuyên ngành Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng năm

2015, NXB Y học, MS sách chuẩn quốc tế ISBN: 978-604-66-0950-6, tr.49-

57.

17. Bùi Quang Phúc và cộng sự (2015). Khánh Hòa-tỉnh thứ 5 có nghi ngờ sốt

rét kháng thuốc tại Việt Nam năm 2014. Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và

các bệnh ký sinh trùng, số 1, tr.3-7.

18. Bùi Quang Phúc, Tạ Thị Tĩnh, Nguyễn Quang Thiều và cs., (2019). Hiệu lực và tính an toàn của thuốc Pyramax® trong điều trị bệnh nhân sốt rét do

Plasmodium falciparum chƣa biến chứng tại Gia Lai, Tạp chí Phòng chống

bệnh Sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 1, tr 85-90.

19. Bùi Quang Phúc, Huỳnh Hồng Quang và cs., (2021). Hiệu lực điều trị của

Dihydroartemisinin-piperaquin trên 151 bênh nhân sốt rét Plasmodium

falciparum chƣa biến năm 2019, Tạp chí y học quân sự, số 353, tr 72-76.

20. Huỳnh Hồng Quang, Bùi Quang Phúc, Nguyễn Văn Chƣơng, Trần Thanh

Dƣơng (2016). Cập nhật tình hình sốt rét do Plasmodium falciparum kháng

thuốc tại khu vực tiểu vùng sông Mê Kông và Việt Nam: Một nghiên cứu đa

trung tâm. Hội nghị khoa học toàn quốc về bệnh truyền nhiễm và HIV/AIDS

năm 2016. Tạp chí của Hội truyền nhiễm Việt Nam, ISSN:0866-7829, trang

47- 54.

21. Huỳnh Hồng Quang và Nguyễn Văn Chƣơng (2014). Hiện tƣợng kháng liên

quan đến tiến trình chậm sạch P. falciparum sau điều trị dihydroartemisinin-

piperaquin tại một số vùng SRLH có giao lƣu biên giới Campuchia. Y học

TP. Hồ Chí Minh, tập 18, phụ bản số 6, tr. 247-252.

22. Huỳnh Hồng Quang (2014). Đánh giá hiệu lực của dihydroartemisinin-

piperaquin điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum chƣa biến chứng và

chloroquin điều trị Plasmodium vivax tại một số điểm miền Trung-Tây

Nguyên, Luận án Tiến sỹ Y học, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung

ƣơng.

23. Huỳnh Hồng Quang, Bùi Quang phúc (2015). Hiệu lực và hiệu quả thuốc

dihydroartemisinin-piperaquin trong điều trị sốt rét P. falciparum chƣa biến

chứng tại xã Hàm Cần, huyện Hàm Thuận Nam, Bình Thuận. Hội nghị Khoa

học Y học Dự phòng năm 2015 “Nghiên cứu vì Sức khỏe cộng đồng”. Tạp

chí Y học dự phòng, tập XXV, số 5 (165) 2015, ISSN 0868-2836, tr.341-347.

Dƣơng (2016). Cập nhật tình hình sốt rét do Plasmodium falciparum kháng

thuốc tại khu vực tiểu vùng sông Mê Kông và Việt Nam: Một nghiên cứu đa

trung tâm. Hội nghị khoa học toàn quốc về bệnh truyền nhiễm và HIV/AIDS

năm 2016. Tạp chí của Hội truyền nhiễm Việt Nam, ISSN:0866-7829, trang 47-

54.

24. Huỳnh Hồng Quang, Bùi Quang Phúc, Nguyễn Văn Chƣơng, Trần Thanh

25. Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Thị Minh Trinh (2019).

Đột biến gen kháng thuốc Plasmepsine2/3, Kelch 13 với diễn tiễn làm sạch

ký sinh trùng P. falciparum tại vùng biên giới Campuchia-Việt Nam-Lào.

Truyền nhiễm Việt Nam, Tạp chí của Hội Truyền nhiễm Việt Nam, Số đặc biệt

Hội nghị khoa học Toàn quốc về bệnh truyền nhiễm 2019, ISSN:0866-7829,

trang 65-66.

26. Đoàn Hạnh Nhân, Trần Tịnh Hiền (2006). Kết quả nghiên cứu về thuốc phối

hợp dihydroartemisinin-piperaquine điều trị sốt rét ở Việt Nam. Công trình

NCKH, Chuyên nghành sốt rét-ký sinh trùng-côn trùng. Nhà xuất bản Y học,

tr.144-152.

27. Đoàn Hạnh Nhân, Nông Thị Tiến, Nguyễn Mai Hƣơng (2005). Nghiên cứu

thuốc Artekin (dihydroartemisinin - piperaquin) tiền lâm sàng và điều trị sốt

rét chƣa biến chứng. Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và Các bệnh ký sinh

trùng, số 3, tr.36-43.

28. Ngô Đức Thắng (2019). Tình hình sốt rét trên Thế giới và Việt Nam: Cập

nhật Chiến lƣợc Phòng chống và Loại trừ sốt rét. Tạp chí phòng chống bệnh

sốt rét và các bệnh ký sinh trùng số 5 (113)/2019.

29. Tạ Thị Tĩnh, Ngô Việt Thành, Nguyễn Mạnh Hùng (2011). Hiệu lực điều trị

của một số thuốc sốt rét đối với P. falciparum (2005-2010). Công trình

NCKH, tập I Bệnh sốt rét, Nhà xuất bản Y học, tr.95-103.

Hƣờng, Lê Thành Đồng, Phùng Đức Thuận, Nông Thị Tiến, Ngô Việt Thành,

Nguyễn Mạnh Hùng (2013). Hiệu lực của một số thuốc sốt rét có thành phần là

dẫn chất của artemisinin (ACTs) trong điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum

chƣa biến chứng tại một số vùng sốt rét lƣu hành giai đoạn 2005-2012. Tạp chí

Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, ISSN 0868-3735, số 6-

2013, trang 90-96.

30. Tạ Thị Tĩnh, Bùi Quang Phúc, Huỳnh Hồng Quang, Vũ Văn Thái, Nguyễn Văn

31. Nguyễn Thị Minh Thu (2006). Đánh giá tính an toàn của thuốc sốt rét phối

hợp piperaquine-dihydroartemisinin trên bệnh nhân trẻ em và ngƣời lớn mắc

sốt rét. Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, Số 2,

năm 2006.

32. Nguyễn Thị Minh Trinh, Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Doãn Khôi (2016).

Xác định đột biến trên vùng gen K13 liên quan kháng artemisinin của P.

falciparum tại xã Phƣớc Chiến, Thuận Bắc, tỉnh Ninh Thuận. Báo cáo khoa

học toàn văn. Hội nghị KST Toàn quốc lần thứ 43, Buôn Ma Thuột, Đăk Lăk,

NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, ISBN:978-604-913-442-5, tr.240-

45.

33. Triệu Nguyên Trung, Huỳnh Hồng Quang, Li Guoqiao và cs., (2008). Đánh

giá hiệu lực thuốc phối hợp có artemisinine trong điều trị sốt rét do P.

falciparum chƣa biến chứng tại vùng SRLH, miền Trung-Tây Nguyên (2004-

2008). Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Vol.12-supplement, số 4: 28-34.

Tài liệu tiếng Anh

34. Adam I, Salah MT, Eltahir HG, Elhassan AH, Elmardi KA, Malik EM.

(2010), “Dihydroartemisinin - piperaquine versus artemether-lumefantrine, in

the treatment of uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in central

Sudan”, Ann Trop Med Paras; 104(4): 319-326.

35. Ashley EA, McGready R, Hutagalung R, Phaiphun L et al. (2005). “A

randomized, controlled study of a simple, once - daily regimen of

dihydroartemisinin - piperaquine for the treatment of uncomplicated,

multidrug-resistant falciparum malaria”, Clinical Infectious Diseases, 2005,

41:425-32.

36. Alison Paolo N. Bareng, Jennifer Luchavez, Chris Drakeley (2022).

Prevalence and temporal changes of mutations linked to antimalarial drug

resistance in Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in Palawan,

Philippines. International Journal of Infectious Diseases 116 (2022):174-

181.

37. Amato R, Lim P, Miotto O et al (2017). Genetic markers associated with

dihy-droartemisinin–piperaquine failure in Plasmodium falciparum malaria in

Cambodia: a genotype–phenotype association study. Lancet Infect Dis 2017;

17: 164–73.

38. Amato R, Pearson RD, Almagro-Garcia J et al (2018). Origins of the current

out-break of multidrug-resistant malaria in southeast Asia: a retrospective

genet-ic study. Lancet Infect Dis 2018; 18: 337–45.

39. Arjen M. Dondorp, François Nosten, Poravuth Yi (2009). Artemisinin

resistance in Plasmodium falciparum malaria. The New England Journal of

medicine 361(5):455-67.

40. Ariey F, Witkowski B, Menard D et al., (2014). A molecular marker of

artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria. Nature, 505

(7481):50-5.

41. Aurélie Pascual, Philippe Parola, Françoise Benoit-Vical et al, (2012). Ex

vivo activity of the ACT new components pyronaridine and piperaquine in

comparison with conventional ACT drugs against isolates of Plasmodium

falciparum PMID: 22333675Malar J. 2012; 11: 45. Published online 2012

Feb 14. doi: 10.1186/1475-2875-11-45.

42. Ajogbasile FV, Oluniyi PE, Kayode AT, Akano KO, Philip C et al. (2022).

Molecular profiling of the artemisinin resistance Kelch 13 gene in

Plasmodium falciparum from Nigeria. PLoS ONE 17(2):e0264548.

43. Barbara H Stokes, Satish K Dhingra, Kelly Rubiano (2021). Plasmodium

falciparum K13 mutations in Africa and Asia impact artemisinin resistance

and parasite fitness. Epidemiology and Global Health Microbiology and

Infectious Disease, Jul 19, 2021. https://doi.org/10.7554/eLife.66277

44. Barbara Forte, David A. Fidock, Ian H. Gilbert (2021). Prioritization of

molecular targets for antimalarial drug discovery. ACS Infect. Dis. 2021

(7):2764-76.

45. Chanaki Amaratunga , Pharath Lim , Seila Suon (2016). Dihydroartemisinin-

piperaquine resistance in Plasmodium falciparum malaria in Cambodia: a

multisite prospective cohort study, Lancet Infect Dis2016 Mar;16(3):357-

65.doi: 10.1016/S1473-3099(15)00487-9. Epub 2016 Jan 8.

46. Cho Naing, Joon Wah Maka, Kyan Aungb et al., (2013). Efficacy and safety

of dihydroartemisinin-piperaquin for treatment of uncomplicated

Plasmodium falciparum malaria in endemic countries: Meta-analysis of

randomised controlled studies. Royal Society of Trop. Med. and

Hyg;107(2):65-73.

47. Christian Nsanzabana, Philippe J. Guérin, Didier Ménard et al., (2018).

Tools for surveillance of anti-malarial drug resistance: An assessment of the

current landscape. Malar J (2018)17:75

48. Colin Sutherland, Didier Menard et al., (2022). Malaria: A genetic

intervention. Life 2021;10:e72000, doi: https://doi.org/10.7554/eLife.72000

49. D. Ménard, N. Khim, J. Beghain, A.A. Adegnika et al.,(2016). A Worldwide

Map of Plasmodium falciparum K13-Propeller Polymorphisms. N Engl J Med.

2016 Jun 23; 374(25): 2453–2464. doi: 10.1056/NEJMoa1513137.

50. Euclides Nenga Manuel Sacomboio, Joana Morais (2022). Factors

associated with resistance to in-hospital treatment of malaria in Angolan

patients.

51. Fang Huang, Christopher G. Jacob, Matthew Adams, Hui Liu, Christopher

V. Plowe (2020). Genomic epidemiology of antimalarial drug resistance in

Plasmodium falciparum in Southern China. Front. Cell. Infect. Microbiol.

10:610985.

52. Frank Smithuis, Moe Kyaw Kyaw, Ohn Phe, et al., (2010). Effectiveness of

five artemisinin combination regimens with or without primaquine in

uncomplicated falciparum malaria: an open-label randomised trial, The

Lancet infectious diseases, Vol.10, Issue 10, pp. 673-681.

53. Fehintola V. Ajogbasile, Oluniyi PE, Kayode AT, Philip C, et al. (2022).

Molecular profiling of the artemisinin resistance Kelch 13 gene in

Plasmodium falciparum from Nigeria. PLoS ONE 17(2):e0264548.

54. Frank M Kagoro, Karen I Barnes, Philippe J Guerin, Richard J Maude

(2022). Mapping genetic markers of artemisinin resistance in Plasmodium

falciparum malaria in Asia: A systematic review and spatiotemporal

analysis, published online Jan.25, 2022. www.thelancet.com/microbe.

55. Florian Kurth, Peter Pongratz, Sabine Bélard ..et al.,(2009). In vitro activity

of pyronaridine against Plasmodium falciparum and comparative evaluation

of anti-malarial drug susceptibility assays. Published: 23 April 2009. Malaria

Journal 2009, 8:79 doi:10.1186/1475-2875-8-79. Received: 18 November

2008. Accepted: 23 April 2009.

56. Sigma-tau SpA (2010), “Application for inclusion of dihydroartemisinin plus

piperaquine fixed dose combination tablets”, Application for Inclusion in the

17th WHO Model list of essential medicines, 15 november 2010.

57. Gurjeet Singh, A.D. Urhekar, Raksha (2015). In vitro antimalarial drug

sensitivity testing for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax. IOSR

Journal of Dental and Medical Sciences, ISSN: 2279-0861, vol.14(4):49-55

58. Hanna Y Ehrlich, Justin Jones, Sunil Parikh (2020). Molecular surveillance

of antimalarial partner drug resistance in sub-Saharan Africa: A spatial-

temporal evidence mapping study. Lancet Microbe 2020 (1):e209-17.

59. Hamilton WL, Amato R, van der Pluijm RW et al. Evolution and expansion

of multidrug-resistant malaria in southeast Asia: a genomic epidemiology

study. Lancet Infect Dis 2019; 19: 943–51.

60. Hien Tran Tinh, Dolecek C, Nguyen TD, et al., (2004). Dihydroartemisinin-

piperaquin against multidrug-resistant P. falciparum malaria in Vietnam:

Randomised clinical. Lancet; 363(9402):18-22.

61. Hien Tran Tinh, Christiane Dolecek, Nicholas J White, Jeremy Farrar

(2007). Randomized clinical trials of dihydroartemisinin-piperaquine against

multidrug resistant falciparum malaria in Viet Nam. Lancet 2007 Jan

363(9402):3-9.

62. Imwong M, Suwannasin K, Kunasol C et al., (2017). The spread of

artemisinin-resistant Plasmodium falciparum in the Greater Mekong

subregion: a molecu-lar epidemiology observational study. Lancet Infect Dis

2017; 17: 491–7.

63. José Antonio Garrido-Cardenas, Francisco Manzano-Agugliaro et al.,

(2019). Plasmodium genomics: An approach for learning about and ending

human malaria. Parasitology Research (2019) 118:1-27.

64. Tangpukdee N, Krudsood S, Thanachartwet V (2008). Efficacy of Artequick

versus artesunate-mefloquine in the treatment of acute uncomplicated

falciparum malaria in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health.

2008 Jan;39(1):1-8.

65. The Four Artemisinin-Based Combinations (4ABC) Study Group. (2011). A

Head-to-Head Comparison of Four Artemisinin-Based Combinations for

Treating Uncomplicated Malaria in African Children: A Randomized Trial.

PLoS Med 8(11): e1001119. doi:10.1371/journal.pmed.1001119;

66. Thriemer K, Hong N, Rosanas-Urgell A, et al. (2014). Delayed parasite

clearance after treatment with dihydroartemisinin-piperaquine in

Plasmodium falciparum malaria patients in Central Vietnam. Antimicrob

Agents Chemother. 2014;58(12):7049-7055.

67. Kittiya Mahotorn, Peerapan Tan-ariya, Thunyapit Thita et al.,(2018). In

Vitro Sensitivity of Pyronaridin in Thai Isolates of Plasmodium falciparum.

Am. J. Trop. Med. Hyg., 98(1), 2018, pp. 51–56. doi:10.4269/ajtmh.17-0286.

68. Mathirut Mungthin, Ekularn Watanatanasup, Naruemon Sitthichot, etal,.

(2017). Influence of the pfmdr1 Gene on In Vitro Sensitivities of Piperaquine

in Thai Isolates of Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg., 96(3),

2017, pp. 624–629.doi:10.4269/ajtmh.16-0668

69. Mallika Imwong, Olivo Miotto, Arjen M. Dondorp et al, (2021). Evolution

of multidrug resistance in Plasmodium falciparum: A longitudinal study of

genetic resistance markers in the Greater Mekong Subregion. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, Vol. 65, No. 12

70. Mey Bouth Denis, Timothy M.E.Davis, SeanHewitt (2002). Efficacy and

safety of dihydroartemisinin-piperaquine (Artekin) in Cambodian children

and adults with uncomplicated falciparum malaria. CID 2002(35):1469-76.

71. Menard D, Dondorp A. Antimalarial drug resistance: a threat to malaria

elimination. Cold Spring Harb Perspect Med 2017; 7: a025619.

72. Miotto Olivo, Amato R, Ashley EA et al (2015). Genetic architecture of

artemisinin-resistant Plasmodium falciparum. Nat Genet 2015, 47:226-234.

73. Mukul Rawat, Abhishek Kanyal, Krishanpal Karmodiya (2022).

Identification of co-existing mutations and gene expression trends associated

with K13-mediated artemisinin resistance in P.falciparum. Front. Genet., 06

April 2022

74. Myat Htut Nyunt, Myat Thu Soe, Myat Phone Kyaw et al.,(2017). Clinical

and molecular surveillance of artemisinin resistant falciparum malaria in

Myanmar (2009–2013) Malar J. 2017; 16: 333. doi: 10.1186/s12936-017-

1983-9

75. Nguyen Thuy-Nhien, Huynh Hong Quang, Jeremy Farrar, Nicholas J. White,

Tran Tinh Hien (2017). K13 propeller mutations in Plasmodium falciparum

populations in regions of malaria endemicity in Vietnam (2009-2016).

Antimicrob Agents Chemother 61:e01578-16.

76. Thanh NV, Thuy-Nhien N, Tuyen NTK et al.,(2017). Rapid decline in the

susceptibil-ity of Plasmodium falciparum to dihydroartemisinin–piperaquine

in the south of Vietnam. Malar J 2017; 16: 27.

77. N.X. Thanh, T.N. Trung, N.C. Phong, H.H. Quang G Dennis Shanks, Marina

Chavchich, Michael D Edstein (2012). The efficacy and tolerability of

artemisinin-piperaquin versus artesunat-amodiaquin for the treatment of

uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in South-Central Vietnam”,

Malaria Journal 2012, 11:217. doi:10.1186/1475-2875-11-217.

78. Niraja Suresh, Kasturi Haldar (2018). Mechanism of artemisinin resistance

in P. falciparum malaria. Current Opinion in Pharmacology, 42:46-54.

79. Najia Karim Ghanchi, Bushra Qurashi, Mohammad Asim Beg Philippe

(2021). Molecular surveillance of drug resistance: Plasmodium falciparum

artemisinin resistance single nucleotide polymorphisms in Kelch protein

propeller (K13) domain from Southern Pakistan. Malar J (2021) 20:176.

80. Leah Mwai, Steven M. Kiara, Abdi Abdirahman, et al., (2009). In Vitro

Activities of Piperaquine, Lumefantrine, and Dihydroartemisinin in

Kenyan Plasmodium falciparum Isolates and Polymorphisms

in pfcrt and pfmdr1▿Antimicrob Agents Chemother. 2009 Dec; 53(12): 5069–

5073. Published online 2009 Sep 21. doi: 10.1128/AAC.00638-09.

81. Bosman, Didier Ménard, Jean-Marie Kindermans (2014). Plasmodium

prevalence and artemisinin-resistant falciparum malaria in Preah Vihear

province, Cambodia: A cross-sectional population-based study. Malaria

Journal, 13:394

82. Paola Favuzza, Jennifer K. Thompson, Alan F. Cowman et al., (2020). Dual

plasmepsin-targeting antimalarial agents disrupt multiple stages of the

malaria parasite life cycle. Cell host and microbe 27, 642-658.

83. Pharath Lim , Chansuda Wongsrichanalai, Pheaktra Chim, Nimol

Khim, Saorin Kim, et al., (2010). Decreased in vitro susceptibility of

Plasmodium falciparum isolates to artesunate, mefloquine, chloroquine, and

quinine in Cambodia from 2001 to 2007. 2010 May;54(5):2135-42.

PMCID: PMC2863643 DOI: 10.1128/AAC.01304-09

84. Phong NC, Chavchich M, Quang HH et al.. (2019). Susceptibility of

Plasmodium falciparum to artemisinins and Plasmodium vivax to chloroquine

in Phuoc Chien Commune, Ninh Thuan Province, south-central Vietnam.

Malar J 2019; 18: 10.

85. Bui Quang Phuc, Huynh Hong Quang, Tran Thanh Duong et al., (2013).

Efficacy and safety of oral artesunate and dihydroartemisinin-piperaquin for

the treatment of uncomplicated P.falciparum malaria in Binh Thuan, Ninh

Thuan, Daklak and Gia Lai provinces, Vietnam 2011-2012. Journal for

malaria and parasitic disease control, vol. 5-2013, ISSN 0868-3735, pp.84-

89.

86. Phuc BQ, Rasmussen C, Menard D, Bustos D, Ringwald P, Thieu NQ

(2017). Treatment failure of dihydroartemisinin-piperaquine phosphate for

Plasmodium falciparum malaria, Vietnam. Emerg Infect Dis 2017:715-717.

87. Phuc Quang Bui, Quang Hong Huynh, Thieu Quang Nguyen, Hanh Van

Truong, Benoit Witkowski, Dai Cong Tran, Maria Dorina Bustos, Pascal

Ringwald, Tinh Thi Ta (2019). Pyronaridine-artesunate efficacy and safety

in uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in areas of artemisinin-

resistant falciparum in Viet Nam (2017-2018). Clinical Infectious Diseases.

doi: 10.1093/cid/ciz580.

88. Pascual A, Madamet M, Bertaux L, Amalvict R, et al., In vitro piperaquine

susceptibility is not associated with the Plasmodium falciparum chloroquine

resistance transporter gene. French National Reference Centre for Imported

Malaria Study Group.Malar J. 2013 Nov 25;12:431.

89. Huynh Hong Quang, Trieu Nguyen Trung, Ta Thi Tinh et al., (2013),

Conventional and nouvel antimalarial drug efficacy: A review over the last

decade (2001-2011) in Central highland, Vietnam. Journal for malaria and

parasitic disease control, vol. 5-2013, ISSN 0868-3735, pp.48-58

90. Huynh Hong Quang, Nguyen Thi Lien Hanh, Nguyen Thi Minh Trinh

(2017). Artemisinins resistance molecular marker Kelch 13

in falciparum malaria in two sentinel sites of Central Highlands of Vietnam.

Vietnam Journal of Preventive Medicine, Volume 27, Issue 4, 2017, pp. 68-

78.

91. Ngo Viet Thanh, Nguyen Thuy Nhien, Huynh Hong Quang, Jeremy Farrar,

Nicholas J. White, Tran Tinh Hien (2017). Rapid decline in the susceptibility

of P. falciparum to dihydroartemisinine-piperaquine phosphate in the South

of Vietnam. Malar J (2017) 16:27.

92. Ringwald. P and Basco. LK (1999). In vitro activity of dihydroartemisinin

against clinical isolates of Plasmodium falciparum in Yaounde, Cameroon.

.Am. J. Trop. Med. Hyg 61(2):187-192.

93. Richard T. Eastman, David A. Fidock (2009), “Artemisinin-based

combination therapies: A vital tool in efforts to eliminate malaria”, Nature

reviews microbiology 7, 864-874.

94. Ross LS, Dhingra SK, Mok S et al,. (2018). Emerging Southeast Asian

PfCRT muta-tions confer Plasmodium falciparum resistance to the first-line

antimalarial piperaquine. Nat Commun 2018; 9: 3314.

95. Rob W van der Pluijm, Mallika Imwong, Prof, Nguyen Hoang Chau, et

al,.(2019). Determinants of dihydroartemisinin-piperaquine treatment failure

in Plasmodium falciparum malaria in Cambodia, Thailand, and Vietnam: a

prospective clinical, pharmacological, and genetic study. Lancet Infect

Dis. 2019 Sep; 19(9): 952–961. doi: 10.1016/S1473-3099(19)30391-3.

96. Undark et al., (2022). Drug-resistant malaria is emerging in Africa. Is the

world ready? https://www.gavi.org/vaccineswork/drug-resistant-malaria.

97. Van der Pluijm RW, Imwong M, Chau NH et al,. (2019). Determinants of

dihydroar-temisinin–piperaquine treatment failure in Plasmodium falciparum

malaria in Cambodia, Thailand, and Vietnam: a prospective clinical,

pharmacological, and genetic study. Lancet Infect Dis 2019; 19: 952–61

98. Wanna Chaijaroenkul, Mathirut Mungthin et al., (2005). In vitro antimalarial

drug susceptibility in Thai border areas from 1998-2003. Malar J. 2005;

99. WHO (1997). In vitro micro test (MARKII) for the assessment the

response of P.

falciparum

to chloroquine, mefloquine, quinine,

amodiaquine, sulfadoxine/pyrimethamine and artemisinin. Unpublished

document; CTD/MAL/97.20.

4:37.

100. WHO (2008). Methods and techniques for clinical trials on antimalarial

drug efficacy: Genotyping to identify parasite populations.

101. WHO (2009). Methods for surveillance of antimalarial drug efficacy.

102. WHO (2010). Field application of in vitro assays for the sensitivity of

human malaria parasites tp antimalarial drugs. L.K

Basco.http://whqlibdoc.who.int/publications/2007/9789241595155_eng.pdf.

Last accessed 22 May 2012.

103. WHO (2011). Global report on antimalarial efficacy & drug resistance

2000-2010. https://www.who.int/publications/i/item/9789241500470.

104. WHO (2017). Artemisinin and artemisinin-based combin-ation therapy

resistance. Status Report. 2017. https://apps.who.int/iris/han

dle/10665/255213.

105. WHO (2018). Artemisinin and artemisinine-based combination therapy

resistance. Status report August, 2018.

106. WHO (2019). Artemisinin resistance and artemisinin-based combination

therapy efficacy, Status report December, 2019

107. WHO (2020). Report on antimalarial drug efficacy, resistance and response,

10 years of surveillance (2010-2019)

108. WHO (2020). World malaria report: 20 years of global progress and

challenges

109. WHO (2022). Technical consultation on the malaria rebound phenomenon.

Report on a virtual meeting, 22-23 March 2022

110. Workineh Shibeshi, Assefa Mulu Baye, Ephrem Engidawork (2022).

Efficacy and safety of Artemisinin-based combination therapy for the

treatment of uncomplicated malaria in pregnant women: A systematic review

and meta-analysis. Therapeutics and Clinical Risk Management

2021(17):1353-1370

111. Witkowski B, Amaratunga C, Khim N et al. (2013). Novel phenotypic

assays for the detection of artemisinin-resistant P. falciparum malaria in

Cambodia: In-vitro and ex-vivo drug-response studies. Lancet Infect

Dis;13(12):1043-49.

112. WWARN K13 Genotype-Phenotype Study Group. Association of muta-

tions in the Plasmodium falciparum Kelch13 gene (Pf3D7_1343700) with

parasite clearance rates after artemisinin-based treatments- a WWARN in-

dividual patient data meta-analysis. BMC Med 2019; 17: 1.

113. WWARN, 2014, Worldwinde antimalarial Resistance network.

http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator.

114. Xiangli Kong, Jun Feng, Yan Xu, Ge Yan, Shuisen Zhou (2022). Molecular

surveillance of artemisinin resistance-related PfK13 and Pfcrt

polymorphisms in imported Plasmodium falciparum isolates reported in

Eastern China from 2015-2019. Research square,

https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1964099/v1.

Phụ lục 1

THÔNG TIN CHUNG VỀ NGHIÊN CỨU

Tên tôi là Đỗ Mạnh Hà, đang làm việc tại Viện Sốt rét-KST-CT TƢ, Bộ Y tế.

Hiện chúng tôi đang nghiên cứu về điều trị sốt rét. Sốt rét là một bệnh phổ biến và

nguy hiểm trong khu vực, tuy vậy bệnh có thể điều trị khỏi bằng thuốc. Mục đích

của nghiên cứu là đánh giá thuốc dihydroartemisinin-piperaquin phosphat điều trị

sốt rét do P. falciparum không biến chứng, theo hƣớng dẫn của Bộ Y tế.

Chúng tôi mời những ngƣời lớn và trẻ em từ 2 tuổi đến 70 tuổi, đang sống ở

vùng này tham gia vào nghiên cứu để giúp khẳng định hiệu lực của thuốc sử dụng

để điều trị bệnh nhân sốt rét. Tôi sẽ cung cấp thêm thông tin cho bạn và mời bạn

(hoặc con bạn) tham gia nghiên cứu này. Trƣớc khi quyết định xem bạn (hoặc con

bạn) có tham gia hay không, bạn có thể trao đổi thêm với bất kỳ ai nếu bạn thấy phù

hợp. Có thể có một số từ bạn không hiểu. Nếu không hiểu thì nhắc tôi dừng lại và

tôi sẽ giải thích cho bạn hiểu. Nếu sau này bạn có vấn đề gì thì có thể hỏi tôi, bác sỹ

khác hoặc cán bộ trong nhóm nghiên cứu. Bạn (hoặc con bạn) tham gia nghiên cứu

này là hoàn toàn tự nguyện. Nếu bạn (hoặc con bạn) không đồng ý, bạn (hoặc con

bạn) vẫn tiếp tục đƣợc điều trị bệnh nhƣ bình thƣờng. Thậm chí nếu bạn đồng ý bây

giờ, nhƣng sau này thay đổi ý định không tiếp tục nữa, bạn (hoặc con bạn) vẫn tiếp

tục đƣợc chữa bệnh.

Thuốc điều trị:

Nếu bạn đáp ứng tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu, chúng tôi sẽ cung cấp cho

bạn thuốc sốt rét dihydroartemisinin-piperaquin phosphat trong 3 ngày liên tiếp.

Bạn (con bạn) sẽ uống từ ½ viên đến 4 viên (tùy loại thuốc) mỗi ngày tuỳ theo cân

nặng, trong 2-3 ngày liên tiếp. Liều lƣợng theo đúng liều mà Bộ Y tế đã qui định

điều trị cho bệnh nhân sốt rét và nhà sản xuất đã ghi trên lọ.

Các nguy cơ (tác dụng ngoại ý) có thể khi sử dụng thuốc nghiên cứu. Tất cả

thuốc đều có thể gây ra các tác dụng ngoại ý. Bạn có thể bị hoa mắt chóng mặt nhẹ

(nhƣng hiếm). Các tác dụng ngoại ý khác thỉnh thoảng xảy ra đó là đau bụng, buồn

nôn. Bạn nên báo cho bác sỹ khi các tác dụng ngoại ý này xảy ra.

Trong thời gian theo dõi, chúng tôi sẽ có thể tiến hành nhiều lần lấy một ít

máu ở đầu ngón tay của bạn (hoặc con bạn). Bạn (hoặc con bạn) có thể cảm thấy

hơi đau ở chỗ lấy máu. Đau sẽ hết trong vòng 1 ngày. Máu sẽ lấy vào lam kính và

mẫu giấy thấm nhỏ. Mẫu máu sẽ dùng để đếm số lƣợng KSTSR trong máu của bạn

(hoặc con bạn) và nghiên cứu đặc điểm của chúng. Các KST sẽ đƣợc phân tích sau

nghiên cứu. Phân tích mẫu máu sẽ không ảnh hƣởng đến kết quả điều trị. Mẫu máu

chỉ dùng vào mục đích nhƣ vậy, chứ không mục đích nào khác.

Nghiên cứu hiệu lực thuốc sẽ kéo dài 42 ngày. Trong thời gian đó bạn (hoặc

con bạn) sẽ điều trị tại TYT xã trong 3 ngày đầu. Vào các ngày D7, D14, D21, D28,

D35, D42 thì mỗi ngày bạn (hoặc con bạn) đến TYT để khám bệnh và xét nghiệm

KSTSR. Trong trƣờng hợp bạn (hoặc con bạn) có sốt trong quá trình theo dõi, bạn

(hoặc con bạn) cần phải đến TYT xã mà không chờ đợi đến lịch. Sau 42 ngày sẽ kết

thúc liệu trình theo dõi. Mỗi lần đến, bạn sẽ đƣợc thầy thuốc khám lại. Trong quá

trình điều trị, bạn (hoặc con bạn) không đƣợc dùng thêm bất kỳ thuốc nào khác nếu

không đƣợc phép của bác sỹ. Với nữ trên 12 tuổi (có gia đình), cần xét nghiệm nƣớc

tiểu để loại bỏ những trƣờng hợp có thai.

Thuốc có thể có một số tác dụng ngoại ý nhƣ chóng mặt, buồn nôn, nôn nhƣng

hiếm khi xảy ra. Chúng tôi sẽ theo dõi bạn (hoặc con bạn) chặt chẽ để phát hiện

biểu hiện này nếu có hoặc theo dõi các vấn đề khác. Tôi sẽ cho bạn số điện thoại để

gọi nếu có gì bất thƣờng hoặn nếu bạn cần hỏi. Bạn cũng có thể đếm trạm y tế bất

kỳ lúc nào để gặp bác sỹ. Nếu bạn (hoặc con bạn) có xuất hiện các tác dụng ngoại ý

của thuốc, chúng tôi có thể cấp một số thuốc miễn phí cho bạn để giúp giảm các

triệu chứng hoặc chúng tôi có thể dừng thuốc, nếu cần, chúng tôi sẽ hội chẩn và sẽ

luôn hỏi ý kiến của bạn mỗi khi thay đổi.

Nếu bạn (hoặc con bạn) quyết định tham gia nghiên cứu này, những ốm đau

liên quan đến sốt rét hoặc tới điều trị sốt rét sẽ đƣợc điều trị miễn phí cho bạn. Bạn

(hoặc con bạn) tham gia sẽ giúp chúng tôi đánh giá hiệu quả thuốc sốt rét và nhƣ

vậy sẽ có lợi cho xã hội và thế hệ tƣơng lai. Chúng tôi sẽ trả tiền đi lại cho bạn (nếu

bạn tự đến).

Chúng tôi sẽ không chia sẽ thông tin về những ngƣời tham gia trong nghiên

cứu này với bất kỳ ai. Thông tin thu thập từ nghiên cứu này đƣợc giữ bí mật. Các

thông tin mà bạn ( hoặc con bạn) cung cấp đề đƣợc ghi mã số chứ không ghi tên bạn

(hoặc con bạn). Chỉ có những ngƣời tham gia nghiên cứu mới biết số nào là của

bạn. Chúng tôi sẽ chia sẽ kiến thức mà chúng tôi có đƣợc trong nghiên cứu này với

bạn trƣớc khi công bố rộng rãi. Những thông tin bí mật sẽ không đƣợc chia sẽ. Sẽ

có cuộc họp nhỏ ở xã và cuộc họp này sẽ không công bố công khai. Sau đó chúng

tôi sẽ công bố kết quả và số liệu để những ngƣời khác quan tâm đến lĩnh vực này

học hỏi đƣợc từ nghiên cứu này.

Đề cƣơng này đã đƣợc thông qua và chấp thuận của Hội đồng Đạo đức Y sinh

học của Tổ chức Y tế thế giới, Viện Sốt rét-KST-CT TƢ. Nếu bạn muốn tìm hiểu

kỹ hơn về hội đồng phê duyệt, bạn có thể liên hệ với họ. Nếu bạn có câu hỏi gì liên

quan tới nghiên cứu này thì hãy tới địa điểm nghiên cứu.

. .

Phụ lục 2

MẪU SÀNG LỌC BỆNH NHÂN SỐT RÉT DO P. FALCIPARUM

Số hiệu sàng lọc của BN Ngày đến khám

Số nghiên cứu:

Sàng lọc /Trƣớc điều trị

Ngày tháng năm

ĐIỂM NGHIÊN CỨU - SENTINEL SITE

Tên trung tâm y tế:

Xã:

Huyện:

Tỉnh:

SỐ LIỆU NHÂN KHẨU HỌC

hoặc tuổi ƣớc đoán: tháng hoặc năm

Ngày sinh:

Ngày tháng năm

Giới (Chỉ đánh dấu vào một ô (☑)):  Nam  Nữ

. .

Chiều cao: cm Cân nặng: kg

NHIỆT ĐỘ CƠ THỂ TRƢỚC ĐIỀU TRỊ

Có tiền sử sốt trong vòng 24 giờ trƣớc đó  Có  Không Nhiệt độ: C Đánh dấu vào ô (☑) thích hợp:- nách -màng nhĩ - trực tràng - miệng

XÉT NGHIỆM MÁU GIỌT DÀY VÀ GIỌT MỎNG ĐỂ PHÁT VÀ

ĐẾM KÝ SINH TRÙNG P. FALCIPARUM

Loài? P. falciparum  P. vivax  P. ovale  P. malariae 

Có giao bào P. falciparum?

Số lƣợng KST P. falciparum thể vô tính:...............................

Có loài KST khác ngoài P. falciparum không? Nếu có, bệnh nhân không đạt tiêu chuẩn lựa chọn.

 Có  Không

LÂY MẪU MÁU LÀM PCR

Có lấy mẫu máu làm PCR không?  Có  Không

PHÂN TÍCH NƢỚC TIỂU (TÉT THỬ THAI) Phần này chỉ áp dụng cho bệnh nhân nữ.

Kết quả tét thử thai:  Âm tính  Dƣơng tính Nếu (+), bệnh nhân không đạt tiêu chuẩn)

TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN

1. Bệnh nhân mắc sốt rét chƣa biến chứng từ 2 tuổi đến 70 tuổi;

2. Nhiễm đơn thuần P. falciparum với mật độ từ 1000 đến dƣới 100.000/µL máu.

3. Nhiệt độ nách ≥ 37,5°C hoặc có tiền sử sốt trong vòng 24 giờ;

4. Bệnh nhân có khả năng uống đƣợc thuốc;

5. Chƣa dùng thuốc sốt rét trong thời gian 2 tuần gần đây;

6. Không mắc các bệnh mãn tính về gan, thận, tim mạch cũng nhƣ các bệnh nhiễm trùng

cấp tính khác, không suy gan, suy thận.

7. Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu thông qua bản chấp thuận tham gia.

Bệnh nhân có đạt các tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu khổng?

 Có  Không

TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ

1. Bệnh nhân sốt rét là phụ nữ mang

2. Nhiễm KSTSR khác loài P. falciparum hoặc nhiễm phối hợp có P. falciparum;

3. Không có khả năng uống đƣợc thuốc;

4. Bệnh nhân bi rối loạn tiêu hóa hoặc bất dung nạp đƣờng uống;

5. Bệnh nhân bị sốt rét nhƣng mắc thêm các bệnh mạn tính, sốt rét nặng, SRAT, suy gan, suy

thận, hoặc đã dùng thuốc sốt rét trong thời gian 2 tuần gần đây;

6. Bệnh nhân không đồng ý tham gia vào nghiên cứu hoặc không chịu theo lịch khám và theo dõi

trong suốt 42 ngày của quy trình đề cƣơng.

Bệnh nhân có các tiêu chuẩn loại trừ không?

 Có  Không

Nếu có, hãy nêu cụ thể lý do loại trừ:

Số hiệu bệnh nhân

BỆNH NHÂN THÔNG BÁO ĐỒNG Ý VÀ CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Ngày tháng năm

Ký bản đồng ý:  Có  Không Ký bản chấp thuận:  Có  Không

Phụ lục 3

PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN

SỐT RÉT DO P. FALCIPARUM

Tôi/Cháu tôi đó đƣợc mời tham gia nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều trị của thuốc

sốt rét. Tôi hiểu rằng tôi/cháu tôi sẽ uống Arterakin để điều trị sốt rét không biến

chứng do Plasmodium falciparum cần theo dõi điều trị 42 ngày. Tôi cũng đã đƣợc

thông báo là những nguy cơ chỉ ở mức tối thiểu, kể cả đau ở đầu ngón tay. Tôi biết

rằng, bản thân tôi/cháu tôi có thể không đƣợc lợi gì. Ngƣời ta đã cho tôi tên của chủ

trì đề tài, ngƣời mà tôi có thể dễ dàng liên hệ tại số điện thoại họ đã cho.

Chữ ký của ngƣời tham gia:

Tôi đã đọc các thông tin trên, hoặc đã nghe đọc. Tôi đã có dịp để hỏi các câu hỏi,

bất kỳ câu hỏi nào của tôi cũng đƣợc trả lời thoả đáng. Tôi đồng ý tự nguyện tham

gia vào nghiên cứu giám sát này và hiểu rằng tôi/cháu tôi có quyền rút khỏi nghiên

cứu vào bất kỳ lúc nào mà vẫn không ảnh hƣởng đến quá trình điều trị bệnh cho

tôi/cháu tôi .

Họ tên ngƣời tham gia:………………………………………

Chữ ký của ngƣời tham gia:…………………………………..

Ngày…….tháng…………năm…………

Chữ ký của ngƣời làm chứng: (Nếu bệnh nhân không tự đọc, ngƣời làm chứng

đọc đƣợc phải ký. Nếu có thể thì ngƣời này phải do bệnh nhân chọn và phải không

liên quan gì tới nhóm nghiên cứu).

Tôi đã chứng kiến, đọc đúng bản đồng ý tự nguyện tham gia cho bệnh nhân. Tất cả

các câu hỏi của bệnh nhân đã đƣợc trả lời. Tôi khẳng định bệnh nhân đồng ý tự

nguyện tham gia vào nghiên cứu này.

Tên ngƣời làm chứng: _______________________________ Điểm chỉ của

bệnh nhân (hoặc ngƣời bảo hộ)

Chữ ký ngƣời làm chứng: ___________________

Ngày: _____________________

Chữ ký của ngƣời nghiên cứu:

Tôi đã đọc hoặc chứng kíến đọc đúng mẫu đồng ý tham gia cho bệnh nhân và bệnh

nhân đã có cơ hội để hỏi tất cả các câu hỏi. Tôi khẳng định bệnh nhân đồng ý tự

nguyện tham gia vào nghiên cứu này.

Tên ngƣời nghiên cứu: ______________________________

Chữ ký ngƣời nghiên cứu: _____________________

Ngày: ____________________

Bệnh nhân đó đƣợc cấp mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu:………………..(chữ ký

của nghiên cứu viên hoặc trợ lý)

Phụ lục 4.

PHIẾU ĐỒNG Ý THỬ NƢỚC TIỂU XÁC ĐỊNH CÓ THAI

Tôi đƣợc mời tham gia nghiên cứu hiệu lực điều trị thuốc sốt rét. Nhóm

nghiên cứu yêu cầu tôi lấy nƣớc tiểu vào ngày đầu tiên và ngày thứ 42 hoặc vào

ngày tôi không đồng ý tham gia nghiên cứu, mẫu nƣớc tiểu này sẽ đƣợc xét nghiệm

để xác định tôi có thai hay không. Tôi hiểu rằng kết quả xét nghiệm sẽ đƣợc giữ kín

và không điền tên. Tôi hiểu tôi phải tránh có thai trong thời gian nghiên cứu vì

thuốc tôi uống có thể ảnh hƣởng đến thai nhi. Tôi đã thảo luận với bác sĩ về các

biện pháp tránh thai và họ đã yêu cầu tôi sử dụng bao cao su. Tôi hiểu rằng nếu xét

nghiệm dƣơng tính tôi sẽ không đƣợc tham gia nghiên cứu.

Chữ ký của ngƣời tham gia:

Tôi đồng ý thử: ______________________(chữ ký ngƣời tham gia) hoặc không

đồng ý

lấy máu XN và

tôi không ký vào mẫu đồng ý dƣới đây

_________________________ (chữ ký của ngƣời tham gia)

Tên của ngƣời tham gia

Chữ ký của ngƣời tham gia

Ngày

(Ngày/tháng/năm)

Chữ ký của ngƣời làm chứng:

Chỉ cần chữ ký của ngƣời làm chứng và điểm chỉ của của tham gia, nếu ngƣời

tham gia không biết chữ. Trong trƣờng hợp ngƣời làm chứng biết chữ cần phải ký.

Nếu có thể, thì ngƣời tham gia sẽ chọn ngƣời làm chứng và không liên quan gì với

nhóm nghiên cứu).

Tôi xác nhận đã đọc chính xác các mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu cho ngƣời

sắp tham gia nghiên cứu và họ đã có điều kiện để hỏi kỹ hơn. Tôi khẳng định rằng

ngƣời tham gia đã tự nguyện tham gia nghiên cứu.

Tên của ngƣời

Điểm chỉ của ngƣời tham gia:

làm chứng:

Chữ ký của ngƣời

làm chứng

Ngày:

Chữ ký của ngƣời điều tra:

Tôi đã đọc chính xác /ngƣời làm chứng đã đọc chính xác mẫu đồng ý tham gia

nghiên cứu cho ngƣời tham gia nghiên cứu, và ngƣời tham gia đã có cơ hội đƣợc

hỏi. Tôi xác định là ngƣời tham gia hoàn toàn tự nguyện

Tên của ngƣời điều tra:

Chữ ký của ngƣời điều tra:

Ngày:

Một bản phô tô của mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu đã đƣợc đƣa cho ngƣời tham

gia ___________________

(Chữ ký của chủ trì đề tài hoặc điều tra viên)

Phụ lục 5.

BẢN MÔ TẢ QUYỀN LỢI VÀ NGHĨA VỤ

ĐỐI VỚI ĐỐI TƢỢNG THAM GIA NGHIÊN CỨU

Khi tiến hành nghiên cứu, những bệnh nhân đủ điều kiện tiêu chuẩn sẽ đƣợc

các bác sĩ trƣởng nhóm nghiên cứu giải thích kỹ về quyền lợi và nghĩa vụ của bệnh

nhân mắc sốt rét tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân đó chỉ đƣợc đƣa vào nghiên cứu

nếu họ tình nguyện và cam kết tham gia nghiên cứu. Họ sẽ đƣợc khám bệnh, cặp

nhiệt độ, lập phiếu theo dõi, lấy lam máu làm xét nghiệm, uống thuốc của nghiên

cuứ đề ra (thuốc sốt rét và một số thuốc bổ trợ khác) theo đúng quy trình trong đề

cƣơng nghiên cứu. tất cả chi phí điều trị (thuốc sốt rét, thuốc điều trị triệu chứng,

vitamin, các xét nghiệm,…) trong suốt thời gian nghiên cứu đều đƣợc miễn phí.

Mọi phí tổn liên quan đến đi lại để khám hoặc xét nghiệm lại đúng lịch trình

nghiên cứu, nhóm nghiên cứu sẽ chi trả lại đầy đủ. Các bệnh nhân đƣợc khám bệnh

kỹ, đƣợc bác sĩ trực tiếp cho uống thuốc, đƣợc theo dõi sát trong thời gian nghiên

cứu, đƣợc giải thích chu đáo, đƣợc quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào nếu họ

không muốn hợp tác. Đồng thời, mỗi ngày lấy lam máu làm xét nghiệm, đếm ký

sinh trùng sốt rét, họ đƣợc bồi dƣỡng thù lao đầy đủ.

Thực tế nhóm nghiên cứu muốn giá trị thù lao này cao hơn nữa, nhƣng do kinh

phí đề tài hạn hẹp nên nhóm nghiên cứu chƣa thể đáp ứng đƣợc. Về phần nghĩa vụ,

họ sẽ phải đến khám bệnh, uống thuốc và làm xét nghiệm theo đúng lịch hẹn mà

cán bộ nghiên cứu đã hƣớng dẫn, cũng nhƣ trả lời trung thực các câu hỏi mà thầy

thuốc hoặc cán bộ nghiên cứu hỏi khi theo dõi các tác dụng ngoại ý trên lâm sàng

(nếu có) đối với loại thuốc nghiên cứu này.

……, ngày …..tháng ……năm …

Chủ nghiệm đề tài (Đã ký)

Phụ lục 6: DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

7 33 29 27 24 21 26 22 56 33 12 20 28 41 37 20 21 64 7 20 39 23 18 25 20 27 14 20 24 20 26 30 45 18 13 24 20 44 49

Ngày D3 48 0 0 0 0 224 64 16 0 0 16 0 0 0 560 16 32 0 16 32 0 0 0 0 0 0 16 32 0 0 0 0 0 0 880 0 16 760 236

M F M M M M M M F M F M F F M M M M F F M F M M M M M F F M M M F F M M M F M

C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y WT C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y

Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc Bình Phƣớc

01BPAK 02BPAK 03BPAK 04BPAK 05BPAK 06BPAK 07BPAK 08BPAK 09BPAK 10BPAK 11BPAK 12BPAK 13BPAK 14BPAK 15BPAK 16BPAK 17BPAK 18BPAK 19BPAK 20BPAK 21BPAK 22BPAK 23BPAK 24BPAK 25BPAK 26BPAK 27BPAK 28BPAK 29BPAK 30BPAK 31BPAK 32BPAK 33BPAK 34BPAK 35BPAK 36BPAK 36BPAK 38BPAK 39BPAK

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

40 GLKPAK 01 Gia Lai 41 GLKPAK 02 Gia Lai 42 GLKPAK 03 Gia Lai 43 GLKPAK 04 Gia Lai 44 GLKPAK 05 Gia Lai 45 GLKPAK 06 Gia Lai 46 GLKPAK 07 Gia Lai 47 GLKPAK 08 Gia Lai 48 GLKPAK 09 Gia Lai 49 GLKPAK 10 Gia Lai 50 GLKPAK 11 Gia Lai 51 GLKPAK 12 Gia Lai 52 GLKPAK 13 Gia Lai 53 GLKPAK 14 Gia Lai 54 GLKPAK 15 Gia Lai 55 GLKPAK 16 Gia Lai 56 GLKPAK 17 Gia Lai 57 GLKPAK 18 Gia Lai 58 GLKPAK 19 Gia Lai 59 GLKPAK 20 Gia Lai 60 GLKPAK 21 Gia Lai 61 GLKPAK 22 Gia Lai 62 GLKPAK 23 Gia Lai 63 GLKPAK 24 Gia Lai 64 GLKPAK 25 Gia Lai 65 GLKPAK 26 Gia Lai 66 GLKPAK 27 Gia Lai 67 GLKPAK 28 Gia Lai 68 GLKPAK 29 Gia Lai 69 GLKPAK 30 Gia Lai 70 GLKPAK 31 Gia Lai 71 GLKPAK32 Gia Lai 72 GLKPAK 33 Gia Lai 73 GLKPAK 34 Gia Lai 74 GLKPAK 35 Gia Lai 75 GLKPAK 36 Gia Lai 76 GLKPAK 37 Gia Lai 77 GLKPAK 38 Gia Lai 78 GLKPAK 39 Gia Lai 79 GLKPAK 40 Gia Lai 80 GLKPAK 41 Gia Lai

22 51 18 24 30 25 49 35 24 37 25 35 19 27 20 22 36 22 52 25 31 16 29 20 25 27 26 19 27 16 30 35 33 30 15 28 21 21 28 10 28

Ngày D3 215 0 0 0 0 0 488 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 197 0 0 0 0 0 0 7 262 0 672 0 0 0 0 0 0 699 92 0 0

M M F M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M F M M M M M M M

C580Y C580Y WT WT WT WT C580Y WT WT WT K503N WT WT WT WT C580Y WT WT WT WT C580Y C580Y WT WT C580Y C580Y P553L C580Y C580Y C469F P553L C469F P553L C580Y WT K503N C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

81 GLKPAK 42 Gia Lai 82 GLKPAK 43 Gia Lai 83 GLKPAK 44 Gia Lai 84 GLKPAK 45 Gia Lai 85 GLKPAK 46 Gia Lai 86 GLKPAK 47 Gia Lai 87 GLKPAK 48 Gia Lai Gia Lai 88 GLAK01 Gia Lai 89 GLAK02 Gia Lai 90 GLAK03 Gia Lai 91 GLAK04 Gia Lai 92 GLAK05 Gia Lai 93 GLAK06 Gia Lai 94 GLAK07 Gia Lai 95 GLAK08 Gia Lai 96 GLAK09 Gia Lai 97 GLAK10 Gia Lai 98 GLAK11 Gia Lai 99 GLAK12 Gia Lai 100 GLAK13 Gia Lai 101 GLAK14 Gia Lai 102 GLAK15 Gia Lai 103 GLAK16 Gia Lai 104 GLAK17 Gia Lai 105 GLAK18 Gia Lai 106 GLAK19 Gia Lai 107 GLAK20 Gia Lai 108 GLAK21 Gia Lai 109 GLAK22 Gia Lai 110 GLAK23 Gia Lai 111 GLAK24 Gia Lai 112 GLAK25 Gia Lai 113 GLAK26 Gia Lai 114 GLAK27 Gia Lai 115 GLAK28 Gia Lai 116 GLAK29 Gia Lai 117 GLAK30 Gia Lai 118 GLAK31 Gia Lai 119 GLAK32 Gia Lai 120 GLAK33 Gia Lai 121 GLAK34

24 38 27 39 23 40 21 34 25 19 22 43 30 29 30 15 30 37 38 35 60 25 13 10 27 37 14 27 25 33 55 14 30 28 21 8 28 27 10 18 26

Ngày D3 0 0 0 0 0 0 0

M M M M M M M M M M M M F F M M M F M M F M M M M M M M M M M F M M M M F M M M M

WT C580Y C580Y WT C580Y C580Y C580Y Y511H C580Y C469F WT P553L C469F C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y WT WT C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y C580Y P553L C580Y C580Y C580Y WT Y511H C580Y C580Y WT C580Y WT C469F WT

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

Ngày D3

122 GLAK35 123 GLAK36 124 GLAK37 125 GLAK38 126 GLAK39 127 GLAK40 128 GLAK41 129 GLAK42 130 GLAK43 131 GLAK44 132 GLAK45 133 GLAK46 134 GLAK47 135 GLAK48 136 GLAK49 137 GLAK50 138 GLAK51 139 GLAK52 140 GLAK53 141 GLAK54 142 GLAK55 143 GLAK56 144 GLAK57 145 GLAK58 146 GLAK 59 147 GLAK 60 148 01KHAK 149 02KHAK 150 03KHAK 151 04KHAK 152 05KHAK 153 06KHAK 154 07KHAK 155 08KHAK 156 09KHAK 157 10KHAK 158 11KHAK 159 12KHAK 160 13KHAK 161 14KHAK 162 15KHAK

Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Gia Lai Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa Khánh Hòa

22 35 8 21 18 18 39 27 34 36 19 20 43 35 30 16 24 9 25 25 14 27 30 34 28 16 46 9 33 17 37 5 21 50 9 50 36 20 10 11 50

0 0 0 744 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

WT C580Y WT C580Y C580Y C580Y Y511H WT Y511H WT WT WT C580Y WT Y511H WT WT C580Y C580Y WT C580Y WT P553L WT WT WT WT WT WT P553L WT,P553L WT WT WT WT P553L WT WT P553L P553L P553L

M M F M M M M M M M M M M M M M M M M M F M M M M F M M F M M M M F M M M M F F F

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

Khánh Hòa 163 16KHAK Khánh Hòa 164 17KHAK Khánh Hòa 165 18KHAK Khánh Hòa 166 19KHAK Khánh Hòa 167 20KHAK Khánh Hòa 168 21KHAK Khánh Hòa 169 22KHAK Khánh Hòa 170 23KHAK Khánh Hòa 171 24KHAK Khánh Hòa 172 25KHAK Khánh Hòa 173 26KHAK Khánh Hòa 174 27KHAK Khánh Hòa 175 28KHAK Khánh Hòa 176 29KHAK Khánh Hòa 177 30KHAK Khánh Hòa 178 31KHAK Khánh Hòa 179 32KHAK Khánh Hòa 180 33KHAK Khánh Hòa 181 34KHAK Khánh Hòa 182 35KHAK Khánh Hòa 183 36KHAK Khánh Hòa 184 37KHAK Khánh Hòa 185 38KHAK Khánh Hòa 186 39KHAK Khánh Hòa 187 40KHAK Khánh Hòa 188 41KHAK Khánh Hòa 189 42KHAK Khánh Hòa 190 43 KHAK Khánh Hòa 191 44KHAK Khánh Hòa 192 45KHAK Khánh Hòa 193 46KHAK Khánh Hòa 194 47KHAK Khánh Hòa 195 48KHAK Khánh Hòa 196 49KHAK Khánh Hòa 197 50KHAK Khánh Hòa 198 51KAAK Khánh Hòa 199 52KHAK 200 NTAKTG01 Ninh Thuận 201 NTAKTG02 Ninh Thuận 202 NTAKTG03 Ninh Thuận 203 NTAKTG04 Ninh Thuận

49 9 12 14 13 9 2 14 17 47 17 46 50 52 12 16 7 14 60 65 28 44 11 20 14 10 50 23 5 21 50 9 50 52 12 16 7 13 14 34 8

Ngày D3 0 0 0 640 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 282 13 31 0 15 0 0 0 236 1230 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F M M M M F M M F M M M F M F M F M M M M M M M F M F F M M F M M M F M F M M F M

WT WT WT P553L WT P553L WT WT WT H384Q WT WT WT WT WT WT C580Y P553L P553L WT P553L WT WT G639D P553L C580Y WT G638E WT WT WT C580Y WT WT WT WT WT WT WT WT WT

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

204 NTAKTG05 Ninh Thuận 205 NTAKTG06 Ninh Thuận 206 NTAKTG07 Ninh Thuận 207 NTAKTG08 Ninh Thuận 208 NTAKTG09 Ninh Thuận 209 NTAKTG10 Ninh Thuận 210 NTAKTG11 Ninh Thuận 211 NTAKTG12 Ninh Thuận 212 NTAKTG13 Ninh Thuận 213 NTAKTG14 Ninh Thuận 214 NTAKTG15 Ninh Thuận 215 NTAKTG16 Ninh Thuận 216 NTAKTG17 Ninh Thuận 217 NTAKTG18 Ninh Thuận 218 NTAKTG19 Ninh Thuận 219 NTAKTG20 Ninh Thuận 220 NTAKTG21 Ninh Thuận 221 NTAKTG22 Ninh Thuận 222 NTAKTG23 Ninh Thuận 223 NTAKTG24 Ninh Thuận 224 NTAKTG25 Ninh Thuận 225 NTAKTG26 Ninh Thuận 226 NTAKTG27 Ninh Thuận 227 NTAKTG28 Ninh Thuận 228 NTAKTG29 Ninh Thuận 229 NTAKTG30 Ninh Thuận 230 NTAKTH01 Ninh Thuận 231 NTAKTH02 Ninh Thuận 232 NTAKTH03 Ninh Thuận 233 NTAKTH04 Ninh Thuận 234 NTAKTH05 Ninh Thuận 235 NTAKTH06 Ninh Thuận 236 NTAKMN01 Ninh Thuận 237 NTAKMN02 Ninh Thuận 238 NTAKMN03 Ninh Thuận 239 NTAKMN04 Ninh Thuận 240 NTAKMN05 Ninh Thuận 241 NTAKMN06 Ninh Thuận 242 NTAKMN07 Ninh Thuận 243 NTAKMN08 Ninh Thuận 244 01QTAK

Quảng Trị

67 39 28 38 33 54 44 9 35 11 25 27 35 13 6 36 4 16 16 10 57 30 44 31 35 7 23 37 15 30 30 17 40 30 15 21 25 27 35 13 8

Ngày D3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M F M M M M M M M M F M M

WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT C580Y WT WT WT WT WT WT WT C580Y WT WT WT WT WT WT WT C580Y WT WT WT WT

STT

SNC

Địa điểm

Tuổi

Giới

Kiểu gen

245 02QTAK 246 03QTAK 247 04QTAK 248 05QTAK 249 06QTAK 250 07QTAK 251 08QTAK 252 09QTAK 253 10QTAK 254 11QTAK 255 12QTAK 256 13QTAK 257 14QTAK 258 15QTAK 259 16QTAK 260 17QTAK 261 18QTAK 262 19QTAK 263 20QTAK 264 21QTAK 265 22QTAK 266 23QTAK 267 24QTAK 268 25QTAK 269 26QTAK 270 27QTAK 271 28QTAK 272 29QTAK 273 30QTAK 274 31QTAK 275 32QTAK 276 33QTAK 277 34QTAK 278 35QTAK 279 36QTAK 280 37QTAK 281 38QTAK 282 39QTAK 283 40QTAK 284 41QTAK 285 42QTAK

Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị Quảng Trị

32 42 10 4 3 7 20 30 26 58 29 14 27 58 20 43 6 28 19 61 64 29 16 16 16 19 22 13 21 16 15 30 30 17 40 30 15 21 25 58 20

Ngày D3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

WT WT WT WT C580Y WT WT C580Y C580Y WT WT WT,C580Y WT WT WT,C580Y WT WT,C580Y WT,C580Y C580Y C580Y WT WT WT WT WT WT WT C580Y WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT

M M F F F F M M F M F M F M F M F M F M M F M M M M M F F M M F M F M M F M M M M