Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản

Mã ngành : 62 62 03 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. NGUYỄN HỮU DŨNG 2. GS.TS. HEIDRUN I. WERGELAND

KHÁNH HÒA - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

KHÁNH HÒA - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở

cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt

thời gian từ năm 2007-2012 dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Thầy Cô hƣớng dẫn.

Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc

ai công bố trong bất kỳ công trình nào.

Khánh Hòa, năm 2014

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Thùy

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học

Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi

trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá-

NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn

bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án.

Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô

giáo hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sƣ Heidrun I. Wergeland đã định

hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

luận án.

Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng

ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và

phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong

nghiên cứu này.

Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS. Lê Văn Bé, TS. Phạm

Quốc Hùng, TS. Đặng Thúy Bình, ThS. Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ,

đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá

trình thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch

- Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS. Ragnhild A. Jakobsen, TS. Gyri T.

Haugland, TS. Eirin F. Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS. Paul H. Lovik đã

tận tình hƣớng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi

thực hiện nghiên cứu tại Trƣờng Đại học Bergen, Nauy.

Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi đƣợc bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu

sắc nhất đến những ngƣời thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn

Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho

tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó.

Khánh Hòa, năm 2014

Nguyễn Thị Thanh Thùy

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................................ ii

MỤC LỤC ..................................................................................................................................................... iii

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................................... viii

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................................... ix

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................ 4

1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides .......................... 4

1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu ............................................................. 4

1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam.......................................... 6

1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi ....................................................... 8

1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ................... 10

1.2.1. Vi khuẩn Vibrio ........................................................................................ 10

1.2.2. Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ............................................ 15

1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng ................................................................ 17

1.3.1. Miễn dịch tự nhiên ................................................................................... 18

1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ................................................................................... 23

1.3.3. Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá ...................................... 27

1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá ............. 29

1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi ................. 29

1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi ................................................ 30

1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam .................... 36

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 40

2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................... 40

2.1.1. Đối tƣợng .................................................................................................. 40

2.1.2. Vật liệu ..................................................................................................... 40

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 41

2.1.4. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 41

2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án ........................................ 42

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 42

2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ................. 42

2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc

hiệu ở cá mú chấm cam ............................................................................................. 45

2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam ............... 50

2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus ................................................................................ 52

2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 56

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................................. 57

3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam .. 57

3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa ............. 57

3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .................................... 59

3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với

cá mú chấm cam ........................................................................................................ 67

3.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả

năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam ................ 70

3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá

mú chấm cam ............................................................................................................ 71

3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú

chấm cam................................................................................................................... 74

3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền

thận cá mú chấm cam ................................................................................................ 77

3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch

cầu tiền thận cá mú chấm cam .................................................................................. 80

3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam ............................................................ 83

3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus ....................................................................................................... 86

3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam .............................. 86

3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA ....................................... 88

3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam

sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin

có bổ sung chất bổ trợ FIA .......................................................................................... 89

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................. 102

Kết luận ................................................................................................................ 102

Đề xuất ý kiến ...................................................................................................... 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................................... 104

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có)

Blood agar base Môi trƣờng thạch máu BA

Brain Heart Infusion Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn BHI

Colony Forming Unit Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn CFU

Cell-Mediated Immunity Miễn dịch qua trung gian tế bào CMI

C-reaction protein Protein phản ứng C CRP

Direct Immersion Ngâm trực tiếp DI

ĐƢMD Đáp ứng miễn dịch

FCA Freund’s complete Adjuvant Chất bổ trợ toàn phần Freund

FIA Freund’s Incomplete Adjuvant Chất bổ trợ bán phần Freund

HGNNV Humpback grouper nervous necrosis Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú

virus lƣng gù

HI Hyperosmotic Immersion Ngâm trong dung dịch ƣu trƣơng

HRP Horseradish peroxidase

i-ELISA indirect Enzyne Linked Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết

Immunosorbent Assay enzyme gián tiếp

Immunoglobulin globulin miễn dịch Ig

Immunoglobulin M globulin miễn dịch lớp M IgM

Interleukin 1 IL-1

Kilo Dalton Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein kDa

Lethal dose 50 Liều gây chết 50% LD50

Lipopolysacharides LPS

MAC Membrane attacking complex Phức hợp tấn công màng

MAM Multivalent Adhesion Molecule Phân tử gắn kết đa trị

MHC II Major histocompatibility complex Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II

Nutrient Broth Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng NB

Non-specific cytotoxic cell Tế bào độc không đặc hiệu NCC

Natural killer cell Tế bào diệt tự nhiên NK

NTTS Nuôi trồng thủy sản

vii

OD Optical Density Mật độ quang

OMP Outer Membrane Protein Protein ngoại mạc

Phagocytosis activity Hoạt tính thực bào PA

Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm muối photphat PBS

RBA Respiratory burst activity Hoạt tính bùng nổ hô hấp

Relative Percent Survival Hệ số sinh tồn tƣơng đối RPS

Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tƣơng đối RPP

Serum Amyloid Protein Protein huyết thanh dạng sợi SAP

SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis

sIg Surface immunoglobuline Phân tử globulin miễn dịch bề mặt

TCBS Thiosulphate citrate bile salt agar Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio

TDH Thermostable direct haemolysin Độc tố gây dung huyết bền nhiệt

TLH Thermolabile haemolysin Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt

αTNF alpha Tumor Necrosis Factor Yếu tố anpha gây hoại tử khối u

Tác nhân gây bệnh TNGB

Trypticase Soya Agar Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp TSA

Trypticase Soya Broth Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp TSB

TRH tdh-related hemolysin Độc tố gây dung huyết liên quan tdh

Bệnh do vi khuẩn Vibrio Vibriosis

Viral Nervous Necrosis Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút VNN

Vi sinh vật VSV

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi................................................... 9

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ... 60

Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides....... 72

Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau

2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan .................................................................................... 74

Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi

đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau .................................. 77

Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất

hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides .......................................... 99

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides ...................................................... 4

Hình 1.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới .................................... 6

Hình 1.3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu ............... 7

Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio ....................................... 11

Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus .................... 26

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu ........................................................................ 42

Hình 2.2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thí nghiệm (b) ................................. 46

Hình 2.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu ..................................... 48

Hình 2.4: Các bƣớc khảo sát hoạt tính thực bào ...................................................... 49

Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa .......... 57

Hình 3.2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch máu ............................... 62

Hình 3.3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus .......................................................................................... 63

Hình 3.4: Cây phát sinh loài các chủng vi khuẩn Vibrio ......................................... 63

Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng Vibrio parahaemolyticus ................... 66

Hình 3.6: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .... 68

Hình 3.7: Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá mú chấm cam Epinephelus coioides khi bị

cảm nhiễm bởi Vibrio parahaemolyticus với các chủng và mật độ vi khuẩn khác

nhau .......................................................................................................................... 68

Hình 3.8: Hình ảnh các loại tế bào máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides .... 72

Hình 3.9: Chỉ số thực bào của bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus

coioides...................................................................................................................... 78

Hình 3.10: Hình ảnh thực bào của các tế bào bạch cầu mô thận cá mú chấm cam

Epinephelus coioides ................................................................................................ 79

Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam

Epinephelus coioides ................................................................................................. 81

Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm

nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a) và ngày thứ 15 (b) sau

khi ngừng cho ăn β-glucan .......................................................................................... 83

Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch (IgM) của cá mú chấm

cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot ............................................... 86

Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch

bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin đƣợc xác

định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm ................................................... 88

Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam Epinephelus

coioides với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật Western

Blot ........................................................................................................................... 90

Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides

sau khi gây miễn dịch bằng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 đã bất hoạt

bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm ......... 93

Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cƣờng

độc ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch ....................................................... 97

Hình 3.18: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cƣờng

độc ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch ....................................................... 98

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng phục vụ

nhu cầu dinh dƣỡng cho con ngƣời, đồng thời đem lại kim ngạch xuất khẩu cho

nhiều nƣớc có tiềm năng phát triển NTTS, trong đó có Việt Nam.

Hiện nay, xu hƣớng phát triển NTTS thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng

là nâng cao năng suất trên đơn vị diện tích ven bờ nhƣng đảm bảo sự phát triển bền

vững, thân thiện với môi trƣờng tự nhiên. Tuy nhiên, cùng với mức độ thâm canh

hóa, dịch bệnh là trở ngại chính cho sự phát triển bền vững sản lƣợng NTTS.

Trong những năm qua, việc chữa trị các bệnh do vi khuẩn và do một số tác

nhân khác bằng thuốc kháng sinh và hóa chất đã gây ra nhiều hậu quả tiêu cực, đã

không mang lại hiệu quả chữa trị nhƣ mong muốn mà còn làm tăng chi phí sản xuất.

Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị dẫn đến phát sinh các chủng vi

khuẩn kháng thuốc, không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm [19] và ảnh hƣởng

tới thị trƣờng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam.

Trƣớc bối cảnh đó, nghiên cứu và phát triển vaccine phòng bệnh cho các đối

tƣợng nuôi thủy sản có giá trị kinh tế thực sự là một cuộc cách mạng trong phát

triển NTTS; đây là việc làm cấp thiết và phù hợp với mục tiêu phát triển NTTS ổn

định, bền vững và thân thiện với môi trƣờng. Để thực hiện định hƣớng này, các

nghiên cứu cơ bản về đặc điểm hệ miễn dịch của đối tƣợng nuôi là một trong những

bƣớc khởi đầu quan trọng cần tập trung ƣu tiên.

Trên thế giới, nghiên cứu miễn dịch ở cá bắt đầu từ những năm 50 của thế kỷ

thứ 18 và ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng miễn dịch học ở

cá [204]. Trong vài chục năm gần đây, nghiên cứu sản xuất và sử dụng vaccine

phòng bệnh cá đã đƣợc thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới và gần 100 loài cá đã

đƣợc nghiên cứu về miễn dịch ở mức độ khác nhau [12].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về miễn dịch ở cá vẫn còn khá mới mẻ và chúng ta

chỉ mới ở những bƣớc đi đầu tiên. Điều này thể hiện qua số lƣợng công trình nghiên

cứu liên quan đến miễn dịch và vaccine ở cá còn rất hạn chế. Chỉ một vài cơ quan

nghiên cứu trong cả nƣớc bắt đầu nghiên cứu cũng nhƣ hợp tác với các tổ chức

trong và ngoài nƣớc về vaccine thủy sản và đa phần là nghiên cứu vaccine vi khuẩn

trên cá nƣớc ngọt. Mặc dù vậy, cho tới nay vẫn chƣa có sản phẩm vaccine nào đƣợc

công bố một cách chính thức trong nƣớc.

Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) là một trong những loài cá mú có giá

trị dinh dƣỡng cao, lớn nhanh nên đƣợc nuôi rất phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới

và Việt Nam. Tuy nhiên, nghề nuôi cá mú đang chịu thiệt hại nặng nề do dịch bệnh

trong những năm gần đây. Nhiều tác nhân gây bệnh (TNGB) trên cá mú đã đƣợc

thông báo nhƣ virus [81], [89], ký sinh trùng [50], [49], [81], vi khuẩn [26], [81],

[171]. Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio (dƣới đây viết tắt là Vibriosis) đã đƣợc

phát hiện trên khoảng 48 loài cá biển và gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến nghề nuôi

thủy sản ở nhiều nƣớc [27]. Riêng ở cá mú, Vibriosis có thể gây chết đến 70 % đàn

cá mú nuôi [174]. Tại Việt Nam, Vibrio cũng đã đƣợc xác định là TNGB xuất

huyết, lở loét, mòn vây ở cá mú nuôi và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngƣời

nuôi [5], [14], [148].

Để giảm thiểu những tổn thất kinh tế do Vibriosis gây ra, nhiều nghiên cứu

biện pháp phòng trị bệnh bằng kháng sinh và hóa chất đã đƣợc chú ý. Tuy nhiên,

hiệu quả đem lại vẫn chƣa ổn định mà còn kéo theo nhiều hệ lụy. Thiệt hại do bệnh

vẫn luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi cá mú tại Việt Nam và các nƣớc trong khu

vực; và cũng là nguyên nhân gây trở ngại trong việc phát triển cá mú trở thành đối

tƣợng nuôi ở qui mô công nghiệp và xuất khẩu. Vì vậy, các nghiên cứu cơ bản về

miễn dịch học của cá mú đối với TNGB sẽ góp phần cung cấp thêm những thông tin

về cơ chế kháng bệnh ở cá, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh

cho cá là hƣớng đi đúng đắn và cần thiết.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đƣợc sự cho phép của Trƣờng Đại học Nha Trang,

đề tài “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides

Hamilton,1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus”

đã đƣợc thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch

(ĐƢMD) ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus.

Nội dung nghiên cứu:

1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở

cá mú chấm cam.

2. Nghiên cứu ĐƢMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn

V. parahaemolyticus và ảnh hƣởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan

đến đáp ứng này.

3. Nghiên cứu ĐƢMD đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V.

parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

1. Về khoa học: Kết quả của luận án đóng góp những thông tin khoa học về

đặc điểm ĐƢMD của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio; Góp phần xây dựng

nền tảng để mở ra hƣớng nghiên cứu về miễn dịch học ở cá biển, một hƣớng mới đã

góp phần nâng cao hiệu quả trong NTTS ở nhiều nƣớc tiên tiến nhƣng chƣa đƣợc

phát triển ở Việt Nam.

2. Về thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học cho

nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine và dùng chất kích thích miễn dịch để phòng

Vibiosis cho cá biển nuôi và đặc biệt là cá mú chấm cam tại Việt Nam.

Tính mới của luận án

1. Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về miễn

dịch học ở cá biển nói chung và cá mú nói riêng tại Việt Nam.

2. Luận án là một trong số ít công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu về

ảnh hƣởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến ĐƢMD không đặc hiệu của

cá mú chấm cam thông qua biến đổi thành phần tế bào máu, hoạt tính thực bào, hoạt

tính hô hấp và khả năng kháng bệnh.

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides

1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu

Hệ thống phân loại:

Ngành động vật có xƣơng sống Vertebrata

Lớp cá xƣơng Osteichthys

Bộ cá vƣợc Perciformes

Họ cá mú Serranidae

Giống cá mú Epinephelus

Loài cá mú chấm cam: Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) [163]

Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides

Tên tiếng Anh: Orange-spotted grouper [163], Green grouper [118].

Tên tiếng Việt: Tùy theo từng địa phƣơng mà loài này có các tên gọi là cá mú

chấm cam, cá mú chấm nâu, cá mú đen.

Cá mú chấm cam có đặc điểm chung của giống cá mú Epinephelus nhƣ có

thân thuôn dài, mình hơi hẹp, miệng rộng, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn. Đặc điểm

nhận biết riêng nhƣ vây lƣng có XI gai cứng và 13 - 16 tia vây mềm, vây ngực có

18 - 20 tia mềm, vây bụng có I gai cứng và 5 tia mềm, vây hậu môn có III gai cứng

và 8 tia mềm; vây đuôi mềm và tròn. Đƣờng bên của cá có 58 - 65 vẩy. Vẩy trên cơ

thể có dạng hình lƣợc, trừ ở ngực, bụng và vùng trên vây hậu môn. Cuống đuôi

thƣờng hẹp. Mỗi bên mang, lƣợc mang có 8 - 10 phiến mang trên và 14 - 17 phiến

mang dƣới. Nắp mang có 3 gai thẳng và thƣờng bị phủ dƣới da. Trên cơ thể có

nhiều chấm màu cam hoặc nâu, màu sắc cơ thể thay đổi thích nghi theo môi trƣờng

sống, giai đoạn phát triển và trạng thái sinh lý [163]. Cá thể có khối lƣợng lớn nhất

ghi nhận đƣợc là 32 kg, chiều dài đạt 120 cm [68].

Giống với nhiều loài trong họ cá mú, cá mú chấm cam phân bố chủ yếu ở các

vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới, là loài thích sống nơi có rạn san hô và bãi đá

ngầm. Đa số các loài phân bố ở độ sâu nhỏ hơn 100 m, chỉ một vài loài phân bố ở

độ sâu 100 - 200 m (có trƣờng hợp đến 500 m) [68], [163]. Ở Việt Nam, cá mú

chấm cam phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan, tập trung chủ yếu ở khu vực

miền Trung nơi có nhiều vịnh, biển ven bờ với các rạn san hô, bãi đá ngầm, cỏ biển

rất thích hợp cho cá mú sinh sống [10].

Cá mú chấm cam thuộc loài cá dữ, trong tự nhiên, chúng ăn giáp xác, cá có

kích thƣớc nhỏ, động vật thân mềm. Tập tính bắt mồi của cá mú rất đặc trƣng là

rình trong các khe đá, bụi rong, san hô để chộp mồi. Khả năng bắt mồi của cá mú tốt nhất ở 22 - 30 oC và có xu hƣớng giảm khi nhiệt độ nƣớc thấp hơn 18 oC [163].

Cá mú chấm cam có tuổi thọ trung bình khoảng 22 năm, cá thể cái trƣởng

thành đạt chiều dài thân từ 25 - 30 cm ở 2 đến 3 năm tuổi, hiện tƣợng chuyển đổi

giới tính xảy ra khi kích thƣớc của cá đạt từ 55 - 75 cm [75]. Cá mú chấm cam

trƣởng thành có hiện tƣợng kết cặp trong mùa sinh sản, thƣờng vào tháng 3 đến

tháng 6 hàng năm. Sức sinh sản thực tế phụ thuộc kích thƣớc cá cái, dao động

khoảng 85 vạn trứng (cá cái dài 35 cm) đến gần 3 triệu trứng (cá cái dài 62 cm). Cá

mú chấm cam thƣờng đẻ trứng ở vùng biển khơi, nơi có độ mặn thích hợp từ 30 - 35

‰ và nhiệt độ khoảng 30 °C. Ấu trùng cá mú chấm cam sống ở vùng cửa sông, nơi

có nhiều bùn lẫn cát, sỏi hoặc ở vùng rừng ngập mặn [68], [88].

1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam

Nuôi trồng thủy sản trên thế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ với nhiều đối

tƣợng nuôi có giá trị nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của con ngƣời. Trong đó, cá

mú đƣợc xem là loài có giá trị kinh tế ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Thống

kê của Pierre et al. (2007) cho thấy khoảng 90 % thực phẩm trên thế giới có nguồn

gốc từ biển, trong đó, cá mú chiếm tỷ lệ khá lớn [158]. Với đặc tính dinh dƣỡng

cao, thịt thơm ngon nên cá mú rất đƣợc ƣa chuộng ở thị trƣờng Nhật Bản, Hàn

Quốc, Hồng Kông, Trung Quốc và một số nƣớc Châu Mỹ. Giá cá mú sống tại thị

trƣờng phía Nam Trung Quốc và Hồng Kông lên tới 100 USD/kg [116].

Sản lƣợng cá mú tăng liên tục trong những năm gần đây. Trong đó, sản lƣợng

khai thác chiếm phần lớn trong tổng sản lƣợng cá mú trên toàn thế giới và ngày

càng có xu hƣớng tăng chậm do nguồn lợi suy giảm trong khi sản lƣợng nuôi đang

tăng lên nhanh chóng. Thống kê của FAO (2012) cho thấy sản lƣợng khai thác năm

2010 đạt hơn 300 ngàn tấn, tăng 25 % so với sản lƣợng năm 2000 (244 ngàn tấn) và

chiếm 79 % tổng sản lƣợng cá mú trong cùng năm. Trái lại, sản lƣợng cá mú nuôi

tăng đột biến từ 9,5 ngàn tấn (năm 2000) đến 81 ngàn tấn (năm 2010), tăng hơn 747

%, chiếm 21 % tổng sản lƣợng cá mú trên toàn thế giới [69] (Hình 1.2).

Năm

Hình 1.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới [69]

(a. Sản lượng cá mú nuôi và khai thác; b. Sản lượng cá mú nuôi và giá trị)

Mặc dù số liệu thống kê thể hiện sản lƣợng cá mú nuôi tăng lên nhƣng tổng

giá trị ở các năm lại không ổn định, có năm lại giảm mạnh nhƣ năm 2006 và năm

2008 (Hình 1.2.b). Điều này cho thấy hiện tƣợng bão hòa của thị trƣờng đối với cá

mú nuôi, đặc biệt do ngƣời nuôi chuyển sang sản xuất các loài cá mú có giá thấp

hơn nên dẫn đến tổng giá trị giảm xuống [141].

Nghề nuôi cá mú đã bắt đầu từ năm 1970 ở Singapore, Malaysia, Hồng Kông,

Thái Lan và Đài Loan [179]. Ngày nay, cá mú đƣợc nuôi ở nhiều quốc gia và vùng

lãnh thổ trên thế giới nhƣ Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Philippines, Thái Lan,

Đài Loan, Hồng Kông, Hàn Quốc, Australia…[158]. Sản lƣợng cá mú nuôi trong

giai đoạn từ năm 2000 đến 2010 tại các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi cá mú chủ

yếu đƣợc thể hiện ở Hình 1.3.

Hình 1.3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu [69]

Hình 1.3 cho thấy Trung Quốc, Đài Loan, Indonesia, Malaysia là những quốc

gia và vùng lãnh thổ có sản lƣợng cá mú nuôi cao nhất thế giới và đối tƣợng đƣợc

nuôi phổ biến nhất là cá mú chấm cam.

Tại Việt Nam, nghề nuôi cá mú bắt đầu hình thành từ năm 1988, đƣợc duy trì

và phát triển đến ngày nay. Vùng nuôi cá mú tập trung ở Hải Phòng, Quảng Ninh,

Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu. Các đối tƣợng nuôi chủ yếu bao gồm cá mú chấm

cam E. coioides, cá mú chấm đen E. malabaricus, cá mú chấm đỏ E. akaara, cá mú

sỏi E. bleekeri, cá mú mỡ E. tauvina, cá mú cọp E. fuscoguttatus, cá mú sáu vạch E.

sexfasciatus, cá mú chấm tổ ong E. merra, cá mú chấm xanh Plectropomus

leopardus [13]. Nguồn cá mú giống cung cấp cho nuôi thƣơng phẩm chủ yếu đƣợc

đánh bắt từ tự nhiên và hình thức nuôi chủ yếu là nuôi lồng trên biển hoặc nuôi ao

đìa vùng triều với qui mô hộ gia đình. Hiện nay, cả nƣớc có khoảng gần 7000 lồng

nuôi cá biển, trong đó, lồng nuôi cá mú chiếm 80 % và khoảng 500 ha ao đìa nuôi

cá mú với sản lƣợng ƣớc tính khoảng 3.000 tấn/năm [13].

1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi

 Bệnh do vi rút ở cá mú nuôi

Bệnh do vi rút nguy hiểm nhất đối với cá mú là bệnh hoại tử thần kinh do vi

rút Viral Nervous Necrosis (VNN). Bệnh này xuất hiện trên cá ở các giai đoạn từ

con giống cho đến trƣởng thành và gây chết với tỷ lệ cao, có thể lên đến 100 %

quần đàn trong thời gian ngắn. Bệnh xảy ra phổ biến nhất ở cá mú chấm đỏ E.

akaara, cá mú cọp E. fuscogutatus, cá mú chấm đen E. malabaricus…[81]. Cá

giống 2 – 5 cm bị nhiễm VNN thƣờng có những biểu hiện đặc trƣng là thân có màu

đen, bơi xoay vòng không định hƣớng và chết rất nhanh, không có biểu hiện tổn

thƣơng ở bên ngoài. Tác nhân gây bệnh do virus trên cá mú đã đƣợc nghiên cứu bởi

nhiều tác giả trên thế giới và biện pháp khắc phục thiệt hại do bệnh này đến nay chủ

yếu là phòng bệnh [81], [89].

 Bệnh do ký sinh trùng ở cá mú nuôi

Bệnh do ký sinh trùng (KST) gây ra cũng rất phổ biến ở cá mú [50], [49],

[81]. Hơn 80 % nông hộ cho biết cá nuôi có những biểu hiện bệnh liên quan đến

KST. Các loại KST gặp nhiều nhất trên cá mú nuôi lồng là sán lá đơn chủ

Monogenea, giáp xác Copepoda, Isopoda và động vật đơn bào (Trichodina,

Cryptocaryon, Apiosoma). Chúng ký sinh trên da, trong miệng, mang, nắp mang,

gây tƣa mang, khó thở, làm cá bỏ ăn, chậm lớn và thƣờng gây chết cao ở giai đoạn

cá nhỏ [81].

 Bệnh xuất huyết lở loét do vi khuẩn Vibrio

Bệnh xuất huyết lở loét là một trong những bệnh thƣờng gặp nhất và xuất hiện

ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá mú nuôi, gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá

mú ở nhiều nƣớc. TNGB thuộc giống Vibrio, các loài thƣờng gặp là V.

parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. carchariae…[81]. Dấu hiệu đầu

tiên của bệnh là cá bỏ ăn, bơi lờ đờ, màu sắc thân đen dần. Cá nhiễm nặng thƣờng có

hiện tƣợng mất thăng bằng, bơi ngửa bụng, mang nhợt nhạt, xuất huyết quanh miệng

và vây, có nhiều vết loét trên bề mặt cơ thể; nội quan có hiện tƣợng xuất huyết ở

thận, gan và thành ruột. Tỷ lệ chết của cá mú nuôi do Vibriosis có thể đến 70 %

quần đàn [174]. Một số vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho cá mú nuôi trên thế giới đƣợc

tổng hợp ở Bảng 1.1.

Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi

Tác nhân Nƣớc Ký chủ Tài liệu tham khảo

Vibrio spp.

Malaysia Malaysia Malaysia Indonesia Trung Quốc Italia Philippines E. malabaricus E. salmoides Epinephelus spp. Epinephelus spp. E. coioides E. marginatus E. suillus Nash et al. (1987) [146] Ong (1988) [152] Leong and Wong (1988) [122] Sarjito et al. (2009) [174] Sun et al. (2009)(Trích [82]) Mesa et al. (2008)(Trích [82]) Lavilla -Pitogo et al.(1992)(Trích [82])

V. parahaemolyticus Malaysia Thái Lan Epinephelus spp. E. malabaricus Najiah et al. (2003) [144], Shyne et al. (2008) [182] Danayadol et al. (1999) [55]

V. alginolyticus Hàn Quốc Thái Lan E. malabaricus E. malabaricus Lee (1995) [121] Danayadol et al. (1999) [55]

V. carchariae

Hàn Quốc Đài Loan Đài Loan E. malabaricus Epinephelus spp. E. coioides Chi et al. (1997)(Trích [82]) Lee et al. (1999) (Trích [82]) Yii et al. (1997) [214]

V. harveyi

Kuwaiit Ấn Độ E. tauvina E. tauvina Saeed (1995) [171] Punitha et al.(2008)(Trích [82]) Chinabut (1996)(Trích [82]

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu cũng đã phát hiện vi khuẩn V.

parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. carchariae, V. vulnificus là TNGB xuất

huyết lở loét cho cá mú nuôi ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Dấu hiệu bệnh lý đặc

trƣng là các vết xuất huyết lở loét trên thân, bệnh lây lan nhanh và có thể gây chết

đến 30 % đàn cá nuôi [5], [8], [14], [148].

Trong các bệnh thƣờng gặp ở cá mú, bệnh lở loét xuất huyết do vi khuẩn

Vibrio spp. gây ra là bệnh thƣờng gặp nhất và có mức độ lây lan nhanh. Những

hiểu biết sâu hơn về đặc điểm cấu tạo, cơ chế gây độc của vi khuẩn Vibrio cũng

nhƣ tác hại của chúng trên các đối tƣợng nuôi trở nên rất cần thiết, là cơ sở ứng

dụng nghiên cứu phòng trị bệnh nhằm mang lại lợi ích kinh tế cho ngƣời nuôi.

1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển

1.2.1. Vi khuẩn Vibrio

 Hệ thống phân loại: Khóa phân loại của Bergey [90]

Ngành : Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria

Bộ : Vibrionales

Họ: Vibrionaceae

Giống: Vibrio

Loài: V. parahaemolyticus

 Đặc điểm hình thái cấu tạo, sinh thái, sinh lý và sinh hóa

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram âm,

cấu tạo có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thƣớc tế bào từ 0,3 - 0,5 m x 1,4

- 2,6 m. Vibrio có khả năng di động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh,

đa phần có phản ứng Oxydase dƣơng tính, có khả năng oxy hoá và lên men trong

môi trƣờng O/F glucose, không có khả năng sinh H2S và nhạy với Vibriostat 2,4-

diamino-6,7-diisopropylpteridine phosphate (0/129). Môi trƣờng TCBS là môi

trƣờng chọn lọc của Vibrio spp.

Hầu hết các loài thuộc giống Vibrio đều phân bố trong môi trƣờng nƣớc mặn,

thích hợp ở 20 - 40 ‰, cá biệt có loài có thể phát triển ở độ mặn 70 ‰ [4].

Màng tế bào vi khuẩn Gram âm cấu tạo gồm 3 lớp: lớp trong (inner

membrane), lớp peptidoglycan và lớp màng ngoài (outer membrane) (Hình 1.4a).

Thành phần chính của màng là protein, lipopolysacharides (LPS) và phospholipids.

Trong đó, protein và phospholipid là thành phần không bền nhiệt trong khi LPS khá

bền với nhiệt.

LPS tạo nên lớp màng ngoài vi khuẩn Gram âm, thành phần gồm lipid và

polysaccharide. Cấu trúc của LPS gồm 3 phần (Hình 1.4b): phần lipid A gồm các

acid béo làm cầu nối giữa chuỗi polysaccharide và màng tế bào, tiếp đến là phần lõi

(core) là một Oligosaccharide, và ngoài cùng là phần chuỗi O-polysaccharide gồm

các phân tử đƣờng gắn với nhau tạo thành chuỗi, đây là phần khác nhau giữa các

loài vi khuẩn Gram âm. Trong đó, lipid A, thành phần gây độc của phân tử LPS,

gây nên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm và hoạt hóa hệ bổ thể, trong

khi đó phần chuỗi O tạo nên tính kháng nguyên đặc hiệu ở vi khuẩn Gram âm [137].

Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio [137]

(a: Cấu tạo màng tế bào; b: Cấu trúc sợi Lipopolysacharite)

Dựa trên sự tổ hợp giữa các thành phần mang tính kháng nguyên có mặt ở

vách tế bào chủ yếu là LPS (Kháng nguyên O) và ở lớp vỏ tế bào (Kháng nguyên

K) tạo nên các tuýp huyết thanh (Serotype) khác nhau của vi khuẩn V.

parahaemolyticus [56]. Tổng hợp tài liệu đã công bố, Christopher et al. (2011) đã

xác định có khoảng 13 loại kháng nguyên O với hơn 70 loại kháng nguyên K và có

ít nhất 12 serotype của V. parahaemolyticus đƣợc nhận dạng [44].

Sự phân bố của V. parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ nƣớc. Ở những vùng nƣớc có nhiệt độ trên 15 oC, chúng có mặt quanh năm trong

nƣớc, chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nƣớc [44],

[108]. Ngoài ra, pH của môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng đến hoạt động của vi khuẩn

này. Nghiên cứu của Kazuyuki et al. (1979) cho thấy cả 20 chủng V.

parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển đƣợc trên môi trƣờng NB với pH biến

thiên từ 6,0 - 9,0. Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi khuẩn không tiết ra hemolysin trong khi ở

các pH khác đều có hiện tƣợng này. Hơn nữa, khả năng vận động bằng tiên mao

của vi khuẩn bị ức chế trong môi trƣờng kiềm nhƣng không bị ảnh hƣởng ở môi

trƣờng trung tính và axit. Kết quả nghiên cứu này cho thấy pH của môi trƣờng có

ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng vận động của V.

parahaemolyticus [110]. Nghiên cứu của Christopher et al. (2011) cho thấy khi ở độ

mặn thích hợp và pH 8,0, vi khuẩn V. parahaemolyticus có khả năng di động bằng

tiên mao với vận tốc 60 μm/s [44].

 Độc tính của vi khuẩn Vibrio

Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho ký chủ thông qua các loại độc tố (toxin), đây là

các hoạt chất sinh học có bản chất protein hoặc không phải protein do vi khuẩn tiết

ra nhằm gây độc cho tế bào vật chủ. Quá trình gây bệnh của chúng diễn ra theo trình

tự bám dính, xâm nhập vào tế bào vật chủ và tiết ra các độc tố phá vỡ màng tế bào

và gây độc cho tế bào vật chủ. Nghiên cứu của Krachler et al. (2011) cho thấy sự

bám dính đầu tiên của V. parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông qua phân tử

gắn kết đa trị (Multivalent Adhesion Molecule - MAM) chứa 6 hoặc 7 vùng gắn kết

(Trích [44]). Hoạt tính dung huyết, thủy phân, phân giải protein, lipid, phospholipid,

cytotoxin, yếu tố gây bám dính, ngƣng kết đều liên quan tới khả năng gây bệnh của

nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và đƣợc quy định bởi các gen độc tố đặc

trƣng [217].

Đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến yếu tố gây độc ở một số loài

vi khuẩn thuộc giống Vibrio nhƣ: V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. harveyi,

V. alginolyticus, V. anguillarium….[43], [145], [162], [184], [217].

Nghiên cứu của Lee (1995) đã khảo sát các yếu tố gây độc của vi khuẩn V.

alginolyticus phân lập từ cá mú E. malabaricus nuôi tại Đài Loan. Kết quả nghiên

cứu cho thấy liều gây chết 50 % (LD50) ở cá khi tiêm cảm nhiễm bằng tế bào vi khuẩn là 0,5 x 103 cfu/g cá; bằng sản phẩm ngoại bào do vi khuẩn này tiết ra là 0,52

µg/g cá và bằng protein có khối lƣợng phân tử 34 kDa đƣợc tách chiết từ sản phẩm

ngoại bào của vi khuẩn này là 0,17 µg/g cá [121]. Nghiên cứu của Quinones et al.

(2010) cho thấy tất cả các chủng V. vulnificus phân lập từ hầu ở Mexico đều có độc

tố proteolysin, 98 % các chủng có khả năng bám chặt vào các tế bào biểu mô, 91,4

% có khả năng phân giải DNA, 77,6 % phân giải mucin, 97,8 % phân giải lecithine

và 79,8 % có khả năng phân giải lipid [162].

Cũng nhƣ các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio, vi khuẩn V.

parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chủng mang các yếu tố gây độc khác nhau.

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính dung huyết (haemolysis) là một trong những

yếu tố gây độc của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ. Haemolysin là

một exotoxin, chúng bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng và giải phóng

haemoglobin. Kết quả là tạo ra hiện tƣợng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis)

hoặc không hoàn toàn (α-haemolysis) [217].

Ngày nay, ngƣời ta đã phát hiện có 4 nhóm protein độc tố gây ra hiện tƣợng

dung huyết ở vi khuẩn Vibrio bao gồm TDH (Thermostable direct haemolysin), Hly

A (E1 Tor haemolysin), TLH (Thermolabile haemolysin) và δ-VPH (Thermostable

haemolysin) [217]. Trong đó, TDH, TLH và δ-VPH thƣờng gặp ở V.

parahaemolyticus trong khi Hly A thƣờng gặp ở V. cholerae [217].

Độc tố TDH thƣờng đƣợc phân lập từ các mẫu viêm ruột ở ngƣời, đặc trƣng

bởi hiện tƣợng Kanagawa dƣơng tính (KP). TDH gây dung huyết kiểu β. Cấu trúc

protein này là một dimer bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có khối lƣợng 21 kDa, rất bền nhiệt (không bị bất hoạt ở 100 oC trong 10 phút) và có tính kháng

nguyên cao [149], [213]. TDH ở V. parahaemolyticus đã đƣợc chứng minh gây vỡ

tế bào bằng cách bám dính, tạo ra các lỗ tấn công màng tế bào vật chủ (pore-

forming toxin), làm rối loạn trao đổi ion và phá vỡ màng tế bào do mất cân bằng

thẩm thấu [194]. Tuy nhiên, Han và Chai (1992) cho rằng không phải tất cả các

chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đều gây bệnh, có 96,5 % các chủng vi khuẩn

này phân lập từ các bệnh nhân ngộ độc thực phẩm thủy sản có hiện tƣợng

Kanagawa dƣơng tính nhƣng đến 99 % các chủng phân lập từ môi trƣờng tự nhiên có

Kanagawa âm tính và chúng thƣờng không phải là TNGB [80]. Mặt khác, Honda et

al. (1988) đã phát hiện một số chủng V. parahaemolyticus gây dung huyết kèm theo

tích dịch nhƣng có KP âm tính, hiện tƣợng này do yếu tố tdh-related hemolysin gây ra [91]. Đây là một loại độc tố không bền nhiệt (biến tính ở 60 oC trong 10 phút) và

cũng có cơ chế gây độc cho tế bào tƣơng tự TDH [213]. Các chủng V.

parahaemolyticus phân lập đƣợc có thể chứa một trong hai loại độc tố này hoặc có

thể chứa cả hai loại và quy định mức độ độc tính khác nhau [56].

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã xác định tính kháng nguyên và độc tố từ protein

ngoại mạc (OMP - outer membrane protein) của vi khuẩn V. parahaemolyticus [126], [139], [209]. Bằng kỹ thuật SDS-PAGE, sau khi sốc nhiệt ở nhiệt độ 37 oC và 42 oC trong 1 - 2 giờ, Wong và Chen (2003) xác định các protein chính của V.

parahaemolyticus có khối lƣợng phân tử 33, 55, 61, 66, 71, 78 và 92 kDa [209].

Với phƣơng pháp cải tiến, Mao et al. (2007) phát hiện thêm các protein có khối

lƣợng phân tử nhỏ hơn là 27, 32, 33, 47 và 48 kDa [139]. Gần đây, khi nghiên cứu

OMP của 19 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio, Li et al. (2010) đã phát hiện loại

protein màng OmpK có khối lƣợng phân tử 28 và 31 kDa có mặt ở hầu hết các

chủng vi khuẩn nghiên cứu thuộc 3 loài V. harveyi, V. alginolyticus và V.

parahaemolyticus. Từ kết quả nghiên cứu, nhóm tác giả này cũng cho rằng đây là

những protein có tính kháng nguyên cao và khuyến nghị nên sử dụng làm vaccine

để ngừa bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra (Vibriosis) ở cá biển [126].

Nhìn chung, các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất là

V. parahaemolyticus đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối sâu, chủ yếu là nghiên cứu các

chủng phân lập từ ngƣời. Kết quả đạt đƣợc mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong

y học, giúp chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra. Tuy nhiên, số lƣợng

công trình nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tƣợng thủy sản

vẫn còn hạn chế. Việc tìm hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên

đối tƣợng nuôi là rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi

khuẩn gây ra cho đối tƣợng thủy sản.

1.2.2. Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển

 Ký chủ

Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế phân bố ở các vùng biển khác nhau đều

nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio. Bao gồm: các loài cá ở vùng biển lạnh nhƣ cá hồi

vân (Oncorhynchus spp.), cá tráp (Sparus aurata), cá chẽm Châu Âu (Dicentrarchus

labrax), cá bơn (Scophthalmus maximus); và các loài cá ở vùng biển ấm nhƣ cá chẽm

(Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú

(Epinephelus spp.). Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra đƣợc báo cáo đã gây thiệt hại

kinh tế cho nghề nuôi cá biển ở nhiều nƣớc trên thế giới [4], [26], [81], [146].

 Dấu hiệu chính của bệnh

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra đặc trƣng bởi sự xuất hiện các đốm đỏ, xuất

huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong). Vẩy cá bị tróc, rụng, tạo nên các vết loét

ngày càng lan rộng và sâu. Vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác. Giải phẫu mẫu cá bệnh

cho thấy hiện tƣợng xuất huyết nội tạng và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh

có thể chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc chết rải rác khi ở thể thứ cấp tính [4].

 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh Vibriosis ở động vật thủy sản thƣờng gặp do một số loài vi

khuẩn thuộc giống Vibrio, chúng có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp

(tác nhân cơ hội). Các loài Vibrio gây bệnh cho cá nuôi vùng nƣớc ấm thƣờng gặp

nhƣ V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. carchariae,

V. anguillarum... [26], [81], [132], [199]. Các loài Vibrio gây bệnh cho cá nuôi

vùng nƣớc lạnh nhƣ V. salmonicida, V. anguillarum, V. logei, V. wodanis, V.

viscosus [26], [199].

 Đặc điểm phân bố và lan truyền bệnh

Bệnh Vibriosis xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nƣớc lợ

và nƣớc mặn. Bệnh xảy ra cả trên cá nuôi lẫn cá tự nhiên. Vi khuẩn Vibrio có ảnh

hƣởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nƣớc và gây bệnh trên

khoảng 48 loài cá biển [27]. Vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể theo một số con

đƣờng nhƣ nguồn nƣớc, dụng cụ, cá bố mẹ hoặc cá giống, thức ăn, đặc biệt là thức

ăn tƣơi sống. Khả năng bùng phát của bệnh phụ thuộc vào các yếu tố môi trƣờng,

yếu tố gây độc của chủng vi khuẩn và tình trạng sức khỏe của chính vật nuôi.

 Chẩn đoán và cách phòng, trị bệnh

Chẩn đoán

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra đƣợc chẩn đoán dựa vào những dấu hiệu bệnh

lý đặc trƣng nhƣ đã mô tả ở trên. Nuôi cấy phân lập Vibrio trên môi trƣờng chọn lọc

TCBS và định danh dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa [22]. Ngoài ra,

định danh Vibrio bằng các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ phân tích trình tự gen

16S ribosomal DNA (rDNA) [84] hoặc các gen độc tố đặc trƣng [35].

Cách phòng, trị bệnh

Một số nghiên cứu đã đề xuất biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng

cách cho ăn, tắm hoặc tiêm kháng sinh. Nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2007) đã trị

bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách tắm kháng sinh Oxytetracyline, Rifamycine

và Erythromycine với nồng độ 30 - 50 ppm trong 30 - 60 phút; hoặc tắm thuốc tím

10 ppm trong 15 - 20 phút; hoặc cồn iốt 15 - 20 ppm từ 10 - 20 phút. Trong trƣờng

hợp cá lớn và bỏ ăn, biện pháp tiêm kháng sinh Sulfamethoxazole 250 mg/kg cá,

Colistin sulfate, Sulfonamide 150 mg/kg cá đã cho thấy có hiệu quả tốt [8]. Biện pháp

trộn kháng sinh vào thức ăn nhƣ trộn Tetracyline 75 - 100 mg/kg cá, Streptomycine

50 - 75 mg/kg cá, Oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7 đến 10 ngày

cũng cải thiện đƣợc tình trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio [26].

Nhìn chung, kháng sinh là phƣơng pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh do vi

khuẩn. Mặc dù kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định trong một số

trƣờng hợp, nhƣng việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng

thuốc gây khó khăn cho quá trình điều trị. Nghiên cứu của Shyne et al. (2008) về

khả năng nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ cá

mú bệnh. Kết quả cho thấy hầu hết các chủng đều kháng lại Sulphadiazine và

Amoxicillin, 87 % kháng lại Gentamycine, 89 % kháng lại Kanamycine và

Oxytetracycline [182]. Ngoài ra, tồn dƣ kháng sinh trong sản phẩm thủy sản còn

ảnh hƣởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trƣờng [19]. Vì vậy, việc sử dụng

kháng sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không nên khuyến khích và cần

cân nhắc thận trọng trong từng trƣờng hợp.

Chính vì những mặt trái do sử dụng kháng sinh, việc phòng bệnh cho cá nuôi

vẫn luôn đƣợc chú ý trong suốt quá trình nuôi. Phƣơng pháp phòng bệnh tổng hợp

thƣờng đƣợc các trại nuôi áp dụng nhƣ sát trùng bể, ao và dụng cụ trƣớc mỗi đợt sản

xuất, xử lý nguồn nƣớc trƣớc khi đƣa vào sử dụng. Thả cá nuôi với mật độ thích hợp,

tránh làm cá bị tổn thƣơng trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ để phòng các loại

bệnh ký sinh trùng và chú ý chất lƣợng thức ăn. Tuy nhiên, đây chỉ là những biện pháp

phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do

bệnh vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây ảnh hƣởng lớn cho nghề nuôi cá biển.

Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách sử dụng

các chất gây kích thích miễn dịch (Immunostimulants) và vaccine phòng bệnh là

phƣơng pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao, đã và đang đƣợc tập

trung nghiên cứu ở nhiều nƣớc trên thế giới. Song, để chế tạo ra các loại vaccine

đặc hiệu hay chọn lựa đƣợc các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại hiệu quả bảo

hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thử thách không nhỏ ở phía trƣớc. Những hiểu biết

về hệ thống miễn dịch cũng nhƣ cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch ở cá trở nên vô cùng

cần thiết; là nền tảng quan trọng cho việc nghiên cứu vaccine, sử dụng vaccine và

các chất kích thích miễn dịch có hiệu quả, góp phần thúc đẩy nghề NTTS phát triển

ổn định và bền vững.

1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng

Miễn dịch học ở cá đƣợc Hermann F. Stannius bắt đầu nghiên cứu từ những

năm 50 của thế kỷ 18. Những hiểu biết về miễn dịch học cá thời gian này rất sơ

khai, chỉ là những mô tả về hình thái giải phẫu các cơ quan và khẳng định sự hiện

diện của tế bào thực bào trong máu cá. Mãi đến năm 1940, miễn dịch học ở cá mới

đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và những hiểu biết về hệ miễn dịch

cá ngày càng hoàn thiện [204].

1.3.1. Miễn dịch tự nhiên

Miễn dịch tự nhiên (hay còn gọi là miễn dịch không đặc hiệu) là khả năng tự

bảo vệ sẵn có của cá thể ngay từ khi mới sinh, không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc

trƣớc với TNGB và mang tính di truyền giống nhau giữa các cá thể cùng loài. Vai

trò của hệ miễn dịch tự nhiên đƣợc coi nhƣ là tuyến phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ

thể chống lại các vật lạ xâm nhập và nó có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho giai

đoạn đầu đời, khi mà hệ miễn dịch thích nghi chƣa đƣợc hoàn thiện.

Nhiều nghiên cứu về các khía cạnh khác nhau của hệ miễn dịch không đặc

hiệu ở cá xƣơng đã đƣợc tổng quan bởi các tác giả Chistiakov et al. (2007) [41],

Ellis (2001) [64], Magnadottir (2006) [138], Rombout et al. (2005) [169], Van

Muiswinkel (2008) [204], Whyte (2007) [206]. Hầu hết các nghiên cứu đều mô tả

về thành phần cấu thành và chức năng của chúng trong cơ chế tạo đáp ứng miễn

dịch tự nhiên ở cá. Ba thành phần chính tạo nên hệ miễn dịch tự nhiên ở cá bao gồm

hàng rào vật lý, hàng rào dịch thể và hàng rào tế bào không đặc hiệu.

Các kháng nguyên (Bao gồm TNGB cho đến các chất kích thích vô cơ) xâm

nhập vào cơ thể cá qua vùng bề mặt biểu bì bị tổn thƣơng, qua mang, đƣờng bên và

ống tiêu hóa [64]. Chúng gặp rào cản đầu tiên là toàn bộ vỏ bọc cơ thể cá bao gồm

vảy, da, mang và các lớp biểu bì. Ngoài ra, lớp dịch nhờn ở da và niêm mạc ruột của

cá không những có chức năng bẫy bắt các vật ngoại lai, mà còn chứa các yếu tố có

khả năng kháng vi khuẩn. Ví dụ nhƣ lectins có khả năng gắn kết với carbohydrates

trên bề mặt tế bào vi khuẩn, ngăn chặn chúng xâm nhập gây bệnh [25]; Lysozyme

tấn công vào lớp peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn gây thủng màng và tiêu

diệt chúng [64]; Các peptides kháng khuẩn (anti-bacteria peptides) nhƣ pleucoridin

bảo vệ cá hồi kháng lại V. anguillarum [102]. Các yếu tố này thƣờng đƣợc tìm thấy

trong trứng, huyết thanh và dịch nhờn của nhiều loài cá và đƣợc chứng minh khả

năng kháng lại các nhóm vi khuẩn khác nhau [24], [183].

Nếu vi khuẩn vƣợt qua hàng rào vật lý và hóa học, vào đƣợc bên trong cơ thể

cá thì chúng sẽ tiếp tục bị chặn lại bởi hàng loạt các yếu tố miễn dịch thuộc hàng

rào dịch thể có chức năng bảo vệ cơ thể theo nhiều cách khác nhau.

Nhóm ức chế sinh trƣởng của vi sinh vật thông qua việc chia sẻ các chất dinh

dƣỡng thiết yếu hoặc cản trở quá trình trao đổi chất của chúng bao gồm Transferrin,

Interferon đã đƣợc nhiều chú ý nghiên cứu ở cá hồi Đại Tây Dƣơng ( Salmo salar)

[117], [138], [157], [187], [188], cá nóc chấm xanh (Tetraodon nigroviridis) [30],

cá mú vằn (Danio rerio) [23] và gần đây đã tìm thấy ở cá mú chấm cam E. coioides

[37], [53].

Nhóm ức chế enzyme có chức năng bảo vệ cơ thể kháng lại quá trình tự huỷ

của chính cơ thể đồng thời tham gia trung hoà các enzyme do TNGB sản sinh ra,

ví dụ α-2 macroglobulin bảo vệ cá hồi kháng lại vi khuẩn A. salmonicida [138].

Nhóm các protein gây kết tủa và kết dính (precipitin và agglutinin) bao gồm

các lectins và pentraxins có trong huyết thanh và dịch nhờn của nhiều loài cá [138].

Lectins có khả năng gắn kết đặc hiệu với các loại đƣờng khác nhau trên bề mặt tế bào

vi khuẩn, gây ngƣng kết, kết tủa nhiều loại vi khuẩn nhƣ liên kết đƣờng mannose,

rhamnose, fucose, galactose dẫn đến hiện tƣợng opsonine hóa, thực bào và hoạt hóa

hệ bổ thể [206]. Các pentraxins gồm protein phản ứng C (C-reaction protein- CRP)

và protein huyết thanh dạng sợi (serum amyloid protein- SAP), chúng có trong dịch

thể và xuất hiện ở các phản ứng pha cấp tính. CRP có khả năng kết hợp với

phosphoryl cholin có trong vách tế bào VSV có ion canxi trong khi SAP ƣa kết hợp

với phosphoryl-ethanolamin, gây kết tủa, hoạt hóa thực bào và hệ bổ thể [138]. Một

số loài cá chỉ có một trong hai loại protein trên nhƣ cá tuyết (Gadus morhua L.) có

CRP trong khi cá hồi Đại Tây Dƣơng, cá heo (wolfish- Anarhichas minor ), cá bơn

(Hippoglossus hippoglossus L.) chỉ có SAP hoặc những loài khác thì có cả 2 loại

pentraxin này nhƣ cá bơn sao (Pleuronectes platessa L.), cá hồi vân (Oncorhynchus

mykiss) [138].

Nhóm chất dung giải (lysin) là các enzyme mà bản thân chúng hoặc tƣơng tác

giữa chúng ngoài việc gây dung giải tế bào TNGB, còn có vai trò opsonin, hoạt hóa

thực bào. Chúng là các lysozyme, chitinase, các thành phần của hệ bổ thể có trong

mô và dịch cơ thể [76], [103].

Bổ thể là tập hợp khoảng hơn 20 loại protein huyết thanh lƣu thông trong dịch

cơ thể, là phần cốt yếu của hệ thống miễn dịch tự nhiên và là nhân tố bảo vệ quan

trọng nhất. Tƣơng tự nhƣ động vật có xƣơng sống bậc cao, cơ chế hoạt động chủ yếu

hệ bổ thể ở cá là tạo nên các lỗ thủng màng tế bào nhờ hoạt hóa bằng 3 con đƣờng

khác nhau: con đƣờng cổ điển, con đƣờng khác và con đƣờng lectin [206]. Kết quả

của 3 con đƣờng này là gây hiện tƣợng dung giải tế bào, opsonin và tiêu diệt mầm

bệnh. Ngoài ra, hệ bổ thể còn có vai trò hoạt hóa phản ứng viêm, gây tăng tính thấm

thành mạch, hóa ứng động bạch cầu và kích thích thực bào [173], [206]. Không giống

nhƣ ở động vật có vú, hệ bổ thể của cá có hoạt tính tốt trong khoảng nhiệt độ rộng, từ 15 oC đến 25 oC và vẫn có thể duy trì hoạt tính ở nhiệt độ thấp (0 - 4 oC) [119].

Yếu tố C3 là thành phần trung tâm của hệ bổ thể trong cả 3 con đƣờng hoạt

hóa kể trên. Chúng chiếm tỷ lệ lớn nhất trong protein huyết thanh. Chức năng của

C3 là tăng cƣờng kích thích thực bào thông qua opsonin, hóa ứng động các tế bào

miễn dịch, kích thích phản ứng viêm, kích thích tế bào B sinh sản và hoạt hóa phức

hợp tấn công màng MAC (Membrane Attacking Complex) [206]. MAC ở cá hồi

vân (O. mykiss) đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh cơ chế hoạt động của nó là tạo

ra các lỗ nhỏ trên màng tế bào vi khuẩn tƣơng tự nhƣ ở động vật có vú [156]. Tùy

từng loài cá xƣơng, yếu tố C3 xuất hiện từ 11 đến 57 ngày sau khi nở và là hàng rào

miễn dịch quan trọng trong thời gian đầu của ấu trùng khi chức năng của các cơ

quan lympho chƣa hoàn thiện [206]. Các dạng cấu trúc và chức năng của phân tử

C3 (isotypes) đƣợc mã hóa bằng nhiều gen khác nhau làm cho các phân tử C3 càng

trở nên đa dạng [172]. Các dạng C3 đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều loài cá nhƣ cá hồi,

cá chép, cá tráp và cá mú vằn [206] và số lƣợng các dạng C3 phát hiện ở các loài cá

rất khác nhau: cá hồi có 4 dạng C3, ở cá tráp có 5 dạng C3 [206], cá chép có 8 dạng

và cá sóc (Oryzias latipes) có 3 dạng [192]. Sự đa dạng phân tử C3 của hệ bổ thể

thể hiện sự tiến hóa của hệ thống miễn dịch và giúp cá tăng cƣờng khả năng nhận

biết của miễn dịch tự nhiên [191].

Mặc dù không mang đặc tính nhớ và tạo đáp ứng miễn dịch thứ cấp mạnh mẽ

khi tái nhiễm TNGB, hàng rào các tế bào của hệ miễn dịch không đặc hiệu đóng vai

trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ sẵn có của cơ thể vật chủ đối với mầm bệnh. Các

tế bào trung tâm tạo nên hàng rào tế bào miễn dịch không đặc hiệu này bao gồm

bạch cầu (BC) đơn nhân (Monocyte)/ đại thực bào (Macrophage), BC trung tính

(Neutrophil) và tế bào độc không đặc hiệu (NCC- Non-specific cytotoxic cells)

[67], [72]. Các hoạt tính hóa ứng động bạch cầu (Leukocyte mobilization), thực bào

(Phagocytosis Activity- PA), bùng nổ hô hấp (Respiratory Burst Activity- RBA),

gây độc tế bào và tạo ra các yếu tố miễn dịch nhƣ Interleukin 1 (IL-1) hoặc yếu tố

anpha gây hoại tử khối u ( alpha Tumor Necrosis Factor – αTNF) là các chức năng

đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều loài cá xƣơng và chứng minh vai trò bảo vệ cơ thể

của hàng rào tế bào ở cá [17], [36], [51].

Ở cá xƣơng, 2 loại tế bào tham gia chính vào quá trình thực bào là đại thực

bào (ĐTB) và BC trung tính. Chúng loại bỏ vi khuẩn xâm nhập thông qua các sản

phẩm có hoạt tính oxy hóa cao trong quá trình bùng nổ hô hấp khi tiếp xúc kháng

nguyên [176].

Đại thực bào là BC không hạt lớn nhất, đƣợc biệt hóa từ các BC đơn nhân,

phân bố rộng rãi ở các mô, bao gồm cả mang cá và xoang cơ thể, nhƣng chủ yếu

đƣợc tìm thấy ở mạng lƣới nội bì của thận, lách. Ở một vài loài cá, ĐTB còn đƣợc

tìm thấy ở tâm nhĩ [4]. Nhiều nghiên cứu cho rằng chức năng ĐTB bao gồm khả

năng thực bào, hóa ứng động tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhờ có các sản phẩm

Interleukin 1 và yếu tố αTNF, xử lý và trình diện kháng nguyên. Mặc dù các thụ thể

trên bề mặt ĐTB cá chƣa đƣợc biết rõ, nhƣng nhiều nghiên cứu cho thấy có sự hiện

diện của thụ thể gắn kết kháng nguyên, thụ thể bổ thể và phức hợp hòa hợp mô chủ

yếu lớp II (MHC II) [166].

Ở một số loài cá, trong số BC có hạt, ngoài BC hạt trung tính còn có BC ƣa axít

(Eosinophils) và BC ƣa kiềm (Basophils) trong khi ở một số loài cá khác vắng mặt

một trong 2 loại BC này. Tỷ lệ của các loại BC này trong máu các loài cá rất khác

nhau [18]. Trong đó, BC trung tính phân bố ở thận, lách, máu và các ổ viêm loét với

các tỷ lệ khác nhau giữa các loài cá. Ví dụ ở cá tuyết, tỷ lệ tế bào BC trung tính phân

bố ở máu nhiều hơn ở thận trong khi ở cá hồi Đại Tây Dƣơng thì ngƣợc lại [170].

Tƣơng tự nhƣ đại thực bào, BC trung tính tham gia chính quá trình thực bào và tiêu

diệt vi khuẩn do sở hữu myeloperoxidase có hoạt tính oxy hóa cao và lysozyme trong

các hạt lysosomes nội bào [70]. Ngoài ra, BC trung tính cũng có sự hiện diện của thụ

thể gắn kết kháng nguyên và thụ thể bổ thể [157]. Khi nghiên cứu quá trình phát triển

của tế bào BC, Willett et al. (1999) đã thông báo nguyên tủy bào BC trung tính

(Neutrophilic myelocyte) bắt đầu xuất hiện ở 34 đến 48 giờ sau khi trứng thụ tinh và

các tế bào trƣởng thành xuất hiện ở các mô khác nhau sau 72 giờ [207].

BC ƣa axít và BC ƣa kiềm ở cá không tham gia thực bào. Mặc dù chức năng của

chúng chƣa đƣợc biết rõ, nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ chúng có vai trò tham gia phản

ứng viêm và bảo vệ cơ thể chống lại ký sinh trùng [18].

Một loại tế bào khác cũng tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, đó là

tế bào độc không đặc hiệu (Non-specific cytotoxic cell - NCC). Mặc dù khác nhau

về hình thái cấu tạo, nhƣng chúng có chức năng tƣơng tự nhƣ tế bào diệt tự nhiên

(Natural killer cells- NK) ở động vật có vú, loại tế bào đƣợc biệt hóa từ tế bào

lympho lớn có hạt. Gần đây, một phát hiện mới về điểm khác biệt của NCC ở cá so

với NK ở động vật có vú ở chỗ NCC của cá là những tế bào lympho kích thƣớc nhỏ

không hạt phân bố trong các cơ quan lympho nhƣ tiền thận và lách nhƣng ít gặp ở

trong máu [181], [203]. Chúng có khả năng diệt nhiều loại tế bào đích khác nhau,

bao gồm các dị bào kể cả các tế bào nuôi cấy nhân tạo, các tế bào nhiễm virus, tế

bào khối u và động vật đơn bào ký sinh mà không đòi hỏi sự tham gia của kháng thể

[157]. NCC đƣợc mô tả đầu tiên ở cá da trơn, sau đó hoạt tính của nó cũng đƣợc

chứng minh ở nhiều loài cá khác nhƣ cá rô phi (Oreochromis niloticus), cá hồi vân,

cá chép và cá tráp [52], [181], [203]. Hoạt tính gây độc tế bào của chúng phụ thuộc

nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ [119], Vitamins [52], và các chất kích thích miễn dịch

nhƣ Chitin [66] và Levamisole [52].

Bên cạnh các nhân tố bảo vệ nêu trên, cơ thể vật chủ còn có khả năng phối hợp

cùng lúc rất nhiều cơ chế miễn dịch không đặc hiệu bao gồm cả các yếu tố tế bào lẫn

yếu tố dịch thể trong phản ứng viêm. Đặc điểm của phản ứng viêm là tăng tính thấm

thành mạch, hóa ứng động bạch cầu từ máu tới ổ viêm [4]. Khi cơ thể bị tổn thƣơng,

khởi đầu là sự gia tăng số lƣợng BC trung tính, tiếp đến là sự xuất hiện của BC đơn

nhân và ĐTB tại ổ viêm. BC trung tính tập trung khoảng một giờ sau khi tiêm tác

nhân gây viêm và đạt số lƣợng cực đại sau 48 h (Trích [4]). Tại đây, hàng loạt các tế

bào thuộc hệ miễn dịch không đặc hiệu bị kích hoạt và thực hiện chức năng thực bào, bùng nổ hô hấp, gây độc để tạo ra một lƣợng độc tố trung gian nhƣ O- hay NO-

đủ lớn để tiêu diệt mầm bệnh [112], [140], [168].

1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu hay còn gọi là miễn dịch mắc phải (Miễn dịch thích nghi)

là đáp ứng miễn dịch (ĐƢMD) chỉ có thể thấy ở động vật có xƣơng sống và có vai

trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự tái nhiễm bệnh. Đặc điểm quan

trọng của cơ chế ĐƢMD này là tính đặc hiệu, tính đa dạng và tính nhớ, nhờ đó mà

khi gặp lại cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên ĐƢMD thứ cấp đặc

trƣng với thời gian phản ứng nhanh và cƣờng độ mãnh liệt hơn.

Cho đến nay, các nghiên cứu tƣơng đối đầy đủ các khía cạnh liên quan ĐƢMD

đặc hiệu ở cá chỉ mới tập trung trên các đối tƣợng quen thuộc nhƣ cá hồi, cá da trơn và

cá chép [169], [193], [203]. Những yếu tố cơ bản của hệ miễn dịch mắc phải là các thụ

quan tế bào lympho T, lympho B, các phân tử kháng thể (Immuno globulin- Ig) [203].

1.3.2.1. Cơ quan lympho ở cá và các lympho bào

Lympho bào có mặt trong máu, các cơ quan lympho và các mô. Tế bào

lympho T (Tế bào T) biệt hoá ở tuyến ức (Thymus), các tế bào lympho B (Tế bào

B) biệt hoá ở tuỷ xƣơng. Trong đó, tế bào T đảm trách ĐƢMD qua trung gian tế bào

và hỗ trợ tế bào B sản sinh kháng thể. Ngoài ra, các tế bào lympho này còn có chức

năng nhớ và dung thứ miễn dịch. Chúng mang các thụ thể với các chức năng riêng

biệt trên bề mặt nhƣ thụ quan nhận diện kháng nguyên trên bề mặt tế bào B (Surface

immunoglobuline- sIg), hoặc thụ quan CD4 trên bề mặt tế bào T có nhiệm vụ hoạt

hóa tế bào B sinh kháng thể, hay tế bào T mang thụ quan CD8 làm nhiệm vụ của

các tế bào độc [4], [157].

Thời điểm xuất hiện đầu tiên của các loại tế bào lympho tại các cơ quan

lympho cũng khác nhau tùy loài cá, ngày tuổi và còn phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt

độ môi trƣờng. Ví dụ ở cá chép (Cyprinus carpio) xuất hiện tế bào lympho ở tuyến ức,

tiền thận và lách lần lƣợt sau 3, 6 và 8 ngày sau khi nở ở nhiệt độ 22 oC. Trong khi đó,

ở cá hồi vân (O. mykiss) xuất hiện các tế bào này ở các cơ quan lympho trên tuần tự

sau 3, 5 và 6 ngày sau khi nở ở 14 oC [196].

Tuyến ức, tiền thận và lách là ba cơ quan lympho lớn nhất ở cá xƣơng [215].

Sự hình thành các cơ quan lympho và xuất hiện các tế bào lympho trong các cơ

quan này có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu ĐƢMD ở cá.

Tuyến ức của cá là một cặp đối xứng nằm ở mặt lƣng xoang mang và ở vị trí

rất nông, chỉ đƣợc che chở bởi lớp ngoại bì của xoang mang (Hình 1.5). Lớp nội bì

của mạch máu trong tuyến ức và biểu bì xoang mang bao phủ tuyến ức liên kết nhau

rất chặt chẽ và ngăn chặn tuyệt đối việc tiếp xúc giữa các nguyên bào T với kháng

nguyên. Tuyến ức là nơi biệt hóa tế bào T. Trong tuyến ức có thể thấy các tế bào T

ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, ngoài ra còn có các đại thực bào, dƣỡng bào,

hồng cầu [64]. Ở cá, tuyến ức phát triển hoàn thiện trong những tuần đầu sau khi

nở, kích thƣớc tƣơng đối của tuyến ức đạt cao nhất khi cá còn non, khoảng 2-3

tháng tuổi. Tuy nhiên, Nakanishi (1991) cho rằng sự hoàn thiện hệ miễn dịch phụ

thuộc nhiều vào kích thƣớc cơ thể hơn là vào độ tuổi, đúng hơn là phụ thuộc vào số

lƣợng tế bào lympho có mặt tại các cơ quan lympho (Trích [196]). Sự phát triển của

tuyến ức đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều loài cá và các tác giả đều cho rằng thời điểm

hoàn thiện tuyến ức khác nhau tùy loài cá và phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ môi

trƣờng [32], [130].

Cơ quan lympho quan trọng thứ hai ở cá là thận. Thận cá cấu tạo gồm 2 phần:

phần trƣớc hay tiền thận (Head kidney) có chức năng tạo máu chủ yếu; phần giữa

và sau hay còn gọi là phần thân (Trunk kidney) có chức năng bài tiết. Tiền thận của

cá, ngoài chức năng tạo máu còn là nơi chứa các tế bào lympho B sinh kháng thể.

Ngoài ra, tiền thận còn chứa các tế bào độc tự nhiên, dƣỡng bào và các đại thực bào

tập trung trong các trung tâm Melanomacrophage [157]. Ở cá hồi vân, các tế bào

lympho và kháng thể IgM ở thận xuất hiện khoảng 12-14 ngày sau khi nở [203].

Lách cũng là cơ quan lympho quan trọng của cá. Mô lympho ở lách cá là một

lớp rìa mỏng bao quanh hệ thống các thể ellipsoid và các trung tâm

Melanomacrophage chứa các đại thực bào, tế bào lympho, các kháng thể và dƣỡng

bào [157]. Ngoài ra, thể ellipsoid lách cá có khả năng lƣu giữ kháng nguyên trong

thời gian dài nên có vai trò quan trọng tạo nên ký ức miễn dịch ở cá [203].

Những hiểu biết về sự phát triển của các cơ quan lympho có ý nghĩa rất quan

trọng trong việc xác định thời điểm sử dụng vaccine cho cá nhằm đem lại hiệu quả

ĐƢMD cao. Hrubec et al. (2004) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa độ tuổi với khả

năng ĐƢMD của con lai cá vƣợc (Giữa 2 loài Morone chrysops và Morone

saxatilis). Thí nghiệm triển khai trên cá ở 5 nhóm tuổi khác nhau là 4, 6, 9, 15 và 19

tháng tuổi, cá đƣợc gây miễn dịch bằng phƣơng pháp ngâm vaccine thƣơng mại

chống vi khuẩn Vibrio. Kết quả cho thấy nhóm cá ít tháng tuổi hơn có mức độ hình

thành kháng thể thấp hơn sau khi gây miễn dịch [93].

Ở cá mú, vài nghiên cứu về sự phát triển của các cơ quan lympho đã đem lại

những thông tin cơ bản và có ý nghĩa ứng dụng. Với phƣơng pháp mô hóa miễn

dịch, Lin et al. (2005) cho thấy chức năng các cơ quan lympho cá mú E.

malabaricus nhƣ tuyến ức, thận, lách đã xuất hiện ở ấu trùng 10 ngày tuổi [129].

Tuy nhiên, nghiên cứu của Kato et al (2004) ở cá mú E. bruneus thông báo rằng các

cơ quan lympho thận, lách và tuyến ức đã lần lƣợt hoàn thiện ở các ngày thứ 1, 6 và

12 sau khi nở. Các tế bào lympho xuất hiện ở các cơ quan này lần lƣợt sau 30, 33

và 21 ngày sau khi nở [109]. Dựa vào kết quả này, Lin et al. (2007) đã thử nghiệm

vaccine chống lại virus VNN ở cá mú chấm cam E. coioides ngay giai đoạn ấu

trùng 18 ngày tuổi, kết quả cho thấy sau 2 ngày liên tục cho cá ăn Artemia đƣợc

nhồi vaccine đã tạo nên kháng thể đặc hiệu với hệ số bảo hộ đến 69,5 % khi cảm

nhiễm nhân tạo [128].

m m 1

Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus [129]

( A: Mũi tên chỉ vị trí của tuyến ức; B: Mặt cắt thẳng đứng của tuyến ức hiển thị cấu

tạo gồm phần lõi ( Medulla - M) và phần vỏ ( Cortex - C) với các mũi tên chỉ các

trung tâm Melanomacrophage bắt màu đỏ đậm khi nhuộm Haematocylin và Eosin).

1.3.2.2. Kháng thể của cá

Kháng thể là một nhóm protein trong huyết thanh giúp sinh vật chống đỡ các

yếu tố kháng nguyên xâm hại cơ thể, đƣợc gọi là globulin miễn dịch

(Immunoglobulin – Ig). Kháng thể tham gia bảo vệ cơ thể thông qua việc trung hoà

hoặc thay đổi hoạt tính độc tố do vi khuẩn, virus tiết ra; hoặc tạo mạng lƣới ngƣng

kết, ngƣng tụ đối với tế bào vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng; hoạt hoá hệ bổ thể.

Cấu trúc của Ig là một phân tử protein có 4 chuỗi polypeptit giống nhau từng

đôi một bao gồm 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ, nối với nhau bằng cầu nối disulfide.

Ở cá xƣơng có 4 loại Ig đã đƣợc báo cáo, bao gồm IgM, IgD, IgZ và IgT [40].

Trong đó, IgM là kháng thể gặp ở hầu hết các loài cá xƣơng.

Đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của IgM trong huyết

thanh cá xƣơng chủ yếu với cấu trúc tetramer, song cũng đã phát hiện cả IgM dạng

dimer và monomer trong huyết thanh ở một số loài cá [203]. Ở cá hồi, ái lực của

IgM dạng monomer và tetramer tƣơng tự nhau nhƣng IgM dạng tetramer có khả

năng hoạt hóa bổ thể hiệu quả hơn [58].

Khối lƣợng phân tử của kháng thể IgM rất khác nhau giữa các loài cá: IgM ở

cá chép có khối lƣợng phân tử 608 kDa [165]; ở cá vƣợc là 833 kDa; ở cá tuyết là

680 kDa [87]; ở cá chỉ vàng là 766 kDa gồm 2 chuỗi nặng (71,8 và 67,6 kDa) và 2

chuỗi nhẹ (30,2 và 29,0 kDa) [143]; ở cá hồi có một chuỗi nặng 72 kDa và 2 chuỗi

nhẹ 27 và 25 kDa [87]; IgM ở cá nheo có 3 chuỗi nhẹ 22, 24 và 26 kDa [135]; ở cá

trắm cỏ có chuỗi nặng 77,3 kDa và chuỗi nhẹ 26,6 kDa [12].

Ở cá mú chấm cam, nghiên cứu của Cheng (2006) cho thấy phân tử IgM có

khối lƣợng chuỗi nặng và chuỗi nhẹ lần lƣợt là 78 và 27 kDa. Ngoài ra, nghiên cứu

này còn tìm thấy thêm một polypeptide có khối lƣợng 50 kDa và nghi ngờ là chuỗi

nặng thứ hai của phân tử IgM ở loài cá này [40].

Mặc dù phân tử kháng thể IgM có cấu trúc và số lƣợng các tiểu đơn vị khác

nhau giữa các loài cá, tuy nhiên, đến nay vẫn chƣa có bằng chứng cho thấy sự khác

nhau này có liên quan đến sự phát triển và phát sinh loài trong bậc thang tiến hóa

[180].

Hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh cá rất khác nhau tùy thuộc đặc điểm

loài, giai đoạn phát triển và các yếu tố ngoại cảnh tác động (đặc biệt là nhiệt độ và

chế độ dinh dƣỡng) [203]. Hàm lƣợng kháng thể IgM trong huyết thanh cá chép là

1,7 mg/mL chiếm 6,34 % protein huyết thanh [165]; ở cá hồi vân là 2,1 mg/mL

[59]; ở cá hồi Đại Tây Dƣơng là 0,8-1,3 mg/mL [87].

Ở cá, ngoài sự có mặt ở các cơ quan lympho, kháng thể còn đƣợc tìm thấy ở

mật [100], dịch nhờn ở da [86], ở mang [136] và ở ruột [104].

1.3.3. Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá

Các nhân tố ảnh hƣởng đến ĐƢMD ở cá có thể đƣợc chia thành 2 nhóm chính:

Các nhân tố nội tại và các nhân tố ngoại cảnh.

Các nhân tố nội tại chủ yếu liên quan đến quá trình phát triển của cá thể. Hệ

miễn dịch của cá phát triển hoàn thiện chỉ vài ngày sau khi nở, phụ thuộc sự hình

thành và xuất hiện các tế bào lympho tại các cơ quan lympho. Vì vậy, trong nuôi

trồng thủy sản, việc xác định thời điểm hệ miễn dịch hoàn thiện nhằm xác định thời

điểm sớm nhất có thể sử dụng vaccine cho cá có ý nghĩa hết sức quan trọng, có ảnh

hƣởng trực tiếp đến hiệu quả bảo hộ của vaccine trên cá. Ví dụ nhƣ hệ số bảo vệ

tƣơng đối (Relative Percent Protection- RPP) đạt đƣợc khi gây miễn dịch cho cá hồi

bằng vaccine bất hoạt Vibrio đạt rất thấp khi cá 2 tuần tuổi và tăng lên 100 % khi cá

ở 10 tuần tuổi [63].

Nhân tố ngoại cảnh ảnh hƣởng lớn nhất đến khả năng tạo ĐƢMD ở cá là nhiệt

độ. Trong phạm vi thích ứng của loài, nhiệt độ càng cao thì ĐƢMD càng nhanh và

cƣờng độ càng cao. Vào mùa đông, nhiệt độ giảm làm cho quá trình sinh tổng hợp

kháng thể bị ngƣng trệ và đặc biệt khi nhiệt độ giảm đột ngột, quá trình sinh kháng

thể có thể bị rối loạn [31]. Chính vì vậy, sức đề kháng của cá thƣờng giảm đi vì

chúng thƣờng bị thiếu máu và giảm đáng kể hàm lƣợng protein trong huyết thanh

sau thời kỳ ngủ và nhịn đói trong mùa đông. Vào mùa xuân, khi nhiệt độ nƣớc ấm

lên, quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, điều kiện môi trƣờng không thuận lợi

làm cá bị stress, nguyên nhân làm tăng hàm lƣợng corticosteroid trong máu dẫn đến

tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh [95]. Tuy nhiên, ảnh hƣởng do nhiệt độ thấp

đối với miễn dịch tự nhiên thƣờng không rõ ràng và ít đặc trƣng hơn so với miễn

dịch thích nghi [31]. Khả năng tạo ĐƢMD thích nghi ở những loài cá phân bố ở vùng

biển ấm thƣờng xảy ra nhanh hơn so với những loài phân bố ở vùng biển lạnh. Đối với cá hồi Đại Tây Dƣơng, ở nhiệt độ thích hợp từ 10-12 oC, kháng thể chỉ đƣợc phát hiện sau khi tiêm vaccine từ 4-6 tuần. Trong khi đó, đối với cá chẽm, ở nhiệt độ 22 oC,

kháng thể có thể đƣợc phát hiện chỉ 1 tuần sau khi gây miễn dịch [186].

Ngoài ra, khả năng ĐƢMD ở cá còn liên quan đến tình trạng sức khỏe, giới

tính, tác động của hoạt động nuôi trồng, các chất gây ô nhiễm, các loại hóa chất,

thuốc kháng sinh, chế độ dinh dƣỡng...[82].

Nhƣ vậy, những hiểu biết về sự hình thành các cơ quan lympho, cơ chế

ĐƢMD cũng nhƣ các nhân tố ảnh hƣởng đến ĐƢMD ở các đối tƣợng cá nuôi có ý

nghĩa rất quan trọng trong NTTS. Ngày nay, việc sử dụng vaccine và các hoạt chất

sinh học tác động đến hệ miễn dịch của cá nuôi là một trong những biện pháp phòng

bệnh hữu hiệu, là chìa khóa thành công trong NTTS, đặc biệt là nghề nuôi cá biển ở

quy mô công nghiệp.

1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá

1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi

Chất kích thích miễn dịch (Immunostimulants) là nhóm các chất có khả năng

làm gia tăng sức đề kháng bằng việc tăng cƣờng cơ chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên,

đặc biệt là khả năng thực bào của hàng rào các tế bào không đặc hiệu. Hiện nay, các

nghiên cứu ứng dụng chất kích thích miễn dịch trên cá biển nuôi ngày càng đƣợc

quan tâm và số lƣợng các chất đƣa vào sử dụng trong NTTS ngày càng nhiều.

Trong các loại hoạt chất kích thích miễn dịch, β-glucans, một hoạt chất đƣợc

tách chiết từ vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, đã đƣợc chứng minh

có tác dụng tốt nhất trong vai trò làm tăng khả năng chống lại TNGB ở nhiều loài

cá. Hoạt tính của β-glucans thể hiện qua khả năng hoạt hóa hệ bổ thể, lysozyme,

làm tăng hoạt tính thực bào, bùng nổ oxy của bạch cầu, kích thích cá sản sinh kháng

thể...Một số loài cá đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu sử dụng β-glucans nhằm tăng

cƣờng khả năng kháng bệnh có thể kể đến nhƣ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), cá

hồi Đại Tây Dƣơng (S. salar), cá hồi vân (O. mykiss), cá tráp (S. auratus), cá chẽm

Châu Âu (D. labrax), cá tuyết (G. morhua L.), cá chép (C. carpio), cá trê (Clarias

batrachus)...[28], [38], [48], [82], [113], [167], [178]. Mặc dù các thử nghiệm sử

dụng β-glucans cho cá ăn ở các nồng độ khác nhau trong khoảng thời gian khác

nhau, kết quả các thí nghiệm đều cho thấy hiệu quả tăng kích thích miễn dịch đạt

cao nhất ở nồng độ bổ sung β-glucans 1 g/kg ( tƣơng đƣơng 1000 ppm hoặc 0,1 % )

trong thời gian 15 ngày. Ví dụ nhƣ cá tráp có chỉ số thực bào của bạch cầu cao nhất

đạt 62% sau khi ăn β-glucans 1 g/kg trong 2 tuần [48]; cá chẽm Châu Âu ăn β-

glucans 0,1 % trong 15 ngày đã làm tăng đáng kể các thông số miễn dịch không đặc

hiệu [28]. Ở cá trê ăn bổ sung β-glucans 0,1 % cũng cho kết quả tƣơng tự [113].

Hầu hết các nghiên cứu sử dụng β-glucans kéo dài đều không cho hiệu quả kháng

bệnh cao [28], [38], [48], [113]...

Ở cá mú, vài nghiên cứu cũng đã ứng dụng các chất kích thích miễn dịch để

cải thiện sức đề kháng, nâng cao sức khỏe cá nuôi. Các hoạt chất chiết xuất từ rong

biển nhƣ Sodium alginate và κ-Carrageenan đƣợc bổ sung vào thức ăn đã làm tăng

số lƣợng bạch cầu, hoạt tính thực bào và khả năng kháng bệnh do V. alginolyticus ở

cá mú cọp [39]. Ở cá mú chấm cam, việc sử dụng 2 loại hoạt chất này cũng đem lại

hiệu quả tƣơng tự, làm tăng khả năng kháng bệnh đối với V. alginolyticus [38], và

vi khuẩn Streptococcus sp. [212].

Harikrishnan et al. (2011) đã thống kê có khoảng 22 loại chất kích thích miễn

dịch đã đƣợc sử dụng cho cá mú nuôi, bao gồm 3 loại thảo dƣợc, 6 loại chế phẩm

sinh học, 2 loại nấm men và 11 loại hợp chất hóa học. Các loại hoạt chất này đƣợc

sử dụng cho cả cá giống và cá trƣởng thành qua đƣờng tiêm và cho ăn. Tùy từng

loại hoạt chất, hiệu quả tăng cƣờng khả năng kháng bệnh cho cá kéo dài từ 120 giờ

đến 12 tuần [82]. Tuy nhiên, trong số 22 loại hoạt chất kích thích miễn dịch đƣợc

sử dụng cho cá mú đã thống kê, chỉ tìm thấy một công trình của Chiu et al.

(2010) nghiên cứu về ảnh hƣởng tế bào nấm S. cerevisiae ở cá mú chấm cam

trong khi hiệu quả của β-glucans đã đƣợc chứng minh ở nhiều loài cá. Kết quả

nghiên cứu này cũng cho thấy cá đƣợc cho ăn tế bào nấm trong 28 ngày đã cải

thiện đáng kể tốc độ tăng trƣởng, các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả

năng kháng bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. [42].

Nhìn chung, các công bố đều cho thấy tác dụng tích cực của các hoạt chất kích

thích miễn dịch trên cá nuôi. Trong đó, β-glucans là chất kích thích miễn dịch đem

lại hiệu quả kháng bệnh cao và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Tuy nhiên, số lƣợng

công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của chất này trên cá mú nuôi vẫn còn hạn chế. Vì

vậy, các nghiên cứu về nồng độ, phƣơng thức và thời gian sử dụng β-glucans cho cá

mú nuôi nhằm đem lại hiệu quả bảo hộ cao, góp phần tăng năng suất nghề nuôi cá

mú cũng cần đƣợc chú ý.

1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi

Ở các nƣớc có nghề nuôi cá biển phát triển nhƣ Na Uy, Mỹ, Nhật Bản, việc

nghiên cứu và sử dụng vaccine cho cá đƣợc đầu tƣ nghiên cứu từ rất sớm và đạt

đƣợc nhiều thành công.

Thử nghiệm vaccine vi khuẩn để phòng bệnh cho cá đƣợc công bố đầu tiên bởi

Duff (1942) [57]. Trong nghiên cứu này, cá hồi cutthroat trout sau khi ăn vi khuẩn

Aeromonas salmonicida bất hoạt bằng chloroform đã có khả năng kháng bệnh lở

loét Furunculosis. Năm 1970, vaccine thƣơng mại đầu tiên đƣợc sản xuất từ vi

khuẩn Vibrio bất hoạt bằng formalin phòng bệnh lở miệng (ERM) và Vibriosis đã

thành công tại Mỹ và đã làm giảm đáng kể lƣợng kháng sinh sử dụng cho nghề nuôi

cá hồi vân tại đây [186]. Tiếp đó, nhằm nâng cao hiệu quả bảo hộ cho cá nuôi,

vaccine tiêm có bổ sung chất bổ trợ (Adjuvant) ra đời trong những năm đầu 1990

[204]. Chất bổ trợ thông thƣờng gồm hai loại: Chất bổ trợ bán phần (FIA) với thành

phần chính là dầu khoáng và chất bổ trợ toàn phần (FCA) với thành phần là hỗn hợp

dầu khoáng và Mycobacterium tuberculosis đã bất hoạt bằng nhiệt. Ngoài vai trò

nhƣ một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu [21], các chất bổ trợ còn giữ cho

kháng nguyên đƣợc phóng thích từ từ trong cơ thể vật chủ, kéo dài thời gian tiếp

xúc của vật chủ với kháng nguyên, xác lập tính nhớ và kích thích sinh kháng thể đặc

hiệu trong thời gian dài [71], [96].

Những năm tiếp sau đó, nhiều loại vaccine vi khuẩn cho cá với các phƣơng

thức chế tạo khác nhau đã đƣợc nghiên cứu nhƣ vaccine bất hoạt kết hợp đa kháng

nguyên, vaccine sống nhƣợc độc, vaccine có bổ sung các loại chất bổ trợ khác

nhau…[159],[204]. Kể từ sau năm 1990, hầu hết các loại vaccine vi khuẩn cho cá

đã đƣợc thƣơng mại hóa ở các nƣớc có nghề nuôi cá phát triển. Các công ty sản

xuất vaccine cho cá có thể kể đến nhƣ Intervet (Hà Lan), Schering-Plough (Mỹ),

Pharmaq (Na Uy), Bayer (Đức)… Việc sử dụng vaccine phòng bệnh đã đem lại

những thành công vƣợt bậc cho nghề nuôi cá ở nhiều nƣớc. Ví dụ nhƣ, trong những

năm 1993 đến năm 2003, nhờ sử dụng vaccine phòng bệnh mà sản lƣợng nghề nuôi

cá hồi ở Na Uy đã tăng lên gấp 3 lần và giảm đáng kể lƣợng kháng sinh sử dụng

[186].

Năm 1951, nghiên cứu vaccin virus phòng bệnh cho cá đƣợc công bố đầu tiên

bởi Goncharov [204]. Nghiên cứu này đã chứng minh khả năng kháng bệnh virus

mùa xuân (Spring viraemia) ở cá chép sau khi tiêm gây miễn dịch bằng virus bất

hoạt formalin. Mãi đến năm 1982, loại vaccine virus này mới đƣợc thƣơng mại hóa

bởi công ty Bioverta ở Tiệp Khắc và đã đem lại nhiều thành công cho nghề nuôi cá

chép, bao gồm cá chép làm thực phẩm (Common carp) và cá chép cảnh (Koi carp)

tại các nƣớc Châu Á [186]. Tiếp theo đó là sự ra đời của vaccine virus tái tổ hợp

năm 1995, từ đây đã mở ra một hƣớng đi mới cho ngành thủy sản thế giới. Vaccine

phòng bệnh do các loại virus nguy hiểm ở cá đã đƣợc tập trung nghiên cứu nhƣ

virus gây hoại tử tuyến tụy (Infectious pancreatic necrosis virus- IPNV), virus gây

hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis- VNN), virus gây hoại tử máu (Infectious

hematopoetic necrosis virus- IHNV), virus gây xuất huyết lở loét (Viral

hemorrhagic septicemia virus-VHSV)… Cho đến năm 2005, Sommerser thống kê

có khoảng 19 loại vaccine phòng bệnh do vi khuẩn và 10 loại vaccine phòng bệnh

do virus đã đƣợc thƣơng mại hóa. Các loại vaccine này đƣợc sử dụng phòng bệnh cho

các đối tƣợng nuôi phổ biến bao gồm cá hồi, cá chẽm, cá mú, cá rô phi, cá chép, cá bơn

đuôi vàng... [186]. Vaccine virus trên thị trƣờng chủ yếu ở dạng bất hoạt [198].

Ký sinh trùng (KST) cũng đƣợc xem nhƣ là TNGB nguy hiểm cho cá khi

nhiễm cƣờng độ cao và là tác nhân mở đƣờng cho vi khuẩn, virus xâm nhập gây

bệnh. Song, các nghiên cứu vaccine phòng bệnh do KST ở cá rất ít đƣợc quan tâm.

Việc nuôi cấy KST để làm kháng nguyên trong sản xuất vaccine rất phức tạp và tốn

kém. Vì vậy, đến nay vẫn chƣa có vaccine phòng bệnh do KST đƣợc công bố trên

thị trƣờng [186].

Trong vài năm trở lại đây, các nghiên cứu vaccine phòng bệnh cho cá mú bắt

đầu đƣợc chú ý, tập trung tại các nƣớc Châu Á nhƣ Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung

Quốc, Đài Loan, Thái Lan. Vaccine virus bất hoạt phòng bệnh VNN đƣợc nghiên

cứu ở các loài cá mú nuôi phổ biến nhƣ cá mú chấm cam E. coioides [106], cá mú

cọp E. fuscoguttatus [154], cá mú E. tukula [107]. Kết quả các nghiên cứu này cho

thấy hiệu quả bảo hộ của vaccine ở cá kéo dài từ 3 tháng đến 17 tháng tùy tuổi cá.

Vaccine tái tổ hợp phòng bệnh VNN cho cá E. coioides cũng đƣợc nghiên cứu và

giá trị bảo hộ đạt 64,2 - 69,5 % sau 7 ngày tiêm gây miễn dịch [128].

Ngoài vaccine virus, thử nghiệm vaccine phòng bệnh do vi khuẩn trên cá mú

cũng đã có vài công bố. Vaccine vi khuẩn V. harveyi bất hoạt đã làm giảm tỷ lệ chết

ở nhóm cá mú E. bruneus tiêm vaccine (35 %) so với nhóm đối chứng (90 %) [83].

Vaccine tổ hợp từ 2 loài vi khuẩn V. harveyi và V. parahaemolyticus bất hoạt

formalin đã đƣợc thử nghiệm trên cá mú chấm cam tại Thái Lan, kết quả cho thấy

hiệu quả bảo hộ đạt đến 77,6 % [45].

Ngoài ra, vaccine phòng bệnh do KST ở cá mú cũng đã đƣợc nghiên cứu.

Yambot và Song (2006) đã tiêm Cryptocaryon irritans giai đoạn theront (Protozoa gây

bệnh đốm trắng ở cá) đã bất hoạt formalin cho cá mú chấm cam. Sau 3 tuần công

cƣờng độc, kết quả cho thấy tỷ lệ chết tích lũy ở nhóm cá đối chứng là 100 % trong khi

ở nhóm tiêm vaccine chỉ từ 0- 40 % tùy thuộc nồng độ kháng nguyên. Đồng thời, hàm

lƣợng kháng thể trong dịch nhờn ở nhóm tiêm vaccine đã tăng hơn đáng kể [211].

Song song với nghiên cứu chế tạo vaccine, phƣơng pháp sử dụng vaccine phòng

bệnh cho cá nuôi để đạt hiệu quả phòng hộ tốt nhất cũng đƣợc quan tâm nghiên cứu.

Cho đến nay, trên thế giới đã sử dụng nhiều cách khác nhau để gây miễn dịch cho cá

nuôi phụ thuộc từng loại vaccine, loài cá, độ tuổi cũng nhƣ điều kiện nuôi. Hiện nay,

trong NTTS, phƣơng pháp dẫn truyền vaccine cho cá qua các con đƣờng nhƣ sau:

 Tiêm (Injection administration): Trong phƣơng pháp này, vaccine có thể

đƣợc tiêm vào xoang bụng hoặc vào phần cơ. Phƣơng pháp tiêm vaccine vào xoang

bụng đƣợc áp dụng phổ biến trong nghề nuôi cá hồi Đại Tây Dƣơng (Salmo salar).

Cá giống đƣợc tiêm vaccine trƣớc khi đƣa ra biển nuôi vài tháng. Thông thƣờng,

phƣơng pháp tiêm xoang bụng áp dụng chủ yếu cho vaccine phòng bệnh do vi

khuẩn và phƣơng pháp tiêm cơ áp dụng cho vaccine DNA phòng bệnh do virus

[47]. Thành phần kháng nguyên trong các loại vaccine tiêm thƣờng kết hợp nhiều

dòng vi khuẩn trong cùng một loài hoặc khác loài và virus đã bị giết chết hoặc

protein của virus. Loại vaccine đa giá này giúp cơ thể cá đáp ứng lại với nhiều loại

kháng nguyên và phòng đƣợc nhiều loại bệnh khác nhau [34]. Tiêm là con đƣờng

dẫn truyền vaccine đem lại hiệu quả cao nhất trong việc kích thích sản xuất kháng

thể toàn thân cũng nhƣ tạo nên hiệu quả bảo vệ tốt nhất và tồn tại trong thời gian dài

[142]. Ngoài ra, lƣợng vaccine sử dụng tiêm cho cá thƣờng nhỏ và toàn bộ vaccine

đƣợc vào trong cơ thể cá nên không tiêu tốn một lƣợng lớn vaccine nhƣ các phƣơng

pháp khác. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng tồn tại khá nhiều nhƣợc điểm. Cá có

khối lƣợng thân nhỏ hơn 20 g thì khó áp dụng đƣợc phƣơng pháp tiêm trong khi cá

càng nhỏ thì càng dễ mẫn cảm với TNGB [159]. Ngoài ra, tiêm vaccine thƣờng gây

sốc cho cá do thao tác đánh bắt khi tiêm, đòi hỏi nhiều thời gian và công sức.

Nhằm khắc phục các nhƣợc điểm trên, các chất gây mê đƣợc sử dụng để giảm

thiểu nguy cơ gây sốc cho cá trong lúc tiêm. Đồng thời, các thiết bị tiêm vaccine tự

động với các dây chuyền hiện đại cũng đƣợc nghiên cứu thiết kế nhằm đáp ứng cho

nghề nuôi cá công nghiệp tại nhiều nƣớc trên thế giới. Trong khi phƣơng pháp tiêm

vaccine bằng tay chỉ tiêm đƣợc 1.000 - 1.200 con/giờ [61] thì sử dụng máy tiêm có

thể lên tới 7.000 - 9.000 con/giờ [160]. Tuy nhiên, tiêm bằng máy lại đòi hỏi kích

thƣớc cá phải tƣơng đƣơng nhau vì lƣợng vaccine ở mỗi liều tiêm đều giống nhau

[160].

 Qua da và mang: Con đƣờng dẫn truyền này có thể đƣợc thực hiện bằng

phƣơng pháp tắm, ngâm hoặc phun vaccine cho cá theo nhiều cách khác nhau.

Ngâm vaccine (Immersion administration) là phƣơng pháp đơn giản, có chi

phí thấp và đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Cá có thể đƣợc ngâm trực tiếp trong

vaccine (Direct Immersion – ID) hoặc ngâm trong dung dịch muối ƣu trƣơng kết

hợp vaccine (Hyperosmotic Immersion – HI). Nồng độ và thời gian ngâm vaccine

phụ thuộc vào loại vaccine, loài cá, khối lƣợng cơ thể. Trƣớc đây, nhiều nghiên cứu

cho rằng phƣơng pháp HI có thể gây sốc cho cá hơn so với DI [61]. Huising et al.

(2003) đã so sánh 2 phƣơng pháp DI và HI trên cá chép C. carpio, kết quả đã chứng

minh phƣơng pháp HI đã làm tăng ĐƢMD của cá mà không làm cá bị sốc [94].

Phƣơng thức này có hiệu quả ở cá hồi trong việc tăng khả năng đề kháng Vibriosis

và ERM [159]. Ở cá mú, nghiên cứu của Kai và Chi (2008) cho thấy khi tắm cá mú

chấm cam trong dịch virus HGNNV bất hoạt bằng Binary ethylenimine đã đem lại

hệ số bảo hộ đạt đến 82 - 87 % và thời gian bảo hộ kéo dài hơn 3 tháng [106].

Ngoài ra, phƣơng pháp phun vaccine trực tiếp lên cá cũng đƣợc thông báo có hiệu

quả kháng bệnh do Vibrio ở cá, áp dụng tốt nhất ở giai đoạn cỡ cá 20 g/con. Tuy

nhiên, phƣơng pháp này dễ gây sốc cho cá hơn là phƣơng pháp DI [60].

Gần đây, để nâng cao hiệu quả hấp thu vaccine qua mang và da, nhiều nghiên

cứu đã cải tiến phƣơng pháp ngâm, tắm vaccine cho cá kết hợp với sóng siêu âm.

Zhou et al. (2002) thí nghiệm về khả năng dẫn truyền vaccine vi khuẩn V.

alginolyticus vào cơ thể cá mú E. awoara bằng sóng siêu âm tần số 20 kHz. Kết quả

cho thấy tắm vaccine trong sóng siêu âm đã đem lại hiệu quả bảo vệ tốt tƣơng

đƣơng với phƣơng pháp tiêm [218]. Phƣơng pháp này cũng cho kết quả bảo vệ tốt ở

loài cá tráp Pagrus major đối với TNGB là V. anguillarum và V. alginolyticus

[218]. Khi so sánh khả năng hấp thu và tạo kháng thể ở cá vàng Carassius auratus

đối với huyết thanh albumin (BSA) giữa 2 phƣơng pháp dẫn truyền là sóng siêu âm

và ngâm HI, Navot et al. (2004) đã chứng minh dẫn truyền bằng sóng siêu âm cho

hiệu quả tốt nhất với thời gian hiệu ứng nhỏ hơn 5 lần so với phƣơng pháp HI [147].

Ngoài ra, phƣơng pháp bao gói kháng nguyên trong các hạt có kích thƣớc nano

(Nano-encapsulation) cũng làm tăng hiệu quả hấp thu vaccine và ĐƢMD ở cá. Kai và

Chi (2008) đã chứng minh vaccine từ virus HGNNV bất hoạt bằng formalin đƣợc bao

gói trong các hạt có kích thƣớc 80 nm đã đem lại hiệu quả bảo hộ ở cá mú chấm cam

là 83 %, trong khi cá tắm trong vaccine chƣa đƣợc bao gói chỉ đạt 58,6 % [106].

Nhìn chung, phƣơng pháp ngâm, tắm vaccine cho cá có những ƣu điểm nhƣ dễ

thực hiện với số lƣợng cá lớn, có thể áp dụng với cỡ cá nhỏ, ít hoặc không gây sốc

cho cá, không tốn nhiều công sức và thời gian. Tuy nhiên, phƣơng pháp này lại đòi

hỏi sử dụng một lƣợng lớn vaccine [159].

 Qua đƣờng tiêu hóa bằng cách cho ăn (Oral administration): Phƣơng pháp

dẫn truyền này thực hiện bằng cách bao gói thức ăn bằng kháng nguyên hoặc trộn

kháng nguyên vào thức ăn trong quá trình chế biến. Hiện nay, trong quá trình sản

xuất vaccine qua đƣờng ăn, một số thành phần khác đƣợc bổ sung vào thức ăn cùng

với kháng nguyên nhƣ vi tảo, các hạt nano, alginate, chitosan, các chủng vi khuẩn

đã đƣợc làm yếu nhằm làm tăng khả năng hấp thu và dẫn truyền vaccine trong cơ

thể cá [159].

Tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp ngâm, ƣu điểm của phƣơng thức này là không gây

sốc cho cá, đơn giản, dễ áp dụng với số lƣợng lớn cá ở các kích cỡ khác nhau, ít tốn

kém công lao động. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp cho ăn là lƣợng vaccine tiêu tốn

lớn do phải cho ăn vaccine trong nhiều ngày và trong đa số trƣờng hợp thực nghiệm

cho thấy hiệu quả bảo vệ thu đƣợc chỉ đạt ở mức độ trung bình [60]. Khó khăn khác

của việc gây miễn dịch bằng phƣơng pháp cho ăn đó là hiệu quả của vaccine giảm

thấp do tác dụng của các men tiêu hoá. Thí nghiệm với vaccine phòng bệnh

Vibriosis ở cá hồi cho thấy phần ruột sau của cá là nơi hấp thu kháng nguyên chủ

yếu. Vì thế, hiệu quả bảo vệ của vaccine cao nhất đạt đƣợc khi bơm vaccine vào

phần ruột sau qua hậu môn của cá [159]. Ngoài ra, việc bao gói vaccine nhằm bảo

vệ vaccine không bị phân huỷ khi đi qua phần trƣớc ống tiêu hóa của cá hẳn sẽ là

phƣơng thức hữu hiệu trong việc gia tăng hiệu quả sử dụng vaccine theo phƣơng

thức cho ăn trong tƣơng lai [159].

Nhìn chung, trên thế giới, nhiều loại vaccine phòng bệnh cho cá nuôi đã đƣợc

nghiên cứu và sản xuất, từ loại vaccine đơn giản nhƣ vaccine bất hoạt (Inactivated),

đến vaccine có công nghệ sản xuất phức tạp nhƣ vaccine nhƣợc độc (Live

attenuated), vaccine đa giá (Multivalent), vaccine tiểu phần (Sub-unit vaccine). Mỗi

loại vaccine có qui trình sản xuất, cách sử dụng cũng nhƣ công hiệu khác nhau trên

các loài cá.

Ở cá mú, mặc dù các nghiên cứu vaccine đã đạt đƣợc một số thành công nhất

định, song, cho đến nay vaccine trên cá mú chỉ có ý nghĩa trong phạm vi phòng thí

nghiệm và vẫn chƣa có sản phẩm thƣơng mại trên thị trƣờng. Vì vậy, việc tiếp tục

nghiên cứu sâu hơn, đầy đủ hơn về các TNGB, cơ chế miễn dịch, nhanh chóng sản

xuất các loại vaccine phòng bệnh cho đối tƣợng này đang rất cần thiết và có ý nghĩa

thực tiễn lớn.

1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vaccine cho cá vẫn còn khá

mới mẽ. Vài công trình nghiên cứu miễn dịch trên cá chỉ mới bắt đầu thực hiện

trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung trên các đối tƣợng cá nƣớc ngọt nhƣ cá

trắm cỏ, cá tra…

Vũ Dũng Tiến (2005) nghiên cứu ĐƢMD ở cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon

idellus) đối với vi khuẩn gây bệnh xuất huyết đốm đỏ (Aeromonas hydrophila). Kết

quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lƣợng protein trong huyết thanh cá trắm cỏ khác

nhau tùy thuộc kích cỡ, điều kiện nuôi cũng nhƣ tình trạng sinh lý cá. Ngoài ra,

phân tử kháng thể IgM của cá trắm cỏ có khối lƣợng phân tử khoảng 830 kDa với

chuỗi nặng khoảng 77,3 kDa và chuỗi nhẹ khoảng 26,6 kDa [12]. Nghiên cứu của

Bui Ngoc Thanh et al. (2009) đã chứng minh tỷ lệ cá rô phi nhiễm ấu trùng

metacercariae của sán lá ký sinh Haplorchis pumilio khi thí nghiệm cảm nhiễm qua

môi trƣờng nƣớc (>70 %), cao hơn nhiều so với phƣơng pháp tiêm xoang bụng (<15

%). Ngƣợc lại, hàm lƣợng kháng thể ở nhóm gây miễn dịch bằng cách tiêm ấu trùng

cercariae tăng lên đáng kể so với nhóm cảm nhiễm qua môi trƣờng nƣớc nuôi [197].

Gần đây, liên quan đến bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

gây ra trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng

loạt các công trình tập trung nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh và bƣớc

đầu nghiên cứu chế tạo vaccine phòng bệnh.

Vũ Thị Thanh Hƣơng và ctv (2011) thông báo đã tạo đƣợc chủng vi khuẩn E.

ictaluri nhƣợc độc thành công bằng phƣơng pháp sử dụng kháng sinh Rifampicin

gây đột biến. Qua đó, chủng vi khuẩn đột biến chỉ gây chết cá khỏe 58,9 % trong khi chủng hoang dại gây chết đến 97 % ở thí nghiệm công cƣờng độc với 105

cfu/con cá [6]. Trong khi đó, chủng E. ictaluri đột biến gen purA (PAM) không

gây chết cá khỏe với liều tƣơng tự [7]. Mặt khác, hai loại protein ngoại mạc của vi

khuẩn này là OmpA và OmpN đƣợc chứng minh là có khả năng gây kích thích miễn

dịch ở cá và khuyến nghị sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất vaccine tiểu phần

phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra [1].

Ngoài ra, trong khuôn khổ chƣơng trình công nghệ sinh học thủy sản của Bộ

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đề tài “Nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh

đốm trắng trên cá tra P. hypophthalmus ” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản

II ( Viện II) chủ trì đã cho kết quả nghiên cứu bƣớc đầu ở phòng thí nghiệm rất khả

quan. Cá tra đƣợc tiêm vaccine kết hợp tá chất Aluminum và tiêm nhắc lại sau 14

ngày đã tạo lƣợng kháng thể trong máu cao và kéo dài thời gian bảo hộ cho đàn cá

đến 2 tháng. Tiếp đó là đề tài “Nâng cao hiệu quả sử dụng vaccine bất hoạt thông

qua sốc nhiệt protein trong vaccine” cũng do Viện II thực hiện trong 3 năm (2010-

2012). Kết quả bƣớc đầu thông báo đã phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩn E. ictaluri

gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Trong

đó, kết quả xác định đƣợc 2 chủng có độc lực cao trong gây nhiễm thực nghiệm, đồng thời khi xử lý bằng sốc nhiệt ở 41oC trong 30 phút, các chủng này đã tạo hàm

lƣợng kháng thể cao nhất ở cá tra [http://www.vienthuysan2.org.vn].

Cũng trên đối tƣợng này, nghiên cứu vaccine phòng bệnh do vi khuẩn E.

ictaluri đã thu hút sự quan tâm của công ty Pharmaq, một trong những công ty hàng

đầu trong sản xuất vaccine cho các đối tƣợng thủy sản tại Na Uy. Qua nhiều năm

nghiên cứu, vaccine Alphaject Panga-1 phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã ra đời

và thử nghiệm thành công trên cá tra tại 3 tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre.

Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vaccine này là an toàn cho cá, giúp cá tạo kháng

thể đặc hiệu chống lại vi khuẩn với hệ số bảo hộ từ 50 – 64,7 % [3]. Mới đây,

vaccine này cũng đã đƣợc Cục thú y (Thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông

thôn) cấp phép lƣu hành kể từ tháng 4/2013 [http://www.fistenet.gov.vn/e-nuoi-

trong-thuy-san/b-nuoi-thuy-san/vac-xin-cho-ca-lan-dau-tien-duoc-chap-thuan-tai-

viet-nam/]. Thành công này đã đem lại một công cụ hỗ trợ hữu hiệu cho sự phát

triển của nghành công nghiệp cá tra tại Việt Nam.

Nhìn chung, gần đây những nghiên cứu miễn dịch cá và vaccine phòng bệnh

cho cá ở Việt Nam đã đƣợc quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, số lƣợng công trình

nghiên cứu còn rất hạn chế, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch trên các đối tƣợng

cá biển có giá trị kinh tế nhƣ cá mú vẫn chƣa đƣợc thực hiện. Một vài công trình

nghiên cứu có liên quan đến miễn dịch và vaccine trên cá nƣớc ngọt và nƣớc lợ

đƣợc Nhà nƣớc đầu tƣ đã và đang thực hiện, kết quả đạt đƣợc cho đến nay mới chỉ

ở qui mô phòng thí nghiệm và chƣa đƣợc áp dụng rộng rãi hoặc chƣa đƣợc công bố.

Với những kết quả bƣớc đầu đạt đƣợc, hy vọng các nghiên cứu về miễn dịch và

vaccine trên những đối tƣợng nuôi có giá trị kinh tế sẽ đƣợc tiếp tục đầu tƣ đúng

mức, nhằm tạo ra những sản phẩm vaccine nội địa phù hợp với đối tƣợng nuôi,

nâng cao chất lƣợng sản phẩm và đủ sức cạnh tranh với thị trƣờng xuất khẩu thủy

sản trên thế giới.

Trên thế giới, các loài cá nuôi phổ biến nhƣ cá hồi Đại Tây Dƣơng, cá hồi vân,

cá chẽm, cá tráp, cá nheo, cá tuyết, cá chép, cá rô phi…đã đƣợc nghiên cứu rất sâu

về ĐƢMD và đã có các sản phẩm vaccine thƣơng mại phòng bệnh do virus và vi

khuẩn cho các đối tƣợng này từ rất sớm [186]. Trong khi đó, cá mú chấm cam là đối

tƣợng cá biển có giá trị kinh tế, đang đƣợc nuôi rất phổ biến tại Việt Nam và các

nƣớc trong khu vực. Song, cá mú chấm cam vẫn chƣa đƣợc sự quan tâm đúng mức

từ phía các nhà khoa học, từ những nghiên cứu cơ bản về đặc điểm hệ miễn dịch

cũng nhƣ ĐƢMD đối với các TNGB. Số lƣợng công trình nghiên cứu liên quan đến

miễn dịch trên cá mú nói chung và cá mú chấm cam nói riêng trên thế giới vẫn còn

rất hạn chế. Vài công trình nghiên cứu trên cá mú đã bƣớc đầu phát hiện thời điểm

hoàn thiện các cơ quan lympho [129], đặc điểm phân tử kháng thể IgM [40], hay đạt

đƣợc một số kết quả nhất định trong thử nghiệm vaccine virus bất hoạt phòng bệnh

VNN [106], [107], [154], hoặc ứng dụng các chất kích thích miễn dịch không đặc

hiệu phòng bệnh do vi khuẩn V. alginolyticus, Streptococcus sp. [38], [39], [212].

Mặc dù các kết quả này có ý nghĩa khoa học quan trọng nhƣng phạm vi ứng dụng

vẫn còn hạn chế trong qui mô phòng thí nghiệm. Vì vậy, cho đến nay, vaccine cho

cá mú vẫn chƣa có mặt trên thị trƣờng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về miễn dịch học trên cá còn khá mới mẽ, đặc

biệt là miễn dịch học ở cá biển vẫn còn bỏ ngõ, trong đó có cá mú. Trong khi đó,

dƣới tác động của biến đổi khí hậu kết hợp với nguồn con giống không kiểm soát,

dịch bệnh trên cá mú vẫn đang liên tục xảy ra và ngày càng có chiều hƣớng nguy

hiểm hơn với tác hại to lớn hơn [5], [8], [14]. Đây cũng là trở ngại lớn khi định

hƣớng phát triển nuôi đối tƣợng này ở qui mô công nghiệp. Do đó, các nghiên cứu

về TNGB, cơ chế ĐƢMD ở cá, làm cơ sở cho ứng dụng nghiên cứu vaccine phòng

bệnh cho cá mú là rất cần thiết, góp phần thúc đẩy nghề nuôi cá mú phát triển ở qui

mô công nghiệp, năng suất ổn định và bền vững.

CHƢƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tƣợng

Cá mú chấm cam Epinephelus coioides

2.1.2. Vật liệu

Bao gồm một số vật liệu chính sau

(i) Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides)

 Cá mú bị bệnh lở loét xuất huyết: Gồm 24 con cá mú chấm cam E. coioides

có khối lƣợng thân từ 16 g – 1.250 g, chiều dài thân từ 11,5 cm – 41 cm đƣợc thu từ

các vùng nuôi cá mú trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu là Cam Ranh và Nha

Trang. Mẫu cá thu có biểu hiện bệnh đặc trƣng là bỏ ăn, có các điểm xuất huyết lở

loét trên da, vây xơ và mòn cụt. Khi thu mẫu, kết hợp ghi chép nguồn gốc cá, ngày

thu, biểu hiện bệnh. Mẫu cá sống đƣợc bảo quản trong các thùng lạnh, có sục khí

trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, cá

đƣợc cân đo khối lƣợng và kích thƣớc, sau đó giải phẫu lấy mẫu bệnh phẩm tại gan,

thận và phần cơ tại vết loét để nuôi cấy phân lập vi khuẩn.

 Cá mú khỏe dùng cho các thí nghiệm: Cá mú chấm cam khỏe đƣợc mua từ

trại sản xuất giống tại Khánh Hòa. Chọn cá có kích cỡ đồng đều, màu sắc cơ thể

sáng, vận động nhanh, không bộc lộ các dấu hiệu bệnh. Cá đƣợc nuôi thuần dƣỡng

ít nhất 2 tuần trƣớc khi tiến hành các thí nghiệm.

(ii) Các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Gồm 4 chủng V. parahaemolyticus đã đƣợc dùng trong nghiên cứu này, cụ thể

nhƣ sau:

 V. parahaemolyticus V3: phân lập từ thận cá mú nuôi thƣơng phẩm tại

Khánh Hòa bị bệnh lở loét năm 2008, lƣu giữ tại Phòng thí nghiệm Bệnh và Môi trƣờng,

Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III. Đây là chủng có độc lực mạnh nhất đƣợc sàng

lọc từ các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh (Phụ lục 1).

 V. parahaemolyticus V1: phân lập từ cá mú bệnh lở loét nuôi tại Cát Bà,

Hải Phòng do Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch bệnh và môi trƣờng khu vực miền

Bắc, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I cung cấp.

 V. parahaemolyticus V2: cung cấp bởi Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch

bệnh và môi trƣờng khu vực miền Nam, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.

 V. parahaemolyticus A: chủng V. parahaemolyticus 17802 mua từ ngân

hàng chủng ATCC (American Type Culture Collection).

(iii) Chất kích thích miễn dịch β-glucan

Chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu sử dụng cho thí nghiệm là sản

phẩm β-glucan dạng bột với hàm lƣợng 99 % đƣợc tách chiết từ vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae do công ty Macrogard® - Biorigin, Na Uy cung cấp.

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài đã thực hiện tại các địa điểm với các nghiên cứu cụ thể nhƣ sau:

(i) Phân lập, định danh vi khuẩn, phân tích kháng thể, phân tích các thông số

miễn dịch không đặc hiệu đƣợc thực hiện tại Phòng Nghiên cứu Bệnh và Môi trƣờng

- Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, 33 Đặng Tất, Nha Trang, Khánh Hòa.

(ii) Các thí nghiệm cảm nhiễm xác định độc lực, đánh giá ảnh hƣởng của chất

kích thích miễn dịch không đặc hiệu và vi khuẩn bất hoạt đến đáp ứng miễn dịch ở cá

mú đƣợc triển khai tại Trung tâm nuôi biển Sông Lô - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng

Thủy sản III.

(iii) Định danh vi khuẩn, tinh sạch phân tử kháng thể Immunoglobuline lớp M

(IgM) từ huyết thanh cá mú khỏe, phân tích protein của vi khuẩn và IgM, tạo kháng

huyết thanh thỏ đối với IgM cá mú phục vụ cho các phƣơng pháp phân tích kháng

thể đƣợc thực hiện tại Phòng Nghiên cứu miễn dịch cá – Bộ môn Sinh học – Khoa

Toán và Khoa học tự nhiên - Trƣờng Đại học Bergen, Na Uy.

2.1.4. Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 1/2008 đến tháng 11/2012.

2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides

(Hamilton,1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus

Đáp ứng miễn Đặc điểm phân tử

dịch đặc hiệu của kháng thể IgM

cá mú E. coioides của cá mú

đối với vi khuẩn V. E. coioides

parahaemolyticus

bất hoạt bằng Đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú E. coioides formalin Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá mú E. coioides với V. parahaemolyticus và ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch này.

KẾT LUẬN Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

2.3.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

 Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh

Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của

Whitman (2004) [205]. Mẫu bệnh phẩm thu từ gan, thận và phần cơ tại vết loét của

cá mú bệnh đƣợc cấy trên môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA; Difco),

Trypticase Soya Broth (TSB; Difco) có bổ sung 2 % NaCl và môi trƣờng chọn lọc

vi khuẩn Vibrio là Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose Agar (TCBS Agar; Merck).

Các chủng thuần sau khi phân lập đƣợc giữ trong môi trƣờng TSB có bổ sung 20 % glycerol (Merck) ở -70 oC, hoặc đông khô để lƣu giống phục vụ cho các nghiên cứu

tiếp theo.

 Nuôi thu sinh khối

Vi khuẩn đƣợc nuôi thu sinh khối ở bình thủy tinh 50 mL chứa môi trƣờng

TSB có 2 % NaCl, ủ ở 33 oC trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.

 Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và định danh vi khuẩn

Hình thái vi khuẩn đƣợc xác định bằng cách quan sát tế bào vi khuẩn ở các

tiêu bản ép, nhuộm Gram (Difco) dƣới kính hiển vi (CX31J, Olympus) ở độ phóng

đại 1000 lần sử dụng vật kính dầu (100 X).

Khả năng dung huyết của vi khuẩn đƣợc khảo sát theo phƣơng pháp của

Twedt et al. (1970) [202], trên môi trƣờng thạch máu (Blood agar base – BA,

Difco) bổ sung 2 % NaCl và 5 % máu thỏ.

Các đặc điểm sinh hóa đƣợc xác định dựa trên các bộ kít API-20E và Biolog

GN system (BioMerieux) với các bƣớc thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Ngoài ra, một số phản ứng sinh hóa khác cũng đƣợc làm thêm nhƣ: Oxidase,

Catalase, O/F, O/129 (150 μg) và xác định đặc điểm sinh thái thông qua khả năng

chịu đựng độ mặn của vi khuẩn ở các nồng độ muối: 0, 3, 6, 8 và 10 %. Các phản

ứng này thực hiện theo phƣơng pháp của Whitman (2004) [205].

Định danh vi khuẩn đƣợc thực hiện kết hợp 2 phƣơng pháp: Định danh theo

phƣơng pháp vi sinh vật học truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý,

sinh hóa thu đƣợc và tra theo khóa phân loại của Bergey [90]. Để kiểm chứng kết

quả định danh theo phƣơng pháp truyền thống, chủng V3 đƣợc định danh bằng

phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA theo

phƣơng pháp của Harris và Hartley (2003) [84] (Kết quả trình bày ở phụ lục 2).

2.3.1.2. Phân tích thành phần protein của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus

Thành phần protein của 4 chủng V. parahaemolyticus đƣợc xác định bằng kỹ

thuật Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) theo

phƣơng pháp của Tsang et al. (1983) [201]. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:

Sau khi nuôi sinh khối, huyền dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm 6.000 vòng/phút ở 4 oC trong 10 phút. Rửa và ly tâm 3 lần trong dung dịch Photphate Buffered Saline

(PBS) để thu phần vi khuẩn kết lắng ở đáy ống nghiệm. Xác định khối lƣợng vi

khuẩn thu đƣợc bằng cân phân tích (AV-320, Shimadzu, Nhật). Pha loãng vi khuẩn

trong dung dịch đệm (950 µl LaemmLi sample buffer, 50 µl dung dịch 2-

Mecaptoethanol, Bio-rad) để đạt nồng độ 1 µg vi khuẩn/µl.

Mẫu vi khuẩn đƣợc sốc nhiệt ở 95 oC/5 phút trƣớc khi cho 5 µg (5 µl) mẫu vào

các giếng trên bản thạch Polyacrylamide và thực hiện điện di ở 200 V trong 45 phút

sử dụng buồng điện di Mini-Protein tetra cell (Bio-Rad).

Nhuộm bản thạch bằng Silver stain kit (Bio-rad) với các bƣớc thực hiện theo

chỉ dẫn của nhà sản xuất. Khối lƣợng phân tử các protein của vi khuẩn trên bản

thạch đƣợc tính toán trên cơ sở so sánh với mẫu hỗn hợp protein chuẩn (Cat. 161-

0314, Bio-rad).

2.3.1.3. Xác định khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus ở cá mú chấm cam

a. Chuẩn bị vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn nghiên cứu (V1, V2, V3 và A) lƣu giữ ở -70 oC đƣợc nuôi

cấy tăng sinh trong môi trƣờng TSB bổ sung 2 % NaCl ở 33 oC trong 18 - 24 giờ.

Dựa vào đƣờng cong sinh trƣởng tƣơng ứng của mỗi chủng vi khuẩn đã

đƣợc xác định trƣớc để xác định thời điểm thu hoạch (Phụ lục 3). Huyền dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm 6.000 vòng/phút ở 4 oC trong 10 phút (H-1300-Kokusan, Nhật)

rồi pha loãng trong PBS. Xác định mật độ vi khuẩn thông qua đƣờng chuẩn đƣợc

thiết lập trƣớc dựa trên sự tƣơng quan giữa mật độ quang OD ( Đo bằng máy đo

quang phổ Smartspec TM3000, Biorad ở bƣớc sóng 600 nm) và mật độ vi khuẩn

sống (cfu/mL) (Qua nuôi cấy xác định gián tiếp trên TCBS) theo phƣơng pháp của

Dalgaard et al. (1994) [54] và Begot et al. (1996) [29] (Phụ lục 3). Pha loãng huyền dịch khuẩn trong PBS để đạt mật độ cần thí nghiệm độc lực tƣơng ứng là 102, 103, 104 và 105 cfu/g cá.

b. Cá mú chấm cam và điều kiện thí nghiệm

Cá mú khỏe dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm các chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus V1, V2, V3 và A có khối lƣợng thân trung bình lần lƣợt là 38,43

± 3,07; 32,63 ± 1,83; 17,57 ± 1,40; 25,80 ± 2,33 g/con đƣợc phân bố ngẫu nhiên vào các bể composit 300 lít chứa nƣớc biển có độ mặn 33 ‰, nhiệt độ 27 - 28 oC,

sục khí và bơm lọc tuần hoàn liên tục, mỗi bể chứa 6 con.

c. Bố trí thí nghiệm và cách gây nhiễm Mỗi chủng vi khuẩn đƣợc bố trí cảm nhiễm với 4 mật độ vi khuẩn 102, 103, 104 và 105 cfu/g cá và nhóm đối chứng. Huyền dịch vi khuẩn với các mật độ khác

nhau đƣợc tiêm vào cơ của cá thí nghiệm và tiêm 0,2 mL PBS tiệt trùng đối với

nhóm cá đối chứng. Thí nghiệm lặp lại 2 lần.

d. Theo dõi chăm sóc, thu mẫu và đánh giá độc lực

Hàng ngày, cá đƣợc cho ăn bằng thức ăn viên (M503, Uni-president Việt

Nam) với khẩu phần 2 % và theo dõi quá trình phát bệnh. Ghi chép dấu hiệu bệnh

lý, tỷ lệ chết ở mỗi nghiệm thức thí nghiệm. Thu cá vừa mới chết hoặc sắp chết để

phân lập lại vi khuẩn ở gan, thận, vết loét và đối chiếu với vi khuẩn tiêm vào.

Độc lực của mỗi chủng vi khuẩn đƣợc đánh giá qua liều gây chết 50 % (Lethal

dose - LD50) đƣợc tính theo phƣơng pháp của Reed và Muench (1938) [164] bằng

công thức:

50 - a [ LgA + ( x Lg X) ] LgLD50 = b-a

Trong đó:

a: Tỷ lệ chết tích lũy cao nhất dƣới 50 %

b: Tỷ lệ chết tích lũy thấp nhất trên 50 %

A: Nồng độ vi khuẩn gây tỷ lệ chết tích lũy a

X: Hệ số pha loãng (Bậc 10)

2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc

hiệu ở cá mú chấm cam

2.3.2.1. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí 4 nghiệm thức ứng với các nồng độ β-glucan nhƣ sau:

 Nghiệm thức 1: Thức ăn không bổ sung β-glucan (ĐC)

 Nghiệm thức 2: Thức ăn bổ sung β-glucan, nồng độ 500 ppm (G500)

 Nghiệm thức 3: Thức ăn bổ sung β-glucan, nồng độ 1.000 ppm (G1000)

 Nghiệm thức 4: Thức ăn bổ sung β-glucan, nồng độ 2.000 ppm (G2000)

Thí nghiệm lặp lại 2 lần

2.3.2.2. Chuẩn bị thức ăn có bổ sung β-glucan

Thức ăn viên (M503, Uni-president Việt Nam) đƣợc dùng cho thí nghiệm này. Trƣớc mỗi bữa ăn, β-glucan (Macrogard®- Biorigin, Na Uy) đƣợc trộn vào thức ăn

với nồng độ tƣơng ứng với các nghiệm thức thí nghiệm, sau đó bao các viên thức ăn

có β-glucan bằng dầu mực.

2.3.2.3. Cá và điều kiện nuôi dƣỡng trong thí nghiệm

Cá mú chấm cam E. coioides sau khi thuần dƣỡng 2 tháng, 240 cá thể khỏe

mạnh có khối lƣợng và chiều dài thân trung bình lần lƣợt là 186,8 ± 3,9 g và 22,5 ±

0,2 cm đƣợc chọn sử dụng cho thí nghiệm. Cá đƣợc chia đều vào 8 bể composit với

thể tích 500 lít/bể chứa nƣớc biển đã qua lọc cơ học và xử lý bằng tia UV. Thí

nghiệm trong điều kiện nuôi nƣớc chảy vận tốc 2 lít/phút, sục khí liên tục, nhiệt độ dao động từ 28 - 29 oC, độ mặn từ 33 - 34 ‰. Mật độ thí nghiệm 30 con/bể.

Cá thí nghiệm đƣợc cho ăn mỗi ngày một lần với khẩu phần là 2 % khối lƣợng

thân. Thức ăn có trộn β-glucan chỉ sử dụng cho cá thí nghiệm trong thời gian 2 tuần

đầu, sau đó cá tiếp tục đƣợc cho ăn bằng thức ăn viên bình thƣờng.

a. b.

Hình 2.2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thí nghiệm (b)

2.3.2.4. Thu mẫu cá và xử lý mẫu

Ở ngày thứ 1 và ngày thứ 15 kể từ khi chấm dứt dùng loại thức ăn có trộn β-

glucan, 3 con cá ở mỗi bể thí nghiệm (6 con/nghiệm thức) đƣợc thu ngẫu nhiên để

phân tích các thông số miễn dịch.

Ở mỗi con cá, mẫu máu đƣợc thu từ tĩnh mạch cuống đuôi, phết một lớp mỏng

trên 3 lam kính sạch đã tiệt trùng, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng và sử dụng cho

việc xác định công thức bạch cầu máu.

Đồng thời, các mẫu cá đƣợc giải phẫu, thu tiền thận để phân lập tế bào bạch

cầu sử dụng cho khảo sát các thông số miễn dịch không đặc hiệu.

2.3.2.5. Xác định công thức bạch cầu trong máu

Các mẫu máu sau khi phết mỏng trên lam, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.

Các lam tiêu bản đƣợc nhuộm bằng bộ kit Diff Quick (Lucerna Chem) với các bƣớc

thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

Quan sát lam tiêu bản bằng kính hiển vi (OLYMPUS CX31) với độ phóng đại

1000X sử dụng vật kính dầu. Mỗi lam tiêu bản, đếm các loại tế bào bạch cầu trên 15

thị trƣờng kính dịch chuyển theo đƣờng zic zac theo phƣơng pháp của Selvaraj et

al. (2006) [177].

Phân loại bạch cầu máu cá theo chỉ dẫn của Ainsworth (1992) [18]. Tỷ lệ bạch

cầu tổng số đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa tổng số các loại bạch cầu đếm đƣợc so với

tổng số tế bào máu đếm đƣợc trên 15 thị trƣờng kính (> 100 tế bào). Tỷ lệ mỗi loại

bạch cầu đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa số bạch cầu mỗi loại đếm đƣợc so với tổng số

bạch cầu đếm đƣợc.

2.3.2.6. Phân lập, nuôi cấy và khảo sát hoạt tính thực bào và hoạt tính hô hấp

của bạch cầu tiền thận

a) Phân lập bạch cầu

Tế bào bạch cầu từ mô thận cá mú thí nghiệm đƣợc phân lập dựa theo phƣơng

pháp tách tế bào trên phân lớp gradient percoll của Yeh et al. (2008) [212]. Các

bƣớc thực hiện đƣợc tóm lƣợc nhƣ sau:

Mẫu mô thận đƣợc nghiền qua màng lọc 100 µm trong L-15 (Leibovit’s

Lonza). Cho 2 mL dịch tế bào lên lớp trên của ống gradient percoll (Sigma) tỷ trọng 1,045/1,064 g/cm3, ly tâm ở 1.310 vòng/phút ở 4 oC trong 30 phút (1236R,

Scanspeed, Denmark). Thu tế bào bạch cầu tập trung ở xung quanh vạch phân cách

giữa 2 lớp percoll.

Kiểm tra chất lƣợng tế bào phân lập bằng cách ly tâm chuyển tế bào lên lam

tiêu bản với tốc độ 1000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng trên máy ly tâm tế

bào (Cytospin Thermoscientic, Anh) và quan sát lam tiêu bản trên kính hiển vi với

độ phóng đại 1000 lần. Đếm số lƣợng tế bào bạch cầu bằng buồng đếm hồng cầu

(Neubauer- Hirschmann). Nuôi cấy tế bào sử dụng cho khảo sát chỉ số thực bào.

a. c. d.

Hình 2.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu (a. Ống gradient

percoll; b. Dụng cụ làm tiêu bản; c. Máy ly tâm tế bào; d. Tế bào bạch cầu trên lam

tiêu bản sau khi nhuộm Diff-quick)

b. Khảo sát hoạt tính thực bào của bạch cầu (Phagocytic activity assay- PA)

Hoạt tính thực bào của tế bào BC mô thận cá mú đƣợc xác định dựa trên thí

nghiệm khảo sát khả năng bắt nuốt các hạt nhuộm huỳnh quang (Hạt bead -

Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres, 1µm) theo phƣơng pháp của Yeh et al.

(2008) [212].

Tế bào BC phân lập từ tiền thận đƣợc nuôi cấy qua đêm ở 30 oC trong môi

trƣờng L-15. Rửa và thu những tế bào bạch cầu còn sống. Định lƣợng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu và pha loãng trong môi trƣờng L-15 để đạt mật độ 1 x 107 tế

bào/mL.

Cho 500 µl mẫu BC pha loãng vào các giếng của đĩa 24 giếng (Nunc) chứa lamen tròn đã tiệt trùng, ủ ở 30 oC trong 2 giờ. Hút bỏ hết phần dịch nổi chứa các tế

bào chƣa bám. Tiếp tục, cho 5107 hạt bead vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ ở 30 oC

trong tối để các tế bào tiến hành thực bào. Cố định tế bào bằng methanol (Merck)

trong 5 phút và nhuộm các lamen tiêu bản bằng dung dịch Diff Quick (Lucerna

Chem). Gắn lamen tròn lên các lam kính bằng keo dán (Mount Quick, Electron

Microscopy Sciences). Quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus BX41,

Nhật) ở độ phóng đại 1000 lần.

Chỉ số thực bào (PA %) của BC xác định bằng tỷ số giữa tổng tế bào BC tham

gia thực bào trên 100 tế bào quan sát, đồng thời phân loại cƣờng độ thực bào (số tế

5 µm

c .

bào bắt đƣợc 1 hạt, 2 hạt hoặc ≥ 3 hạt) trên tổng số tế bào quan sát.

Hình 2.4: Các bƣớc khảo sát hoạt tính thực bào (a: Ống gradient percoll; b:

Nuôi cấy tế bào và cảm nhiễm hạt bead; c: Nhuộm tiêu bản; d: Hiện tượng thực

bào của bạch cầu)

c. Khảo sát hoạt tính bùng nổ hô hấp của bạch cầu (Respiratory burst assay-RBA)

Hoạt tính bùng nổ hô hấp (Respiratory burst - RB) của tế bào BC tiền thận

đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Cheng et al. (2007) [38] với các bƣớc thực

hiện nhƣ sau:

Cho 100 µl tế bào BC (1 x 106 tế bào/mL) vào các giếng (Đĩa 96 giếng, Nunc MaxiSorpTM), ủ trong 2 giờ ở 30 oC. Tiếp theo, tế bào lần lƣợt đƣợc ủ với 100 µl

dung dịch Zymosan (Sigma) và 100 µl NBT 0,3 % (Nitroblue tetrazolium, Sigma)

trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ngừng phản ứng bằng 100 µl methanol. Cho tiếp

vào mỗi giếng 120 µl dung dịch KOH 2M và 140 µl DMSO (dimethyl sulphoxide,

Sigma) để tạo phản ứng màu.

Hoạt tính RB của tế bào BC thể hiện qua mức độ màu tạo thành từ phản ứng khử Nitroblue tetrazolium đƣợc xác định trên máy đo quang phổ (iMarkTM, Bio-rad)

ở bƣớc sóng 630 nm. Mỗi mẫu thực hiện lặp lại 3 lần trên cùng một đĩa trong cùng

điều kiện.

2.3.2.7. Khảo sát khả năng kháng bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus của cá

mú chấm cam sau khi ăn β-glucan.

Để xác định khả năng kháng bệnh đối với vi khuẩn, cá thí nghiệm đƣợc gây

nhiễm thực nghiệm ở 2 thời điểm: Ngày thứ 1 và ngày thứ 15 sau khi ngừng cho ăn

β-glucan.

Ở mỗi thời điểm, 12 con cá/bể thí nghiệm đƣợc chọn ngẫu nhiên để công cƣờng độc bằng huyền dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 mật độ 1,07 x 105

cfu/g cá. Theo dõi ghi nhận các triệu chứng phát bệnh và số cá chết sau khi gây

nhiễm.

2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam

2.3.3.1. Thu huyết thanh

Thu huyết thanh cá mú chấm cam theo phƣơng pháp của Aakre et al (1994)

[16]. Các bƣớc thực hiện gồm: Lấy máu tại tĩnh mạch cuống đuôi của cá mú khỏe, giữ mẫu máu ở 4 oC trong 2 giờ trƣớc khi ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4 oC để tách phần dịch huyết thanh ở phía trên ống nghiệm. Huyết thanh đƣợc giữ ở -70 oC cho

các nghiên cứu tiếp theo.

2.3.3.2. Tinh sạch kháng thể IgM từ huyết thanh cá mú chấm cam

Tinh sạch kháng thể IgM cá mú chấm cam thực hiện trên hệ thống sắc ký

FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden) đƣợc mô tả bởi Havarstein et al. (1988) [87].

Các bƣớc thực hiện nhƣ sau: lọc huyết thanh cá mú qua màng lọc 0,22 mm. Bơm 1

mL huyết thanh vào cột lọc Superose 6 (HR 16/50) đã đƣợc cân bằng với đệm A

(Bis-Tris 50 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,4) với tốc độ bơm 0,1 mL/phút ở nhiệt độ

phòng. Thu phân tử kháng thể IgM ở những phân đoạn có hoạt tính. Tiếp tục tinh

sạch bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion trên cột Mono Q với tốc độ 0,5 mL/phút.

Rửa giải hấp để thu IgM theo gradient nồng độ NaCl từ 0 - 0,7 M trong 15 mL đệm A. Lƣu giữ dung dịch IgM cá mú thu đƣợc ở -70 oC.

2.3.3.3. Phân tích thành phần protein của phân tử IgM

Phân tử kháng thể IgM cá mú đƣợc phân tích thành phần protein bằng kỹ thuật

sắc ký bản thạch SDS-PAGE theo phƣơng pháp của Tsang và ctv (1983) [201].

Mẫu IgM sau khi sốc nhiệt ở 95 oC trong 5 phút đƣợc cho vào các giếng bản

thạch Polyacrylamide với các thể tích 5 µl/ giếng và 10 µl/ giếng. Các bƣớc tiếp

theo thực hiện tƣơng tự nhƣ phân tích protein của vi khuẩn ở mục 2.3.1.2, trang 43.

2.3.3.4. Tạo huyết thanh thỏ kháng IgM của cá mú chấm cam

Tạo huyết thanh thỏ kháng IgM của cá mú bằng cách gây miễn dịch cho thỏ

qua 3 lần tiêm dƣới da với liều 0,2 mg IgM cá mú pha loãng trong PBS và chất bổ

trợ theo tỷ lệ 1:1. Mỗi lần tiêm cách nhau 4 tuần. Trong đó, liều thứ nhất pha trộn

với chất bổ trợ toàn phần FCA (Freund’s complete Adjuvant, Difco) và 2 liều tiếp

theo pha với chất bổ trợ bán phần FIA (Freund’s Incomplete Adjuvant, Difco). Hai tuần sau lần tiêm cuối cùng, tiến hành thu kháng huyết thanh thỏ và lƣu giữ ở -70 oC.

2.3.3.5. Phân tích liên kết đặc hiệu giữa IgM của cá mú chấm cam với huyết

thanh thỏ

Phân tích liên kết đặc hiệu của IgM cá mú với kháng huyết thanh thỏ bằng kỹ

thuật Western Blot theo phƣơng pháp của Towbin et al. (1979) [200]. Các bƣớc

thực hiện nhƣ sau:

Thành phần protein của IgM cá mú sau khi tách bằng kỹ thuật SDS-PAGE đã

mô tả nhƣ trên, đƣợc chuyển qua màng Nitrocellulose (Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 µm, Bio-rad - NC) ở 100 V trong 2 giờ ở 4 oC. Sau đó, cố định

màng NC 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong hỗn hợp TBS (NaCl 150 mM, Tris base 20

mM, pH 7,4) và 5 % sữa tách béo (Skim milk, Merck - SM). Ủ trong huyết thanh

thỏ kháng IgM cá mú với tỷ lệ pha loãng 1:500/TBS trong 2 giờ. Tiếp tục ủ với

huyết thanh dê kháng IgG thỏ có gắn enzyme HRP (Goat anti rabbit IgG (H+L)-

HRP conjugate, Bio-rad) (tỷ lệ pha loãng 1:3000/TBS) trong 1 giờ ở nhiệt độ

phòng. Giữa các bƣớc đều rửa màng NC 3 lần trong TTBS (TBS + 0,05 % Tween

20). Ngâm màng NC trong cơ chất (HRP conjugate substrate kit, Bio-rad), các vạch

phản ứng giữa kháng thể thỏ và IgM cá mú hiện rõ sau 30 phút.

2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus

2.3.4.1. Chuẩn bị kháng nguyên

a. Nuôi cấy và bất hoạt chủng vi khuẩn

Sau khi nuôi tăng sinh trong môi trƣờng TSB bổ sung 2 % NaCl, ở nhiệt độ 33 oC trong 18 - 24 giờ, các chủng vi khuẩn đƣợc bất hoạt bằng formalin với nồng độ 0,5 % (v/v) trong 24 giờ ở 4 oC [98].

Kiểm tra hiệu quả của việc bất hoạt bằng cách nuôi cấy huyền dịch vi khuẩn bất

hoạt trên môi trƣờng TCBS trong 24 giờ. Vi khuẩn bị bất hoạt hoàn toàn (không mọc

trên TCBS) đƣợc sử dụng làm nguyên liệu pha chế kháng nguyên. Một phần vi khuẩn

bất hoạt đƣợc đông khô sử dụng cho phƣơng pháp định lƣợng kháng thể.

b. Pha chế kháng nguyên gây miễn dịch cho cá

Pha chế kháng nguyên thực hiện theo phƣơng pháp của Li et al.(2005) [123].

Các bƣớc thực hiện gồm: Huyền dịch vi khuẩn bất hoạt đƣợc ly tâm ở 6.000 vòng/phút ở 4 oC trong 10 phút. Rửa 3 lần trong PBS để loại bỏ hoàn toàn formalin. Pha loãng vi khuẩn kết lắng sau khi ly tâm trong PBS để đạt mật độ 1x109 tế

bào/mL (Mật độ vi khuẩn cần pha đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn tƣơng quan

giữa mật độ quang OD và mật độ vi khuẩn- phụ lục 3).

Đối với kháng nguyên kết hợp chất bổ trợ, hòa huyền dịch khuẩn trong chất bổ

trợ FIA với tỷ lệ 1:1 (v/v) để tạo kháng nguyên với nồng độ nhƣ trên.

2.3.4.2. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể của cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus không sử dụng chất bổ trợ FIA

a. Bố trí thí nghiệm

Bốn chủng vi khuẩn thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 5 nghiệm thức:

+ Nghiệm thức 1: Cá đƣợc gây miễn dịch bằng chủng A bất hoạt formalin

+ Nghiệm thức 2: Cá đƣợc gây miễn dịch bằng chủng V1 bất hoạt formalin

+ Nghiệm thức 3: Cá đƣợc gây miễn dịch bằng chủng V2 bất hoạt formalin

+ Nghiệm thức 4: Cá đƣợc gây miễn dịch bằng chủng V3 bất hoạt formalin

+ Nghiệm thức đối chứng: cá đƣợc tiêm PBS.

Thí nghiệm lặp lại 2 lần.

b. Cá và điều kiện thí nghiệm

Cá mú chấm cam sau khi thuần dƣỡng 2 tuần, 200 cá thể khỏe mạnh có khối

lƣợng và chiều dài trung bình lần lƣợt là 45,6 ± 8,8 g và 13,2 ± 1,2 cm đƣợc chọn sử

dụng cho thí nghiệm. Cá đƣợc chia vào 10 bể composit với thể tích 500 lít/bể chứa

nƣớc biển đã qua lọc cơ học và xử lý bằng tia UV. Thí nghiệm trong điều kiện nuôi nƣớc chảy vận tốc 2 lít/phút, sục khí liên tục, nhiệt độ dao động từ 28 - 29 oC, độ

mặn từ 33 - 34 ‰. Mật độ thí nghiệm 20 con/bể.

c. Cách gây miễn dịch

Trƣớc khi gây miễn dịch, cá không đƣợc cho ăn trong 24 giờ. Gây mê cá thí

nghiệm bằng Ethyleneglycol Monophenylether với nồng độ 100 ppm trong nƣớc

biển. Cá đƣợc gây miễn dịch bằng cách tiêm xoang bụng 0,1 mL kháng nguyên/cá

thể, đối với nhóm đối chứng tiêm 0,1 mL PBS/cá thể.

d. Theo dõi, chăm sóc

Cá thí nghiệm đƣợc cho ăn mỗi ngày một lần bằng thức ăn viên (M503, Uni-

President) với khẩu phần 2 % khối lƣợng thân. Hàng ngày, theo dõi các yếu tố môi

trƣờng và tình trạng sức khỏe cá.

e. Thu mẫu

Sau khi gây miễn dịch 30, 45 và 60 ngày, tiến hành thu mẫu huyết thanh để

phân tích kháng thể. Tại mỗi thời điểm, thu ngẫu nhiên 5 con/bể, lấy máu tại tĩnh

mạch đuôi để tách huyết thanh sử dụng cho định lƣợng kháng thể.

Số cá lấy mẫu không cho lại vào bể thí nghiệm.

f. Định lượng kháng thể trong huyết thanh cá thí nghiệm

Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh cá thí nghiệm đƣợc xác định bằng

phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzyme gián tiếp (indirect Enzyme Linked

Immunosorbent Assay- i-ELISA) đƣợc mô tả bởi Jakobsen (1999) [98]. Phƣơng

pháp này dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tạo thành

phức hợp miễn dịch. Kháng thể trong phức hợp miễn dịch này sẽ đƣợc kết hợp với

một kháng thể thứ cấp có gắn enzyme và đƣợc phát hiện thông qua phản ứng tạo

phức màu do tác dụng của enzyme này lên cơ chất tƣơng ứng.

Hiệu giá kháng thể cần đo phụ thuộc vào độ đậm nhạt của phức màu và đƣợc

định lƣợng bằng mức độ hấp phụ ánh sáng khi sử dụng máy đo mật độ quang học.

Qui trình phân tích nhƣ sau:

Vi khuẩn đã bất hoạt đƣợc lƣu giữ dƣới dạng đông khô đƣợc hòa loãng trong

PBS (pH 7,3) tƣơng ứng với nồng độ 10 µg/mL. Cho 150 µl dịch khuẩn/giếng (Đĩa 96 giếng, Nunc MaxiSorpTM), ủ qua đêm ở 4 oC, mỗi chủng vi khuẩn thực hiện trên

đĩa riêng. Sau khi cố định 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong PBS-T (PBS + 0,05 %

Tween 20) và 3 % sữa tách béo (Skim milk), tiếp tục ủ trong 100 µl kháng huyết

thanh cá mú (Pha loãng 1:200 trong PBS-T) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Mỗi

giếng thêm 50 µl huyết thanh thỏ kháng IgM cá mú ( Pha loãng 1:3000 trong PBS-

T) trong 2 giờ. Sau đó, thêm 50 µl/giếng huyết thanh dê kháng IgG thỏ có gắn

enzyme HRP (Goat anti-rabbit IgG conjugated with HRP- Biorad, pha loãng 1:2000

trong PBS-T) trong 1 giờ. Thêm 50 µl/giếng cơ chất Peroxidase gồm 0-

Phenylenediamine (Sigma) pha trong dung dịch đệm Phosphate citrate. Sau 10 phút,

kết thúc phản ứng bằng 50 µl dung dịch H2SO4 2.0 M. Đo mật độ quang của các

giếng bằng máy đo quang phổ (iMark microplate reader - Bio-rad) ở bƣớc sóng 490

nm. Mỗi mẫu huyết thanh đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần trên cùng một đĩa.

2.3.4.4. Đáp ứng tạo kháng thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam

đƣợc gây miễn dịch bằng Vibrio parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin có bổ

sung chất bổ trợ FIA

a. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức nhƣ sau:

+ Nghiệm thức 1 : Gây miễn dịch bằng vi khuẩn bất hoạt có bổ sung FIA (V3F)

+ Nghiệm thức 2 : Gây miễn dịch bằng vi khuẩn bất hoạt không bổ sung FIA (V3)

+ Nghiệm thức 3: Đối chứng tiêm PBS tiệt trùng (PBS-C)

+ Nghiệm thức 4: Đối chứng không tiêm (C).

Thí nghiệm lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.

Phƣơng thức gây miễn dịch, theo dõi, chăm sóc, thu mẫu huyết thanh: Tƣơng

tự thí nghiệm ở mục 2.3.4.2, trang 52.

b. Chuẩn bị kháng nguyên

Chọn chủng vi khuẩn có khả năng kích thích tạo kháng thể cao nhất ở thí

nghiệm trên để gây miễn dịch cho cá.

Chuẩn bị kháng nguyên tƣơng tự nhƣ ở tiểu mục b, mục 2.3.4.1, trang 52.

c. Cá thí nghiệm

Sau khi nuôi thuần dƣỡng 1 tháng, cá thí nghiệm gồm 400 con có khối lƣợng

và chiều dài thân trung bình lần lƣợt là 49,8 ± 12,8 g và 14,7 ± 1,3 cm. Mật độ thí

nghiệm là 50 con/bể. Thí nghiệm bố trí trong hệ thống bể composit thể tích 500 lít

với các điều kiện nuôi tƣơng tự thí nghiệm ở mục 2.3.4.2, trang 53.

d. Gây nhiễm thực nghiệm

Khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam đƣợc đánh giá qua kết quả gây

nhiễm thực nghiệm tại 2 thời điểm: 30 ngày và 60 ngày sau khi gây miễn dịch. Ở

mỗi thời điểm, 10 cá thể/bể đƣợc tiêm vào cơ huyền dịch khuẩn V. parahaemolyticus V3 mật độ 2,5 x 105 cfu/g (sau 30 ngày) và 2,0 x 105 cfu/g ( sau

60 ngày). Hàng ngày, theo dõi quá trình phát bệnh và ghi nhận số cá chết ở các

nghiệm thức trong thời gian gây nhiễm.

e. Đánh giá đáp ứng kháng thể

+ Thu mẫu: Các mẫu huyết thanh của cá thí nghiệm ở các nghiệm thức đƣợc

thu tại thời điểm 30, 45 và 60 ngày sau khi gây miễn dịch đƣợc sử dụng phân tích

tính đặc hiệu và định lƣợng kháng thể.

+ Xác định tính đặc hiệu: Kháng thể đƣợc phát hiện dựa trên kỹ thuật

Western blot theo phƣơng pháp của Towbin et al. (1979) [200]. Các vạch phản ứng

thể hiện sự kết hợp đặc hiệu giữa các thành phần protein mang tính kháng nguyên

của vi khuẩn và kháng thể của cá với sự có mặt của các enzyme và kháng thể trung

gian. Các bƣớc thực hiện phát hiện kháng thể đƣợc tóm lƣợc nhƣ sau:

Thành phần protein của vi khuẩn V. parahaemolyticus sau khi tách bằng kỹ

thuật SDS-PAGE đã mô tả nhƣ ở mục 2.3.1.2 trang 43, đƣợc chuyển qua màng NC (Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 µm, Bio-rad) ở 100 V trong 2 giờ ở 4 oC. Sau

đó, cố định màng NC trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong hỗn hợp TBS (150 mM

NaCl, 20 mM Tris base, pH 7,4) và 5 % sữa tách béo trƣớc khi ủ trong các mẫu huyết thanh cá mú với tỷ lệ pha loãng 1:50 trong TBS ở 33 oC trong 2 giờ. Các

bƣớc thực hiện tiếp theo tƣơng tự nhƣ mô tả ở mục 2.3.3.5 trang 51.

+ Định lƣợng kháng thể: Kháng thể trong huyết thanh cá mú đƣợc định

lƣợng theo phƣơng pháp ELISA gián tiếp đã mô tả bởi Jakobsen (1999) [98]. Các

bƣớc thực hiện phân tích kháng thể tƣơng tự nhƣ đã mô tả ở mục 2.3.4.2, tiểu mục

f, trang 54.

+ Đánh giá hệ số bảo hộ RPS (Relative percent survival) của kháng nguyên

đối với cá theo phƣơng pháp của Ellis (1988) [60].

)

( 1 

* 100

Tỷ lệ chết ở nhóm gây miễn dịch (%) RPS (%) = Tỷ lệ chết ở nhóm đối chứng (%)

2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê trên phần mềm SPSS version 15.0. Các

giá trị trung bình của các đại lƣợng (khối lƣợng, chiều dài thân cá, tỷ lệ các loại tế

bào bạch cầu trong máu, tỷ lệ tế bào tham gia thực bào, giá trị OD trên các phép đo

mật độ quang, tỷ lệ nhiễm bệnh…) giữa các nghiệm thức đƣợc so sánh theo phƣơng

pháp phân tích phƣơng sai một yếu tố (one-way ANOVA) và Chi- test. So sánh sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhiều giá trị trung bình của các biến bằng phân

tích Post Hoc test theo phép kiểm định Tukey HSD ở độ tin cậy 95 %.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam

3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa

Trong thời gian từ tháng 3 – 7 năm 2008, 24 mẫu cá mú chấm cam E. coioides

bị bệnh xuất huyết lở loét đƣợc thu từ các vùng nuôi cá mú thƣơng phẩm tại Khánh

Hòa. Trong đó, 16 cá thể đƣợc thu từ các lồng nuôi trên biển ở Vũng Ngán, Nha

Trang và 8 cá thể từ các ao nuôi thƣơng phẩm tại Cam Ranh. Các mẫu cá bệnh thu

đƣợc có khối lƣợng thân từ 16 – 1.250 g và chiều dài thân từ 11,5 – 41,0 cm.

Đặc điểm bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban

đầu là cá thƣờng bơi gần mặt nƣớc hoặc bơi sát vào lƣới, da cá sẫm màu, xuất hiện

các đốm đỏ trên thân. Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra xung quanh,

kèm theo biểu hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi. Giải phẫu nội quan

thƣờng thấy gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích dịch trong xoang bụng ở một

số trƣờng hợp bệnh nặng.

5 cm

a.

b. Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh

Hòa (a: Biểu hiện bên trong, b: Biểu hiện bên ngoài)

Trong 24 mẫu cá bệnh thu đƣợc, các dấu hiệu bệnh lý xuất hiện với tỷ lệ khác

nhau tùy thuộc vào tình trạng nhiễm bệnh. Trong đó, 100 % mẫu có triệu chứng

xuất huyết vây, miệng; 75 % mẫu có nhiều vết loét trên thân; 62,5 % mẫu có gan

nhợt nhạt; 58,3 % mẫu có thận bầm, nhão; và 33,3 % mẫu có tích dịch vàng trong

xoang bụng.

Từ các mẫu cá nhiễm bệnh đã phân lập đƣợc 16 chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus với tần số bắt gặp 66,7 %. Trong đó, 8 chủng đƣợc phân lập từ

thận, 4 chủng từ gan và 4 chủng từ phần cơ tại vết loét.

Các chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đã đƣợc kiểm tra nhanh độc lực bằng cách tiêm 0,2 mL dịch khuẩn (108 cfu/mL) cho cá khỏe và quan sát cá thí nghiệm

trong 5 ngày. Kết quả sàng lọc đã chọn đƣợc 4 chủng có gây triệu chứng sƣng đỏ,

loét tại vết tiêm và gây chết cá thí nghiệm với biểu hiện lở loét tƣơng tự nhƣ cá

nhiễm bệnh ngoài tự nhiên. Tuy nhiên, liều gây chết 50 % (LD50) của 4 chủng này

có sự khác nhau qua thí nghiệm xác định độc lực. Trong đó, chủng có độc tính cao nhất là C07K đƣợc phân lập từ thận có giá trị LD50 thấp nhất là 2,14 x 103 cfu/g.

Chủng này đƣợc ký hiệu là V3, và đƣợc sử dụng để so sánh với các chủng V.

parahaemolyticus phân lập từ cá mú nhiễm bệnh ở miền Bắc Việt Nam (Viện

Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I cung cấp, ký hiệu là chủng V1), ở miền Nam

(Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II cung cấp, ký hiệu chủng V2) và chủng

chuẩn do ATCC cung cấp (Chủng A). Các kết quả thu mẫu, phân lập và sàng lọc vi

khuẩn trình bày chi tiết ở phụ lục 1.

Từ kết quả này có thể thấy vi khuẩn V. parahaemolyticus chiếm tỷ lệ bắt gặp

khá lớn trong các trƣờng hợp cá mú chấm cam bị bệnh xuất huyết lở loét nuôi

thƣơng phẩm tại Khánh Hòa. Ngoài ra, kết quả cảm nhiễm cũng đã chứng tỏ vi

khuẩn này là tác nhân gây ra bệnh xuất huyết lở loét cho cá mú chấm cam trong

điều kiện nhân tạo.

Kết luận này cũng tƣơng tự với kết quả nghiên cứu bệnh ở cá mú nuôi tại

Khánh Hòa mà tác giả thu đƣợc trong quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ năm

2005. Kết quả điều tra tình hình bệnh cá mú tại thời gian này cho thấy có tới 77,8 %

số hộ nuôi cá mú trong ao đất ở Cam Ranh và 83,3 % số hộ nuôi cá mú lồng bè ở

Nha Trang đã chịu thiệt hại do bệnh xuất huyết lở loét với tỷ lệ cá nhiễm bệnh từ 20

– 30 % đàn cá /ao (lồng)/vụ và đã xác định V. parahaemolyticus là một trong những

tác nhân gây bệnh có tần số bắt gặp khá lớn với 56 % [148].

Gần đây, Đỗ Thị Hòa và ctv (2008) cũng thông báo rằng bệnh Vibriosis xảy ra

100 % ở cá biển nuôi lồng và 58,3 % ở cá nuôi ao, trong đó trên cá mú nuôi, bệnh

này chiếm 40/65 ( 61,5 %) số hộ đƣợc điều tra tại Khánh Hòa [5].

Hầu hết các nghiên cứu bệnh thƣờng gặp trên cá mú nuôi tại các vùng nuôi

khác nhau ở Việt Nam cũng đều khẳng định Vibriosis là bệnh thƣờng gặp và chiếm

tỷ lệ cao nhất ở cá nuôi. Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện kịp thời có khả

năng gây chết rất cao. Bệnh thƣờng xuất hiện vào mùa nóng và đầu mùa mƣa, khi

môi trƣờng thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc. Hơn nữa, vi khuẩn tổng số trong

nƣớc có xu hƣớng tăng khi nhiệt độ tăng. Đây là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm

nhập gây bệnh và đặc biệt gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi [9], [14],

[15].

Mặc dù nhận thức rõ về tác hại do V. parahaemolyticus nói riêng và bệnh do vi

khuẩn Vibrio gây ra cho nghề nuôi cá biển, nhƣng các nghiên cứu sâu hơn về đặc

điểm vi khuẩn gây bệnh cũng nhƣ khả năng sinh đáp ứng miễn dịch ở ký chủ đối với

chúng vẫn chƣa đƣợc quan tâm đúng mức. Vì vậy, các nghiên cứu về đặc điểm sinh

hóa, độc tính, thành phần protein nhằm cung cấp những hiểu biết cơ bản về tác nhân

gây bệnh đã trở nên rất cần thiết và có ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng nghiên cứu

phát triển vaccine phòng bệnh Vibriosis trên cá mú trong tƣơng lai.

3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

3.1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý

Bốn chủng vi khuẩn đƣa vào nghiên cứu (V1, V2, V3 và A) đều thể hiện các

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa khá giống nhau: vi khuẩn Gram âm, hình que

ngắn, có khả năng di động, tạo khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng TCBS do

không có khả năng phân giải đƣờng sucrose và đều có khả năng chịu mặn cao đến 8

% trong môi trƣờng TSB (Bảng 3.1).

Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy cả bốn chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đều

có khả năng oxy hoá và lên men trong môi trƣờng O/F glucose, không sinh H2S và

dƣơng tính với các phản ứng oxidase, catalase, lysine decarboxylase, ornithine

decarboxylase, gelatinase, indole, nhạy với Vibriostat O/129 (150 µg). Ngoài ra,

hầu hết các chủng đều có khả năng phân giải protein, lipid và một số loại đƣờng bởi

sự có mặt của các enzyme đặc trƣng có liên quan chặt chẽ đến khả năng gây bệnh

của chúng trên vật chủ.

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus

Đặc điểm V1 V2 V3 A

Các đặc điểm hình thái, sinh lý Hình dạng tế bào Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn

Gram Di động - + - + - + - +

Hoạt tính hemolysin +/α +/β +/α V/α

Màu sắc khuẩn lạc trên TCBS Xanh Xanh Xanh Xanh

Khả năng chịu mặn (% NaCl):

- - - - 0

+ + + + 3

+ + + + 6

+ V + + 8

- - - - 10

+ + + + Các đặc điểm sinh hóa Cytochrom-Oxidase

+ + + + Catalase

+ + + + O/129 (150 μg)

+/+ +/+ +/+ +/+ O/F Glucose

- - - - β-galactosidase (ONPG test)

- + + + - - - - + + V - - - - + + V - - - - + V + - - - Arginine dihydrolase Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Citrate H2S Urease Tryptophan deaminase

+ + + + Indole

Voges Proskauer - - - -

Gelatinase + + + +

Glucose Mannitol + + + + + + + +

Inositol - - - -

Sorbitol - - - -

Rhamnose Sucrose - - - - - - - -

Melibiose - - - -

Amygdalin + V V V

- + - + - + - +

Arabinose Khử NO2 Phosphatase alcaline + + + +

Esterase (C4) + + + +

Esterase lipase (C8) + + + +

Lipase (C14) - - - -

Leucine arylamidase + + + +

Valine arylamidase - - - -

Cystine arylamidase - - - -

Trypsin + + + +

Chymotrypsin + + + -

Phosphatase acid + + + +

- - - Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase -

- - - - α-galactosidase

- - - - β-galactosidase

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - β-glucuronidase α-glucosidase β-glucosidase β-N-acetyl-glucosaminidase α-mannosidase α-fucosidase

Ghi chú: + ( ≥ 90 % dương tính), - ( ≥ 90 % âm tính), V ( variable, không ổn định giữa các lần thử)

Ngoài ra, kết quả kiểm tra hoạt tính hemolysin của 4 chủng vi khuẩn nghiên

cứu cho thấy chúng đều có khả năng dung huyết máu thỏ trên môi trƣờng thạch.

Trong đó, chủng V3 cho kiểu dung huyết β trong khi 3 chủng còn lại có kiểu dung

huyết α (Hình 3.2).

Dung huyết kiểu α Dung huyết kiểu β

Hình 3.2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch máu

Từ kết quả trên có thể thấy rằng, ngoài một vài điểm khác biệt nhƣ khả năng

chịu mặn, phân giải đƣờng Amygdalin, Citrate và Ornithine decarboxylase, các

chủng V1, V2, V3 đều có hầu hết đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý khá tƣơng

đồng với chủng chuẩn ATCC 17802 và đƣợc định danh là vi khuẩn V.

parahaemolyticus theo khóa phân loại của Bergey.

Bên cạnh kết quả định danh dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh hóa truyền

thống, phƣơng pháp định danh bằng sinh học phân tử đối với chủng V3 dựa trên phân

tích trình tự gen 16S rDNA và so sánh với trình tự chủng chuẩn A và các chủng V.

parahaemolyticus trên Genbank đã thể hiện mức độ tƣơng đồng đến 99 % (Trình tự

khác biệt đƣợc trình bày chi tiết ở phụ lục 2). Phản ứng PCR cho kết quả một băng đậm

nét ở 550 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.3).

550 bp

500 bp

100 bp

1 2 3 4 M

Hình 3.3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus (M: DNA marker 100 bp, cột 1, 2: chủng V3; cột

3, 4: chủng A)

Ngoài ra, cây phát sinh loài (Hình 3.4) cho thấy chủng V. parahaemolitycus V3

có mối quan hệ gần gũi với chủng chuẩn A và chủng V. parahaemolyticus ES05

(Genbank)

Hình 3.4: Cây phát sinh loài các chủng vi khuẩn Vibrio (V. parahaemolyticus

V3: chủng V3; V. parahaemolyticus A: chủng A; các chủng V. campbelli, V. harveyi,

Vibrio sp., Vibrio sp. My, V. parahaemolyticus ES05 là các chủng tham khảo từ

Genbank).

Nhƣ vậy, dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và di truyền có

thể khẳng định chủng V3 phân lập từ cá mú chấm cam E. coioides bị bệnh lở loét

nuôi tại Khánh Hòa là V. parahaemolyticus. Vì vậy, chủng này đƣợc sử dụng làm

kháng nguyên trong nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với vi

khuẩn V. parahaemolyticus tại nghiên cứu này cùng với các chủng V1, V2 và A.

Vi khuẩn Vibrio có mặt khắp nơi trong môi trƣờng nƣớc mặn và là một phần

của hệ vi sinh vật nƣớc. Vi khuẩn Vibrio đầu tiên đƣợc báo cáo là tác nhân gây bệnh

trên cá biển vào năm 1909 ở vùng biển Baltic với dấu hiệu đặc trƣng là các vết loét

trên bề mặt cơ thể, đôi khi kèm theo hiện tƣợng xuất huyết trong cơ và nội quan của

cá bệnh [153]. Ngày nay, nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Vibrio gây bệnh xuất

huyết nhiễm trùng máu ở nhiều loài cá biển nuôi có giá trị kinh tế phân bố cả ở

vùng biển ấm và lạnh nhƣ cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá

hồi vân (Oncorhynchus spp.), cá tráp (Sparus auratus), cá chẽm Châu Âu

(Dicentrarchus labrax), cá bơn (Scophthalmus maximus)...Tác nhân gây bệnh ở cá

biển thuộc giống Vibrio thƣờng là các loài sau: V. parahaemolyticus, V.

alginolyticus, V. vulnificus, V. carchariae… Dấu hiệu đặc trƣng bên ngoài của bệnh

Vibriosis bao gồm xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn; hoại tử phần cơ tại các vết

loét; vây mòn cụt, mắt lồi và đục. Giải phẫu nội quan cá bệnh nặng cho thấy gan,

thận thƣờng bị xuất huyết, phù nề [26], [81], [132], [199].

Ở họ cá mú Epinephelus, vi khuẩn Vibrio thƣờng gây bệnh trên các loài cá

mú chấm xanh (Plectropomus leopardus), mú đen (Epinephelus malabaricus), mú

chấm cam (E. coioides) và mú mè (E. bleekeri) đã gây thiệt hại kinh tế cho nghề

nuôi cá mú ở nhiều nƣớc nhƣ Malaysia, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc,

Indonesia, Philippines, Thái Lan… [82].

Vi khuẩn V. parahaemolyticus đã đƣợc thông báo gây bệnh ở nhiều loài cá mú

nuôi ở Thái Lan [45], [55]; Trung Quốc [126]; Malaysia [144]; Việt Nam [5], [8],

[14], [148]…Khả năng gây bệnh của vi khuẩn này đối với vật chủ liên quan đến khả

năng dung huyết đƣợc quy định bởi các protein độc tố và khả năng phân giải

protein, lipid và các loại đƣờng bởi sự có mặt của các enzyme đặc trƣng [217].

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính dung huyết là một trong những yếu tố gây

độc của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ, bao gồm độc tố bền nhiệt

TDH với kiểu dung huyết β [97], [195] và độc tố không bền nhiệt TRH gây hiện

tƣợng dung huyết kèm theo tích dịch [91] và đều có tính kháng nguyên cao [213],

[217].

Một loại độc tố không bền nhiệt khác có ở V. parahaemolyticus là TLH đƣợc

mã hóa bởi gen tlh. Chúng có khả năng dung giải tế bào bởi enzyme phospholipase

A2/lysophospholipase và bắt gặp ở hầu hết các chủng V. parahaemolyticus phân lập

từ động vật thủy sản [213]. Cấu trúc TLH gồm hai phân tử protein chứa 418 và 398

acid amin tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 47,5 và 45,3 kDa [217]. Cho

đến nay, cơ chế gây độc của TLH trên vật chủ vẫn chƣa biết rõ. Tuy nhiên, có vài

nghiên cứu khác đã chỉ ra tính độc của loại hemolysin này là gây dung huyết cá bơn

với 18 đơn vị hoạt tính/µg hay gây chết cá ngựa khi tiêm vào xoang bụng với liều

gây chết 50 % (LD50) là 0,8 µg protein/g cá [101]. Một nghiên cứu mới nhất về

TLH của nhóm Wong et al. (2012) cho thấy yếu tố này có khả năng gây hiện tƣợng

apotosis, hoại tử tế bào hồng cầu cá tráp bạc (Sparus sarba) và cho rằng TLH có

tiềm năng phát triển làm vaccine và sử dụng nhƣ là gen chỉ thị để phát hiện vi khuẩn

Vibrio [210].

Tuy nhiên, để có cơ sở khẳng định sự có mặt của các protein độc tố trên, việc

giải trình tự DNA của vi khuẩn này dựa trên khuyếch đại các đoạn gen tdh, trh, tlh và

nghiên cứu cơ chế gây độc của chúng trên cá nên cần tiếp tục nghiên cứu.

3.1.2.2. Thành phần protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Thành phần protein của các chủng vi khuẩn V1, V2, V3 và A đƣợc phân tích

bằng kỹ thuật SDS-PAGE của Laemmli (1970) [115] đƣợc cải tiến bởi Tsang et al.

(1983) [201] thể hiện qua Hình 3.5:

Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng Vibrio parahaemolyticus

Hình 3.5 cho thấy thành phần protein của 4 chủng V. parahaemolyticus tƣơng

tự nhau. Các protein có khối lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 97,4 kDa đến thấp

hơn 14,4 kDa. Trong đó, các protein chính có khối lƣợng phân tử ƣớc lƣợng lần

lƣợt là 97,4; 66; 55; 47; 38; 31; 28; 21; 19; 16 và vạch thấp hơn 14,4 kDa.

Thành phần protein của vi khuẩn đƣợc tách ra bằng kỹ thuật SDS-PAGE khá

phụ thuộc vào phƣơng pháp thực hiện, chủ yếu là thời gian và các nhiệt độ gây sốc

khác nhau. Khi nghiên cứu xác định tính kháng nguyên và độc tố từ protein ngoại

mạc (OMP- outer membrane protein) của vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng kỹ thuật SDS-PAGE sốc nhiệt ở 37 oC và 42 oC trong 1-2 giờ, Wong và Chen (2003) xác định các protein chính có khối lƣợng phân tử 33, 55, 61, 66, 71, 78, 92 kDa, tuy nhiên số vạch protein ở điều kiện sốc nhiệt 37 oC ít hơn so với 42 oC. Theo các tác giả này, gây sốc nhiệt cao hơn sẽ làm cho các phân tử protein tách nhau ra tốt hơn

[209]. Sau đó, Mao et al. (2007) phát hiện thêm các protein có khối lƣợng phân tử

nhỏ hơn có mặt ở V. parahaemolyticus là 27, 32, 33, 47 và 48 kDa [139]. Ngoài ra,

nồng độ muối và môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau cũng ảnh hƣởng tới thành phần

protein màng ngoài của vi khuẩn. Cũng bằng kỹ thuật phân tích SDS-PAGE, V.

parahaemolyticus đƣợc nuôi trong môi trƣờng BHI chỉ thấy rõ vạch 37 kDa, trong

khi nuôi trong môi trƣờng NB thì quan sát thấy 3 vạch protein ở 37, 40 và 46 kDa.

Ngoài ra, vạch protein 44 kDa chỉ quan sát thấy khi vi khuẩn này đƣợc nuôi trong

NB có bổ sung thêm 2 % maltose [150]. Gần đây, khi nghiên cứu protein ngoại mạc

của 19 chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio, Li et al. (2010) đã phát hiện loại protein

màng OmpK có khối lƣợng phân tử 28 và 31 kDa có mặt ở hầu hết các chủng vi

khuẩn V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus. Từ kết quả này, nhóm

nghiên cứu đã cho rằng đây là những phân tử protein có tính kháng nguyên cao và

giới thiệu sử dụng làm vaccine phòng bệnh cho cá biển [126]. Nhóm tác giả này

cũng đã chứng minh phân tử protein màng OmpK có khối lƣợng 28 kDa là loại

protein có tính kháng nguyên cao khi sử dụng làm vaccine phòng bệnh cho cá mú

chấm cam E. coioides tạo nên khả năng kháng bệnh tốt, với hệ số bảo hộ (RPS) đạt

tới 100 % khi công cƣờng độc vào ngày thứ 28 sau khi tiêm vaccine [125].

Nhìn chung, thành phần OMP của vi khuẩn V. parahaemolyticus thay đổi tùy

điều kiện nuôi cấy và phƣơng pháp phân tích. Tuy nhiên, kết quả phân tích thành

phần protein của các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ cá mú chấm cam E.

coioides của nghiên cứu này cho thấy nhiều điểm tƣơng đồng với các nghiên cứu

nêu trên. Thành phần protein của các chủng V. parahaemolyticus V1, V2, V3 và A

có tƣơng đối đầy đủ các loại protein chủ yếu đã đƣợc báo cáo trƣớc đây. Ngoài ra,

kết quả của nghiên cứu này còn thể hiện đƣợc sự có mặt của các protein có khối

lƣợng phân tử 66, 47, 31, 28, 21 kDa tƣơng đồng với các protein độc tố và có tính

kháng nguyên cao đã đƣợc nhiều tác giả công bố [97], [125], [126], [209], [217]. Phát

hiện này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chọn lựa các chủng vi khuẩn tiềm năng

ứng dụng cho nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cho cá biển.

3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với

cá mú chấm cam

Bốn chủng vi khuẩn V1, V2, V3 và A đƣợc nuôi cấy tăng sinh trong môi trƣờng TSB có 2 % NaCl trong 24 giờ ở 33 oC, ly tâm 6000 vòng/phút ở 4 oC trong 10 phút để thu vi khuẩn kết lắng. Sau đó, pha loãng vi khuẩn theo các nồng độ thí

nghiệm và gây cảm nhiễm cho cá khỏe bằng phƣơng pháp tiêm cơ.

Quan sát cá thí nghiệm đƣợc gây nhiễm thực nghiệm bằng 4 chủng vi khuẩn

nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng các chủng vi khuẩn này đều có thể gây ra các dấu

hiệu bệnh lý đặc trƣng của bệnh xuất huyết lở loét bao gồm bỏ ăn, vết tiêm sƣng đỏ

và ngày càng sƣng to, lở loét dần ra xung quanh, xuất huyết trên thân, vây, gan

sƣng, màu sắc tái nhạt. Các dấu hiệu bệnh này cũng tƣơng tự với biểu hiện của cá

mú nhiễm bệnh trong tự nhiên (Hình 3.6).

B

D

Hình 3.6: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (A: Biểu hiện bệnh bên ngoài; B: Biểu hiện bệnh bên trong; C: Cá

đối chứng; D: Phân lập lại vi khuẩn trên API-20E)

Sau 10 ngày cảm nhiễm, tỷ lệ chết của các nhóm cá thí nghiệm đƣợc trình bày

a. LD50 > 105 cfu/g

b. LD50 = 2,14 x 104 cfu/g

c. LD50 = 1,78 x 103 cfu/g

d. LD50 = 1,48 x 104 cfu/g

tại Hình 3.7.

Hình 3.7: Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá mú chấm cam Epinephelus coioides

khi bị cảm nhiễm bởi Vibrio parahaemolyticus với các chủng và mật độ vi

khuẩn khác nhau (a: Chủng V1; b: Chủng V2; c: Chủng V3; d: Chủng A)

Sau 10 ngày cảm nhiễm, hiện tƣợng cá chết xuất hiện ở tất cả các nghiệm thức

thí nghiệm. Tuy nhiên, tùy theo chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đã cảm nhiễm

mà tỷ lệ chết tích lũy có sự khác nhau. Trong đó, chủng V3 và A đã gây ra tỷ lệ chết

cao hơn hai chủng còn lại (V1, V2), cụ thể nhƣ sau: Tỷ lệ chết tích lũy tƣơng ứng với 4 mật độ vi khuẩn tiêm vào cá từ 102 đến 105 cfu/g của bốn chủng V.

parahaemolyticus thể hiện lần lƣợt là V3 (16,7; 41,7; 75 và 91,7 %), A (0,0; 25,0;

41,7 và 91,7 %), V2 (16,7; 33,3; 41,7 và 66,7 %) và V1 (0,0; 33,3; 25,0 và 41,7 %).

Kết quả phân lập lại vi khuẩn ở gan, thận của cá thí nghiệm có biểu hiện bệnh lở

loét đều thấy có mặt của vi khuẩn V. parahaemolyticus. Cá ở nhóm đối chứng vẫn

khỏe mạnh bình thƣờng trong suốt thời gian thí nghiệm và không có biểu hiện xuất

huyết, lở loét (trừ 1 cá thể ở nhóm đối chứng thí nghiệm chủng V2 chết không có

biểu hiện bên ngoài, chiếm 8,33 %).

Độc lực của các chủng vi khuẩn thí nghiệm thể hiện ở giá trị LD50 đƣợc tính

toán theo công thức của Reed và Muench (1938) [164] cho kết quả tƣơng ứng với các chủng V3, A, V2 lần lƣợt là: 1,78 x 103; 1,48 x 104; 2,14 x 104 cfu/g cá. Các

nhóm cá đƣợc gây nhiễm bằng chủng V1 có tỷ lệ chết dƣới 50 %, vì vậy, không thể

tính đƣợc giá trị LD50 của chủng V1 đối với cá mú chấm cam trong thí nghiệm này.

Tuy nhiên, có thể nhận định rằng chủng này có độc lực thấp và giá trị LD50 phải trên 105 cfu/g cá. Kết quả thí nghiệm này thể hiện chủng V3 có độc lực cao nhất gây

bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam.

Vi khuẩn V. parahaemolyticus đã đƣợc nhiều tác giả thông báo là tác nhân gây

bệnh cho các đối tƣợng thủy sản nhƣ bào ngƣ [131]; tôm [78], [111]; hầu [120]…

Trên cá biển, V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá tráp đỏ và nhiều loài cá

biển khác ở Nhật [85], [114]; gây bệnh lở loét làm chết hàng loạt cá hồng bạc

(Sparus sarba) ở Hồng Kông [124]; cá hồng (Lutjanus guttatus) ở Mexico [74], cá

giò (Rachycentron canadum L.) ở Đài Loan [127], cá Iberian toothcarp (Aphanius

iberus) [20] và cá tuyết (Solea senegalensis) [219] ở Tây Ban Nha,.

Ở cá mú, vi khuẩn V. parahaemolyticus đã đƣợc thông báo gây bệnh Vibriosis

với các biểu hiện xuất huyết, lở loét cho cá nuôi thƣơng phẩm ở Malaysia [144];

Thái Lan [45], [55]; Trung Quốc [126]. Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh Vibriosis trên

cá biển trong đó có cá mú đã đƣợc nhiều tác giả công bố, một số tác nhân gây bệnh

chủ yếu bao gồm: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. carchariae… [5], [8],

[14], [148].

Sự khác biệt về độc tính của các chủng thuộc giống Vibrio có thể là do các

chủng này đƣợc phân lập từ nguồn gốc khác nhau. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra

rằng khả năng gây bệnh của vi khuẩn V. parahaemolyticus trên các loài cá khác

nhau là không giống nhau. Nghiên cứu của Li et al. (1999) cho thấy khi tiêm huyền dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus nồng độ 108 cfu/mL đã gây chết hàng loạt cá

tráp (Sparus sarba) với biểu hiện xuất huyết và lở loét [124]. Hiện tƣợng này cũng

bắt gặp ở cá tuyết S. senegalensis [219] và cá A. iberus [20] ở Tây Ban Nha với giá trị LD50 lần lƣợt là 105 và 106 cfu/g cá.

So sánh với kết quả đã công bố của các tác giả khác, giá trị LD50 của chủng V.

parahaemolyticus V3 phân lập từ cá mú chấm cam bị bệnh ở Khánh Hòa có giá trị thấp hơn rất nhiều, chỉ là 1,78 x 103 cfu/g cá, sự sai khác này có thể do các chủng vi

khuẩn mang gen độc tố đƣợc phân lập từ các ký chủ và điều kiện sống khác nhau.

Tóm lại, chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 có phổ protein tƣơng đồng

với các chủng V1, V2, và chủng đối chứng A. Tuy nhiên, độc lực của chủng V3 đối với cá mú chấm cam là cao nhất với giá trị LD50 là 1,78 x 103 cfu/g. Đây cũng là cơ sở để chọn chủng V3 làm kháng nguyên đặc trƣng của V. parahaemolyticus trong

nghiên cứu đáp ứng miễn dịch này.

3.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và

khả năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam

Thí nghiệm thực hiện trên đàn cá mú chấm cam (186,8 ± 3,9 g; 22,5 ± 0,2 cm)

đƣợc cho ăn thức ăn có bổ sung β-glucan ở các nồng độ 500, 1.000, 2.000 ppm liên

tục trong 2 tuần và nhóm đối chứng cho ăn thức ăn viên không bổ sung β-glucan. Ở

ngày thứ nhất và ngày thứ 15 kể từ khi ngừng cho ăn β-glucan, cá ở các nghiệm

thức đƣợc thử thách bởi chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3. Một số thông số

đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua sự biến đổi tỷ lệ các loại tế bào

máu; chỉ số thực bào và hoạt tính hô hấp của tế bào tiền thận, ngoài ra khả năng

kháng bệnh của cá mú chấm cam cũng đã đƣợc mô tả rõ từ kết quả của thí nghiệm

này.

3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá

mú chấm cam

Theo chỉ dẫn phân loại tế bào máu cá của Ainsworth (1992) [18], thành phần

tế bào máu cơ bản của cá mú chấm cam bao gồm: tế bào hồng cầu, các loại tế bào

bạch cầu (Leucocytes), tế bào lympho (Lymphocyte) và tiểu cầu (Thrombocyte).

Trong đó, các loại tế bào bạch cầu (BC) quan sát đƣợc gồm có BC đơn nhân

(Monocyte), BC trung tính (Neutrophil), BC ƣa axít (Eosinophil) và BC ƣa kiềm

(Basophil).

Trong điều kiện nghiên cứu, dựa trên sự quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng

đại 1000 X dƣới vật kính dầu, đặc điểm hình thái các loại tế bào máu của cá mú

chấm cam nhƣ sau:

 Hồng cầu: Hình bầu dục, chiều dài và chiều rộng tƣơng ứng là 11,4 ± 1,1 và

7,1 ± 0,8 µm, có một nhân hình ovan ở giữa bắt màu tím đậm.

 Tế bào lympho: Hình tròn hoặc hơi tròn, có một nhân lớn chiếm gần hết tế

bào, lớp nguyên sinh chất mỏng, lớp màng có nhiều chân giả.

 Bạch cầu ƣa kiềm: Hình hơi tròn, đƣờng kính 6,6 ± 0,9 µm và 5,8 ± 0,9 µm,

có một nhân lớn hình ovan hoặc hình chữ U bắt màu tím đậm chiếm gần hết tế bào,

phần nguyên sinh chất đậm đặc chứa nhiều hạt bắt màu tím xanh.

 Bạch cầu ƣa a xít: Có nhiều hình dạng khác nhau, nhân bắt màu tím đậm, chia

thùy và thƣờng có hình móng ngựa, nguyên sinh chất chứa hạt bắt màu tím hồng.

 Bạch cầu trung tính: Thƣờng có hình tròn, nhân bắt màu tím đậm, chia nhiều

thùy có nhiều hình dạng khác nhau, nguyên sinh chất chứa hạt bắt màu tím nhạt hơn

so với BC ƣa axít và kiềm, có nhiều chân giả, có khả năng vận động mạnh.

 Bạch cầu đơn nhân: là tế bào có kích thƣớc lớn nhất, thƣờng có hình tròn, có

một nhân bắt màu tím đậm, hình ovan hoặc hình tròn lõm, thƣờng nằm về một phía

của tế bào, nguyên sinh chất bắt màu tím nhạt không chứa hạt, có nhiều chân giả.

 Tiểu cầu: Có kích thƣớc nhỏ, hình giọt nƣớc hoặc hình que 2 đầu tù, nhân to

chiếm phần lớn thể tích tế bào, bắt màu tím đậm và hình dạng thay đổi theo hình

dạng tế bào, chỉ một ít nguyên sinh chất bắt màu tím nhạt bao xung quanh nhân.

Chúng ít khi đứng riêng rẽ mà thƣờng tập trung thành từng đám.

Kích thƣớc và hình ảnh của các loại tế bào máu cá mú chấm cam thể hiện qua

Bảng 3.2 và Hình 3.8.

Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides

(n = 15, giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn)

Loại tế bào Kích thƣớc tế bào Kích thƣớc nhân

Dài (µm) Rộng (µm) Dài (µm) Rộng (µm)

Hồng cầu 11,4 ± 1,1 7,1 ± 0,8 5,3 ± 0,5 4,3 ± 0,5

Bạch cầu trung tính 9,3 ± 2,2 7,7 ± 1,3 6,8 ± 0,7 5,2 ± 0,7

Bạch cầu ƣa a xít 8,1 ± 1,1 5,5 ± 0,6 4,6 ± 0,8 6,4 ± 0,6

Bạch cầu ƣa kiềm 6,6 ± 0,9 5,8 ± 0,7 3,9 ± 1,0 5,8 ± 0,9

Bạch cầu đơn nhân 9,9 ± 1,5 7,1 ± 0,9 4,5 ± 0,9 8,8 ± 1,3

Lympho bào 6,0 ± 0,9 5,1 ± 0,5

Tiểu cầu 7,6 ± 1,1 3,9 ± 0,9

Hình 3.8: Hình ảnh các loại tế bào máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides

(M- Bạch cầu đơn nhân; L-tế bào lympho; T- Tiểu cầu; N-Bạch cầu trung tính;E-

Bạch cầu ưa a xít; B- Bạch cầu ưa kiềm; Er- Hồng cầu)

Thành phần, kích thƣớc và đặc điểm hình thái các loại tế bào máu cá khác

nhau tùy thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ đặc điểm loài, điều kiện sống, tình trạng sức

khỏe, độ tuổi và cả giới tính [33]. Mỗi loại tế bào máu đảm trách các chức năng

riêng trong cơ thể và chúng cũng có các cơ chế hoạt động khác nhau. Tế bào BC ƣa

kiềm không có khả năng thực bào, chỉ tham gia phản ứng viêm, tăng tính thấm

thành mạch, hóa ứng động các BC khác trong cơ chế ĐƢMD không đặc hiệu [18].

BC ƣa axít có khả năng thực bào, gây độc và tham gia quá trình oxy hóa để loại bỏ

dị vật xâm nhập, đặc biệt là ký sinh trùng [2]. BC trung tính có khả năng thực bào

rất lớn, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế ĐƢMD tự nhiên [18]. Cùng với BC

trung tính, BC đơn nhân tham gia chính vào hệ miễn dịch tự nhiên của cơ thể, ngoài

ra chúng còn tham gia vào quá trình xử lý và trình diện kháng nguyên trong cơ chế

tạo đáp ứng đặc hiệu của cơ thể [157]. Tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong quá

trình đông máu vì nó rất dễ bị tan vỡ và sản sinh ra các chất làm đông máu [2].

Ngoài ra, có một vài nghi ngờ tiểu cầu tham gia thực bào đã đƣợc công bố nhƣ tiểu

cầu ở cá tầm Trung Quốc (Acipenser sinensis) [216] hay ở cá bơn sao (Pleuronectes

platessa) [62].

Trong nghiên cứu này, việc phân loại các loại tế bào máu cá bằng cách nhuộm

màu và quan sát dƣới kính hiển vi quang học gặp khá nhiều khó khăn, đặc biệt là

không quan sát đƣợc hình dạng hạt của các loại bạch cầu có hạt nên việc mô tả chỉ ở

mức độ tƣơng đối. Tuy nhiên, về thành phần, quan sát của chúng tôi cho thấy máu

cá mú chấm cam E. coioides có đầy đủ các loại tế bào đã đƣợc công bố ở các loài cá

xƣơng. Bao gồm hồng cầu, lympho bào, tiểu cầu, BC đơn nhân và các loại BC có

hạt nhƣ BC trung tính, BC ƣa axít và BC ƣa kiềm.

Sự có mặt của các loại tế bào BC có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong ĐƢMD

tự nhiên của cơ thể. Ở một số loài cá có thể thiếu 1 hoặc 2 loại tế bào BC (chủ yếu

là BC có hạt ƣa kiềm hoặc ƣa axit). Nghiên cứu của Saunders (1966) trên 121 loài

cá phân bố ở vùng biển Puerto Rico cho thấy hầu hết các loài đều có tế bào hồng

cầu, BC trung tính và tiểu cầu, tuy nhiên, chỉ có 70/121 loài có tế bào BC ƣa acid và

5/121 loài có BC ƣa kiềm. Một điều khá bất ngờ là trong máu của cả 6 loài cá thuộc

họ cá mú mà tác giả này nghiên cứu (Centropomus undecimalis, Rypticus

saponaceus, Epinephelus adscensionis, E. guttatus, E. striatus và Cepalopholis

fulva) đều không có BC ƣa kiềm [175]. Hoặc nghiên cứu trên máu cá tầm Trung

Quốc (A. sinensis) cũng chỉ có 2 loại BC có hạt là BC trung tính và BC ƣa axít

[216]. Tuy nhiên, một nghiên cứu gần đây trên cá mú đỏ Mycteroperca rosacea của

Burgos-Aceves et al. (2010) [33] cho thấy trong máu của loài cá này có đầy đủ các

loại tế bào máu tƣơng tự nhƣ thành phần tế bào máu ở cá mú chấm cam trong

nghiên cứu của chúng tôi. Mặc dù giống nhau về thành phần tế bào nhƣng kích

thƣớc của hầu hết các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam đều lớn hơn so với kích

thƣớc tế bào tƣơng ứng ở cá mú đỏ M. rosacea, ngoại trừ kích thƣớc BC ƣa kiềm

thì ngƣợc lại [33].

3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú

chấm cam

Sự biến đổi về tỷ lệ các loại BC ở máu cá mú chấm cam sau 2 tuần ăn β-glucan

với các nồng độ khác nhau đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau

2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan (%, trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 6)

Các nghiệm thức thí nghiệm Loại bạch cầu

Bạch cầu tổng số

Bạch cầu trung tính

Bạch cầu đơn nhân

Bạch cầu ƣa a xít

Bạch cầu ƣa kiềm

Lympho bào ĐC 3,3 ± 0,6a 21,5 ± 2,8a 18,7 ± 8,0a 4,9 ± 2,4a 5,0 ± 0,9b 49,9 ± 7,0b G500 4,2 ± 0,4b 23,6 ± 4,4ab 26,4 ± 3,7ab 5,2 ± 1,3a 3,3 ± 0,6a 41,5 ± 5,8ab G1000 5,3 ± 0,4c 27,9 ± 1,9b 26,5 ± 5,4ab 4,9 ± 1,4a 3,0 ± 0,8a 37,7 ± 4,3a G2000 6,0 ± 0,5c 27,1 ± 3,3b 27,6 ± 2,5b 4,1 ± 0,7a 2,4 ± 0,8a 38,8 ± 6,5a

Ghi chú: Các ký hiệu số mũ khác nhau trên cùng một hàng biểu thị sự sai khác có ý

nghĩa thống kê (P<0,05)

Bảng 3.3 cho thấy sau 2 tuần đƣợc ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, công thức

bạch cầu trong máu cá mú chấm cam thí nghiệm đã có sự thay đổi so với nhóm cá

đối chứng không đƣợc ăn β-glucan. Cụ thể là: Sau 2 tuần thí nghiệm, tỷ lệ tế bào

BC trong tổng số tế bào máu ở nhóm cá đƣợc ăn bổ sung β-glucan đã tăng cao và

khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với nhóm cá đối chứng. Trong đó, tỷ lệ

BC tổng số đạt cao nhất ở nhóm ăn β-glucan nồng độ 1000 ppm và 2000 ppm với

giá trị tƣơng ứng là 5,3 % và 6 %, tiếp đến là nhóm đƣợc cho ăn nồng độ 500 ppm

với 4,2 %, và thấp nhất ở nhóm đối chứng chỉ với 3,3 %.

Hơn nữa, sự tăng lên về số lƣợng BC tổng số ở nhóm cá đƣợc ăn bổ sung chất

kích thích miễn dịch β-glucan chủ yếu là do sự tăng lên của các loại BC trung tính

và BC đơn nhân (Đại thực bào). Cụ thể là, tỷ lệ % BC trung tính và BC đơn nhân

trong tổng số lƣợng BC trong máu ở nhóm cá đƣợc cho ăn bổ sung β-glucan cao

hơn so với nhóm đối chứng không ăn β-glucan, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

(P<0,05). Trong đó, tỷ lệ 2 loại tế bào này đạt cao nhất ở nhóm cá đƣợc ăn bổ sung

β-glucan nồng độ 1000 ppm và 2000 ppm (Bảng 3.3).

Nhƣ vậy, sau 2 tuần cho cá mú chấm cam ăn thức ăn có bổ sung hoạt chất β-

glucan, tỷ lệ tế bào BC tổng số tăng cao ở nhóm cá cho ăn nồng độ cao (1000 và

2000 ppm). Trong đó, 2 loại BC tham gia chính vào quá trình thực bào bao gồm BC

đơn nhân và BC trung tính cũng tăng cao rõ rệt, và sai khác có ý nghĩa thống kê so

với các nghiệm thức còn lại. Điều này cho thấy rằng, việc cho cá mú chấm cam ăn

bổ sung β-glucan ở nồng độ 1000 và 2000 ppm có tác dụng làm tăng số lƣợng tế

bào tham gia thực bào, từ đó có khả năng giúp tăng sức đề kháng của cá.

Đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh β-glucan có ảnh hƣởng rõ rệt

đến sự biến đổi số lƣợng BC ở cá, chủ yếu là tăng số lƣợng các loại BC có khả năng

thực bào, kích thích các chỉ số thực bào, diệt vi khuẩn, hoạt hóa bổ thể và hoạt hóa

tế bào lympho (tế bào B) sản sinh kháng thể, từ đó làm tăng khả năng kháng bệnh ở

nhiều loài cá nuôi nhƣ cá chép ( C. carpio) [177], cá hồi vân (O. mykiss) [99], cá hồi

Đại Tây Dƣơng (S. salar) [65], cá tráp (S. auratus) [48], cá chẽm Châu Âu (D. labrax)

[28], cá bơn (S. maximus) [151]...

Nghiên cứu của Jeney và Anderson (1993) quan sát thấy sự gia tăng tổng số BC

ở cá hồi vân sau 12 giờ sử dụng β-glucan so với nhóm đối chứng, cụ thể tăng cao ở

ngày thứ nhất đối với cá tiêm và ở ngày thứ 3 đối với cá tắm trong β-glucan [99].

Ở cá chép (C. carpio), nghiên cứu của Selvaraj et al. (2006) thông báo rằng

sau 16 ngày tiêm β-glucan với các nồng độ từ 100, 500 và 1000 µg/cá thể, BC tổng

số tăng mạnh so với nhóm đối chứng, tỷ lệ thuận với nồng độ β-glucan lần lƣợt là

16,7; 66,7 và 75,0 %; số lƣợng BC trung tính và BC đơn nhân cũng có xu hƣớng

tăng tƣơng tự trong khi BC ƣa axít và BC ƣa kiềm lại có xu hƣớng giảm khi tăng

nồng độ β-glucan tiêm vào; Riêng đối với tế bào lympho thì sự khác biệt không có ý

nghĩa thống kê. Khi bổ sung β-glucan cho cá qua đƣờng cho ăn cũng cho kết quả

tƣơng tự nhƣ trên [177].

Ở cá bơn (S. maximus) ăn β-glucan liên tục trong 35 ngày với nồng độ 2 g/kg

thức ăn (2000 ppm), BC tổng số ở nhóm cá thí nghiệm cao hơn so với nhóm đối

chứng sau 1 ngày và 8 ngày kể từ khi ngừng cho ăn, trong khi sai khác không có ý

nghĩa thống kê ở ngày thứ 21 sau khi ngừng cho ăn [151]. Nghiên cứu của Palic´ et

al. (2006) cũng cho kết quả tƣơng tự khi cho cá chép (Pimephales promelas) ăn β-

glucan với liều 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tế bào BC trung tính tăng lên 23 % so với

nhóm đối chứng ở ngày thứ 3, đồng thời các chức năng của BC trung tính đều đƣợc

hoạt hóa, từ đó làm tăng khả năng chịu đựng của cá trong điều kiện sốc cũng nhƣ

khả năng kháng bệnh [155].

Ở cá, hầu hết các loại BC đều đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch

không đặc hiệu. Các yếu tố tác động bên ngoài (yếu tố môi trƣờng, cơ học, tác nhân

gây bệnh, mùa vụ, thức ăn…) hoặc bên trong (giai đoạn phát triển, giới tính…) đều

có ảnh hƣởng đến sự biến động số lƣợng của các loại BC. BC đơn nhân và BC trung

tính có vai trò quan trọng nhất trong cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch tự nhiên giúp cơ

thể chống lại dị vật xâm nhập thông qua chỉ số thực bào, hoá ứng động, tiêu diệt tế

bào vi khuẩn [157], [193]. Vì vậy, kết quả của nhiều nghiên cứu trên cá đều cho

thấy số lƣợng tế bào BC đơn nhân và BC trung tính tăng cao ở các nhóm cá cho ăn

hoặc tiêm β-glucan. Tuy nhiên, bổ sung glucan qua đƣờng tiêm luôn đem lại hiệu

quả cao hơn do đƣợc kích thích bởi phản ứng viêm [193].

Nghiên cứu của chúng tôi trên cá mú chấm cam E. coioides cũng cho kết quả

tƣơng tự. Điều này chứng tỏ β-glucan có mối liên quan chặt chẽ đến sự biến đổi tỷ

lệ BC trong máu cá, là bƣớc khởi đầu cho một chuỗi các phản ứng thuộc cơ chế đáp

ứng miễn dịch tự nhiên giúp vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh.

3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền

thận cá mú chấm cam

Kết quả ở trên đã chứng minh rằng khi cho cá mú chấm cam ăn thức ăn có bổ

sung β-glucan ở các nồng độ 1.000 và 2.000 ppm thì tỷ lệ % của tế bào BC trung

tính và BC đơn nhân đã tăng lên có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Chức năng của 2

loại BC này trong hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá xƣơng thể hiện ở khả năng

thực bào để bảo vệ cơ thể, ngoài ra chúng còn tham gia vào quá trình xử lý và trình

diện kháng nguyên trong cơ chế tạo đáp ứng đặc hiệu của cơ thể [157].

Việc bổ sung β-glucan cho cá mú chấm cam qua con đƣờng thức ăn không chỉ

làm biến đổi thành phần tế bào máu mà còn ảnh hƣởng đến tính năng của chúng khi

tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể. Một trong những tính năng quan trọng liên

quan trực tiếp đến sức đề kháng của cá là hoạt tính thực bào của BC. Chỉ số thực

bào của tế bào BC tiền thận cá mú chấm cam sau 2 tuần ăn β-glucan và sau 15 ngày

kể từ khi ngừng ăn β-glucan đƣợc thể hiện ở Bảng 3.4

Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam

khi đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau

Thời gian Nghiệm thức

Ngày thứ nhất sau khi ngừng cho ăn β-glucan

Ngày thứ 15 sau khi ngừng cho ăn β-glucan ĐC G500 G1000 G2000 ĐC G500 G1000 G2000 Tỷ lệ tế bào BC tham gia thực bào (%) 13,3 ± 2,3a 16,0 ± 2,1ab 26,0 ± 7,1c 20,7 ± 1,2bc 13,5 ± 0,9a 13,8 ± 0,8a 13,3 ± 0,4a 13,5 ± 1,1a Cƣờng độ thực bào của tế bào bạch cầu mô thận ( %, n = 6, TB ± SD ) 2 hạt 4,4 ± 0,3a 5,0 ± 0,9ab 6,9 ± 2,4b 6,2 ± 0,7ab 4,9 ± 0,6a 4,5 ± 0,9a 4,0 ± 0,6a 4,2 ± 0,4a 1 hạt 6,3 ± 1,6a 7,3 ± 0,5ab 12,1 ± 2,6c 9,1 ± 1,2b 6,2 ± 1,0a 7,4 ± 0,8a 7,1 ± 0,4a 7,2 ± 0,8a > 3 hạt 2,6 ± 0,5a 3,7 ± 1,0a 7,0 ± 3,3b 5,3 ± 1,4ab 2,4 ± 0,3b 2,0 ± 0,2a 2,2 ± 0,2ab 2,0 ± 0,2a

Ghi chú: Các ký hiệu số mũ khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý

nghĩa thống kê (P<0,05)

Kết quả ở Bảng 3.4 đã thể hiện, sau 2 tuần liên tục cho ăn β-glucan, chỉ số

thực bào của BC mô thận ở các nhóm cá thí nghiệm ngay sau khi ngừng cho ăn bổ

sung đã tăng lên rõ rệt so với nhóm đối chứng. Tỷ lệ tế bào tham gia thực bào đạt

cao nhất ở nhóm cá ăn β-glucan 1000 ppm (26,0 %), tiếp đến là nhóm cá ăn ở nồng

độ 2000 ppm (20,7 %) và 500 ppm (16,0 %), thấp nhất ở nhóm đối chứng với 13,3

%. Tuy nhiên, tỷ lệ tế bào BC tham gia thực bào ở nghiệm thức G1000 và G2000

lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng, nhƣng chỉ số thực bào ở

hai nghiệm thức này lại không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P>0,05).

Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng đã thể hiện, cƣờng độ thực bào của BC

cũng khác nhau có ý nghĩa giữa các nghiệm thức. Cụ thể, tỷ lệ tế bào ăn nhiều hạt

bead (> 3 hạt) cũng đạt cao nhất ở nhóm cá đƣợc cho ăn β-glucan 1000 ppm, sai

khác có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức G500 và đối chứng.

Tuy nhiên, sau 15 ngày ngừng cho ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, số tế bào

tham gia thực bào và cƣờng độ thực bào của tế bào BC mô thận giảm đáng kể và sai

khác không có ý nghĩa thống kê giữa nhóm cá thí nghiệm và đối chứng, kết quả thể

hiện ở Bảng 3.4 và Hình 3.9.

Hình 3.9: Chỉ số thực bào của bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus

coioides (A: Ngày thứ nhất sau khi ngừng cho ăn β-glucan; B: Ngày thứ 15 sau khi

ngừng cho ăn β-glucan)

Hình 3.10: Hình ảnh thực bào của các tế bào bạch cầu mô thận cá mú chấm

cam Epinephelus coioides ( : Tế bào bạch cầu có thực bào; : Tế bào bạch cầu

không thực bào)

Từ kết quả trên có thể nói rằng, việc bổ sung β-glucan cho cá qua con đƣờng

thức ăn đã làm tăng số lƣợng và tính năng của tế bào BC, mở đƣờng cho hàng loạt

các phản ứng hoạt hóa các chức năng của chúng, kích thích thực bào mạnh mẽ để

tiêu diệt các vi khuẩn xâm nhập. Thực tế cho thấy, sau 2 tuần cho ăn β-glucan có ảnh

hƣởng tích cực đến hệ miễn dịch tự nhiên của cá mú chấm cam biểu hiện qua việc

tăng chỉ số thực bào, từ đó làm tăng khả năng kháng bệnh ở cá, tuy nhiên hiệu quả

này không còn duy trì sau 15 ngày kể từ khi ngừng cho ăn.

Nhiều nghiên cứu ở các loài cá khác cũng cho kết quả tƣơng tự. Bổ sung β-

glucan cho cá bằng nhiều cách: cho ăn, tiêm hoặc tắm đều có tác dụng kích thích

làm tăng chỉ số thực bào của BC tiền thận [28], [65], [99], [105], [151].

Trong điều kiện in vitro, khả năng thực bào của đại thực bào cá hồi Đại Tây

Dƣơng (S. salar) khi nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung glucan ở các nồng độ từ

0,1; 1; 10 và 50 µg/mL trong vòng 7 ngày có sự khác nhau. Chỉ số thực bào ở nồng

độ 10 và 50 µg/mL cao hơn ở nồng độ thấp 0,1 và 1 µg/mL, đặc biệt khi quan sát

tiêu bản dƣới kính hiển vi cho thấy các đại thực bào ở nhóm 50 µg/mL phình to

chứa đầy các hạt glucan bên trong [105].

Ở cá tráp (S. auratus), sau 2 tuần cho ăn β-glucan với nồng độ 1 và 10 g/kg,

chỉ số thực bào của BC đạt các giá trị tƣơng ứng là 62 % và 55 %; trong khi đó tỷ lệ

này giảm mạnh ở tuần thứ ba, chỉ còn 42 % và 34 % [48].

Thí nghiệm trên cá chẽm Châu âu (D. labrax) cũng cho kết quả tƣơng tự. Khi

cho ăn β-glucan 0,1 %, khả năng hoạt hóa thực bào, lysozyme, và các thông số miễn

dịch tự nhiên của cá thí nghiệm đƣợc tăng cƣờng sau thời gian cho ăn 15 ngày. Tuy

nhiên hiệu quả này không sai khác so với nhóm đối chứng khi cho ăn kéo dài đến

35 ngày [28].

Nhìn chung, mặc dù các nghiên cứu nêu trên đƣợc thực hiện ở các loài cá khác

nhau, nhƣng kết quả khá tƣơng đồng với nghiên cứu mà chúng tôi đã thực hiện trên

loài cá mú chấm cam. Hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy β-glucan có ảnh hƣởng

tích cực đến hệ miễn dịch ở cá và thời gian cho ăn chỉ nên kéo dài đến 2 tuần. Đây

cũng là lời khuyên đối với ngƣời nuôi chỉ nên áp dụng cho cá ăn bổ sung β-glucan

trong thời gian ngắn trƣớc khi vận chuyển hoặc lúc giao mùa nhằm tăng sức đề

kháng cho cá nuôi.

3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch

cầu tiền thận cá mú chấm cam

Cùng với quá trình thực bào, các phản ứng oxy hóa khử xảy ra mạnh mẽ bên

trong các tế bào thực bào (Phagocyte) bởi sự xúc tác của các enzyme có tính oxy

hóa (Oxidase enzyme) có tác dụng tiêu diệt các vi khuẩn đã bị BC bắt giữ. Quá

trình này diễn ra mạnh mẽ trong các BC sau khi tiến hành thực bào đƣợc gọi là sự

bùng nổ hô hấp (Respiratory Burst- RB). Vì vậy, việc đánh giá hoạt tính bùng nổ hô

hấp (Respiratory Burst Assay- RBA) là một công cụ nhằm đánh giá khả năng tiêu

diệt tế bào lạ của các tế bào thực bào. Hoạt tính RB của tế bào BC tiền thận cá mú

chấm cam trong kiểm định RBA đƣợc biểu hiện thông qua màu sắc của phản ứng

khử Nitroblue tetrazolium do oxidase enzyme của tế bào BC với xúc tác zymosan.

Sự khác biệt màu sắc đƣợc đo bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 630 nm, kết quả

kiểm định ở các nhóm cá thí nghiệm đƣợc trình bày ở Hình 3.11:

Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam

Epinephelus coioides (A: Ngày thứ 1 sau khi ngừng cho ăn β-glucan; B: Ngày thứ

15 sau khi ngừng cho ăn β-glucan; Các chữ cái khác nhau trên các cột biểu hiện sự

sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05)

Hình 3.11 cho thấy sau 2 tuần cho ăn β-glucan, hoạt tính RB của tế bào BC

mô tiền thận có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức thí nghiệm

(P< 0,05). Cụ thể, nhóm cho ăn β-glucan 1000 ppm và 2000 ppm có chỉ số RB cao

hơn so với nhóm cá cho ăn 500 ppm và đối chứng. Tuy nhiên, sau 15 ngày ngừng

cho ăn β-glucan, hoạt tính RB ở các nhóm đều giảm và sự sai khác không có ý

nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (P>0,05).

Hoạt tính RB là một trong những cơ chế tiêu diệt vi khuẩn trong hoạt động

thực bào của BC sau khi bắt nuốt các tế bào lạ xâm nhập vào cơ thể, kết quả là sự - khi có sự kết hợp của phức hệ enzym NADPH-oxidase trong gia tăng các anion O2

lớp màng nguyên sinh chất của các phagocyte và tế bào vi khuẩn.

Nhiều công trình nghiên cứu đã đều khẳng định hoạt chất β-glucan có ảnh

hƣởng trực tiếp tới chỉ số thực bào của đại thực bào và BC trung tính, từ đó làm

tăng hoạt tính RB của chúng ngay cả khi có mặt β-glucan ở nồng độ thấp. Tuy

nhiên, nồng độ β-glucan thích hợp để kích thích hoạt tính RB của tế bào BC không

giống nhau trên các loài cá.

Ở cá hồi S. salar, nồng độ β-glucan từ 0,1-1,0 µg/mL cho hoạt tính RB của đại

thực bào cao nhất, tuy nhiên ở nồng độ 10,0 µg/mL thì không có sự tác động và ở

50 µg/mL thì kìm hãm quá trình này [105].

Trong khi đó, ở một loài thuộc họ cá chép Pimephales promelas, nghiên cứu

của nhóm Palic et al. (2006) cho thấy hoạt tính RB của tế bào BC trung tính bắt đầu - ở nồng độ thể hiện ở nồng độ β-glucan 600 µg/mL trong khi không tạo anion O2

150 µg/mL [155].

Ở cá mú chấm cam E. coioides, việc cho ăn bổ sung cả tế bào nấm men

Saccharomyes cerevisiae (là nguồn nguyên liệu chiết xuất β-glucan) với nồng độ 105 và 107 cfu/kg không chỉ có hiệu quả rõ rệt trong việc kích thích tốc độ tăng

trƣởng, giảm hệ số thức ăn, mà còn tăng chỉ số thực bào, hoạt tính RB, lysozyme và

khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Streptococus sp. và virus irido gây ra [42]. Cụ thể

là các thông số đáp ứng miễn dịch này ở nhóm thí nghiệm đều cao hơn so với đối

chứng trong suốt thời gian từ 1 đến 4 tuần cho ăn, đạt giá trị cao nhất sau 2 tuần cho ăn và sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa 2 nồng độ cho ăn (105 và 107

cfu/kg) [42].

Trái lại, thí nghiệm của Kumari và Sahoo (2006) khi cho một loài cá trê

Clarias batrachus ăn β-glucan ở nồng độ 0,1 % với thời gian kéo dài khác nhau: 1

tuần, 2 tuần và 3 tuần. Kết quả thí nghiệm cho thấy các chỉ số thực bào, hoạt tính

RB và lysozyme tăng đáng kể sau 1 tuần cho ăn, trong khi tốc độ tăng trƣởng không

có sự sai khác giữa các nghiệm thức. Ngoài ra, khi kéo dài thời gian cho ăn các

thông số miễn dịch không có sự thay đổi [113].

Các kết quả nghiên cứu nêu trên cũng tƣơng đồng với nghiên cứu của chúng

tôi đƣợc thực hiện trên cá mú chấm cam. Tế bào BC ở mô thận ở cá mú chấm cam

có hoạt tính RB cao nhất sau 2 tuần cho ăn β-glucan nồng độ 1000 ppm và hoạt tính

này giảm xuống sau 15 ngày kể từ khi ngừng cho ăn β-glucan, tƣơng ứng với việc

giảm khả năng thực bào trong cùng thời điểm trên.

3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam

Sau 2 tuần cho ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, cá ở các nghiệm thức thí

nghiệm đều khỏe mạnh và hoạt động bình thƣờng. Số cá này đƣợc chọn ngẫu nhiên

để gây nhiễm thực nghiệm bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 nhằm khảo sát

khả năng kháng bệnh của cá thí nghiệm tại 2 thời điểm: Ngày thứ nhất và ngày thứ

15 sau khi ngừng cho ăn β-glucan. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá cảm nhiễm đƣợc

thể hiện qua Hình 3.12:

Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm

nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a) và ngày thứ 15 (b)

Kết quả cảm nhiễm cá mú chấm cam bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus tại

sau khi ngừng cho ăn β-glucan

thời điểm ngay sau khi ngừng ăn β-glucan cho thấy, tỷ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá

thí nghiệm G500, G1000, G2000 thấp hơn so với nhóm đối chứng, với các giá trị

tƣơng ứng lần lƣợt là 29,2; 20,8; 20,8 và 70,8 % (Hình 3.12 a). Kết quả phân tích

kiểm định Chi-test cho thấy sự sai khác có ý nghĩa giữa nhóm thí nghiệm và nhóm

đối chứng (P<0,05), nhƣng tỷ lệ chết giữa các nhóm thí nghiệm ở nồng độ cho ăn

khác nhau lại không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Hệ số bảo vệ RPS của việc cho ăn

bổ sung β-glucan liên tục trong 15 ngày đạt từ 58,8 % (ở nhóm bổ sung 500 ppm) đến

70,6 % (ở nhóm bổ sung nồng độ 1000 ppm và 2000 ppm).

Tuy nhiên, kết quả đợt gây nhiễm thực nghiệm thứ hai ở thời điểm 15 ngày

sau khi ngừng cho ăn β-glucan cho thấy, tỷ lệ chết tích lũy ở nhóm cá thí nghiệm và

nhóm đối chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P> 0,05), với các giá trị lần

lƣợt là 62,5; 58,3; 54,2 và 62,5 % (Hình 3.12 b). Hệ số bảo vệ PRS tính toán ở

nhóm ăn bổ sung β-glucan nồng độ 2000 ppm chỉ còn 13,3 % và ở nồng độ 1000

ppm là 6,7 %.

Sức đề kháng bệnh của cá qua thí nghiệm này thể hiện sự tƣơng đồng với kết

quả khảo sát hoạt động thực bào và hoạt tính hô hấp của tế bào BC đã mô tả ở trên.

Điều này chứng tỏ rằng, β-glucan đã kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá

mú chấm cam, biểu hiện qua sự biến động các thông số miễn dịch bao gồm tăng chỉ

số thực bào, tăng hoạt tính hô hấp, dẫn đến tăng khả năng kháng bệnh đối với vi

khuẩn. Tuy nhiên, tác dụng này chỉ mang tính nhất thời và chỉ duy trì trong thời

gian ngắn. Sau 15 ngày kể từ khi ngừng cho ăn β-glucan, hiệu quả bảo vệ của β-

glucan ở cá mú chấm cam không còn nữa.

Ở nhiều nơi trên thế giới, β-glucan cũng đã đƣợc chứng minh làm tăng khả

năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên một số loài cá nhƣ cá chép ( C.

carpio) [178], cá hồi Đại Tây Dƣơng ( S. salar) [167], cá hồi vân ( O. mykiss) [99], cá

khoang cổ Amphiprion frenatus [11]... Tuy nhiên, nồng độ và thời gian sử dụng β-

glucan có ảnh hƣởng khác nhau đến hiệu quả kháng bệnh ở cá nuôi.

Trong nghiên cứu này, sau 2 tuần liên tục cho ăn β-glucan, hiệu quả kháng bệnh

ở cá mú chấm cam tốt hơn so với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, kết quả ở nhóm cho ăn

với nồng độ cao ( 2000 ppm ) sai khác không có ý nghĩa thống kê so với 2 nồng độ cho

ăn thấp hơn ( 500 ppm và 1000 ppm), và hầu nhƣ không còn hiệu quả bảo vệ sau 15

ngày kể từ khi ngừng cho ăn β-glucan.

Nghiên cứu của Couso et al. (2003) trên cá tráp ( S. auratus) cũng cho thấy

khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae ở các nhóm cá thí

nghiệm ăn β-glucan 1 g/kg tốt hơn so với nhóm ăn 10 g/kg và đều cao hơn so với

nhóm đối chứng. Thậm chí, β-glucan tỏ ra không hiệu quả khi cho ăn kéo dài và lặp

lại (chu kỳ 2 tuần cho ăn bổ sung và 1 tuần không bổ sung β-glucan ) ở các nồng độ

5 và 10 g/kg, kết quả cho thấy tỷ lệ chết cao hơn ở nhóm cá đƣợc cho ăn β-glucan

so với đối chứng khi cảm nhiễm [48].

Hoặc ở cá bơn (S. maximus) khi cho ăn β-glucan kéo dài trong 5 tuần chỉ đem

lại kết quả là gia tăng số lƣợng BC trong máu nhƣng sự kích thích các thông số hệ

miễn dịch tự nhiên không rõ ràng và không có hiệu quả bảo vệ cá chống lại vi

khuẩn V. anguillarum. Kết quả là, tỷ lệ chết tích lũy ở nhóm cho ăn β-glucan và

nhóm đối chứng gần nhƣ nhau với tỷ lệ lần lƣợt là 44 % và 41 % [151].

Xu hƣớng này cũng xảy ra tƣơng tự khi tiêm chất kích thích miễn dịch là

Sodium alginate cho cá mú chấm cam, khả năng thực bào và kháng vi khuẩn V.

alginolyticus của cá thí nghiệm đƣợc tiêm ở nồng độ 20 mg/kg tốt hơn so với 30

mg/kg [38].

Giải thích hiện tƣợng này, các tác giả đều có chung quan điểm là có thể các tế

bào đã quá tải do bị hoạt hóa bởi chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu với liều

lƣợng cao, và cơ thể bị mất nhiều năng lƣợng do quá trình kích thích thực bào trong

thời gian dài. Hơn nữa, việc sử dụng β-glucan trong thời gian dài đã kích thích liên

tục hệ miễn dịch tự nhiên làm cho cơ chế tạo đáp ứng này không còn nhạy ở những

đợt kích thích sau đó nên dẫn đến hiệu quả ngƣợc lại. Vì vậy, tùy theo đối tƣợng cá

nuôi, chỉ nên bổ sung β-glucan vào thức ăn cho cá với liều lƣợng thích hợp, và cho

cá ăn trong khoảng thời gian thích hợp trƣớc khi vận chuyển hoặc trƣớc đợt dịch

bệnh nhằm tăng sức đề kháng của chúng, vừa đảm bảo hiệu quả kinh tế của việc sử

dụng chế phẩm này.

Ngoài ra, hầu hết các công trình đã công bố chỉ tập trung nghiên cứu liều

lƣợng và thời gian cho cá ăn β-glucan thích hợp mà chƣa quan tâm đến thời gian

duy trì hiệu quả bảo vệ của chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu trên cá. Kết

quả nghiên cứu của chúng tôi trên cá mú chấm cam cho thấy β-glucan hầu nhƣ

không còn hiệu quả sau khi ngừng cho ăn 15 ngày. Điều này cũng chƣa thể khẳng

định liệu tác dụng của nó kéo dài đến đâu trong khoảng thời gian 15 ngày sau khi

ngừng cho ăn. Đây cũng là một hƣớng nghiên cứu tiếp theo để có cơ sở khuyến cáo

về thời gian cho ăn thích hợp cũng nhƣ hiểu rõ thời gian duy trì hiệu quả của chất

kích thích miễn dịch này nhằm đem lại hiệu quả sử dụng cho ngƣời nuôi.

Nhƣ vậy, việc sử dụng chất kích thích miễn dịch rõ ràng có tác dụng kích thích

các thông số hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá, từ đó làm tăng khả năng kháng

bệnh. Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ của các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi

thƣờng không cao và mang tính tạm thời. Vì vậy, việc sử dụng vaccine tác động đến

hệ miễn dịch đặc hiệu của cá nhằm tăng hiệu quả cũng nhƣ kéo dài thời gian bảo hộ

trong suốt quá trình nuôi là mục tiêu mang tính chiến lƣợc cho định hƣớng phát

triển nghề nuôi thủy sản ở qui mô công nghiệp.

Trong nghiên cứu này, để tìm hiểu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm

cam, chúng tôi sử dụng vi khuẩn bất hoạt bằng formalin gây miễn dịch cho cá và

khảo sát khả năng sinh kháng thể cũng nhƣ khả năng kháng bệnh của chúng khi tiếp

xúc với tác nhân gây bệnh trong thực nghiệm, kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày ở

phần tiếp theo.

3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus

3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam

Phân tử kháng thể IgM cá mú chấm cam sau khi tinh sạch đƣợc phân tích

protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và phát hiện liên kết đặc hiệu đối với kháng huyết

thanh thỏ bằng kỹ thuật Western Blot, kết quả thể hiện ở Hình 3.13.

H kDa 1 2 3 4 5 97.4 66.2

31.0

21.5

14.4

Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch (IgM) của cá mú chấm cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot (1: Marker; 2, 3: IgM cá mú trên SDS-PAGE; 4, 5: Liên kết giữa IgM cá mú và huyết thanh thỏ kháng IgM cá mú trên Western blot; H: Chuỗi nặng; L: Chuỗi nhẹ)

Hình 3.13 cho thấy phân tử kháng thể IgM của cá mú chấm cam phân tích

bằng kỹ thuật SDS-PAGE có chuỗi nặng và chuỗi nhẹ với khối lƣợng lần lƣợt là 78

kDa và 25 kDa. Ngoài ra, phân tử này còn có một polypeptide ở vị trí chuỗi nhẹ có

khối lƣợng phân tử khoảng 23 kDa. Kết quả phân tích tính đặc hiệu bằng Western

blot cũng thể hiện các vạch liên kết giữa các protein của IgM cá mú với huyết thanh

thỏ tại các vị trí có khối lƣợng phân tử tƣơng tự các chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của

IgM.

Kháng thể IgM đƣợc phát hiện ở hầu hết các loài cá xƣơng, là sản phẩm của

ĐƢMD đặc hiệu bảo vệ cá chống lại các tác nhân gây bệnh mắc phải. Kháng thể

tham gia bảo vệ cơ thể thông qua việc trung hoà hoặc thay đổi hoạt tính độc tố do vi

khuẩn, virus tiết ra; hoặc tạo mạng lƣới ngƣng kết, ngƣng tụ đối với tế bào vi khuẩn,

nấm, ký sinh trùng; hoạt hoá hệ thống bổ thể; opsonin hoá các tế bào vi khuẩn và

virus [157].

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh sự tồn tại của IgM trong huyết

thanh cá xƣơng với khối lƣợng chuỗi nặng trong khoảng 74-79 kDa, và chuỗi nhẹ

trong khoảng 22 đến 25 kDa [161], [208]. Tuy nhiên, ở một số loài cá, ngoài 2

chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, phân tử IgM còn có một số polypeptide khác và đƣợc cho

là các IgM đồng dạng (Isotype IgM). Ví dụ nhƣ ở cá mập (Bài báo không nêu tên

khoa học) có 2 chuỗi nặng có khối lƣợng phân tử là 72 và 56 kDa [73], hoặc ở cá

hồi Đại Tây Dƣơng ( S. salar L.), cá hồi nƣớc ngọt ( S. trutta) và cá đầu cừu

(Archosargus probatocephalus) cũng phát hiện các polypeptide khác trong phân tử

IgM [92], [134], [185]. IgM ở cá hồi có một chuỗi nặng 72 kDa và 2 chuỗi nhẹ 27

và 25 kDa [87]; IgM ở cá nheo có 3 chuỗi nhẹ 22, 24 và 26 kDa [135]; Ở cá mú E.

itaira, Clen (1991) cũng phát hiện một protein có khối lƣợng 50 kDa ngoài các

protein chính đã nêu ở trên [46]. Nghiên cứu của Cheng et al. (2006) trên cá mú

chấm cam E. coioides nuôi tại Đài Loan cho thấy phân tử IgM có khối lƣợng chuỗi

nặng và chuỗi nhẹ lần lƣợt là 78 và 27 kDa [40]. Ngoài ra, tác giả này còn phát hiện

thêm 1 polypeptide có khối lƣợng khoảng 50 kDa trong cấu tạo IgM của loài cá mú

này và cho rằng đây là chuỗi nặng phụ của phân tử IgM.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phân tử IgM cá mú chấm cam nuôi tại

Khánh Hòa cũng có 2 protein chính có khối lƣợng là 78 và 25 kDa, phù hợp với

chuỗi nặng và chuỗi nhẹ IgM của nhiều loài cá xƣơng nêu trên, và thêm 1

polypeptide ở vị trí chuỗi nhẹ có khối lƣợng 23 kDa. Khác với nghiên cứu của

Cheng (2006) cũng trên cùng loài cá mú chấm cam E. coioides nuôi tại Đài Loan,

chuỗi nhẹ là 27 kDa, cao hơn kết quả của chúng tôi, và một chuỗi nặng phụ với 50

kDa. Sự khác biệt này có thể do đặc tính chủng loài ở các vùng phân bố khác nhau.

3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA

Trong cùng điều kiện thí nghiệm, sau khi tiêm vi khuẩn V. parahaemolyticus bất

hoạt bằng formalin, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể của cá mú chấm cam đối

với 4 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus ở các thời điểm 30, 45 và 60 ngày thể

hiện ở Hình 3.14:

Thời gian sau khi gây miễn dịch ( Ngày)

Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch

bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin đƣợc

xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm (Ký tự trên mỗi cột trong

cùng thời điểm chỉ sự khác nhau có ý nghĩa (P< 0,05) với kiểm định Tukey, n=10)

Hình 3.14 cho thấy, ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch, hiệu giá kháng

thể trong huyết thanh cá mú ở các nhóm cá thí nghiệm đều cao hơn có ý nghĩa so

với nhóm cá đối chứng (P<0,05). Trong đó, hiệu giá kháng thể cao nhất đạt đƣợc ở

nhóm tiêm kháng nguyên là chủng V3, tiếp theo là chủng A, kế tiếp là 2 chủng V1

và V2, và thấp nhất ở nhóm đối chứng; với giá trị OD thể hiện sự tƣơng quan thuận

với hàm lƣợng kháng thể trong mẫu lần lƣợt là 0,188 ± 0,004; 0,183 ± 0,005; 0,174

± 0,005; 0,177 ± 0,002 và 0,115 ± 0,001.

Sau 45 ngày gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của cá thí

nghiệm giảm thấp hơn so với thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch. Tuy nhiên,

giữa các nhóm cá đƣợc gây miễn dịch bằng các chủng vi khuẩn khác nhau cũng có

xu hƣớng tƣơng tự nhƣ tại thời điểm 30 ngày. Hiệu giá kháng thể ở các nhóm thí

nghiệm cao hơn có ý nghĩa so với nhóm đối chứng. Trong đó, nhóm cá đƣợc gây

miễn dịch bằng chủng V3 có hiệu giá kháng thể cao nhất. Các giá trị OD thể hiện sự

tƣơng quan hàm lƣợng kháng thể của cá đƣợc gây miễn dịch bằng các chủng V3, A, V1, V2 và ĐC lần lƣợt là 0,151 ± 0,005; 0,146 ± 0,002; 0,139 ± 0,004; 0,141 ±

0,002 và 0,125 ± 0,002.

Ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể của cá ở các

nghiệm thức thí nghiệm và đối chứng đã không còn sai khác có ý nghĩa thống kê

(P>0,05) (Hình 3.14).

Nhƣ vậy, trong 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu, chủng V. parahaemolyticus V3

bất hoạt bằng formalin đã kích thích hệ miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam tạo

kháng thể cao nhất ở các thời điểm thu mẫu 30 và 45 ngày.

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của kháng nguyên vi khuẩn bất hoạt bằng formalin

có bổ sung chất bổ trợ FIA đến khả năng đáp ứng của hệ miễn dịch đặc hiệu của cá

mú chấm cam, chủng V. parahaemolyticus V3 đƣợc chọn lựa làm kháng nguyên

gây miễn dịch cho cá ở nghiên cứu tiếp theo.

3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam

sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng

formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA

Đàn cá mú chấm cam E. coioides (49,8 ± 12,8 g; 14,7 ± 1,3 cm) đƣợc gây

miễn dịch bằng cách tiêm huyền dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 đã bất hoạt

bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA. Sau 30, 45 và 60 ngày tiêm miễn dịch, cá

thí nghiệm đƣợc thu huyết thanh để phân tích kháng thể, đồng thời thử thách với

chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus có độc lực cao (V3) tại thời điểm 30 và 60

ngày sau khi gây miễn dịch. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh

của cá mú chấm cam đã đƣợc xem xét từ kết quả của thí nghiệm này

3.3.3.1. Phát hiện kháng thể ở cá thí nghiệm sau khi gây miễn dịch

Sau khi gây miễn dịch 30, 45 và 60 ngày bằng kháng nguyên vi khuẩn V.

parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA, bằng kỹ

thuật Western Blot theo phƣơng pháp của Towbin et al. (1979) [200], kháng thể

trong huyết thanh của cá thí nghiệm đƣợc phát hiện qua các liên kết đặc hiệu với

protein vi khuẩn V. parahaemolyticus V3, kết quả thể hiện ở Hình 3.15:

Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam Epinephelus

coioides với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật

Western Blot (Cột 1: Marker; Cột 2,3 và 4: Kháng nguyên là vi khuẩn V.

parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin có bổ sung FIA sau 30, 45 và 60 ngày;

Cột 5,6 và 7: Kháng nguyên là vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng

formalin không bổ sung FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột 8: nhóm đối chứng được

tiêm PBS)

Khi đối chiếu với thành phần protein của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus

làm kháng nguyên (Hình 3.15), có thể thấy rằng, bằng kỹ thuật Western Blot, huyết

thanh cá đƣợc gây miễn dịch đều có phản ứng với hầu hết các protein chính của

chủng vi khuẩn này, thể hiện rõ ở các vạch phản ứng liên kết giữa kháng thể với

kháng nguyên trên màng NC có khối lƣợng lần lƣợt là 66, 55, 47, 38, 33, 31, 28, 21,

18 kDa. Trong khi đó, huyết thanh ở nhóm đối chứng không thể hiện các vạch liên

kết đặc hiệu tƣơng ứng. Điều này có nghĩa là cá mú đã tạo đƣợc kháng thể đặc hiệu

với kháng nguyên vi khuẩn bất hoạt tiêm vào.

Kết quả Western blot còn thể hiện nhóm cá đƣợc tiêm kháng nguyên có bổ

sung chất bổ trợ có số lƣợng các vạch liên kết nhiều hơn (cột 2, 3, 4, Hình 3.15) so

với nhóm cá tiêm kháng nguyên không có chất bổ trợ (cột 5,6,7 Hình 3.15) ở cả 3

thời điểm thu mẫu. Kết quả này đã chứng tỏ rằng, chất bổ trợ có tác dụng kích thích

cá mú E. coioides tạo kháng thể với hầu hết các protein có trong thành phần của vi

khuẩn làm kháng nguyên.

Ngoài ra, ở các thời điểm thu mẫu khác nhau, mức độ phản ứng của kháng thể

có trong huyết thanh của cá trong mỗi nhóm cũng cho thấy sự khác nhau rõ rệt. Cụ

thể là, số lƣợng vạch phản ứng thể hiện liên kết giữa kháng thể- kháng nguyên có

xu hƣớng giảm dần từ 30, 45 và 60 ngày sau khi gây miễn dịch.

Với kết quả trên, có thể nói rằng, chủng V3 chứa nhiều loại protein có tính

kháng nguyên cao và có thể lựa chọn để dùng làm nguyên liệu để sản xuất vaccine

phòng bệnh lở loét xuất huyết cho cá mú chấm cam. Hơn nữa, đáp ứng miễn dịch

đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với chủng V3 bất hoạt formalin tăng lên đáng kể

khi kết hợp với chất bổ trợ FIA.

Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Vibrio là một trong những tác nhân gây

bệnh thƣờng gặp nhất ở cá biển. Trong đó, V. parahaemolyticus gây bệnh xuất

huyết lở loét ở nhiều loài cá biển nhƣ cá giò, cá mú [4], [81], [146] và còn là một

tác nhân nguy hiểm gây bệnh viêm ruột ở ngƣời do ăn hải sản sống [44]. Một trong

những yếu tố gây độc của vi khuẩn này là các protein mang các gen độc tố khác

nhau có khả năng kích thích miễn dịch khác nhau ở cá đã đƣợc nhiều tác giả nghiên

cứu [43], [145], [162], [184], [217].

Hầu hết các nghiên cứu về protein độc tố và đặc tính kháng nguyên của vi

khuẩn V. parahaemolyticus cho thấy nhiều điểm tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu

này. Nghiên cứu của Yeung và Boor (2004) cho biết protein có khối lƣợng 21 kDa

ở V. parahaemolyticus là loại protein bền nhiệt gây hoạt tính dung huyết và mang

tính kháng nguyên cao [213]. Sau đó, Zhang và Austin (2005) tìm thấy thêm 2 loại

protein độc tố có khối lƣợng 47,5 và 45,3 kDa trên vi khuẩn này [217].

Gần đây, nghiên cứu của Mao et al. (2007) cho biết 5 loại protein ngoại mạc

(Outer Membrane Protein) ở vi khuẩn V. parahaemolyticus có khối lƣợng lần lƣợt

là 27, 31, 33, 47 và 48 kDa, đây là những protein có tính kháng nguyên cao trong

vai trò kích thích sinh kháng thể kháng bệnh ở cá yellow croaker (Pseudosciaena

crocea)[139]. Nghiên cứu mới đây của Li et al. (2010) trên 3 loài vi khuẩn thƣờng

gây bệnh cho cá mú là V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus, kết quả

chỉ ra rằng cả 3 loài vi khuẩn này đều có 2 loại protein có khối lƣợng 28 và 21 kDa

và đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sinh kháng thể bảo vệ cá mú chấm

cam chống lại bệnh do các tác nhân này gây ra [126].

Trƣớc đó, vaccine tái tổ hợp từ gen mã hóa protein OmpK 28 kDa qua vector

là vi khuẩn Escherichia coli có bổ sung FIA đƣợc thí nghiệm trên cá mú chấm cam.

Sau 28 ngày tiêm, vaccine này đã chứng tỏ hiệu quả kích thích sinh kháng thể ở cá

cao hơn có ý nghĩa so với đối chứng với biểu hiện vạch liên kết kháng nguyên-

kháng thể trên phân tích Western blot và hệ số bảo hộ RPS 100 % khi ngâm gây

nhiễm bằng vi khuẩn độc [125]. Nhóm nghiên cứu này cũng chỉ ra sự tƣơng đồng

về trình tự gen OmpK giữa 3 loài V. harveyi, V. alginolyticus và V.

parahaemolyticus đến 96 % [125]. Trên vi khuẩn V. anguillarum, Hamod et al.

(2012) cũng tìm thấy protein OMP 28 kDa và chứng minh hiệu quả bảo hộ của nó

trên cá chép Labeo rohita đến 67,8 % [79].

Nhìn chung, hầu hết các nghiên cứu cho rằng các loại protein chính có khối

lƣợng phân tử 21, 28, 31, 33, 45, 47, 48 tìm thấy trên vi khuẩn Vibrio đều có khả

năng gây kích thích miễn dịch cao và giới thiệu làm kháng nguyên sản xuất vaccine

phòng bệnh Vibriosis trên cá biển.

Trong nghiên cứu này, ở vi khuẩn V. parahaemolyticus V3, ngoài các protein

có tính kháng nguyên tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu trƣớc đó, huyết thanh cá mú sau

30 ngày gây miễn dịch bằng vi khuẩn này còn thể hiện nhiều vạch phản ứng của các

loại protein có khối lƣợng phân tử khác nhau. Điều này cho thấy V.

parahaemolyticus V3 mang nhiều loại protein có tính kháng nguyên cao và có thể

ứng dụng cho nghiên cứu vaccine tiểu phần phòng bệnh cho cá biển. Tuy nhiên để

có cơ sở khẳng định điều này, việc phân tách các loại protein và nghiên cứu đáp ứng

của chúng trên cá là định hƣớng cho nghiên cứu tiếp theo trong tƣơng lai.

3.3.3.2. Hàm lƣợng kháng thể của cá mú Epinephelus coioides sau khi gây miễn

dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin ở các

thời điểm khác nhau

Cùng với việc kiểm định tính đặc hiệu của kháng thể bằng kỹ thuật Western

Blot nêu trên, hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh cá thí nghiệm vào các thời

điểm 30, 45 và 60 ngày sau khi tiêm kháng nguyên đã đƣợc phân tích bằng kỹ thuật

ELISA gián tiếp. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.16.

Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides sau khi gây miễn dịch bằng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 đã bất hoạt bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm (V3+ FIA: Cá được gây miễn dịch bằng kháng nguyên của chủng V3 có chất bổ trợ FIA; V3: Cá được gây miễn dịch bằng kháng nguyên của chủng V3 không có chất bổ trợ FIA; PBS-C: Cá đối chứng tiêm dung dịch PBS và C: Cá đối chứng không tiêm; Ký tự trên mỗi cột trong cùng thời điểm chỉ sự khác nhau có ý nghĩa (P< 0,05) với kiểm định Tukey, n=10)

Hình 3.16 cho thấy, ở các thời điểm 30 và 45 ngày sau khi gây miễn dịch, hiệu

giá kháng thể trong huyết thanh của các nhóm cá mú tiêm kháng nguyên chủng V3

bất hoạt bằng formalin có bổ sung FIA hoặc không bổ sung FIA đều cao hơn có ý

nghĩa thống kê so với nhóm cá đối chứng (P<0,05). Riêng ở nhóm cá đƣợc tiêm

kháng nguyên có bổ sung FIA, hiệu giá kháng thể trong huyết thanh vẫn duy trì ở

mức cao hơn có ý nghĩa so với nhóm đối chứng sau 60 ngày gây miễn dịch.

Tuy nhiên, khi tiêm kháng nguyên có chất bổ trợ, quá trình kích thích sinh

kháng thể ở cá mú chấm cam mạnh mẽ hơn với hiệu giá kháng thể cao hơn hẳn (P<

0,05) so với nhóm cá tiêm kháng nguyên không bổ sung FIA. Giá trị OD thể hiện

tƣơng quan hiệu giá kháng thể trong huyết thanh ở nhóm cá tiêm có bổ sung FIA so

với nhóm không bổ sung FIA qua các thời điểm thu mẫu 30, 45 và 60 ngày lần lƣợt

là 0,211 ± 0,014; 0,185 ± 0,005; 0,135 ± 0,001 so với 0,177 ± 0,002; 0,148 ± 0,005;

0,118 ± 0,004.

Tƣơng tự với kết quả phát hiện kháng thể bằng Western blot (Hình 3.15), hiệu

giá kháng thể tạo ra ở cá mú chấm cam có xu hƣớng giảm dần sau thời gian gây

miễn dịch 30, 45 và 60 ngày. Đến 60 ngày, hiệu giá kháng thể ở các nhóm đều giảm

thấp, trong đó kháng thể ở nhóm tiêm kháng nguyên không bổ sung FIA (0,118 ±

0,004) gần nhƣ tƣơng đƣơng với chỉ số này ở cả 2 nhóm đối chứng (0,115 ± 0,001

và 0,115 ± 0,002), trong khi đó chỉ số này ở nhóm tiêm có FIA vẫn còn duy trì ở

mức cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) với giá trị OD là 0,135 ± 0,001. Điều

này cũng tƣơng ứng với kết quả ở Hình 3.15, sau 60 ngày gây miễn dịch, nhóm tiêm

có FIA có vạch phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên với số lƣợng nhiều hơn

và rõ hơn so với nhóm không có FIA và nhóm đối chứng.

Nhìn chung, kết quả thể hiện qua Hình 3.15 và 3.16 đã chứng tỏ kháng thể

đƣợc phát hiện trong huyết thanh cá mú chấm cam E. coioides đối với vi khuẩn V.

parahaemolyticus V3 có sự tƣơng đồng với kết quả phân tích hiệu giá kháng thể. Cả

2 hình thức phân tích đều chứng minh kháng nguyên vi khuẩn V. parahaemolyticus

V3 bất hoạt đã kích thích đáp ứng sinh kháng thể ở cá mú chấm cam tăng lên đáng

kể. Trong đó, chất bổ trợ FIA đã thể hiện vai trò hỗ trợ, kích thích sinh kháng thể

mạnh mẽ hơn ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn này. Tuy nhiên, mức độ đáp ứng

có xu hƣớng giảm dần theo thời gian và đến 60 ngày thì hầu nhƣ không có sự khác

biệt, trừ nhóm gây miễn dịch kháng nguyên có bổ sung FIA.

Ở cá biển, nhiều nghiên cứu vaccine chế tạo từ kháng nguyên là vi khuẩn bất

hoạt nguyên tế bào hoặc từ các thành phần của vi khuẩn đều đem lại kích thích sinh

đáp ứng miễn dịch dịch thể ở nhiều loài cá. Tuy nhiên, lƣợng kháng thể sinh ra và

thời gian bảo hộ trên cá không những tùy thuộc vào thành phần kháng nguyên mà

còn liên quan đến phƣơng pháp dẫn truyền và số lần sử dụng vaccine cho cá.

Tƣơng tự với kết quả của nghiên cứu của chúng tôi, nhóm nghiên cứu của Li

et al. (2008) cũng chứng minh hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh cá mú chấm

cam E. coioides giảm dần theo thời gian sau khi tiêm vaccine. Kết quả khảo sát hàm

lƣợng kháng thể tạo ra từ 1 đến 8 tuần sau tiêm vaccine tiểu phần OmpK V. harveyi

có bổ sung FIA đã ghi nhận rằng lƣợng kháng thể tạo ra trong huyết thanh cá đạt giá

trị cao nhất sau khi tiêm vaccine 4 tuần, sau đó lƣợng kháng thể có xu hƣớng giảm

và đến 8 tuần sau khi tiêm thì không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P>0,05) so

với nhóm đối chứng [125].

Ở cá mú E. bruneus cũng có kết quả tƣơng tự, Harikrishnan et al. (2012)

nghiên cứu hiệu quả của vaccine vi khuẩn V. harveyi bất hoạt 0,2 % formalin có bổ

sung chất bổ trợ là Liposomes, kết quả sau khi tiêm 4 tuần cho thấy vaccine có bổ

sung chất bổ trợ đã cho đáp ứng tạo kháng thể tốt hơn nhiều so với vaccine không

có chất bổ trợ [83].

Tuy nhiên, ở cá bơn Nhật Bản ( Paralichthys olivaceus), nghiên cứu của Li et al.

(2005) lại cho thấy hàm lƣợng kháng thể tạo ra sau 30 ngày tiêm vaccine bất hoạt V.

anguillarium bằng formalin 0,15 % không có sự sai khác giữa nhóm có FIA và

không FIA. Nhƣng sau khi tiêm vaccine nhắc lại, cách lần đầu 50 ngày, hàm lƣợng

kháng thể tăng lên và đạt giá trị cao nhất kéo dài trong suốt từ 20 đến 40 ngày sau

mũi tiêm nhắc lại và có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa nhóm có FIA và không

FIA [123].

Cũng trên đối tƣợng cá bơn Nhật Bản ( P. olivaceus), nghiên cứu của Sun et

al. (2011) đã chứng minh vaccine từ V. anguillarum và V. harveyi bất hoạt 1 %

formalin có bổ sung FIA đã tạo đáp ứng sinh kháng thể sau 60 ngày tiêm vaccine và

có sự khác biệt so với nhóm không có FIA và đối chứng. Nghiên cứu này cũng cho

thấy vaccine hỗn hợp 2 loại vi khuẩn này với vi khuẩn Edwardsiella tarda và

Streptococcus iniae đã tạo nên lƣợng kháng thể cao hơn nhiều so với kháng nguyên

riêng rẽ. Từ đó, tác giả cũng đã lý giải về sự tƣơng tác của các kháng nguyên trong

vai trò kích thích sinh miễn dịch và gợi ý cho các nghiên cứu vaccine đa giá

(Multivalent) phòng nhiều bệnh cùng lúc trên đối tƣợng nuôi [190].

Mặc dù các kết quả nghiên cứu trên cho thấy sự khác biệt về thời gian phát

huy của chất bổ trợ FIA trong vai trò hỗ trợ kháng nguyên vi khuẩn kích thích tăng

miễn dịch ở cá, một thực tế không thể bàn cãi là FIA đã chứng tỏ công dụng của nó

trong việc tăng cƣờng khả năng phòng bệnh của vaccine ở cá nuôi.

Chất bổ trợ đã đƣợc sử dụng từ những năm 1920 để tăng cƣờng hiệu quả bảo

vệ cho các loại vaccine ở ngƣời và vật nuôi. Vai trò của chất bổ trợ thể hiện ở 3 khía

cạnh: Thứ nhất, chúng nhƣ là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu qua

trung gian tế bào, hoạt hóa thực bào, kích thích tế bào T, tế bào B sinh kháng thể

[21]. Thứ hai là chúng giữ cho kháng nguyên đƣợc phóng thích từ từ trong cơ thể

vật chủ, kéo dài thời gian tiếp xúc của vật chủ với kháng nguyên và kích thích sinh

kháng thể đặc hiệu trong thời gian dài [96]. Thứ ba, chất bổ trợ đóng vai trò nhƣ là

những xe chuyên chở kháng nguyên đi đến các tổ chức lympho. Trên đƣờng đi, các

kháng nguyên liên tục đƣợc nhận diện, xác lập tính nhớ cho các tế bào trình diện

kháng nguyên, kích thích sinh miễn dịch đặc hiệu ở vật chủ [71].

Chính vì các công dụng trên, hiện nay, trong công nghệ sản xuất vaccine

thƣơng mại, ngƣời ta đã tìm ra nhiều loại chất bổ trợ khác nhau có công dụng tốt

trong vai trò kích thích sinh kháng thể và không để lại tác dụng phụ trên vật chủ

nhƣ β-glucan [177], muối nhôm (Aluminium salt) [189], các hạt kích thƣớc nano

mang điện tích dƣơng (cationic nanoparticles) nhƣ GMDP (N-Acetyl-

glucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine) chiết xuất từ vách tế bào

vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [77]...Đặc biệt, trong công nghệ sản xuất vaccine

cho cá hồi, chất bổ trợ đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và đem lại nhiều thành công cho

nghề nuôi cá hồi ở các nƣớc Bắc Âu [195].

Tóm lại, vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin đã kích

thích cá mú chấm cam sinh kháng thể. Hiệu quả này đƣợc tăng cƣờng và kéo dài

hơn khi kháng nguyên vi khuẩn này đƣợc bổ sung chất bổ trợ FIA với tỷ lệ 1:1

(v/v). Việc lựa chọn các chất bổ trợ để kết hợp với vi khuẩn V. parahaemolyticus

V3 nhằm đem lại hiệu quả kích thích tạo kháng thể cao hơn ở cá cũng cần đƣợc

nghiên cứu thêm khi sản xuất vaccine phòng bệnh do vi khuẩn này gây ra.

3.3.3.4 Khả năng kháng bệnh ở cá mú chấm cam đã đƣợc gây miễn dịch khi công

cƣờng độc bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3

a. Khả năng kháng bệnh của cá ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch

Sau khi gây miễn dịch 30 ngày, 20 cá thể ở mỗi nghiệm thức (10 con/bể) đƣợc

công cƣờng độc bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3, kết quả theo dõi quá trình phát

sinh bệnh và tỷ lệ chết tích lũy sau 10 ngày thí nghiệm đƣợc thể hiện ở Hình 3.17.

Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công

cƣờng độc ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch (V3+FIA: kháng nguyên

bổ sung FIA; V3: kháng nguyên không có FIA; PBS-C: đối chứng tiêm PBS; C: đối

chứng không tiêm)

Hình 3.17 cho thấy, sau 30 ngày gây miễn dịch, cá mú chấm cam đƣợc gây

nhiễm thực nghiệm bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3, tỷ lệ chết tích lũy của cá thí nghiệm khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ( χ2, P<0,05).

Nhóm gây miễn dịch bằng vi khuẩn bất hoạt có bổ sung FIA (V3+FIA) có tỷ lệ chết

tích lũy thấp nhất (10 %), trong khi tỷ lệ này ở nhóm không bổ sung FIA là 40 % và

tỷ lệ chết tích lũy cao nhất ở 2 nhóm đối chứng PBS-C và C với tỷ lệ lần lƣợt đến

70 % và 90 %.

b. Khả năng kháng bệnh của cá ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch

Ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch, cá mú chấm cam bị công cƣờng

độc bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3. Kết quả theo dõi quá trình phát sinh

bệnh và tỷ lệ chết tích lũy sau 10 ngày thí nghiệm đƣợc thể hiện ở Hình 3.18:

Hình 3.18: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công

cƣờng độc ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch (V3+FIA: kháng nguyên

bổ sung FIA; V3: kháng nguyên không có FIA; PBS-C: đối chứng tiêm PBS; C: đối

chứng không tiêm)

Tƣơng tự nhƣ đợt công cƣờng độc 30 ngày sau khi gây miễn dịch, kết quả thể

hiện ở Hình 3.18 cho thấy nhóm cá đƣợc gây miễn dịch bằng kháng nguyên có FIA

có tỷ lệ chết tích lũy thấp nhất (41,2 %), tiếp đến là nhóm cá đƣợc gây miễn dịch

bằng kháng nguyên không bổ sung FIA ( 62,4 %) và cao nhất ở 2 nhóm cá đối

chứng, với tỷ lệ chết 65 % và 75 %. So sánh giữa 2 đợt công cƣờng độc thì tỷ lệ

chết tích lũy của nhóm cá thí nghiệm ở 30 ngày sau khi gây miễn dịch thấp hơn so

với tỷ lệ này ở đợt thí nghiệm sau 60 ngày.

Kết quả tính toán hệ số bảo hộ (RPS) của kháng nguyên vi khuẩn V.

parahaemolyticus V3 bất hoạt qua 2 đợt công cƣờng độc thể hiện ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

bất hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides

Thời điểm cảm Tỷ lệ chết tích lũy Hệ số bảo hộ (%)

nhiễm sau khi gây (%)

miễn dịch (Ngày) V3+FIA V3 PBS-C C V3+FIA V3

30 10,0 40,0 70,0 90,0 87,5 50,0

60 41,2 62,4 65,0 75,0 41,1 10,9

Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy nhóm cá tiêm kháng nguyên có bổ sung chất bổ

trợ FIA có khả năng kháng bệnh tốt hơn so với nhóm cá tiêm kháng nguyên không

bổ sung chất bổ trợ. Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ của kháng nguyên giảm dần theo

thời gian nếu không đƣợc tiêm nhắc lại. Cụ thể, hệ số bảo hộ (RPS %) của kháng

nguyên có chất bổ trợ sau 30 ngày là 87,5 % và giảm còn 41,1 % sau 60 ngày,

tƣơng tự kháng nguyên không bổ sung FIA có RPS sau 30 ngày là 50 % và giảm

còn 10,9 % sau 60 ngày (gần nhƣ không còn tác dụng bảo hộ).

Theo Ellis (1988), vaccine có hệ số bảo hộ RPS ≥ 60 % mới đƣợc cho là có

khả năng bảo hộ tốt cho cá đối với tác nhân gây bệnh [60]. Nhƣ vậy, theo kết quả

nghiên cứu này, kháng nguyên có bổ sung FIA chứng tỏ có khả năng bảo hộ tốt cho

cá kéo dài đến 30 ngày. Sau 60 ngày thì hầu nhƣ kháng nguyên không còn khả năng

bảo hộ cho cá nếu không đƣợc tiêm nhắc lại.

Kết quả này cũng phù hợp với vaccine của nhiều loại kháng nguyên khác. Kết

quả nghiên cứu của Mao et al. (2007) khi tiêm vaccine bất hoạt 0,5 % formalin từ tế

bào vi khuẩn V. parahaemolyticus cho một loài cá biển nuôi phổ biến ở Trung Quốc

100

(Pseudosciaena crocea) đạt hệ số bảo hộ RPS cao nhất đến 90% sau khi tiêm

vaccine 4 tuần [139].

Vaccine bất hoạt V. anguillarum bằng formalin 0,15 % có bổ sung FIA đã

chứng tỏ khả năng kháng bệnh của cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) đối với

V. anguillarum và V. parahaemolyticus với hệ số RPS lần lƣợt là 87,5 % và 53,9 %

[123]. Cũng ở loài cá này, sau 60 ngày gây miễn dịch bằng hai loại vaccine đơn giá

từ vi khuẩn V. anguillarum và V. harveyi bất hoạt nguyên tế bào bằng formalin 1 %

có bổ sung FIA, hiệu quả bảo vệ lần lƣợt là 49 % và 53,9 % [190]. Kết quả này cũng

tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu trên cá mú của chúng tôi, hệ số bảo hộ sau 60

ngày tiêm đã giảm đáng kể và không còn khả năng bảo hộ, ngay cả ở nhóm tiêm

kháng nguyên có bổ sung FIA.

Trên cá mú E. bruneus, nhóm nghiên cứu Harikrisnan et al. (2012) cho thấy hệ

số bảo hộ của vaccine bất hoạt từ vi khuẩn V. harveyi đạt 61,1 %. Ở nghiên cứu này,

cá thí nghiệm đã phải tiêm vaccine nhắc lại đến 3 lần (2 tuần/lần) và ít nhiều cũng

gây ảnh hƣởng đến sức khỏe cá [83].

Ngoài ra, các loại vaccine tái tổ hợp từ các thành phần vi khuẩn cũng cho kết

quả bảo hộ tốt trên cá mú. Nghiên cứu của Li et al. (2008) cho thấy vaccine tiểu phần

OpmK (1 mg/mL) tách chiết từ vi khuẩn V. harveyi có bổ sung FIA cho hệ số bảo

hộ ở cá mú chấm cam E. coiodes đến 100 % sau 28 ngày tiêm. Điều đáng lƣu ý

trong nghiên cứu này là protein OpmK cũng có mặt trong vi khuẩn V.

parahaemolyticus với độ tƣơng đồng trình tự gen đến 96 % [125]. Cũng cùng đối

tƣợng nghiên cứu là cá mú chấm cam, tuy nhiên, kết quả này cho thấy hệ số RPS

cao hơn so với kết quả của nghiên cứu của chúng tôi. Điều này chứng tỏ độ tinh

sạch của kháng nguyên có ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả của vaccine trong vai trò

phòng bệnh.

Một loại vaccine DNA khác cũng đƣợc tái tổ hợp từ thành phần của vi khuẩn

V. parahaemolyticus, sau 4 tuần tiêm 0,1 mL vaccine DNA pEGFP-N1/m- vps nồng

độ 10 và 50 μg cho cá bơn Scophthalmus maximus đã cho hệ số bảo hộ đối với vi

khuẩn V. parahaemolyticus với giá trị RPS lần lƣợt là 80,6 % và 96,1 % [133]. Nhƣ

101

vậy, có thể nói rằng, nồng độ của kháng nguyên đã ảnh hƣởng đến hiệu quả bảo hộ

của vaccine trên cá.

Phƣơng pháp sử dụng vaccine cũng ảnh hƣởng tới khả năng bảo hộ của chúng

trên cá. Zhou et al. (2002) tiến hành so sánh 3 phƣơng pháp sử dụng vaccine bất

hoạt từ V. alginolyticus trên cá mú E. awoara (khối lƣợng 10,9 ± 2.3 cm): ngâm

thông thƣờng, ngâm kết hợp sóng siêu âm và tiêm. Kết quả cho thấy phƣơng pháp

ngâm kết hợp sóng siêu âm có hiệu quả tƣơng đƣơng với phƣơng pháp tiêm với hệ

số RPS đều đạt hơn 90 % sau 4 và 8 tuần, sai khác có ý nghĩa thống kê so với nhóm

cá sử dụng phƣơng pháp ngâm thông thƣờng [218].

Nhìn chung, khả năng đáp ứng miễn dịch không những phụ thuộc vào nhiều

yếu tố nhƣ vật chủ (đặc điểm loài, kích thƣớc, tuổi, giai đoạn phát triển), kháng

nguyên (thành phần, nồng độ, phƣơng pháp điều chế), phƣơng thức dẫn truyền

(tiêm, ngâm, cho ăn); mà còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố môi trƣờng. Chính vì

thế, khi phân tích so sánh với các nghiên cứu trên các loài cá khác nhau hay các loại

kháng nguyên khác nhau, mặc dù có nhiều điểm tƣơng đồng nhƣng kết quả nghiên

cứu của chúng tôi cũng có một số điểm khác biệt.

Kết quả nghiên cứu này đã khẳng định vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất

hoạt bằng formalin đã kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam E.

coioides, đồng thời cũng gợi mở hƣớng nghiên cứu tiếp theo về các thành phần

mang tính kháng nguyên của vi khuẩn, định hƣớng cho nghiên cứu sản xuất vaccine

DNA hay vaccine tiểu phần từ vi khuẩn này để phòng bệnh Vibriosis trên cá biển.

102

CHƢƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

Kết luận

1. Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 có đặc điểm hình thái, sinh lý,

sinh hóa tƣơng tự với chủng chuẩn ATCC 17802 và gây bệnh xuất huyết lở loét cho

cá mú chấm cam E. coioides trong điều kiện thí nghiệm với các biểu hiện bệnh tƣơng tự nhƣ trong tự nhiên, với liều gây chết 50 % (LD50) là 1,78 x 103 cfu/g.

2. Thành phần protein của vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 gồm các protein

có khối lƣợng phân tử trong khoảng từ 97,4 đến thấp hơn 14,4 kDa. Trong đó, các

protein có khối lƣợng 66, 47, 31, 28, 21 kDa có tính sinh miễn dịch cao, có ý nghĩa

ứng dụng trong sản xuất vaccine tiểu phần.

3. Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá mú chấm cam E.

coioides tăng lên sau khi đƣợc ăn thức ăn có bổ sung β-glucan ở các mức 500, 1000

và 2000 ppm trong 2 tuần, thể hiện ở sự gia tăng số lƣợng tế bào bạch cầu tham gia

thực bào trong máu, chỉ số thực bào và hoạt tính RB của tế bào BC phân lập từ tiền

thận. Trong đó, liều bổ sung β-glucan 1000 ppm vào thức ăn mang lại hiệu quả cao

nhất. Tuy nhiên, các thông số đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và hiệu quả bảo vệ

kháng lại V. parahaemolyticus ở cá thí nghiệm đều suy giảm và không có sự sai

khác so với nhóm cá đối chứng khi kiểm tra vào ngày thứ 15 sau khi ngừng cho ăn

thức ăn bổ sung β-glucan.

4. Cá mú chấm cam E. coioides sau khi gây miễn dịch bằng 4 chủng vi khuẩn

V. parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin đều có biểu hiện tăng hàm lƣợng kháng

thể trong huyết thanh. Trong đó, chủng V3 có khả năng kích thích cá mú chấm cam

sinh kháng thể mạnh nhất.

5. Kháng nguyên vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin kết

hợp chất bổ trợ FIA đã kích thích cá mú E. coioides sinh kháng thể đặc hiệu cao

hơn có ý nghĩa so với nhóm cá đƣợc tiêm kháng nguyên không bổ sung FIA và cá

đối chứng sau 30 và 45 ngày tiêm gây miễn dịch (P < 0,05). Xu thế này tƣơng ứng

với số lƣợng vạch phản ứng kháng nguyên-kháng thể ở nhóm cá tiêm kháng nguyên

có FIA nhiều hơn so với nhóm cá tiêm kháng nguyên không có FIA và đối chứng ở

103

2 thời điểm trên. Tuy nhiên, hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh của cá thí

nghiệm giảm và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức sau 60 ngày tiêm gây

miễn dịch.

6. Kháng nguyên từ vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin

có bổ sung FIA tạo hiệu quả bảo vệ cá mú E. coioides kháng bệnh do vi khuẩn này

gây ra khi công cƣờng độc ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch với giá trị RPS

là 87,5 %. Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ này suy giảm sau 60 ngày gây miễn dịch.

7. Đơn vị cấu trúc phân tử kháng thể IgM của cá mú chấm cam E. coioides gồm

một chuỗi nặng 78 kDa và một chuỗi nhẹ 25 kDa, ngoài ra, còn có một polypeptide

có khối lƣợng 23 kDa hiện chƣa rõ vai trò của nó trong cấu trúc phân tử này.

Đề xuất ý kiến

1. β-glucan bổ sung vào thức ăn có tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch

không đặc hiệu ở cá mú E. coioides sau khi ăn liên tục trong 2 tuần. Tuy nhiên, hiệu

quả này giảm mạnh sau 15 ngày ngừng cho ăn. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu xác

định thời gian cho ăn bổ sung β-glucan thích hợp cũng nhƣ thời gian duy trì tác

dụng của nó trên cá sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc đƣa ra khuyến cáo về

việc sử dụng β-glucan hiệu quả và ít tốn kém nhất cho ngƣời nuôi.

2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá E. coioides đối với vi khuẩn V.

parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA chỉ hiệu quả

đến ngày thứ 45 sau khi gây miễn dịch và suy giảm sau 60 ngày gây miễn dịch. Do

vậy, nghiên cứu thêm về nồng độ kháng nguyên, các chất bổ trợ khác nhau và cỡ cá

gây miễn dịch thích hợp nhằm kéo dài hiệu quả bảo vệ của vaccine trên cá mú.

3. Trong thành phần phân tử kháng thể IgM cá mú E. coioides, ngoài 2 chuỗi

nặng và chuỗi nhẹ là 78 và 25 kDa thì còn có 1 polypeptide 23 kDa ở vị trí chuỗi

nhẹ. Nghiên cứu về cấu trúc phân tử của các chuỗi polypeptide để có cơ sở khẳng

định vai trò của nó trong phân tử IgM góp phần làm rõ đặc điểm kháng thể IgM của

cá mú.

4. Đối với vi khuẩn có độc lực cao là V. parahaemolyticus V3, cần tiếp tục

nghiên cứu về gen độc tố và khảo sát hoạt tính sinh miễn dịch của các protein chính để

làm cơ sở cho sản xuất vaccine tiểu phần trên cá mú.

104

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Dƣơng Vân Anh, Vũ Thị Thu Hƣơng, Lê Lƣu Phƣơng Hạnh, Đinh Thị Cao

Khanh và Nguyễn Quốc Bình (2011), Tái cấu trúc và tinh sạch protein màng

ngoài tái tổ hợp OpmA và OpmN của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri biểu hiện

trong E. coli ở dạng thể vùi, Kỷ yếu Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc,

Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thủy sản, tr. 105.

2. Lƣu Thị Dung và Phạm Quốc Hùng (2005), Mô phôi học Thủy sản, NXB

Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.

3. Từ Thanh Dung (2011), Thử nghiệm văcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá

tra nuôi thâm canh, Tạp chí thƣơng mại thủy sản, truy cập ngày 29-5-2013, tại

trang web http://vietfish.org/thu-nghiem-vacxin-phong-benh-gan-than-mu-

cho-ca-tra-nuoi-tham-canh.htm.

4. Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004),

Bệnh học thuỷ sản, NXB Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, 423 trang.

5. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út và Nguyễn

Thị Nguyệt Huệ (2008), "Các loại bệnh thƣờng gặp trên các biển nuôi ở

Khánh Hòa", Tạp chí khoa học công nghệ thủy sản, Trƣờng Đại học Nha

Trang, 2, tr. 16-24.

6. Vũ Thị Thanh Hƣơng, Bùi Thị Thanh Tịnh và Nguyễn Quốc Bình (2011), Tạo

chủng Edwardsilla ictaluri nhƣợc độc bằng cách chọn trên môi trƣờng kháng

sinh rifampicin nhằm ngăn ngừa bệnh gan thận mủ trên cá tra, Kỷ yếu Hội

nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5:

Công nghệ sinh học Thủy sản, tr. 108.

7. Võ Văn Nha (2011), Đặc điểm sinh học vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột

biến gen PurA dùng làm vaccin phòng bệnh gan thận mủ cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus), Kỷ yếu Hội nghị công nghệ sinh học toàn

quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thủy sản, tr.

113.

105

8. Bùi Quang Tề (2007), Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến đối với cá Mú,

cá Giò nuôi và đề xuất các giải pháp phòng trị bệnh, Bản tin số 33, 5/2007,

Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I.

9. Bùi Quang Tề và ctv (1998), Chẩn đoán và phòng trị một số bệnh truyền

nhiễm ở cá nuôi lồng và thủy đặc sản, Báo cáo đề tài khoa học, Viện Nghiên

cứu nuôi trồng thủy sản I, Bộ thủy sản, Hà Nội.

10. Nguyễn Nhật Thi (1991), Cá biển Việt Nam, Cá xƣơng vịnh Bắc Bộ, NXB

Khoa học - Kỹ thuật, Hà Nội.

11. Nguyễn Thị Thanh Thủy và Nguyễn Hoàng Yến (2009), "Hiệu quả của beta-

1,3/1,6 glucan lên tỷ lệ sống và sức đề kháng với Vibrio alginolyticus của cá

khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus (Brevoort, 1856)", Tạp chí Khoa học và

Công nghệ biển, 2, tr. 71-80.

12. Vũ Dũng Tiến (2005), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá tr m cỏ

(Ctenopharyngodon idellus C. V.) nuôi tại khu vực Hà Nội đối với vi khuẩn

Aeromonas hydrophila, Luận án tiến sĩ Nông nghiệpTrƣờng Đại học thủy sản,

TP. Nha Trang.

13. Lê Anh Tuấn (2004), "Tình hình nuôi cá mú ở Việt Nam: hiện trạng và các trở

ngại về mặt kỹ thuật", Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Trƣờng Đại

học Nha Trang, số đặc biệt/2004, tr. 174-179.

14. Phan Thị Vân (2006), Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến đối với cá mú,

cá giò nuôi và đề xuất các giải pháp phòng trị, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng

thủy sản I, Bộ thủy sản. Hà Nội.

15. Lê Xân (2005), "Kỹ thuật ƣơng cá hƣơng lên cá giống ba loài cá biển: cá song

chấm cam (Epinephelus coioides), cá giò (Rachycentron canadum) và cá hồng

Mỹ (Scyaenops ocellatus)", Tạp chí thủy sản, 8/2005, tr. 24-30.

TIẾNG ANH

16. Aakre, R., Wergeland, H.I., Aasjord, P.M. and Endresen, C. (1994),

"Enhanced antibody response in Atlantic salmon (Salmo salar L.) to

Aeromonas salmonicida cell wall antigens using a bacterin containing beta-

1,3-M- Glucan as adjuvant", Fish Shellfish Immunol., 4, pp. 47-61.

106

17. Afonso, A., Lousada, S., Silva, J., Ellis, A.E. and Silva, M.T. (1998),

"Neutrophil and macrophage responses to inflammation in the peritoneal

cavity of rain-bow trout Oncorhynchus mykiss. A light and electron

microscopic cytochemical study", Dis. Aquat. Org., pp. 27-37.

18. Ainsworth, A.J. (1992), "Fish granulocytes: Morphology, distribution and

function", Annual Rev. of Fish Diseases, pp. 123-148.

19. Akinbowale, O.L., Peng, H. and Barton, M.D. (2006), "Antimicrobial

resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia", J Appl.

Microbiol., 100, pp. 1103-1113.

20. Alcaide, E., Amaro, C., Todoli, R. and Oltra, R. (1999), "Isolation and

characterization of Vibrio parahaemolyticus causing infection in Iberian

toothcarp Aphanius iberus", Dis Aquat Org., 35, pp. 77-80.

21. Alexander, J. and Brewer, J.M. (1995), "Adjuvants and their modes of action",

Livestock Prod. Sci., 42, pp. 153-162.

22. Alsina, M. and Blanch, A.R. (1994), "Improvement and Update of A Set of

Keys for Biochemical-Identification of Vibrio Species", Journal of Applied

Bacteriology, 77, pp. 719-721.

23. Altmann, S.M., Mellon, M.T., Distel, D.L. and Kim, C.H. (2003), "Molecular

and functional analysis of an interferon gene from the zebrafish, Danio rerio",

Journal of Virology, 77, pp. 1992-2002.

24. Aranishi, F. and Mano, N. (2000), "Antibacterial cathepsins in different types

of ambicoloured Japanese flounder skin", Fish Shellfish Immunol., 10, pp. 87-

89.

25. Arison, G.J. (1996), "Lectins as defense molecules in vertebrates and

invertebrates", Fish Shellfish Immunol., 6, pp. 277-289.

26. Austin, B. and Austin, D. A (2007), Vibrios, Bacterial Fish

Pathogens:Diseases in Farmed and Wild Fish, Austin, B. and Austin, D. A.

eds., Praxis Publishing Ltd, Chichester, UK, p. 594.

107

27. Austin, B. and Austin, D.A. (1987), Vibrios, Bacterial Fish Pathogens:

Disease in Farmed and Wild Fish, Austin, B. and Austin, D.A. eds., Ellis

Horwood Limited, Chichester, England, pp. 263-287.

28. Bagni, M., Romano, N., Finoia, M.G., Abelli, L., Scapigliati, G., Tiscar, P.G.,

Sarti, M. and Marino, G. (2005), "Short and long term effects of a dietary

yeast β-glucan (Macrogard) and alginic acid (Ergosan) preparation on immune

response in sea bass (Dicentrarchus labrax)", Fish Shellfish Immunol., 18, pp.

311-325.

29. Begot, C., Desnier, I., Daudin, J.D., Labadie, J.C. and Lebert, A. (1996),

"Recommendations for calculating growth parameters by optical density

measurements", Journal of Microbiological Methods, 25, pp. 225-232.

30. Bird, S., Zou, J., Kono, T., Sakai, M., Dijkstra, J.M. and Secombes, C. (2004),

"Characterisation and expression analysis of interleukin 2 (IL-2) and IL-21

homologues in the Japanese pufferfish, Fugu rubripes, following their

discovery by synteny", Immunogenetics, 56, pp. 909 - 923.

31. Bly, J.E., Quiniou, S.M-A. and Clem, L.W. (1997), Environmental effects on

fish immune mechanisms, Fish vaccinology, Gudding, R., et al. eds., Karger.

Basel.

32. Bowden, T.J., Cook, P. and Rombout, J.H.W.M. (2005), "Development and

function of the thymus in teleosts", Fish Shellfish Immunol., 19, pp. 413-427.

33. Burgos-Aceves, M.A., Campos-Ramos, R. and Guerrero-Tortolero, D.A.

(2010), "Description of peripheral blood cells and differential blood analysis

of captive female and male leopard grouper Mycteroperca rosacea as an

approach for diagnosing diseases", Fish Physiol Biochem., 36, pp. 1263-1269.

34. Busch, R. A. (1997), "Polyvalent vaccines in fish: The interactive effects of

multiple antigens", Dev. Biol. Stand., 90, pp. 245–256.

35. Chao, G., Jiao, X., Zhou, X., Yang, Z., Huang, J., Zhou, L. and Qian, X.

(2009), "Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio

parahaemolyticus isolated from different sources in coastal province Jiangsu,

China", Food Control, 20, pp. 907-912.

108

36. Chaves-Pozo, E. , Munoz, P. , Lopez-Munoz, A., Pelegrın, P., Garcıa, A. and

Mulero, V. (2005), "Early innate immune response and distribution of

inflammatory cells in the bony fish gilthead seabream experimentally infected

with Vibrio anguillarum", Cell and Tissue Research, 320, pp. 61- 68.

37. Chen, Y. M. , Su, Y. L. , Lin, J. H. , Yang, H. L. and Chen, T. Y. (2006),

"Cloning of an orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) Mx DNA and

characterization of its expression in response to nodavirus", Fish Shellfish

Immunol., 20, pp. 58-71.

38. Cheng, A. C., Tu, C.W, Chen, Y.Y., Nan, F.H. and Chen, J.C. (2007), "The

immunostimulatory effects of sodium alginate and k-carrageenan on orange-

spotted grouper Epinephelus coicoides and its resistance against Vibrio

alginolyticus", Fish Shellfish Immunol., 22, pp. 197-205.

39. Cheng, A.C., Chen, Y.Y. and Chen, J.C. (2008), "Dietary administration of

sodium alginate and κ -carrageenan enhances the immune response of brown-

marbled grouper Epinephelus fuscoguttatus and its resistance against Vibrio

alginolyticus", Vet . Immunol. Immunopathol., 121, pp. 206– 215.

40. Cheng, C. A., John, J. A. C. , Wu, M. S. , Lee, C. Y., Lin, C. H. , Lin, C. H.

and Chang, C. Y. (2006), "Characterization of serum immunoglobulin M of

grouper and cDNA cloning of its heavy chain", Vet. Immunol. Immunopathol.,

109, pp. 255–265.

41. Chistiakov, A.D., Hellemans, B. and Volckaert, F.A.M. (2007), "Review on

the immunology of European sea bass Dicentrarchus labrax", Vet . Immunol.

Immunopathol., 117, pp. 1-16.

42. Chiu, C.H., Cheng, C.H., Gua, W.R., Guu, Y.K and Cheng, W. (2010),

"Dietary administration of the probiotic, Saccharomyces cerevisiae P13,

enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the

grouper, Epinephelus coioides", Fish Shellfish Immunol., 29, pp. 1053-1059.

43. Chiu, T. H., Duan, J. and Su, Y. C. (2007), "Characteristics of virulent Vibrio

parahaemolyticus isolated from Oregon and Washington", J. Food Prot.,

70(4), pp. 1011-1016.

109

44. Christopher, A. B., Thomas, J. C. and Kim, O. (2011), "Vibrio

parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants", Microbes and

Infection, 13, pp. 992-1001.

45. Clark, J.S., Tangtrongpiros, J. and Chansue, N. (2010), "Establishing safety

and efficacy of an injectable form of a Vibrio vaccine for the orange-spotted

grouper", Aquaculture Asia Pacific Magazine, pp. 30-33.

46. Clem, L.W. (1991), "Phylogeny of immunoglobulin structure and function", J.

Biol. Chem., 246(1), pp. 9–15.

47. Corbeil, S., LaPatra, S. E. , Anderson, E. D. and Kurath, G. (2000),

"Nanogram quantities of a DNA vaccine protect rainbow trout fry against

heterologous strains of infectious hematopoietic necrosis virus.", Vaccine, 18,

pp. 2817–2824.

48. Couso, N., Castro, R., Magarinos, B., Obach, A. and Lamas, J. (2003), "Effect

of oral administration of glucans on the resistance of gilthead seabream to

Pasteurellosis", Aquaculture, 219, pp. 99-109.

49. Cruz-Lacierda, E. R., Toledo, J. D. , Tan-Fermin, J. D. and Burreson, E. M.

(2000), "Marine leech (Zeylanicobdella arugamensis) infection in cultured

orange-spotted grouper, Epinephelus coioides", Aquaculture, 185, pp. 191-

196.

50. Cruz-Lacierda, E.R., Lester, R.J.G., Eusebio, P.S., Marcial, H.S. and Pedrajas,

S.A. (2001), "Occurrence and histopathogenesis of a didymozoid trematode

(Gonapodasmius epinepheli) in pond-reared orange-spotted grouper,

Epinephelus coioides", Aquaculture, 201, pp. 211-217.

51. Cuesta, A., Angeles Esteban, M. and Meseguer, J. (2006), "Cloning,

distribution and up-regulation of the teleost fish MHC class II alpha suggests a

role for granulocytes as antigen-presenting cells", Molecular Immunology, 43,

pp. 1275 - 1285.

52. Cuesta, A., Esteban, M.A. and Meseguer, J. (2002), "Natural cytotoxic activity

in seabream (Sparus aurata L.) and its modulation by vitamin C", Fish

Shellfish Immunol., 13, pp. 97-109.

110

53. Cui, H., Yan, Y. , Wei, J. , Huang, X. , Huang, Y. , Ouyang, Z. and Qin, Q.

(2011), "Identification and functional characterization of an interferon

regulatory factor 7-like (IRF7-like) gene from orange-spotted grouper,

Epinephelus coioides", Dev. Comp. Immunol., 35, pp. 672 – 684.

54. Dalgaard, P., Ross, T., Kamperman, L., Neumeyer, K. and McMeekin, T.

(1994), "Estimation of bacterial growth rates from turbidimetric and viable

count data", International Journal of Food Microbiology, 23, pp. 391-404.

55. Danayadol, Y. (1999), Disease of grouper (Epinephelus coioides) cultured in

Thailand, The APEC/NACA Workshop on Grouper Research and

Development, eds. Hat Yai, Thailand.

56. DePaola, A., Ulaszek, J., Kaysner, C.A., Tenge, B.J., Nordstrom, J.L., Wells,

J., Puhr, N. and Gendel, S.M. (2003), "Molecular, serological, and virulence

characteristics of Vibrio parahaemolyticus isolated from environmental, food,

and clinical sources in North America and Asia.", Appl. Environ. Microbiol.,

69(7), pp. 3999-4005.

57. Duff, D.C.B. (1942), "The oral immunization of trout against Bacterium

salmonicida. ", Journal Immunology, 44, pp. 87-94.

58. Elcombe, B.M., Chang, R.J., Taves, C.J. and Winkelhake, J.L. (1985),

"Evolution of antibody structure and effector functions: Comparative

hemolytic activities of monomeric and tetra-meric IgM from rainbow trout,

Salmo gairdnerii", Comparative Biochemistry and Physiology, 80, pp. 697-

706.

59. Elesen, N.J. and Vestegard Jorgensen, P.E. (1986), "Quatification of serum

immunoglobin in rainbow trout Salmo gairdneri under various environmental

conditions", Dis. Aquat. Org., 1, pp. 183-191.

60. Ellis, A. E. (1988), General principles of fish vaccination, Academic Press

Limited, London, 119 p.

61. Ellis, A. E. (2002), Health and disease in Atlantic salmon farming, Handbook

of Salmon Farming, eds. Stead, S. M. and Laird, L. M., Springer Praxis,

Chichester, pp. 373–401.

111

62. Ellis, A.E. (1976), "Leucocytes and related cells in the plaice Pleuronectes

platessa", J Fish Biol., 8, pp. 143-156.

63. Ellis, A.E. (1998), Fish vaccination, Harcourt Brace Jovanovich Publishers,

London, 255 p.

64. Ellis, A.E. (2001), "Innate host defense mechanisms of fish against viruses and

bacteria", Dev. Comp. Immunol., 25, pp. 827 - 839.

65. Engstad, R. E. and Robertsen, B. (1993), "Recognition of yeast wall glucan

by Atlantic salmon (Salmo salar L.) macrophages", Dev. Comp. Immunol.,

17, pp. 319-330.

66. Esteban, M.A., Cuesta, A., Ortuno, J. and Meseguer, J. (2001),

"Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin on gilthead seabream

(Sparus aurata L.) innate immune system", Fish Shellfish Immunol., 11, pp.

303-315.

67. Evans, D.L., Leary, J.H. and Jaso-Friedmann, L. (2001), "Nonspecific

cytotoxic cells and innate immunity: Regulation by programmed cell death",

Dev. Comp. Immunol., 25, pp. 791 - 805.

68. FAO, accessed 28/05/2012, from

http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Epinephelus coioides

69. FAO, accessed 28/05/2012, from http://www.fao.org/fi/statist/FSOFT/FISHPLUS.

70. Fischer, U., Utke, K., Somamoto, T., Kollner, B., Ototake, M. and Nakanishi,

T. (2006), "Cytotoxic activities of fish leucocytes", Fish Shellfish Immunol.,

20, pp. 209–226.

71. Fodey, Terence L., Delahaut, Philippe, Charlier, Caroline and Elliott,

Christopher T. (2008), "Comparison of three adjuvants used to produce

polyclonal antibodies to veterinary drugs", Vet. Immunol. Immunopathol., 122,

pp. 25-34.

72. Frøystad, M.K., Rode, M., Berg, T. and Gjøen, T. (1998), "A role for

scavenger receptors in phagocytosis of protein-coated particles in rainbow

trout head kidney macrophages", Dev. Comp. Immunol., 22, pp. 533- 549.

112

73. Fuller, L., Murray, J. and Jensen, J.A. (1978), "Isolation from nurse shark

serum of immune 7S antibodies with two different molecular weight H-

chains", Immunochemistry, 15(4), pp. 251–259.

74. Gomez-Gil, B., Fajer-Avila, E. and Garcia- Vargas, F. (2007), "Vibrios of the

spotted rose snapper Lutjanus guttatus Steindachner, 1869 from Northwestern

Mexico". J Fish Dis., 102, pp. 1518-1526.

75. Grandcourt, E.M., Abdessalaam, T. Z., Francis, F. and Shamsi, A. T. (2003),

Population biology and stock assessment of the Orange-spotted grouper,

Epinephelus coioides, in the Southern Arabian Gulf. Environmental Research

and Wildlife Development Agency, UAE.

76. Grinde, B. (1989), "Lysozyme from rainbow trout, Salmo gairdneri

Richardson, as an antibacterial agent against fish pathogens", J Fish Dis., 12,

pp. 95 - 104.

77. Grubhofer, N. (1995), "An adjuvant formulation based on N-acetylglu-cosaminyl-N-

acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine with dimethyldioctadecylammonium

chloride and zinc-L-proline complex as synergists", Immunol. Lett., 44, pp. 19-24.

78. Haldari, S., Chatterjee, S., Asakura, M., Viayakumaran, M. and Yamasak, S.

(2007), "Isolation of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae (Non-O1

and 0139) from moribund shrimp (Penaeus monodon) and experimental

challenge study against post larvae and juveniles", Annals of Microbiology,

57, pp. 55-60.

79. Hamod, M.A., Nithin, M.S., Shukur, Y.N., Karunasagar, I. and Karunasagar, I.

(2012), "Out membrane protein K as a subunit vaccine against V.

anguillarium", Aquaculture, 354 – 355, pp. 107 – 110.

80. Han, T. J. and Chai, T. J. (1992), "Electrophoretic and Chemical

Characterization of Lipopolysaccharides of Vibrio parahaemolyticus", Journal

of Bacteriology, 174, pp. 3140-3146.

81. Harikrishnan, R. , Balasundaram, C. and Heo, M.S. (2010), "Molecular

studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture:

Economic importance, diseases and immunology", Aquaculture, 309, pp. 1-14.

113

82. Harikrishnan, R., Balasundaram, C. and Heo, M.S. (2011), "Fish health

aspects in grouper aquaculture.", Aquaculture, 320, pp. 1-21.

83. Harikrishnan, R., Kim, J.S., Balasundaram, C. and Heo, M.S. (2012),

"Vaccination effect of liposomes entrapped whole cell bacterial vaccine on

immune response and disease protection in Epinephelus bruneus against

Vibrio harveyi", Aquaculture, 342-343, pp. 69-74.

84. Harris, K.A. and Hartley, J.C. (2003), "Development of broad-range 16S

rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service",

Journal of Medical Microbiology, 52, pp. 685-691.

85. Hatai, K. , Iwahashi, Y. and Egusa, S. (1975), "Vibrio parahaemolyticus

from diseased yellowtails", Fish Pathol., 10(1), pp. 31-37.

86. Hatten, F., Fredriksen, A., Hordvik, I. and Endresen, C. (2001), "Presence of

IgM in cutaneous mucus, but not in gut mucus of Atlantic salmon, Salmo

salar. Serum IgM is rapidly degraded when added to gut mucus", Fish

Shellfish Immunol., 11, pp. 257–268.

87. Havarstein, L.S., Aasjord, P.M., Ness, S. and Endresen, C. (1988),

"Purification and partial characterization of an IgM- like serum

immunoglobulin from Atlantic salmon (Salmo salar)", Dev. Comp. Immunol.,

12, pp. 773-785.

88. Heemstra, P.C. and Randall, J. E. (1993), "FAO species catalogue. An

annotated and illustrated catalogue of the grouper, rockcod, hind, coral

grouper and lyretail species known to date", FAO Fisheries Synopsis.,

125(16).

89. Hegde, A., Chen, C.L., Qin, Q.W., Lam, T.J. and Sin, Y.M. (2002),

"Characterization, pathogenicity and neutralization studies of a nervous

necrosis virus isolated from grouper, Epinephelus tauvina, in Singapore",

Aquaculture, 213, pp. 55-72.

90. Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T. and Williams, S. T. (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th eds. by Hensyl,

W.R., Williams & Wilkins, Baltimore, USA, p. 787.

114

91. Honda, T., Ni, Y. and Miwatani, T. (1988), "Purification and characterization

of a hemolysin produced by a clinical isolate of Kanagawa phenomenon-

negative Vibrio parahaemolyticus and related to the thermostable direct

hemolysin", Infect. Immun., 56, pp. 961–965.

92. Hordvik, I., Berven, F.S., Solem, S.T., Hatten, F. and Endresen, C. (2002),

"Analysis of two IgM isotypes in Atlantic salmon and brown trout", Mol.

Immunol., 39(56), pp. 313–321.

93. Hrubec, T.C., Ward, D., Smith, S.A. and Robertson, J.L. (2004), "Age related

changes in humoral immune response of hybrid striped bass (Morone chrysops

x Morone saxatilis)", Vet. Immunol. Immunopathol., 101, pp. 103-108.

94. Huising, O., Guichelaar, T. , Hoek, C., Verburg-Van, L., Flik, G. , Savelkoul,

J. and Rombout, J. (2003), "Increased efficacy of immersion vaccineation in

fish with hyperosmotic pretreatment", Vaccine, 21, pp. 4178–4193.

95. Huizinga, H.W., Esch, G.W. and Hazen, T.C. (1979), "Histopathology of red-

sore diseases (Aeromonas hydrophila) in naturally and experimentally infected

largemouth bass Micropterus salmoides (Lacépède)", J. Fish Dis., 2, pp. 263-

277.

96. Hunter, R.L., Strickland, F. and Kezdy, F. (1981), "Studies on the adjuvant

activity of nonionic block copolymer surfactants. The role of hydrophile-

lipophile balance", J. Immunol., 127, pp. 1244–1250.

97. Iida, T. and Honda, T. (1997), "Hemolysins produced by vibrios", J.Toxicol.

Toxin Rev., 16, pp. 215–227.

98. Jakobsen, R.A., Gutierrez, M.A. and Wergeland, H.I. (1999), "Antibodies to

Aeromonas salmonicida Lipopolysaccharide and cell wall antigens in rabbit

and salmon immune sera", Fish Shellfish Immunol., 9, pp. 609-620.

99. Jeney, G. and Anderson, D.P. (1993), "Glucan injection or bath exposure

given alone or in combination with a bacterin enhance the non-speciflc

defence mechanisms in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)", Aquaculture,

116, pp. 315-329.

115

100. Jenkins, P.G., Wrathmell, A.B., J.E., Harris. and Pulsford, A.L. (1994),

"Systemic and mucosal immune response to enterically delivered antigen in

Oreochromis mossambicus", Fish Shellfish Immunol., 4, pp. 255–271.

101. Jia, A., Woo, N.Y.S. and Zhang, X.H. (2010), "Expression, purification and

characterization of thermallabile hemolysin (TLH) from Vibrio alginolyticus",

Dis. Aquat. Org., 90, pp. 121-127.

102. Jia, X., Patrzykat, A., Devlin, R.H., Ackerman, P.A., Iwama, G.K. and

Hancock, R.E.W. (2000), "Antimicrobial peptides protect coho salmon from

Vibrio anguillarum infections", Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 1928-1932.

103. Jolles, P. and Jolles, J. (1984), "What’s new in lysozyme research? Always a

model system, today as yesterday", Mol. Cell. Biochem., 63, pp. 165 - 189.

104. Jones, D.R., Hannan, C.M., Russel-Jones, G.J. and Raison, R.L. (1999),

"Selective B cell non-responsiveness in the gut of the rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss)", Aquaculture, 172, pp. 29–39.

105. Jorgensen, J. B. and Robertsen, B. (1995), "Yeast 1,3-glucan stimulates

respiratory burst activity of Atlantic Salmon (Salmo salar L.) macrophages",

Dev. Comp. Immunol., 19(1), pp. 43-57.

106. Kai, Y .H. and Chi, S. C. (2008), "Efficacies of inactivated vaccines against

betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus coioides) by bath

immunization", Vaccine, 26, pp. 1450–1457.

107. Kai, Y.H., Su, H.M., Tai, K.T. and Chi, S.C. (2010), "Vaccination of grouper

broodfish (Epinephelus tukula) reduces the risk of vertical transmission by

nervous necrosis virus", Vaccine, 28, pp. 996-1001.

108. Kaneko, T. and Colwell, R. R. (1973), "Ecology of Vibrio parahaemolyticus

in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology, 113, pp. 24-32.

109. Kato, K., Ishimaru, K., Sawada, Y., Mutsuro, J., Miyashita, S., Murata, O. and

Kumai, H. (2004), "Ontogeny of digestive and immune system organs of

larval and juvenile kelp grouper Epinephelus bruneus reared in the

laboratory", Fisheries Science, 70, pp. 1061-1069.

116

110. Kazuyuki, K., Shigeko, T. and Hiroo, I. (1979), "Effect of Medium on

Flagellation of Vibrio parahaemolyticus", Appl. Environ. Microbiol., 37, pp.

1248-1249.

111. Khuntia, C.P., Das, B.K., Samantaray, B.R., Samal, S.K. and Mishra, B.K.

(2008), "Characterization and pathogenicity studies of Vibrio

parahaemolyticus isolated from diseased freshwater prawn, Macrobrachium

rosenbergii (de Man)", Aquaculture, 39, pp. 301-310.

112. Klebanoff, S.J. (1998), Microbicidal mechanisms, oxygen-dependent,

Encyclopedia of immunology, Delves, P.J. and Roitt, I.M. eds, Academic

Press, UK, pp. 1713- 1718.

113. Kumari, J. and Sahoo, P.K. (2006), "Dietary beta- 1,3 glucan potentiates

innate immunity and disease resistance of Asian catfish, Clarias batrachus

L.", J. Fish Dis., 29, pp. 95-101.

114. Kusuda, R., Salco, H. and Kawai, K. (1979), "Classification of vibriosis

isolated from diseased fishes. Part 1. On the morphological and biochemical

properties", Gyobyo Kenkya, 13, pp. 123-138.

115. Laemmli, U.K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of

the head of bacteriophage T4", Nature, 227, pp. 680-685.

116. Laining, A. , Rachmansyaha, Ahmada, T. and William, K. (2003), "Apparent

digestibility of selected feed ingredients for humpback grouper, Cromileptes

altivelis", Aquaculture, 218, pp. 529 – 538.

117. Langston, A. L., Johnstone, R. and Ellis, A. E. (2001), "The kinetics of the

hypoferraemic response and changes in levels of alternative complement

activity in diploid and triploid Atlantic salmon, following injection of

lipopolysaccharide", Fish Shellfish Immunol., 11, pp. 333 - 345.

118. Lauro Tito, C. llagan (2012), "Green grouper from Mindanao: KGMC in

focus", Aquaculture, 8(2), pp. 36-37.

119. Le Morvan, C., Troutand, D. and Descaux, P. (1998), "Differential effects of

temperature on specific and nonspecific defenses in fish", Journal of

Experimental Biology, 201, pp. 165-168.

117

120. Lee, J.K., Jung, D.W., Eom, S.Y., Oh, S.W., Kim, Y.J., Kwak, H.S. and Kim,

Y.H. (2008), "Occurrence of Vibrio parahaemolyticus in oysters from Korean

retail outlets", Food Control., 19, pp. 990-994.

121. Lee, K.K. (1995), "Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in grouper

Epinephelus malabaricus", Microbial Pathogenesis, 19, pp. 39-48.

122. Leong, T.S. and Wong, S.Y. (1988), "A comparative study of the parasite

fauna of wild and cultured grouper (Epinephelus malabaricus) in Malaysia.",

Aquaculture, 68, pp. 203-207.

123. Li, J., Gao, D., Wang, Q., Wang, J. and Wang, Q. (2005), "Efficacy of Vibrio

anguillarum antigen administered by intraperitoneal injection route in

Japanese flounder, Paralichthys olivaceus", Aquaculture Research, 36, pp.

1104 -1111.

124. Li, J., Yie, J., Foo, R.W.T., Ling, J.M.L., Xu, H.S. and Woo, N.Y.S (1999),

"Antibiotic resistance and plasmid profiles of vibrio isolates from cultured

silver sea bream, Sparus sarba", Marine Pollution Bulletin, 39, pp. 245-249.

125. Li, N., Junjie, B., Shuqin, W., Xiaozhe, F., Haihua, L., Xing, Y. and Cunbin,

S. (2008), "An outer membrane protein, OmpK, is an effective vaccine

candidate for Vibrio harveyi in Orange-spotted grouper (Epinephelus

coioides)", Fish Shellfish Immunol., 25, pp. 829–833.

126. Li, N., Yang, Z., Bai, J., Fu, X., Liu, L., Shi, C. and Wu, S. (2010), "A shared

antigen among Vibrio species: Outer membrane protein-OmpK as a versatile

Vibriosis vaccine candidate in Orange-spotted grouper (Epinephelus

coioides)", Fish Shellfish Immunol., 28, pp. 952-956.

127. Liao, I. C., Huang, T. S. , Tsai, W. S. , Hsueh, C. M. , Chang, S. L. and

Leano, E. M. (2004), "Cobia culture in Taiwan: Current status and problems",

Aquaculture, 237, pp. 155-165.

128. Lin, C.C., Lin, J.H.Y., Chen, M.S. and Yang, H.L. (2007), "An oral nervous

necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper

(Epinephelus coioides)", Aquaculture, 268, pp. 265-273.

118

129. Lin, H.T., Lin, H.Y. and Yang, H.L. (2005), "Histology and histochemical

enzyme-staining patterns of major immune organs in Epinephelus

malabaricus", Journal of Fish Biology, 66, pp. 729-740.

130. Lin, Y.H. and Shiau, S.Y. (2005), "Dietary L-ascorbic acid affects growth,

nonspecific immune response and disease resista nce in juvenile grouper

Epinephelus malabaricus", Aquaculture, 244, pp. 215– 221.

131. Liu, P. C. , Chen, Y. C. , Huang, C. Y. and Lee, K. K. (2000), "Virulence of

Vibrio parahaemolyticus isolated from cultured small abalone, Haliotis

diversicolor, with withering syndrome", Letters in Applied Microbiology, 31,

pp. 433-437.

132. Liu, P.C., Lin, J. Y., Chuang, W. H. and Lee, K.K. (2004), "Isolation and

characterization of pathogenic Vibrio harveyi (V-carchariae) from the farmed

marine cobia fish Rachycentron canadum L. with gastroenteritis syndrome",

World J. Microbiol. Biotechnol., 20, pp. 495-499.

133. Liu, R., Chen, J., Li, K. and Zhang, X. (2011), "Identification and evaluation a

DNA vaccine candidate of a virulence-associated serine protease from a

pathogenic Vibrio parahaemolyticus ", Fish Shellfish Immunol., 30, pp. 1241-

1248.

134. Lobb, C.J. and Clem, L.W. (1981), "Phylogeny of immunoglobulin structure

and function-X. Humoral immunoglobulins of the sheapshead, Archosargus

probatocephalus", Dev. Comp. Immunol., 5(2), pp. 271–282.

135. Lobb, C.J., Olson, M.O. and Clem, L.W. (1984), "Immunoglobulin light chain

classes in a teleost fish", J. Immunol., 132, pp. 1917-1925.

136. Lumsden, J.S., Ostland, V.E., Byrne, P.J., Ferguson, H.W. (1993): and .

Disease of Aquatic Organism 16, 21–27. (1993), "Detection of a distinct gill-

surface antibody response following horizontal infection and bath challenge of

brook trout Salvelinus fontinalis with Flavobactewium branchiophilum, the

causative agent of bacterial gill disease", Dis. Aquat. Org., 16, pp. 21-27.

119

137. Madigan, M. T., Martinko, J. M. and Parker, J. (2003), Brock Biology of

microorganism, Prentice Hall, America, p. 1019.

138. Magnadottir, B. (2006), "Innate immunity of fish (overview)", Fish Shellfish

Immunol., 20, pp. 137 -151.

139. Mao, Z., Yu, L., You, Z., Wei, Y. and Liu, Y. (2007), "Cloning, expression

and immunogenicty analysis of five outer membrane proteins of Vibrio

parahaemolyticus zj2003", Fish Shellfish Immunol., 23, pp. 567-575.

140. Meseguer, J., Esteban, M.A., Lopez-Ruiz, A. and Bielek, E. (1994),

"Ultrastructure of nonspecific cytotoxic cells in teleosts. Effector-target cell

binding in a marine and a freshwater species (Sparus aurata L. and Cyprinus

carpio L.)", The Anatomical Record., 239, pp. 468-474.

141. Mike, R. (2008), "Production update – Marine finfish aquaculture in the

Asian-Pacific Region", Aquaculture, 8(1), pp. 48- 51.

142. Mitchell, H. (1995), "Choosing a furunculosis vaccine: points to consider",

Bull. Aquacult. Assoc. Can., 95, pp. 30–37.

143. Morrison, R.N. and Nowak, B.F. (2001), "Affinity purification and partial

characterisation of systemic immonoglobulin of snapper (Pagrus auratus)",

Aquaculture, 201, pp. 1-17.

144. Najiah, M., Lee, K.L., Hassan, M., Sharief, M.L. and Mohd-Azmi (2003),

"Preliminary study on genetic distance of Vibrio parahaemolyticus isolate

from diseased fish and shrimp brackfishwater ponds by Random Amplified

Polymorphic DNA (RAPD) in Malaysia", Asian fisheries science,16, pp. 299-

305.

145. Narjol, G., Blackstone, G. M. and DePaola, A. (2006), "Characterization of a

Vibrio alginolyticus strain, isolated from Alaskan oysters, carrying a

hemolysin gene similar to the Thermostable Direct Hemolysin-related (trh) of

Vibrio parahaemolyticus", Applied and Environmental Microbiology, 72(12),

pp. 7925–7929.

120

146. Nash, G., Anderson, I.G., Shariff, M. and Shamsudin, M.N. (1987),

"Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer,

and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia",

Aquaculture, 67, pp. 105-111.

147. Navot, N. , Kimmel, E. and Avtalion, R. R. (2004), "Enhancement of antigen

uptake and antibody production in goldfish (Carassius auratus) following bath

immunization and ultrasound treatment", Vaccine, 22, pp. 2660–2666.

148. Nguyen Thi Thanh Thuy and Nguyen Huu Dung (2008), "Ulcerative disease

on culture grouper in Khanh Hoa, Viet Nam", Aquaculture Asia Pacific, 4(3),

pp. 27-29.

149. Nishibuchi, M. , Fasano, A., Russell, R. G. and Kaper, J. B. (1992),

"Enterotoxigenicity of Vibrio parahaemolyticus with and without genes

encoding Thermostable Direct Hemolysin", Infection and Immunity, 60, pp.

3539-3545.

150. Nitzan, Y., Gribun, A. and Pechatnikov, I. (1983), "Isolation and

characterization of the outer membrane from Vibrio parahaemolyticus",

Journal of General Microbiology, 129(10), pp. 3185-3196.

151. Ogier de Baulny, M., Quentel, C., Fournier, V., Lamour, F. and Gouvello,

R.L. (1996), "Effect of long-term oral administration of P-glucan as an

immunostimulant or an adjuvant on some non-specific parameters of the

immune response of turbot Scophthalmus maximus", Disease of Aquatic

Organisms, 26, pp. 139-147.

152. Ong, B (1988), "Characteristics of bacteria isolated from diseased groupers,

Epinephelus salmoides", Aquaculture, 73, pp. 7-17.

153. Pacha, R. E. and Kiehn, E. D. (1969), "Characterization and relation of

marine vibrios pathogenic to fish: physiology, serology, and

epidemiology", J. Bacteriol.,100(3), pp. 1242-1247.

154. Pakingking, Jr., Bautista, R., Jesus-Ayson, E.G. and Reyes, O. (2010),

"Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brown-marbled

grouper (Epinephelus fuscoguttatus) following vaccination with inactivated

betanodavirus", Fish Shellfish Immunol., 28, pp. 525-533.

121

155. Palic, D., Andreasenb, C.B., Heroltc, D.M., Menzeld, B.W and Rothc, J.A.

(2006), "Immunomodulatory effects of β-glucan on neutrophil function in

fathead minnows (Pimephales promelas Rafinesque, 1820)", Dev. Comp.

Immunol., 30, pp. 817-830.

156. Papanastasiou, A.D. and Zarkadis, I.K. (2006), "Cloning and phylogenetic

analysis of the alpha subunit of the eighth complement component (C8) in

rainbow trout", Molecular Immunology, 43, pp. 2188-2194.

157. Petersen, E. F. (2003), Monoclonal antibodies to leucocytes and

immunoglobulin from Atlantic salmon ( Salmo salar L.) - Production,

characterisation and application, Doctor science thesis, Department of

Fisheries and Marine Biology, University of Bergen.

158. Pierre, S., Gaillard, S. , Nathalieprevot-Dalvise, Aubert, J. , Odile, R. C. ,

Daniel, L. T. and Joel, P. G. (2007), Grouper aquaculture: Asian success and

Mediterranean trials, Wiley InterScience.

159. Plant, K. P. and LaPatra, S. E. (2011), " Advances in fish vaccine delivery",

Developmental and Comparative Immunology, 35, pp. 1256–1262.

160. Plumb, J. A. and Hanson, L. A. (2010), Health Maintenance and Principle

Microbial Diseases of Cultured Fishes, Wiley-Blackwell.

161. Pucci, B., Coscia, M.R. and Oreste, U. (2003), "Characterization of serum

immunoglobulin M of the Antarctic teleost Trematomus bernacchii", Comp.

Biochem. Physiol., 135(2), pp. 349–357.

162. Quinones, R. E. I, Bonifacio, I. N. , Betancourt-Rule, M., Ramirez Vives, F.

and Vázquez Salinas, C. (2010), "Putative virulence factors identified in

Vibrio vulnificus strains isolated from oysters and seawater in Mexico",

International Journal of Environmental Health Research, 20(6), pp. 395-405.

163. Randall, J.E and Heemstra, P.C. (1991), Revision of Indo-Pacific groupers

(Perciformes: Serranidae: Epinephelinae), with descriptions of five new

species, Bernice Pauahi Bishop Museum, Honolulu, Hawaii, p. 332.

122

164. Reed, L.J. and Muench, H. (1938), "A simple method of estimating fifty

percent endpoints", The American Journal of Hygiene, 27, pp. 493-497.

165. Richter, R., Frenzel, E.M., Hadge, D., Kopperschlager, G. and Ambrosius, H.

(1973), "Structure of Immunoglobulin on carp (Cyprinus carpio L.) ", Acta.

biol. med. germ., 30, pp. 735-749.

166. Robertsen, B., Bergan, V. , Roekenes, T. , Larsen, R. and Albuquerque, A

(2003), "Atlantic salmon interferon genes: cloning, sequence analysis,

expression, and biological activity", J Interferon Cytokine Res., 23, pp. 601 -

612.

167. Robertsen, B., Engstad, R.E. and Jørgensen, J.B. (1994), β-glucans as

immunostimulants in fish., Modulators of Fish Immune Responses, Stolen, J.S.

and Fletcher, T.C. eds, SOS Publications, pp. 83-99.

168. Rodrıguez, A., Esteban, M.A. and Meseguer, J. (2003), "Phagocytosis and

peroxidase release by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes in response to

yeast cells", The Anatomical Record, 272, pp. 415-423.

169. Rombout, M., Huttenhuis, T. , Picchietti, S. and Scapigliati, G. (2005),

"Phylogeny and ontogeny of fish leucocytes", Fish Shellfish Immunol., 19, pp.

441-455.

170. Ronneseth, A., Wergeland, H.I. and Pettersen, E.F. (1994) "Neutrophils and

B-cells in Atlantic cod (Gadus morhua L.)", Fish Shellfish Immunol., 21, pp.

331-342.

171. Saeed, M.O. (1995), "Association of Vibrio harveyi with mortalities in

cultured marine fish in Kuwait", Aquaculture, 136, pp. 21-29.

172. Sahu, A. and Lambris, J.D. (2001), "Structure and biology of complement

protein C3, a connecting link between innate and acquired immunity",

Immunological Review, 180, pp. 35-48.

173. Sakai, D.K. (1984), "Opsonization by fish antibody and complement in the

immune phagocytosis by peritoneal exudate cells isolated from salmonid

fishes", J. Fish Biol., 7, pp. 29-38.

123

174. Sarjito, O. , Radjasa, K., Sabdono, A, Prayitno, S.B. and Hutabarat, S (2009),

"Phylogenetic diversity of the causative agent of Vibriosis associated with

grouper fish from Karimunjawa Island, Indonesisa", Current research in

bacteriology, 2, pp. 14-21.

175. Saunders, D.C. (1966), "Differential blood cell counts of 121 species of

marine fishes of Puerto Rico", Transactions of the American Microscopical

Society, 85, pp. 427-449.

176. Secombes, C.J. and Fletcher, T.C. (1992), "The role of phagocytes in the

protective mechanisms of fish", Annu. Rev. Fish Dis., 2, pp. 53-71.

177. Selvaraj, V, Sampath, K. and Sekar, V. (2006), "Adjuvant and

immunostimulatory effects of β-glucan administration in combination with

lipopolysaccharide enhances survival and some immune parameters in carp

challenged with Aeromonas hydrophila", Vet. Immunol. Immunopathol., 114,

pp. 15-24.

178. Selvaraj, V., Sampath, K. and Sekar, V. (2005), "Administration of yeast

glucan enhances survival and some non-specific and specific immune

parameters in carp ( Cyprinys carpio) infected with Aeromonas hydrophila",

Fish Shellfish Immunol., 19, pp. 293-306.

179. Seng, L.T. (1998), Grouper Culture, Tropical mariculture, De Silva, S.S. eds,

Academic Press, London, pp. 423– 448.

180. Shelton, E. and Smith, M. (1970), "The ultrastructure of carp (Cyprinus

carpio) Immonoglobulin: A Tetrameric Macroglobulin", J. Mol. Biol., 54, pp.

615-617.

181. Shen, L., Stuge, T.B. and Miller, N.W. (2002), "Channel catfish cytotoxic

cells: a mini-review", Dev. Comp. Immunol., 26, pp. 141-149.

182. Shyne, A. P. S., Sobbhana, K. S. , George, K. C. and Paul Rai, R. (2008),

"Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio

parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.)",

J. Mar. Biol. Ass., 50, pp. 1-6.

124

183. Smith, V.J., Fernandes, J.M.O., Jones, S.J., Kemp, G.D. and Tatner, M.F.

(2000), "Antibacterial proteins in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss", Fish

Shellfish Immunol., 10, pp. 243-260.

184. Snoussi, M., Noumi, E. , Usai, D. , Sechi, L. A. , Zanetti, S. and Bakhrouf, A.

(2008), "Distribution of some virulence related-properties of Vibrio

alginolyticus strains isolated from Mediterranean seawater (Bay of Khenis,

Tunisia): investigation of eight Vibrio cholerae virulence genes", World J

Microbiol Biotechnol., 24, pp. 2133–2141.

185. Solem, S.T., Hordvik, I., Killie, J.A., Warr, G.W. and Jorgensen, T.O. (2001),

"Diversity of the immunoglobulin heavy chain in the Atlantic salmon ( Salmo

salar L.) is contributed by genes from two parallel IgH isoloci", Dev. Comp.

Immunol., 25(5-6), pp. 403–417.

186. Sommerser, I., Krossoy, B., Biering, E. and Frost, P. (2005), "Review

vaccines for fish in aquaculture", Expert Rev. Vaccines, 4(1), pp. 89 - 101.

187. Stafford, J. L. and Belosevic, M. (2003), "Transferrin and the innate immune

response of fish: Identification of a novel mechanism of macrophage

activation", Dev. Comp. Immunol., 27, pp. 539 - 554.

188. Stafford, J. L., Neumann, N. F. and Belosevic, M. (2001), "Products of

proteolytic cleavage of transferrin induce nitric oxide response of goldfish

macrophages", Dev. Comp. Immunol., 25, pp. 101 - 115.

189. Stills, H.F. (2005), " Adjuvants and antibody production: dispelling the myths

associated with Freund’s complete and other adjuvants", ILAR J., 46, pp. 80 -

93.

190. Sun, Y., Liu, C.S. and Sun, L. (2011), "A multivalent killed whole-cell

vaccine induces effective protection against Edwardsiella tarda and Vibrio

anguillarum", Fish Shellfish Immunol., 31, pp. 595 -599.

191. Sunyer, J.O., Tort, L. and Lambris, J.D. (1997), "Diversity of the third form of

complement, C3, in fish: functional characterization of five forms of C3 in the

diploid fish Sparus aurata", Biochemistry Journal., 326, pp. 877-881.

125

192. Sunyer, J.O., Zarkadis, I.K. and Lambris, J.D. (1998), "Complement diversity:

a mechanism for generating immune diversity", Immunology Today, 19, pp.

519-523.

193. Swain, P., Dash, S., Sahoo, P.K., Routray, P., Sahoo, S.K., Gupta, S.D.,

Meher, P.K. and Sarangi, N. (2007), "Non-specific immune parameter of

brood Indian major carp Labeo rohita and their seasonal variations", Fish

Shellfish Immunol., 22, pp. 38-43.

194. Takahashi, A., Sato, Y., Shiomi, Y., Cantarelli, V.V., Iida, T., Lee, M. and

Honda, T. (2000), "Mechanisms of chloride secretion induced by thermostable

direct haemolysin of Vibrio parahaemolyticus in human colonic tissue and a

human intestinal epithelial cell line", J. Med. Microbiol., 49, pp. 801–810.

195. Takeda, Y., Taga, S. and Miwatani, T. (1978), "Evidence that the thermostable

direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus is composed of two subunits",

FEMS Microbiol. Lett., 4, pp. 271–274.

196. Tatner, M. F. (1996), Natural changes in the immune system of fish, The fish

immune system: organism, pathogen and environment, Iwama G., Nakanishi

T. eds, Academic Press, USA, pp. 255-287.

197. Thanh, Bui Ngoc, Dalsgaard, A., Munangandu, H. and Evensen, O. (2009),

Experimental infection and host response of tilapia Oreochromis niloticus to

zoonotic metacercariae Haplorchis pumilio, Mahidol University, Thailand,

accessed 29-5-2013, from http://www.tm.mahidol.ac.th/fbpz2009/fbpz2009-

present.htm.

198. Thiery, R., Cozien, J. , Cabon, J. , Lamour, F. , Baud, M. and Schneemann, A.

(2006), "Induction of a protective immune response against viral nervous

necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using

betanodavirus virus-like particles", J. Virol., 80, pp. 10201 – 10207.

199. Toranzo, A. E., Magarinos, B. and Romalde, J. L. (2005), "A review of main

bacterial fish diseases in mariculture systems", Aquaculture, 246, pp. 37-61.

126

200. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979), "Electrophoretic transfer of

proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and

some applications", Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76, pp. 4350-4354.

201. Tsang, V. C. W., Peralta, J. M. and Simons, A. R. (1983), "Enzyme-Linked

Immunoelectro transfer Blot Techniques (Eitb) for studying the specificities of

antigens and antibodies separated by gel-electrophoresis", Methods in

Enzymology, 92, pp. 377-391.

202. Twedt, R.M., Novelli, R.E., Spaulding, P.L. and Hall, H.E. (1970),

"Comparative hemolytic activity of Vibrio parahaemolyticus and related

Vibrios", Infection and Immunity, 1, pp. 394-399.

203. Uribe, C. , Folch, H. , Enriquez, R. and Moran, G. (2011), "Innate and

adaptive immunity in teleost fish: a review", Veterinarni Medicina., 56(10),

pp. 486–503.

204. Van Muiswinkel, W.B. (2008), "A history of fish immunology and

vaccination. The early days", Fish Shellfish Immunol., 25, pp. 397-408.

205. Whitman, K.A. (2004), Finfish and shellfish Bacteriology Manual Techniques

and Procedures, Iowa State Press, 272 p.

206. Whyte, K. S. (2007), "The innate immune response of finfish - A review of

current knowledge", Fish Shellfish Immunol., 23, pp. 1127 – 1151.

207. Willett, C., Cortes, A., Zuasti, A. and Zapata, A. (1999), "Early hematopoiesis

and developing lymphoid organs in the zebrafish", Developmental Dynamics,

214, pp. 323-336.

208. Wilson, M.R. and Warr, G.W. (1992), "Fish immunoglobulins and the genes

that encode them", Annu. Rev. Fish Dis., 2, pp. 201–221.

209. Wong, H.C. and Chen, Y.C. (2003), "Analysis of the envelope proteins of

heat-shocked Vibrio parahaenolyticus cells by immunoblotting and biotin-

labeling method", Microbiol and Immunology, 47, pp. 313-319.

210. Wong, S.K., Zhang, X.H. and Woo, N.Y.S. (2012), "Vibrio alginolyticus

thermolabile hemolysin (TLH) induces apoptosis, membrane vesiculation and

necrosis in sea bream erythrocytes", Aquaculture, 330-333, pp. 29-36.

127

211. Yambot, A.V. and Song, Y.L. (2006), "Immunization of grouper, Epinephelus

coioides, confers protection against a protozoan parasite, Cryptocaryon

irritans", Aquaculture, 260, pp. 1-9.

212. Yeh, S.P., Chang, C.A., Chang, C.Y., Liu, C.H. and Cheng, W. (2008),

"Dietary sodium alginate administration affects fingerling growth and

resistance to Streptococcus sp. and iridovirus, and juvenile non-specific

immune responses of the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides", Fish

Shellfish Immunol., 25, pp. 19-27.

213. Yeung, P.S.M. and Boor, K.J. (2004), "Epidemiology, pathogenesis, and

prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections", Foodborne

pathogens and disease, 1(2), pp. 74-88.

214. Yii, K.C., Yang, T.I. and Lee, K.K. (1997), "Isolation and characterization of

Vibrio carchariae, a causative agent of gastroenteritis in the groupers,

Epinephelus coioides.", Current Microbiology, 35, pp. 109-115.

215. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Gutierrez-De Frias, C. and Cortes, A. (2006),

"Ontogeny of the immune system of fish", Fish Shellfish Immunol., 20, pp.

126–136.

216. Zexia, G., Weimin, W., Yi, Y., Abbas, K., Dapeng, L., Guiwei, Z. and Diana,

J.S. (2007), "Morphological studies of peripheral blood cells of the Chinese

sturgeon, Acipenser sinensis", Fish Physiol Biochem., 33, pp. 213-222.

217. Zhang, X. H. and Austin, B. (2005), "A review haemolysins in Vibrio

species", Journal of Applied Microbiology, 98, pp. 1011–1019.

218. Zhou, Y. C., Wang, J. , Zhang, B. and Su, Y. Q. (2002), "Ultrasonic

immunization of sea bream, Pagrus major (Temminck & Schlegel), with a

mixed vaccine against Vibrio alginolyticus and V. anguillarum", J. Fish Dis.,

25, pp. 325–331.

219. Zorrilla, I., Arijo, S., Chabrillon, M., Diaz, P., Martinez-Manzanares, E.,

Balebona, M.C. and Morinigo, M.A. (2003), "Vibrio species isolated from

diseased farmed sole, Solea senegalensis (Kaup), and evaluation of the

potential virulence role of their extracellular products", J. Fish Dis., 26, pp.

103-108.

Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản

Mã ngành : 62 62 03 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Năm

CHƢƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

a.

b. Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh

B

D

31.0

21.5

14.4

CHƢƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển nguồn nhân lực du lịch trong các cơ sở lưu trú tại Hà Nội

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển nguồn nhân lực du lịch trong các cơ sở lưu trú tại Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Giáo dục đạo đức sinh thái cho sinh viên các trường đại học tại Thành phố Hồ Chí Minh hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Giáo dục đạo đức sinh thái cho sinh viên các trường đại học tại Thành phố Hồ Chí Minh hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Công tác hoằng pháp và hoạt động của đạo tràng Phật giáo tỉnh Lào Cai hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Hành vi nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe tâm thần của học sinh trung học phổ thông tại Hà Nội hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Hành vi nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe tâm thần của học sinh trung học phổ thông tại Hà Nội hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Đảng bộ tỉnh Đồng Nai lãnh đạo công tác bảo tồn và phát huy giá trị các di tích lịch sử - văn hóa từ năm 1996 đến năm 2015

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Đảng bộ tỉnh Đồng Nai lãnh đạo công tác bảo tồn và phát huy giá trị các di tích lịch sử - văn hóa từ năm 1996 đến năm 2015

Luận án Tiến sĩ: Thực hiện Pháp lệnh thực hiện dân chủ ở xã, phường, thị trấn vùng dân tộc thiểu số tỉnh Quảng Nam hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Thực hiện Pháp lệnh thực hiện dân chủ ở xã, phường, thị trấn vùng dân tộc thiểu số tỉnh Quảng Nam hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Công tác hoằng pháp và hoạt động của đạo tràng Phật giáo tỉnh Lào Cai hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu chất lượng dịch vụ viễn thông di động tại Tổng công ty viễn thông Viettel

Luận án Tiến sĩ: Nâng cao chất lượng cơ sở vật chất các trường đại học tư thục trên địa bàn thành Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Năng lực cạnh tranh của doanh nghiệp nhỏ và vừa trên địa bàn tỉnh Phú Thọ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự thành công trong khởi sự kinh doanh của phụ nữ khu vực miền Bắc

Luận án Tiến sĩ: Kiểm soát nội bộ tại Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Kiểm soát nội bộ tại Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp phát triển trung tâm logistics quốc tế cho khu vực kinh tế trọng điểm phía Bắc

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến mức độ công bố thông tin trên báo cáo thường niên của các ngân hàng thương mại Việt Nam

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo