Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN TRUNG TIẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA

BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN TRUNG TIẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA

BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED)

TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số:

9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên

HÀ NỘI - 2018

LỜ I CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng

bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn

và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Trung Tiến

LỜ I CẢ M ƠN

Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất

nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Bá

Hiên, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành

luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà

luận án của tôi đã được hoàn thành.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban

Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm,

Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô

giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi

những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Trân trọng cảm ơn Lãnh đạo, toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Kiểm

nghiệm thuốc Thú y TW1, các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện về thời gian,

động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và

hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trung Tiến

MỤC LỤC

Lờ i cam đoan ..................................................................................................................... i

Lờ i cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ iii

Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. vi

Danh mục bảng ............................................................................................................... vii

Danh mục hình ............................................................................................................... viii

Trích yếu luận án .............................................................................................................. x

Thesis abstract ................................................................................................................. xii

Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1

1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2

1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3

1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 3

1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4

2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................... 4

2.2.

Lịch sử bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn ............................................................... 4

2.3.

Tình hình dịch PED trên thế giới và Việt Nam .................................................... 5

2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới .......................................................................... 5

2.3.2. Tình hình dịch PED ở Viê ̣t Nam........................................................................... 6

2.4. Căn bệnh ............................................................................................................... 8

2.4.1. Phân loại và hình thái của PEDV.......................................................................... 8

2.4.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh ..................................................................... 9

2.4.3. Đặc tính nuôi cấy của virus ................................................................................ 12

2.4.4. Sức đề kháng của virus gây bệnh PED .............................................................. 12

2.4.5. Dịch tễ học lâm sàng ........................................................................................... 13

2.5. Dịch tễ học phân tử ............................................................................................. 16

2.6. Triệu chứng và bệnh tích của lợn mắc PED ....................................................... 18

2.6.1. Triệu chứng lâm sàng.......................................................................................... 18

2.6.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 19

iii

2.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV ................................................................... 20

2.7.1. Phát hiện virus .................................................................................................... 20

2.7.2. Chẩn đoán phân biệt ........................................................................................... 23

2.7.3. Phân lập virus ...................................................................................................... 24

2.8. Phòng và điều trị bệnh ........................................................................................ 25

Phần 3. Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu ...................................... 30

3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 30

3.2.

Thời gian thực hiện đề tài ................................................................................... 30

3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 30

3.3.1. Nghiên cứu tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ................. 30

3.3.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen...................................................................... 30

3.3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV ............. 30

3.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 31

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 31

3.5.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ ................................................... 32

3.5.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng .......................................................................... 32

3.5.3. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 32

3.5.4. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................................... 32

3.5.5. Phương pháp tách ARN tổng số ......................................................................... 32

3.5.6. Phương pháp tổng hợp cDNA ............................................................................ 33

3.5.7. Phương pháp phát hiện PEDV ............................................................................ 34

3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen............................................................................. 34

3.5.9. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền .................................................... 35

3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phả hệ ..................................................................... 35

3.5.11. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử ........................................ 35

3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 36

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 37

4.1.

Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc từ 2013-2015 ............................... 37

4.1.1. Kết quả thiết lập phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV ........................................ 37

4.1.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 .......................... 41

4.1.3. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại ............................... 42

4.1.4. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED ................................. 44

4.2. Kết quả phân tích đặc điểm về trình tự gen ........................................................ 48

4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam ............................. 48

4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam ....................................... 61

4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm về dịch tễ học phân tử của PEDV ........................ 67

4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành của PEDV theo nhóm di truyền ................................. 67

4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam ..................................... 73

4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian ............. 75

Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 85

5.1. Kết luận ............................................................................................................... 85

5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 85

Danh mục công trình công bố có liên quan đến luận án ................................................. 87

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 87

Phụ lục .......................................................................................................................... 103

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ

CPE

Cytopathogenic effect

cs.

Cộng sự

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle’s Medium

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

Envelope

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic acid

ELISA

Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay

FAO

Food and Agriculture Organization

FBS

Fetal Bovine Serum

Membrane

MOI

Multiplicity of Infection

Nucleocapsid

ORF

Open Reading Frame

ORF3

Open Reading Frame 3

PBS

Phosphate Buffer Saline

PED

Porcine Epidemic Diarrhea

PEDV

Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RNA

Ribonucleic Acid

RT-PCR

Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction

Spike protein

50% Tissue Culture Infective Dose

TCID50

TGE

Transmissible Gastroenteritis

TGEV

Transmissible Gastroenteritis Virus

TPB

Tryptose Phosphate Broth

PDCoV Porcine deltacoronavirus

DANH MỤC BẢNG

3.1.

Thông tin về mồi đặc hiệu được dùng trong nghiên cứu ....................................... 31

3.2.

Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................................. 34

Tương đồng trình tự nucleotide và amino acid của 11 chủng PEDV với các

4.1.

chủng tham chiếu ................................................................................................... 39

4.2.

Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015 .................................. 41

4.3.

Tình hình dịch PED ở lợn của một số tỉnh miền Bắc theo trang trại ..................... 43

4.4.

Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED ................................ 44

4.5.

Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED ....................................... 46

4.6.

Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 1 ................................................... 75

4.7.

Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 2 nhóm châu Á ............................ 80

vii

Tên bảng Trang STT

DANH MỤC HÌNH

2.1.

Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc ........................................ 9

2.2. Mô hình cấu trúc và bộ gen PEDV ........................................................................ 10

2.3.

Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian ............................. 13

2.4.

Con đường truyền lây của PEDV .......................................................................... 17

2.5.

Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED .............................................................. 19

2.6.

So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV ................................. 22

4.1.

Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm .................................... 37

4.2.

Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi P1/P2 ......................... 38

4.3.

Triệu chứng của lợn con theo mẹ mắc PED .......................................................... 45

4.4.

Bệnh tích đại thể của lợn con theo mẹ mắc PED .................................................. 47

4.5.

Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV .................................. 49

4.6.

Phân loại các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen S ......................... 50

4.7.

Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV ...................................... 51

4.8.

Đột biến thêm- xóa ở gen S của 38 chủng PEDV ................................................. 52

4.9.

Tốc độ thay đổi nucleotide tại các vị trí codon của gen mã hóa vùng quyết

định kháng nguyên ................................................................................................. 54

4.10. Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV ........................................ 56

4.11. Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV ......................................... 58

4.12. Trình tự amino acid ở vùng S10 của 38 chủng PEDV ........................................... 60

4.13. Trình tự nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV ............................................. 62

4.14. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV .......................... 63

4.15. Phân loại chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3 ........................ 64

4.16. Khoảng cách di truyền của gen ORF3 giữa các chủng PEDV .............................. 65

4.17. Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV....................................... 66

4.18. Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S ...................................... 68

4.19. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dẫn tới các chủng của

Việt Nam dựa vào trình tự gen S ........................................................................... 69

4.20. Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 ............................................... 70

viii

STT Tên hình Trang

4.21. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dựa vào gen ORF3 của genogroup 1 của

Việt Nam ................................................................................................................ 72

4.22. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần

gen S (n =43) ......................................................................................................... 73

4.23. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần

gen S (n =911) ....................................................................................................... 74

4.24. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự

gen ORF3 ............................................................................................................... 76

4.25. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự

gen S ...................................................................................................................... 77

4.26. Sự phát tán theo không gian của genogroup 2 dựa vào gen ORF3 ....................... 79

4.27. Sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV nhánh châu Á ..................... 81

4.28. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV

genogroup 2 nhánh châu Á .................................................................................... 82

4.29. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV

genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ ................................................................................... 83

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Trung Tiến

Tên Luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở

lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số: 9.64.01.08

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Trong nghiên cứu này trước tiên làm rõ tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc,

bao gồm vùng đồng bằng sông Hồng và vùng trung du- miền núi. Trên cơ sở xác định

được sự lưu hành của PEDV, đặc điểm dịch tễ học được phân tích đa chiều, đi sâu tìm

hiểu những biến đổi có liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung hòa virus. Đặc biệt, phân

tích mối liên hệ về gen được thực hiện trên cơ sở dữ liệu lớn nhằm làm rõ nhiều đặc

điểm dịch tễ học phân tử chưa được đề cập trong nhiều nghiên cứu trước đây.

Phương pháp nghiên cứu

Có hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i)

phương pháp RT-PCR dùng trong phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình

tự gen virus. (ii) Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm dịch tễ

học phân tử dựa vào các phần mềm như BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST, v.v...

Kết quả chính và kết luận

Có 5 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm:

(i) Bằng phản ứng RT-PCR, đã xác định được dịch PED đã xuất hiện ở một không

gian trải rộng ở 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là 41,98% và liên tục theo thời

gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015). Các trang trại ở vùng đồng bằng có tỷ

lệ trang trại dương tính PEDV cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở các tỉnh trung du-

miền núi (68,42% so với 35,29%).

(ii) Lợn mắc PED có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh: phân tanh và

có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa không tiêu (38%); ruột non trong (60%) và có

cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột (20%).

(iii) Tính đa dạng di truyền của gen S và gen ORF3 của 38 chủng PEDV của Việt

Nam được phân tích đa chiều về tỷ lệ % tương đồng, phân loại theo nhóm di truyền và

khoảng cách di truyền giữa các chủng virus. Qua đó đã xác định được PEDV lưu hành ở

Việt Nam không có nguồn gốc từ các chủng virus vacxin và có tính đa dạng di truyền

với mức tương đồng trình tự gen S là 63,7% - 87,9% và gen ORF3 là 93% - 99%. Các

chủng virus mang đột biến thêm- xóa và đột biến điểm ở vùng quyết định kháng nguyên

của gen S được dự đoán không dẫn tới dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa.

(iv) Phân tích cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 được

thực hiện với dung lượng mẫu lớn (n = 911 trình tự gen S, n = 886 trình tự gen ORF3)

được tạo ra trong nghiên cứu này và thu thập từ ngân hàng gen. Nghiên cứu này đã

khẳng định sự lưu hành của 2 genogroup PEDV ở Việt Nam. Trong đó genogroup 2 bao

gồm nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ. Một số chủng là kết quả của quá trình tái tổ hợp ở

gen S giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2

(v) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV lưu hành ở Việt Nam được cho từng

genogroup virus, với hai kết luận quan trọng được rút ra. Thứ nhất, PEDV lưu hành ở

Việt Nam có nguồn gốc đa dạng: virus thuộc genogroup 1 và nhánh châu Á của

genogroup 2 có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc. Trong khi đó virus thuộc nhánh Bắc

Mỹ có nguồn gốc từ Mỹ. Thứ hai, chủng virus tổ tiên của PEDV hiện lưu hành được dự

đoán tồn tại trước thời điểm xảy ra dịch PED khoảng 6-9 năm. Sau khi xâm nhập, các

chủng PEDV của Việt Nam bắt đầu tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và lây

lan ra các địa phương khác.

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Trung Tien

Thesis title: Epidemiological study of porcine epidemic diarrhea in pig populations in

the north of Vietnam

Major: Veterinary epidemiology

Code: 9.64.01.08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

This study firstly investigated the prevalence of PED in northern provinces which

were divided in to the river delta and the mountainous areas. Based on the identification

of PEDV in each region, the molecular epidemiology of PEDV was analyzed under

different aspects. For example, genetic substitutions which are related to neutralizing

epitopes were focused. Especially, based on a large data for phylogenetic inferences,

this study revealed several important aspect of molecular epidemiology which was

missed in several publications.

Materials and Methods

This study used two major methods, which were: (i) RT-PCR based method for

viral detection and Sanger sequencing. (ii) Method for molecular epidemiological

analyses was relied on several state-of-the-art tools, such as: BioEdit, MEGA, MAFFT,

BEAST, etc.

Main findings and conclusions

Five main results were drawn from this study, as the follows.

(i) The result of RT-PCR screening confirmed the emergence of PED in all

10/10 investigated provinces. The outbreaks were found consecutively from 2013-2015,

and the average rate of prevalence was 41.98%. Farms located in the river delta region

tended to have a higher PEDV positive rate (68.42%) in compare to those located in the

mountainous area (35.29%).

(ii) PEDV infected piglets displayed typical clinical symptoms as well as gross

lesions of PED, such as: typical odor (64%), un-digested milk in feces (38%); thin-wall

small intestine (60%) and milk curved in the intestinal lumen (20%).

(iii) The genetic diversities of S and ORF3 genes of 38 field strains were analyzed

under different aspects. It was concluded that field strains of PEDV in Vietnam were

xii

not related to vaccine strain. The sequence similarities between field viruses were

63.7% - 87.9% for the S gene and were 93% - 99% for the ORF3 gene. Genetic

insertion- deletions as well as point mutations in important epitopes of the spike protein

were predicted not resulting escape mutants.

(iv) Phylogenetic analyses were done on the large data of both S and ORF3 gene.

The results confirmed the prevalence both genogroup 1 and genogroup 2 of PEDV in

pig population in Vietnam. Of the genogroup 2, PEDVs in Vietnam were separated into

the emerging Asian and North American clades. Several strains were determined to be

the result of recombination on the S gene between genogroup 1 and genogroup 2.

(v) The molecular epidemiology was inferred for each genogroup. Firstly,

Vietnamese PEDVs were predicted originating from the viruses circulating in China

(for genogroup 1 and Asian clade of genogroup 2). Meanwhile, the North American

clade was predicted to derive from USA. Secondly, the most recent common ancestor of

Vietnamese PEDV was predicted to emerge in Vietnam 6-9 years prior to the first PED

outbreak. After the introduction, the viruses diversified locally to form Vietnamese

clade and started to diffuse spatial-temporally into different locations.

xiii

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bê ̣nh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là

một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ

Coronaviridae. Về mặt lâm sàng, biểu hiện của bệnh PED rất giống với bệnh

viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) mặc dù chúng là hai virus hoàn toàn khác

nhau cùng họ Cornonaviridae. Bệnh gây ra trên lợn ở tất cả các lứa tuổi với triệu

chứng lâm sàng là nôn và tiêu chảy. Tỷ lệ lây lan và tử vong ở lợn con dưới 5

ngày tuổi có thể tới 100% bởi tiêu chảy và mất nước nặng. Bê ̣nh PED xảy ra

quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy

ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào

năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều quốc gia khác ở châu Á

như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan.

Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tích

đặc điểm di truyền của các chủng virus gây bệnh PED, so sánh sự khác nhau về

mặt di truyền, đặc điểm phát sinh loài của các chủng phân lập ở những địa điểm

khác nhau, từ đó đưa ra các dự đoán, khuyến cáo và biện pháp đối phó hiệu quả

trước sự biến đổi của virus. Park et al. (2007) đã phân tích sự phát triển di truyền

của gen S (spike glycoprotein gene) và gen M trên các mẫu virus PED thực địa

phân lập tại Hàn Quốc và chia các chủng virus thành 3 nhóm G1, G2, G3, (G1 có

3dưới nhóm: G1-1, G1-2 và G1-3), các chủng đó rất khác biệt với các chủng từ

Châu Âu. Khi phân tích trình tự gen mã hóa cho màng virus (gen M) từ các mẫu

phân lập tại Trung Quốc, Chen et al. (2008) đã phát hiện có một nhóm mới

(genotype) của virus PED đang lưu hành.

Ở Việt Nam, bê ̣nh tiêu chảy thành dịch ở lợn lần đầu tiên được phát hiện

vào năm 2008, đầu năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và

cs., 2012). Theo các nghiên cứu đã công bố bệnh tiêu chảy thành dịch xảy ra

trên lợn mọi lứa tuổi, lần đầu tiên được xác định là do Porcine Epidemic

Diarrhea Virus (PEDV) tại Việt Nam. Bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh

miền Đông Nam bộ, gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế chăn nuôi heo do làm tăng

tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết cao đặc biệt trên lợn con theo mẹ từ 50 - 100%. Cho đến

nay có rất ít công trình trong nước tiến hành nghiên cứu về loại virus này. Do

Tien Duy et al. (2011) ở Thái Lan đã phân lập và giải trình một số chủng virus

PED trên các mẫu được lấy ở miền Nam Việt Nam trong thời gian từ 2009 đến

2010. Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức từ các công ty, trang trại,

dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010. Việc phòng

chống bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vacxin. Trong

khi các chủng virus thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt

di truyền, do đó việc nắm bắt và cập nhật được các đặc tính phân tử của các

chủng PEDV đóng vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vacxin thích

hợp và hiệu quả phục vụ cho công tác tiêm phòng. Trong khi đó, việc đánh giá

và phân tích đặc điểm di truyền của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam còn

hạn chế, đã gây khó khăn trong việc định hướng sử dụng vacxin trong công tác

phòng bệnh. Do đó, nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, xác định các type virus

đang lưu hành trong nước cũng như tìm hiểu nguồn gốc phát sinh phân loại,

biến đổi di truyền của các type virus này là rất cần thiết cho việc phòng chống

dịch PED cũng như định hướng cho việc nhập khẩu và triển khai sử dụng

vacxin một cách hiệu quả, đồng thời cũng là một nền tảng quan trọng trong việc

định hướng sản xuất vacxin trong nước nhằm đạt hiệu quả miễn dịch cao hơn

cũng như chủ động được nguồn vacxin và tiết kiệm chi phí cho việc nhập khẩu.

Để hạn chế dịch PED, việc nghiên cứu xác định được các chủng virus

gây bệnh, đồng thời giải mã, phân tích hệ gen, xác định được nguồn gốc tiến

hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV là vô cùng quan trọng và là

công việc nghiên cứu hết sức cần thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to

lớn để từ đó góp phần quan trọng trong định hướng chiến lược cho việc sản

xuất vacxin phòng bệnh trong tương lai.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/

thành phố khu vực phía Bắc;

- Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các

genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc.

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi do PEDV giai đoạn 2013 - 2015. Các tỉnh/ thành phố thuộc đồng bằng châu thổ sông

Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình và Vĩnh Phúc) và Trung du - Miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên và Lào Cai).

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam.

- Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành

phố của miền Bắc Việt Nam. Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý của

bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu hành phổ

biến của PED trong các trang trại chăn nuôi.

- Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hoàn chỉnh và 8 trình

tự gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành

tại thực địa không có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng.

- Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh

được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt nam.

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED tại

10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của bệnh,

chứng minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa.

- Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là

tư liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi-Thú y.

- Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức tương

đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và những chủng

vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện pháp phòng chống

bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. GIỚI THIỆU CHUNG

Dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một bệnh

truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống

Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch PED thường xảy ra ở lợn con

dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch PED đã và

đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc

gia trên thế giới (Laude et al., 1993; Lee, 2015). Dịch PED lần đầu tiên được

phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy

ra phổ biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ,

và ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan (Chen et al., 2010;

Chen et al., 2008; Song and Park, 2012; Puranaveja et al., 2009). Ở Việt Nam,

dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh

thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn

trong cả nước (Do Tien Duy et al., 2011).

2.2. LỊCH SỬ BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN

Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn được phát hiện đầu tiên tại nước Anh

vào năm 1971 (Oldham, 1972). Bệnh xảy ra trên lợn vỗ béo với các biểu hiện

lâm sàng giống với bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE), chỉ khác một đặc

điểm quan trọng đó là lợn con đang bú mẹ không mắc bệnh. TGEV và các tác

nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định không phải là nguyên nhân

gây ra bệnh trên. Sau đó căn bệnh này đã lây lan sang các nước châu Âu và được

gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea - EVD).

Năm 1976 căn bệnh tiêu chảy giống TGE lại xuất hiện nhưng xảy ra trên tất cả

lợn ở mọi lứa tuổi, gồm cả lợn con đang trong giai đoạn bú sữa mẹ (Wood,

1977), khả năng nguyên nhân gây bệnh là TGEV và các tác nhân gây bệnh

đường tiêu hóa khác cũng đã được loại trừ. Khi đó, tên EVD loại 2 được đưa ra

để phân biệt với EVD loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971 với sự khác nhau đó là

lợn con đang bú mẹ chỉ mắc EDV loại 2 mà không mắc EDV loại 1.

Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt

bùng phát EVD loại 2 (Chasey and Cartwright, 1978). Kết quả gây bệnh nghiệm

thực cho lợn bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích

đường tiêu hoá biểu hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo. Rõ ràng là

Coronavirus này liên quan tới sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã

được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” (Porcine Epidemic Diarrhea, PED).

2.3. TÌNH HÌNH DỊCH PED TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới

Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính đã

trở nên hiếm có ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng. Hiện nay, các

ổ dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về bệnh

này. Hơn nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và lợn

mới sinh sản, trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh.

Trong thập niên 70 và 80 của thế kỷ XX, dịch PED lưu hành rộng rãi ở

châu Âu, gây bệnh ở lợn mọi lứa tuổi. Trong khoảng thời gian từ cuối thập niên

80 đến thập niên 90, dịch có xu hướng giảm đáng kể, với rất ít ổ dịch rời rạc

được ghi nhận ở một số nước như Tây Ba Nha, Hungary, Anh và cộng hòa Séc

(Carvajal et al., 2015). Trong năm 2005- 2006, dịch PED xảy ra nghiêm trọng ở

Ý, với tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ từ 8,3% đến 11,9% (Martelli et al., 2008).

Từ năm 2014 đến nay, PED được mô tả xuất hiện trở lại ở một số nước như

Đức (Hanke et al., 2015), Ý (Boniotti et al., 2016), Bỉ, Pháp (Grasland et al.,

2014) v.v...

Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các quốc gia châu Á, đặc

biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and Park, 2012).

Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện năm 1973, sau

hơn hai thập kỷ sử dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở lại của PEDV

tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và bùng phát

ngày càng trầm trọng ở các tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn. Từ tháng 2

năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100% (tương ứng

50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012). Ở Nhật, dịch

PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết từ 30 tới

100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc, dịch PED

xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp xuất hiện

ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam. Trong thời

gian cuối năm 2007-2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu tiên ở tỉnh

Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã gây thiệt

hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích cây phát sinh loài, thấy

tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống chủng ở

Trung Quốc JS - 2004 - 2.

2.3.2. Tình hình dịch PED ở Viê ̣t Nam

Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy ở

Việt Nam. Trong năm 2008 - 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền

Đông Nam Bộ gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra

rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử

vong giữa các tỉnh dao động từ 65 - 91%. Theo nhận định của các chuyên gia thì

nguyên nhân của tiêu chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn

(PED) hoặc do viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra. Năm 2010, dịch vẫn

tiếp tục xảy ra ở một số trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch

trong năm 2009. Theo thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt

Nam trong 5 tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có

nhiều ca bệnh nhất là Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ

yếu tập trung ở miền Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình

Phước, Củ Chi). Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức các công ty, trang

trại tại Hải Dương, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên, Thái Bình,

Hà Nam, Nam Định, Hòa Bình,… dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm

trọng từ đầu năm 2010 và cho đến nay tình hình dịch bệnh tại các tỉnh phía Bắc

Việt Nam ngày càng trầm trọng hơn. Các nghiên cứu trước đó tại Viện Thú y

Quốc gia, Trung tâm chẩn đoán Thú y TW, Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH

Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã xác định được các ca nhiễm PED

trên lợn ở phía Bắc Việt Nam.

Ở Việt Nam, hiện tại có rất ít nghiên cứu tiến hành về bệnh PED. Bệnh

được phát hiện từ năm 2008 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và cs.,

2012). Sau đó, bệnh ngày càng lan rộng và bùng phát ở nhiều khu vực. Bệnh gây

thiệt hại nặng nề cho các trang trại bởi tỉ lệ mắc toàn đàn rất cao (gần 100%).

Theo thống kê không chính thức của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt

Nam trong năm tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED. Các trại bị

nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở các tỉnh nam bộ như Đồng Nai, Lâm Đồng,

Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu.

Cũng tại các tỉnh phía Nam, một số nghiên cứu xác định các yếu tố liên

quan lây truyền dịch bệnh cũng như đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích của

dịch tiêu chảy cấp xảy ra ở các trại heo khu vực phía nam để góp phần định

hướng trong việc chẩn đoán bệnh PED và xây dựng biện pháp hạn chế sự lây lan

bệnh này ở các trại heo tại Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012).

Qua khảo sát các ổ dịch tiêu chảy cấp, tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên heo

con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và 81,67%). Hai tỷ lệ này giảm dần

theo lứa tuổi. Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh giữa các trại

phụ thuộc vào: khoảng cách đến với trại heo bị bệnh (trại càng gần có nguy cơ

lây bệnh càng cao), vệ sinh sát trùng (thực hiện trên 2 tuần, một lần có tỷ lệ

nhiễm bệnh cao hơn so với 1 tuần, một lần), quy mô chăn nuôi (tỷ lệ nhiễm bệnh

cao ở trại có quy mô chăn nuôi nhỏ, dưới 50 heo nái), và nguồn nước sử dụng (tỷ

lệ nhiễm bệnh cao ở trại có nguồn nước chưa qua xử lý). Triệu chứng lâm sàng

đặc trưng của dịch tiêu chảy cấp trên heo con là tiêu chảy phân lỏng (100%), ói

mửa (90,33%), sau đó suy nhược, mất nước và chết nhanh. Các bệnh tích thường

gặp ở cơ quan tiêu hóa của heo con là dạ dày căng phồng, chứa sữa đông, thức ăn

không tiêu hóa (94,42%) và thành ruột non mỏng, phồng to, chứa nhiều nước và

dịch chất bên trong (86,33%). Bệnh tích vi thể cũng xảy ra trên cả dạ dày và 3

đoạn của ruột non với sự hư hại nặng phần niêm mạc và các tuyến. Các kết quả

này góp phần định hướng trong việc chẩn đoán bệnh PED và xây dựng biện pháp

hạn chế sự lây lan bệnh này ở các trại heo tại Việt Nam.

Ở khu vực phía Bắc, các nghiên cứu đã xác định được bệnh tiêu chảy thành

dịch trên lợn (Porcine epidemic diarrhea: PED) xảy ra tại 26 trại ở 6 tỉnh, trong

đó một số trại cộng nhiễm cả TGEV và Rotavirus. Tại các trại, PED thường bùng

phát vào mùa lạnh (từ tháng 11 đến tháng 4), thời gian lây lan nhanh, thường xảy

ra đầu tiên trên đàn lợn nái, tỷ lệ lợn biểu hiện tiêu chảy cao (trung bình 76,8%).

Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều bị tiêu chảy (có thể lên tới 100%), tỷ lệ chết cao ở

lợn con theo mẹ (68,6%). Có sự khác biệt lớn về mức độ cảm nhiễm, tỷ lệ biểu

hiện tiêu chảy, tỷ lệ chết, thời gian tiêu chảy giữa các trại và giữa các nhóm tuổi,

giới tính. Triệu chứng chủ yếu ở lợn mắc PED là tiêu chảy, nôn mửa, bỏ ăn, kèm

theo các rối loạn về hô hấp, thần kinh, mức độ trầm trọng tăng dần theo tuổi.

Bệnh tích đại thể ở lợn con thường gặp là thành ruột non mỏng, căng phồng toàn

bộ hoặc từng đoạn (61,3 - 94%); dạ dày sung huyết, xuất huyết (19,4 - 84%);

hạch lympho màng treo ruột, gan sung huyết, ứ huyết; tĩnh mạch màng treo ruột

sung huyết nặng, khó quan sát thấy mạch bạch huyết ở màng treo ruột. Bệnh tích

vi thể chủ yếu đường tiêu hóa: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô hấp

thu thoái hóa không bào; biểu mô phủ dạ dày, ruột bong tróc; sung huyết, xuất

huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ở lớp đệm và lớp hạ niêm mạc đường tiêu hóa

(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014).

Việc ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy do virus

PED ở lợn con theo mẹ dưới 10 ngày tuổi, cho thấy: Các lợn con bị mắc PED

thường có biểu hiện sốt, chán ăn, bỏ ăn, tiêu chảy phân nhiều nước, màu vàng

xám, có sữa không tiêu, lợn gầy yếu, ủ rũ, mệt mỏi. Dạ dày căng phồng chứa

thức ăn không tiêu, ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng, chứa dịch màu

vàng, hạch màng treo ruột sưng to. Kết quả phản ứng RT-PCR đã chỉ ra rằng các

lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như trên đều mắc PED (Nguyễn

Văn Điệp và cs., 2014).

Bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra có tính lây lan nhanh tuy nhiên chưa có

loại vacxin nào phòng bệnh thì nguy cơ tái phát, nguy cơ biến chủng của virus

cũng là vấn đề rất đáng lo ngại. Trước tình hình đó, việc hiểu biết về đặc điểm

căn bệnh và chẩn đoán nhanh là hết sức cấp thiết trong phòng chống dịch bệnh,

bảo vệ sức khỏe vật nuôi và kinh tế cho người chăn nuôi.

2.4. CĂN BỆNH

2.4.1. Phân loại và hình thái của PEDV

Dựa trên đặc điểm kháng nguyên và di truyền, virus PED (PEDV) được xếp

vào chi Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, coronavirus ở mèo, chó

và coronavirus 229E ở người (Gonzalez et al., 2003). Hạt PEDV mang những

điểm đặc trưng của họ Coronaviridae. Theo phân loại về huyết thanh học, người

ta xác định vius PED hiện mới chỉ có 1 serotype. Các chủng PEDV phân lập từ

châu Âu, Hàn Quốc và Trung Quốc đều tương đồng về mặt huyết thanh với

chủng CV777 phân lập từ thực địa ở Bỉ năm 1978 (Kweon et al., 1993).

Hình thái của PEDV trong tế bào biểu mô đường tiêu hoá tương tự như các

coronavirus khác (Ducatelle et al., 1982). Virus có một nhân đậm đặc điện tử với

quầng sáng ở giữa và những phần toả ra từ nhân dạng chuỳ dài xấp xỉ 20 nm. Hạt

virus xác định từ mẫu phân có hình thái đa dạng và đường kính từ 90 đến 190 nm

(minh họa tại hình 2.1) (Debouck et al., 1981). Virus nhân lên thông qua việc nẩy

Hạt virus được nhuộm với urany acetat 2%, chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm.

chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ.

Nguồn: Kweon et al. (1993)

Hình 2.1. Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc

2.4.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngoài, vật chất di

truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28 kb (hình 2.2). Hệ gen

bao gồm ít nhất bảy khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein cấu trúc [gai (S), vỏ

(E), màng (M) và nucleocapsid (N)] và 3 loại protein không cấu trúc (replicase

1a, 1b và ORF3), với thứ tự trên hệ gen 5’-replicase (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’

(Bridgen et al., 1993; Bridgen et al., 1998; Duarte et al., 1994; Kocherhans et al.,

2001). Gen polymerase gồm 2 khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) 1a

và 1b, chiếm 2/3 bộ gen tính từ đầu 5’ và mã hoá cho các polyprotein tái bản

không cấu trúc (replicase 1a và 1b). Các gen mã hoá cho protein cấu trúc chính

như S (150-220 kDa), E (7 kDa), M (20-30 kDa) và N (58 kDa) nằm ở vị trí tiếp

nối gen polymerase. Gen ORF3 là một gen phụ trợ, nằm giữa các gen cấu trúc.

Nó mã hoá cho một protein bổ trợ, số lượng và trình tự của các gen thay đổi ở

các coronavirrus khác nhau (Narayanan et al., 2008).

Bộ gen virus PED

Đầu 3’

Đầu 5’

Khung đọc mở 1a

Khung đọc mở 1b

Nguồn: Song et al. (2012)

Hình 2.2. Mô hình cấu trúc và bộ gen PEDV

Protetin cấu trúc của PEDV tương tự như các coronavirus khác. Virus có

một protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein

màng (M) 27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với ARN nặng 57-58 kDa

(Duarte et al., 1994; Duarte et al., 1994). Protein S của PEDV là glycoprotein

loại 1 gồm 1383 amino acid (aa). Nó chứa một chuỗi peptid tín hiệu (1-18 aa),

các epitop trung hoà (499-638, 748-755), 764-771, và 1368-1374), một vùng

xuyên màng (1334 – 1356), và một vùng ngắn nằm trong bào tương. Protein S

cũng có thể được chia thành vùng S1 (1-789 aa) và vùng S2 (790-1383 aa) dựa

trên tính tương đồng của nó ở coronavirus khác nhau. Giống như các protein S

của coronavirus khác, protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng

nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều

hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong

quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên

(Chang et al., 2002). Ngoài ra, glycoprotein S cũng liên quan tới sự thích nghi

sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc lực khi gây bệnh

trên động vật (Park et al., 2007). Trong nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh,

hiện tại các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào glycoprotein này (Puranaveja et

al., 2009).

ORF3 là gen mã hoá cho protein không cấu trúc và là protein phụ trợ,

không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV. Tuy nhiên các nghiên cứu

gần đây đã chỉ ra chức năng quan trọng của protein này trong việc quyết định

độc tính của PEDV. Sự biến đổi của gen ORF3 trong quá trình cấy chuyển

nhiều lần trên tế bào có thể làm giảm độc tính của chủng thực địa. Sự khác biệt

của gen ORF3 cũng được thể hiện rõ rệt giữa các chủng thực địa và các chủng

nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Wongthida et al., 2017; Park et al., 2008).

Protein M là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc

màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng

gắn carboxy ở bên trong (Utiger et al., 1995). Protein M không chỉ đóng vai trò

quan trọng trong chu trình lắp ráp virus (Nguyen and Hogue, 1997) mà còn trong

việc tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể (Saif, 1993).

Protein M có thể đóng một vai trò trong quá trình tạo ra α-interferon (Laude et

al., 1992). Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép tạo thành các hạt

giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus

hoàn chỉnh. Việc tiến hành thêm các nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng

thêm hiểu biết của chúng ta về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng

PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa (Chen et al., 2010).

2.4.3. Đặc tính nuôi cấy của virus

Đặc tính nuôi cấy trong môi trường tế bào: ban đầu, việc nhân PEDV

được thực hiện bằng cách gây nhiễm cho lợn con theo đường miệng (Debouck

and Pensaert, 1980), bằng cách cho lợn con uống virus. Việc nuôi cấy virus

trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn, người ta

đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng rất ít thành công. Phân lập

virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học, và công

tác quản lý dịch bệnh.

Hofmann and Wyler (1988) đã nghiên cứu thành công môi trường tế bào

thích hợp để PEDV phát triển, nhân lên và có thể phân lập được virus. Đến

nay, tế bào Vero (thận khỉ xanh châu Phi) có thể cấy chuyển được PEDV, gây

bệnh tích tế bào, tuy nhiên, sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt

của men trypsin trong môi trường nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy, virus

tác động lên tế bào hình thành các không bào và thể hợp bào (có thể lên tới

100 nhân). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Ngoài ra, PEDV

đã được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng quang lợn ở

Nhật Bản (Shibata et al., 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản (P-5V) đã

được sử dụng làm chủng virus vacxin và được nuôi cấy trên các dòng tế bào

lợn KSEK6 và IB - RS2.

2.4.4. Sức đề kháng của virus gây bệnh PED

PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 4oC và giữa pH 6,5 – 7,5 tại 37oC, bất

hoạt khi pH < 4 và pH > 9. Trong môi trường nuôi cấy thích nghi, virus bị mất

khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 60oC trong vòng 30 phút, nhưng ổn định ở

50oC. Virus mẫn cảm với ether, chloroform và không gây ngưng kết hồng cầu

của nhiều loài. PEDV bị bất hoạt bởi hầu hết các chất khử trùng bao gồm cả:

cresol, natri hydroxyt 2% (NaOH 2%), formol 1%, natri cacbonate (4% muối

khan hoặc 10% dạng tinh thể với 0,1% chất tẩy rửa), chất tẩy rửa có ion và

không ion, iodophor mạnh (1%) trong acid phosphoric và chloroform

(Callebaut et al., 1982).

Nguồn: Kim et al. (2018)

Hình 2.3. Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian

Về sức đề kháng với nhiệt độ, PEDV không bền với nhiệt độ, bị bất hoạt nhanh chóng ở nhiệt độ phòng sau 2 ngày. Ngược lại, ở nhiệt độ 4oC, virus tồn

tại trong khoảng 2 tuần (Kim et al., 2018).

2.4.5. Dịch tễ học lâm sàng

2.4.5.1. Loài vật mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở loài lợn, ở mọi lứa tuổi. Trong nhiều ổ dịch tỷ lệ lợn ốm lên

đến 100%, tỷ lệ chết trung bình ở lợn con là 50% nhưng cũng có thể rất cao đến

100% (Lee, 2015). Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 - 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết

100%. Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 - 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng

50%. Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi > 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30%.

2.4.5.2. Phương thức truyền lây

Phương thức truyền lây của PEDV tương tự với TGEV, nhưng PEDV có

xu hướng tồn tại dễ dàng hơn trên lợn đã bị nhiễm bệnh. Đường truyền phân

miệng có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác. PED

cấp tính thường xảy ra ở thời điểm 4 – 5 ngày sau khi lợn bán hoặc mua về.

Virus có thể xâm nhập vào trại thông qua lợn nhiễm virus được chuyển về

hoặc các dụng cụ có mang virus như: xe vận chuyển, ủng, quần áo bảo hộ…

đây là những nguồn lây nhiễm tiềm năng cho lợn mẫn cảm. PEDV không khác

nhiều TGEV về đường truyền lây nhưng virus này có vẻ tồn tại lâu hơn trong

các trang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi. Khi dịch xảy ra ở trại lợn

sinh sản, virus có thể được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa

phương. Một chu kỳ dịch địa phương có thể được hình thành nếu số lợn được

sinh ra và lợn cai sữa trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của virus thông

qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn

dịch tại thời điểm cai sữa. PEDV có thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con

sau cai sữa ở những trại như vậy. Nguyên nhân khác dẫn tới bệnh PED lưu

hành ở một trang trại là do hiện tượng mang và thải virus một cách liên tục,

trong vòng 1 tháng kể từ khi lợn bị nhiễm và qua khỏi (Crawford et al., 2015).

Ngoài con đường bài thải qua phân, một số công bố gần đây còn cho thấy

PEDV có khả năng bài thải qua sữa. Do đó, các tác giả này giả thiết rằng sữa là

một con đường truyền dọc quan trọng của PEDV từ mẹ sang con (Sun et al.,

2012). Hiện vẫn còn ít nghiên cứu về đường truyền lây này của PEDV.

2.4.5.3. Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế sinh bệnh của PEDV được nghiên cứu trên lợn con không được

uống sữa đầu. Cho lợn con 3 ngày tuổi uống chủng CV777 sau khoảng 22 đến 36

giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy (Debouck et al., 1980).

Vị trí và sự nhân lên của virus được xác định thông qua kỹ thuật miễn dịch

huỳnh quang và kính hiển vi điện tử. PEDV nhân lên trong bào tương của các tế

bào lông nhung, phá huỷ các tế bào biểu mô và làm ngắn lông nhung niêm mạc

ruột, tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung và tuyến ruột có thể giảm từ 7:1 xuống còn

3:1 (Pospischil et al., 2002). Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn

cảm với PEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể được quan sát sau 12-

18 giờ gây nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 đến 36 giờ, tuy nhiên ít quan sát thấy có

sự phá hủy tế bào biểu mô ở kết tràng (Guscetti et al., 1998). Đặc điểm sinh bệnh

của PEDV ở ruột non của lợn con rất giống với TGEV. So với TGEV, sự nhân

lên và lây lan trong ruột non của virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung

bệnh lâu hơn.

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được

nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan

sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên

hoặc được gây nhiễm. Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm

cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ. Hiện vẫn chưa có cơ chế

thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo

việc hoại tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành

(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014).

Vị trí nhân lên của virus được xác định thông qua kĩ thuật miễn dịch huỳnh

quang và kính hiển vi điện tử. Nghiên cứu của Shibata và cộng sự đã chỉ ra rằng

ở lợn sạch bệnh (specific pathogen free) khi được uống virus PED phân lập từ

thực địa ở độ tuổi từ 2 ngày đến 12 tuần, sức đề kháng tăng dần theo tuổi và lợn

chỉ bị chết khi trong giai đoạn từ 2 - 7 ngày tuổi (Shibata et al., 2001). Cơ chế

sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết,

nhưng bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt

trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm.

Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay

không vẫn chưa rõ.

Biểu hiện và tiến triển lâm sàng của lợn sạch bệnh bị gây nhiễm chủng

PEDV đã thích nghi trên môi trường nuôi cấy tế bào (ca - PEDV) nhẹ hơn nhiều

so với lợn nhiễm chủng thể hoang dại (wt - PEDV), độc lực của chủng ca -

PEDV yếu hơn nhiều, tốc độ sinh sản của virus chậm hơn và sự biến đổi về mặt

vi thể ở các cơ quan của lợn nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn (Lin et al., 2017).

2.5. DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

Để xác định mối quan hệ giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả

hệ (phylogenetic tree) và đặc điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự

gen S, M, và ORF3 (Song and Park, 2012) đôi khi cả gen E (Park et al., 2011).

Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý chia PEDV thành

3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các nhóm nhỏ hơn

(G1-1, G1-2, và G1-3) (Park et al., 2007). Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự

gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở Trung Quốc, Hàn

Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác biệt với các chủng

PEDV phân lập được từ các quốc gia thuộc châu Âu (Do Tien Duy et al., 2011;

Puranaveja et al., 2009; Park et al., 2007; Park et al., 2011).

Phân tích mối liên hệ gen giữa các chủng PEDV có thể được thực hiện trên

cơ sở phân tích toàn bộ hệ gen của virus. Nhiều nghiên cứu cho thấy trình tự của

gen mã hóa spike protein hoặc phân đoạn gen mã hóa vùng S1 của spike protein

(amino acid 1- 735) là phù hợp để phân tích đặc điểm tiến hóa của virus (Chen et

al., 2014; Lee et al., 2010; Chung et al., 2015). Theo tác giả Lee (2015), mặc dù

chỉ có 1 serotyp duy nhất, PEDV có thể được chia làm 2 genogroup: nhóm G1 cổ

điển (G1, classical) và nhóm G2 (field epidemic/ pandemic). Mỗi nhóm lại được

chia thành nhiều dưới nhóm: 1a, 1b và 2a, 2b.

Nhóm G1a bao gồm chủng nguyên mẫu CV777, chủng virus vacxin và các

chủng virus thích nghi trên tế bào. Nhóm G1b bao gồm một số biến chủng mới

được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2011 (Li et al., 2012), sau đó

được phát hiện ở Mỹ vào năm 2014 (Wang et al., 2014), ở Hàn Quốc năm 2013

(Lee et al., 2014; Cho et al., 2014) và một số nước châu Âu (Hanke et al., 2015;

Theuns et al., 2015; Grasland et al., 2014). Nhóm G2 bao gồm các chủng virus

thực địa, được chia thành dưới nhóm 2a (gây ra các vụ dịch PED ở châu Á trước

đây) và dưới nhóm 2b (gây ra các vụ dịch PED ở châu Á và bắc Mỹ gần đây).

Theo tác giả Lee (2015), các nhóm di truyền của PEDV có hiện tượng

truyền lây qua lại giữa các nước trong khu vực và giữa các châu lục (châu Á-

châu Mỹ). Các con đường truyền lây được tóm tắt ở hình 2.4.

Mũi tên nét liền biểu hiện đường truyền lây đã được biết giữa các nước;

mũi tên nét chấm là đường truyền lây dự đoán.

Nguồn: Lee (2015)

Hình 2.4. Con đường truyền lây của PEDV

Nhóm cổ điển G1a lưu hành ở Trung Quốc có thể xuất phát từ việc sử dụng

các chủng virus vacxin hoặc do nhập lậu chủng virus vacxin nhược độc từ Hàn

Quốc. Nhóm G2a bắt nguồn từ Hàn Quốc, lây lan sang Trung Quốc và sau đó lây

sang các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Việt Nam. Nhóm G2a ở các nước

Đông Nam Á cũng có thể bắt nguồn trực tiếp từ Hàn Quốc. Nhóm di truyền mới

nổi G1b và G2b hình thành ở Trung Quốc có thể là kết quả của quá trình tái tổ

hợp giữa virus thuộc nhóm G1a và G2a lưu hành tại nước này. Cả 2 nhóm này

sau đó lây lan gần như đồng thời sang Mỹ, và sau đó xuất hiện ở Hàn Quốc, một

số nước bắc Mỹ, nam Mỹ và có thể cả Nhật Bản và Đài Loan.

Trong một nghiên cứu khác, dựa vào hiện tượng thêm - xóa ở gen mã hóa

spike protein, có thể chia PEDV làm 2 nhóm: NON- S INDEL và S INDEL). Ở

Mỹ, những biến thể thuộc nhóm S INDEL gây ra các ổ dịch có triệu chứng lâm

sàng nhẹ (Vlasova et al., 2014). Các chủng PEDV phân lập được ở châu Âu

(Đức, Ý, Bỉ, Hà Lan và Pháp) vào năm 2014 và 2015 đều thuộc nhóm S INDEL

cùng với nhóm lưu hành ở Mỹ. PEDV thuộc nhóm non - S INDEL đã được phát

hiện ở Ukraina, gây bệnh nghiêm trọng ở lợn dưới 10 ngày tuổi, với tỷ lệ chết lên

tới 100% (Dastjerdi et al., 2015).

2.6. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA LỢN MẮC PED

2.6.1. Triệu chứng lâm sàng

Các mức độ nghiêm trọng gây ra bởi PEDV là rất khác nhau, phần lớn phụ

thuộc vào tình trạng miễn dịch và tình hình dịch bệnh ở các trang trại lợn. Khi

lợn mắc PED, biểu hiện chủ yếu và thường là duy nhất ở lợn đó là tiêu chảy

mạnh, phân rất nhiều nước. Lợn có hiện tượng bỏ ăn, mệt mỏi. Lợn con theo mẹ:

gầy, lười bú, ỉa chảy, phân lỏng, tanh, màu vàng, có sữa không tiêu; nôn mửa,

lợn con sụt cân nhanh do mất nước. Lợn con thích nằm lên bụng mẹ, điều trị

bằng các loại kháng sinh đặc trị tiêu chảy không có kết quả.

Lợn sinh sản: tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết rất khác nhau. Lợn thường qua khỏi sau

1 tuần. Bệnh xảy ra ở những trại giống mẫn cảm có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong rất

khác nhau. Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc với tỷ lệ có thể lên tới 100%.

Biểu hiện của PED tương tự TGE, tuy rằng PED lây lan chậm hơn và có tỷ lệ

chết ở lợn con thấp hơn. Lợn con dưới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nước sau

khi tiêu chảy 2 - 4 ngày. Tỷ lệ chết ở lợn con trung bình khoảng 50%, nhưng có

thể cao hơn tới 100%. Ở giai đoạn lớn hơn, lợn thường tự hồi phục sau khi quá

trình tiêu chảy kéo dài được 1 tuần. Khi PED cấp tính ở 1 trại nào đó qua đi thì

lợn con giai đoạn 2 - 3 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và lợn

mới nhập về thường phát bệnh. Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp tính

điển hình với tỷ lệ chết cao trên lợn sơ sinh hiếm xảy ra ở châu Âu, nhưng các ổ

dịch tại Nhật Bản và Hàn Quốc lại cho thấy tỷ lệ lợn sơ sinh chết rất cao

(Sueyoshi et al., 1995; Chae et al., 2000).

Ở lợn trong giai đoạn nuôi vỗ béo, nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong

vòng một tuần, tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy. Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt

mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nước. Biểu hiện về mặt lâm sàng ở lợn mắc PED

đang trong giai đoạn nuôi vỗ béo có thể nặng hơn so với mắc TGE. Sau khoảng

7-10 ngày, lợn sẽ hồi phục. Tỷ lệ tử vong ở lợn trong giai đoạn vỗ béo thường từ

1-3%, lợn chết nhanh, thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trước khi

có biểu hiện tiêu chảy. Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại có lợn giống

mẫn cảm và chịu nhiều stress (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014).

2.6.2. Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của lợn mắc PED tương tự như ở bệnh TGE,

thậm chí khó phân biệt với bệnh do porcine deltacoronavirus gây ra (Chen et al.,

2015). Dạ dày trống rỗng do lợn nôn, và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch

dưỡng do sự kém hấp thu ở ruột. Các đoạn ruột non chứa đầy dịch, căng phồng,

thành ruột mỏng tới mức có thể nhìn thấy do sự teo lại của tầng niêm mạc. Chất

chứa trong ruột non lợn cợn.

Lợn con đang theo mẹ chết do PED, xác gầy, khô do tiêu chảy nặng, phần

mông dính nhiều phân vàng. Ruột căng phồng, đầy dịch, màu vàng, chứa những

cục sữa chưa tiêu. Thành ruột mỏng và trong. Hạch lâm ba màng treo ruột xuất

huyết nhẹ. Lát cắt ngang ruột non của lợn bị nhiễm virus PED. Lông nhung ruột

(A) lợn sơ sinh tiêu chảy và mất nước nghiêm trọng, (B) dạ dày ruột viêm và sung huyết,

non của lợn bị ngắn lại.

Nguồn: Puranaveja et al. (2009)

Hình 2.5. Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED

Về mặt vi thể, sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào biểu

mô và sự bong tróc của các tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hoà

lẫn vào nhau rõ rệt, tuy rằng các biểu hiện này không trầm trọng bằng bệnh TGE

(Coussement et al., 1982). Bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, PEDV

được phát hiện chủ yếu ở các tế bào biểu mô lông nhung ruột. Ở kết tràng, chưa

có bệnh tích vi thể nào được báo cáo. Điều thú vị là các nghiên cứu siêu vi thể đã

cho thấy có sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương tế bào và sự

thay đổi tế bào ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng. Những sự thay đổi cấu

trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi

nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang ruột

(Pospischil et al., 1981). Sau đó, các tế bào trở nên dẹt hơn, liên kết vòng bịt giữa

các tế bào biểu mô mất đi và tế bào được giải phóng vào bên trong lòng ống ruột.

2.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PEDV

2.7.1. Phát hiện virus

Do các virus gây ra tiêu chảy có các đặc điểm lâm sàng tương đối giống

nhau nên không thể dựa vào các đặc điểm này để chẩn đoán PEDV, do đó việc

chỉ ra sự có mặt của PEDV được thực hiện trong các phòng thí nghiệm

(Kusanagi et al., 1992; Pijpers et al., 1993). Nhiều kỹ thuật được sử dụng trong

việc phát hiện PEDV như miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi điện tử

hoặc phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).

Kỹ thuật RT-PCR và các biến thể của nó được ứng dụng phổ biến để phát

hiện sự có mặt của PEDV trong mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc PED. Trong

phương pháp này các cặp mồi được thiết kế bắt cặp đặc hiệu với trình tự

nucleotide ở một trong các gen sau: gen S, M hoặc gen mã hóa protein ORF3.

Các kỹ thuật này có thể được phân loại như sau: (i) phản ứng RT-PCR đơn phát

hiện PEDV (Ishikawa et al., 1997; Kweon et al., 1997); (ii) phản ứng RT-PCR

phân biệt giữa chủng PEDV vacxin và chủng PEDV gây bệnh thực địa (Park et

al., 2013; Zhu et al., 2016), hoặc phân biệt giữa các nhóm PEDV gây bệnh ở

thực địa (Liu and Wang, 2016); (iii) phản ứng RT-PCR nhiều đích phát hiện

đồng thời/ chẩn đoán phân biệt các nguyên nhân gây tiêu chảy: phân biệt PEDV

và TGEV (Kim et al., 2007; Jung and Chae, 2005); phân biệt PEDV và Porcine

deltacoronavirus (Zhang et al., 2016); phát hiện PEDV, TGEV và group A

rotavirus (Song et al., 2006; Ben et al., 2010); phát hiện PEDV, TGEV, group A

rotavirus và PCV2 (Zhao et al., 2013).

Kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phương pháp RT-PCR (Reverse transcription

polymerase chain reaction) được phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí

nghiệm và từ thực địa (Utiger et al., 1995). Để khẳng định sự có mặt của PEDV

trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen M

(Kweon et al., 1997). Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ

bản, đã có rất nhiều những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như

việc sử dụng multiplex-RT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều

virus khác nhau, là một kỹ thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ

nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ

dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006). Kim and Chae (2002) đã so sánh ba kỹ

thuật (phản ứng RT-PCR, hóa miễn dịch và lai tại chỗ) để xác định PEDV. Tác

giả kết luận rằng RT-PCR xác định sự có mặt của PEDV thường xuyên hơn các

phương pháp khác. Mặc dù chỉ áp dụng được trên các mô cố định bằng formalin,

hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ có thể là một công cụ hiệu quả để xác định kháng

nguyên PEDV và axit nucleic của virus.

RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ

thuật hữu dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản. Trong kỹ thuật

này, 4-6 mồi được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng ADN đích, điều này tạo ra tính

đặc hiệu cao hơn so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra

số lượng lớn hơn các đoạn ADN (Ren and Li, 2011). Các kit phân tích

Immunochromatography cũng được sử dụng phổ biến ở các trại chăn nuôi để

phát hiện PEDV trên cơ sở protein S với độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 98%. Kỹ

thuật này có độ chính xác kém hơn RT-PCR tuy nhiên cho phép chẩn đoán nhanh

trong vòng 10 phút (Song and Park, 2012). Hiện nay, với sự phát triển của kỹ

thuật nhân gen đặc hiệu sử dụng enzyme trong điều kiện đẳng nhiệt, một số

phương pháp nhằm thay thế RT-PCR đã được phát triển như: reverse

transcription loop-mediated isothermal amplification (Ren and Li, 2011; Yu et

al., 2015). Một số tác giả đã phát triển kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt kết hợp với

que thử nhanh (vertical flow visualization strip) cho phép phát hiện PEDV với độ

nhạy và độ đặc hiệu cao (Wang et al., 2016; Gou et al., 2015). Kết quả thực hiện

Hình ảnh que thử nhanh phát hiện PEDV (A); kết quả điện di kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP (B) và

RT-PCR (C); kết quả LAMP dưới ánh sáng xanh (D) và quan sát bằng mắt thường (E).

được minh họa ở hình 2.6.

Nguồn: Wang et al. (2016)

Hình 2.6. So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV

Kết quả phát hiện PEDV bằng phương pháp reverse transcription loop-

mediated isothermal amplification kết hợp với vertical flow visualization strip

(hình 2.6 A) có độ nhạy tương tự như phương pháp reverse transcription loop-

mediated isothermal amplification (hình 2.6 D, E).

Ngoài các công cụ chẩn đoán trên, kit sắc ký miễn dịch khá tiện dụng bởi

chúng có thể được sử dụng ngay tại trang trại dùng phát hiện protein S của

PEDV với độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 98%. Kỹ thuật này tuy ít chính xác hơn

RT-PCR nhưng lại cho phép có được kết quả chẩn đoán nhanh chỉ trong vòng 10

phút. Do đó, nó đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần kết quả chẩn đoán nhanh,

chính xác để kịp thời đưa ra những quyết định, chính sách liên quan đến công tác

kiểm dịch bệnh và giết mổ động vật.

Gần đây, kỹ thuật ELISA dựa vào protein đã được hoàn thiện để chẩn đoán

virus PED. Trong kỹ thuật này kháng thể đa dòng được tạo ra thông qua gây

miễn dịch cho thỏ từ sản phầm của gen M biểu hiện trên vi khuẩn E.coli. Bằng

phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF) sử dụng kháng thể kháng protein M có

thể xác định đặc hiệu sự có mặt của PEDV ở các tế bào bị nhiễm. Kết quả sử

dụng ELISA phong bế và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp đã phát hiện được sự

có mặt của kháng thể kháng PEDV ở ngày thứ 7 và từ ngày 10 đến ngày 13 sau

khi gây nhiễm. Với các xét nghiệm ứng dụng hai phương pháp này, cần lấy mẫu

huyết thanh lần thứ 2 (khi con vật đang hồi phục) và kiểm tra sau ít nhất 2-3 tuần

kể khi có hiện tượng tiêu chảy. Kháng thể PED được xác định bằng xét nghiệm

ELISA ức chế (ELISA-blocking test) và IF ức chế (IF-blocking test) đã cho thấy

kháng thể duy trì ít nhất một năm trong cơ thể con vật.

2.7.2. Chẩn đoán phân biệt

Ngoài tiêu chảy do PEDV, có nhiều bệnh khác cũng gây ra triệu chứng tiêu

chảy, đó là phản ứng của cơ thể và hậu quả có liên quan đến đường ruột như:

Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm (Transmissible gastroenteritis, TGE):

nguyên nhân do virus thuộc họ Coronavirus, bệnh lây lan nhanh và tỷ lệ chết của

lợn con rất cao. Bệnh xảy ra ở lợn con dưới 2 tuần tuổi, lợn mất nước, sút cân

nhanh, nôn mửa, ỉa chảy phân nhiều nước, màu vàng hoặc hơi xanh, lổn nhổn

mùi khó chịu. Bệnh tích là thành ruột non mỏng, dạ dày chứa sữa không tiêu màu

trắng do TGEV phá hủy nhung mao ruột. Ở lợn trưởng thành bệnh ở thể mang

bệnh ít biểu hiện.

Bệnh do Rotavirus: bệnh do virus thuộc họ Reoviridae gây ra, thường xảy

ra ở lợn 1-5 ngày tuổi, tỷ lệ chết cao 50 - 100%. Triệu chứng điển hình là phân

nhão như hồ sau phân lẫn nhiều nước màu vàng trắng hoặc xám, chứa nhiều chất

vón. Do virus cư trú, hủy hoại làm thoái hóa lớp nhung mao ruột làm khả năng

tiêu hóa và hấp thu kém nên khi lợn khỏi bệnh nếu được nuôi tiếp lợn sẽ còi cọc

và chậm lớn.

Bệnh do deltacoronavirus (PDCoV): các nhà khoa học trên thế giới đã phát

hiện được một loại virus mới được đặt tên là deltacoronavirus họ Coronaviridae.

Virus này được xác định gây bệnh với những bệnh tích rất dễ nhầm lẫn với bệnh

tích do PED và TGE (Jung et al., 2015): thành ruột non mỏng, trong suốt, tích tụ

(A) Thành ruột non và kết tràng mỏng và trong (mũi tên), (B) hiện tượng teo lông nhung ở lợn gây nhiễm và (C) lông nhung ruột non bình thường của lợn đối chứng. Tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu

phát hiện PDCoV ở đoạn không tràng (J) và manh tràng (K) ở lợn gây nhiễm. Không phát hiện được tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu ở lợn đối chứng (L).

một lượng lớn chất lỏng màu vàng (hình 2.7).

Nguồn: Jung et al. (2015)

Hình 2.7. Bệnh tích của lợn gây nhiễm bởi PDCoV

2.7.3. Phân lập virus

Trong các nghiên cứu đầu tiên, PEDV được cấy chuyển in vitro bằng cách

cho lợn uống huyễn dịch ruột của lợn mắc tiêu chảy trong giai đoạn đầu (Debouck and Pensaert, 1980). Phương pháp này thu được virus có hiệu giá/ ml là 105 liều

gây nhiễm cho lợn (pig infectious dose). Việc tiếp đời và thích nghi PEDV trên

môi trường tế bào là tương đối khó, với nhiều loại tế bào kết hợp với bổ sung/

không bổ sung trypsin và pancreatin đều không phù hợp cho sự nhân lên của

virus. Tuy nhiên, tế bào Vero (African green monkey kidney) có thể dùng để

thích nghi và tiếp đời PEDV, trong điều kiện bổ sung trypsin (Hofmann and

Wyler, 1988). Tế bào nhiễm PEDV hình thành không bào trong nguyên sinh chất

và hình thành thể hợp bào (syncytia) với số lượng nhân khác nhau, có thể lên tới

100 nhân (Hofmann and Wyler, 1988). PEDV thích nghi trên tế bào Vero có thể

được tiếp đời trên các dòng tế bào khác như MA104, tế bào bàng quang của lợn,

tế bào thận lợn (Shibata et al., 2000; Kusanagi et al., 1992).

2.8. PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH

Cho tới khi được 4 - 13 ngày tuổi, lợn con sinh ra từ lợn mẹ đã có miễn

dịch sẽ được bảo vệ khỏi PEDV nhờ kháng thể IgG truyền qua sữa đầu; độ dài

miễn dịch phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể của lợn mẹ. Sau khi lợn mẹ cảm

nhiễm với kháng nguyên trong ruột, các tế bào sinh miễn dịch IgA di chuyển tới

tuyến vú nơi chúng cố định và chế tiết kháng thể IgA vào sữa đầu. Do đó, khi

thiết kế vacxin, cần lưu ý trục miễn dịch “ruột- tuyến vú” để tạo ra miễn dịch qua

sữa hiệu quả.

Lợn con thường xuyên bú sữa từ lợn mẹ đã có miễn dịch sẽ được bổ sung

liên tục vào đường tiêu hoá của nó một lượng kháng thể IgA, đây là quá trình

tiếp nhận miễn dịch thụ động. Lượng IgG chiếm hơn 60% lượng

Immunoglobulin trong sữa đầu. Tuy nhiên IgA hiệu quả hơn trong việc trung

hoà mầm bệnh lây nhiễm qua đường miệng hơn là IgG hay IgM bởi nó bền

vững hơn trước sự phân huỷ protein trong đường ruột và có khả năng trung hoà

virus cao hơn IgG và IgM. Vì thế việc truyền IgA thụ động từ những con mẹ có

miễn dịch sẽ gây ra khả năng miễn dịch tốt ở lợn con trong giai đoạn bú mẹ.

Tuy nhiên, những kháng thể này không thể bảo vệ chúng khỏi lây nhiễm PEDV

qua đường tiêu hoá.

Cho đến nay, một số vacxin phòng bệnh PED chế từ các chủng virus có

trình tự gen, độc lực, cách thức phân bố khác nhau vẫn được tiếp tục nghiên cứu

và hoàn thiện. Virus dòng CV777 đã thích ứng trên với môi trường tế bào có

trình tự gen khác biệt rõ rệt so với chủng CV777 phân lập từ thực địa, sự khác

biệt này liên quan tới việc suy giảm mạnh độc lực của virus cũng như việc giảm

nhẹ mức độ thay đổi mô bệnh học ở lợn mắc bệnh. Tuy nhiên ở châu Âu, bệnh

gây bởi PEDV không quan trọng về mặt kinh tế đủ để người ta tiến hành sản xuất

vacxin. Chính vì vậy, thử nghiệm hoàn thiện vacxin chủ yếu được tiến hành ở

các nước Châu Á, nơi PED bùng phát trầm trọng với tỷ lệ tử vong gia tăng ở lợn

con sơ sinh. Một vacxin khác dùng cho lợn con đang bú mẹ có thể chế từ virus đã

suy giảm độc lực thu được qua việc cấy chuyển nhiều đời (93 đời cấy chuyển)

của PEDV trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero. Ở Nhật Bản, một loại vacxin

nhược độc thương mại sản xuất từ chủng PEDV (P-5V) thích ứng trên tế bào

nuôi cấy đã được dùng cho lợn nái từ năm 1997. Mặc dù những vacxin này được

xem là khá hiệu quả, tuy nhiên không phải tất cả lợn nái sử dụng vacxin đều tạo

được miễn dịch qua sữa ổn định.

Tại Hàn Quốc, loại vacxin phòng bệnh PED chế từ chủng DR13 nhược độc

(thu được sau khi cấy chuyển chủng cường độc 100 đời) đã được nghiên cứu và

đưa vào sản xuất. Kết quả thử nghiệm cho thấy loại vacxin này dùng theo đường

uống cho kết quả cao hơn dùng theo đường tiêm. Đặc biệt, virus vacxin có độ ổn

định và an toàn cao, virus vacxin đem cấy chuyển 3 đời trên lợn thu được vẫn

duy trì được độ an toàn khi tiêm phòng cho lợn (Song et al., 2007). Ngoài ra, tỷ

lệ tử vong ở lợn con do PED giảm xuống khi cho lợn nái mang thai uống virus

dòng DR13. Dòng virus trên đã được cấp chứng chỉ sử dụng làm vacxin cho theo

đường uống ở Hàn Quốc năm 2004 (số phát minh 0502008). Tại Philippin,

vacxin này được đăng ký và thương mại hoá năm 2011. Mặc dù nhiều lợi ích của

vacxin DR13 đã được chứng minh, tuy nhiên không có sự khác biệt đáng kể về

thời gian bài thải virus trên lợn con thử nghiệm – một chỉ số quan trọng về mức

độ bảo hộ miễn dịch. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh cao hơn sẽ làm cho

thời gian bài thải virus ngắn hơn, giảm mức độ trầm trọng và thời gian tiêu chảy

ở lợn con; việc bảo hộ hoàn toàn khỏi sự lây nhiễm PEDV giúp phòng chống lại

sự bài thải virus khi lợn tiếp xúc với virus cường độc (Lee, 2015). Khi cho lợn

con uống PEDV nhược độc, miễn dịch tạo được chỉ phần nào bảo vệ chúng trước

thử thách từ các chủng cường độc, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy mức độ bảo

hộ liên quan mật thiết tới liều virus được uống. Ở liều uống thấp, chỉ có 25% lợn

được bảo vệ khi thử thách nhưng tỷ lệ này tăng lên 50% khi lợn được uống với

liều tăng lên gấp 20 lần (Song et al., 2015).

Do đó để nghiên cứu sản xuất được những vacxin lý tưởng, một số tiêu

chuẩn như yếu tố hạn chế sự bài thải virus ở lợn con, đáp ứng miễn dịch niêm

mạc với PEDV cần được chú trọng trong nghiên cứu sản xuất vacxin thế hệ mới.

Hiện nay, thông tin về miễn dịch qua niêm mạc của PEDV là rất hạn chế. De

Arrieba và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật điểm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme

(ELISPORT) để biệt hoá những tế bào chế tiết kháng thể đặc hiệu ở niêm mạc và

mô lympho của lợn được chủng PEDV. Sau khi lây nhiễm PEDV, kết quả cho

thấy khả năng sản xuất của tế bào chế tiết kháng thể (ASC) trong ruột tương tự

như khi gây nhiễm TGEV và Rotavirus; trong đó các IgG được các ASC chế tiết

và lưu hành nhiều hơn. Ở lợn nhiễm PEDV, có thể xác định được một lượng nhỏ

IgM do ASC tiết ra sau 4 ngày gây nhiễm và tế bào B nhớ xuất hiện lúc 21 ngày

sau gây nhiễm trong hạch lympho, lách và máu. Cuối cùng, trong thời gian thử

thách của lợn, các tác giả khẳng định tồn tại mối tương quan giữa khả năng bảo

hộ với kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh và đáp ứng của ASC trong các mô

lympho đường ruột và máu.

Kết quả một số nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch với kháng

nguyên PEDV được biểu hiện trên thực vật chuyển gen và vi khuẩn sinh axit

lactic đã được công bố. Cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện protein S tương ứng

với epitop trung hoà của PEDV được sử dụng làm thức ăn cho lợn, sau đó tiến

hành kiểm tra xem lợn có sinh đáp ứng miễn dịch hay không. Trong một thí

nghiệm khác, nhóm tác giả đã đánh giá được hiệu lực bảo hộ động vật thí nghiệm

khi cho theo đường miệng cà rốt và sa lát chuyển gen kháng nguyên PEDV sau

khi tối ưu hoá các codon và áp dụng các hệ thống biểu hiện virus (Gerdts and

Zakhartchouk, 2017). Ở chuột thí nghiệm, kháng thể được tạo ra đã trung hoà

virus PED. Không có kháng thể trung hoà nào được xác định ở chuột hay lợn

được gây miễn dịch niêm mạc từ Lactobacillus casei tái tổ hợp có biểu hiện

protein N trên bề mặt. Tuy nhiên việc đưa kháng nguyên vào cơ thể biểu hiện

trên vi khuẩn như vậy đã giúp tạo ra một lượng lớn IgA niêm mạc và kích thích

lưu hành IgG chống lại protein N của PEDV. Như vậy, trước khi thương mại hoá

các loại vacxin như trên, cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn nữa; ví dụ cần

làm rõ sự bất đồng giữa kết quả thử nghiệm vacxin sản xuất ở quy mô phòng thí

nghiệm và các vacxin sản xuất trên quy mô lớn.

Việc nghiên cứu sản xuất vacin nhược độc và tái tổ hợp như trên cần được

ưu tiên bởi PED gây nên những thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế cho ngành chăn

nuôi lợn. Tuy nhiên, những bất lợi khi sử dụng vacxin nhược độc không phải là

không có. Gần đây, một khảo sát được thực hiện ở Trung Quốc đã xác định mối

quan hệ về nguồn gốc phát sinh mật thiết giữa một chủng PEDV thực địa ở

Trung Quốc (CH/GSJIII/07) và hai chủng virus vacxin, điều đó chỉ ra rằng các

virus trong vacxin sống có thể tiến triển thành những dạng có khả năng truyền

lây cao hơn khi được đem ra sử dụng trên thực địa (Ducatelle et al., 1982).

Do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu nên hiện tại chữa triệu chứng

tiêu chảy là biện pháp điều trị chủ yếu khi lợn mắc PED, lợn được cho uống

nước tự do, bổ sung điện giải chống mất nước, và hạn chế khẩu phần ăn, đặc

biệt là ở lợn đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh. Các biện pháp vệ sinh

nên được áp dụng nghiêm ngặt để đề phòng sự xâm nhiễm PEDV từ bên ngoài

vào trong trại. Việc nhập lợn đã mắc PEDV luôn là nguy cơ lây nhiễm cao

nhất, ngoài ra bệnh cũng có thể lây lan qua các dụng cụ, người hay chuột bọ

mang mầm bệnh. Nếu trại đã chẩn đoán nhiễm PED, việc đầu tiên cần chú ý là

các biện pháp phòng để ngăn cản tạm thời sự xâm nhiễm của virus vào khu

vực nái. Việc chủ động phơi nhiễm virus PED cho nái bằng phân, ruột của lợn

đã nhiễm PEDV sẽ kích thích tạo miễn dịch qua sữa và giúp ngăn cản sự xâm

nhiễm của virus vào lợn con, do đó làm giảm tỷ lệ chết ở đàn có virus lưu

hành. Trên thực tế, người chăn nuôi có thể tự chế vacxin chuồng bằng cách

nghiền một bộ ruột non của lợn con đang theo mẹ mắc PED với nước vừa đủ

200ml (có thể bổ sung kháng sinh), trộn vào cám cho khoảng 20 lợn nái ăn.

Kết quả cho thấy sau một vài tháng PED qua đi, các trại đó vẫn có nguy cơ

bùng phát PED trở lại.

Nếu một trại có dịch PED xảy ra và virus được chẩn đoán tồn tại trên các

đàn lợn con sau cai sữa kế tiếp nhau, để thải trừ hẳn virus khỏi trại, ngay sau khi

tách mẹ cai sữa, nên nhanh chóng chuyển lợn con sang khu vực khác trong

khoảng thời gian ít nhất 4 tuần.

Tác dụng miễn dịch phòng bệnh của globulin miễn dịch (IgY) kháng lại

PEDV sản xuất từ lòng đỏ trứng gà đã được thử nghiệm trên lợn sơ sinh (Kweon

et al., 2000). Kết quả cho thấy việc sử dụng IgY làm giảm tỷ lệ chết và tăng tỷ lệ

sống ở lợn con sau khi thử thách bằng PEDV cường độc. Kết quả này cho thấy

IgY kháng PEDV có thể là một biện pháp phòng bệnh hiệu quả thay thế biện

pháp gây và truyền miễn dịch qua sữa đầu. Ngoài ra, một nghiên cứu khác cho

thấy các tác nhân tăng trưởng biểu bì (EGF) kích thích sự phân chia tế bào ở biểu

mô tuyến ruột và thúc đẩy sự hồi phục ở phần ruột bị teo ở lợn con nhiễm PEDV

(Lee et al., 2015) được cho là khá tiềm năng trong ứng dụng điều trị PED.

Ở nước ta, hiện tại những thông tin và hiểu biết của người quản lý và

người chăn nuôi còn rất hạn chế, hầu như chưa có công bố chính thức nào về

tình hình nhiễm PED tại Việt Nam. Trong khi dịch bệnh ngày càng lan rộng và

phức tạp thì việc tiếp cận và sử dụng vacxin phòng bệnh còn gặp nhiều khó

khăn. Tính đến giữa năm 2012, hầu như cả nước mới có 1-2 công ty bước đầu

nhập khẩu và phân phối vacxin PED (do Hàn Quốc sản xuất). Sự lựa chọn cho

loại vacxin để sử dụng chưa nhiều, thông tin về tính tương đồng và khả năng

bảo hộ của vacxin với các chủng PEDV ở Việt Nam còn chưa được khuyến cáo.

Do đó, để hạn chế thiệt hại do PED gây ra, người chăn nuôi phải thực hiện

nghiêm túc các biện pháp vệ sinh phòng bệnh. Khi dịch bệnh xảy ra, cần chú

lưu ý khâu bổ sung điện giải chống mất nước cho lợn. Theo số liệu ban đầu của

chúng tôi áp dụng tại một số trại lợn mắc PED ở Hải Dương, Bắc Giang, Hưng

Yên, giải pháp bổ sung dung dịch nước muối sinh lý hoặc ringer lactac theo

đường phúc mạc cho lợn con theo mẹ có thể làm giảm tỷ lệ chết giảm xuống

thấp, chỉ còn 10-20%.

PHẦN 3

NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các hoạt động nghiên cứu thực địa được tiến hành tại các trang trại chăn

nuôi thuộc 10 tỉnh miền Bắc: Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Thái

Bình, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Bắc Giang, Lào Cai và Thái Nguyên.

Các hoạt động nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại Khoa

Thú y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam (phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật -

Truyền nhiễm, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y), phòng

thí nghiệm Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1.

3.2. THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Đề tài nghiên cứu này được triển khai từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2016.

3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1. Nghiên cứu tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Điều tra tình hình bệnh PED từ năm 2013 – 2015 tại 10 tỉnh miền Bắc

- Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và biến đổi bệnh lý đặc trưng của lợn mắc

PED ở các trang trại dương tính PEDV

3.3.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen

- Giải trình tự gen S và ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam

- Phân tích đặc điểm trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV lưu

hành ở Việt Nam. So sánh với trình tự gen tương ứng của các chủng virus lưu

hành trên thế giới

3.3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV

- Nghiên cứu đặc điểm về sự lưu hành theo nhóm di truyền

- Nghiên cứu hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam

- Nghiên cứu sự phát tán theo không gian và thời gian của các chủng PEDV

dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 của hai genogroup.

3.4. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Mẫu phân/ ruột của lợn nghi mắc tiêu chảy do PEDV

- Bộ kít tổng hợp cDNA

- Bộ kít PCR

- Trình tự gen S (phụ lục 1) và ORF3 (phụ lục 2) của các chủng PEDV

lưu hành ở Việt Nam và trên thế giới có đầy đủ thông tin về địa điểm và thời

gian phân lập.

- Cặp mồi đặc hiệu (bảng 3.1) dùng trong nghiên cứu này được tham

khảo từ các nghiên cứu trước đây (Park et al., 2008; Kim et al., 2007; Tian et al., 2014; Gao et al., 2013).

Bảng 3.1. Thông tin về mồi đặc hiệu được dùng trong nghiên cứu

Vị trí

Kích thước

Tên mồi

Trình tự nucleotide (5’-3’)

bắt đầu*

(bp)

P1a

TTCTGAGTCACGAACAGCCA

22.103

651

P2a

CATATGCAGCCTGCTCTGAA

22.734

PEDVS1-P1b CCATTAGTGATGTTGTGTTAG

20.535

1031

PEDVS1-P2b GCACAGCAGCTCCATT

21.565

PEDVS2-P1b CCACATACCAGAAGGTTTTAG

21.372

1146

PEDVS2-P2b CCAGTAATCAACTCACCCTT

22.517

PEDVS3-P1b CCCTGAGTTTGGTAGTGG

22.446

1154

PEDVS3-P2b CATCCGTCTGTAGAGCAAG

23.599

PEDVS4-P1b CTCATCGGTGGTATGGTGCT

23.497

1355

PEDVS4-P2b AGCAGACTTTGAGACATCTTTGAC

24.851

ORF3-1d

TCCTAGACTTCAACCTTACG

24.741

830

ORF3-2d

GGTGACAAGTGAAGCACAGA

25.551

Cặp mồi dùng phát hiện PEDV (a), giải trình tự gen S (b, c) và gen ORF3 (d). (*) các vị trí nucleotide

được đánh số theo chủng tham chiếu CV777 (AF353511)

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài

chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện

đại trong lĩnh vực thú y:

3.5.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ

Thu thập thông tin, thu thập mẫu ở các đàn lợn có triệu chứng của bệnh

PED từ các trại trên địa bàn nghiên cứu thông qua các kỹ thuật viên của trại.

3.5.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng

Dựa vào quan sát triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để bước đầu xác

định bệnh. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình thường dễ dàng

phát hiện trong những trường hợp động vật mắc bệnh đầu tiên trong ổ dịch,

sau đó do nhiều nguyên nhân mà các dấu hiệu điển hình này bị che lấp hoặc lu

mờ đi, nên khó phát hiện, do đó khi điều tra cần quan sát trên nhiều động vật

bệnh và mổ khám nhiều động vật chết mới có thể thấy được đầy đủ các biểu

hiện này.

3.5.3. Phương pháp mổ khám

Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ

chức của lợn mắc PED, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu

chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ

vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan

nội tạng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh.

3.5.4. Phương pháp lấy mẫu

Mẫu được thu thập trên thực địa từ những lợn có biểu hiện lâm sàng tiêu

chảy cấp tại các trại chăn nuôi ở một số địa phương thuộc miền Bắc Việt Nam,

bao gồm: (i) các đoạn ruột và hạch ruột, (ii) phân. Mẫu được bảo quản lạnh sau

khi lấy mẫu và trong suốt quá trình vận chuyển.

Xử lý mẫu ruột: cắt nhỏ, nghiền nhuyễn bằng cối- chày sứ, hoàn nguyên

thành huyễn dịch 10% bằng PBS 1x

Mẫu phân được hòa thành huyễn dịch 10% trong PBS 1x

Mẫu được bảo quản mẫu ở - 700C cho đến khi kiểm tra.

3.5.5. Phương pháp tách ARN tổng số

Bước 1: Giải phóng ARN

Bổ sung 800 µl dung dịch Trizol vào 200 µl huyễn dịch mẫu

Vortex và sau đó bổ sung tiếp 200 µl dung dịch Chloroform,

Vortex mạnh trong 15 giây,

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Bước 2: Tách pha ARN

Huyễn dịch trên được ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C.

Sau khi ly tâm, chuyển pha trên (upper phase) có chứa ARN vào một ống

Eppendorf mới (với lượng khoảng 500 µl)

Bước 3: Kết tủa ARN:

Bổ sung 500 µl dung dịch Isopropanol, tủa ở -20oC/ 10 phút

Ly tâm 12000 vòng/ phút/ 10 phút ở 40C.

Bước 4: Rửa phần tủa:

Bỏ dịch trên, thu cặn ARN

Thêm 1ml ethanol 75%

Trộn đều nhẹ nhàng

Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC

Loại bỏ phần dịch phía trên, thu tủa ARN

Bước 5: Tan tủa và thu ARN:

Hong khô tủa ARN ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút,

Hòa ARN trong 30 µl nước cất 3 lần đã loại Rnase

Bảo quản ở - 700C cho tới khi sử dụng

3.5.6. Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã

ngược (reverse transcriptase), sử dụng kit SuperScript (Invitrogen) và oligo dT.

Thành phần phản ứng cDNA được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA

Thành phần

Thể tích (μl)

Nước đã loại Rnase

4.5

Mẫu ARN tinh sạch

dNTPs (2,5mM mỗi loại)

Mồi oligo dT (200pM/µl)

Superscript II Rnase H-reverse transcriptase (200U/µl)

RNase inhibitor (10U/µl)

0.5

5x first strand buffer

Tổng thể tích

Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện ở 37oC trong 60 phút và sau đó

94oC trong vòng 5 phút.

3.5.7. Phương pháp phát hiện PEDV

Mẫu bệnh phẩm là phân hoặc ruột của lợn nghi nhiễm bệnh tiêu chảy cấp

PED từ các trại lợn được thu thập bảo quản trong các ống chứa mẫu đã được vô

trùng. Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được chẩn đoán bằng phản ứng RT-PCR

với các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện PEDV. Chỉ các mẫu dương tính với PEDV

mới được lựa chọn cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.

Phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV được thực hiện bằng các nguyên liệu

sau: kít PCR (AccuPower PCR PreMix, Bioneer), cặp mồi P1/P2 (bảng 3.1) và

cDNA được tổng hợp ở bước 3.5.3, với chu trình nhiệt như sau: 94oC/300 giây;

lặp lại 35 vòng chu trình sau: 94oC/30 giây, 53oC/30 giây, 72oC/60 giây.

Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên thạch agarose có bổ sung

thuốc nhuộm ADN, đọc kết quả như sau: mẫu dương tính với virus khi giếng

chứa mẫu điện di xuất hiện vạch sản phẩm tương ứng với độ dài đoạn gen được

thiết kế. Mẫu âm tính khi không xuất hiện vạch sản phẩm PCR.

3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen

Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo hai chiều (xuôi và

ngược) bằng phương pháp Sanger. Trình tự nucleotide tiếp tục được phân tích

bằng chương trình tin sinh học BioEdit v7.1.3.0 (Hall, 1999) trên cơ sở đối

chiếu so sánh (i) giữa trình tự nucleotide được giải trình tự theo chiều xuôi và

chiều ngược, và (ii) với trình tự gen S hoặc ORF3 tham chiếu công bố trên

ngân hàng gen.

3.5.9. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền

Phần mềm MEGA7 (Kumar et al., 2016) được dùng để tính khoảng cách di

truyền (genetic distance) giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam, dựa vào

trình tự gen S (n=38) và gen ORF3 (n=12). Các mô hình mô phỏng sự biến đổi

nucleotide được dùng bao gồm: Kimura-2P (K2P), Tajama-Nei, Tamura-3P và

Tamura-Nei. Khoảng cách di truyền giữa các chủng virus sau đó được sắp xếp

biểu diễn dưới dạng đồ thị tần suất.

3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phả hệ

Các bước xây dựng cây phả hệ (dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3)

được tóm tắt như sau:

(i) Xây dựng cơ sở dữ liệu bao gồm các chủng PEDV thu nhận từ ngân hàng

gen và các chủng đã biết genogroup (Lin et al., 2016).

(ii) Sắp xếp (alignment) trình tự nucleotide theo cột trên cơ sở bộ ba mã

hóa (codon- based alignment) bằng phần mềm MAFFT (Katoh and Standley,

2013) và PAL2NAL (Suyama et al., 2006).

(iii) Xây dựng cây phả hệ bằng thuật toán neighbor-joining được tích hợp

trong chương trình MEGA (Kumar et al., 2016). Mức tin cậy của các nhánh phân

chia ở mỗi nút (node) được biểu thị bằng giá trị bootstrap.

(iv) Biểu diễn và hiệu đính cây phả hệ bằng phần mềm FigTree (Drummond

et al., 2012).

3.5.11. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử

Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại quá

trình phát tán theo không gian (quốc gia- quốc gia, địa phương- địa phương) và

thời gian (năm) của PEDV dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3. Các tham số

của mô hình dựa theo kết quả của nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009).

3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu

- Kiểm định giả thuyết về trị trung bình của 2 tổng thể độc lập (independent

samples t-test) được thực hiện bằng phần mềm SPSS,

- Phân tích phương sai một yếu tố (oneway ANOVA) dùng kiểm định giả

thuyết trung bình bằng nhau của các nhóm mẫu,

- Các phép kiểm định được thực hiện với mức ý nghĩa là α = 0,05.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. TÌNH HÌNH DỊCH PED Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC TỪ 2013-2015

4.1.1. Kết quả thiết lập phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV

Trong khuôn khổ của đề tài, tình hình dịch PED đã được nghiên cứu tại

các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED tại Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng,

Hưng Yên, Thái Bình, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Bắc Giang, Lào Cai và Thái

Nguyên. Ngoài PEDV, ở Việt Nam đã xác định được sự có mặt và lưu hành của

TGEV và gần đây là porcine deltacoronavirus (Le et al., 2017) là loại virus mới

được chứng minh gây ra triệu chứng và bệnh tích khó phân biệt về mặt lâm

sàng với bệnh do PEDV gây ra (Ma et al., 2015). Do đó, kỹ thuật RT-PCR đã

được dùng để khẳng định sự có mặt của PEDV trong mẫu (phân hoặc ruột non)

Ghi chú: (M) 1 kb plus DNA ladder; giếng 1 – 11 là các mẫu bệnh phẩm tương ứng với

ký hiệu HUA-PED: 45, 47, 55, 56, 58, 60, 63, 65, 67, 69 và 80

thu thập được (hình 4.1).

Hình 4.1. Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm

Với các điều kiện tối ưu của phản ứng RT-PCR, cặp mồi P1/P2 cho vạch có

kích thước giống như thiết kế (651 bp). Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR tiếp tục

được khẳng định bằng giải trình tự gen sản phẩm thu được với kết quả phân tích

thể hiện tại hình 4.2 và bảng 4.1.

Vị trí nucleotide được đánh dấu theo gen S

Hình 4.2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi P1/P2

TT Trình tự

HUA-PED45_Vietnam_2013

98,8 96,5 97,0 96,5 97,0 95,3 96,5 97,0 96,5 95,3 93,6 97,0 95,3 97,0 97,0 95,3 95,9

HUA-PED47_Vietnam_2013

99,6

97,6 98,2 97,6 98,2 96,5 97,6 98,2 97,6 96,5 94,7 98,2 96,5 98,2 98,20 96,5 97,0

HUA-PED55_Vietnam_2014

96,3 96,7

99,4 98,8 99,4 97,6 98,8 99,4 98,8 96,5 94,7 98,2 96,5 99,4 99,4 96,5 97,0

HUA-PED56_Vietnam_2014

96,5 96,8 99,4

99,4 100 98,2 99,4 100 99,4 97,0 95,3 98,8 97,0 100 100 97,0 97,6

HUA-PED58_Vietnam_2014

96,1 96,5 99,0 99,6

99,4 97,6 98,8 99,4 98,8 96,5 95,9 98,2 97,0 99,4 99,4 96,5 97,0

HUA-PED60_Vietnam_2014

96,5 96,8 99,4 100 99,6

98,2 99,4 100 99,4 97,0 95,3 98,8 97,0 100 100 97,0 97,6

HUA-PED63_Vietnam_2014

Bảng 4.1. Tương đồng trình tự nucleotide và amino acid của 11 chủng PEDV với các chủng tham chiếu

95,9 96,3 98,8 99,0 98,6 99,0

97,6 98,2 97,6 95,3 93,6 97,0 95,3 98,2 98,2 95,9 96,5

HUA-PED65_Vietnam_2014

96,1 96,5 99,0 99,6 99,2 99,6 98,6

99,4 100 96,5 94,7 98,2 96,5 99,4 99,4 96,5 97,0

3 9

HUA-PED67_Vietnam_2014

97,2 97,6 98,2 98,8 98,4 98,8 97,8 98,4

99,4 97,0 95,3 98,8 97,0 100 100 97,0 97,6

10 HUA-PED69_Vietnam_2014

96,3 96,7 99,2 99,8 99,4 99,8 98,8 99,8 98,6

96,5 94,7 98,2 96,5 99,4 99,4 96,5 97,0

11 HUA-PED80_Vietnam_2014

97,4 97,8 97,2 97,4 97,0 97,4 96,8 97,0 97,8 97,2

93,6 97,0 95,3 97,0 97,0 95,3 95,9

12 KJ960178_JFP1013_Vietnam_2013

96,3 96,7 95,3 95,9 95,9 95,9 94,9 95,5 96,3 95,7 96,5

95,3 94,1 95,3 95,3 93,6 94,1

13 HQ883489_VN109S5_Vietnam_2010 98,2 98,6 97,2 97,8 97,4 97,8 96,8 97,4 98,2 97,6 98,4 97,6

97,0 98,8 98,8 97,0 97,6

14 HQ883485_VN92S1_Vietnam_2009

97,2 97,6 96,3 96,8 96,5 96,8 95,9 96,5 97,2 96,7 97,4 96,7 98,6

97,0 97,0 95,3 95,9

15 KJ451040_KNU-1305_Korea_2013

97,2 97,6 97,4 98,0 98,0 98,0 97,0 97,6 99,2 97,8 97,4 95,9 97,8 96,8

100 97,0 97,6

16 KF650370_ISU13-1_USA 2013

97,4 97,8 97,6 98,2 98,2 98,2 97,2 97,8 99,4 98,0 97,6 96,1 98,0 97,0 99,8

97,0 97,6

17 DQ462404_DR13_vacxin

95,1 95,5 96,5 96,7 96,7 96,7 95,7 96,3 96,5 96,5 96,1 94,5 96,5 95,5 96,5 96,7

99,4

JN599150_CV777_vacxin

95,3 95,7 96,7 96,8 96,8 96,8 95,9 96,5 96,7 96,7 96,3 94,7 96,7 95,7 96,7 96,8 99,8

Ghi chú: tương đồng (%) về trình tự nucleotide (trên đường chéo) và amino acid (dưới đường chéo)

Khi so sánh trình tự một phần gen S (651 bp) của 11 chủng PEDV được

giải trình tự (hình 4.2) với các chủng tham chiếu trên thế giới, đã phát hiện được

32 vị trí có đột biến. So sánh với chủng VN/JFP1013-1/2013 (KJ960178) đã phát

hiện 17 sự sai khác về trình tự gen ở các vị trí khác nhau (1539: A↔C, 1556:

A↔G, 1557: T↔C, 1563: T↔G, 1615: T↔C, 1617: T↔G, 1646: T↔G, 1656:

T↔C, 1660: A↔C, 1664: A↔C, 1679: T↔G, 1680: G↔T, 1689: A↔C, 1694:

A↔G; 1928: G↔A, 2016: C↔T, 2019: G↔A).

Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gene S thấy PEDV từ 2 mẫu bệnh

phẩm HUA-PED45 và HUA-PED47 thu thập được ở Thái Bình vào năm 2013 có

sự tương đồng với nhau rất cao (99,6%), chỉ có sự sai khác ở 2 vị trí nucleotide là

1916 (C↔T) và 1987 (T↔A). Khi so sánh trình tự gen S của PEDV ở Thái Bình

với mẫu virus từ mẫu bệnh phẩm thu thập được ở Thái Nguyên năm 2014 cho

biết có 11 vị trí nucleotide sai khác (1539: A↔C, 1556: A↔G, 1559: A↔C,

1635: T↔C, 1812: G↔T, 1831: T↔G, 1834: A↔G, 1928: A↔G, 2016: C↔T,

2019: G↔A, 2043: C↔T).

Về tính tương đồng (bảng 4.1), 11 chủng PEDV giống từ 95,3% đến 100%

về trình tự nucleotide và từ 95,9% đến 100% về trình tự amino acid (bảng 4.1).

So sánh với một số chủng tham chiếu đã được công bố trên ngân hàng gen, 11

chủng của Việt Nam có tính tương đồng cũng tương đối cao: trình tự nucleotide

tương đồng từ 93,6% đến 100% và trình tự amino acid tương đồng từ 94,5%

đến 100%. So sánh với 2 chủng virus vacxin PED thường dùng ở một số nước

như Trung Quốc (CV777) và Hàn Quốc (DR13), kết quả cho biết mức tương

đồng trình tự nucleotide là 95,3% đến 97,6% và trình tự amino acid từ 95,1%

đến 96,8% (bảng 4.1).

Các kết quả trình bày nêu trên cho biết phản ứng RT-PCR sử dụng cặp

mồi P1/P2 đảm bảo độ đặc hiệu trong phát hiện PEDV (thông qua kích thước

vạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen sản phẩm PCR thu được). Trên cơ sở

đó, các mẫu phân hoặc ruột của lợn thu thập trong giai đoạn từ 2013- 2015 tại

10 tỉnh/ thành phố đã được sàng lọc. Kết quả được tổng hợp và trình bày tại các

phần dưới đây.

4.1.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015

Bảng 4.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015

TT

Địa điểm

Loại mẫu*

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu dương tính

Tỷ lệ % dương tính

Tỷ lệ trung bình

Phân

40,00

Bắc Giang

40,00

Ruột

40,00

Phân

37,50

Hà Nội

47,37

Ruột

54,50

Phân

28,50

Hải Dương

42,86

Ruột

57,10

Phân

40,00

Hải Phòng

50,00

Ruột

60,00

Phân

33,30

Hòa Bình

Ruột

66,60

55,56

Ruột

40,00

Phân

42,80

Hưng Yên

53,85

Ruột

57,80

Phân

33,30

Lào Cai

50,00

Ruột

60,00

Ruột

50,00

Thái Bình

34,25

Phân

31,14

Ruột

50,00

Thái Nguyên

37,50

Phân

34,62

Phân

50,00

Vĩnh Phúc

45,45

Ruột

42,80

Tổng hợp

212

89 41,98

* Trường hợp thu thập được lợn bệnh, mẫu ruột sẽ được dùng thay mẫu phân trong phát hiện PEDV.

Kết quả xét nghiệm ở bảng 4.2 cho thấy sự hiện diện của PEDV của lợn ở

tất cả các địa phương lấy mẫu, với tỷ lệ dương tính dao động từ 34,25% (Thái

Bình) tới 55,56% (Hòa Bình). Phân tích phương sai một nhân tố (ANOVA) về tỷ

lệ dương tính PEDV ở lợn giữa 10 tỉnh cho giá trị p = 0,841 > 0,05. Do vậy, khác

biệt về tỷ lệ nhiễm PEDV của lợn giữa các địa phương là không có ý nghĩa thống

kê ở mức 95%. Xét trên khía cạnh vị trí địa lý, kết quả trên cho thấy dịch PED

không chỉ xảy ra ở các tỉnh thành tiếp giáp nhau như Hà Nội, Hải Phòng, Hải

Dương, Hưng Yên và Thái Bình; mà còn phát hiện được ở một số tỉnh xa như

Thái Nguyên, Lào Cai. Ngoài 10 tỉnh thuộc phạm vi nghiên cứu, PEDV cũng

được phát hiện ở lợn của Bắc Ninh, Hà Nam, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An và

Quảng Trị (kết quả không trình bày trong luận án này).

Đối với 2 loại mẫu xét nghiệm là phân và ruột, kết quả ở bảng 4.2 cho biết tỷ

lệ mẫu ruột dương tính với PEDV (40,00% - 66,60%, trung bình 53,90%) cao hơn

so với tỷ lệ mẫu phân dương tính với virus (28,50% - 50,00%, trung bình 38,00%).

Bằng phân tích phương sai một nhân tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê

(p = 0,004 < 0,05). Kết quả xét nghiệm này phù hợp với công bố của Nguyễn Tất

Toàn và cs (Nguyễn Tất Toàn và cs., 2012, Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy,

2012), trong đó nhóm tác giả cũng phát hiện được 58,14% mẫu ruột non dương

tính PEDV và cao hơn nhiều so với các mẫu phân (16,96%). Trong những điều

kiện bảo quản không tốt (không có môi trường bảo quản, mẫu đông tan nhiều lần,

v.v...), virus có vỏ bọc lipid như PEDV rất dễ bị phá hủy lớp màng ngoài. Khi đó

sự có mặt rất phổ biến của Rnase sẽ phân cắt sợi ARN của virus. Ngược lại, với

mẫu bệnh phẩm tươi, bảo quản và vận chuyển mẫu trong điều kiện tối ưu, tỷ lệ

phát hiện PEDV trong mẫu phân và mẫu ruột non bằng phương pháp RT-PCR

khác nhau không đáng kể (Song et al., 2006; Kim et al., 2001).

Mặc dù tất cả mẫu bệnh phẩm nêu trên (bảng 4.2) được lấy ở lợn có triệu

chứng tiêu chảy nghi ngờ do nguyên nhân virus như: (i) nôn, phân nhiều nước và

có cục sữa không tiêu; hoặc (ii) ruột non căng phồng, có cục sữa không tiêu ở các

đoạn ruột già, v.v... nhưng chỉ có trung bình 41,98% mẫu dương tính PEDV. Kết

quả này có thể do lợn được lấy mẫu nhiễm các virus gây tiêu chảy khác. Khả

năng này là có thể bởi lẽ trong một công bố gần đây, deltacoronavirus đã được

phát hiện ở Hà Nội và Thái Bình là hai tỉnh thuộc phạm vi thu thập mẫu của

nghiên cứu này (Lê Văn Phan và cs., 2017).

4.1.3. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại

Những nghiên cứu trong vòng 5 năm trở lại đây tại Việt Nam cho thấy PEDV

là nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát dịch tiêu chảy trên lợn (Do Tien Duy et al.,

2011; Vui et al., 2015). Do không nằm trong danh mục các bệnh bắt buộc phải

khai báo dịch, nên tình hình dịch PED ở ngoài thực địa được dự đoán xảy ra trên

diện rộng. Để làm rõ hơn tình hình dịch PED ở lợn của 10 tỉnh miền Bắc, kết quả

xét nghiệm được tổng hợp theo trang trại và được trình bày ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Tình hình dịch PED ở lợn của một số tỉnh miền Bắc

theo trang trại

Số trại

Tỷ lệ (%)

TT

Địa điểm

theo dõi

dương tính

Bắc Giang

25,00

Hà Nội

80,00

Hải Dương

66,67

Hải Phòng

60,00

Hòa Bình

40,00

Hưng Yên

85,71

Lào Cai

33,33

Thái Bình

60,00

Thái Nguyên

40,00

Vĩnh Phúc

50,00

58,10

Tổng hợp

55

32

Kết quả xét nghiệm PEDV tại 55 trại (có lợn mắc tiêu chảy nghi do virus

và chưa từng sử dụng vacxin phòng bệnh do PEDV) cho thấy có 32 trại phát hiện

được PEDV trong mẫu bệnh phẩm, tương ứng với tỷ lệ 58,1%. Mặc dù tỷ lệ

trang trại dương tính với PEDV khác nhau giữa các tỉnh (dao động từ 25,00% -

85,71%), nhưng không có địa phương nào là không có trang trại mắc PED. Kết

quả này cho thấy PEDV xuất hiện khá phổ biến ở các địa phương thuộc phạm vi

nghiên cứu của đề tài này.

Xét về mặt địa lý, 6 tỉnh thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng đều có tỷ lệ

trang trại dương tính với PEDV trên 50%. Cụ thể, tỷ lệ trang trại dương tính cao

nhất là ở Hưng Yên (85,71%) và Hà Nội (80,00%); tiếp đến là Hải Dương, Hải

Phòng, Thái Bình với tỷ lệ dương tính lần lượt là 66,67%, 60,00% và 60,00%.

Ngược lại, ở 4 tỉnh trung du- miền núi phía Bắc, tỷ lệ trang trại có lợn dương tính

với PEDV đều dưới 50%, ví dụ như: Lào Cai là 33,33% và Bắc Giang là 25,00%.

Kết quả tính chung theo vùng địa lý cho thấy tỷ lệ trang trại có PEDV lưu hành ở

lợn của 6 tỉnh đồng bằng sông Hồng cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở 4 tỉnh

trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%), ở mức tin cậy 95% (phụ lục 1). Sự

khác biệt về tỷ lệ trang trại dương tính PEDV ở 2 vùng nói trên có thể do các tỉnh

đồng bằng có số lượng hộ chăn nuôi lớn và mật độ chăn nuôi lợn cao nên tỷ lệ

mắc PED cao hơn so với các trại ở khu vực vùng trung du - miền núi.

Tổng hợp các kết quả trình bày ở bảng 4.2 và bảng 4.3 cho phép rút ra nhận

xét: kể từ khi PED được công bố lần đầu tại miền Nam năm 2009 (Do Tien Duy

et al., 2011), dịch tiêu chảy ở lợn do PEDV gây ra đã xuất hiện ở miền Bắc với

không gian trải rộng (10/10 tỉnh thu thập mẫu) và liên tục theo thời gian (trong

các năm thu thập mẫu từ 2013-2015).

4.1.4. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED

Để làm rõ đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của lợn mắc tiêu

chảy do virus, nghiên cứu này đã tìm hiểu triệu chứng và bệnh tích của 50 lợn

con theo mẹ (giai đoạn mẫn cảm nhất với PEDV) đã được khẳng định chỉ dương

tính với PEDV. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4- 4.5 và hình 4.3- 4.4.

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED

Số con có triệu chứng

Số con

Địa điểm

Mùi phân

Phân lỏng,

Lông xù,

theo dõi

Nôn mửa

Mất nước

tanh, gây

có cục sữa

bết phân

Bắc Giang

Hà Nội

Hải Dương

Hải Phòng

Hòa Bình

Hưng Yên

Thái Bình

Vĩnh Phúc

Tổng hợp

50 7 (14%)

32 (64%)

19 (38%)

40 (80%) 41 (82%)

Mặc dù lợn ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với PEDV và mắc bệnh thể lâm sàng, nhưng lợn con theo mẹ là nhóm có biểu hiện bệnh rõ nhất. Vì vậy, nghiên

cứu này đã tập trung làm rõ đặc điểm triệu chứng và bệnh tích ở nhóm lợn này.

Kết quả trình bày ở bảng 4.4 cho biết lợn con mắc tiêu chảy do PEDV thường

biểu hiện 2 triệu chứng liên quan tới hiện tượng tiêu chảy. Phổ biến nhất là triệu

Lợn khỏe mạnh (A), lợn con tiêu chảy phân bết lông (B-D), phân nhớt (E) và có cục sữa chưa tiêu (F)

chứng lợn con gầy sọp do mất nước (82%), tiếp theo là hiện tượng lông xù, bết phân ở toàn thân (80%). Hình ảnh minh họa được trình bày ở hình 4.3.

Hình 4.3. Triệu chứng của lợn con theo mẹ mắc PED

Kết quả tổng hợp ở bảng 4.4 cũng cho thấy rõ tỷ lệ lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình của lợn mắc tiêu chảy do PED: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), một số trường hợp trong phân có cục sữa không tiêu (38%). Ngoài các

triệu chứng nêu trên, lợn bệnh còn có biểu hiện chung như run rẩy, nằm chồng

đống lên nhau, v.v... (kết quả không trình bày). Các đặc điểm về triệu chứng ở

lợn con theo mẹ nhiễm PEDV kể trên cũng được mô tả ở nhiều nghiên cứu trong

và ngoài nước (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014; Sun et al., 2012). Tuy nhiên, hiện tượng nôn mửa chỉ chiếm 7 trong tổng số 50 ca theo dõi (14%).

Tóm tắt kết quả nghiên cứu bệnh tích của lợn con theo mẹ mắc PED được

tổng hợp và trình bày ở bảng 4.5.

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED

Số con có bệnh tích

Số con

Sữa chưa tiêu

Ruột non

Địa điểm

Hạch ruột

theo dõi

Mỏng,

Xung

xung huyết

Dạ dày

Ruột

trong

huyết

Bắc Giang

Hà Nội

Hải Dương

Hải Phòng

Hòa Bình

Hưng Yên

Thái Bình

Vĩnh Phúc

Tổng hợp

50 50 (100%) 10 (20%) 30 (60%) 4 (8%)

0 (0%)

Đối với lợn con được khẳng định mắc tiêu chảy do PEDV, nghiên cứu này

không ghi nhận được biến đổi bệnh lý đại thể ở các hệ cơ quan ngoài đường tiêu

hóa như: hô hấp, tuần hoàn. Các nhóm bệnh tích quan sát được ở hệ tiêu hóa chủ

yếu tập trung vào các đặc điểm giảm tiêu hóa/ giảm hấp thu. 100% số lợn mổ

khám đều quan sát được sữa đông vón trong dạ dày. Khác với nhiều nghiên cứu

khác, cục sữa đông vón trong dạ dày thường được nhấn mạnh như một bệnh tích

điển hình của lợn mắc PED (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Tuy nhiên, trong

quá trình mổ khám, đặc điểm này còn thấy cả ở nhóm lợn con theo mẹ không

mắc PED (kết quả không trình bày). Do đó, cục sữa đông trong dạ dày là do lợn

con theo mẹ chết mà không kịp tiêu hóa hết, không phải là bệnh tích điển hình

của bệnh. Hiện tượng ruột non có màu trong, chứa nhiều dịch xuất hiện với tỷ

lệ cao nhất (60%). Cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột non và kết tràng (mũi

Thành ruột non mỏng, trong (A); cục sữa chưa tiêu ở ruột non và ruột già (A, B); mất “tĩnh mạch sữa” (C);

hạch màng treo ruột non bình thường (D)

tên, hình 4.4A-B) xuất hiện với tỷ lệ không cao (khoảng 20%).

Hình 4.4. Bệnh tích đại thể của lợn con theo mẹ mắc PED

Nhiều thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên thế giới cho thấy đặc điểm

bệnh lý cơ bản của lợn mắc PED là ruột non giãn, thành ruột non trong, bên

trong lòng ruột có nhiều dịch màu vàng và cục sữa không tiêu (Sueyoshi et al.,

1995; Shi et al., 2017). Tuy nhiên, đối chiếu với một nghiên cứu thực hiện đối

với chủng phân lập YS hoặc ZB của Trung Quốc năm 2013 (Wang et al., 2013), 100% lợn được mổ khám trong nghiên cứu này không có đặc điểm xuất huyết ở niêm mạc ruột non và dạ dày cũng như hiện tượng sưng và sung huyết ở hạch màng treo ruột. Kết quả này có thể do sự khác biệt về độc lực của

Với các kết quả thu được từ việc theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn

chủng PEDV, hoặc có thể do hiện tượng nhiễm ghép các vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa khác. mắc PED trong thời gian nghiên cứu, chúng tôi có nhận xét:

PEDV lưu hành thường xuyên ở lợn, đặc biệt là ở lợn con theo mẹ

trong 10 tỉnh thành nghiên cứu. Mặc dù biểu hiện lâm sàng và bệnh tích khá

rõ, nhưng chỉ có 41,98% (bảng 4.2) dương tính với PEDV; như vậy, việc chẩn

đoán lâm sàng cần rất thận trọng, tốt nhất vẫn là gửi mẫu xét nghiệm với kỹ thuật RT-PCR. Nếu phải dựa vào dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể để chẩn đoán, cần chú ý các đặc điểm cơ bản sau: phân tanh và có mùi

gây đặc trưng, phân có sữa không tiêu; ruột non trong và có cục sữa không

tiêu ở các đoạn ruột.

4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM VỀ TRÌNH TỰ GEN

Để làm cơ sở cho so sánh đa chiều về đặc điểm sinh học phân tử cũng

như đặc điểm dịch tễ học phân tử, chúng tôi tiến hành thu thập toàn bộ trình

tự gen S và ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam. Do vậy, cơ sở dữ liệu về

trình tự gen S bao gồm 38 trình tự hoàn chỉnh của gen mã hóa spike protein

(gen S), thu thập trong khoảng 2013- 2016, ở 11 tỉnh/ thành phố thuộc miền

Bắc, miền Trung và miền Nam. Cơ sở dữ liệu trình tự gen ORF3 bao gồm 12

trình tự gen ORF3 hoàn chỉnh, thu thập trong khoảng 2013- 2014 tại 6 tỉnh/

thành phố thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam.

4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam

Kết quả phân tích 38 trình tự gen S đã sắp cột (alignment) gồm 4188 vị trí

cho kết quả như sau: (i) 60/4188 vị trí (chiếm 1,43%) có đột biến mất nucleotide;

(ii) 3530/4188 vị trí (chiếm 84,29%) không có đột biến nucleotide

(monomorphic), với 16 vùng được đánh giá là bảo thủ với mức tin cậy p < 0,05;

(iii) 598/4188 vị trí (chiếm 14,28%) có đột biến (đa hình nucleotide, polymorphic),

với 411 vị trí được xếp vào nhóm “vị trí có thông tin” (parsimony-informative site,

vị trí mà ở đó có ít nhất 2 thay đổi loại nucleotide và mỗi một loại thay đổi

nucleotide xuất hiện ở ít nhất 2 trình tự).

4.2.1.1. Đặc điểm về tính đa dạng di truyền của gen S

Đặc điểm đầu tiên phản ánh tính đa dạng của PEDV lưu hành ở Việt

Nam là sự biến động chiều dài gen S. Cụ thể, gen S của 38 chủng PEDV được

phân tích trong nghiên cứu này có kích thước thay đổi dựa trên số lượng

nucleotide như sau: 4140 nt (1 chủng), 4146 nt (6 chủng), 4149 nt (5 chủng),

4155 nt (16 chủng), 4158 nt (9 chủng) và 4179 nt (1 chủng). Như vậy, về độ

dài nucleotide: giữa các chủng có thể khác nhau tớ 39 nt, do đó dẫn tới sự sai

khác về tính tương đồng, tính đa dạng và khoảng cách di truyền giữa các

chủng PEDV lưu hành. Trong phần dưới đây, nghiên cứu này đi sâu phân tích

tính đa dạng di truyền ở các khía cạnh: (i) tỷ lệ % tương đồng, (ii) phân loại

theo nhóm di truyền và (iii) khoảng cách di truyền giữa các chủng virus.

Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy)

a. Tỷ lệ % tương đồng nucleotide

Hình 4.5. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV

Dễ nhận thấy ở 4/5 chiều dài gen S (từ nucleotide 800 - 4188), 38 chủng

PEDV có sự tương đồng > 90% về trình tự nucleotide (ngoại trừ chủng KJ960178

(vùng C) và chủng KX708903 (vùng D)). Ở hai vùng A và B (từ nucleotide 1 -

800), mức tương đồng về trình tự gen giữa các chủng PEDV trong nghiên cứu này

là thấp nhất, dao động từ 63,7% - 87,9%. Sự biến động về mức tương đồng trên

dọc chiều dài gen S giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam (trình bày ở hình

4.5) cũng đã được biết đối với một số chủng virus lưu hành trên thế giới, trong đó

có PEDV phân lập ở lợn của Trung Quốc (Chen et al., 2016).

b. Phân loại theo nhóm di truyền

Kết quả phân tích tương đồng trình tự nucleotide kể trên cho biết các chủng

PEDV lưu hành ở nước ta tương đối đa dạng. Trong phần này, cây phát sinh

Chủng PEDV được thu thập trong nghiên cứu này và truy cập từ Genbank có nguồn gốc tại

Hà Nội (HNi), Hòa Bình (HB), Hưng Yên (HY), Thái Bình (TB), Hải Phòng (HP), Vĩnh Phúc (VP),

Lào Cai (LC), Thái Nguyên (TN), Quảng Trị (QT), Vũng Tàu (VT) và Đồng Nai (DNi)

chủng loại đã được xây dựng để phân nhóm PEDV (hình 4.6).

Hình 4.6. Phân loại các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen S

Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại cho biết 38 chủng PEDV trong

nghiên cứu này thuộc genogroup 1 (7 trình tự, với chiều dài gen S là 4140 nt và

4146 nt) và genogroup 2 (31 trình tự, với chiều dài gen S là 4149 nt, 4155 nt,

4158 nt và 4179 nt). Đối với genogroup 2, nếu lấy khoảng cách di truyền là 0,025

có thể chia genogroup này thành 3 dưới nhóm là sub G2.1, G2.2 và G2.3. Như

vậy, trong một khoảng thời gian tương đối ngắn (từ 2013- 2016) đã xuất hiện các

chủng PEDV khác nhau về mặt di truyền đang lưu hành trên đàn lợn ở 11 tỉnh/

thành phố có trình tự gen S được phân tích trong nghiên cứu này.

c. Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV của Việt Nam

Khoảng cách di truyền (genetic distance) của gen S giữa 38 chủng được

Trục Ox biểu diễn khoảng cách di truyền (genetic distance). Đường nét đứt biểu diễn giới hạn về khoảng

cách di truyền giữa genogroup 1 và genogroup 2 của PEDV

tính bằng 4 mô hình mô phỏng sự biến đổi của nucleotide (hình 4.7).

Hình 4.7. Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV

Biểu diễn tần suất khoảng cách di truyền của gen S giữa 38 chủng PEDV trên

mặt phẳng tọa độ Oxy cho 3 vùng phân bố rời rạc (A, B, C). Vùng A là vùng biểu

diễn khoảng cách di truyền của các chủng giống nhau trong cùng genogroup nên

có phạm vi dao động từ 0,000 đến 0,016. Vùng B và vùng C là vùng biểu diễn

khoảng cách di truyền giữa các chủng khác nhau trong cùng genogroup, nên có

phạm vi dao động cao từ 0,016 đến 0,040 (genogroup 1) và từ 0,041 đến 0,062

(genogroup 2). Giữa các chủng PEDV thuộc genogroup 2 có khoảng cách di

truyền lớn hơn các chủng thuộc genogroup 1. Kết quả này cũng phản ánh đặc điểm

phân nhóm của genogroup 2 rằng: có ít nhất 3 dưới nhóm lưu hành ở Việt Nam.

4.2.1.2. Đặc điểm về đột biến thêm- xóa (insertion- deletion)

Trên cơ sở sắp xếp trình tự nucleotide theo cột và so sánh, các vùng gen S

Vị trí nucleotide được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 (AF353511)

có đột biến thêm- xóa đã được xác định (hình 4.8).

Hình 4.8. Đột biến thêm- xóa ở gen S của 38 chủng PEDV

Đã xác định được 6 vị trí của gen S mang đột biến thêm- xóa (ký hiệu từ

1- 6, hình 4.9). Trong đó đột biến ở phần gen mã hóa tiểu phần S1 là đa số với

5/6 điểm thêm- xóa. Các vùng thêm- xóa thường ngắn, chỉ gồm 1 - 2 - 4 codon,

ngoại trừ chủng KX982576 (vùng số 5) có đột biến thêm 8 codon. Đột biến

thêm- xóa tại các vị trí khác nhau của gen S đã được phát hiện ở nhiều chủng

PEDV lưu hành ở nhiều quốc gia, với số lượng nucleotide thêm- xóa rất đa

dạng: từ 1 đến 11 nucleotide (Wang et al., 2014; Marthaler et al., 2014), hoặc

từ 582- 648 nucleotide (Diep et al., 2017). Đặc điểm đột biến thêm- xóa của các

chủng PEDV trình bày ở trên không bao gồm 13 chủng PEDV của Việt Nam

được công bố ở ngân hàng gen (KX982555- KX982577). Các chủng virus này

đều mang đột biến kết thúc phiên mã protein ở giữa gen S dẫn tới protein được

mã hóa ngắn hơn 261 amino acid (Diep et al., 2017). Mặc dù tác giả cho rằng

13 chủng virus kể trên được lấy từ lợn có triệu chứng tiêu chảy, nên đột biến

làm ngắn 261 amino acid được phỏng đoán không ảnh hưởng tới đặc tính lây

nhiễm hạt virus. Ngoài PEDV, ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam đã có sự lưu hành

của porcine deltacoronavirus (loại virus được xác định gây bệnh với triệu chứng

giống với PEDV) (Le et al., 2017). Chúng tôi cho rằng chủng PEDV mang đột

biến làm ngắn 261 amino acid là hạt virus mất đặc tính lây nhiễm (defective

viral particle) và không tiến hành so sánh.

Hiện nay, vai trò của đột biến thêm- xóa trong cơ chế sinh bệnh của PEDV

chưa được làm sáng tỏ. Kết quả phân tích trình tự gen của chủng PEDV nhược

độc hóa trên môi trường tế bào (TC-PC177) thấy xuất hiện đột biến xóa 197 aa ở

đầu N của protein S. Đột biến này đã được chứng minh không ảnh hưởng tới tính

hướng tổ chức nhưng làm giảm độc lực của chủng virus (Hou et al., 2017). Mặc

dù kết quả so sánh bắt cặp trình tự gen S giữa 38 chủng PEDV của Việt Nam với

chủng TC-PC177 cho thấy vùng mang đột biến thêm- xóa từ số 1 đến số 4 (hình

4.8) nằm hoàn toàn trong vùng đột biến xóa 197 aa, do đó vai trò của các đột

biến thêm- xóa ở các chủng PEDV lưu hành ở nước ta cần được làm rõ. Trên

protein S, có 3 vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể

trung hòa, từ aa 499- 638 (Chang et al., 2002), aa 636- 789 (Sun et al., 2007) và

aa 1368- 1374 (Cruz et al., 2008). Đột biến thêm- xóa của 38 chủng PEDV trong

nghiên cứu xảy ra tại codon mã hóa aa ở các vị trí (so với chủng CV777,

AF353511) là: 57-58 (vùng số 1), 110 (vùng số 2), 135-136 (vùng số 3), 158-159

(vùng số 4), 379-380 (vùng số 5) và 1194 (vùng số 6) và đều nằm ngoài 3 epitop

trung hòa COE, S1D và 2C10. Do đó, các đột biến thêm- xóa được dự đoán

không ảnh hưởng tới đáp ứng miễn dịch. Thực nghiệm in vitro đã chứng minh

khả năng trung hòa chéo giữa chủng PEDV có đột biến thêm - xóa và những

chủng không có dạng đột biến này (Chen et al., 2016).

4.2.1.3. Đặc điểm đột biến ở vùng quyết định kháng nguyên

Bằng thực nghiệm, đã có 3 vùng quyết định kháng nguyên ở protein S được

xác định: (i) COE từ aa 499- 638 (Chang et al., 2002), (ii) S1D từ aa 636- 789

với 2 epitop được nhận biết bởi tế bào lympho B (B cell epitope) là SS2 (aa 748-

755) và SS6 (aa 764- 771) và (iii) 2C10 từ aa 1368- 1374. Epitop 2C10 chỉ gồm

7 aa và kết quả so sánh giữa 38 chủng PEDV cho thấy trình tự nucleotide và

amino acid của epitop này tương đối bảo thủ (kết quả không trình bày).

Tốc độ thay đổi nucleotide của vùng gen mã hóa kháng nguyên COE và S1D (A). So sánh tốc độ thay đổi

nucleotide giữa gen COE và S1D tại mỗi vị trí codon (B-D). Tốc độ thay đổi nucleotide tại vị trí codon

thứ nhất (CP1), thứ hai (CP2) và thứ ba (CP3) của bộ ba mã hóa của gen COE (E) và gen S1D (F).

a. Đặc điểm về sự biến đổi nucleotide ở các vị trí codon

Hình 4.9. Tốc độ thay đổi nucleotide tại các vị trí codon của gen mã hóa

vùng quyết định kháng nguyên

Về tốc độ thay đổi nucleotide (x 10-3 thay đổi/ vị trí/ năm), gen mã hóa S1D

có tốc độ trung bình là 1,84 (0,72 ÷ 3,12) và nhỏ hơn tốc độ trung bình của gen

mã hóa COE là 2,41 (0,96 ÷ 3,77). Với khoảng tin cậy 95% của tốc độ đột biến

nucleotide là giao nhau (hình 4.9A), về cơ bản vùng gen mã hóa COE và S1D có

tốc độ đột biến tương đương. Giữa hai gen không có sự khác biệt về tốc độ thay

đổi nucleotide ở vị trí codon thứ nhất (hình 4.9B). Sự khác biệt về tốc độ thay đổi

nucleotide ở vị trí codon thứ hai (hình 4.9C) và ở vị trí codon thứ 3 (hình 4.9D)

là rõ nhất, với khoảng tin cậy 95% chỉ giao nhau ở biên. Mặc dù gen COE và

S1D đều có tốc độ thay đổi nucleotide theo thứ tự CP3 > CP2 > CP1 (1,83 > 0,66

> 0,52 (COE); 1,40 > 1,06 > 0,53 (S1D)), nhưng gen mã hóa S1D có tốc độ thay

đổi lớn gấp 1,6 lần so với gen mã hóa COE. Theo bảng mã di truyền, bất kỳ sự

thay đổi nào ở vị trí codon thứ hai của bộ 3 mã hóa đều dẫn tới sự thay đổi amino

acid được mã hóa (Bofkin and Goldman, 2007). Do vùng quyết định kháng

nguyên S1D có 2 epitop trung hòa là SS2 và SS6, nên có thể dự đoán rằng tốc độ

thay đổi amino acid nhanh hơn ở vùng gen này liên quan đến cơ chế lẩn tránh

đáp ứng miễn dịch.

b. Đặc điểm về sự biến đổi amino acid của vùng COE

Trên cơ sở sắp xếp trình tự amino acid theo cột (alignment), trình tự amino

acid của vùng COE được trình bày ở hình 4.10. Vùng quyết định kháng nguyên

COE (aa 499 – 638) được xác định bao gồm một vùng quyết định kháng nguyên

kích thích sản sinh kháng thể trung hoà từ aa 499-600 (tương đương aa 496-597

của chủng CV777) (Okda et al., 2017). So với chủng tham chiếu CV777, 38

chủng PEDV của Việt Nam sai khác ở 31 vị trí, tập trung tại 8 vị trí là amino acid

517, 521, 527, 549, 594, 605, 612 và 635.

Vùng quyết định kháng nguyên COE còn đóng vai trò là receptor gắn thụ

thể pAPN (porcine aminopeptidase-N) (Li et al., 2007). Trong 4 vị trí gắn với

pAPN (đóng khung từ 1-4), có tới 3 vị trí trong đó xảy ra đột biến. Trình tự

amino acid ở vùng gắn pAPN số 3 nhìn chung là bảo thủ (trừ 3 chủng là

KJ960178, KJ960179, KJ960180 có đột biến). Đột biến ở vùng bám pAPN cũng

đã được xác định đối với PEDV lưu hành ở nhiều nước trên thế giới.

5 6

Các vùng gắn với thụ thể porcine aminopeptidase-N (pAPN) được đóng khung. Vùng kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 496-597) được xác định bởi Okda et al., 2017.

Vị trí đột biến dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa được đánh dấu bởi mũi tên. Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 (AF353511).

Hình 4.10. Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV

Mặc dù có bằng chứng trái ngược nhau nhưng pAPN (đặc biệt là tiểu phần

VII) được chứng minh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình bám và xâm

nhập của PEDV vào tế bào. Đối với coronavirus, vùng kháng nguyên làm nhiệm vụ

gắn kết với tế bào vật chủ thường là đích tác động của kháng thể trung hòa. Do đó,

đột biến ở 4 vị trí bám pAPN của 38 chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam được dự

đoán có ảnh hưởng đến quá trình xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ. Ở khía

cạnh khác, PEDV có thể không bị trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu (neutralization

resistance) chỉ với một điểm đột biến ở vùng bám với pAPN: từ valine (V) sang

glycine (G) ở vị trí 638 (tương đương với vị trí 635 của chủng CV777). Không có

chủng virus nào trong 38 chủng ở nghiên cứu này được dự đoán là có khả năng lẩn

tránh kháng thể trung hòa do đều mã hóa valine ở vị trí 635 (mũi tên, hình 4.29).

c. Đặc điểm về sự biến đổi amino acid của vùng S1D

Trình tự amino acid của vùng quyết định kháng nguyên S1D được trình bày

ở hình 4.11. Trong 21 vị trí có thay đổi amino acid (so với chủng CV777), có 6 vị

trí đột biến nằm trong vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng

thể trung hòa (aa 741- 768). Trong vùng này, epitop trung hòa SS2 và SS6 của 38

chủng PEDV của Việt Nam có tính bảo thủ rất cao. Epitop SS2 giống với trình tự

của chủng CV777 ở 37/38 chủng, trong khi đó epitop SS6 sai khác 1 aa so với

chủng CV777 (vùng đóng khung, hình 4.11). Ngoài các vùng quyết định kháng

nguyên kích thích sản sinh kháng thể trung hòa nằm trên tiểu phần S2 kể trên, đột

biến R895G (tương đương với vị trí 891 của chủng tham chiếu CV777) được

chứng minh có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình thích nghi của virus in

vitro (đột biến R-> G dẫn tới tăng hiệu giá virus và kích thước của plaque nhỏ

hơn). Kết quả đối chiếu, so sánh cho biết 38 chủng PEDV trong nghiên cứu này

đều mã hóa arginine (R) tại vị trí 891.

Kết quả phân tích 2 vùng quyết định kháng nguyên cho thấy có một số biến

đổi tại các vùng này ở 38 chủng PEDV thực địa ở nước ta. Hiện còn một số bằng

chứng trái chiều về khả năng trung hòa chéo giữa genogroup 1 và genogroup 2

của PEDV (Islam et al., 2016). Vì vậy, bên cạnh nghiên cứu đặc tính sinh học

phân tử, rất cần phân lập chủng PEDV thực địa để làm nguyên liệu cho các

nghiên cứu sâu hơn về đáp ứng miễn dịch cũng như phát triển vacxin phòng bệnh

phù hợp chủng.

5 8

Epitop trung hòa SS2 và SS6 được đóng khung. Các phân đoạn aa 741-756, 744-771 và 753-768 kích thích sản sinh kháng thể trung hòa được xác định

bởi Okda và cs., 2017. Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 (AF353511)

Hình 4.11. Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV

4.2.1.4. Đặc điểm sự thay đổi amino acid ở vùng gắn sialic acid

Trước khi có sự biến đổi cấu trúc không gian (conformational changes) của

tiểu phần S2 dẫn tới sự hòa màng virus- màng tế bào, PEDV phải bám được vào

các receptor trên bề mặt tế bào vật chủ thông qua vùng đặc hiệu trên tiểu phần

S1. Theo chức năng này, tiểu phần S1 của PEDV được chia thành 2 phần: đầu N

(NTD) bám vào thụ thể sialoglycoconjugate và đầu C (CTD) bám proteinaceous

receptor. Do đầu CTD nằm trong vùng quyết định kháng nguyên COE và đã

được phân tích ở trên, nên kết quả trình bày trong mục này tập trung vào đặc

điểm biến đổi amino acid tại đầu NTD.

Đặc điểm nổi bật của trình tự amino acid của vùng gắn với thụ thể sialic

acid (S10) của 38 chủng PEDV trong nghiên cứu này là đột biến thêm- xóa. Đặc

điểm thêm- xóa có thể thấy ở các chủng PEDV lưu hành trong tự nhiên (chủng

TTR-2 ở Nhật Bản có đột biến xóa 194 amino acid) hoặc ở các chủng PEDV

thích nghi cao độ trên môi trường tế bào (chủng TC-PC177 với đột biến xóa 197

amino acid) (Hou et al., 2017). Cho đến nay, ảnh hưởng của các đột biến thêm-

xóa tại các vị vùng bám này hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ đối với PEDV.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra vai trò rất quan trọng của vị trí bám

sialic acid có liên quan tới tính hướng tổ chức (tế bào biểu mô ruột non). Mặc dù

vậy, đã có một số công bố đã cho thấy PEDV có khả năng bài thải qua tuyến sữa

(Sun et al., 2012), thậm chí virus còn được chứng minh bài thải qua tinh dịch

(Gallien et al., 2018). Các kết quả kể trên cho thấy PEDV có tính hướng một số

tổ chức khác nhau. Tuy vậy, cơ chế phân tử của đặc điểm này vẫn chưa được làm

rõ. So sánh trình tự gen S của 38 chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam với trình tự

tương ứng của chủng PEDV bài thải qua tuyến sữa (KP890336) cho thấy cả 3 vị

trí đột biến từ số 1 đến số 3 (hình 4.12) là đều sai khác.

Ở một góc độ khác, có 2 đột biến điểm tại vị trí 100 (Phe-to-Leu; F100L) và

129 (Pro-to-Leu; P129L) dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa. Đối

chiếu với trình tự tương ứng của 38 chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam, có thể

thấy 2 vị trí kể trên là bảo thủ (100F, 120P), ngoại trừ chủng KP455316 thu thập

ở Quảng Trị năm 2014 mang đột biến F100L.

6 0

Các vị trí đột biến điểm dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa được đóng khung, đột F-96-L được chỉ bởi mũi tên. Đánh dấu từ 1-3 là các vị trí đột biến của

chủng PEDV bài thải qua sữa. Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 (AF353511)

Hình 4.12. Trình tự amino acid ở vùng S10 của 38 chủng PEDV

4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam

Gen ORF3 của PEDV gồm 672 nucleotide (không bao gồm codon kết thúc

phiên mã). Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh được vai trò của ORF3 có

liên quan đến quá trình thích nghi của virus trên môi trường tế bào (Wongthida et

al., 2017) và độc lực của virus (Park et al., 2008). Trong phạm vi của nghiên cứu

này, chúng tôi tiến hành phân tích để làm rõ một số đặc điểm ở cấp độ phân tử

gen ORF3 của 12 chủng PEDV lưu hành tại Việt Nam. Nghiên cứu này đi sâu

phân tích tính đa dạng di truyền ở các khía cạnh: đặc điểm biến đổi trình tự

nucleotide và amino acid được mã hóa, tỷ lệ % tương đồng và khoảng cách di

truyền giữa các chủng virus.

4.2.2.1. Đặc điểm biến đổi nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV

Hình 4.13 trình bày kết quả phân tích trình tự nucleotide của 12 chủng

PEDV lưu hành ở Việt Nam được thu thập trong năm 2013 và 2014. Vị trí

nucleotide được đánh dấu theo chủng tham chiếu DR13 (EU054929). Vị trí có

thông tin (vị trí mà ở đó có ít nhất 2 thay đổi loại nucleotide và mỗi một loại thay

đổi nucleotide xuất hiện ở ít nhất 2 trình tự) giữa 12 chủng PEDV của Việt Nam

được đánh dấu màu xám.

Khi so sánh với trình tự tham chiếu (DR13, EU054929), có 47 vị trí được

xác định đa hình nucleotide. So sánh riêng 12 trình tự gen ORF3 của Việt Nam

đã sắp cột (alignment) gồm 672 vị trí cho kết quả như sau: (i) 627/672 vị trí

(chiếm 93,30%) không có đột biến nucleotide (monomorphic), với 2 vùng (nt

551- 606 và nt 628- 672) được đánh giá là bảo thủ với mức tin cậy p < 0,05; (iii)

45/672 vị trí (chiếm 6,70%) có đột biến (đa hình nucleotide, polymorphic), với 12

vị trí được xếp vào nhóm “vị trí có thông tin” (đánh dấu màu xám). Cũng như

nhiều nghiên cứu khác trên thế giới (Chen et al., 2013; Su et al., 2016), khi phân

tích trình tự gen Khác với trình tự gen S, chúng tôi không quan sát thấy đột biến

thêm- xóa ở gen ORF3 ở 12 chủng PEDV trong nghiên cứu này. Do đột biến thêm

xóa là một đặc điểm thường gặp trong quá trình thích nghi của PEDV in vitro

(Park et al., 2008), có thể suy luận rằng các chủng PEDV trong nghiên cứu này

không phải là chủng virus vacxin.

Hình 4.13. Trình tự nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV

Kết quả so sánh mức tương đồng ở mỗi vị trí nucleotide của gen ORF3 được

trình bày ở hình 4.14.

Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy) Vị trí nucleotide được đánh dấu

theo chủng tham chiếu DR13 (EU054929).

Hình 4.14. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV

Khi so sánh mức độ tương đồng nucleotide gen ORF3 giữa 12 chủng

PEDV với chủng tham chiếu DR13 (hình 4.14), tùy thuộc vào vị trí nucleotide

được so sánh, các chủng của Việt Nam tương đồng từ 93% - 99%. Từ

nucleotide 1- 406, chủng virus KT941120 (Hưng Yên, 2014) giống > 97% so

với DR13. Cũng trong khoảng này 11 chủng virus còn lại có mức tương đồng <

97%. Đặc điểm biến đổi nucleotide gen ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở

Việt Nam còn được phân tích thông qua xây dựng cây phát sinh chủng loại

(hình 4.15).

Hình 4.15. Phân loại chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3

Kết quả phân tích cây phả hệ dựa vào trình tự nucleotide gen ORF3 cho thấy

PEDV của Việt Nam có thể được chia thành 2 genogroup (Chen et al., 2014).

Genogroup 2 được xác định chỉ gồm 1 chủng KT941120. Đặc điểm này phù hợp

với phân loại dựa vào phân tích % tỷ lệ tương đồng (hình 4.14) và khoảng cách di

truyền (hình 4.16).

Hình 4.16. Khoảng cách di truyền của gen ORF3 giữa các chủng PEDV

Trục Ox biểu diễn khoảng cách di truyền (genetic distance). Đường nét

đứt biểu diễn giới hạn về khoảng cách di truyền gen ORF3 giữa genogroup 1

và genogroup 2.

Như vậy, mặc dù số lượng trình tự gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt

Nam còn hạn chế, nhưng qua phân tích trình bày ở hình 4.14 đến hình 4.16 có thể

thấy tính đa dạng về mặt di truyền của PEDV. Đặc điểm này cũng được xác định

đối với các chủng PEDV lưu hành ở một số nước trên thế giới, trong đó có Trung

Quốc và Thái Lan (Chen et al., 2013; Temeeyasen et al., 2014).

4.2.2.2. Đặc điểm biến đổi amino acid của protein ORF3

Hình 4.17 trình bày kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của 12

chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam.

Các vị trí liên quan đến ức chế sự nhân lên của virus in vitro được đánh dấu bởi mũi tên. Trong đó, aa 81

và 167 có ảnh hưởng rõ rệt nhất được đánh dấu màu xám. Vùng aa 82-98 liên quan đến hiện tượng ức chế

sự nhân lên của virus được gạch chân. Vị trí xuất hiện đột biến tại (aa 98) trong quá trình nhược độc hóa

chủng virus nhược độc PC22A được đóng khung nét liền. Vùng aa (1) và (2) ảnh hưởng tới kênh ion K+,

trong đó aa 170 có ảnh hưởng rõ rệt được đóng khung bằng nét đứt

Hình 4.17. Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV

Các nghiên cứu được công bố gần đây cho thấy protein ORF3 ngoài đóng

vai trò là kênh ion trên vỏ bọc của virus (Wang et al., 2012) với Tyrosin ở vị trí 170 (170Y) đóng vai trò quan trọng trong duy trì hoạt động của kênh ion K+. Vị

trí này ở protein ORF3 của 12 chủng PEDV của Việt Nam đều không có đột

biến. Đối chiếu với 2 vị trí amino acid (F81L và M167S) đóng vai trò then chốt

trong quá trình ức chế sự nhân lên của virus in vitro (Wongthida et al., 2017),

chúng tôi không quan sát được các đột biến đã được chứng minh ức chế sự

nhân lên của PEDV.

4.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VỀ DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

CỦA PEDV

4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành của PEDV theo nhóm di truyền

Tổng hợp các công bố liên quan đến PEDV lưu hành ở Việt Nam cho thấy

3 yếu tố như (i) địa điểm lấy mẫu, (ii) thời gian nghiên cứu, (iii) loại gen (S hoặc

ORF3) được lựa chọn, và (iv) số lượng trình tự gen dùng cho phân tích sẽ dẫn

đến các kết quả tương đối khác nhau về đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV.

Ví dụ thứ nhất: ở nghiên cứu được công bố năm 2011 (Do Tien Duy et al., 2011)

cho biết chỉ phát hiện được 8/8 chủng PEDV thuộc genogroup 1 ở các mẫu thu

thập tại một số tỉnh miền Nam trong năm 2009- 2010. Kết quả này dựa trên trình

tự một phần gen S và toàn bộ gen M. Ngược lại, nghiên cứu về PEDV lưu hành ở

Việt Nam trong khoảng 2012-2015 cho biết 25 chủng PEDV thu thập ở 7 tỉnh

miền Bắc thuộc cả về genogroup 1 và genogroup 2 (Diep et al., 2017). Trong

khoảng thời gian và không gian lấy mẫu phân tích tương tự, kết quả phân tích

một phần trình tự gen S (nu 1534- 2049) của 11 chủng PEDV tại 3 tỉnh thuộc

miền Bắc và miền Trung lại cho biết PEDV lưu hành ở 3 tỉnh trong khoảng thời

gian 2013-2014 đều thuộc về genogroup 1.

Nhận biết được các nhược điểm nêu trên, để có được bức tranh tương đối

toàn diện về dịch tễ học phân tử của PEDV lưu hành ở Việt Nam, nghiên cứu này

đã thực hiện phân tích với dung lượng mẫu lớn (n = 911 trình tự gen S, n = 886

trình tự gen ORF3) được sàng lọc từ ngân hàng gen.

4.3.1.1. Cây phả hệ của PEDV dựa vào gen S

Để làm rõ mối liên hệ về trình tự gen giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt

Nam với thế giới, chúng tôi đã thu thập và phân tích cơ sở dữ liệu bao gồm 911

trình tự gen S hoàn chỉnh, có đầy đủ thông tin về địa điểm và thời gian thu thập

mẫu. Kết quả phân tích được trình bày ở hình 4.18.

Nhánh của cây phát sinh chủng loại được đánh dấu màu đen (genogroup 1) và màu xanh (genogroup 2).

Nhánh dẫn tới các chủng lưu hành ở Việt Nam được đánh dấu màu đỏ và được chỉ bằng mũi tên

Hình 4.18. Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S

Kết quả trình bày ở hình 4.18 cho thấy 38 chủng PEDV của Việt Nam (mũi

tên) thuộc về 2 nhóm riêng rẽ là genogroup 1 và genogroup 2. Trong khi các chủng

virus thuộc genogroup 1 chỉ bao gồm 1 nhánh, PEDV thuộc genogroup 2 phân bố rải

rác ở các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại. Cùng với các chủng PEDV

lưu hành ở các nước khác, 31 chủng virus của Việt Nam thuộc genogroup 2 được

phân bố vào 2 dưới nhóm là nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ (Lin et al ., 2016). Kết

quả phân loại PEDV lưu hành ở Việt Nam kể trên là phù hợp nghiên cứu được công

bố năm 2015 (Kim et al., 2015; Le et al., 2016) trong đó nhóm tác giả cho biết: dựa

vào trình tự toàn bộ gen S, PEDV lưu hành ở một số tỉnh thuộc miền Bắc và miền

Trung thuộc về genogroup 1 và genogroup 2. Dưới một góc độ khác, kết quả phân

tích được trình bày trong nghiên cứu này cho biết một số công bố (Vui et al., 2015)

chỉ phát hiện được genogroup 2 của PEDV lưu hành ở nước ta là chưa chính xác.

So với một số nước trong khu vực như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Thái Lan, dịch PED xuất hiện ở Việt Nam tương đối muộn, được công bố xảy

ra lần đầu vào năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011). Do đó, chúng tôi tiến hành

so sánh đặc điểm phân nhánh của PEDV lưu hành ở Việt Nam với virus lưu hành

ở một số nước trong khu vực. Kết quả trình bày ở hình 4.19 cho biết, một số

chủng virus lưu hành ở Việt Nam tạo thành các nhóm nhỏ, trong các nhóm này bắt đầu có sự phân nhánh (nhánh màu đỏ, hình 4.19). Đặc điểm phân nhánh nhánh giúp rút ra nhận xét rằng: sau khi xâm nhập vào Việt Nam, các chủng

PEDV đã lưu hành trong quần thể động vật mẫn cảm và hình thành nên các nhóm

di truyền địa phương. Đặc điểm trên đã được nhận xét đối với PEDV lưu hành ở

một số quốc gia, ví dụ như Thái Lan (Stott et al., 2017) và Hàn Quốc (Lee et al.,

2010). Đặc điểm dịch tễ học phân tử này đã được biết đến ở nhiều virus khác

Chúng tôi lựa chọn 1 nhánh nhỏ của cây phả hệ có các chủng PEDV của Việt Nam (hình nhỏ đính kèm).

Nhánh cây phả hệ được đánh dấu bằng màu tương ứng với mỗi quốc gia có chủng virus lưu hành.

ngoài PEDV, ví dụ như porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Kim et al., 2012) và porcine deltacoronavirus (Lee et al., 2016), v.v...

Hình 4.19. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dẫn tới các chủng

của Việt Nam dựa vào trình tự gen S

Trên hình 4.19, các chủng PEDV lưu hành ở Hàn Quốc (nhánh màu xanh da

trời) nằm gần phía gốc của cây phả hệ hơn so với các chủng PEDV lưu hành ở Việt

Nam (nhánh màu đỏ). Khi so sánh giữa 2 nhóm này, dễ dàng nhận thấy các chủng

PEDV của Việt Nam có đặc điểm chia nhánh còn hạn chế. Nguyên nhân có thể do

PEDV mới lưu hành ở Việt Nam trong khoảng thời gian tương đối ngắn hơn so với

PEDV lưu hành ở Hàn Quốc. Lý do khác là số lượng trình tự gen thu thập ở Việt

Nam còn hạn chế, dẫn tới chưa làm rõ được đặc điểm phân nhánh chi tiết của chủng

virus lưu hành ở nước ta. Nhận xét này chỉ rõ sự cần thiết tiếp tục nghiên cứu giải

trình tự để có bức tranh tổng thể về PEDV lưu hành ở Việt Nam.

4.3.1.2. Cây phả hệ của PEDV dựa vào gen ORF3

Mối liên hệ giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam trong tương quan với

Các nhánh của cây thuộc về genogroup 1 và genogroup 2 được đánh dấu lần lượt bằng màu đen và màu

xanh. Các nhánh có chủng PEDV của Việt Nam được đánh dấu màu đỏ. Nhóm biến thể chưa được xác

định genogroup được đánh dấu màu tím.

các chủng lưu hành trên thế giới tiếp tục được phân tích dựa vào gen ORF3.

Hình 4.20. Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3

Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen ORF3 phân chia các

chủng PEDV thành 2 genogroup rõ ràng là genogroup 1 và genogroup 2. Tuy

nhiên, khác với các công bố trước đây (Chen et al., 2014; Wang et al.,

2016), kết quả trình bày trong nghiên cứu này cho thấy, ngoài 2 genogroup

kể trên, còn quan sát được 1 nhánh phát sinh nằm ở gốc của cây phả hệ.

Nhánh này hiện bao gồm 2 chủng virus (với đặc điểm gen khác biệt lớn so

với các chủng PEDV hiện lưu hành) được tìm thấy ở các mẫu bệnh phẩm lưu

trữ từ năm 2000 ở Anh và năm 2008 ở Nga (Strizhakova et al., 2017;

Steinbach et al., 2016).

Về các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam, phân tích cơ sở dữ liệu gồm

886 trình tự gen ORF3 có trong ngân hàng gen (bao gồm các trình tự gen cập

nhật của Việt Nam), nghiên cứu này đã xác định PEDV lưu hành ở nước ta

gồm genogroup 1 (11 chủng, phân lập năm 2013-2014) và genogroup 2 (1

chủng, phân lập năm 2014). Đây được xem như kết quả bổ sung về đặc điểm

dịch tễ học virus lưu hành ở nước ta, bởi lẽ dựa vào gen ORF3 nghiên cứu

trước đây đã nhận định PEDV lưu hành ở Việt Nam chỉ bao gồm một nhóm di

truyền có quan hệ chặt chẽ với nhau (Kim et al., 2015).

Đặc điểm phân nhánh của cây phả hệ có các chủng PEDV của Việt Nam

thuộc genogroup 1 tiếp tục được làm rõ (hình 4.21). Với cơ sở dữ liệu chỉ bao

gồm 39 chủng tham chiếu (Kim et al., 2015), hình 4.21 B cho biết 11 chủng

PEDV của Việt Nam tạo thành một nhánh của cây phả hệ (đóng khung).

Nhánh này không bao gồm các chủng PEDV của các nước khác. Ngược lại,

kết quả trình bày ở hình 4.21 A cho biết 11 chủng PEDV kể trên nằm ở các

nhánh khác nhau (phần đóng khung số 1 và số 2). Xen kẽ với các chủng

PEDV của Việt Nam là các chủng virus lưu hành ở Trung Quốc. Kết quả so

sánh này một lần nữa cho thấy rõ số lượng trình tự gen dùng trong phân tích

có ảnh hưởng lớn tới các kết luận liên quan đến đặc điểm dịch tễ học phân tử

của PEDV.

7 2

Một phần của cây phả hệ (hình nhỏ góc trên cùng bên trái) chứa các chủng PEDV của Việt Nam. (B) cây phả hệ được xây dựng dựa vào gen ORF3

trong nghiên cứu của Kim et al., 2015

Hình 4.21. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dựa vào gen ORF3 của genogroup 1 của Việt Nam

4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam

Trong quá trình phân tích cây phả hệ dựa vào trình tự 1 phần hoặc toàn bộ

gen S, chúng tôi nhận thấy một số chủng có sự thay đổi về genogroup được phân

loại. Nguyên nhân của hiện tượng nêu trên là kết quả của quá trình tái tổ hợp

giữa các đoạn của cùng một gen hoặc giữa các gen của bộ gen virus (Ruths et al.,

2005). Nghiên cứu này đã làm rõ hiện tượng tái tổ hợp của các chủng PEDV lưu

hành ở Việt Nam trên cơ sở so sánh cây phả hệ được xây dựng bởi các đoạn khác

(A) Cây phả hệ dựa trên trình tự gen S từ nt 1534- 2049 – Kết quả nghiên cứu của NCS (2015). (B)

cây phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ gen S được xây dựng trong nghiên cứu này. Các chủng PEDV giống

nhau ở mỗi cây phả hệ được nối với nhau bởi một đường thẳng

nhau của gen S: một phần (nt 1534- 2049) gen S- toàn bộ gen S.

Hình 4.22. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và

một phần gen S (n =43)

Hình 4.22 A cho biết 11/11 chủng PEDV được xếp vào genogroup 1 dựa

vào trình tự phân đoạn gen S gồm 650 nt. Đáng chú ý có 5/11 chủng (đánh dấu

màu vàng, hình 4.23) được xếp vào genogroup 2 ở cây phả hệ được xây dựng

dựa vào trình tự toàn bộ gen S. Đối với các chủng còn lại, mặc dù không thấy có

sự thay đổi genogroup, vẫn quan sát được sự thay đổi vị trí (được nhóm với các

chủng khác nhau) giữa 2 cây phả hệ.

Chúng tôi tiếp tục tìm hiểu đặc điểm trên ở cơ sở dữ liệu gồm 911 trình tự.

Cơ sở dữ liệu phân tích gồm 911 trình tự gen S. Để dễ quan sát, chỉ có nhánh của cây phả hệ được

hiển thị. (A) Cây phả hệ dựa trên trình tự gen S từ nt 1534- 2049. (B) cây phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ

gen S được xây dựng trong nghiên cứu này. Các chủng PEDV giống nhau ở mỗi cây phả hệ được nối với

nhau bởi một đường thẳng

Kết quả được trình bày ở hình 4.23.

Hình 4.23. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và

một phần gen S (n =911)

Kết quả ở hình 4.23 vẫn cho thấy hiện tượng thay đổi genogroup giữa 2 cây

phả hệ được xây dựng từ những phần khác nhau của gen S. Tái tổ hợp là một cơ

chế tiến hóa của virus nói chung (Simon-Loriere et al., 2011) và của PEDV nói

riêng (Stott et al., 2017; Tian et al., 2014; Chung et al., 2016). Hiện tượng tái tổ

hợp của PEDV diễn ra khá đa dạng: (i) giữa PEDV và TGEV (Boniotti et al.,

2016), (ii) giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2 và xảy ra tại

nhiều vị trí của gen S (Stott et al., 2017; Sun et al., 2015), (iii) giữa các gen khác

nhau của bộ gen (Tian et al., 2014), v.v... Như vậy, có thể thấy đặc điểm tái tổ

hợp của một số chủng PEDV ở Việt Nam không phải là trường hợp riêng.

4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian

Trên cơ sở phân loại genogroup virus dựa vào cây phả hệ, các nhánh của

cây bao gồm các chủng PEDV của Việt Nam đã được tách riêng để phân tích sự

phát tán của virus theo không gian và thời gian.

4.3.3.1. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc genogroup 1

Để thuận tiện cho việc theo dõi, các chủng PEDV của Việt Nam thuộc

genogroup 1 được tóm tắt ở bảng sau.

Bảng 4.6. Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 1

TT Tên chủng

Địa danh

Năm

ORF3

S

VN/VAP1113.1

Vũng Tàu

2013

KJ960179

VN/JFP1013.1

Đồng Nai

2013

KJ960178

VN/KCHY.310113 Hưng Yên

2013

KJ960180

HUA.PED47

Thái Bình

2013

KP455968

HUA.PED45

Thái Bình

2013

KP455967

VN232/HB/2013

Hòa Bình

2013

KX982564

HUA.PED55

Quảng Trị

2014

KP455969

KP455315

HUA.PED58

Quảng Trị

2014

KP455970

KP455316

HUA.PED60

Quảng Trị

2014

KP455971

KP455317

10 HUA.PED63

Quảng Trị

2014

KP455972

KP455318

11 HUA.PED67

Quảng Trị

2014

KP455973

KP455319

12 HUA.PED68

Hải Phòng

2014

KP455974

KP455320

Ghi chú: (*) chủng PEDV không được phân loại là genogroup 1 dựa vào trình tự gen S, (x) chủng PEDV

không có trình tự gen ORF3

Hình 4.24 trình bày kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của

PEDV thuộc genogroup 1 lưu hành ở Việt Nam dựa vào trình tự gen ORF3.

Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán và chiều dài

được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. Kích thước của chấm ⚫ ở mỗi nút tương ứng

với mức tin cậy của dự đoán 40%- 100%

Hình 4.24. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa

vào trình tự gen ORF3

Hình 4.24 cho biết các chủng PEDV thuộc genogroup 1 lưu hành ở một số

tỉnh có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc (nhánh màu đỏ). Các chủng PEDV

của Việt Nam được xếp vào genogroup 1 (dựa vào gen ORF3) có thể được chia

thành 3 nhánh: (i) nhánh được tìm thấy ở miền Trung (Quảng Trị), (ii) miền Bắc

(Thái Bình) và (iii) nhánh được tìm thấy ở miền Bắc và miền Nam (Hưng Yên,

Vũng Tàu, Đồng Nai). Hình 4.25 là đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV

Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán và chiều dài

được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán (A). Nhánh dẫn đến các chủng PEDV lưu

hành ở Việt Nam (B). Nguồn gốc được dự đoán của virus phát sinh ở các nhánh được biểu thị ở mỗi nút

(node) của cây. Kích thước của chấm ⚫ ở mỗi nút tương ứng với mức tin cậy của dự đoán 70%- 98%

thuộc genogroup 1 lưu hành ở Việt Nam dựa vào trình tự gen S.

Hình 4.25. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa

vào trình tự gen S

Giống như kết quả dự đoán nguồn gốc của các chủng virus lưu hành ở Việt

Nam dựa vào gen ORF3, kết quả phân tích dựa trên trình tự của gen S cũng chỉ

rõ toàn bộ các chủng PEDV lưu hành tại các địa phương lấy mẫu có nguồn gốc

trực tiếp từ các chủng lưu hành ở Trung Quốc. Mặc dù vậy, kết quả ở hình 4.24

và hình 4.25 đều chỉ ra rằng PEDV lưu hành ở các tỉnh của Việt Nam nằm ở các

nhánh khác nhau của cây phả hệ (bắt nguồn từ các nhánh khác nhau lưu hành ở

Trung Quốc). Quan trọng hơn, kết quả phân tích đã cho biết sau khi xâm nhập

vào Việt Nam, các chủng virus này đã có sự lây lan. Ví dụ: dựa vào gen S (hình

4.25), con đường phát tán được dự đoán là từ Quảng Trị- Quảng Trị, Quảng Trị-

Hải Phòng và Quảng Trị-p Trung Quốc.

Về mặt thời gian, hình 4.24 cho thấy, mặc dù 11 mẫu PEDV thuộc

genogroup 1 của Việt Nam đều được lấy vào năm 2013- 2014, nhưng kết quả

dự đoán thời điểm sớm nhất mà virus xuất hiện tại các địa phương là không

giống nhau, dao động từ khoảng năm 2009 – 2013 (1- 4 năm trước thời điểm

mẫu được lấy). Ngược lại, dựa vào gen S (hình 4.25) thời điểm sớm nhất mà

PEDV được dự đoán xuất hiện tại các địa phương kể trên là vào khoảng năm

2005 và khoảng năm 2008 (6- 9 năm trước thời điểm mẫu được lấy). Sự chênh

lệnh về thời gian nói trên giữa dự đoán dựa vào gen ORF3 và gen S có thể được

giải thích do đặc điểm của hiện tượng tái tổ hợp của gen S. Kết quả phân tích

cây phả hệ hình 4.23 cho biết một số chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam mang

gen S tái tổ hợp. Vì đặc điểm đa nguồn gốc, dẫn tới thời điểm dự đoán là khác

nhau giữa gen ORF3 và gen S.

Nhìn chung, kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học theo thời gian cho biết

PEDV thuộc genogroup 1 đã lưu hành ở đàn lợn tại các tỉnh như Hòa Bình,

Quảng Trị và Hải Phòng trong một khoảng thời gian tương đối dài trước khi ca

bệnh do PED được phát hiện. Đây được biết đến là đặc điểm dịch tễ học phân tử

virus nói chung và PEDV nói riêng (Jarvis et al., 2016). Ví dụ như ở Mỹ, ổ dịch

PED đầu tiên được công bố vào cuối năm 2013, nhưng kết quả phân tích cho biết

nguồn gốc tổ tiên của các chủng virus gây bệnh hiện thời được dự đoán lưu hành

trong khoảng 2006- 2009 (Jarvis et al., 2016).

4.3.3.2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc genogroup 2

Phân loại genogroup PEDV dựa vào gen ORF3 (hình 4.20) cho biết chỉ có 1

chủng PEDV của Việt Nam nằm trong nhóm này. Kết quả phân tích đặc điểm

Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán. Chủng PEDV

của Việt Nam được đánh dấu bởi mũi tên. Đánh số 1-2-3 là thứ tự được dự đoán về đường truyền lây của

PEDV qua các Quốc gia.

dịch tễ học phân tử dựa vào gen ORF3 được trình bày ở hình 4.26.

Hình 4.26. Sự phát tán theo không gian của genogroup 2 dựa vào gen ORF3

Cơ sở dữ liệu dùng cho phân tích gồm trình tự gen ORF3 thu thập ở 13

quốc gia. Trong đó, kết quả cho biết các chủng PEDV lưu hành ở Hàn Quốc

được dự đoán là nguồn gốc tổ tiên xa nhất của các chủng virus lưu hành trên thế

giới (hình 4.26). Chủng PEDV của Việt Nam (mũi tên) được dự đoán có nguồn

gốc từ các chủng lưu hành ở Trung Quốc.

Dựa vào gen trình tự gen S, kết quả phân loại tại hình 4.18 cho thấy

genogroup 2 của PEDV lưu hành ở Việt Nam thuộc về 2 nhóm: nhóm châu Á và

nhóm Bắc Mỹ theo phân loại của (Lin et al., 2016). Do đó, nghiên cứu sự phát

tán theo không gian và thời gian của genogroup 2 ở nước ta được thực hiện đối

với từng nhóm.

4.3.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc nhóm châu Á

PEDV thuộc nhóm châu Á bao gồm các chủng lưu hành ở 5 nước

trong khu vực và được thu thập từ năm 1998 đến năm 2017 (bảng 4.7). Kết

quả phân tích được trình bày ở hình 4.27.

Bảng 4.7. Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 2 nhóm châu Á

Nguồn gốc

Năm

phân lập

Trung Quốc

Hàn Quốc

Việt Nam

Philippin

Thái Lan

1998

1

2001

1

2005

3

2006

2

2008

2

3

2009

7

2010

8

2011

41

2

3

2012

90

2

10

2013

55

1

7

3

2014

49

7

2

5

1

2015

31

15

2016

19

1

2017

4

Vùng giới hạn bởi các nhánh của cây phả hệ được đánh dấu bởi màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh

thổ được dự đoán. Chiều dài của các nhánh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. Để dễ quan sát,

ký hiệu tên chủng được lược bỏ. Các chủng PEDV của Việt Nam được hiển thị kèm là năm phân lập

(2 số cuối của năm)

Hình 4.27. Sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV nhánh châu Á

Hình 4.27 cho biết, PEDV thuộc nhóm châu Á lưu hành ở Trung Quốc,

Philippine, Thái Lan và Việt Nam được dự đoán có nguồn gốc từ các chủng

PEDV từ Hàn Quốc. Chủng virus tổ tiên này được dự đoán xuất hiện vào khoảng

năm 1993. Về tình hình của Việt Nam, PEDV lưu hành ở nước ta (giới hạn bởi

vùng màu tím) được xác định có nguồn gốc trực tiếp từ các chủng lưu hành ở

Cây phát sinh chủng loại với các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ

được dự đoán (A). Nhánh dẫn đến các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam (B-D) với chiều dài được căn

chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. Nguồn gốc được dự đoán của virus phát sinh ở các

nhánh được biểu thị ở mỗi nút (node) của cây phát sinh chủng loại (E-H)

Trung Quốc (vùng màu đỏ). Kết quả phân tích cụ thể được trình bày ở hình 4.28.

Hình 4.28. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của

PEDV genogroup 2 nhánh châu Á

Mặc dù vậy, các chủng PEDV thuộc genogroup 2 lưu hành ở nước ta xuất

phát từ các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại. Kết quả này cho thấy

PEDV sự xâm nhập vào nước ta qua nhiều đợt. Thậm chí, virus lưu hành ở một

tỉnh, tại các thời điểm khác nhau cũng được dự đoán có nguồn gốc khác nhau: ví

dụ như các chủng lưu hành ở Hưng Yên được mô tả ở hình 4.28 C và 4.28 D. Đối

với nhóm châu Á này, chúng tôi cũng nhận thấy một đặc điểm tương tự như với

genogroup 1, đó là: sau khi xâm nhập vào một số tỉnh, các chủng virus này đã có

sự lây lan ra các tỉnh khác (hình 4.28 E-H).

4.3.3.4. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc nhóm Bắc Mỹ

Khác với nhóm châu Á, PEDV thuộc nhóm Bắc Mỹ là các chủng có nguồn

gốc từ PEDV lưu hành ở Mỹ từ năm 2013, nhóm này không chỉ bao gồm các

chủng virus ở lục địa châu Mỹ mà còn có các chủng ở lục địa châu Á (Hàn Quốc,

Cây phát sinh chủng loại với các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ

được dự đoán. Nhánh dẫn đến các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam được đánh dấu bởi mũi tên và đi

kèm là dự đoán về nguồn gốc phát sinh

Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan và Việt Nam) và ở lục địa châu Âu.

Hình 4.29. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của

PEDV genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ

Kết quả phân tích ở hình 4.29 cho biết PEDV của Việt Nam thuộc nhóm

Bắc Mỹ có nguồn gốc từ các chủng virus lưu hành ở Mỹ. Dựa vào đặc điểm phân

nhánh, có thể thấy rõ các chủng này nằm ở các nhánh khác nhau. Kết quả này dự

đoán rằng có nhiều đợt xâm nhập của PEDV thuộc nhóm này vào nước ta. Cũng

do số lượng trình tự gen PEDV của Việt Nam của nhóm này còn hạn chế, chúng

tôi không dự đoán được liệu sau khi xâm nhập, các chủng virus này có lây lan

sang các địa phương khác hay không.

Tổng hợp kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV lưu

hành ở Việt Nam chúng tôi thấy rằng chúng có nguồn gốc từ các chủng lưu hành

ở Trung Quốc. Đặc điểm này đã được nhận xét trong một số công bố trước đây

(Do Tien Duy et al., 2011; Le et al., 2016). Tuy nhiên, nhận xét về nguồn gốc

của PEDV nhóm Bắc Mỹ là từ các chủng lưu hành ở Mỹ hiện mới được phát

hiện trong công bố gần đây (Diep et al., 2017) và trong phân tích trình bày ở

nghiên cứu này.

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

1) Dịch PED đã xuất hiện ở 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là

41,98% và diễn ra liên tục từ 2013-2015. Các trang trại ở vùng đồng bằng có tỷ

lệ dương tính PEDV cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở các tỉnh trung du- miền

núi (68,42% so với 35,29%).

2) Lợn con theo mẹ mắc PED với những triệu chứng và bệnh tích điển hình

của bệnh: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa không tiêu

(38%); ruột non trong (60%) và có cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột (20%).

3) Về đặc điểm di truyền: PEDV lưu hành ở Việt Nam không có nguồn gốc

từ các chủng virus vacxin và có tính đa dạng di truyền với các mức tương đồng

trình tự gen S là 63,7% - 87,9% và gen ORF3 là 93% - 99%. Các chủng virus

mang đột biến thêm- xóa và đột biến điểm ở vùng quyết định kháng nguyên của

gen S được dự đoán không dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa.

4) Có 2 genogroup PEDV lưu hành ở Việt Nam. Trong đó genogroup 2 bao

gồm nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ. Một số chủng là kết quả của quá trình tái tổ

hợp ở gen S giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2.

5) Về đặc điểm dịch tễ học phân tử:

PEDV lưu hành ở Việt Nam có nguồn gốc đa dạng: virus thuộc genogroup

1 và nhánh châu Á của genogroup 2 có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc.

Trong khi đó virus thuộc nhánh Bắc Mỹ có nguồn gốc từ Mỹ. Chủng virus tổ tiên

của PEDV hiện lưu hành được dự đoán tồn tại trước thời điểm xảy ra dịch PED

khoảng 6-9 năm. Sau khi xâm nhập, các chủng PEDV của Việt Nam có khả năng

đã tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp tục lây lan ra các địa

phương khác.

5.2. ĐỀ NGHỊ

1) Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm

dịch tễ học của PED tại 10 tỉnh, thành miền Bắc. Vì vậy, cần tiếp tục mở rộng

phạm vi nghiên cứu để có bức tranh toàn diện hơn về đặc điểm dịch tễ học của

bệnh PED và đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV đang lưu hành ở nước ta.

2) Tiếp tục phân lập, xác định các đặc tính sinh học, phân tích hệ gen của

PEDV, tiến tới sản xuất vacxin phòng bệnh PED bằng chủng thực địa phục vụ

công tác phòng chống dịch bệnh.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Trung Tiến, Nguyễn Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn Bá

Hiên và Lê Văn Phan (2015). Một số đặc điểm sinh học phân tử của các

chủng virus gây ra dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine epidemic diarrhea -

PED) thu thập được ở Việt Nam từ năm 2013 - 2014. Tạp chí Khoa học và

Phát triển, 13 (7): 1089 - 1100.

2. Yong Kwan Kim, Seong-In Lim, Ji-Ae Lim, In-Soo Cho, Eun-Hye Park,

Van Phan Le, Nguyen Ba Hien, Pham Ngoc Thach, Do Hai Quynh, Tran

Quang Vui, Nguyen Trung Tien and Dong-Jun An (2015). A novel strain of

porcine epidemic diarrhea virus in Vietnamese pigs. Archives of Virology,

160 (6): 1573 - 1577.

3. Van Phan Le, Dinh Quyen Le, Duc Duong Than, Nguyen Trung Tien,

Nguyen Ba Hien, SeEun Choe and Dong-Jun An (2016). Genetic diversity of

the spike gene of the porcine epidemic diarrhea virus collected from the

Central and Northern Vietnam during 2013 - 2016. Proceeding of the 19th

FAVA, Ho Chi Minh city, Vietnam: 113 - 117.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Văn Phan, Cao Thị Bích Phượng, Đồng Văn Hiếu, Lê Đình Quyền và Phạm

Ngọc Thạch (2017). Bước đầu xác định Porcine deltacoronavirus (PDCoV) gây tiêu

chảy ở lợn nuôi tại thành phố Hà Nội và tỉnh Thái Bình. Tạp chí Khoa học Nông

nghiệp Việt Nam, 15 (2), 171-177.

2. Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy (2012). Đặc trưng kiểu gien của virus gây bệnh

tiêu chảy cấp (PEDV) trên heo ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ. Tạp chí Khoa

học Kĩ thuật Thú y, 19 (7), pp, 34-41.

3. Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Đình Quát, Trịnh Thị Thanh Huyền, Đỗ Tiến Duy, Trần

Thị Dân, Nguyễn Thị Phước Ninh và Nguyễn Thị Thu Năm (2012). Phát hiện virus

gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) trên heo ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ. Tạp chí

Khoa học Kĩ thuật Thú y, 19 (5), pp, 23-28.

4. Nguyễn Văn Điệp, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa và R. Yamaguchi (2014).

Một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch trên heo ở một số

tỉnh phía Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú y, 21 (2), pp, 43-55.

Tài liệu tiếng Anh

5. Ben Salem A. N., A. Chupin Sergei, P. Bjadovskaya Olga, G. Andreeva Olga, A.

Mahjoub and B. Prokhvatilova Larissa (2010). Multiplex nested RT-PCR for the

detection of porcine enteric viruses. Journal of virological methods, 165 (2), 283-93.

6. Bofkin L. and N. Goldman (2007). Variation in evolutionary processes at different

codon positions. Molecular biology and evolution, 24 (2), 513-521.

7. Boniotti M., B. A. Papetti, A. Lavazza, G. Alborali, E. Sozzi, C. Chiapponi, S.

Faccini, P. Bonilauri, P. Cordioli and D. Marthaler (2016). Porcine epidemic

diarrhea virus and discovery of a recombinant swine enteric coronavirus Italy.

Emerging infectious diseases, 22 (1), pp, 83-87.

8. Bridgen A., M. Duarte, K. Tobler, H. Laude and M. Ackermann (1993). Sequence

determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea

virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E

and porcine transmissible gastroenteritis virus. The Journal of general virology, 74

(Pt 9) (9), pp, 1795-1804.

9. Bridgen A., R. Kocherhans, K. Tobler and A. Carvajal, M. Ackermann (1998).

Further analysis of the genome of porcine epidemic diarrhoea virus. Advances in

experimental medicine biology, 730, 781-786.

10. Callebaut P., P. Debouck and M. Pensaert (1982). Enzyme-linked immunosorbent

assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with

porcine epidemic diarrhea. Veterinary microbiology, 7 (4), pp, 295-306.

11. Carvajal A., H. Argüello, F. J. Martínez-Lobo, S. Costillas, R. Miranda, G. P. J. de

Nova and P. Rubio (2015). Porcine epidemic diarrhoea: new insights into an old

disease. Porcine Health Management, 1 (1), pp, 1-8.

12. Chae C., O. Kim, C. Choi, K. Min, W. S. Cho, and J. H. Kim Tai (2000).

Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis

virus infection in Korean pigs. The Veterinary record, 147 (21), 606-8.

13. Chang S. H., J. L. Bae, T. J. Kang, J. Kim, G. H. Chung, C. W. Lim, H. Laude, M.

S. Yang and Y. S. Jang (2002). Identification of the epitope region capable of

inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus.

Molecules and cells, 14 (2), 295-299.

14. Chasey D. and S. F. Cartwright (1978). Virus-like particles associated with porcine

epidemic diarrhea. Research in Veterinary Science, 25.

15. Chen F., X. Ku, Z. Li, A. M. Memon, S. Ye, Y. Zhu, C. Zhou, L. Yao, X. Meng

and Q. He (2016). Genetic characteristics of porcine epidemic diarrhea virus in

Chinese mainland revealing genetic markers of classical and variant virulent

parental/attenuated strains. Gene, 588 (1), 95-102.

16. Chen J. F., D. B. Sun, C. B. Wang, H. Y. Shi, X. C. Cui, S. W. Liu, H. J. Qiu and L.

Feng (2008). Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane

protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China. Virus genes, 36

(2), pp, 355-364.

17. Chen J., C. Wang, H. Shi, H. Qiu, S. Liu, X. Chen, Z. Zhang and L. Feng (2010a).

Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China. Archives of

virology, 155 (9), pp, 1471-1476.

18. Chen J., C. Wang, H. Shi, H. Qiu, S. Liu, X. Chen, Z. Zhang and L. Feng (2010b).

Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China. Archives of

Virology, 155 (9), pp,1471-6.

19. Chen Q., G. Li, J. Stasko, J. T. Thomas, W. R. Stensland, A. E. Pillatzki, P. C.

Gauger, K. J. Schwartz, D. Madson, K. J. Yoon, G. W. Stevenson, E. R.

Burrough, K. Harmon M., R. G. Main and J. Zhang (2014). Isolation and

characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013

disease outbreak among swine in the United States. Journal of clinical

microbiology, 52 (1), Pp, 234-243.

20. Chen Q., J. T. Thomas, L. G. Gimenez-Lirola, J. M. Hardham, Q. Gao, P. F.

Gerber, T. Opriessnig, Y. Zheng, G. Li, P. C. Gauger, D. M. Madson, D. R

Magstadt and J. Zhang (2006b). Evaluation of serological cross-reactivity and

cross-neutralization between the United States porcine epidemic diarrhea virus

prototype and S-INDEL-variant strains. BMC veterinary research, 12 (1), 70.

21. Chen Q., P. Gauger, M. Stafne, J. Thomas, P. Arruda, E. Burrough, D. Madson, J.

Brodie, D. Magstadt, R. Derscheid, M. Welch and J. Zhang (2015). Pathogenicity

and pathogenesis of a United States porcine deltacoronavirus cell culture isolate in

5-day-old neonatal piglets. Virology, 482, 51-59.

22. Chen X., J. Yang, F. Yu, J. Ge, T. Lin and T. Song (2012). Molecular

characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus

(PEDV) samples from field cases in Fujian China. Virus Genes, 45.

23. Chen X., L. Zeng, J. Yang, F. Yu, J. Ge and Q. Guo (2013). Sequence

heterogeneity of the ORF3 gene of porcine epidemic diarrhea viruses field samples

in Fujian, China 2010–2012. Viruses, 5.

24. Cho Y. Y., S. I. Lim, Y. K. Kim, J. Y. Song, J. B. Lee and D. J. An (2014).

Complete Genome Sequence of K14JB01 a Novel Variant Strain of Porcine

Epidemic Diarrhea Virus in South Korea. Genome announcements, 2 (3).

25. Chung H. C., J. H. Lee, V. G. Nguyen, T. M. L. Huynh, G. E. Lee, H. J. Moon, S. J.

Park, H. K. Kim and B. K. Park (2016). New emergence pattern with variant porcine

epidemic diarrhea viruses South Korea 2012-2015. Virus research, 226, 14-19.

26. Chung H. C., V. G. Nguyen, H. J. Moon, J. H. Lee, S. J. Park, G. E. Lee, H. K.

Kim, Y. S. Noh, C. H. Lee, D. Goede and B. K. Park (2015). Isolation of porcine

epidemic diarrhea virus during outbreaks in South Korea 2013-2014. Emerging

infectionus diseases, (12) 2238-2240.

27. Coussement W., R. Ducatelle, P. Debouck and J. Hoorens (1982). Pathology of

experimental CV777 coronavirus enteritis

in piglets. I. Histological and

histochemical study. Veterinary Pathology, 19 (1), 46-56.

28. Crawford K., K. Lager, L. Miller, T. Opriessnig, P. Gerber and R. Hesse (2015).

Evaluation of porcine epidemic diarrhea virus transmission and the immune

response in growing pigs. Veterinary research, Pp, 46-49.

29. Cruz D. J., C. J. Kim and H. J. Shin (2008). The GPRLQPY motif located at the

carboxy-terminal of the spike protein induces antibodies that neutralize Porcine

epidemic diarrhea virus. Virus research, 132 (1-2), 192-196.

30. Dastjerdi A., J. Carr, R. J. Ellis, F. Steinbach and S. Williamson (2015). Porcine

epidemic diarrhea virus among farmed pigs Ukraine. Emerging infectionus

diseases, 21 (12), 2235-2237.

31. Debouck P. and M. Pensaert (1980). Experimental infection of pigs with a new

porcine enteric coronavirus CV777. American Journal of Veterinary Research, 41.

32. Debouck P., M. Pensaert and W. Coussement (1981). The pathogenesis of an

enteric infection in pigs experimentally induced by the coronavirus-like agent CV

777. Veterinary Microbiology, 6 (2), pp, 157-165.

33. Diep N. V., J. Norimine, M. Sueyoshi, N. T. Lan and R. Yamaguchi (2017). Novel

porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) variants with large deletions in the spike

(S) gene coexist with PEDV strains possessing an intact S gene in domestic pigs in

Japan: a new disease situation. PLoS ONE, 12 (1), e0170126.

34. Diep N. V., M. Sueyoshi, U. Izzati, N. Fuke, A. P. P. Teh, N. T. Lan and R.

Yamaguchi (2017). Appearance of US-like porcine epidemic diarrhoea virus

(PEDV) strains before US outbreaks and genetic heterogeneity of PEDVs collected

in Northern Vietnam during 2012-2015. Transboundary and emerging diseases

[Epub ahead of print].

35. Do Tien Duy, Nguyen Tat Toan, S. Puranaveja and R. Thanawongnuwech (2011).

Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from

southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks. Thai Journal of Veterinary

Medicine, 41 (1), Pp, 55-64.

36. Drummond A. J., M. A. Suchard, D. Xie and A. Rambaut (2012). Bayesian

phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7. Molecular biology and evolution,

29 (8), 1969-1973.

37. Duarte M. and H. Laude (1994). Sequence of the spike protein of the porcine

epidemic diarrhoea virus. The Journal of general virology, 75 (Pt 5) (5), pp, 1195-

1200.

38. Duarte M., K. Tobler, A. Bridgen, D. Rasschaert, M. Ackermann and H. Laude

(1994). Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between

the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF. Virology,

198 (2), Pp, 466-476.

39. Ducatelle R., W. Coussement, P. Debouck and J. Hoorens (1982). Pathology of

experimental CV777 coronavirus enteritis in piglets II Electron microscopic study.

Veterinary Pathology, 19.

40. Gallien, S., A. Moro, G. Lediguerher, V. Catinot, F. Paboeuf, L. Bigault, M. Berri,

P. C. Gauger, N. Pozzi, E. Authie, N. Rose và B. Grasland, 2018: Evidence of

porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) shedding in semen from infected specific

pathogen-free boars. Veterinary research, 49, pp, 7.

41. Gao Y., Q. Kou, X. Ge, L. Zhou, X. Guo and H. Yang (2013). Phylogenetic

analysis of porcine epidemic diarrhea virus field strains prevailing recently in

China. Archives of virology, 158 (3), 711-715.

42. Gerdts V. and A. Zakhartchouk (2017). Vaccines for porcine epidemic diarrhea

virus and other swine coronaviruses. Veterinary microbiology, 206 (Supplement

C), 45-51.

43. Gonzalez J. M., P. P. Gomez, D. Cavanagh, A. E. Gorbalenya and L. A. Enjuanes

(2003). Comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family

Coronaviridae. Archives of virology, 148 (11), pp, 2207-2235.

44. Gou H., J. Deng, J. Wang, J. Pei, W. Liu, M. Zhao and J. Chen (2015). Rapid and

sensitive detection of porcine epidemic diarrhea virus by reverse transcription loop-

mediated isothermal amplification combined with a vertical flow visualization strip.

Molecular and cellular probes, 29 (1), 48-53.

45. Grasland B., L. Bigault, C. Bernard, H. Quenault, O. Toulouse, C. Fablet, N. Rose,

F. Touzain and Y. Blanchard (2014). Complete genome sequence of a porcine

epidemic diarrhea s gene indel strain isolated in france in december. Genome

announcements, 3 (3), e00535-15.

46. Guscetti F., C. Bernasconi, K. Tobler, R. K. Van, A. Pospischil and M. Ackermann

(1998). Immunohistochemical detection of porcine epidemic diarrhea virus

compared to other methods. Clinical and diagnostic laboratory immunology, 5 (3),

pp, 412-414.

47. Hall T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and

analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41,

95-98.

48. Hanke D., M. Jenckel, A. Petrov, M. Ritzmann, J. Stadler, V. Akimkin, S. Blome,

A. Pohlmann, H. Schirrmeier, M. Beer and D. Hoper (2015). Comparison of

porcine epidemic diarrhea viruses from Germany and the United States, 2014.

Emerging infecttious diseases, 21 (3), pp, 493-6.

49. Hofmann M. and R. Wyler (1988). Propagation of the virus of porcine epidemic

diarrhea in cell culture. Journal of clinical microbiology, 26 (11), pp, 2235-9.

50. Hou Y., C. M. Lin, M. Yokoyama, B. L. Yount, D. Marthaler, A. L. Douglas, S.

Ghimire, Y. Qin, R. S. Baric, L. J. Saif and Q. Wang (2017). Deletion of a 197-

amino-acid region in the N-terminal domain of spike protein attenuates porcine

epidemic diarrhea virus in piglets. Journal of virology, 91 (14), e00227-17.

51. Ishikawa K., H. Sekiguchi, T. Ogino and S. Suzuki (1997). Direct and rapid

detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR. Journal of virological

methods, 69 (1-2), 191-5.

52. Islam M. T., T. Kubota, M. Ujike, Y. Yahara and F. Taguchi (2016). Phylogenetic

and antigenic characterization of newly isolated porcine epidemic diarrhea viruses

in Japan. Virus Research, 222 (Supplement C), 113-9.

53. Jarvis M. C., H. C. Lam, Y. Zhang, L. Wang, R. A. Hesse, B. M. Hause, A.

Vlasova, Q. Wang, J. Zhang, M. I. Nelson, M. P. Murtaugh and D. Marthaler

(2016). Genomic and evolutionary inferences between American and global strains

of porcine epidemic diarrhea virus. Preventive veterinary medicine, 123

(Supplement C) 175-84.

54. Jung K. and C. Chae (2005). RT-PCR-based dot blot hybridization for the detection

and differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible

gastroenteritis virus in fecal samples using a non-radioactive digoxigenin cDNA

probe. Journal of virological methods, 123 (2), 141-6.

55. Jung K., H. Hu, B. Eyerly, Z. Lu, J. Chepngeno and L. J. Saif (2015). Pathogenicity

of 2 porcine deltacoronavirus strains in gnotobiotic pigs. Emerging infectious

diseases, 21 (4), 650-4.

56. Katoh K. and D. M. Standley (2013). MAFFT multiple sequence alignment

software version 7: improvements in performance and usability. Molecular biology

and evolution, 30 (4), 772-80.

57. Kim H. K., V. G. Nguyen, I. O. Kim, J. H. Park, S. J. Park, S. M. Rho, J. Y. Han

and B. K. Park (2012). Epidemiologic and phylogenetic characteristics of porcine

reproductive and respiratory syndrome viruses in conventional swine farms of Jeju

Island as a candidate region for PRRSV eradication. Transboundary and Emerging

Diseases 2012, 59 (1), 62-71.

58. Kim O. and C. Chae (2002). Comparison of reverse transcription polymerase chain

reaction immunohistochemistry and in situ hybridization for the detection of

porcine epidemic diarrhea virus in pigs. Canadian Journal of Veterinary Research,

66 (2), 112-116.

59. Kim S. H., I. J. Kim, H. M. Pyo, D. S. Tark, J. Y. Song and B. H. Hyun (2007).

Multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of

transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus. Journal of

virological methods, 146 (1-2), 172-7.

60. Kim S. Y., D. S. Song and B. K. Park (2001). Differential detection of

transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex

RT-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation, 13 (6), 516-20.

61. Kim Y. K., S. I. Lim, J. A. Lim, I. S. Cho, E. H. Park, V. P. Le, N. B. Hien, P. N. Thach,

do H. Quynh, T. Q. Vui, N. T. Tien and D. J. An (2015). A novel strain of porcine

epidemic diarrhea virus in Vietnamese pigs. Archives of virology, 160 (6), 1573-7.

62. Kim Y., V. D. Krishna, M. Torremorell, S. M. Goyal and M. C. Cheeran (2018).

Stability of porcine epidemic diarrhea virus on fomite materials at different

temperatures. Veterinary Science 5 (1), pp. 1-10.

63. Kocherhans R., A. Bridgen, M. Ackermann and K. Tobler (2001). Completion of the

porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence. Virus Genes. 23.

64. Kumar S., G. Stecher and K. Tamura (2016). MEGA7: molecular evolutionary

genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution,

33 (7) 1870-4.

65. Kusanagi K., H. Kuwahara, T. Katoh, T. Nunoya, Y. Ishikawa, T. Samejima and M.

Tajima (1992). Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in

cell cultures and partial characterization of the isolate. The Journal of veterinary

medical science, 54 (2) 313-8.

66. Kweon C. H., B. J. Kwon, S. R. Woo, J. M. Kim, G. H. Woo and D. H. Son (2000).

Immunoprophylactic effect of chicken egg yolk immunoglobulin (IgY) against

porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in piglets. The Journal of veterinary

medical science, 62.

67. Kweon C. H., J. G. Lee, M. G. Han and Y. B. Kang (1997). Rapid diagnosis of

porcine epidemic diarrhea virus infection by polymerase chain reaction. The Journal

of veterinary medical science,59 (3) 231-2.

68. Kweon C., B. Kwon, T. S. Jung, Y. Kee, D. Hur and E. Hwang (1993). Isolation of

porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) in Korea. Korean Journal of Veterinary

Research, 33.

69. Laude H. and J. F. O. Vautherot (1993). Coronaviruses (molecular biology and

virus-host interactions). Advances in experimental medicine and biology.

70. Laude H., J. Gelfi, L. Lavenant and B. Charley (1992). Single amino acid changes

in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus

transmissible gastroenteritis virus. Journal of Virology. 66 (2). pp. 743-9.

71. Le V. P., D. Q. Le, D. D. Than, T. T. Nguyen, B. H. Nguyen, S. E. Choi and D. J.

An (2016). Genetic diversity of the spike gene of the porcine epidemic diarrhea

virus collected from the central and northern Vietnam during 2013-2016. 19 th

Federation of Asian Veterinary Associations Congress 113-117.

72. Le V. P., S. Song, B. H. An, G. N. Park, N. T. Pham, D. Q. Le, V. T. Nguyen, T. T.

H. Vu, K. S. Kim, S. Choe and D. J. An (2017). A novel strain of porcine

deltacoronavirus in Vietnam. Archives of virology, 11 (10) DOI 10.1007/s00705-

017-3594-8.

73. Lee C. (2015). Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging

epizootic swine virus. Virology journal, 12 193.

74. Lee C. (2015). Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging

epizootic swine virus. Virology journal 12 (1). pp. 193.

75. Lee D. H., Y. S. Jeon, C. K Park., S. J. Kim, D. S. Lee and C. Lee (2015).

Immunoprophylactic effect of chicken egg yolk antibody (IgY) against a

recombinant S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein in

piglets. Archives of virology 160.

76. Lee D. K., C. K. Park, S. H. Kim and C. Lee (2010). Heterogeneity in spike protein

genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea. Virus research, 149

(2). pp. 175-82.

77. Lee J. H., H. C. Chung, V. G. Nguyen, H. J. Moon, H. K. Kim, S. J. Park, C. H.

Lee, G. E. Lee and B. K. Park (2016). Detection and phylogenetic analysis of

porcine deltacoronavirus in Korean swine farms 2015. Transboundary and

emerging diseases 63 (3) 248-252.

78. Lee S. and C. Lee (2013). Outbreak-related porcine epidemic diarrhea virus strains

similar to US strains South Korea (2014). Emerging infectious diseases, 20.

79. Lemey P., A. Rambaut, A. J. Drummond and M. A. Suchard (2009). Bayesian

phylogeography finds its roots. PLoS Computational biology 5 (9) e1000520.

80. Li B. X., J. W. Ge and Y. J. Li (2007). Porcine aminopeptidase N is a functional

receptor for the PEDV coronavirus. Virology 365.

81. Li W., H. Li, Y. Liu, Y. Pan, F. Deng, Y. Song, X. Tang and Q. He (2012). New

variants of porcine epidemic diarrhea virus China 2011. Emerging infectious

diseases 18 (8) 1350-3.

82. Lin C. M., L. J. Saif, D. Marthaler and Q. Wang (2016). Evolution antigenicity and

pathogenicity of global porcine epidemic diarrhea virus strains. Virus research 226

(Supplement C) 20-39.

83. Lin C. M., Y. Hou, D. G. Marthaler, X. Gao, X. Liu, L. Zheng, L. J. Saif and Q.

Wang (2017). Attenuation of an original US porcine epidemic diarrhea virus strain

PC22A via serial cell culture passage. Veterinary microbiology 201 (Supplement C.

pp. 62-71.

84. Liu X. and Q. Wang (2016). Reverse

transcription-PCR assays for

the

differentiation of various US porcine epidemic diarrhea virus strains. Journal of

virological methods 234 137-41.

85. Ma Y., Y. Zhang, X. Liang, F. Lou, M. Oglesbee and S. Krakowka (2015). Origin

evolution and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States.

Molecular biology 6.

86. Martelli P., A. Lavazza, A. D. Nigrelli, G. Merialdi, L. G. Alborali and M. B.

Pensaert (2008). Epidemic of diarrhoea caused by porcine epidemic diarrhoea virus

in Italy. The veterinary record 162 (10). pp. 307-10.

87. Marthaler D., L. Bruner, J. Collins and K. Rossow (2014). Third strain of

porcine epidemic diarrhea virus United States. Emerging infectious diseases 20

(12) 2162-3.

88. Narayanan K., C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C. T. Tseng

and S. Makino (2008). Severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp1

suppresses host gene expression including that of type I interferon in infected cells.

Journal of virology. 82 (9). pp. 4471-9.

89. Nguyen V. P. and B. G. Hogue (1997). Protein interactions during coronavirus

assembly. Journal of Virology. 71 (12). pp. 9278-9284.

90. Okda F. A., S. Lawson, A. Singrey, J. Nelson, K. S. Hain, L. R. Joshi, J.

Christopher-Hennings, E. A. Nelson and D. G. Diel (2017). The S2 glycoprotein

subunit of porcine epidemic diarrhea virus contains immunodominant neutralizing

epitopes. Virology 509 (Supplement C) 185-194.

91. Oldham J. (1972). Letter to the editor. Pig Farming 10.

92. Park S. J., D. S. Song and B. K. Park (2013). Molecular epidemiology and

phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field isolates in

Korea. Archives of virology 158 (7) 1533-41.

93. Park S. J., H. J. Moon, J. S. Yang, C. S. Lee, D. S. Song, B. K. Kang and B. K.

Park (2007). Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine

epidemic diarrhea viruses isolated in Korea. Virus Genes. 35 (2). pp. 321-32.

94. Park S. J., H. J. Moon, Y. Luo, H. K. Kim, E. M. Kim and J. S. Yang (2008).

Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-

type porcine epidemic diarrhea viruses. Virus Genes, 36.

95. Park S. J., H. K. Kim, D. S. Song, H. J. Moon and B. K. Park (2011). Molecular

characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus

(PEDV) field isolates in Korea. Archives of virology 156 (4). pp. 577-85.

96. Pijpers A., A. P. Nieuwstadt, C. Terpstra and J. H. Verheijden (1993). Porcine

epidemic diarrhoea virus as a cause of persistent diarrhoea in a herd of breeding and

finishing pigs. The veterinary record, 132.

97. Pospischil A., A. Stuedli and M. Kiupel (2002). Diagnostic notes update on porcine

epidemic diarrhea. Journal Swine Health Prod,10.

98. Pospischil A., R. G. Hess and P. A. Bachmann (1981). Light microscopy and

ultrahistology of intestinal changes in pigs infected with epizootic diarrhoea virus

(EVD): comparison with transmissible gastroenteritis (TGE) virus and porcine

rotavirus infections. Zentralbl Veterinarmed B, 28 (7), 564-77.

99. Puranaveja S., P. Poolperm, P. Lertwatcharasarakul, S. Kesdaengsakonwut, A.

Boonsoongnern, K. Urairong, P. Kitikoon, P. Choojai, R. Kedkovid, K. Teankum

and R. Thanawongnuwech (2009). Chinese-like strain of porcine epidemic

diarrhea virus Thailand. Emerging infectious diseases, 15 (7), pp. 1112-5.

100. Ren X. and P. Li (2011). Development of reverse transcription loop-mediated

isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus.

Virus genes, 42 (2), 229-35.

101. Ruths D. and L. Nakhleh (2005). Recombination and phylogeny: effects and

detection. International Journal of Bioinformatics Research and Application, 1 (2),

202-12.

102. Saif L. J. (1993). Coronavirus immunogens. Veterinary Microbiology, 37 (3-4),

pp. 285-97.

103. Shi W., S. Jia, H. Zhao, J. Yin, X. Wang, M. Yu, S. Ma, Y. Wu, Y. Chen, W. Fan,

Y. Xu and Y. Li (2017). Novel approach for isolation and identification of porcine

epidemic diarrhea virus (PEDV) strain NJ using porcine intestinal epithelial cells.

Viruses, 9 (1), 19.

104. Shibata I., M. Ono and M. Mori (2001). Passive protection against porcine

epidemic diarrhea (PED) virus in piglets by colostrum from immunized cows. The

Journal of Veterinary Medical Science, 63.

105. Shibata I., T. Tsuda, M. Mori, M. Ono, M. Sueyoshi and K. Uruno (2000).

Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and

experimental infection of pigs of different ages. Veterinary microbiology, 72 (3-

4), pp, 173-82.

106. Simon-Loriere E. E. C. Holmes (2011). Why do RNA viruses recombine? Nature

Reviews. Microbiology, 9 (8), 617-626.

107. Song D. and B. Park (2012). Porcine epidemic diarrhoea virus: a

comprehensive review of molecular epidemiology diagnosis and vaccines.

Virus genes, 44.

108. Song D. and Park B. (2012). Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive

review of molecular epidemiology diagnosis and vaccines. Virus genes, 44 (2),

pp. 167-175.

109. Song D. S., B. K. Kang, J. S. Oh, G. W. Ha, J. S. Yang, H. J. Moon, Y. S. Jang

and B. K. Park (2006). Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential

detection of porcine epidemic diarrhea virus transmissible gastroenteritis virus

and porcine group A rotavirus. Journal of veterinary diagnostic investigation, 18

(3), 278-81.

110. Song D. S., J. S. Oh, B. K. Kang, J. S. Yang, H. J. Moon and H. S. Yoo (2007).

Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain.

Research in Veterinary Science, 82.

111. Song D., H. Moon and B. Kang (2015). Porcine epidemic diarrhea: a review of

current epidemiology and available vaccines. Clinical and Experimental Vaccine

Research, 4.

112. Steinbach F., A. Dastjerdi, J. Peake, S. A. La Rocca, F. P. Tobin, J. P. Frossard

and S. Williamson (2016). A retrospective study detects a novel variant of porcine

epidemic diarrhea virus in England in archived material from the year 2000. PeerJ

4 (4), e2564.

113. Stott C. J., G. Temeeyasen, T. Tripipat, P. Kaewprommal, A. Tantituvanont, J.

Piriyapongsa and D. Nilubol (2017). Evolutionary and epidemiological analyses

based on spike genes of porcine epidemic diarrhea virus circulating in Thailand in

2008-2015. Infection, genetics and evolution, 50 (Supplement C), 70-76.

114. Strizhakova O., D. Hanke, I. Titov, S. Blome and A. Malogolovkin (2017).

Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Isolated in

Belgorod Russia in 2008. Genome Announcements, 5 (41) e01026-17.

115. Su Y., Y. Liu, Y. Chen, B. Zhao, P. Ji, G. Xing, D. Jiang, C. Liu, Y. Song, G.

Wang, D. Li, R. Deng and G. Zhang (2016). Detection and phylogenetic analysis

of porcine epidemic diarrhea virus in central China based on the ORF3 gene and

the S1 gene. Virology journal, 13 (1) 192.

116. Sueyoshi M., T. Tsuda, K. Yamazaki, K. Yoshida, M. Nakazawa, K. Sato, T.

Minami, K.,

Iwashita M. Watanabe

and Y. Suzuki

(1995). An

immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhoea. Journal of

comparative pathology, 113 (1) 59-67.

117. Sun D. B., L. Feng, H. Y. Shi, J. F. Chen, S. W. Liu and H. Y. Chen (2007). Spike

protein region (aa 636–789) of porcine epidemic diarrhea virus is essential for

induction of neutralizing antibodies. Acta Virological, 51.

118. Sun M., J. Ma, Y. Wang, M. Wang, W. Song, W. Zhang, C. Lu and H. Yao

(2015). Genomic and epidemiological characteristics provide new insights into the

phylogeographical and spatiotemporal spread of porcine epidemic diarrhea virus

in Asia. Journal of clinical microbiology, 53 (5), 1484-92.

119. Sun R. Q., R. J. Cai, Y. Q. Chen, P. S. Liang, D. K. Chen and C. X. Song (2012).

Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets China. Emerging

infectious diseases, 18 (1). pp. 161-3.

120. Suyama M., D. Torrents and P. Bork (2006). PAL2NAL: robust conversion of

protein sequence alignments into the corresponding codon alignments. Nucleic

acids research, 34 (Web Server issue), W609-12.

121. Temeeyasen G., A. Srijangwad, T. Tripipat, P. Tipsombatboon, J. Piriyapongsa,

W. Phoolcharoen, T. Chuanasa, A. Tantituvanont and D. Nilubol (2014). Genetic

diversity of ORF3 and spike genes of porcine epidemic diarrhea virus in Thailand.

Infection, genetics and evolution, 21, 205-13.

122. Theuns S., N. N. Conceicao, I. Christiaens, M. Zeller, L. M. Desmarets, I. D.

Roukaerts D. D. Acar, E. Heylen, J. Matthijnssens and H. J. Nauwynck (2015).

Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus from a novel

outbreak in belgium january 2015. Genome announcements, 3 (3), e00506-15.

100

123. Tian P. F., Y. L. Jin, G. Xing, L. L. Qv, Y. W. Huang and J. Y. Zhou (2014).

Evidence of recombinant strains of porcine epidemic diarrhea virus, United States,

2013. Emerging Infectious Diseases, 20.

124. Tian Y., Z. Yu, K. Cheng, Y. Liu, J. Huang and Y. Xin (2003). Molecular

characterization and phylogenetic analysis of new variants of the porcine

epidemic diarrhea virus in Gansu China in 2012. Viruses 5: 1991-2004.

125. Utiger A., K. Tobler, A. Bridgen, M. Suter and M. Singh and M. Ackermann

(1995). Identification of Proteins Specified by Porcine Epidemic Diarrhoea Virus.

In Corona- and Related Viruses: Current Concepts in Molecular Biology and

Pathogenesis Talbot P. J., Levy G. A. Eds. Springer US: Boston MA. pp. 287-290.

126. Vlasova A. N., D. Marthaler, Q. Wang, M. R Culhane., K. D. Rossow, A. Rovira,

J. Collins and L. J. Saif (2014). Distinct characteristics and complex evolution of

PEDV strains North America May 2013-February 2014. Emerging infectious

diseases, 20 (10), 1620-8.

127. Vui D. T., T. L. Thanh, N. Tung, A. Srijangwad, T. Tripipat, T. Chuanasa and D.

Nilubol (2015). Complete genome characterization of porcine epidemic diarrhea

virus in Vietnam. Archives of virology, 160 (8), 1931-8.

128. Wang E., D. Guo, C. Li, S. Wei, Z. Wang, Q. Liu, B. Zhang, F. Kong, L. Feng

and D. Sun (2016). Molecular characterization of the ORF3 and S1 genes of

porcine epidemic diarrhea virus non S-INDEL strains in seven regions of China

2015. PLoS ONE, 11 (8), e0160561.

129. Wang F. X., D. Y. Yuan, Y. N. Jin, L. Hu, Z. Y. Sun, Q. He, S. H. Zhao, S. B.

Zhan and Y. J. Wen (2016). Reverse transcription cross-priming amplification-

nucleic acid test strip for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus.

Scientific reports, 6, 24702.

130. Wang J., P. Zhao, L. Guo, Y. Liu, Y. Du, S. Ren, J. Li, Y. Zhang, Y. Fan, B.

Huang, S. Liu and J. Wu (2013). Porcine epidemic diarrhea virus variants with

high pathogenicity China. Emerging infectious diseases, 19 (12), 2048-9.

131. Wang K., W. Lu, J. Chen, S. Xie, H. Shi, H. Hsu, W. Yu, K. Xu, C. Bian, W. B.

Fischer, W. Schwarz, L. Feng and B. Sun (2012). PEDV ORF3 encodes an ion

channel protein and regulates virus production. FEBS letters, 586 (4), 384-91.

101

132. Wang L., B. Byrum and Y. Zhang (2014). New variant of porcine epidemic

diarrhea virus, United States, 2014. Emerging infectious diseases, 20 (5), 917-9.

133. Wongthida P., B. Liwnaree, N. Wanasen, J. Narkpuk and A. Jongkaewwattana

(2017). The role of ORF3 accessory protein in replication of cell-adapted porcine

epidemic diarrhea virus (PEDV). Archives of virology, 162 (9), pp, 2553-2563.

134. Wood E. N. (1997). An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea.

The Veterinary record, 100 (12), pp, 243-4.

135. Yu X., L. Shi, X. Lv, W. Yao, M. Cao, H. Yu, X. Wang and S. Zheng (2015).

Development of a real-time reverse transcription loop-mediated isothermal

amplification method for the rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus.

Virology journal, 12, 76.

136. Zhang J., Y. L. Tsai, P. Y. Lee, Q. Chen, Y. Zhang, C. J. Chiang, Y. H. Shen, F.

C. Li, H. F. Chang, P. C. Gauger, K. M. Harmon and H. T. Wang (2016).

Evaluation of two singleplex reverse transcription-Insulated isothermal PCR tests

and a duplex real-time RT-PCR test for the detection of porcine epidemic diarrhea

virus and porcine deltacoronavirus. Journal of virological methods, 234, 34-42.

137. Zhao J., B. J. Shi, X. G. Huang, M. Y. Peng, X. M. Zhang, D. N. He, R. Pang, B.

Zhou and P. Y. Chen (2013). A multiplex RT-PCR assay for rapid and differential

diagnosis of four porcine diarrhea associated viruses in field samples from pig

farms in East China from 2010 to 2012. Journal of virological methods, 194 (1-

2), 107-12.

138. Zhu Y., G. H. Wang, Y. D. Cui and S. J. Cui (2016). Establishment of a

nanoparticle-assisted RT-PCR assay to distinguish field strains and attenuated

strains of porcine epidemic diarrhea virus. Archives of virology, 161 (9), 2543-7.

102

PHỤ LỤC

1. Xử lý thống kê sinh học tỷ lệ dương tính PEDV

1.1. Tỷ lệ dương tính PEDV giữa các tỉnh

————— 6/23/2018 9:40:28 AM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help. One-way ANOVA: Hà Nội, Hòa Bình, Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Thái Bình, ... Source DF SS MS F P Factor 9 1.222 0.136 0.54 0.841 Error 202 50.415 0.250 Total 211 51.637 S = 0.4996 R-Sq = 2.37% R-Sq(adj) = 0.00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--- Hà Nội 19 0.4737 0.5130 (---------------------) Hòa Bình 9 0.5556 0.5270 (-------------------------------) Hải Dương 14 0.4286 0.5136 (-------------------------) Hải Phòng 10 0.5000 0.5270 (------------------------------) Hưng Yên 26 0.5385 0.5084 (------------------) Thái Bình 73 0.3425 0.4778 (----------) Bắc Giang 10 0.4000 0.5164 (------------------------------) Vĩnh Phúc 11 0.4545 0.5222 (----------------------------) Thái Nguyên 32 0.3750 0.4919 (---------------) Lào Cai 8 0.5000 0.5345 (--------------------------------) ------+---------+---------+---------+--- 0.20 0.40 0.60 0.80 Pooled StDev = 0.4996 1.2. Tỷ lệ dương tính PEDV giữa mẫu phân và mẫu ruột

One-way ANOVA: Phân, Ruột Source DF SS MS F P Factor 1 2.042 2.042 8.65 0.004 Error 210 49.595 0.236 Total 211 51.637 S = 0.4860 R-Sq = 3.95% R-Sq(adj) = 3.50% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- Phân 129 0.3411 0.4759 (---------------) Ruột 83 0.5422 0.5012 (-------------------) ----+---------+---------+---------+----- 0.30 0.40 0.50 0.60 Pooled StDev = 0.4860

103

1.3. Tỷ lệ trang trại dương tính PEDV theo vùng

One-way ANOVA: Đồng bằng, Trung du Source DF SS MS F P Factor 1 1.289 1.289 5.65 0.021 Error 53 12.093 0.228 Total 54 13.382 S = 0.4777 R-Sq = 9.63% R-Sq(adj) = 7.93% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- Đồng bằng 38 0.6842 0.4711 (--------------) Trung du 17 0.3529 0.4926 (---------------------) ----+---------+---------+---------+----- 0.20 0.40 0.60 0.80 Pooled StDev = 0.4777

104

2. Danh mục trình tự gen S sử dụng trong nghiên cứu

(mã số GenBank, quốc gia, năm phân lập)

105

106

107

108

109

3. Danh mục trình tự gen ORF3 sử dụng trong nghiên cứu

(mã số GenBank, tên chủng)

110

111

112

113