Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam

ViÖN HµN L¢M khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam ViÖn c«ng nghÖ sinh häc L£ THÞ VIÖT Hµ NGHIÊN CỨU C I M HỆ GEN TY TH V N V M H I O OME CỦ MỘT LOÀI ÁN LÁ UỘT THUỘC H HETEROPHYIDAE KÝ INH GÂY ỆNH T ÊN NGƯỜI V ỘNG VẬT TẠI VIỆT N M LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2021

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU C I M HỆ GEN TY TH VÀ N VỊ M H RI OSOME CỦ MỘT S LOÀI SÁN LÁ RUỘT THUỘC HỌ HETEROPHYIDAE KÝ SINH GÂY ỆNH TRÊN NGƯỜI VÀ ỘNG VẬT TẠI VIỆT N M

Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ sinh học

2. PGS.TS. ồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2021

M ƠN

t t s u s hất đ GS.TS. Lê Thanh Hoà, nguyên

rưở Ph M ễ dị h, V ệ C hệ s h họ , V ệ H m Khoa họ v

C hệ V ệt Nam, th o th s t m hu t đ t t h tr t p hư d ,

dành h u th a tru đ t th , t o mọ đ u ệ thu ợ , trao đ , đị h

hư , đ v v p đ t tro qu tr h h u, họ t p v ho th h

t t s u s đ PGS.TS Đồ Vă Qu , Phó V ệ

V ệ trưở V ệ C hệ s h họ , V ệ H m Khoa họ v C hệ V ệt

Nam, th đồ hư d hoa họ đ t t h hỉ ảo t tro th a họ t p

v h u

ảm h th h hất t t p thể h u Phòng

M ễ dị h họ - V ệ C hệ s h họ - V ệ H m Khoa họ v C hệ

V ệt Nam đ h ệt t h p đ t ho th h u ủa m h

đượ ảm :

- Ba h đ o V ệ C hệ s h họ , V ệ H m Khoa họ v C

hệ V ệt Nam đ t o đ u ệ ho t đượ họ t p v h u

- Ba G m đố Họ v ệ Y–Dượ họ tru V ệt Nam, PGS S Ph m

Quố B h, Chủ tị h H đồ rư v , đồ h ệp ủa B m ,

Phòng, Khoa ủa Họ v ệ đ t o đ u ệ p đ t tro suốt qu tr h họ t p

- C m s hỗ trợ h phí ủa Quỹ Ph t tr ể Khoa họ v hệ Quố

a (NAFOS ED) tro đ t m số 1 - 1 v 108.02-2017.09 do GS S

ha h H a hủ h ệm.

- S Đỗ ru Dũ , rưở Khoa K s h tr , V ệ Sốt r t-Ký sinh

trùng-C tr ru ư v đồ h ệp trong Khoa đ p đ t h

th h ệ v ệ thu m u, thí h ệm h u h h th họ cho nghiên

Cuố t t t s u s đ ư th , a đ h đ

u u hu hí h, đ v , p đ ũ hư h a s h h hă v

tru h ệt hu t p t ho th h qu tr h họ t p v h u ủa m h

ê hị V ệt Hà

iii

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các

cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép

của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn ....................................................................................................... i

Lời cam kết ....................................................................................................... iii

Mục lục ............................................................................................................. iv

Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................ ix

Danh mục các bảng .......................................................................................... xii

Danh mục các hình ........................................................................................... xiv

MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3

1. 1. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ h Heterophyidae thuộc

lớp Sán lá Trematoda ................................................................... 3

Phân loại sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae ................................... 3 1.1.1.

Đặc điểm sinh học và phân b c a sán lá ruột nhỏ họ 1.1.2.

Heterophyidae ................................................................................. 6

1.1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae trên thế

gi i v ở Việt Nam .......................................................................... 11

T th , ribosome t th v c i m h gen t th ................... 17 1.2.

Gi i thiệu ty thể c a động vật ......................................................... 17 1.2.1.

ibosome c a ty thể .................................................................. 21 1.2.2.

Cấu trúc v sắp xếp gen ở hệ gen ty thể .......................................... 21 1.2.3.

Đặc điểm gen v v ng kh ng m h a ở hệ gen ty thể .................... 23 1.2.4.

1.2.5. Nghiên cứu ứng dụng gen v hệ gen ty thể ..................................... 29

Giới thi u Ribosome c a t o v n v m h a ri osome .... 31 1.3.

1.3.1. Gi i thiệu ribosome c a tế b o ....................................................... 31

1.3.2. Đơn v m h a ribosome ............................................................ 33

1.3.3. Nghiên cứu ứng dụng ch th phân t c a đơn v m h a

ribosome ................................................................................. 37

1.4. ngh a v s c n thi t nghiên cứu c i m mtDNA v n

40 v m h a ri osome c a sán lá ruột nhỏ Haplorchis c a t i

CHƯƠNG 2. Đ I TƯ NG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………… 43

Đ i t ng v t li u a i m nghiên cứu ……………………… 43 2.1.

2.1.1. Đ i t ng v vật liệu nghiên cứu ………………………………… 43

2.1.2. M u nghiên cứu c a các lo i thuộc họ Heterophyidae …………... 43

2.1.3. Đ a điểm v thời gian nghiên cứu ................................................... 45

Ph ng pháp ti p c n v tr nghiên cứu …………………… 45 2.2.

Ph ng pháp nghiên cứu h gen t th ………………………... 47 2.3.

2.3.1. Ph ơng pháp xác đ nh cấu trúc v sắp xếp hệ gen ty thể c a sán lá

ruột nhỏ Haplorchis taichui ……………………………………… 47

2.3.2. Ph ơng pháp phân t ch đặc điểm gen N ribosome (MRG) ty

thể ………………………………………………………………… 48

2.3.3. Ph ơng pháp phân t ch đặc điểm gen N vận chuyển t N ty

thể ………………………………………………………………… 48

Ph ơng pháp phân t ch v ng kh ng m h a ở hệ gen ty thể …….. 2.3.4. 49

Phân t ch ph ơng thức s dụng nucleotide v t nh toán giá tr độ 2.3.5.

lệch skew skewness trong hệ gen ty thể ………..………………. 49

2.3.6. Phân tích đặc điểm gen m h a protein v s thiên v s dụng

bộ m ……………………………………………………………... 50

2.3.7. Ph ơng pháp t nh toán khoảng cách di truy n c a các lo i sán lá

ruột nhỏ d a trên cộng h p 3 gen cob+nad1+cox1 ……………… 50

2.3.8. Ph ơng pháp t nh toán khoảng cách di truy n c a các lo i sán lá

ruột nhỏ d a trên cộng h p 12 PCG c a ty thể …………………... 51

2.3.9. Ph ơng pháp phân t ch phả hệ d a trên ch th cộng h p ba gen

PCG c a ty thể (cob+nad1+cox1) ………………………………... 51

2.3.10. Ph ơng pháp phân t ch phả hệ d a trên ch th cộng h p to n bộ

12 PCG c a ty thể ………………………………………………... 52

Ph ng pháp nghiên cứu n v mã hóa ribosome (rTU) ........ 2.4. 53

2.4.1. Ph ơng pháp xác đ nh cấu trúc v sắp xếp gen v ng giao gen c a

đơn v m h a ribosome ………………………………………….. 53

2.4.2. Ph ơng pháp xác đ nh độ d i v đặc điểm gen r N v v ng

giao gen ở đơn v m h a ribosome ................................................ 53

2.4.3. Ph ơng pháp phân t ch ph ơng thức s dụng nucleotide và tính

toán giá tr độ lệch skew trong đơn v m h a ribosome …….. 54

2.4.4. Ph ơng pháp phân tích t ơng đ ng nucleotide c a các gen r N

v ph n m h a ribosome c a sán lá ruột nhỏ họ eterophyidae ... 54

2.4.5. Ph ơng pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen r N

ribosome (5.8S, 18S, 28S rRNA) ………………………………… 55

2.4.6. Ph ơng pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai v ng giao gen

ITS (ITS-1, ITS-2) ……………………………………………….. 56

2.4.7. Ph ơng pháp phân tích phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a

trên chu i gen 28S rRNA to n ph n …………………………… 56

2.4.8. Ph ơng pháp phân tích phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a

trên cộng h p gen (18S+28S rRNA) to n ph n 57

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………. 58

3.1 K t qu nghiên cứu h gen t th loài Haplorchis taichui m u

Vi t Nam …………………............................................................ 58

3.1.1. Cấu trúc v sắp xếp hệ gen ty thể c a sán lá ruột nhỏ Haplorchis

taichui ............................................................................................. 58

3.1.2. Phân t ch đặc điểm gen N ribosome c a ty thể ………………. 62

3.1.3. Đặc điểm gen N vận chuyển t N c a ty thể ……………… 63

3.1.4. Đặc điểm v ng kh ng m h a ở mtDNA c a sán lá ruột nhỏ

Haplorchis taichui ……………………………………………….. 65

3.1.5. Ph ơng thức s dụng nucleotide v giá tr độ lệch skew trong

hệ gen ty thể ……………………………………………………… 65

3.1.6. Phân t ch đặc điểm gen m h a protein v thiên v s dụng bộ

m (codon usage) ………………………………………………… 66

vii

3.1.7 . Khoảng cách di truy n giữa Haplorchis taichui v các lo i sán lá

khác ở họ eterophyidae v Opisthorchiidae d a trên cộng h p

amino acid c a ba gen (cob+nad1+cox1) ………………………... 68

3.1.8. Khoảng cách di truy n giữa Haplorchis taichui v các lo i sán lá

khác ở họ eterophyidae v Opisthorchiidae d a trên cộng h p

amino acid c a 12 PCG …………………………………………... 70

3.1.9. Phân t ch phả hệ sán lá ruột nhỏ d a trên chu i amino acid cộng

h p c a ba gen m h a protein (cob+nad1+cox1) ……………….. 72

3.1.10. Phân t ch phả hệ sán lá ruột nhỏ d a trên chu i amino acid cộng

h p c a to n bộ 12 gen m h a protein ………………………….. 74

3.2. K t qu nghiên cứu n v m h a ri osome loài Haplorchis

taichui v lo i H. pumilio m u Vi t Nam ……………………… 77

3.2.1. Cấu trúc v sắp xếp gen c a đơn v mã hóa ribosome c a

Haplorchis taichui ………………………………… 77

3.2.2. Độ d i gen r N v v ng giao gen ở đơn v m h a ribosome

c a các lo i Haplorchis taichui v Haplorchis pumilio .................. 80

3.2.3. Đặc điểm cấu trúc bậc hai gen r N . 1 2 r N …... 81

3.2.4. 3.2.5. Đặc điểm cấu trúc v ng giao gen T T -1, ITS-2) …………… ết quả phân t ch ph ơng thức s dụng nucleotide trong đơn v 86

m h a ribosome …………………………………………………. 88

3.2.6. ết quả phân t ch t ơng đ ng nucleotide c a các gen r N v

ph n m h a ribosome c a sán lá ruột nhỏ họ eterophyidae …... 90

3.2.7. Phân t ch phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a trên chu i

nucleotide gen 2 ribosome to n ph n …………………………. 91

3.2.8. Phân t ch phả hệ c a H. taichui v H. pumilio d a trên cộng h p

to n ph n hai gen rRNA (18S+28S rRNA) ……………………… 94

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ …………………………………….. 97

4.1. V nghiên cứu h gen t th sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui 99

viii

4.1.1. V thu nhận dữ liệu gen học hệ gen ty thể ……………………….. 99

4.1.2. V đặc điểm hệ gen ty thể c a sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui 100

4.1.3. V một s ứng dụng mtDN trong nghiên cứu di truy n v phả

4.1.4. hệ …………………………………………………………………. V đ ng g p cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gen ty thể ………………. 104 107

4.2. V nghiên cứu n v m h a ri osome H.taichui v H.

pumilio …………………………………………………………… 109

4.2.1. V thu nhận dữ liệu gen học đơn v m h a ribosome …………… 109

4.2.2. V đặc điểm đơn v m h a ribosome c a sán lá ruột nhỏ

Haplorchis taichui v H. pumilio ………………………………… 110

4.2.3. V một s ứng dụng rTU trong nghiên cứu di truy n v phả hệ … 113

4.2.4. V đ ng g p cung cấp cơ sở dữ liệu đơn v m h a ribosome …... 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 119

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG B LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ..... 121

TÓM TẮT BẰNG TIẾNG ANH ................................................................... 122

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 130

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung i i ngh

Adenosine triphosphate Phân tử mang năng lượng ATP

Base pair Cặp bazơ bp

Consensus sequence cs Chu i chung l a t căn ch nh nhi u chu i cộng sự

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

ĐVLSN Zoonosis/zoonoses Động vật lâ sang người

và những người khác et al.

External Transcribed Spacer Vùng ngoại gen ETS

hai pin /stem Secondary structure C u t c nhánh

Morphology nh thái h c HTH

Vùng bản l IGS

ITIS

Non-transcribed intergenic spacer Integrated Taxonomic Information System Internal Transcribed Spacer th ng th ng tin phân loại t ch hợp Vùng giao gen ITS

Kb (= Kbp) Kilo base pair Đơn vị đo (= 1.000 cặp bazơ)

KCDT Genetic distance hoảng cách di t u n

Parasite sinh t ùng KST

Long non-coding region Vùng không mã hóa dài LNR

Secondary structure C u t c loop

Phản ứng chu i t ùng hợp dài LPCR Long- Polymerase Chain Reaction

Long repeat unit C u t c lặp dài LRU

mimum free energy Năng lượng k t n i t i thi u MFE

Minute intestinal fluke Sán lá uột nh MIF

Mitoribosomal gene Gen RNA ibosome t th MRG

mRNA messenger RNA RNA thông tin

mtDNA mitochondrial genome h gen t th

mt-LSU large mitoribosomal unit ti u đơn vị lớn ibosome t th

mtRP/MRP Mitoribosomal protein protein ribosome ty th

mt-SSU small mitoribosomal unit ti u đơn vị nh ibosome t th

NCBI

National Center for Biotechnology Information Non-coding region Trung tâm Thông tin CNSH u c gia ( oa Vùng không mã hóa NCR/NR

Nghiên cứu sinh NCS

nDNA Nuclear genome gen nhân

OXPHOS Oxidative phosphorylation

Protein coding gene uá t nh hoá-khử phospho l h a gen mã hóa protein PCG

Polymerase Chain Reaction Phản ứng chu i t ùng hợp PCR

Molecular biology sinh h c phân tử SHPT

sán lá uột nh SLRN

Short non-coding region vùng kh ng mã h a ngắn SNR

Ribosomal DNA DNA ribosome rDNA

Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNA

ribosomal RNA Gen RNA ribosome rRNA

ribosomal transcription unit Đơn vị mã h a ribosome rTU

rTU* Ph n mã h a TU

SRU Coding ribosomal transcription unit Short repeat unit C u t c lặp ngắn

tRNA/trn transfer RNA Gen RNA vận chu n

TRU/TR/RU Tandem repeat unit Đơn vị c u t c lặp li n k

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1

ồ

……………………………………….. 8

Các gen trong hệ e ể ậ ồ 3 e ã ó Bảng 1.2

protein, 2 gen RNA e e ã ó RNA ậ

ể …………………………………………………………... 23

S RN Bảng 2.1

V ệ N

S T NA TU

ó ệ …..……………….. 44

V e ặ ể gen trong mtDNA Bảng 3.1

H. taichui ( QT3 V ệ N

15.120 bp; GenBank: MG972809) và H. taichui (LA, Lào,

15.131 bp; GenBank: KF214770) ……………………………… 60

T ệ e e A T Bảng 3.2

ệ e e e e ã ó e

e e ể R NA

S RN e e e ………………………… 66

T ệ ã e Bảng 3.3

NA H. taichui V ệ N H. taichui

M. yokogawai Q e e e………….. 67

T e ệ Bảng 3.4

3 e cob+nad1+cox1

ữ Htai-QT3-VN và Sfal-QN2-VN V ệ

N e e e

Opisthorchiidae…………………………………………………. 69

xiii

T e ệ Bảng 3.5

e ã ó e

ữ Htai-QT3-VN

e e e Opisthorchiidae ………………………….. 71

V e e ã ó e Bảng 3.6

V ệ N Haplorchis taichui (Htai-

QT3-VN, . H. pumilio (Hpum-HPU8-VN, 7.416 bp) 80

T ệ e e A T Bảng 3.7

ệ e e e e S RNA S RNA

e S S RNA ã ó e

e e e Haplorchis taichui,

Haplorchis pumilio, Cryptocotyle lingua Euryhelmis

costaricensis ……………………………………………………. 89

Bảng 3.8 ồ e e e S RNA

S RNA e S S RNA ã ó

ã ó e TU

Heterophyidae, Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio,

Cryptocotyle lingua Euryhelmis costaricensis ……………… 90

xiv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1

5 (ITIS).……………………………………..……………………

Hình 1.2 Haplorchis Stellantchasmus ậ ừ

b V ( ẫ ì ẽ

9 ả).………………………………………………………………

10 Hình 1.3 C ( ) SLRN …...

Hình 1.4 Phân b ầ Haplorchis spp. (H. taichui, H. pumilio

và H. yokogawai) ự ê ự ú

14 ả ……………………………………………...

Hình 1.5 M b ị ( D A)

18 ơ ị mã hóa ribosome (rTU) b ………………..

19 Hình 1.6 Mô hình m ì ……………….

20 Hình 1.7 M quá trình b …….

Hình 1.8 M ì ú mtDNA

22 ……………………………………………...............

Hình 1.9 C ú bậ A b

25 ( A A) ……………………………

Hình 1.10 C ú bậ ì A ậ

26 …………………………………………………...

Hình 1.11 ì ê A

b ú ơ ị b b

32 ậ b ơ ………………………………………….

Hình 1.12 M b ễ ó ứ ơ ị ã ó

34 b ( TU) ú ơ ị TU ……………...

Hình 1.13 C ú bậ A b

b A b ……………….. 36

Hình 2.1 ơ b ê ứ b ự

) ê ứ ( D A) ) ê ứ

ơ ị ã ó b ( TU)………………………………… 46

Hình 3.1 ì ả ả C ừ D A

H. taichui ………………………… 58

Hình 3.2 ơ H. taichui …………… 61

Hình 3.3 M ì ú bậ ã ó b (M )

gen ty H. taichui …………………... 63

Hình 3.4 M ì ú ự t A y

Haplorchis taichui ứ ự bả ữ

các amino acid mà chúng ậ .………………………… 64

Hình 3.5 C ả ị q ề ự ê

ỗ ễ ừ cob+nad1+cox1 ữ

SLRN V ( ì )

5 O

Echinostomatidae, Fascio (

).......................................................................................... 73

Hình 3.6 C ả ị q ả ự ê

ỗ ễ ừ C 75

Hình 3.7 ì ả ả C C TU ừ

H. taichui H. pumilio ……………………… 78

xvi

Hình 3.8 T ậ ự ầ ã ó ơ ị ã ó

ribosome Haplorchis

taichui (V ) H. pumilio (V ) Cryptocotyle

lingua ( ) Euryhelmis costaricensis ( ậ Bả ) ………... 79

Hình 3.9 M ì ú bậ 5. A b

……………………………………………. 82

Hình 3.10 M ì ú bậ ỗ A

Haplorchis taichui Haplorchis pumilio ………….. 83

Hình 3.11 M ì ú bậ ỗ A

Haplorchis taichui Haplorchis pumilio ……………………. 85

Hình 3.12 M ì ú bậ ỗ

T - Haplorchis taichui Haplorchis pumilio ………… 86

Hình 3.13 M ì ú bậ ỗ

T - Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio,

Cryptocotyle lingua Euryhelmis costaricensis ………... 87

Hình 3.14 C ả ị q ả ự ê

ỗ A ầ (~3.8 – 3.9 kb)

H. taichui H. pumilio V . 92

Hình 3.15 C ả ị q ả ự ê

ỗ A ầ (5.846–

5.870 bp) H. taichui H. pumilio V

……………………………………………. 95

M U

Bệnh ký sinh trùng ng v t l y s ng ng i KST VLSN do sán lá gây

nên ng là mối qu n t m nhi u quố gi trên thế giới. Chỉ tính riêng sán lá truy n

qu thứ ăn nh á, tôm u , ũng ã ó khoảng 50 triệu ng i bị nhiễm hàng năm

và khoảng 750 triệu nguy ơ bị nhiễm. thứ d n trí, môi tr ng, nhu ầu sống,

t p tụ ăn uống thiếu vệ sinh ã tạo i u kiện thu n lợi ho KST VLSN trong thứ

ăn (food-borne), trong cá, tôm, cua (fish-borne , trong n ớ w ter-borne) và trong

thự v t thủy sinh pl nt-borne truy n l y dễ dàng s ng ng i á n ớ ng

phát triển, trong ó ó Việt N m. Sán lá ru t nh SLRN) h Heterophyid e lây

s ng ng i qu á do ăn á h nấu hín ph n bố kh p thế giới, với khoảng 7

triệu ng i bị nhiễm, hầu hết á n ớ Ch u Á, gồm Hàn Quố , Trung Quố , ài

Lo n, Việt N m, Lào, Thái L n, M l ysi , Indonesi , Philippin và Ấn .

M dù á loài SLRN ơ bản ã ợ xếp vào á hi riêng biệt t ơng ứng

trên ơ s ph n loại h nh thái h , nh ng việ h n oán, ph n biệt và th m ịnh

loài i h i ó nh ng k thu t và ông nghệ hính xá hơn. Xá ịnh loài, ph n loại

và á mối qu n hệ phả hệ, tiến hó h Heterophyid e và ph n b Opisthor hi t

ần ó á hỉ thị ph n t áng tin y, trong ó hỉ thị t hệ gen ty thể

(mitogenome, mtDNA là m t trong nh ng ông ụ tốt nhất. Nguồn ung ấp hỉ

thị ph n t là tr nh tự nucleotide và mino id suy diễn nếu ó ủ mtDNA và hệ

gen nhân (nuclear genome, nDNA). T hệ gen nh n, ơn vị mã hó ribosome

(ribosomal transcription unit, rTU) ợ kh i thá s dụng ph biến nhất.

Chỉ thị ph n t ợ s dụng ó thể là toàn b tr nh tự nu leotide và mino

id, nếu ó ủ m t vùng DN , ủ m t số gen h y toàn b số gen mã hó protein

(protein coding genes, PCG), á gen RN ty thể S rrnS và S rrnL) ủ

mtDNA ho và á gen S rRN S rRN , á vùng gi o gen ITS- và ITS-

ủ rTU. Nhu ầu ứng dụng SHPT làm sáng t i u kiện và vị trí ph n loại, khoảng

á h di truy n gi á hủng loài, ph n biệt mối qu n hệ v loài hi h liên h và

ph n Lớp Liên h Ph n b là rất lớn, biệt với á loài ― n n ‖, loài ‗

n ‖, loài ― m‖, loài ―lai‖ và á dạng phát triển ủ sinh v t ùng hiện diện

trong ùng v t hủ. Sự ông nh n hính xá m i loài hi h là ơ s ho á

h ơng tr nh ph ng hống và kiểm soát ối với á bệnh KST do cá truy n l y trên

thế giới.

Cho ến n y, toàn phần h y phần tr nh tự mtDN mới thu nh n ợ

80 ến 0 hủng ủ 0–70 loài) sán lá trem tode và ợ ăng ký trong ơ s

d liệu GOBASE (http://gobase.bcm.umontreal.ca/) hay GenBank

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ . M t khá , số l ợng rTU ủ á loài n

ít hơn rất nhi u, ả mtDN và rTU h b o phủ hết tất ả á hi và á h trong

Lớp Sán lá, kể ả h Heterophyid e. Do v y, giải tr nh, ph n tí h và kh i thá d

liệu mtDNA và rTU ủ sán lá nói hung và ủ SLRN nói riêng ng ợ y

mạnh. Khi tài này tiến hành, hỉ mới ó tr nh tự mtDNA và m t rTU gần

hoàn hỉnh ợ thu nh n và ph n tí h h Heterophyid e. Do v y, d liệu

mtDN và rTU ủ Haplorchis taichui và m t số SLRN khá ủ h

Heterophyidae do h ng tôi ung ấp rất ó giá trị ho á nghiên ứu và ứng dụng

tiếp theo.

Xuất phát t nhu ầu và yêu ầu thự tế diện nói trên, nhằm b sung d liệu

mtDN và rTU ủ m t số loài SLRN l u hành tại Việt N m ho ứng dụng, chúng

tôi tiến hành tài: “Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa

ribosome của một số loài sán lá ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh

trên ngƣời và động vật tại Việt Nam‖ với mụ tiêu hung là:

―T toàn bộ ệ n ty t ể à n m bo om một loài

án lá ột n ỏ t op y tạ V ệt N m, ph n t ểm á n à

ệ n n m p n ên ứ tễ p n tử à ứn n t on ẩn oán

p n loạ ‖, trong ó 2 mụ tiêu hính ủ tài là:

1. Nghiên cứ t n t ệ n ty t ể loà án lá ột n ỏ plo

taichui, ph n t ểm n à y n p ệ

2 N ên ứ t n t n m bo om một loà án lá ột n ỏ

(Haplorchis taichui, Haplorchis p m l o p n t ểm n à y n p ệ

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae thuộc l p Sán lá

Trematoda

1.1.1. Phân loại sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae

Ngành Sán d t (Platyhelminthes) là ngành b o gồm hàng hụ h t p trung

á loại sán d t ký sinh g y bệnh hủ yếu ng ru t và ng ph i t ng v t

s ng ng i truy n qu thứ ăn n ớ uống, trong ó m t số h th ng g p tại Việt

Nam là Heterophyidae, Opisthorchiidae, Echinostomatidae, Fasciolidae, Taeniidae

và P r gonimid e Dung et al., 2007; Lan-Anh et al., 2009; De et al., 2012; Doanh

et al., 2013; Chai, Jung, 2017; Chai, 2019). Sán lá ru t nh h Heterophyid e lây

nhiễm s ng ng i thông qua á ăn á h nấu hín và ó ít nhất loài thu 13

chi genus ph n bố kh p thế giới, ó tầm qu n tr ng nhất ịnh v dị h tễ trong

ng ồng. Khoảng hơn 7 triệu ng i bị nhiễm bệnh SLRN heterophyidi sis do

á loài này g y r . Theo Chai, Jung (2017), ó là á loài thu hi Haplorchis (H.

taichui, H. pumilio, H. yokogawai, và H. vanissimus), chi Metagonimus (M.

yokogawai, M. takahashii, M. miyatai, M. minutus và M. katsuradai), chi

Stellantchasmus (S. falcatus), chi Centrocestus (C. formosanus, C. armatus, C.

cuspidatus và C. kurokawai), chi Heterophyes (H. heterophyes, H. nocens, H.

dispar và H. aequalis), chi Pygidiopsis (P. summa và P. genata), chi

Heterophyopsis (H. continua), Stictodora (S. fuscata và S. lari), chi Procerovum (P.

varium và P. calderoni), chi Acanthotrema (A. felis), chi Apophallus (A. donicus),

chi Ascocotyle (A. longa) và chi Cryptocotyle (C. lingua).

Heterophyid e ùng với h Opisthor hiid e thu Liên h Opisthorchioidea

Looss, 1899 ph n b Opisthor hi t Digene b o gồm m t nhóm á loài ó sự

ph n bố khá r ng trên toàn thế giới và khoảng 00 v ng i g y nhiễm ủ á loài

trong hai h này ã ợ mô tả (Thaenkham et al., 2012; Chai, Jung, 2017; 2020;

Chai, 2019; Santos, Borges, 2020). Hầu hết nh ng ng i nhiễm sống á n ớ

Ch u Á, b o gồm Hàn Quố , Trung Quố , ài Lo n, Việt N m, Lào, Thái L n,

Malaysia, Indonesia, Philippin và Ấn . Khái niệm SLRN (minute intestinal

flukes, MIF ợ r s dụng nhằm ph n biệt m t b ph n á loài ó kí h

th ớ nh b trong ại gi nh sán lá ru t intestin l flukes phần lớn truy n qu

thứ ăn và l y nhiễm qu hệ tiêu hó ủ ng v t, him và ng i Chai, Jung,

2020). Sán lá ru t b o gồm SLRN, ó ị bàn ph n bố rất r ng, l u hành với tỷ lệ

nhiễm o, dạng v m t ph n loại và ó hơn 0 loài trên toàn thế giới Chai et

al., 2009; Toledo, Esteban, 2016; Chai, Jung, 2017; Hotez, 2019).

T p hợp SLRN là á loài sán lá ủ ba h Heterophyidae, E hinostom tid e

và E hino h smid e ó kí h th ớ nh 0,5–2 mm × 0,2–10 mm , ký sinh và g y

bệnh trong ng ru t và truy n qu thứ ăn, trong ó ó SLRN thu h

Heterophyidae, ã ợ ph n biệt với SLRN thu á h E hinostom tid e

Echinochasmidae, u truy n qu á n ớ ng t và n ớ lợ Trung Dũng, 0 5;

Chai, Jung, 2017). SLRN h Heterophyidae Leiper, 1909 có kí h th ớ rất b

(khoảng 1–2 mm), ó khả năng l y nhiễm ng v t ó x ơng sống, b o gồm ả

ng v t ó v , ng i và chim (Chai, 2019). Trong gần 50 năm qu , việ ph n loại

giun sán nói hung và sán lá nói riêng, trong ó ó SLRN ũng dần i vào hệ thống.

M dù kí h th ớ nh và phần ph n loại dự theo h nh thái h (HTH) s dụng

á ph ơng pháp truy n thống và soi nhu m, SLRN ũng ã ợ xếp vào á ấp

ph n loại gồm á loài thành viên ợ ông nh n ủ tiêu hí v loài re ognized,

v lid spe ies . M dù v y, nhi u loài biến thể mới, ũng nh nh ng loài ũ h

ủ á i u kiện tí h hợp ho ông nh n loài hi h á ấp ph n loại và nhu ầu

phát hiện, h n oán, ph n tí h phả hệ, tiến hó ph n t ng i h i nh ng nghiên

ứu và th m ịnh hính xá bằng á h kết hợp HTH và SHPT (Betson et al., 2020).

Theo tóm t t ph n loại ó tại Trung t m Thông tin Công nghệ sinh h Quố

gi ủ M (theo NCBI: Taxonomy: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/), hệ

thống ph n loại ủ h Heterophyid e và á hi ủ h này ợ s p xếp ph n ấp

theo D ng ph n loại (Lineage), nh s u: cellular organisms; Eukaryota;

Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Protostomia; Spiralia;

Lophotrochozoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea; Opisthorchiida;

Opisthorchiata; Heterophyidae; (Centrocestus; Haplorchis; Metagonimus;

Procerovum; Stellantchasmus).

Trong Hệ thống thông tin ph n loại tí h hợp ITIS, Integr ted T xonomi

Information System)/ https://www.itis.gov/), ấp b ph n loại, vị trí á loài và á

hi trong h Heterophyid e ũng ã ợ s p xếp khá hoàn hỉnh với á h khá

H nh 1.1. Ph n ấp s p xếp ph n loại ủ h Heterophyid e và á hi trong h này theo Hệ thống thông tin ph n loại tí h hợp ITIS . Nguồn: https://www.itis.gov/).

trong ngành Sán d t (H nh . ).

Cụ thể, ph n ấp ph n loại ủ h Heterophyid e và á loài nh s u:

Ph n Giới: (Bilateria)

Hạ Giới Infr kingdom): Protostomia

Trên Ngành Superphylum): Platyzoa

Ngành (Phylum): Sán d t, Platyhelminthes Minot, 1876

Gi i (Kingdom): ng v t nim li

D ới Ngành Subphylum): Neodermata

L p (Class): Sán lá , Trematoda, Rudolphi, 1808)

D ới Lớp (Subclass): Digenea, Carus, 1863

Bộ (Order): Opisthorchiida

Ph n B (Suborder): Opisthorchiata

Liên H Superf mily): Opisthorchioidea

Họ (Family): Heterophyidae Leiper, 1909

Chi (Genus): Haplorchis

Lo i (Species): Haplorchis taichui

Lo i (Species): Haplorchis pumilio

Chi (Genus): Stellantchasmus

Lo i (Species): Stellantchasmus falcatus

Phân b Opisthorchiata gồm á h Acanthostomatidae, Cryptogonimidae,

Heterophyidae, N itrem tid e, Opisthor hiid e và P hytrem tid e, trong ó h i

h Heterophyid e và Opisthor hiid e ợ hứng minh ó qu n hệ ph n loại gần

nh u, tạo nên Liên h Opisthor hioide thu Ph n b Opisthor hi t (Thaenkham

et al., 2012; Le et al., 2020a,b; Chai, Jung, 2019). M dù ợ oi là SLRN, nh ng

á loài trong h E hinostom tid e lại thu nhánh khá ủ hệ thống ph n loại,

h ng thu B E hinostomid , Ph n b E hinostom t và gần với h F s iolid e

trong Liên h E hinostom toide Tkach et al., 2016; Toledo, Esteban, 2016; Le et

al., 2020b).

Cho ến n y, ít nhất 3 hi ợ biết ến trong h Heterophyidae Leiper

1909 (Pearson, 2008), trong số ó, 3 hi ph biến trong ng ồng b o gồm

Metagonimus, Heterophyes, Haplorchis, Pygidiopsis, Heterophyopsis,

Stellantchasmus, Centrocestus, Stictodora, Procerovum, Acanthotrema,

Apophallus, Ascocotyle và Cryptocotyle (Chai, 2019; Chai, Jung, 2020) (H nh .1).

1.1.2. Đặc điểm sinh học và phân c sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae

1.1.3 1 n t á ấ tạo kỳ p át t ển án lá ột n ỏ

Heterophyidae

n t á ấ tạo án lá ột n ỏ t op y

H Heterophyidae gồm á loài SLRN ký sinh và g y bệnh trên ng i truy n

lây qu á gồm á n ớ ng t và n ớ lợ , ó loài hủ yếu ợ ghi nh n trong

ó 5 loài ph biến và loài ít ph biến hơn Bảng .1) (Chai, 2019; Chai, Jung,

2020). Hiện n y, loài ã ợ ông nh n là loài hợp lệ (valid species) trong chi

Haplorchis, b o gồm H. pumilio Looss, 1899, H. taichui Nishigori, 1924, H.

yokogawai Katsuta, 1932, H. vanissimus Africa, 1938, H. parataichui Pearson,

1964, H. sprenti Pearson, 1964, H. wellsi Pearson, 1964, H. parapumilio Pearson,

Ow-Yang, 1982 và H. paravanissimus Pearson, Ow-Yang, 1982. Trong số ó, H.

taichui, H. pumilio, H. yokogawai và H. vanissimus là nh ng loài l y nhiễm s ng

ng i (Chai, Jung, 2017) (Bảng . ).

Trong nghiên ứu này, h ng tôi xin giới thiệu hạn hế m t số loài SLRN

ó liên qu n trự tiếp ến á nghiên ứu SHPT ủ tài, ó là á loài thu hi

Haplorchis, b o gồm H, taichui và H. pumilio và m t loài thu hi

Stellantchasmus là S. falcatus. M t số ối t ợng SLRN khá mà tài h n ể so

sánh và ph n tí h gen hệ gen và á hỉ thị SHPT ũng s ợ p ến trong

á huyên mụ t ơng ứng.

Sán lá ột n ỏ plo t (H nh . )

Haplorchis taichui, Nishigori, 1924; Chen, 1936 ợ mô tả lầ ầu tiên vào

năm , là loài ó h nh dạng bầu dụ với l ng và bụng d t á m t, số l ợng g i

mó u – g i s p xếp h nh nải huối và m t mảng á g i r n rất nh

(Pearson, Ow-Yang, 1982). Giá miệng h nh tr n, tiếp ến ó yết hầu ph nh r và

ru t ph n làm nhánh k o dài ến vị trí tinh hoàn H nh . ) (De, Le, 2011), kí h

th ớ khá nh u m i loài (H. pumilio, H. parapumilio, H. vanissimus và H.

paravanissimus), lớn nhất là H. wellsi và b nhất là H. yokogawai và H. sprenti

(Chai, Jung, 2017).

Sán lá ột n ỏ plo p m l o (H nh . B)

Haplorchis pumilio Looss, 1896 ợ Looss mô tả lần ầu tiên năm 1899

i C p, loài này ó iểm HTH ph n biệt với á loài Haplorchis khác là kích

th ớ , h nh dạng, số l ợng g i mó u trên giá bụng Pearson, Ow-Yang, 1982).

Sán tr ng thành ó dạng h nh quả lê, ó 3 – 0 g i h nh h I ho , ó m t số

g i nh dài 2,5–5, μm (Pearson, Ow-Yang, 1982; De, Le, 2011) (H nh 1.2B , là

iểm ph n biệt h nh thái khá r gi á loài Haplorchis: 12– H. taichui,

32– 0 H. pumilio, 15–21 H. parataichui, ũng nh số l ợng kí h th ớ và h nh

dạng thùy gi H. paravanissimus, H. wellsi, H. yokogawai và H. sprenti (Pearson,

Ow-Yang, 1982). Trứng ủ H. taichui và H. pumilio gần giống nh u, h nh ô v n,

v dày nhẵn, ó n p nhô lên giống nh ó v i, ó thể ó mấu nh phí d ới ho

không, kí h th ớ 5–28 x 12–15 µm ( Trung Dũng, 0 5).

Bảng 1.1. D nh sá h loài sán lá ru t nh g y nhiễm ng i t á truy n s ng 5 loài ph biến và loài ít ph biến , nguồn nhiễm và ph n bố ị lý ủ h ng theo Chai, Jung, 2017; 2020) STT

Ph n bố địa l

Lo i

Centrocestus formosanus

Ngu n g y nhi m Cá n ớ ng t

Haplorchis pumilio

Cá n ớ ng t

Haplorchis taichui

Cá n ớ ng t

Haplorchis yokogawai

Cá n ớ ng t

Heterophyes heterophyes

Cá n ớ lợ

6 7

Heterophyes nocens Heterophyopsis continua

Cá n ớ lợ Cá n ớ lợ

Metagonimus miyatai 8 9 Metagonimus takahashii 10 Metagonimus yokogawai

Cá n ớ ng t Cá n ớ ng t Cá n ớ ng t

Pygidiopsis genata

Cá n ớ ng t

Pygidiopsis summa Stellantchasmus falcatus

12 13

Cá n ớ lợ Cá n ớ lợ ng t

14 15 16 17 18 19 20 21 22

Stictodora fuscata Stictodora lari Acanthotrema felis Apophallus donicus Ascocotyle longa Centrocestus armatus Centrocestus cuspidatus Centrocestus kurokawai Cryptocotyle lingua

Br zil, Trung Quố , Colombi , Cost Ri , Cro ti , i C p, Ấn , Nh t Bản, Lào, Mexi o, Philippin, ài Lo n, Thái L n, Tunisi , Th Nh K , Ho K , Việt N m Austr li , C mbodi , Trung Quố , i C p, Ấn , Ir q, Isr el, Keny , Lào, M l ysi , Mexi o, My nm r, Philippin, Sri L nk , ài Lo n, Thái L n, Ho K Tex s , Venezuel , Việt N m B ngl desh, Trung Quố , i C p, Ấn , Ir q, Isr el, Kuw it, Lào, M l ysi , My nm r, Philippin, Sri L nk , ài Lo n, Thái L n, Ho K H w ii , Việt N m ustr li , C mbodi , Trung Quố , i C p, Ấn , Indonesi , Kuw it, Lào, M l ysi , My nm r, Philippin, Sri L nk , ài Lo n, Thái L n, Ho K H w ii , Việt N m i C p, Gree e, Ấn , Ir n, It ly, Nh t Bản, Kuw it, Sri L nk , S udi r bi , T y B n Nh , Sud n, Thái L n, Tunisi , Th Nh K , Tiểu VQ R p thống nhất, Yemen Trung Quố , Nh t Bản, Hàn Quố Trung Quố , Nh t Bản, Hàn Quố , S udi r bi , Thái L n, Tiểu VQ R p thống nhất, Việt N m Nh t Bản, Hàn Quố Nh t Bản, Hàn Quố Trung Quố , Ch u u, Ấn , Nh t Bản, Hàn Quố , ài Lo n, Nga i C p, Ir n, Isr el, Kuw it, Rum ni, Philippin, Tunisi , Ukraine Nh t Bản, Hàn Quố , Việt N m ustr li , Trung Quố , Ấn , Isr el, Palestine, Nh t Bản, Hàn Quố , Lào, Philippin, ài Lo n, Thái L n, Ho K H w ii , C mbodi , Việt N m Nh t Bản, Hàn Quố , Kuw it ustr li , Nh t Bản, Hàn Quố , Ng , Việt Nam Hàn Quố Ho K C n d , Ch u u, Ukr ine, Ho K Hàn Quố , Nh t Bản Trung Quố , i C p, Kuw it, ài Lo n, Tunisi Nh t Bản Denm rk, Engl nd, Greenl nd, I el nd, Nh t Bản, B M , N Uy, Nga, Ukraine

23 24 25

Haplorchis vanissimus Heterophyes dispar Heterophyes aequalis

Cá n ớ lợ Cá n ớ lợ Cá n ớ lợ Cá n ớ ng t Cá n ớ lợ Cá n ớ ng t Cá n ớ ng t Cá n ớ ng t Cá n ớ ng t và lợ Cá n ớ ng t Australia, Philippin i C p, Trung ông Cá n ớ lợ i C p, Trung ông Cá n ớ lợ

26 Metagonimus katsuradai 27 Metagonimus minutus Procerovum calderoni 28 Procerovum varium 29

Cá n ớ ng t Cá n ớ lợ Cá n ớ ng t Cá n ớ lợ

Nh t Bản, Ng ài Lo n Trung Quố , i C p, Philippin ustr li , C mbodi , Trung Quố , i C p, Ấn , Nh t Bản, Hàn Quố , Lào, Philippin, Việt N m

Ghi ch Số -15 : 5 loài g y nhiễm ph biến trên ông bố ã ghi nh n Số -29): 14 loài g y nhiễm ít ph biến d ới 5 ông bố ã ghi nh n .

H nh 1.2. Sán lá ru t nh hi Haplorchis và Stellantchasmus thu th p t bệnh nh n tại Việt N m mẫu nhu m và h nh v mô tả . . Haplorchis taichui tr ng thành B. Haplorchis pumilio tr ng thành; C. Stellantchasmus falcatus tr ng thành; D. Haplorchis yokogawai tr ng thành. Ghi h : OS = oral sucker (Giá miệng); P = pharynx (yết hầu); I = intestine (ru t); VS = ventral sucker (Giá bụng); SV = seminal vesicle (Túi sinh tinh); SR = seminal receptacle (T i hứ tinh); O = ovary (Buồng trứng); T = testis (Tinh hoàn); H = hooklet (Gai móc câu); E = eggs (Trứng); VG = vitelline gland (Tuyến sinh tinh). [Nguồn: De, Le 0 Trung Dũng 0 5 .

Sán lá ột n ỏ St ll nt m l t (Hình 1.2C)

SLRN Stellantchasmus falcatus Onji et Nishio, ợ mô tả lần ầu tiên

Nh t Bản, tạo m t hi mới (Diorchitrema , s u ó ợ oi là ồng d nh với

Stellantchasmus. Ở ài Lo n, Stellantchasmus formosanus và Stellantchamus

amplicaecalis ợ báo áo là loài mới tuy nhiên, ả h i loài ợ oi là ồng

ngh với S. falcatus. Sán tr ng thành ó dạng h nh quả lê nh (pyriform), ầu

phí trên thu h p lại Hình 1.2C . Phần ầu ó giá miệng or l su ker , phần tr ớ

hầu ng n, yết hầu ph rynx ó kí h th ớ trung b nh (28,8 x 27,8 µm , thự quản

ng n, ru t hi nhánh gi ơ thể. Hai tinh hoàn (testis) lớn ối diện nh u, kích

th ớ 55–95 x 35– 7,5 µm. T i tinh hi phần, buồng trứng nh bên phải.

Tuyến noãn hoàng lớn nằm phí l ng trải dài t phần tr ớ ủ buồng trứng tới

phần d ới. M t nghiên ứu SLRN Việt N m tỉnh N m ịnh ho biết, kí h th ớ

trứng ủ H. taichui là , –28,1 x 12,8–16,6 µm ủ H. pumilio 25,5–31,9 x

12,8–17,9 µm, ủ S. falcatus là 20–24 x 10–13,5 µm Trung Dũng, 0 5 .

triển v ng i ủ sán

hu phát triển v n đ i c sán lá ruột nhỏ họ t rophyi

Hình 1.3. Chu k phát lá ru t nh h Heterophyid e Nguồn: https://www.cdc.gov/dpdx/heterophyiasis/index.html). Ch thí h: 1. Trứng bên trong ó phôi phát triển ến miracidium ợ thải theo phân r ngoài môi tr ng. 2. là v t hủ trung gi n thứ nhất nuốt vào, miracidia t trứng ợ giải phóng ra x m nh p ru t ủ ố . Mir idi s phát triển trải qu m t số gi i oạn trong ố (2a: sporocysts, 2b: rediae; 2c: cercariae). 3. Nhi u ấu trùng uôi er ri e ợ giải phóng r t ố 4. Cer ri e tiếp tụ x m nh p qua da vào á n ớ ng t ho á n ớ lợ phù hợp v t hủ trung gi n thứ h i và h nh thành n ng ấu trùng (metacercariae) trong á mô ủ á. 5. V t hủ hính ng i nhiễm bệnh khi ăn á không nấu hín ó met er ri e g y nhiễm. 6. S u khi vào ng tiêu hó , metacercariae thoát nang ru t non và phát triển thành sán tr ng thành và trứng. 7. Sán tr ng thành ký sinh trong ru t. 8. Chó, m o, m t số loài him ó thể nhiễm do ăn á nhiễm và là v t hủ tàng tr , SLRN phát triển trứng theo ph n r ngoài tiếp tụ hu k b n ầu. Haplorchis spp. là á loài SLRN hoàn thành v ng i phải trải qu nhi u

loài v t hủ v t hủ hính, v t hủ trung gi n . Sán tr ng thành ký sinh ru t,

trứng và trứng theo ph n r ngoài, rơi vào môi tr ng n ớ , m t số loài ố loài

thí h hợp ăn và miracidia phát triển trải qu m t số gi i oạn trong ố sporocyst,

rediae) phát triển và giải phóng ấ t ùn ô (cercariae) (Skov et al., 2009 . Ấu

trùng uôi x m nh p qua da vào á n ớ ng t và á n ớ lợ, rụng uôi hình thành

n ng ấu trùng met er ri e trong á mô (trong thịt ho m ng ủ á. Ng i

ho ng v t ăn phải á ó nang ấu trùng h ợ nấu hín, ấu trùng này thoát

nang ến ru t phát triển thành sán tr ng thành và ký sinh tại y, trứng và trứng

theo ph n r ngoài tiếp tụ v ng i. M t số ng v t ho ng dã và ng v t nuôi

hó, m o ũng ó thể nhiễm do ăn á ó metacercariae và tr thành v t hủ tàng

tr . SLRN phát triển trứng theo ph n r ngoài tiếp tụ hu k b n ầu (H nh .3).

Do ó ảnh h ng v dị h tễ h á n ớ v số l ợng ng i nhiễm ngày

àng tăng, ph n bố r ng, truy n l y hủ yếu qu á n ớ ng t, là nguồn protein hủ

yếu á n ớ ng phát triển, trong ó ó Việt N m, nên SLRN H. taichui và H.

pumilio ợ h tr ng nghiên ứu trong nh ng năm gần y (Chai, Jung, 2019).

i u kiện sống và t p tụ ăn á sống bán sống ăn g i tái l u , m t số n ớ h u

Á, nh Hàn Quố , Trung Quố , Việt N m, Thái L n, Lào, C mbodi ... ã tạo i u

kiện ho sự l y nhiễm và gi tăng tỷ lệ nhiễm ủ SLRN (De, Le, 2011; Nguyen TH

et al., 2021 . Tại Việt N m, m t số nghiên ứu v á loài SLRN t p trung vào t m

hiểu ph n bố và ph n vùng dị h tễ bệnh (De, Le, 2011; De et al., 0 Ng V n

Thanh, 2016) tuy nhiên, ũng ã có m t số d liệu SHPT t mtDNA và rTU mới

thu nh n và ng ợ s dụng kết hợp trong nghiên ứu (De et al., 2012;

Trung Dũng, 0 5 Le et al., 2017; 2020a).

1.1.3. Tình hình n hiên cứu sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae trên thế

iới và ở Việt N m

1 1 3 1 T n n n ên ứ án lá ột n ỏ t op y t ên t ế

ớ

Nghiên ứ plo t t ên t ế ớ

Haplorchis taichui ó sự ph n bố xuyên suốt ông Á, ông N m Á s ng T y

Á và B Phi, b o gồm Thái L n, Lào, C mpu hi , Việt N m, N m Trung Quố ,

ài Lo n, Philippin, H w ii, i C p, P lestine, B ngl desh, Ấn và M l ysi

(Chai et al., 2009; Chai, 2019) (Bảng . H nh . ). Khu vự b Thái L n, các

tỉnh Chi ng R i, Chi ng M i, M e Hong Son và L mphun, ợ phát hiện là vùng

h u SLRN (Radomyos et al., 1998; Chai, 2019), tỉnh Khon K en rất ph biến

trong ng ồng á làng bản (Wijit et al., 2013).

Ở Lào, H. taichui ợ phát hiện năm , s u ó, 17 tỉnh và thành phố

Viêng Chăn ó ả sán lá g n nh O. viverrini và á loài SLRN khá (Rim et al.,

2003). Sự ồng ho nhiễm gi H. taichui và á loài SLRN khá là ph biến

tỉnh Saravane và thành phố Viêng Chăn. Tỷ lệ nhiễm SLRN khá o Savannakhet,

Kham Mu n và Phongsali. Tại Ch mp s k và Lu ng Pr b ng, phần lớn do SLRN

H. taichui, H. yokogawai và H. pumilio (Chai et al., 2013).

Tại Trung Quố , H. taichui ng i ghi nh n lần ầu tiên tỉnh Quảng T y

năm 00 Li et al., 2010), tỷ lệ l u hành ,0–70, % x t nghiệm ph n và PCR xá

ịnh là H. taichui (Jeon et al., 2012 . Ở ài Lo n, nơi H. taichui ợ phát hiện ầu

tiên năm , hiện n y ó rất ít nghiên ứu. Ở Philippin, hủ yếu ợ liệt kê là H.

taichui ví dụ mi n n m Mindanao (Belizario et al., 2004 . Ở i C p và Cô-o t,

rất ít báo áo v nhiễm Haplorchis ng i tuy nhiên, sự hiện diện ủ H. taichui

ợ ghi nh n t ng v t El-Azazy et al., 2015).

N ên ứ plo p m l o t ên t ế ớ

Haplorchis pumilio ph n bố Việt N m, Thái L n, Lào, C mpu hi , N m

Trung Quố , ài Lo n, Philippin, i C p, P lestine, Ir q, Ấn , Sri L nk ,

Bangladesh và Malaysia (Pearson, Ow-Yang, 1982; Chai et al., 2009, 2020) (Bảng

. H nh . ).

Ở Thái L n, phí B Thái L n ợ oi là vùng h u ủ loài H. pumilio

(Radomyos et al., 1998 . Ở Lào, H. pumilio lần ầu tiên ợ ghi nh n ng i

tỉnh S r v ne, Viêng Chăn, Champasak, Luang Prabang và Xiêng Khoảng (Chai et

al., 2013). Ở C mpu hi , h ợ phát hiện trên ng i, tuy nhiên, năm 0 , á

tỉnh Purs t, gần Hồ Tonles p bị nhiễm met er ri e ủ H. pumilio (Chai et al.,

2014 . Ở N m Trung Quố , H. pumilio g y nhiễm ng i ghi nh n Quảng ông

năm (Li et al., 2010). Ở Philippin, l y nhiễm ng i h ợ ghi lại. Ở i

C p, nhiễm H. pumilio trên ng i ầu tiên ợ ghi nh n b i Khalifa et al. (1977).

N ên ứ St ll nt m l t t ên t ế ớ

Stellantchasmus falcatus là loài SLRN ph n bố ustr li , Trung Quố , Ấn

, Isr el, Palestine, Nh t Bản, Hàn Quố , Lào, Philippin, ài Lo n, Thái L n, Ho

K H w ii , Campuchia, Việt N m. Nhiễm S. falcatus ng i lần ầu tiên ợ

ghi nh n là phát hiện trứng trong ph n ng i Nh t Bản. Ng i bị nhiễm S.

falcatus d ới tên loài là D. pseudocirrata) do thu ợ sán tr ng thành t bệnh

nhân Philippin, s u ó, H w ii, Ho K , Nh t Bản, Thái L n, Hàn Quố và Việt

Nam (Dung et al., 2007; Chai et al., 2009).

1.1.3.2. P n b l án lá ột n ỏ t op y dae

Trong nh ng năm gần y số l ợng ng i nhiễm ngày àng tăng ối với á

loài SLRN Haplorchis spp., Stellantchasmus spp., Procerovum spp., Centrocestus

spp., biệt á n ớ h u Á Chai et al., 2019 . Do sự ph n bố r ng và truy n

l y hủ yếu qu á n ớ ng t, nguồn thự ph m tiêu thụ hàng ngày á n ớ ng

phát triển, nên SLRN thu á chi nói trên, biệt là Haplorchis spp. ng là ối

t ợng áng h ý á n ớ h u Á, kể ả Việt N m ( Trung Dũng, 0 5 Ng

Văn Th nh, 0 ). Chi Haplorchis gây nhiễm trên ng i t p trung vào 5 loài là H.

taichui, H. pumilio, H. yokogawai, H. pleurolophocerca và H. vanissimus, trong ó

ph biến nhất là H. pumilio Looss, , ài Lo n, Trung Quố , Philippin, Ai

C p, Thái L n, ustr li , Việt N m Skov et al., 2009) và H. taichui Nishigori,

ợ phát hiện trên ng i Philippin, Thái L n, Lào, ài Loan, Bangladesh,

Việt N m Dung et al., 2007; Van et al., 2009; De, Le, 2011). Haplorchis

yokogawai Katsuta, 1932 ký sinh trên ng i Philippin, Indonesia, Thái Lan,

Trung Quố , ài Lo n Việt N m ũng ó nói ến, nh ng h ợ khẳng ịnh

h t h (H nh 1.4).

Haplorchis taichui ũng ợ mô tả hi tiết Hàn Quố , s dụng kính hiển

vi iện t . i u tr tại Hàn Quố năm 00 ho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá g n nh

Clonorchis sinensis và SLRN (Heterophyid e ã tăng lên so với á năm tr ớ . Tại

Lào, m t ợt i u tr t nh h nh nhiễm sán lá g n nh và SLRN tại tỉnh S v nn khet

ho thấy 7, % ng i nhiễm á loại, nhiễm phối hợp O. viverrini và loại SLRN

khá . T ng số sán tr ng thành ợ thu lại, số là á loài H. taichui, H.

pumilio, H. yokogawai, Prosthodendrium molenkampi, Phaneropsolus bonnei và

Echinostoma spp. (Chai et al., 2010).

H nh 1.4. Phân bố toàn ầu ủ Haplorchis spp. (H. taichui, H. pumilio và H. yokogawai dự trên sự hiện diện v ng i ủ h ng ợ mô tả Nguồn: Chai, 2019). Ch ó số liệu t ng thể toàn quố v SLRN tại Việt N m, nh ng m t số

nghiên ứu i u tr và xá ịnh HTH gần y Dung et al., 2007; Thien et al., 2007;

Thu et al., 2007; Nguyen TH et al., 2007; Lan-Anh et al., 2010; Tran et al., 00

và b ớ ầu th m ịnh bằng SHPT ho thấy thành phần loài, ng nhiễm, tá

ng và qu n hệ KST-v t hủ ủ SLRN Việt N m ũng phản ánh t nh trạng dị h

tễ giống nh á n ớ li n k V n et al., 2009; Phan et al., 2010a,b; 2011; De,

Le, 2011; De et al., 003 0 Trung Dũng, 0 5 Ng Văn Th nh, 0 .

Nh ng nghiên ứu HTH và ứng dụng hỉ thị DN trí h xuất t mtDNA ũng

nh t rTU ủ á loài trong h Heterophyid e ã góp phần rất lớn trong i u tr

xá ịnh loài g y nhiễm và ph n ố ị lý trên thế giới (Dzikowski et al., 2004;

Wongsawad, Wongsawad, 2012; Choudhary et al., 2015) ũng nh dị h tễ h ph n

t và di truy n quần thể Việt N m và thế giới (Thaenkham et al., 2010; 2011;

2017; Chontananarth et al., 2014; 2018) H nh . .

1.1.3.3 T n n n ên ứ SLRN t op y ở V ệt N m

Trong nh ng năm gần y m t số nghiên ứu v SLRN trên v t hủ trung

gian và ng i, b ớ ầu ã ợ tiến hành tại Việt N m (De et al., 2003; 2012;

Dung et al., 2007; Thien et al., 2007; Thu et al., 2007; Nguyen TH et al., 2007) và

ã t m thấy nhi u loài SLRN thu h Heterophyid e và E hinostom tid e ký sinh

hủ yếu trên ng v t Anh et al., 2009a,b; Lan-Anh et al., 0 0 De, Le, 0

Trung Dũng, 2015; Le et al., 2017). SLRN ã ợ xá ịnh tại 0 tỉnh thành

Việt N m, trong ó ó tỉnh phí B , tỉnh mi n Trung và tỉnh phí N m (

Trung Dũng, 0 5). Sự phát hiện và ghi nh n SLRN ó sự hênh lệ h lớn gi á

vùng, mi n nh v y, thự r là do việ t hứ i u tr n h phủ kh p á vùng

ị lý, á tỉnh thành và t ng kết số liệu n h hợp lý, do á tỉnh mi n B

việ i u tr SLRN ợ thự hiện th ng xuyên hơn so với á tỉnh mi n Trung và

phí N m De, Le, 0 Trung Dũng, 0 5 Ng Văn Th nh, 0 ). M dù

v y, nh ng số liệu thu th p ợ và sự xá minh v loài g y nhiễm qu i u tr

HTH và SHPT ã gi p ho ông tá ph ng hống hiệu quả và thiết thự hơn

Trung Dũng, 0 5 Ng Văn Th nh, 0 ).

Haplorchis taichui ợ phát hiện N m ịnh vào năm 5 và m t loài

SLRN khác là Procerovum cheni ã ợ phát hiện ru t gà và vịt tại Ph Xuyên

Hà N i . Năm 00 , tại Việt N m ã ó thông báo m t số loài SLRN g y bệnh trên

ng i b o gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, S. falcatus, Procerovum spp.

và Echinostoma spp. (Nguyễn Văn et al., 2006). Các loài SLRN này ợ t m

thấy á tỉnh Quảng Ninh, Hà T y, N m ịnh, Yên Bái, Ph Th , Th nh Hó ,

L m ồng và Th Thiên Huế với tỷ lệ nhiễm 0, % ến , % dự trên kết quả x t

nghiệm SHPT, biệt H. pumilio ợ t m thấy hầu hết tại á ị ph ơng nói

trên (Nguyễn Văn et al., 2006). Tỷ lệ nhiễm SLRN á h gi nh tại N m

ịnh ho thấy rất o , % 3 5 , gồm H. taichui, H. pumilio hiếm u thế

loài) và H. yokogawai (Dung et al., 2007; 2013); s u ó, tại m t số xã khác ũng

tỉnh N m ịnh, ,7% 05 thành viên h gi nh ó kết quả d ơng tính ối

với trứng SLRN (De, Le, 2011).

Nghiên ứu v SLRN và sán lá g n nh trên á ã ợ tiến hành tại Việt

N m và á loại metacercariae ủ H. pumilio. H. taichui, H. yokowagai, C.

formosanus ã ợ xá ịnh và ph n loại. Ở Nghệ n, 44,6% á n ớ ng t tự do

thu ợ và 3, % á trong hệ thống nuôi trồng thủy sản bị nhiễm các loại

metacercariae ủ sán lá (Chi et al., 2008). Cá tại Hà N i có ến 5% và tại Nam

ịnh ó ến 4,6% mang metacercariae ủ á loài H. pumilio, H. taichui tại hồ

Thanh Trì (Hà N i) và hồ Vị Xuyên (N m ịnh) (Nguyễn Văn et al., 2006; De

et al., 2012). Tại mi n N m, m t khảo sát á Tr ho thấy tỷ lệ nhiễm

metacercariae hung là , %, trong ó H. pumilio là 0,7%. Với nguồn á tự nhiên,

tỷ lệ nhiễm metacercariae là 30, % trong ó SLRN H. pumilio là 2,8%; cá quả á

huối á h nuôi trồng thủy sản t p trung không ó, trong khi á quả tự nhiên ó

tỷ lệ nhiễm H. pumilio là 2,6% (Thu et al., 2007). Trong á h nuôi thủy sản V C

v n o huồng tại khu vự sông Mê-Kông, metacercariae thu ợ t nhi u loài,

trong ó H. pumilio hiếm ,0%, H. taichui là 4,3% và S. falcatus là 4,7% (Thien

et al., 2007 . ng v t nuôi ó tới , % nhiễm loài SLRN m o, 35% trong số

0 hó x t nghiệm nhiễm loài SLRN và trong lợn ó , % nhiễm 5 loài

SLRN, gi ầm nhiễm với tỷ lệ o, gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, C.

formosanus, E. cinetorchis, Echinochasmus japonicus, Ech. perfoliatus và Ech.

japonicus (Anh et al., 2009a,b; Lan-Anh et al., 2010).

M t ông tr nh nghiên ứu hu áo và hệ thống ủ Trung Dũng 0 5

tại tỉnh phí B , gồm Hà N i, Ph Th , Hà Gi ng, Quảng Ninh, H B nh, N m

ịnh, Ninh B nh, Th nh Hó , Quảng Trị ho thấy H. taichui, H. pumilio, S. falcatus

xá ịnh ký sinh trên ng i ã ợ ghi nh n ( Trung Dũng, 2015). M t nghiên

ứu khá tại huyện Ng Sơn, Th nh Hó ũng ho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá truy n

qu á nói hung và SLRN nói riêng là rất o, trong ó iển h nh là SLRN H.

taichui và H. pumilio ã ợ mô tả n k Ng Văn Th nh, 0 ).

Cho ến n y, hầu hết á mẫu SLRN ủ á loài trong h Heterophyid e ã

ợ th m ịnh bằng SHPT s dụng hỉ thị rTU (ITS-2 và 18S rRNA, 28S rRNA

và hỉ thị gen ty thể cox1, nad1, cob và m t số hỉ thị khá ), so sánh thành phần

hu i gen gi á loài, tính toán khoảng á h di truy n, phả hệ, nguồn gố các loài

H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, S. falcatus ủ Việt N m (De et al., 2003;

Nguyễn Văn et al., 00 Kim Văn Vạn et al., 2007) và Thái Lan, Lào và Hàn

Quố (Sayasone et al., 2009; De, Le, 2011; Nguyễn Thị Khuê et al., 2014; 0 5

Trung Dũng et al., 2014a,b; 2015). Hệ gen ty thể và rTU ủ H. taichui, H. pumilio

và S. falcatus ( ối t ợng nghiên ứu ủ tài này ã ợ giải tr nh tự m t phần

ho toàn b trong ó ó á hủng ph n l p tại Việt N m và thế giới Lào Lee et

al., 2013; Le et al., 2017 . Toàn b mtDNA và rTU ủ loài H. taichui mẫu Việt

N m ã ợ thu nh n, ph n tí h tr t tự s p xếp gen, iểm gen, vùng gi o gen,

tính toán khoảng á h di truy n, ph n tí h phả hệ và di truy n quần thể.

1.2. Ty thể ribosome ty thể v đặc điểm hệ gen ty thể

1.2.1. Giới thiệu ty thể c độn vật

1 2 1 1 S l ề ty t ể, n n ấ tạo à ứ n n ty t ể

Ty thể (mitochondrion, mitochondria) là b ph n qu n tr ng ủ tế bào, tồn

tại thể ơn b i, không tái t hợp, di truy n d ng m , ó hệ gen và ribosome riêng

hoạt ng v l p v t ơng tá với tế bào hủ. Do ó kí h th ớ nh , lại hứ

á gen sản xuất protein enzyme tối ần thiết ho hoạt ng sống ủ tế bào, nên ty

thể ợ oi là ối t ợng lý t ng ể khảo sát sự biến i gen/hệ gen phụ vụ

nghiên ứu v giám ịnh, ph n loại phả hệ quần thể và á bệnh lý ph n t . Cá gen

ty thể ó hệ số biến i nh nh hơn hệ gen nh n tế bào t 0– 5 lần, nên rất thu n

lợi ho nghiên ứu v tiến hó và di truy n quần thể (Boore, 1999). Cá gen ty thể

trong ùng hủng, ùng loài, th m hí trong á loài ó qu n hệ gần v sinh h ó

sự bảo tồn rất o, do v y bất ứ sự th y i nh nào ũng là dấu hiệu ó giá trị

trong giám ịnh và ph n loại (H nh .5A).

Ty thể là loại bào qu n org nelle biệt nằm rải rá trong nguyên sinh

hất ủ á tế bào nh n th t Euk ryot , với số l ợng khoảng 00– 0.000 ơn vị

trong m t tế bào, hứ hàng trăm ến hàng ngh n bản s o hệ gen ty thể

(mitochondrial DN opy number , t p trung nhi u nh ng tế bào hoạt ng mạnh

và tăng sinh C stell ni et al., 0 0 . Ty thể ó hệ gen riêng hứ á gen sản xuất

sản ph m protein enzyme th m gi quá tr nh ôxy hoá-kh phosphoryl hó

OXPHOS , giải phóng năng l ợng d ới dạng TP denosine triphosph te ho tế

bào hoạt ng Wey-Fabrizius et al., 2013; Tang et al., 2020), là nhà máy năng

l ợng ủ tế bào và nh n lên l p không phụ thu vào quá tr nh ph n hi ủ

H nh .5. Minh h ấu tạo tế bào và vị trí ủ hệ gen ty thể mtDN và ơn vị mã hó ribosome (rTU trong tế bào. Nguồn: https://www.emoss-illustration.com/scientific-illustration.

tế bào Friedm n, Nunn ri, 0 H nh .5 H nh .6).

Hiện n y ó h i giả thuyết v nguồn gố ty thể: nộ ộn sinh và t sinh. V

giả thuyết t n , ng i t ho rằng ty thể sinh r t việ tá h m t phần DN ủ

nh n tế bào nh n th t kh i sinh v t nh n sơ tại th i iểm tiến hó ph n h ớng phần

DN này ó thể ợ b b i nh ng lớp màng không bị protein ph tạp. Nh ng

ngày àng ó nhi u bằng hứng ho thấy ty thể m ng nhi u tính hung với vi

khu n, do ó dẫn ến việ hấp nh n r ng rãi giả thuyết nộ ộn n , ó là ty thể

tiến hó t sự tá h r thành tế bào qu n riêng biệt ó nguồn gố t vi khu n n i sinh

(Kuroiwa et al., 2006; Martin, Müller, 2007; Gray, 2012). Do nguồn gố mtDNA

n h biết m t á h n k nên việ xá ịnh mối qu n hệ tiến hó ấu tạo ủ

hệ gen trong tế bào ó nhi u vấn ần làm sáng t Martin, Müller, 2007). V v y,

nghiên ứu ty thể và mtDN là hết sứ ần thiết và ng ợ y mạnh ể giải

áp á u h i v tiến hoá, nguồn gố , hứ năng và ph n loại Crimi, Rigolio,

2008).

1 2 1 2 ấ tạo à ứ n n ty t ể

Qu n sát d ới kính hiển vi iện t , ty thể ó dạng h nh hạt u ho ov n,

kí h th ớ t 0,5–1 m, ợ b o b b i h i lớp màng. Màng ngoài nhẵn, hứ

á protein v n huyển ể á v t hất vào và r kh i ty thể. Vùng nằm gi

màng trong và màng ngoài hứ ầy hất l ng g i là ngăn ngoài. Màng trong u n

lại thành á nếp gấp rist e và á kho ng hứ ầy dị h g i là ngăn trong h y

m trix, trong ó ó nhi u ribosome ty thể và hứ m t l ợng lớn á enzyme th m

gi vào quá tr nh hô hấp hiếu khí Kuroiwa et al., 2006; Logan, 2006). Các enzyme

th m gi t ng hợp TP ợ g n á nếp gấp ủ màng trong và á nếp gấp làm

Hình 1.6. Mô hình minh h ấu tạo iển h nh ủ ty thể. Nguồn: https://www.britannica.com/science/mitochondrion).

tăng áng kể b m t t ng hợp TP (Hình 1.6).

Ty thể ó hệ gen riêng, g i là hệ gen ty thể mtDN ó là v t hất di truy n

ngoài nhân, ấu tạo dạng v ng tr n, gồm á gen PCG th m gi quá tr nh ôxy hó –

kh xảy r trong ty thể. Cùng với b máy phiên mã, dị h mã và hệ thống tRN v n

huyển riêng, mtDN hoạt ng l p với hệ gen nh n ủ tế bào D‘Souz ,

Minczuk, 2018). Cá iểm này ủ ty thể rất giống với iểm ấu tạo và hoạt

ng ủ vi khu n, do ó á nhà kho h ho rằng, ty thể là bào qu n ó nguồn

gố t vi khu n ng sinh n i bào endosymbioti với á tế bào nh n th t xuất

hiện sớm nhất Saccone et al., 1999; Kuroiwa et al., 2006).

Trải qu hàng triệu năm, phần lớn á gen ủ mtDN , ng y ả nh ng gen

qu n tr ng ối với á hứ năng hoạt ng ủ hính ty thể ã ợ huyển vào hệ

gen nhân (Chen et al., 005 . Cá sản ph m protein ủ á gen huyển vị này lại

phải ợ ng ợ tr lại vào ty thể ể trợ gi p ty thể hoạt ng, nh á hệ

thống v n huyển protein riêng biệt qu màng Chawin et al., 1998 . Ty thể hỉ gi

lại –13 PCG ho sản ph m là á enzyme, gen ribosome ủ ty thể

mitoribosom l genes, MRG và gen v n huyển mino id (transfer RNA,

tRNA), tất ả ể hủ ng tạo sản ph m enzyme th m gi hệ thống OXPHOS sản

Hình 1.7. Minh h quá trình t ng hợp sinh h ủ mitoribosome. Ribosome ty thể ợ ấu tạo b i á protein ty thể (MRP) và RNA S rRN và S rRN . rRN và S rRN ợ t ng hợp t hệ gen ty thể th m gi ùng MRP ( ợ t ng hợp b i ribosome tế bào 0S và ợ nh p vào gi n bào ủ ty thể thông qu b máy huyển nh p kh u qu màng ty thể tên g i là TOM và TIM protein). Kế tiếp, MRP và rRN ợ l p ráp thành tiểu ơn vị lớn ủ ty thể mt-LSU) và tiểu ơn vị nh mt-SSU) tạo thành mitoribosome hoạt ng t ng hợp protein enzyme ủ ty thể. Nguồn: Lopez-Sanchez et al., 2021).

xuất TP ủ tế bào Friedm n, Nunn ri, 0 ; Tang et al., 2020).

1.2.2. Ribosome c ty thể

Ty thể không hỉ s h u hệ gen riêng mà n ó b máy biểu hiện gen riêng

b o gồm m t số t hợp liên kết RN với protein hứ năng, ó là các ribosome ty

thể mitoribosome . Mitoribosome ó số l ợng ến hàng hụ ơn vị, nằm rải rá

dính lên màng trong ủ nếp gấp ty thể H nh . . Cũng giống nh ribosome ủ tế

bào m ó trong nguyên sinh hất tế bào ytosoli ribosome, ribosome tế bào h y

ribosome), mitoribosome hịu trá h nhiệm ho việ dị h mã mRNA ần thiết ủ ty

thể, hẳng hạn nh nh ng mRN mã hó ho á sản ph m protein enzyme th m

gia quá trình phosphoryl hóa-oxy hóa (OXPHOS) ủ tế bào Tomal et al., 2019;

Tang et al., 2020).

Giống nh ribosome tế bào, ribosome ty thể b o gồm h i tiểu ơn vị: m t

tiểu ơn vị lớn mt-LSU, large mitoribosomal unit) và m t tiểu ơn vị nh mt-

SSU, small mitoribosomal unit). M i m t tiểu ơn vị là t hợp liên kết h t h ủ

RN ty thể ó là 12S rRNA và S rRNA, hay g i chung là mt-RN và á

protein ribosome ty thể mitoribosom l protein, mtRP hay MRP) (H nh .7). Tiểu

ơn vị nh mt-SSU bám vào mRN s o h p t hệ gen ty thể và làm t ơng tá gi

các b mã mRNA với các ối mã tRNA, ể tRN v n huyển mino id t ơng

ứng ho t ng hợp sợi polypeptide. LSU hứ trung t m peptidyl tr nsfer se x tá

h nh thành á liên kết peptide gi các amino acid ph n phối b i á tRN tạo

thành hu i polypeptide (Lopez-Sanchez et al., 2021).

1.2.3. ấu trúc và s p xếp n ở hệ n ty thể

Hệ gen ty thể ng v t, kể ả KST bào, là m t v ng DN kh p kín, ó

dài khoảng 3–25 nghìn nucleotide, hứ –13 PCG, 2 MRG, 22 tRNA và m t

vùng không mã hóa (non-coding region, NCR), dài ng n khá nh u tu loài ng

v t Boore, 1999; Bernt et al., 2013a) (H nh 1.8).

Hệ gen ty thể ủ ng v t ó ấu tr và s p xếp tr nh tự nu leotide rất h t

h gi á gen, oạn DN giới hạn ho m t gen là m t hu i nu leotide ơn gen,

không hứ intron. Gần nh là hỉ ần m t vài p b se s u m i gen ã ó thể ph n

ịnh r nh giới ho m t gen, ngoại tr vùng NCR. M t số gen thự sự n ó m t số

nu leotide gối lồng lên nh u mã kết th ủ gen tr ớ với mã kh i ầu ủ gen

kế tiếp, th m hí n lồng vào nh u ến 0 nu leotide nh gen nad4L và nad

ủ m t số loài sán d t Le et al., 00 . Vùng NCR mtDN ủ ng i và ng

v t n ó tên g i là ‗D- loop‘ là vùng hứ iểm kh i phát, b t ầu ho việ s o

chép DNA hệ gen (Hình 1.8A).

Hình 1.8. Mô h nh ấu tr v ng tr n và s p xếp mtDN ng i và sán lá ru t nh . A. Hê gen ty thể ủ ng i Nguồn: https://researchgate.net/publication/). B. Sơ ồ v ng tr n ủ hệ gen ty thể ủ sán lá ru t nh Haplorchis taichui (GenBank: KF214770) hứ á gen mã hó protein, gen RN ribosome, RN v n huyển và vùng không mã hó NCR Nguồn: Lee et al. (2013)).

Ký sinh trùng Ngành Sán d t gồm lớp Sán Lá Trem tod và Sán D y

Cestod và Ngành Giun Tr n Nem tod , ó mtDN với dài khá nh u,

khoảng 3– 5 kb, hứ PCG, ó là á gen mã hó t ng hợp á phứ hợp

enzyme th m gi quá tr nh ôxy hó -kh trong tế bào. Cá PCG b o gồm

cytochrome oxidase subunit 1–3 (cox1; cox2; cox3); nicotinamide dehydrogenase

subunit 1–6 (nad1; nad2; nad3; nad4; nad4L, nad5; nad6); gen cytochrome b (cob

hay cytB) và gen adenosine triphosphate synthase Fo subunit 6 (atp6). Không có gen

atp8 hiển diện trong mtDN ủ KST sán d t và giun tr n. Ngoài r , bên ạnh á

PCG, mtDN ủ KST và ng v t n ó MRG là S rRN h y rrnS) và 16S

rRNA (hay rrnL , gen tRN v n huyển và m t vùng NCR Boore, 1999; 2006;

Le et al., 00 0 0b Hu, G sser, 00 Bảng . H nh . B .

số á gen ợ dị h mã biểu hiện theo ùng m t h ớng one-way

tr ns ription và á gen tRN nằm gi á gen mã hó ho RN ribosome ho

á gen PCG. Trong m t số tr ng hợp, không ó sự tá h biệt gi á gen. M t

ho m t số nu leotide uối ùng ủ m t gen tr ớ gối lồng lên nh ng nucleotide

ầu ủ gen tiếp theo. M t số tr ng hợp ó sự lồng gối vào nh u ủ á gen dài

hơn tới hàng hụ nu leotide, nh ng thông th ng hỉ gối m t h y vài nu leotide

Bảng 1.2. Các gen trong hệ gen ty thể ng v t (gồm 13 gen mã hóa protein, 2 gen RNA ribosome và 22 gen mã hóa cho RNA v n chuyển (Boore, 1999; Le et al., 2002).

Le et al., 2002; Littlewood et al., 2006).

Protein đƣợc mã hóa

K hiệu DNA ty thể động vật

Cytochrome oxidase subunit I, II, III

COI, COII, COIII

K hiệu gen chu n hóa đƣợc dùng hiện nay cox1, cox2, cox3

Cytochrome b apoenzyme

Cytb

cob

ND1-6, 4L

nad1-6, nad4L

Nicotinamide dehydrogenase (NADH) subunits 1–6, 4L ATP synthase Fo subunit 6, 8

, ho TP , TP

atp6, atp8*

rrnL

RN ribosome tiểu phần lớn

LrRNA

RN ribosome tiểu phần nh

SrRNA

RN v n huyển huyên biệt ho m i amino acid (18 RNA) RN v n huyển hiệu ho leu ine RNA) RN v n huyển hiệu ho serine RNA)

M i mino id t ơng ứng với m t ký tự ợ ph n biệt b i odon nh n biết L CUN và L UUR ợ ph n biệt b i odon nh n biết S1 (AGN) và S2 (UCN)

rrnS Ví dụ: trnV (tRNAVal), trnH (tRNAHis) trnL1; tRNALeu1(CUN), trnL2; tRNALeu2(UUR) trnS1; tRNASer1(AGN) trnS2; tRNASer2(UCN)

Ghi chú: Dấu * : gen atp8 không có trong mtDNA ủ ký sinh trùng (Le et al., 2002).

1.2.4. Đặc điểm n và v n h n m h ở hệ n ty thể

1.2.4.1. Các gen mã hóa protein (PCG)

Các PCG mtDNA ng v t b o gồm: 7 gen mã hoá ho phứ hợp

nicotinamide dehydrogenase (nad), ó là nad1–6 và nad4L 3 gen mã hó ho phứ

hợp yto hrome oxid se cox ó là cox1–3) m t gen mã hoá cho cytochrome b

(cob hay cytB) và 2 gen mã hoá cho adenosine triphosphatase (atp) là atp6 và atp8

(Hình 1.8A). Cho ến n y, á nghiên ứu Giun tr n và Sán d t ho thấy, không

ó sự hiện diện ủ gen atp8, là m t gen ty thể ợ t m thấy tất ả ng v t ó

x ơng sống, kể ả ng i. Sự v ng thiếu gen atp8 và hỉ n lại gen hoạt ng là

n t tr ng ủ mtDNA ủ sán và giun KST (Le et al., 2002; Hu, Gasser,

2006; Wey-Fabrizius et al., 2013).

Các gen PCG ủ mtDNA ợ t ng hợp theo ơ hế dị h mã riêng ủ ty

thể (Saraste, 1999). Trong mtDNA số ng v t bào, thành phần và tr t tự

ủ á gen ợ bảo tồn o, biệt trong nh ng loài ó qu n hệ gần gũi trong

ùng m t h . B mã di truy n mtDNA ng v t bào ó sự khá biệt với ―bộ

m t yền n ‖ (universal genetic code) và gi á nhóm ủ ngành Sán d t

(Wolstenholme, 1992; Ozawa, 1995). Sự khá nh u này ó liên qu n ến b mã m

ầu st rt odon , b mã kết th stop odon và m t số b mã hó huyên biệt

khá mã hó ho m t số mino id biệt. Mã m ầu trong dị h mã t ng hợp

á protein số loài là TG, mã hó ho Methionine Met , tuy nhiên, sán lá,

ngoài TG ũng ó thể b t ầu bằng b mã GTG (Wolstenholme, 1992; Ozawa,

1995; Le et al., 2004). Ở giun sán ký sinh, m t số gen n s dụng thêm á b mã

ATT, AAT, TTG ho GTT, tuy rất hiếm (Okimoto, Wolstenholme, 1990).

Cá mã kết th ph biến là T G ho T . B mã TGA không ợ s

dụng ể kết th dị h mã mà là mã hó ho mino id Tryptoph n W Le et al.,

2002; 2004 . Trong m t vài tr ng hợp, hỉ ó m t nucleotide Thymine, T ho

b ôi Thymine và denine, T ợ s dụng làm b mã kết th m t gen, ng i

t g i y là bộ m k yết, th ng thấy mtDNA ủ nhi u loài (Telford et al.,

2000; Le et al., 2004). G n thêm hu i denyl ầu 3‘ trong quá tr nh phiên mã

s b sung thêm ể hoàn hỉnh mã kết th T ối với á b mã khuyết này.

Cá PCG ợ dị h mã bằng á h s dụng b mã di truy n ty thể ó tên g i là

―Echinoderm Mitochondrial Genetic Code‖ ủ sán lá Bảng số 9 trong

GenBank).(Telford et al., 2000; Le et al., 2004; Littlewood et al., 2006).

Việ xá ịnh á PCG t ơng ối dễ dàng do hu i gen ó tính bảo tồn o

v dài, tr nh tự nucleotide và amino acid ủ á PCG biệt á loài ùng

hi và ùng h . Phứ hợp cox ví dụ, cox1 và phần lớn á gen nad ví dụ, nad1,

nad3 ợ ứng dụng nhi u trong việ giám ịnh á loài hị em sister spe ies và

á loài ó qu n hệ gần gũi. Tuy nhiên m t số gen khá nh TP se apt6, atp8 và

phứ hợp nad nh nad4L, nad3 và nad6) th ó sự ồng nhất ít hơn, kể ả á

Hình 1.9. Cấu tr b h i mô ph ng ủ h i gen RN ribosome ty thể gen S rRN và gen 16S rRNA). Ghi h : . Gen S rRN ó ấu tr b h i do á hu i ―k p tó ‖ h irpin và á ―v m‖ loop tạo thành. B. Gen S rRN ó ấu tr b h i t ơng tự gen S rRN . Nguồn: Cấu tr á gen RN ribosome ty thể ủ loài sán lá g n lớn F s iol hep ti Le et al., 2001).

loài ó qu n hệ gần gũi Logan, 2006).

1.2.4.2 á n RN bo om ty t ể MRG)

Hai gen RNA ribosome ty thể MRG ủ mtDNA ó trong tất ả á loài

ng v t bào. Sản ph m rRN ty thể ủ h ng là thành phần RN ấu tr ủ

ribosome ty thể. Gen rrnL (hay 16S rRNA) th m gi vào thành phần ấu tạo tiểu

ơn vị lớn (mt-LSU) và gen rrnS (hay 12S rRNA) th m gi vào thành phần ấu tạo

tiểu ơn vị nh mt-SSU ủ ribosome ty thể (H nh .7). Ở hầu hết các loài, các

gen ribosome ty thể nằm trên ùng m t hu i nucleotide và ợ tá h biệt bằng m t

tRN v n huyển ho m t số PCG khá nh u (H nh .8) (Logan, 2006).

Cá gen RN ribosome ty thể gen S rRN và S rRN ũng u n lại

tạo thành các cấu tr b h i ribosome ty thể nh ng ơn giản hơn so với á ấu

trúc b h i phứ tạp ủ á gen RN ủ ơn vị mã hó ribosome gen S rRN

và S rRN ợ qu n sát thấy ribosome ủ tế bào và á gen rRN trong vi

khu n (Blair, 2006; Greber, Ban, 2016) (Hình 1.9).

1.2.4 3 á n RN ận chuyển amino acid (tRNA)

M i ph n t tRN ó h i hứ năng hính: tiếp nh n mino id và v n

huyển mino id ã ợ hoạt hó ến phứ hệ ―ribosome-mRN ‖, ể tiến hành

việ -dị h mã ho m t b mã odon ụ thể ủ m t mino id trên ph n t

mRNA. Hầu hết á tRNA ủ hệ gen nh n tế bào là m t sợi RNA nh dài khoảng

75– 0 bp, ó ấu tr b h i gấp kh , h nh dạng giống ―lá sồi‖ lover le f H nh

Hình 1.10. Cấu trúc b h i iển hình của RNA v n chuyển ủ hệ gen nh n và khuyết thiếu s p xếp á ánh t y ủ m t số tRN ký sinh trùng. A. Cấu tr b h i ầy ủ ủ tRN v n huyển hệ gen nh n B. Hoạt ng nh n biết b mã (codon) RN thông tin mRN và ối mã nti- odon ủ tRN b mã G G mã hó mino id Glut mi id RN thông tin ã ợ nh n biết và b t p với ― ối mã‖ CUC ể v n huyển Glut mi id ến t ng hợp hu i polypeptide. C. Khuyết thiếu ánh t y TYC ợ th y thế bằng v m TYC (TYC replacement loop) th ng g p tRN ủ mtDN giun tr n. D. Khuyết thiếu ánh t y DHU m t số tRN ợ th y thế bằng v m DHU DHU repl ement loop ủ mtDN sán d t. Ghi chú: AA-arm: ánh tay tiếp nh n amino acid; DHU-arm: ánh tay dihydrouridine (DHU); TYC-arm: ánh tay TYC; AC-arm: ánh tay ― ối mã‖ nticodon). Nguồn: Yusoff, 2015; Le et al., 2001; 2020b và https://www.semanticscholar.org/paper/).

1.10A).

Các tRNA ủ mtDN ó dài ng n hơn, trong khoảng 55–73 nu leotide.

Hoạt ng ủ tRN nh n h y ty thể là giống nh u, ó là hịu trá h nhiệm nh n

biết, tiếp nh n và v n huyển m t loại mino id t ơng hợp ến g n vào

chu i polypeptide ng dài dần tại vị trí củ ribosome ng t ng hợp trong quá trình

dị h mã. M i m t tRN ó m t vị trí ánh t y tiếp nh n mino id mino yl

arm, AA-arm, hay acceptor arm) cho phép g n mino id t ơng ứng và m t vùng

ối mã nti odon ánh t y ― ối mã‖ nti odon h y C-arm) cho phép nh n

ra b mã g n trên mRNA thông qua liên kết hydro H nh . 0B .

Giống nh á ấu tr h nh ―lá sồi‖ ủ tRN trong nh n, số á gen

tRNA ty thể ủ ng v t ó x ơng sống và không x ơng sống ó thể u n thành

ấu tr b tạo nên nhánh h y n g i là á án t y (arm) và trong m i tRN

th ng ó 3– ấu tr ―cánh tay‖ ó hứ năng khá nh u H nh . 0 ,B).

i) Cánh tay “ti p nhận amino acid (amino acid acceptor arm/AA-arm) là

nơi mino id t ơng ứng ợ g n vào ể tRN vào hu i polypeptide ng

ợ t ng hợp.

(ii) Cánh tay AC (AC-arm) hay “đối mã nti odon , gồm ―đoạn

C-stem và v m ‖ C-loop hứ 3 nu leotide ối mã ủ m t mino id,

ó v i tr mã trên mRN bằng sự kết p nti odon- odon theo nguyên t b

sung nh ng ó sự linh hoạt

(iii) Cánh tay D (D- rm h y ―DHU‖ dihydrouridine arm/DHU-arm , gồm

―đoạn D-stem và v m ‖ D-loop), nh n biết enzyme mino yl-tRNA

synthetase;

(iv) Cánh tay T (T-arm) hay ―TΨC‖ TΨC-arm) ợ t tên theo sự hiển

diện ủ hu i T C thymidine–pseudouridine – ytidine , gồm ―đoạn T T-

stem và v m T‖ T-loop), ó v i tr nh n biết ribosome ể i vào ng vị trí tiếp

nh n mino yl-tRN vị trí , uối ùng, oạn mạ h thẳng -CC ầu 3' là vị

trí g n vào ủ mino id ã ợ hoạt hoá ể tạo thành á mino yl-tRNA.

Nói hung, á ph n t tRN ó ấu tr th ng rất giống nh u nhi u

oạn và khá nh u hủ yếu b b m (anticodon). M t số tRN ủ mtDNA

ó á ấu tr hơi khá với á tRNA ủ nDNA tế bào. Chẳng hạn nh ánh t y

dihydrouridine DHU ó thể bị khuyết thiếu, ấu tr nh v y ợ g i là DHU-

replacement; ho ũng ó thể cánh tay TpsiC bị thiếu, ợ g i là TΨ -

replacement (Hình 1.10C,D). Sự th y i này v ấu tr á ánh t y ủ m t số

tRN là bằng hứng thù mtDNA sán d t, giun tr n, m t số côn trùng, m t số

loài d g i và m t số ng v t ó x ơng sống (Okimoto, Wolstenholme, 1990; Le et

al., 2001; Hu, Gasser, 2006).

1.2.4.4. Vùng không mã hóa non- o n on NR o N R

Trong mtDNA củ ng v t bào n ó m t vùng riêng biệt không mã

hoá ho bất k gen nào và th ng hứ nhi u ấu tr l p (repeat unit) g i là vùng

không mã hóa (NCR). dài ủ vùng này th y i t vài trăm ến hàng ngh n

nucleotide (Boore, 1999; Hu, Gasser, 2006; Le et al., 2002; 2020b). Kí h th ớ

vùng này th y i tùy loài và ó hứ á ấu tr ùn mầm (stem-loop ần ho

quá tr nh s o h p hệ gen và á vị trí i u khiển quá tr nh phiên mã gen. Do sự

ó m t ủ á yếu tố motif i u hoà s o h p hệ gen, nên toàn b vùng này n

ợ g i là vùng ―k ểm oát‖ ontrol region . Ở ng i, vùng này ợ g i là D-

loop displ ement loop , dự vào ơ hế s o h p không ùng h ớng ủ hu i

n ng OH he vy và hu i nh OL light u n v ng th y thế nh u Anderson et al.,

1981).

Tr nh tự vùng NCR th ng tạo thành ấu tr b h i phứ tạp do á ấu

tr l p nối tiếp nh u ho ảo ng ợ và nh ng oạn l p này th ng khá nh u v

kí h th ớ và số l ợng Zhang, Hewitt, 1997). Ở sán lá, vùng này th ng bị ph n

á h b i m t ho m t số gen tRNA tạo thành tiểu vùng không mã hó ng n SNR,

short non-coding region) và tiểu vùng không mã hóa dài (LNR, long non-coding

region). Sự khá nh u v hi u dài ủ á vùng này sán d y th ng ít hơn so với

sán lá. Cá biến hủng ủ loài sán máng (Schistosoma spp.) thu th p á vùng

ị lý khá nh u trên thế giới ũng biến thiên rất nhi u t vài trăm ến vài ngh n

bp, ó loài ến 0 ngh n) (Desprès et al., 1993; Le et al., 2019 . M t ông bố gần

y ủ Le et al. (2020b) ho thấy mtDNA ủ sán lá ru t Echinostoma revolutum

h E hinostom tid e ó vùng NCR hứ ến ấu tr l p trong ó ó 7 ấu

tr l p dài LRU, long repe t unit , m i m t LRU dài là 3 7 bp và ấu tr l p

ng n khá SRU, short repe t unit , m i m t SRU là 07 bp.

Ở ác vùng NCR này, ngoài á yếu tố i u hoà sao chép, n ó á vị trí

bám ủ á protein trong mối t ơng tá DN -protein với nh n ho với á

protein i u hoà phiên mã ty thể Boore, 1999; D‘Souz , Min zuk, 0 ). Vùng

NCR ó thành phần denine và Thymine +T rất o, v v y vùng này n ợ

g i là vùng giàu +T, số ôn trùng (Zhang, Hewitt, 1997 . Cá tiểu vùng

không mã hoá khá nằm gi á gen PCG, ợ g i là vùng ―giao gen‖ intergeni

region) và th ng rất ng n, không ó hứ năng r ràng, hỉ ơn giản là hu i nối

các gen với nh u Le et al., 2001; 2002; Logan, 2006; Hu, Gasser, 2006).

1.2.5. N hiên cứu ứn ụn n và hệ n ty thể

1.2.5.1 á ỉ t p n tử mtDNA ử n t on n ên ứ

Các gen ủ mtDNA ó giá trị là ngoài vấn ung ấp d liệu gen ý ngh

gen h và d liệu protein ý ngh protein h và hứ năng , thì mtDNA n

ung ấp hỉ thị di truy n ph n t , ó là m t phần h y toàn phần á PCG hay MRG

(ví dụ: cob, cox1, nad1, nad3, atp6; 12S và 16S rRNA ợ s dụng ph biến trong

xây dựng ph ơng pháp h n oán, ph n loại ph n t và di truy n quần thể Le et

al., 2002; McManus et al., 2004; Hu, Gasser, 2006). Gen cob, cox1, nad1 là nh ng

gen ó giá trị ợ h n trong giám ịnh và ịnh loại á loài ó h hàng gần gũi,

các gen nad3, 16S (rrnL), 12S (rrnS), vùng NCR ợ h n trong ph n loại và so

sánh biến i gen ủ á loại h hàng x Le et al., 2002; Blair, 2006). Chỉ thị

ph n t ơn gen h y ng hợp nhi u gen mino id ợ lự h n ho nghiên ứu

phả hệ và tiến hó Litlewood, 2008).

Chỉ thị di truy n mtDNA ã và ng ứng dụng tại Việt N m hiện n y rất ó

hiệu quả trong việ giám ịnh, h n oán, ph n loại, dị h tễ và di truy n quần thể

m t số loài sán d t g y bệnh Lê Thanh Hòa, 2007a,b). ó là việ giám ịnh loài

sán lá g n nh C. sinensis (Nguyễn Văn , Lê Th nh H , 00 b giám ịnh

SLRN H. taichui và H. pumilio (Van et al., 2009; Dung et al., 2013) giám ịnh sán

lá ph i Paragonimus heterotremus trên á v t hủ khá nh u Doanh et al., 2013).

Xác ịnh sán d y T. saginata và T. asiatica g y bệnh trên ng i Việt N m bằng

ph ơng pháp SHPT mtDNA ũng ã ợ thự hiện Nguyễn Văn , Lê Th nh

H , 00 Nguyễn Văn et al., 2006) hay ph n tí h iểm ủ sán lá g n lớn

(Fasciola spp. và xá ịnh l i ngoại loài gi F. gigantica và F. hepatica (Nguyen

S et al., 2012; Nguyen et al., 2018). M t số ông bố SHPT ủ sán lá g n nh O.

viverrini góp phần rất lớn ho ịnh h ớng nghiên ứu loài sán g y ung th tiên phát

này Việt N m và thế giới (Ngô Thị H ơng, 00 ).

Chỉ thị ph n t mtDNA ủ SLRN h Heterophyid e và hi Haplorchis ũng

ã ợ s dụng hiệu quả trong nghiên ứu xá ịnh và th m ịnh loài, h n oán,

dị h tễ h ph n t và tiến hó , phả hệ, biệt là hỉ thị cox1 (De, Le, 2011;

Thaenkham et al., 2011; Dung et al., 2013). Cá gen thu ợ t mtDN ủ

SLRN trên thế giới và Việt N m ã ung ấp nguồn d liệu hỉ thị ph n t ần

thiết trong nghiên ứu v mối qu n hệ gi loài và loài n i loài và ngoại loài trong

giám ịnh phả hệ và dị h tễ h ph n t De, Le, 2011; Lan-Anh et al., 2010;

Nguyễn Thị Khuê et al., 2015; Trung Dũng, 0 5).

1.2.5.2 T n n n ên ứ mt N án lá ột n ỏ trên t ế

ớ à ở V ệt N m

ối với ngành Sán d t, mtDNA hoàn hỉnh ủ hàng hụ loài sán lá và sán

dây ng i và ng v t ã ợ thu nh n và ph n tí h ầy ủ, ung ấp nguồn d

liệu dụng Nguồn: GOB SE: http://gobase.bcm.umontreal.ca/). Có thể kể r m t

số mtDNA xem Bảng Le et al. (2016 ủ SLRN Haplorchis taichui

(GenBank: KF214770); Metagonimus yokogawai KC330755 ủ h

Heterophyid e sán lá ru t Echinochasmus japonicus (Le et al., 2016); Echinostoma

caproni, E. paraensei (LL250667; KT008005), E. miyagawai (MH393928) (Li et

al., 2019 và E. revolutum (MN496162)) (Le et al., 2020b ủ h

E hinostom tid e. Hệ gen ty thể ủ sán lá ã ung ấp nguồn gen giá trị ho xá

ịnh loài, h n oán, ph n biệt, phả hệ, tiến hó và di truy n quần thể trên thế giới

(Le et al., 2002; 2016; Lee et al., 2013; Liu et al., 2014; Li et al., 2019).

Trong 20 năm gần y, tại Việt N m ho t mẫu thu ợ ủ Việt N m, bên

ạnh ph ơng pháp kiểm tr HTH, á hỉ thị gen ty thể ủ SLRN có giá trị dị h tễ

h qu n tr ng ã ợ nghiên ứu. M t số hỉ thị cox1, nad1 ã ợ s dụng hiệu

quả với các loài H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, S. falcatus, P. varium và C.

formosanus thu h Heterophyid e (Dung et al., 2007; 2013; Van et al., 2009;

Skov et al., 2009; Anh et al., 2009b; De, Le, 2011), á loài Echinostoma spp. (E.

cinetorchis, E. revolutum) h E hinostom tid e và á loài Echinochasmus spp.

(Ech. japonicus, Ech. perfoliatus) h Echinochasmidae (Chai et al., 2009; 2012;

Phan et al., 2011; Le et al., 2016; 2017 . Hiện n y k thu t SHPT mtDNA ng

ợ ứng dụng ngày àng r ng rãi và ó hiệu quả trong việ xá ịnh, h n oán và

ph n loại nhi u loài KST sán d t tại Việt N m và thế giới.

1 3 Gi i thiệu ribosome của t b o v đơn vị mã hóa ribosome

1.3.1. Giới thiệu ri osom c tế ào

Trong m t tế bào ng v t kể ả KST ó h i loại ribosome tồn tại, ó là

ribosome ủ tế bào m và ribosome ủ ty thể ủ tế bào ó. H i loại ribosome này

có m t trong tất ả á tế bào sống ủ ng v t bào và y là nơi xảy r quá

tr nh sinh t ng hợp protein ho tế bào và ơ thể. Ribosome tế bào là m t loại tế bào

qu n ó ấu tạo gồm thành phần rRN ssrRN SrRN và lsrRNA/28SrRNA)

và hàng hụ loại protein liên kết (mtRP hay MRP) tạo nên m t loại thự thể n i

bào g i là hạt ribosome (Amunts et al., 2015). Hạt ribosome tế bào ó thể trạng

thái tự do trong nguyên sinh hất ho g n trên b m t ủ mạn l ớ nộ ất

(endoplasmic reticulum).

Ribosome trong tế bào nh n thự ó kí h th ớ khá lớn, ng kính 0–

nm, hằng số l ng 0S S, Swedberg , rRN hiếm 55% và protein hiếm 5%.

Mitoribosome ph n bố trong ty thể, kí h th ớ nh hơn và hệ số l ng ũng thấp

hơn, hỉ 70S t ơng ơng với ribosome ủ tế bào nh n sơ Greber, Ban, 2016 .

Trung b nh số l ợng ribosome m i tế bào nh n thự là 5.000 hạt ho nhi u hơn.

Trong tế bào nh n sơ prok ryote nh vi sinh v t hẳng hạn, á hạt ribosome tồn

tại tự do ho kết hợp với RN thông tin (Cerqueira, Lemos, 2019) H nh . .

RN ribosome rRN là thành phần x tá ủ ribosome. Ribosome ủ tế

bào sinh v t nh n th t hứ loại ph n t rRN khá nh u: S rRN , 5. S

rRN , S rRN và 5S rRN . B ph n t rRN ợ t ng hợp trong nh n và

ph n t n lại ợ t ng hợp nơi khá . Trong bào t ơng, rRN và protein kết

hợp lại thành phứ hệ nu leoprotein g i là tiểu ơn vị ribosome, gồm tiểu ơn vị

lớn thành phần RN là S rRN và tiểu ơn vị nh thành phần RN là S

rRN H nh .7 và H nh . . Ribosome g n với mRN ể thự hiện quá tr nh

sinh t ng hợp protein Cerqueir , Lemos, 0 và th ng l nào ũng g n với

m t sợi mRN do á ribosome luôn luôn ng hoạt ng dị h mã. Ribosome tế

bào nh n th t ó hằng số l ng 0S: gồm m t tiểu ơn vị nh 0S gồm S rRN

dính với 33 proteins và m t tiểu ơn vị lớn 0S gồm 5S rRN , 5. S rRN , S

rRN và proteins . Ribosome tế bào nh n sơ ó hằng số l ng 70S, gồm m t

tiểu ơn vị nh 30S S RN dính với protein và m t tiểu ơn vị lớn 50S 5S

Hình 1.11. Quá tr nh ph n t tạo nên á gen rRN , s p t ấu tạo ủ m t hạt ribosome và ấu tr ơn vị ribosome ủ tế bào nh n th t và tế bào nh n sơ. Ch thí h: . Ph n t tạo nên 5. S, S và S rRN tạo nên hạt ribosome 0S B. S p t hạt ribosome gồm rRN và phứ hợp protein ó m t khe nh left ể tiếp nh n mRN . C. Thành phần S, 5S 5. S và S trong ribosome 0S ủ tế bào nh n th t euk ryote ng v t. D. Thành phần 5S, 3S và S rRN trong ribosome 70S ủ tế bào nh n sơ prok ryote vi khu n và t ơng tự ả ribosome ty thể.

rRN , 3S rRN và 3 protein H nh 1.11).

Nguồn: https://www.quora.com/What-are-70S-ribosomes; https://www.biochemcalcs.com/cell- structure-and-functions/; http://www.bio.miami.edu/dana/160/160S19_13.html).

M t loại ribosome khá ủ riêng ty thể h y mitoribosome là m t phứ hợp

protein hoạt ng trong ty thể và ó hứ năng dị h mã mRN ủ ty thể ợ mã

hó trong mtDN . Mitoribosome, giống nh ribosome tế bào hất, b o gồm h i tiểu

ơn vị, tiểu ơn vị lớn (mitochondrial large subunit, mt-LSU) và tiểu ơn vị nh

(mitochondrial small subunit, mt-SSU). Tuy nhiên, tỷ lệ gi rRNA và protein khác

với ribosome tế bào hất. Mitoribosome hứ nhi u protein hứ năng ụ thể và ó

ít rRN hơn ribosome tế bào (Amunts et al., 2015). Mitoribosome sinh v t nh n

th t hứ loại ph n t rRN ty thể, ó là S rRN th m gi là thành phần RN

ủ tiểu ơn vị lớn mt-LSU và S rRN th m gi là thành phần RN ủ tiểu ơn

vị nh mt-SSU (Lopez-Sanchez et al., 2021) (H nh 1.11).

1.3.2. Đ n v m h ri osome

1 3 2 1 S p ếp à ấ t á n m bosome

M i m t ơn vị mã hó ribosome (ribosomal transcription unit, rTU hay

rDNA là m t vùng DN ủ nhiễm s thể ủ hệ gen nh n tế bào mã hó ho 3

gen mã hóa ribosome (gen 18S rRNA, gen 5.8S rRNA và gen 28S rRNA) và h i

vùng giao gen, lần l ợt là ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer 1 and 2). Cá

rTU s p xếp tiếp nối nh u thành dãy trong m t t hợp(operon), ó ến hàng trăm

ơn vị, g i là t hợp rDN nh n tế bào (nuclear ribosomal operon) (Blair, 2006).

Trong hệ gen nh n ủ ng i, á rTU ịnh vị ùn t t t ứ ấp

se ond ry onstri tion h y n g i là NOR nu leol r org nizing region , á

nhiễm s thể số 3, , 5, và (McStay, 2016; Potapova, Gerton, 2019). Các

rTU nối với nh u bằng hu i nucleotide không mã hó ó hứ nhi u ấu tr l p,

g i là vùng bản l IGS non-transcribed intergenic spacer) (Potapova, Gerton,

2019). Sát nh p với IGS m t số loài n ó vùng ngoại gen ETS extern l

tr ns ribed sequen e , do v y, m t ơn vị rTU toàn phần hoàn hỉnh ó ấu tr

khung DN tr ng là: [5‗-IGS-ETS- S-ITS -5. S-ITS - S-IGS ETS -3‗ và

s p xếp thành dãy nối tiếp nh u ến vài trăm ơn vị (Turowski, Tollerve, 2015).

Cấu tr gen và s p xếp gen ủ rTU ó sự bảo tồn trong tất ả m i loài ng v t

bào, nh ng iểm ủ t ng gen và vùng gi o gen ó sự biến i khá nh u

(Olson et al., 2003; Lockyer et al., 2003; Blair, 2006; Littlewood, 2008; Tkach et

al., 2016). Biến i với mứ thấp th ng thấy á loài h hàng gần và o hơn

h hàng x , ngoại tr hu i nu leotide vùng bản l IGS ó biến i h nh rất

H nh . . Minh h tế bào và nhiễm s thể ó vùng hứ ơn vị mã hó ribosome rTU và ấu tr ủ m t ơn vị rTU. Ghi h : A. Nhiễm s thể ó rTU ịnh vị vùng th t thứ ấp. B. S o h p rRN ribosome và quá tr nh ph n t á S rRN , 5. S rRN và S rRNA. Nguồn: https://www2.le.ac.uk/projects/vgec/diagrams/36%20chromosome%20unravel.jpg/view; https://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_14.jpg).

cao (Salim, Gerton, 2019; Qiu et al., 2019).

1.3.2.2. ểm gen ùn o n à ùn b n lề n m

bo om

Quá tr nh mã hó ủ t ng ơn vị rTU ể tạo nên ph n t rRN nguồn pre-

rRN ó hằng số l ng 5S xảy r liên tụ , ph n t này hứ 3 phần gen rRN và

h i phần gi o gen ITS. S u ó oạn hứ 3 gen rRN ợ giải phóng kh i ITS-

và ITS-2 và ph n t thành á rRN thành phần, gen 18S rRNA, gen 5. rRN và

gen 28S rRNA H nh . H nh . . Ba gen rRNA này là sản ph m ủ quá tr nh

t ng hợp rRN ợ thự hiện t vùng rDN ủ ơn vị mã hó ribosome nhiễm

s thể và á gen rRN ợ s p t làm á thành phần ể ấu tạo nên tiểu ơn vị

lớn và tiểu ơn vị nh ủ á hạt ribosome.

T ng dài ủ m t hu i nu leotide hoàn hỉnh ủ rTU sán lá d o ng

trong khoảng 7–10 kb (Briscoe et al., 2016; Qiu et al., 2019; Brabec et al., 2015; Su

et al., 2018; Le et al., 2020a), dài nhất là 0. bp rTU ủ m t hủng ủ loài

Paramphistomum cervi h P r mphistom tid e Zheng et al., 2014) ợ biết ho

ến n y. Ở sán lá nói hung và sán lá ru t nói riêng, dài ủ gen S rRN nằm

trong khoảng , 5 ến kb, ví dụ sán lá g n lớn Fasciola spp. và h F s iolid e

là 5 bp sán lá ru t nh Cryptocotyle lingua MW3 0 và h

Heterophyidae là 1991–1992 bp. Gen 5. S rRN ó mứ bảo tồn o ả v

dài 57– 0 bp và v thành phần nu leotide á loài ùng h và khá h trong

lớp Sán lá Blair, 2006; Zheng et al., 2014; Su et al., 2018; Le et al., 2020a). Gen

28S rRNA toàn phần ủ rTU ó dài khoảng 3, – , kb, tuy nhiên ho ến n y,

vẫn n rất ít rTU hoàn hỉnh ợ thu nh n ể ó d liệu xem x t dài và thành

phần nu leotide ủ gen S rRN toàn phần SLRN và sán lá Liittlewood ,

2008; Zheng et al., 2014; Su et al., 2018; Qiu et al., 2019).

Vùng gi o gen ITS- và ITS- ó dài hết sứ biến ng á loài ùng

h hay khá h , t vài trăm nu leotide ến trên m t ngh n nu leotide. Vùng ITS ó

thể hứ á ấu tr l p, ó là á hu i nu leotide giống nh u s p xếp li n k

(TRU: tandem repeat unit) với số l ợng th y i (Le et al., 2020a). Nhi u loài sán

lá không hứ TRU nên ITS ó dài không biến ng, nh sán lá g n lớn là 45

bp ITS- và 35 -360 bp/ITS-2; h y loài Eurytrema pancreaticum là . 03

bp ITS- và 3 bp ITS-2 (Su et al., 2018; Le et al., 2020a). M t vùng gi o gen

khá , nối S rDN ủ rTU tr ớ với S rDN ủ rTU li n k là vùng bản l

IGS ó kí h th ớ th y i, hứ nhi u phứ hợp ấu tr l p khá nh u và ó tính

h nh o Blair, 2006; Zheng et al., 2014; Qiu et al., 2019).

Tất ả hu i nu leotide ủ phần gen ủ rTU là S, ITS- , 5. S, ITS ,

S và IGS u ó khả năng tạo nên ấu tr b h i gấp kh không gi n 3 hi u

và ó ũng là m t tính v ấu tr ủ á hu i gen rRNA ribosome và vùng

giao gen ITS (H nh . 3) (Schultz et al., 2005; Blair, 2006; Greber, Ban, 2016). Cấu

tr b h i là kết quả tạo h nh ủ sự b t p á tr nh tự gi á nu leotide ối

xứng b sung, ó là gi và T và gi G và C hạy theo hi u ối ng ợ , tạo nên

á ấu h nh ―k p t ‖ (hairpin/stem) và á ― m‖ (loop) ó tính ối xứng cao ể

tạo nên sự n ịnh ủ gen rRN trong ribosome (Caburet et al., 2005; Schultz et

H nh . 3. Cấu tr b h i mô ph ng ủ gen S rRN ủ ribosome tế bào và ủ gen S rRN ủ ribosome ty thể. Nguồn: Blair et al. (2006).

al., 2005; Voronova et al., 2018).

T ơng tự, hu i nu leotide ủ gen S và S rRN ribosome ty thể ũng

tạo nên ấu tr b h i nh ng mô h nh và sự phứ tạp ủ ấu tr ơn giản hơn so

với gen S rRN và S rRN ủ ribosome tế bào H nh . 3B). Cấu tr b

h i l p thể nh thế này không hỉ b t g p S rRN h y S rRN mà n á

vùng gi o gen ITS- h y ITS- trong ơn vị mã hó ribosome, nh ã thấy ITS-

ITS- ủ sán lá ph i Nanophyetus spp. h P r gonimid e Voronova et al.,

2018). L i ủ ấu tr b h i ủ ITS- ó sự bảo tồn o trong m i loài sinh v t

nh n th t Schultz et al., 2005).

1.3.3. N hiên cứu ứn ụn ch th phân t c đ n v m h ri osom

Trong nh ng năm gần y xu h ớng giải mã toàn b rTU ủ á loài sán lá

ể nghiên ứu ph n tí h iểm gen h ủ h ng ng ợ y mạnh. S dụng

dài toàn phần ho mứ tin t ng hơn, hính xá hơn khi s dụng m t phần

hu i nu leotide ủ gen S h y và S rRN , hay vùng gi o gen ITS ho

ITS2) v gó th m ịnh loài, ph n loại, phả hệ, qu n hệ v loài và di truy n quần

thể Choudhary et al., 2015; Chontananarth et al., 2018; Pérez-Ponce de León et al.,

2019 . Hơn n , so sánh ph n tí h toàn b hu i gen, toàn b rTU ó giá trị hính

xá hơn so với so sánh hỉ m t oạn DN ủ rTU (Fraija-Fernández et al., 2021).

Xuất phát t nhu ầu ó, nhi u nghiên ứu trên thế giới và tại Việt N m ã thu ợ

gần toàn phần ho toàn phần hu i nu leotide ủ rTU ho phần mã hó ủ rTU

hứ ầy ủ gen S, 5. S và S rRN ủ nhi u loài sán lá ký sinh, trong ó ó

SLRN ủ ng i và ng v t (Zheng et al., 2014; Briscoe et al., 2016; Su et al.,

2018; Qiu et al., 2019; Le et al., 2017; 2020a).

Tuy vẫn n nhi u loài h ó ầy ủ tr nh tự rTU, ít nhất là phần mã hó

gồm S, ITS- , 5. S, ITS- , S, nh ng số l ợng giải mã rTU á loài sán lá ngày

àng tăng, t ó ho ph p ó thể trí h xuất hỉ thị toàn phần gen S, ho 28S

ho ng hợp ả h i hỉ thị rRN qu n tr ng này ể nghiên ứu so sánh loài và

x y dựng phả hệ Lockyer et al., 2003; Olson et al., 2003; Thaenkham et al., 2010;

2011; Chan et al., 2021). Bất k ơn gen ribosome nào (18S hay 28S) hay vùng

giao gen (ITS-1 hay ITS- u ợ s dụng trong ph n tí h ph n loại, qu n hệ

tiến hó ủ á loài và truy xuất nguồn gố phả hệ, tuy ph n giải khoảng á h di

truy n và hính xá ph n ấp ó khá nh u (Weider et al., 2005; Blair, 2006;

Waeschenbach et al., 2007; 2012).

Với SLRN, ã ó m t số nghiên ứu rTU và kiến tạo d liệu ứng dụng ho

ph n loại, h n oán và di truy n quần thể Thaenkham et al., 2011; Le et al., 2017;

Chontananarth et al., 2018), ho s dụng hu i gen S ho S, ho vùng giao

gen (ITS-1, ITS- trong ph n tí h ph n loại, qu n hệ v loài ủ á loài và nguồn

gố xuất xứ (Schultz et al., 2005; Blair, 2006; Trung Dũng et al., 2014a; Pérez-

Ponce de León et al., 2019). Chỉ thị ph n t rTU ũng ợ t n dụng trong giám

ịnh ph n biệt loài và xá ịnh d ng bố p tern lity ối với á loài l p, ho

d ng ―lai ngoạ loà ‖ ho ―lai chéo loài‖ hybrid ho introgressive hybridiz tion

(Blair, 2006; Waeschenbach, Littlewood, 2017; Symonová, 2019; Le et al., 2020a).

Vùng mã hó ho gen 5. S rRN ó kí h th ớ rất nh hỉ 57–160 bp) và

rất bảo tồn, ít ó sự biến i gi á loài sinh v t ùng h , th m hí khá h ó h

hàng rất x Blair, 2006). Vùng gi o gen ITS- và ITS- và vùng bản l IGS là á

vùng DN k m bảo tồn nhất ủ rTU, trong ó ó nhi u ấu tr l p repetitive

sequence) ảnh h ng lớn khi so sánh ăn hỉnh hu i ho nghiên ứu qu n hệ

loài và phả hệ khá h . Vùng gi o gen ITS là vùng ó rất nhi u biến i, m dù

h ng th ng ợ s dụng trong nghiên ứu tiến hó ủ sinh v t. Nhi u loài sán

lá ó ấu tr l p tồn tại ITS- ho ITS- ảnh h ng ến so sánh hu i Le et al.,

2017; 2020a). Tuy nhiên, phần lớn á so sánh trên vùng ITS này th ng ể xá

ịnh á biệt hó trong ùng loài hơn là ể ph n tí h xá l p y phả hệ, m dù

ũng ã ó nhi u nghiên ứu s dụng ITS với mụ í h ó. Chu i ITS s là hỉ thị

ph n t thông dụng tin t ng trong s dụng, nếu không hứ ấu tr l p Nolan,

Cribb, 2005; Choudhary et al., 2015).

Vùng DN ủ S phần lớn ó hu i nu leotide bảo tồn o gi á loài,

tuy nhiên ũng ó m t số ph n vùng dom in ó mứ s i khá lớn ợ ký hiệu

là D , D , D3 . D 0, D , D và hính là ối t ợng kh i thá dạng sinh h

khi so sánh ph n tí h phả hệ và qu n hệ v loài Blair, 2006). Việ b sung ng

hợp hu i nu leotide ủ S rDN (lsrDNA, large subunit rDNA) ùng với hu i

nu leotide ủ S rDN (ssrDNA, small subunit rDNA) khi ph n tí h phả hệ ã

ợ hứng minh là làm tăng thêm khả năng ph n giải á ph n nhánh phả hệ á

ấp ph n loại khá nh u, tạo r sự dạng ủ vị trí ph n loại trong á ngành

sinh h , trong ó ó Sán d t (Waeschenbach et al., 2007).

Chu i S àng hoàn hỉnh b sung vào ùng S àng làm tăng hính xá

mối qu n hệ loài ũng nh vị trí ph n loại (Waeschenbach et al., 2007; Fraija-

Fernández et al., 2021). Trong m t nghiên ứu, Lockyer et al. (2003) b sung ng

hợp hu i S gần hoàn hỉnh vào S làm hỉ thị ph n t khi ph n tí h so sánh 3

loài sán d t s dụng ả 3 ph ơng pháp thông dụng, ph ơng pháp ―t ếp ận ạ ‖

m ximum likelihood , ph ơng pháp ―t ết k ệm t ‖ m ximum p rsimony và

ph ơng pháp ― y l ận Bayes‖ B yesi n inferen e method ã ho thấy qu n hệ

á loài ã ợ giải quyết th áng so với hỉ s dụng ơn thuần hỉ thị S.

M t số nghiên ứu khá trên Sán dây (Cestoda) ũng ã khẳng ịnh h h n

khả năng ph n giải á ph n nhánh phả hệ á ấp ph n loại tăng thêm dần khi

ng hợp toàn phần S khoảng .000 bp với m t phần 28S vùng D –D3,

khoảng .100-1.500 bp h y toàn phần 28S (toàn phần D1–12, ~3.800–4.600 bp

sán d t). Trong m t n lự nhằm ánh giá ph n loại s dụng ơn và ng hợp

lsrDNA ho và ssrDNA, Waeschenbach et al. (2012) nh n thấy, khi thêm tr nh tự

28S rRNA hay n g i là lsrDNA (4.057–4.593 bp gần nh hoàn hỉnh vào ùng

với S rRN h y ssrDNA (1.940–2.228 bp) cho 29 ơn vị ph n loại, theo ó thứ

tự ấp b ã ợ ải thiện rất lớn ho vị trí ph n loại lớp sán d y (Cestoda).

Kiểm tr ấu tr liên kết ho thấy y phả hệ dự trên m t phần lsrDN

(D1–D3)+ssrDNA và toàn phần lsrDNA (D1–D12)+ssrDN hoàn hỉnh ó sự khá

biệt áng kể. Các hu i vùng D4–D12 ủ lsrDN ó ảnh h ng lớn ến ấu tr

liên kết trên y phả hệ so với hỉ dùng hu i D1–D3 và so với nh ng loài ph n ấp

hỉ dự trên h nh thái h (Waeschenbach et al., 2007; 2012; Waeschenbach,

Littlewood, 2017 . Nghiên ứu phả hệ mới nhất ho thấy kết hợp ph n tí h

lsr+ssrDN hoàn hỉnh ùng với mtDN ã gi tăng hính xá qu n hệ v loài và

hi và h (Littlewood, 2008; Fraija-Fernández et al., 2021). Trong m t số tr ng

hợp ã làm th y i nh n thứ ph n loại tr ớ y, huyển i vị trí ph n loại loài

ấp m t h , nh m t ánh giá gần y ph n b Diphyllobothriide ủ lớp Sán

Dây (Fraija-Fernández et al., 2021).

M t số ông bố giải tr nh tự phần rTU ho toàn phần rTU ủ á loài

sán lá trong ó ó SLRN ã ó trong Ng n hàng gen, gồm Euryhelmis costaricensis

(GenBank: AB521797; Sato et al., 2010); Isthmiophora hortensis (AB189982);

Paragonimus kellicotti (HQ900670); Paramphistomum cervi (KJ459934; Zheng et

al., 2014); Brachycladium goliath (KR703279; Briscoe et al., 2016); Eurytrema

pancreaticum 5 hủng, KY 0000−KY490004; Su et al., 2018); Clonorchis

sinensis 5 hủng, MK 505 3−MK 505 7 và Metorchis orientalis 5 hủng,

MK482051−MK482055; (Qiu et al., 2019)), ho ph p t n dụng ơn gen, ơn hu i

ho ng hợp lsr+ssrDNA (18S rRNA+ S rRN trong s dụng ph n tí h loài và

phả hệ.

1 4 ngh a v s c n thi t nghiên cứu đặc điểm mtDNA v đơn vị mã hóa

ribosome của sán lá ruột nhỏ Haplorchis của đ t i

Nghiên ứu mtDNA và rTU ủ SLRN là rất ần thiết nhằm ung ấp d liệu

gen hệ gen ho h n oán, phát hiện, ph n biệt, ph n loại, th m ịnh loài, nghiên

ứu phả hệ, truy xuất nguồn gố , tiến hó , nghiên ứu dị h tễ ph n t và di truy n

quần thể. Do mtDN và rTU ó rất nhi u bản s o trong m t tế bào và á gen ủ

h ng ó ấu tr ơn oạn, nên việ s dụng PCR nh n bản DN là rất thu n lợi

(Littlewood, 2008; Fraija-Fernández et al., 2021; Chan et al., 2021).

Hệ gen ty thể ó kí h th ớ nh , hứ á gen ần thiết ho hoạt ng sống

nên ợ oi là ối t ợng lý t ng ể khảo sát sự biến i gen và hệ gen. T ơng tự,

rTU cung ấp gen S, gen 5. S và S th m gi làm thành phần ủ ribosome,

ợ t ng hợp liên tụ và ó qu n hệ tiến hó ph n t loài. Cá gen ủ ty thể và

rTU trong ùng loài hủng, th m hí trong á loài ó qu n hệ gần v sinh h ó

sự bảo tồn rất o, do v y, bất ứ sự th y i nh nào ũng là dấu hiệu giá trị trong

giám ịnh, ph n loại và nghiên ứu di truy n h (Le et al., 2002; Blair, 2006; Chan

et al., 2021).

Tr t tự s p xếp gen ủ mtDNA n ịnh qu m t th i gi n dài trong lị h s

tiến hoá và sự khá biệt tr t tự gi á thành viên trong m t giống genus , m t h

f mily th ng là hiếm, trong khi ó ó sự khá biệt o hơn trong á loài ó qu n

hệ h hàng x Boore, 2006). ối với rTU, tr t tự s p xếp gen vùng gi o gen là bảo

tồn tuyệt ối trong tất ả m i loài ng v t bào (Schultz et al., 2005; Cerqueira,

Lemos, 2019). Tiến hoá gen trong mtDN và rTU ợ phản ánh ầy ủ và liên

qu n h t h ến quy lu t tiến hoá DN chung ủ tế bào sống gi á loài. Hệ

gen ty thể và rTU ung ấp nguồn d liệu quí giá v hỉ thị ph n t trong nghiên

ứu mối qu n hệ gi loài và loài n i loài và ngoại loài , ứng dụng cho h n oán,

giám ịnh, ph n loại, qu n hệ loài, phả hệ, di truy n quần thể và dị h tễ h

(Zarowiecki et al., 2007; Chan et al., 2021).

Ngày n y, á bệnh KST ủ á loài SLRN ký sinh trong ng tiêu hó

xuất hiện ngày àng nhi u. Nguyên nh n hủ yếu là do on ng i ăn á sống, ăn

thứ ăn h nấu hín hứ ấu trùng g y nhiễm. Bên ạnh ó, khả năng nhiễm

SLRN ng i n phụ thu vào á vùng ị lý dị h tễ khá nh u và hiểu biết v

hăm só sứ kh e ủ ng ồng Việt N m (De, Le, 0 Trung Dũng,

0 5 Ng Văn Th nh, 0 . Biến i di truy n mtDN và rTU ủ á loài

SLRN là thự sự ần thiết nghiên ứu, t m hiểu và phát hiện hỉ thị tr ng ể

ứng dụng trong việ giám ịnh, ph n loại và phụ vụ ông tá h n oán hính xá

loài SLRN g y bệnh kh phụ nh ợ iểm ủ ph ơng pháp truy n thống.

Sán lá ru t nh h Heterophyid e tại Việt N m ã ợ i u tr v h nh

thái, ấu tạo, hu k phát triển và ph n bố ị lý 0 tỉnh thành, trong ó m t số

tỉnh ợ oi là iểm nóng, ó là á huyện vùng trũng N m ịnh, Ninh B nh,

Thanh Hó , với tỷ lệ nhiễm rất o ng i, ng v t và á (De, Le, 0

Trung Dũng, 0 5 Ng Văn Th nh, 0 ). Hai loài H. taichui và loài H. pumilio là

ối t ợng hính ủ tài rất ph biến, ợ ph n loại thu hi Haplorchis trong

h Heterophyid e B : Opisthorchiida; Lớp: Sán lá Trem tod và ùng m t số loài

khá , SLRN n thiếu nhi u d liệu v ph n tí h iểm mtDN và rTU. Số liệu

và d liệu thu ợ ủ mtDN và rTU ủ á loài Haplorchis và SLRN h

Heterophyid e t Việt N m không nh ng ó giá trị ứng dụng Việt N m mà n

thế giới ó SLRN l u hành.

Khi h ng tôi tiến hành tài, h ó mtDN và rTU ủ bất k loài

Haplorchis nào, tuy nhiên, khi ng gi i oạn hu n bị kết th giải tr nh tự toàn

b mtDN và toàn b phần mã hó ủ H. taichui ể ph n tí h, th xuất hiện ông

bố mtDN t m t hủng Lào ủ H. taichui (GenBank: KF214770) do Hàn Quố

thự hiện (Lee et al., 2013). Công bố này h ph n tí h ầy ủ iểm mtDNA

và á ấu tr l p trong vùng NCR, tính tiến hó ph n t á loài ph n b

Opisthor hi t , m t phần do l ó hệ thống d liệu mtDN n thiếu nhi u loài ể

so sánh. Ch ng tôi tiếp tụ ph n tí h ầy ủ mtDN và rTU ủ hủng QT3 H.

taichui và rTU ủ hủng HPU8 (H. pumilio ủ Việt N m ể ung ấp d liệu so

sánh với á hủng quố tế. Tr nh tự mtDN ủ H. pumilio hỉ thu ợ m t phần,

nh ng toàn b phần mã hó rTU ã ợ thu nh n, tạo ơ s ho việ ph n tí h ấu

tr , iểm và tiến hó ph n t s dụng á hỉ thị rTU ủ loài này.

Trong ơ s d liệu, rất m y m n h Heterophyid e ã ó toàn b mtDN

ủ loài SLRN Metagonimus yokogawai hủng ủ Hàn Quố , GenB nk:

KC330755); toàn b rTU ủ loài SLRN Cryptocotyle lingua hủng ủ Ng ,

GenB nk: MW3 0 và loài SLRN Euryhelmis costaricensis hủng ủ Nh t

Bản, GenBank: AB521797) (Sato et al., 2010). Cơ s d liệu mtDN và rTU vẫn

n thiếu rất nhi u với á loài SLRN thu h Heterophyid e, ối t ợng trự tiếp

ủ nghiên ứu này. M dù v y, m t số d liệu toàn phần h y m t phần, toàn b

h y á gen ơn l ủ á loài SLRN h Heterophyid e và h gần với

Heterophyid e trong ph n b Opisthor hi t ã gi p nghiên ứu này ủ h ng tôi

s dụng ó hiệu quả trong th m ịnh loài, so sánh ph n tí h iểm gen, s p xếp

hệ gen, ấu tr b h i, di truy n, phả hệ và tiến hó ph n t .

Nghiên ứu h ng tôi hủ ịnh thu ợ toàn b mtDNA và rTU ủ ại

diện SLRN chi Haplorchis h Heterophyid e tại Việt N m, ph n tí h iểm ủ

á gen và hệ gen, nhằm phụ vụ nghiên ứu dị h tễ h ph n t và ứng dụng trong

h n oán ph n loại, ồng th i x y dựng phả hệ, xá ịnh mối qu n hệ v loài và

tiến hó ph n t . H i n i dung hính là:

1. Nghiên ứu giải tr nh tự hệ gen ty thể loài SLRN Haplorchis taichui và

ph n tí h ấu tr , iểm gen và x y dựng phả hệ.

2. Nghiên ứu giải tr nh tự ơn vị mã hó ribosome ủ sán lá ru t nh H.

taichui và H. pumilio, ph n tí h ấu tr , iểm gen và x y dựng phả hệ.

CHƢƠNG 2

I TƢ NG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ối tƣợng vật liệu địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Đ i t n và vật liệu n hiên cứu

ối t ợng nghiên ứu là sán lá ru t nh thu chi Haplorchis, h

Heterophyidae, trong ó ối t ợng hính là h i loài Haplorchis taichui và

Haplorchis pumilio. M t số loài SLRN khá (Stellantchasmus falcatus, Haplorchis

yokogawai, Centrocestus formosanus và Procerovum varium) ũng ợ s dụng

ho nghiên ứu trong giám ịnh, ph n loại SLRN ủ tài.

V t liệu nghiên ứu hính là DN t ng số tá h hiết t sán tr ng thành ủ

hai loài H. taichui và H. pumilio s dụng ể thự hiện PCR và giải tr nh tự thu nh n

mtDN và rTU.

2.1.2. u n hiên cứu c các loài thuộc họ Heterophyidae

Hai mẫu SLRN ủ loài là ối t ợng hính (Bảng . gồm:

- Mẫu SLRN Haplorchis taichui là sán tr ng thành thu t bệnh nh n tại

Quảng Trị Việt N m , trự tiếp ho nghiên ứu ký hiệu là QT3 (Htai-QT3-VN), là

mẫu mới so với á mẫu tr ớ y, s dụng ể giải tr nh tự toàn b mtDNA và rTU.

- Mẫu SLRN Haplorchis pumilio là sán tr ng thành thu t bệnh nh n tại

Quảng Trị Việt N m , trự tiếp ho nghiên ứu, ký hiệu hủng là HPU8 (Hpum-

HPU8-VN, s dụng ể giải tr nh tự toàn b rTU và m t phần mtDN .

H i mẫu ủ h i loài H. taichui và H. pumilio, ợ th m ịnh khuôn DN

t ng số bằng SHPT s dụng á p mồi bám trên vùng gen 16S-12S ty thể

mtDN và gen 18S rRNA (rTU). Ngoài h i loài H. taichui và H. pumilio, m t số

loài SLRN khá trong h Heterophyid e tr ớ ó ã ợ xá ịnh bằng HTH (

Trung Dũng, 0 5 , ũng ợ th m ịnh bằng SHPT s dụng á p mồi bám

trên gen cox1, nad1 mtDN và gen ITS-2/18S/28S rRNA (rTU , so sánh với á

hủng quố tế ó trong Ng n hàng gen ho á ông bố tr ớ y.

Tên loài

Bảng .1. D nh sá h t ng số á mẫu SLRN ợ i u tr , thu mẫu á tỉnh thành phí B c Việt Nam và ợ ph n tí h sàng l , th m ịnh loài bằng SHPT s dụng á hỉ thị mtDN và rTU ủ nhóm nghiên ứu hiện n y và tr ớ y Van et al., 00 De, Le, 0 Trung Dũng, 2015). K hiệu mẫu DNA trƣ c nghiên cứu

Nơi thu mẫu

ST T

Haplorchis pumilio

Hà Giang

HPU2; HPU6; HPUHG

Haplorchis pumilio

Thanh Hóa

HPU3; HPU4; HPUTH

Haplorchis pumilio

Quảng Ninh

HPU1; HPU5

Haplorchis pumilio

Quảng Trị

HPU7; HPU8; HPUQT

Haplorchis pumilio

Hòa Bình

mtDNA (12S)   

mtDNA (nad1)   

rTU 18S/ 28S    

mtDNA (cox1)     

rTU (ITS-2)    

Haplorchis pumilio

N m ịnh



Haplorchis pumilio

Ph Th

HPU9; HPUHB HPUND; HpMcND; HpDzH; HPUPT; HPUPT1

Haplorchis pumilio

Yên Bái

HPUYB; HPMYB

Haplorchis taichui

Hà Giang

HTHG; HTA1; HTA2

10 Haplorchis taichui

Quảng Ninh

HTA3; HTA4

11 Haplorchis taichui

Thanh Hóa

  

   

    

 

12 Haplorchis taichui

Hòa Bình



13 Haplorchis taichui

Quảng Trị



14 Haplorchis taichui

Ph Th

HTA7; HTA8; HTTH HTA5; HTA5; HTA6; HTHB HTA9; HTA10; HTQT1; HTQT2; HTQT3 HTPT; (HTAPT)

15 Haplorchis taichui

Hà N i

HTHN; (HTAHN)

16 Haplorchis taichui

N m ịnh

HTND; HtDzH

17 Haplorchis taichui

Yên Bái

HTAYB; HTMYB

18 Haplorchis yokogawai

Yên Bái

HYOYB

Stellantchasmus falcatus

N m ịnh



    

  



     

Stellantchasmus falcatus

Quảng Ninh



SfND1; SfND2 SfQN1; SfQN2; SfQN3; SfQN4; SfQN5 CspMND; CspMND2

21 Centrocestus formosanus N m ịnh

Centrocestus formosanus

Hà Giang

CfoHG

23 Centrocestus formosanus Hà N i

CspHN

 



 

CFAYB; CFMYB

24 Centrocestus formosanus Yên Bái

Procerovum varium

PVAYB

Yên Bái

    



 Ghi ch Mẫu ung ấp ã ợ giám ịnh loài bằng HTH m t số ợ xá ịnh loài bằng SHPT trong á ông bố tr ớ y, số n lại ợ thự hiện trong nghiên ứu này Van et al., 00 De, Le, 0 Trung Dũng, 0 5). Ký hiệu mẫu bôi m là á mẫu ợ lự h n nghiên ứu s u sàng l và th m ịnh.

T ng toàn b mẫu ợ liệt kê Bảng . t tr ớ ến n y gồm hàng hụ

hủng ủ loài SLRN h Heterophyid e (Haplorchis pumilio, H. taichui, H.

yokogawai, Stellantchasmus falcatus, Centrocestus formosanus và Procerovum

varium) thu th p t 5 ị iểm tỉnh thành phí B Việt N m. số mẫu do TS

Trung Dũng Viện Sốt r t-Ký sinh trùng và Côn trùng trung ơng ung ấp, ã

xá ịnh loài bằng HTH (Dung et al., 2007; 2013; De, Le, 2011), tiếp tụ ợ

th m ịnh bằng SHPT s dụng –5 hỉ thị mtDN và rTU S S nad1; cox1;

ITS , S và S rRN và ph n tí h phả hệ ( Trung Dũng, 0 5 Le et al., 2017).

2.1.3. Đ điểm và th i i n n hiên cứu

tài nghiên ứu này ợ thự hiện tại Viện Công nghệ sinh h (Viện

Hàn l m Kho h và Công nghệ Việt N m). Th i gi n thự hiện: 0 –2019.

Cơ s v t hất ó tại Viện Công nghệ sinh h hiện ại, ầy ủ tr ng thiết bị

ho nghiên ứu SHPT gen hệ gen, bố trí tại Ph ng Thí nghiệm ủ Ph ng Miễn

dị h h và Ph ng Thí nghiệm tr ng iểm Công nghệ gen. V t t , hó hất, dụng ụ

thu loại tinh khiết, hất l ợng tốt ợ t hàng theo yêu ầu ủ á tài

N FOSTED mã số: 0 .0 - 0 .05 và 108.02-2017.09).

2 2 Phƣơng pháp ti p cận v bố tr nghiên cứu

Sán tr ng thành on ủ m i loài ối t ợng nghiên ứu H. taichui và

H. pumilio ợ s dụng ể tá h hiết DN t ng số. M dù ã ợ xá ịnh tên

loài bằng HTH, DN tá h hiết ủ m i mẫu ần ợ kiểm tr và th m ịnh mẫu.

Tr ớ tiên, hỉ thị S rRN ty thể và S rRN ribosome ợ s dụng ể xá

ịnh khuôn DN ủ loài t ơng ứng. Phản ứng LPCR PCR ợ áp dụng với á

mồi b t p trên khuôn s o ho thu ợ sản ph m ó h i ầu lồng vào nh u ể s u

khi giải tr nh tự thu ợ hu i nối tiếp. Sản ph m LPCR ợ tiếp tụ làm khuôn

ho á phản ứng PCR ng n ể tiết kiệm khuôn t DN t ng số.

Dự vào kết quả ông bố v gen h ủ mtDN và rTU hiện ó, á gen và

vùng gi o gen ủ mtDN và rTU thu ợ ợ xá ịnh. H nh . tr nh bày sơ

ồ nghiên ứu gồm: Nghiên ứu hệ gen ty thể (mtDNA) ủ H. taichui; ii Nghiên

ứu ơn vị mã hó ribosome rTU ủ H. taichui và H. pumilio.

Ở ả mtDN và rTU, á hỉ tiêu ph n tí h bao gồm: ấu tr , s p xếp

gen/hệ gen vùng gi o gen, thành phần iểm gen, vùng gi o gen và á ph n tí h

phả hệ. Ở mtDN , ó tính toán khoảng á h di truy n, rTU ó ph n tí h ấu tr

b h i ủ gen vùng gi o gen. Cá ph ơng pháp và k thu t hung ợ tr nh bày

Phần Phụ lụ á ph ơng pháp và k thu t s dụng m i n i dung nghiên ứu

ợ mô tả mụ .3 và . Ch ơng : ối t ợng, v t liệu và ph ơng pháp nghiên

ứu. Cá kết quả ạt ợ ủ m i hỉ tiêu và ánh giá kết quả ợ tr nh bày hi

tiết Ch ơng 3: Kết quả nghiên ứu và Ch ơng : Bàn lu n kết quả.

SƠ NGHIÊN CỨU

Hình 2.1. Sơ ồ bố trí nghiên ứu và á b ớ thự hiện n i dung hính: i Nghiên ứu hệ gen ty thể mtDN ii Nghiên ứu ơn vị mã hó ribosome rTU . Ghi h : SLRN: sán lá ru t nh HTH: h nh thái h SHPT: sinh h ph n t . PCG: gen mã hó protein MRG: gen ribosome ty thể tRN : RN v n huyển mino id. Ký hiệu gen, vùng gi o gen, s p xếp gen ợ mô tả hi tiết trong á mụ t ơng ứng trong lu n án.

Cá ph ơng pháp k thu t s dụng trong nghiên ứu gen h hệ gen ty thể

và ơn vị mã hó ribosome trong tài này là á ph ơng pháp k thu t SHPT

trong ó ó m t số ph ơng pháp k thu t th ng qui ủ nghiên ứu SHPT. Cá

ph ơng pháp k thu t SHPT này ợ giới thiệu và mô tả t ng b ớ thự hiện

Phần Phụ lụ II, b o gồm:

+ Ph ơng pháp tá h hiết DN t ng số

+ Thành phần phản ứng, thự hiện PCR và kiểm tr sản ph m

+ Ph ơng pháp thiết kế mồi hung và mồi hiệu hệ gen ty thể mtDN

+ Ph ơng pháp thiết kế mồi giải tr nh tự ơn vị mã hó ribosome (rTU)

+ Ph ơng pháp tá h d ng, thu DN pl smid tái t hợp

+ Ph ơng pháp giải tr nh tự và x lý hu i nu leotide

+ Ph ơng pháp truy p thu th p hu i so sánh và s p xếp ăn hỉnh

Cá ph ơng pháp k thu t SHPT ụ thể ho n i dung nghiên ứu hính:

Nghiên ứu gen h mtDN và Nghiên ứu gen h rTU ợ mô tả ụ thể tại m i

mụ t ơng ứng.

2 3 Phƣơng pháp nghiên cứu hệ gen ty thể

2.3.1. Ph n pháp xác đ nh cấu trúc và s p xếp hệ n ty thể c sán lá

ruột nhỏ plorchis t ichui

PCR/LPCR thu nh n mtDN ủ H. taichui s dụng á mồi liệt kê Bảng

PL2.1 gồm mồi hung mồi và hiệu 7 mồi ể thu sản ph m ó kí h th ớ

khá nh u (Phụ lụ II). Trên tr nh tự nu leotide ủ á hu i ã thu nh n, tiếp tụ

thiết kế mồi và giải tr nh tự bằng ph ơng pháp kế tiếp lồng nhau, n g i là ―lao

m ‖ trự tiếp ho và s u khi tá h d ng. Giải tr nh tự ợ thự hiện tại á ơ s

dị h vụ tại M rogen Hàn Quố https://www.macrogen.com/en/main/ và trong

n ớ , tại Công ty N m Kho Việt N m (http://biotechem.com.vn/).

Xá ịnh giới hạn và kí h th ớ t ng gen ty thể, vùng gi o gen, vùng không

mã hó và tr t tự s p xếp gen trong mtDNA ủ H. taichui bằng á h so sánh với d

liệu t ơng tự ủ sán d t ó trong Ng n hàng gen và ủ chúng tôi (Le et al., 2002;

2019; 2020b). M i h i PCG ợ xá ịnh bằng á h ăn hỉnh ối hiếu với á

PCG sẵn ó ủ á loài sán lá ã ông bố. Mã kh i ầu ATG ho GTG và mã kết

th TAA ho TAG ợ xá ịnh ho m t PCG, riêng b mã TG là mã kết th

ng v t b o, nh ng mtDNA là b mã mã hó ho mino id Tryptoph n.

S p xếp gen PCG, gen MRG, gen tRN và vùng NCR ủ mtDNA

ủ loài H. taichui ợ minh h dạng v ng tr n và dạng thẳng m v ng tại ầu

5‘ ủ gen cox3. Cấu tr dạng v ng tr n ủ toàn b mtDN ợ x y dựng và

mô h nh hó theo qui ịnh ấu tr mtDN , s dụng phần m m huyên biệt

OGDRAW 1.3.1 tại https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)

(Greiner et al., 2019 ấu tr dạng thẳng ợ v bằng t y s dụng Mi rosoft

PowerPoint dự vào d liệu mtDN thu ợ .

2.3.2. Ph n pháp phân t ch đặc điểm n N ri osom (MRG) ty thể

RN ribosome ty thể MRG gồm gen rrnL (16S) và gen rrnS (12S)

mtDN ủ H. taichui ợ xá ịnh nh mô tả trong Le et al. (2002; 2019; 2020b). Chu i gen 16S rRNA xá ịnh là giới hạn nằm gi hai gen tRNAThr (trnT) và tRNACys (trnC) và hu i gen 12S rRNA nằm gi h i gen tRNACys và cox2.

Mô h nh ấu tr b h i ủ MRG ợ x y dựng dự vào h ơng tr nh

RN fold ó tại: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/ (Gruber et al.,

2008). Chu i nu leotide ủ m i m t MRG ủ H. taichui dạng fasta (.fasta)

ợ nạp trự tiếp vào RN fold, h ơng tr nh tự ng huyển i s ng hu i ký tự

g i là dạng Vienn Vienn form t và x y dựng ồ h ấu tr b h i gr phi l

output dạng kết phẳng pl in sequen e và dạng kết v ng entroid sequen e , s

dụng năng l ợng kết nối tối thiểu (MFE, mimum free energy). Mô h nh ấu tr b

hai ủ MRG ủ H. taichui x y dựng bằng RN fold dạng kết v ng, s dụng

năng l ợng tối thiểu kết nối nu leotide là –117.81 kcal/mol.

2.3.3. Ph n pháp phân t ch đặc điểm n N vận chuyển t N ty

thể

Cá tRN h y n ợ viết t t là trn , gồm gen ợ xá ịnh bằng á

phần m m huyên biệt phối hợp b o gồm: i RWEN ó tại

http://130.235.244.92/bcgi/arwen.cgi (Laslett, Canback, 2008); ii tRN s n-

SE . ó tại: www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE/ (Lowe, Chan, 2016);

iii) MITOS ó tại http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/ (Bernt et al., 2013b . Cấu tr

b h i ủ tRN ợ mô h nh hó bằng h nh v theo qui ịnh ấu tr và qui

lu t n ối ánh t y tRN - rm ủ tRN ủ sán d t sán lá ăn ứ theo mô

h nh trí h lấy t kết quả ủ tRN s n-SE1.21, RWEN h y MITOS so sánh phối

hợp ể ó h nh v uối ùng (Le et al., 2002; 2017; 2019; 2020b). ồ h ấu tr

dạng phẳng uối ùng ủ tRN ợ thự hiện bằng Microsoft PowerPoint.

2.3.4. Ph ng pháp phân tích v n h n m h ở hệ n ty thể

Vùng không mã hó non- oding region, NCR trong hệ gen ty thể ủ H. taichui ợ xá ịnh b i r nh giới ủ 2 gen tRN v n huyển, tRNAGlu (trnE) và tRNAGly (trnG). Gen tRN v n huyển là tRN Glu nằm ng y s u gen nad5 và tRNAGly ng y tr ớ cox3. Cá c n ấ t l p l ền kề t ndem repe t unit,

th ng ký hiệu là TR h y RU ho TRU trong vùng NCR mtDN ủ H. taichui

ợ xá ịnh bằng phần m m T ndem Repeat Finder v3.01 ó tại

https://tandem.bu.edu/trf/trf.html (Benson, 1999).

2.3.5. Phân t ch ph n thức s ụn nucl oti và t nh toán iá tr độ

lệch s w/skewness) trong hệ n ty thể

á t ộ lệ : Giá trị lệ h (skew/skewness value) ủ là hênh lệ h %

s dụng , T, G, C ể kiến tạo nên toàn b hu i nucleotide ủ toàn b h y m t

phần mtDNA, ủ m t gen h y nhi u gen PCG khi ph n tí h ho hu i nu leotide

không mã hó ho á gen S h y S rRNA hay vùng gi o gen ITS ITS ho

toàn b rTU ho bất k hu i nu leotide nào x y dựng t , T, G, C.

á t n toán Tr ớ hết, hu i nu leotide ợ nạp vào h ơng tr nh

GENEDOC .7 và thu nh n tỷ lệ % s dụng nu leotide qu th m số B se

Composition Report và tính toán giá trị +T và G+C bằng á h ng tỷ lệ s dụng

nu leotide m i m t b se lại với nh u. Giá trị lệ h skew d o ng theo lệ h m

và lệ h d ơng t − ến + ợ tính theo ông thứ Perna, Kocher, 1995): [ T

skew - T +T và GC skew G - C)/(G+C . Nếu lệ h bằng 0 th tần số

s dụng và T ũng nh G và C nh nh u trong hu i nucleotide; nếu T skew

lệ h m th ợ hiểu là T ợ s dụng nhi u hơn Le et al., 2004 . ối với sán

lá do tỷ lệ s dụng và T luôn luôn nhi u hơn G và C nên t ng tỷ lệ s dụng +T

luôn luôn nhi u hơn tỷ lệ G+C, t o nên á t ộ lệ ủ T skew luôn luôn ó

giá trị m –) và ủ GC skew luôn luôn ó giá d ơng + Le et al., 2002; 2004;

2019; 2020b; Rajapakse et al., 2020).

2.3.6. Phân tích đặc điểm n m h prot in và thiên v s ụn ộ m

Cá PCG ợ dị h mã bằng á h s dụng b mã di truy n ty thể ó tên g i

là ―Echinoderm Mitochondrial Genetic Code‖ ủ sán lá Bảng số 9 trong

GenBank). Thành phần nu leotide ủ gen và b mã codon) ủ PCG ợ ph n

tích s dụng h ơng tr nh MEGA 7.0 ho MEG X (Kumar et al., 2016; 2018) và

tỷ lệ s dụng b mã codon usage) cho 12 PCG kết nối với nh u ng hợp ợ

xá ịnh với h ơng tr nh GENE INFINITY trự tuyến Cá h s dụng b mã

(Codonusage) tại: http://www.geneinfinity.org/sms/sms_codonusage.html)).

2.3.7. Ph n pháp t nh toán ho n cách i truy n c các loài sán lá

ruột nhỏ trên cộn h p 3 n co n 1+cox1

H i m ơi b hu i nu leotide ng hợp 3 gen PCG gồm cob+nad1+cox t

3 hủng loài sán lá (~1177–1186 aa) thu ph n b Opisthor hi t liệt kê

Bảng PL . ợ vào h ơng tr nh GENEDOC .7, rồi huyển i s ng mino

acid bằng bảng mã di truy n ty thể và s p xếp so sánh ( lignment và ăn hỉnh

h n khối liên kết uối ùng bằng h ơng tr nh MEG 7.0 (Kumar et al., 2016).

T khối ăn hỉnh uối ùng ủ 3 hủng loài ó, trí h lấy 3 hu i

mino id ng hợp ủ cob+nad1+cox1 ủ 3 hủng 7 loài thu Ph n b

Opisthor hi t gồm h i h là Heterophyid e và Opisthor hiid e, là á loài:

Haplorchis taichui . Ht i-L -KF 770 Lào . Ht i-QT3-VN Việt N m );

Metagonimus yokogawai (3. Myok-KR-KC330755 Hàn Quố ); Stellantchasmus

falcatus (4. Sfal-QN2-VN Việt N m ); Clonorchis sinensis (5. Csin-Amur-RU-

FJ381664 (Nga); 6. Csin-GD-CN-JF729303 Trung Quố ; 7. Csin-KR-JF729304

Hàn Quố ; 8. Csin-ND-VN Việt N m ); Metorchis orientalis (9. Mori-HLJ-CN-

KT239342 Trung Quố ); Opisthorchis felineus (10. Ofel-UstTula-RU-EU921260

(Nga)); Opisthorchis viverrini (11. Oviv-BD1-VN Việt N m ; 12. Oviv-KK-TH

Thái L n ; 13. Oviv-LA-JF739555 Lào ).

á t n toán Khoảng á h di truy n p irwise geneti dist n e KCDT

ợ tính toán theo thông số ó trong h ơng tr nh MEG 7.0 (Kumar et al., 2016).

Cá hu i nu leotide ợ vào GENEDOC .7 ể s p xếp ăn hỉnh s u ó

ợ trí h xuất r dạng f st .f st . D liệu á hu i ăn hỉnh dạng .f st

này ợ vào MEG X và tính toán KCDT s dung ph ơng pháp Maximum

Composite Likelihood với hệ số tin t ng bootstr p 000 lần l p lại.

2.3. . Ph n pháp t nh toán ho n cách i truy n c các loài sán lá

ruột nhỏ trên cộn h p 12 P G c ty thể

Chu i ng hợp ủ PCG ủ hủng loài so sánh Bảng PL .3 ủ h

Heterophyidae b o gồm 3 hủng ủ loài SLRN, trong ó ó loài Haplorchis

taichui hủng Ht i-QT3-VN-MG972809 ủ Việt N m và Ht i-L -KF 770 ủ

Lào và loài SLRN Metagonimus yokogawai ủ Hàn Quố hủng Myok-KR-

KC330755); ủ h Opisthorchiidae, gồm loài Clonorchis sinensis (Csin- mur-

RU-FJ3 ủ Ng Csin-GD-CN-JF7 303 ủ Trung Quố và Csin-KR-

JF7 30 ủ Hàn Quố , loài Metorchis orientalis (Mori-HLJ-CN-KT239342 ủ

Trung Quố , loài Opisthorchis felineus (Ofel-UstTul -RU-EU 0 ủ Ng và

loài Opisthorchis viverrini (Oviv-LA-JF739555 ủ Lào ợ s dụng huyển i

sang amino acid và ăn hỉnh n lại dài uối ùng –2977 aa) và tính toán

KCDT. Cá h tính toán giống nh mụ .3.7.

2.3.9. Ph n pháp phân t ch ph hệ trên ch th cộn h p n

PCG c ty thể co n 1 cox1

H i m ơi b hu i nu leotide ng hợp 3 gen PCG gồm cob+nad1+cox t

3 hủng loài sán lá thu ph n b Opisthor hi t liệt kê Bảng PL . ợ

vào h ơng tr nh GENEDOC .7, rồi huyển i s ng mino id suy diễn bằng

bảng mã di truy n ty thể và s p xếp so sánh lignment và ăn hỉnh h n khối liên

kết uối ùng bằng h ơng tr nh MEG 7.0 Kumar et al., 2016).

Phả hệ ủ 3 hủng loài dự trên thành phần mino id (~1.177–1.186 aa)

ợ phân tích và x y dựng y phả hệ bằng h ơng tr nh MEG 7.0, s dụng

ph ơng pháp ―kết n l ền kề‖ Neighbor-Joining method (NJ)), tính toán thông qua

thu t toán Jones-Taylor-Thornton (JTT) và Nearest-Neighbor-Interchange (NNI),

với hệ số tin t ng bootstrap 1000 lần l p lại (Kumar et al., 2016).

2.3.10. Ph n pháp phân t ch ph hệ trên ch th cộn h p toàn ộ

12 PCG c ty thể

Tr nh tự nu leotide ủ PCG theo tr t tự: cox3-cob-nad4L-nad4-atp6-

nad2-nad1-nad3-cox1-cox2-nad6-nad5 ủ mtDNA H. taichui ợ ng hợp, rồi

huyển i s ng hu i mino id suy diễn theo bảng mã di truy n ty thể bằng

h ơng tr nh GENEDOC .7. T ơng tự, PCG ũng ợ ng hợp và huyển i

s ng mino id ủ 35 hủng/loài sán lá khá Bảng PL2.3 t 0 h

(Cyclocoelidae; Echinochasmidae; Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae;

Gastrothylacidae; Heterophyid e Him sthlid e Opisthor hiid e

P r mphistom tid e thu á Ph n b E hinostom t , Opisthor hi t và

Prono eph l t và m t hu i ng hợp PCG ủ loài Schistosoma haematobium h

S histosom tid e làm hu i ngoại hợp outgroup .

Tr nh tự mino acid ng hợp ủ PCG ủ tất ả 3 hủng loài này

(3.371–3.415 aa) ợ ăn hỉnh s dụng h ơng tr nh GENEDOC .7, xá nh n

b i h ơng tr nh MAFFT 7.122 (Katoh, Standley, 2013 và hoàn thiện b i phần

m m Gblocks 0.91b (http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html),

t g t nh ng phần mino id ó sự hênh lệ h ăn hỉnh quá lớn mbiguity

nhằm giảm thiểu tối s i lệ h khi so sánh (Castresana, 2000). Khối liên kết ăn

hỉnh uối ùng n lại (~2962–2977 aa) ợ trí h lấy ể x y dựng y phả hệ s

dụng ph ơng pháp ―t ếp ận ạ ‖ m ximum likelihood, ML ó trong h ơng

trinh MEGA X với hệ số tin t ng bootstrap) 000 lần l p lại. Mô h nh th y thế

với iểm số tốt nhất theo tiêu hí thông tin B yes ợ s dụng là mô hình thông

qua thu t toán Jones-Taylor-Thornton (JTT) + F + G + I, với tần số ớ tính t d

liệu +F , tỷ lệ biến thiên d theo dài ủ ăn hỉnh +G và ho ph p m t phần

vị trí bất biến +I (Kumar et al., 2018).

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome (rTU)

2.4.1. Ph n pháp xác đ nh cấu trúc và s p xếp n v n i o n c

đ n v m h ri osom

S dụng á mồi liệt kê Bảng PL . ợ thiết kế ể thu sản ph m

PCR/LPCR t khuôn rTU ủ H. taichui và H. pumilio ó kí h th ớ khá nh u

(Phụ lụ II). Trên ơ s tr nh tự nu leotide ủ á hu i ã thu nh n, tiếp tụ s

dụng á mồi bên trong ể giải tr nh tự bằng ph ơng pháp kế tiếp lồng nh u trự

tiếp ho và s u khi tá h d ng. Giải tr nh tự ợ thự hiện dị h vụ n ớ ngoài,

tại M rogen Hàn Quố https://www.macrogen.com/en/main/ và trong n ớ , tại

Công ty N m Kho Việt N m http://biotechem.com.vn/).

Chu i nu leotide và dài gen S, 5. S và S ợ xá ịnh bằng á h

s p xếp và ăn hỉnh tr nh tự mới thu nh n với á hu i th m hiếu t ơng ứng ã

ợ ông bố ho ó trong Ng n hàng gen ho ó trong b d liệu ủ h ng tôi

(Le et al., 2017; 2020a). M t số ông bố toàn phần rTU ã ó trong Ng n hàng gen

(Bảng PL . ), ợ ối hiếu ể xá ịnh ấu tr rTU ủ H. taichui và H.

pumilio. Sau khi ó á gen rRNA, vùng gi o gen ITS- ợ xá ịnh là giới hạn

gi á gen S và 5. S; ITS-2 là gi 5. S và S và vùng bản lê IGS là gi

S ủ rTU tr ớ và S ủ rTU kế tiếp. Tr t tự s p xếp gen và á vùng gi o

gen trong rTU tất ả m i loài ó bảo tồn tuyệt ối [ S-ITS -5. S-ITS - S-

IGS -[ S- ..- S-IGS nên việ xá l p ấu tr rTU ủ H. taichui và H.

pumilio theo ó ợ thự hiện. Ch ơng tr nh Tandem Repeat Finder v3.01 ó tại

https://tandem.bu.edu/trf/trf.html (Benson, 1999 ợ s dụng ể t m kiếm chu i

ấu tr l p li n k ó thể ó trong vùng gi o gen ITS ho ITS và trong vùng

bản l IGS nếu ó .

2.4.2. Ph n pháp xác đ nh độ ài và đặc điểm n r N và v n i o

n ở đ n v m h ri osom

Dự trên m t số công bố tr ớ y v kí h th ớ t ng gen vùng gi o gen ủa

m t số loài sán d t (Sato et al., 2010; Briscoe et al., 2016; Su et al., 2018; Le et al.,

2017; 2020a) và d liệu rTU ó trong Ng n hàng gen, h ng tôi ã xá ịnh ợ

dài và iểm t ng gen/vùng giao gen trong p ần m bo om (tạm ký

hiệu là rTU*) của H. taichui (Ht i-QT3-VN và H. pumilio (Hpum-HPU8-VN).

Chu i nu leotide gen 5.8S rRNA ợ xá ịnh ầu tiên dự trên sự bảo tồn rất o

ủ dài và thành phần gen. Tiếp theo, xá ịnh ầu uối 3‘ gen S rRN và h i

ầu 5‘ và 3‘ ủ gen S rRN do ó nu leotide bảo tồn o. C n lại, hu i

nucleotide ITS- là gi ầu 3‘ ủ S rRN và 5‘ ủ 5. S rRN và ITS- là

gi ầu 3‘ ủ 5. S rRN và ầu 5‘ ủ S rRN . Chu i nu leotide sau 3‘ gen

S rRN là IGS. Ở H. taichui và H. pumilio, không giải ợ tr nh tự vùng IGS.

2.4.3. Ph n pháp phân t ch ph n thức s ụn nucl oti và t nh

toán iá tr độ lệch s w tron đ n v m h ri osom

Hiện n y, ó loài thu h Heterophyid e ã ó rTU* ợ giải tr nh tự

gồm Haplorchis taichui hủng QT3, Việt N m (Htai-QT3-VN, KX815126),

Haplorchis pumilio hủng HPU , Việt N m (Hpum-HPU -VN, KX 5 5 , loài

Cryptocotyle lingua, hủng K rtesh, Nga (Clin-Kartesh-RU, MW361240 và loài

Euryhelmis costaricensis, hủng Fuku, Nh t Bản Ecos-Fuku-JP, AB521797). Tất

ả ợ s dụng ể ph n tí h ph ơng thứ s dụng nu leotide và tính toán giá trị

lệ h ―skew‖ ủ rTU*, gen S rRN , gen S rRN và S+ S rRN . Chu i

nucleotide ủ t ng ơn vị này ợ nạp vào GENEDOC .7, thu nh n tỷ lệ % s

dụng nu leotide qu th m số B se Composition Report và tính toán giá trị +T và

G+C. Giá trị ộ lệ skew d o ng theo lệ h m và lệ h d ơng t − ến +

ợ tính theo ông thứ Perna, Kocher, 1995): [ T skew - T +T và GC

skew = (G - C)/(G+C)].

2.4.4. Ph n pháp phân t ch t n đ n nucl oti c các n r N và

ph n m h ri osom c sán lá ruột nhỏ họ t rophyi

Mứ t ơng ồng nu leotide % ủ ơn vị so sánh là S rRN , S

rRN , S rRN + S rRN và rTU* gi bốn loài SLRN h Heterophyid e, b o

gồm Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN), H. pumilio (Hpum-HPU8-VN),

Cryptocotyle lingua Clin-K rtesh-RU và Euryhelmis costaricensis E os-Fuku-JP

ợ tính toán. Cá hu i nu leotide ợ vào GENEDOC .7 ể s p xếp ăn

hỉnh s u ó ợ trí h xuất r dạng f st .f st ể vào MEG X và tính

toán t ơng ồng s dung ph ơng pháp M ximum Composite Likelihood với hệ số

tin t ng bootstr p 000 lần l p lại. Giá trị t ơng ồng (%) biểu hiện bằng tỷ lệ

ồng nhất nu leotide gi á hủng so sánh.

2.4.5. Ph n pháp phân tích đặc điểm cấu trúc ậc h i n r N

ribosome (5.8S, 18S, 28S rRNA)

Có h i h ơng tr nh x y dựng mô h nh ấu tr b h i s dụng ho hu i

nu leotide ủ rRN : i) RNAfold ó tại http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-

bin/RNAWebSuite/) cho chu i rRN nguyên/sơ ấp và ii) RN lifold ó tại

(http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAalifold.cgi) ho hu i rRN

ăn hỉnh/thứ ấp h y n g i là hu i ― n t ận‖ onsensus sequen e . Chu i

nu leotide ầu vào dạng f st .f st ợ nạp vào RNAfold ho RNAalifold,

ợ h ơng tr nh tự ng huyển i sang ký tự dạng Vienn Vienn form t và

tạo ồ h ấu tr b h i dạng kết phẳng pl in sequen e và dạng kết v ng

(centroid sequence) s dụng năng l ợng tối thiểu kết nối nu leotide (minimum free

energy, MFE t ơng ứng ho m i hu i Gruber et al., 2008; Bernhart et al., 2008).

+ Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nu leotide ủ m i gen 5.8S rRNA

(160 bp) ủ m i loài H. taichui (Htai-QT3-VN), H. pumilio Hpum-HPU -VN và

loài so sánh, Cryptocotyle lingua Clin-K rtesh-RU và Euryhelmis costaricensis

(Ecos-Fuku-JP) ợ xá ịnh bằng h ơng tr nh RN fold, trí h lấy ồ h dạng

kết phẳng MFE –54.20 kcal/mol).

+ Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nu leotide ủ m i gen 28S rRNA

(3870–3875 bp ủ m i loài H. taichui Ht i-QT3-VN và H. pumilio (Hpum-

HPU8-VN) ợ xá ịnh bằng h ơng tr nh RN fold, trí h lấy ồ h dạng kết

phẳng (MFE = –1488.00 kcal/mol).

+ Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nguyên gen và ủ hu i ― n t ận‖

S rRN – bp ủ loài H. taichui và loài H. pumilio ợ x y dựng

bằng h ơng tr nh RN fold, trí h lấy ồ h dạng kết phẳng (MFE = –674.30

kcal/mol). Chu i ― n t ận‖ lấy t khối ăn hỉnh S rRN ủ H. taichui gồm

5 hủng Việt N m: hủng QT3 KX 5 Thái L n: 3 hủng N HM00 7,

N HM00 3 và N 3 HM00 0 và m t hủng ủ Isr el, Y 5705 và ủ

H. pumilio gồm 5 hủng Việt N m: hủng HPU KX 5 Thái L n: 3 hủng

HpNP HM00 , HpNP HM00 5 và HpNP3 HM00 và m t hủng ủ

Israel, AY245706) (Thaenkham et al., 2010; Dzikowski et al., 2004).

2.4.6. Ph n pháp phân tích đặc điểm cấu trúc ậc h i v n i o n

ITS (ITS-1, ITS-2)

+ Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nu leotide ITS-1 ủ m i loài H.

taichui Ht i-QT3-VN 7 7 bp và H. pumilio (Hpum-HPU8-VN) (1.106 bp) ợ

xá ịnh bằng h ơng tr nh RN fold dạng kết v ng MFE = –243.90 kcal/mol).

+ Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nu leotide ITS-2 ủ m i loài H.

taichui (Htai-QT3-VN) (444 bp), H. pumilio Hpum-HPU -VN 0 bp và loài

so sánh, Cryptocotyle lingua (Clin-Kartesh-RU) (297 bp và Euryhelmis

costaricensis (Ecos-Fuku-JP) bp ợ xá ịnh bằng h ơng tr nh RN fold

dạng kết phẳng MFE = –187.70 kcal/mol).

2.4.7. Ph n pháp phân t ch ph hệ c . t ichui và . pumilio

trên chu i gen 28S rRN toàn ph n

Sau khi nh n ợ hu i S rRN ủ H. taichui và ủ H. pumilio, h ng

tôi truy p Ng n hàng gen s dụng BL ST ể thu th p á hu i t ơng tự ùng

loài ho khá loài, ùng hi, ho ùng h làm ơ s d liệu ho ph n tí h so sánh

và x y dựng y phả hệ (Bảng PL2.5).

B m ơi h i 3 tr nh tự nu leotide ủ hu i gen S rRN toàn phần

(~3.8–3.9 kb) (Bảng PL2.5 ợ s p xếp ăn hỉnh bằng h ơng tr nh

GENEDOC2.7 và hỉnh s nh bằng phần m m Gblo ks 0. b Castresana, 2000).

Khối liên kết ăn hỉnh uối ùng ủ 3 hủng 26 loài nghiên ứu là ~3.615–3.687

nucleotide ợ ph n tí h và x y dựng y phả hệ. Ngoài hu i S rRN ủ H.

taichui Ht i-QT3-VN và H. pumilio (Hpum-HPU8-VN) và hu i ngoại hợp S.

japonicum h S histosom tid e , 3 hủng loài n lại ại diện ho h thu á

ph n b Opisthor hi t á h : Heterophyidae, Opisthorchiidae), ph n b

Troglotremata á h : N nophyetid e, P r gonimidae, Collyriclidae) và ph n b

E hinostom t á h : E hinostom tid e, F s iolid e .

C y phả hệ ợ x y dựng bằng h ơng tr nh MEG X s dụng ph ơng pháp

‖kết n l ền kề‖ Neighbor-Joining method (NJ , mô h nh th y thế Maximum

Composite Likelihood, với iểm số tốt nhất theo tiêu hí thông tin B yes là mô hình

thông qua thu t toán (GTR) + I + G, với tần số ớ tính t d liệu +F , tỷ lệ biến

thiên d theo dài ủ ăn hỉnh +G và ho ph p m t phần vị trí bất biến +I ,

với hệ số tin t ng bootstrap là 1000 lần l p lại (Kumar et al., 2018).

2.4. . Ph n pháp phân t ch ph hệ c . t ichui và . pumilio

trên cộn h p n 1 2 r N toàn ph n

Hai m ơi ba (23 tr nh tự nu leotide ng hợp ủ hu i gen 18S rRNA+ S

rRN toàn phần 5.846–5.870 bp) ủ 3 hủng 7 loài (Bảng PL .6 ợ s p xếp

ăn hỉnh bằng h ơng tr nh GENEDOC .7 và hỉnh s nh bằng phần m m

Gblocks 0.91b (Castresana, 2000) ợ ph n tí h và x y dựng y phả hệ. Ngoài

hu i 18S+ S rRN ủ H. taichui Ht i-QT3-VN và H. pumilio (Hpum-HPU8-

VN), 20 hủng loài ại diện ho 5 h thu á ph n b Opisthor hi t á h :

Heterophyid e, Opisthor hiid e , ph n b E hinostom t á h : E hinostom tid e,

Fasciolidae và Philophthalmidae) và m t hu i ngoại hợp S. edwardiense h

S histosom tid e , ph n b Strigeidid .

C y phả hệ ợ x y dựng bằng h ơng tr nh MEG X s dụng ph ơng

pháp ‖t ếp ận ạ ‖ Maximum likelihood method (ML)), mô h nh th y thế

Maximum Composite Likelihood, với iểm số tốt nhất theo tiêu hí thông tin B yes

là mô hình thông qua thu t toán mô h nh th y thế Maximum Composite Likelihood,

với iểm số tốt nhất theo tiêu hí thông tin B yes là mô hình thông qua thu t toán

(GTR) + I + G, với tần số ớ tính t d liệu +F , tỷ lệ biến thiên d theo dài

ủ ăn hỉnh +G và ho ph p m t phần vị trí bất biến +I , với hệ số tin t ng

bootstrap là 1000 lần l p lại (Kumar et al., 2018).

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Hai nhóm kết quả ợ tr nh bày trong lu n án:

1. Nhóm kết quả nghiên ứu hệ gen ty thể mtDN loài Haplorchis taichui;

2. Nhóm kết quả nghiên ứu ơn vị mã hó ribosome rTU á loài SLRN

Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio.

3 1 K t quả nghiên cứu hệ gen ty thể lo i Haplorchis taichui mẫu Việt Nam

3.1.1. ấu trúc và s p xếp hệ n ty thể c sán lá ruột nhỏ Haplorchis

taichui

Ch ng tôi s dụng á mồi hung và hiệu liệt kê Bảng PL2.1 ể thự

hiện LPCR/PCR PCR oạn dài và PCR thông th ng ể thu nh n á sản ph m

ó dài khá nh u ủ mtDNA ủ loài H. taichui và giải tr nh tự sản ph m. M t

số sản ph m LPCR PCR thu ợ t mtDN s dụng á p mồi t ơng ứng ợ

tr nh bày H nh 3. .

Hình 3.1. H nh ảnh iện di sản ph m PCR ại diện t khuôn là DN t ng số ủ sán lá ru t nh H. taichui. Ghi h : M: Th ng DN L md HindIII , , 3, 5, : sản ph m PCR ủ mtDN với p mồi t ơng ứng : sản ph m PCR ủ rTU với p mồi t ơng ứng. Sản ph m số , kb rTU ủ gen S và số 5 ,0 kb mtDN ủ gen S ty thể ho mụ í h th m ịnh loài á sản ph m khá giải tr nh tự thu nh n hệ gen ty thể.

Toàn b hệ gen ty thể hoàn hỉnh ủ loài H. taichui hủng QT3, Việt N m,

Htai-QT3-VN ã ợ giải tr nh tự, h giải và ph n tí h ầy ủ iểm gen hệ

gen. iểm gen hệ gen ủ Ht i-QT3-VN ũng ợ so sánh với mtDN ủ H.

taichui hủng ủ Lào và mtDN ủ loài Metagonimus yokogawai hủng ủ Hàn

Quố do á nhóm nghiên ứu Hàn Quố thự hiện. Chi tiết mô tả và ph n tí h gen

h mtDNA ủ Haplorchis taichui ợ tr nh bày tiếp theo ủ lu n án.

Toàn b hu i nu leotide mtDNA hoàn hỉnh (mtDNA) thu nh n t SLRN

H. taichui mẫu Việt N m (Htai-QT3-VN) ó dài hính xá là 15.120 bp. Phân

tí h iểm toàn b hệ gen ty thể và ủ t ng gen ho thấy, mtDNA ủ H.

taichui Việt N m có ấu tr là vòng DNA kh p kín hứ 3 gen, gồm 12 gen mã

hóa protein (PCG), 2 gen RNA ribosome (MRG), gen RN v n huyển (tRNA)

amino acid và m t vùng DNA không mã hóa NCR . Số ăng ký Ng n hàng gen

ủ mtDN t loài H. taichui mẫu Việt N m ó mã số là MG972809.

Bảng 3.1 liệt kê thứ tự s p xếp á gen ủ mtDNA H. taichui mẫu Việt N m

so sánh với H. taichui mẫu Lào. Kí h th ớ mtDN ủ Lào ó thêm m t

nu leotide vùng NCR so với ông bố b n ầu ủ Lee et al. (2013) ông bố, ồng

th i mtDNA hứ nhi u ấu tr l p tại vùng NCR s u khi h ng tôi ph n tí h lại.

Hình 3.2 tr nh bày minh h s p xếp gen trong mtDNA dạng v ng tr n ir ul r

map) (Hình 3.2A), dạng thẳng line r arrangement Hình 3.2B và diễn giải toàn

b s p xếp hệ gen ty thể ủ H. taichui tr nh bày tại H nh PL3. Phụ lụ .

Tất ả á gen ty thể u s p xếp xuôi hi u ùng nh u và gần nh kế tiếp

nhau, khoảng á h gi o gen gi á gen là hu i nu leotide nối gi gen tr ớ với

gen li n k s u ó rất ng n, hỉ là 0–25 nucleotide (Bảng 3.1 . M t số gen n lồng

vào nh u, h ng s dụng –3 nu leotide ủ nh u ể kết th gen ho kh i ầu

gen (Bảng 3.1). Trong ấu tr mtDN ủ H. taichui không có gen atp8 và ó

ũng là tr ng v ấu tr mtDNA tất ả á loài sán d t b o gồm tất ả á

loài sán lá (Le et al., 2002).

Bảng 3.1. Vị trí ủ gen và á iểm gen trong mtDNA hoàn hỉnh ủ loài sán lá ru t nh H. taichui ( hủng QT3, Việt N m, 5.120 bp; GenBank: MG972809) và H. taichui (LA, Lào, 15.131 bp; GenBank: KF214770)

Vị tr (5’ > 3’)

ặc điểm [bp/aa(start/stop)] v các vùng gen

ối mã của tRNA

ặc điểm [bp/aa(start/stop)] v các vùng gen

Gen vùng giao gen

Chu i giao gen (bp)

ối mã của tRNA

Chu i giao gen (bp)

Htai-QT3-VN (MG972809) (Việt Nam) 645/214/(ATG/TAA)

Htai-LA (KF214770) (L o) 645/214/(ATG/TAA)

66 GTG

1110/369/(ATG/TAG) 264/87/(ATG/TAG) 1281/426/(GTG/TAA)

66 TTG 64 GAA 64 CAT

516/171/(ATG/TAG) 870/289/(ATG/TAA)

60 TAC 63 TGC 67 GTC

906/302/(GTG/TAG)

66 GTT 65 TGG 65 GAT 65 CTT

360/119/(ATG/TAG)

62 GCT 64 TCA

1542/513/(ATG/TAG)

64 TGT 979 64 GCA 749 624/201/(ATG/TAG) 459/152/(ATG/TAG)

64 TGT 979 64 GCA 747 624/201/(ATG/TAG) 459/152/(ATG/TAG)

63 GTA 66 TAG 64 TGA 68 TAA 64 TCG

1587/528/(GTG/TAA)

73 TCC

TRU1 (182) TRU2 (182)

1–645 cox3 tRNAHis 648–713 720–1829 cob 1831–2094 nad4L 2055–3335 nad4 tRNAGln 3345–3410 tRNAPhe 3414–3477 tRNAMet 3477–3540 3541–4056 atp6 4082–4951 nad2 tRNAVal 4956–5015 tRNAAla 5017–5079 tRNAAsp 5082–5148 5149–6054 nad1 tRNAAsn 6057–6122 tRNAPro 6126–6190 ttRNAIle 6187–6251 tRNALys 6255–6319 6320–6679 nad3 tRNASer1(AGN)* 6693–6754 tRNATrp 6762–6825 6830–8371 cox1 tRNAThr 8371–8434 8435–9413 rrnL (16S) tRNACys 9414–9477 9478–10226 rrnS (12S) 10227–10850 cox2 10837–11295 nad6 tRNATyr 11297–11359 tRNALeu1(CUN) 11360–11425 tRNASer2(UCN)* 11424–11487 tRNALeu2(UUR) 11496–11563 tRNAArg 11575–11639 11641–13227 nad5 tRNAGlu 13239–13311 NCR 13312–15003 Long Int seq. 1 13312–13557 13558–13739 13740–13921 Long Int seq. 2 13922–14408 14409–14595 14596–14781 14782–14961 15004–15071 15072–15120

TRU3 (183) TRU4 (183) TRU5 (183) tRNAGly unique seq.

1692 246 182 182 487 183 183 183 68 TTC 49

+2 +6 +1 –40 +9 +3 –1 0 +25 +4 +1 +2 0 +2 +3 –3 +3 0 +13 +7 +4 –1 0 0 0 0 –14 +1 0 –2 +8 +11 +1 +11 0 0 0 0 0 0 0 +42 0 0

1–645 648–713 720–1829 1831–2094 2055–3335 3345–3410 3414–3477 3477–3540 3541–4056 4082–4951 4956–5015 5017–5079 5082–5148 5149–6054 6057–6122 6126–6190 6187–6251 6255–6319 6320–6679 6693–6754 6762–6825 6830–8371 8371–8434 8435–9413 9414–9477 9478–10224 10225–10848 10835–11293 11295–11357 11358–11423 11422–11485 11494–11561 11573–11637 11639–13225 13237–13309 13310–15014 13310–13568 13569–13750 13751–13931 13932–14419 14420–14606 14607–14789 14790–14972 15015–15082 15083–15131

1705 259 182 182 487 183 183 183 68 TTC 49

+2 +6 +1 –40 +9 +3 –1 0 +25 +4 +1 +2 0 +2 +3 –3 +3 0 +13 +7 +4 –1 0 0 0 0 –14 +1 0 –2 +8 +11 +1 +11 0 0 0 0 0 0 0 +42 0 0

Ghi ch bp: b se p ir : mino id st rt: st rt: mã kh i ầu stop: mã kết th tRN : RN v n huyển Int. seq.: Chu i gi o gen +. Số nu leotide tr ớ gen k n s u ó -, Số nu leotide lồng vào gen k n s u ó *Dấu s o: RN v n huyển tRN khuyết thiếu ánh t y DHU- rm. NCR: non- oding region vùng không mã hó . Long Int seq. và : Chu i gi o gen dài và TRU: ơn vị hu i l p li n k và 3 bp m i m t hu i unique seq.: Chu i nu leotide nối gen v n huyển tRNAGly và cox3. VN: Việt N m L : Lào.

H nh 3.2. Sơ ồ hệ gen ty thể ủ sán lá ru t nh H. taichui. A. Dạng v ng tròn; B. Dạng mạ h thẳng, m v ng tại 5‘ ủ gen cox3 (Ngân hàng gen: MG972809, mẫu Việt N m và KF 770, mẫu Lào). Cá gen PCG và MRG ợ viết t t theo Boore và á ông bố tr ớ y ủ chúng tôi (Le et al., 2002; 2019; 2020b; Lee et al., 2013). Các gen tRNA v n huyển ợ ánh dấu bằng viết t t ba h ủ mino id ho m t h ái mà tRN ó v n huyển. Vùng không mã hó NCR nằm gi tRN Glu và tRNAGly b o gồm 5 ơn vị ấu tr l p (TRU1–5) và hu i nối Long Int. Seq. và xen k .

Thứ tự s p xếp dạng thẳng ủ 3 gen và vùng không mã hó , m v ng tại

cox3, ợ thể hiện nh s u: 5‘-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-nad2-VAD-

nad1-NPIK-nad3-S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-nad5-E-NCR

[TRU1-5]-G-3‘ H nh 3. B).

Vùng DN không mã hó NCR ó dài . bp mẫu Việt N m và

1.705 bp (mẫu Lào , ợ chia thành á tiểu vùng:

- Tiểu vùng hu i gi o gen dài số bp hứ ơn vị l p li n k TRU

và TRU ( dài bp m i m t hu i .

- Tiểu vùng hu i gi o gen dài số 7 bp hứ 3 ơn vị l p li n k TRU3,

TRU và TRU5 ( dài 3 bp m i m t hu i .

Sau hu i gi o gen dài số , là vị trí ủ tRN v n huyển mino id Glycine (tRNAGly), tiếp ến là hu i nu leotide ng n không mã hó bp nối tRNAGly với cox3.

Vị trí, kí h th ớ , iểm t ng gen và vùng NCR trong mtDNA ủ SLRN

H. taichui (Htai-QT3-VN) ợ liệt kê trong Bảng 3.1 và minh h Hình 3.4. Hai

gen nad4L (264 bp) và nad4 (1. 7 bp s p xếp kế tiếp và lồng vào nh u trên h i

khung gen khá nh u, trong ó gen nad4 gối lồng vào ầu 3‘ ủ gen nad4L và

chung nhau 40 nucleotide, ó ả ả h i hủng Việt N m và Lào Phụ lụ : H nh

PL3.1; PL3.2). T ơng tự, gen cox2 (624 bp) và gen nad6 (459 bp) có 14 nucleotide

ầu 3‘ ủ cox gối vào ầu 5‘ ủ nad6 (Bảng 3.1), m t tr ng hợp hiếm g p

sán lá ợ biết ho ến n y. Chênh lệ h dài khoảng 11– 3 bp gi H. taichui

ủ Việt N m Htai-QT3-VN) và H. taichui ủ Lào Htai-LA) là vùng NCR.

3.1.2. Phân t ch đặc điểm n N ri osom c ty thể

Hệ gen ty thể H. taichui ó gen mã hó ho rRN ủ ty thể, ó là gen S

rRNA (rrnS và 16S rRNA (rrnL) hay MRG th m gi làm thành phần ủ RNA

ribosome ty thể. Gen S rRN ủ mtDN H. taichui Ht i-QT3-VN ó dài

750 bp và gen S rRN ó dài 0 bp (Bảng 3.1). Vùng DN mã hó ho h i gen MRG ó vị trí nằm gi gen tRN Thr (trnT và gen cox và chu i gen ủ tRNACys (trnC) nằm xen vào gi hai gen RNA ribosome ty thể (H nh 3.2).

Mitoribosome ũng b o gồm tiểu ơn vị, trong ó hu i RN ủ S th m gi

vào tiểu ơn vị lớn và hu i RN ủ S th m gi vào tiểu ơn vị nh .

Cấu tr b h i suy diễn iển h nh ủ S rRN và S rRN H. taichui

ợ mô h nh hó và tr nh bày H nh 3.3. Cấu tr ― m‖ ó h i loại: v m uối

m i ―k p t ‖ và ― m‖ tự do không ó liên kết với ―k p t ‖. Cấu tr b

H nh 3.3 ho thấy số ― m‖ tự do gen S rRN nhi u hơn và số ―k p t ‖ ít hơn

so với gen S rRN . H nh thành ấu tr b và số l ợng ―k p t ‖ và ― m‖

ph n phối trong ấu tr gen h i gen S rRN và S rRN ủ loài SLRN H.

taichui hủng ủ Lào và Metagonimus yokogawai ủ Hàn Quố ũng t ơng tự

nh H. taichui hủng ủ Việt N m . Giống nh m i ấu tr RN , hu i

nu leotide ủ S rRN và S rRN ủ mtDN H. taichui ũng u n lại thành

ấu tr b h i tạo nên á ấu tr ―k p t ‖ h irpin stem và ― m‖ loop bảo

H nh 3.3. Mô h nh ấu tr b h i ủ gen mã hó ribosome MRG ủ hệ gen ty thể ủ sán lá ru t nh H. taichui. A. Cấu tr b h i ủ gen S rRN dạng kết v ng. B. Cấu tr b h i ủ gen 16S rRNA dạng kết v ng. Ghi h : Cá hu i nu leotide u n lại và b t p ối xứng b sung tạo nên á ấu tr ―k p tó ‖ và á ―v m‖ trong suốt hi u dài ủ gen. Mô h nh ợ x y dựng bằng h ơng tr nh RN fold với năng l ợng tối thiểu kết nối á nu leotide MFE –117.81 kcal/mol).

ảm b n v ng ủ ribosome Caburet et al., 2005).

3.1.3. Đặc điểm n N vận chuyển t N c ty thể

Hệ gen ty thể H. taichui mã hó ho tRN v n huyển mino id, dài ủ tRN biến ng t 0 bp tRN Val ến 73 bp tRN Glu), phần tRNA

vào khoảng – bp Bảng 3.1). Vùng tiếp nh n amino acid (amino-acyl acceptor

stem hứ 7 bp ít khi bp b t p b sung, th ng thấy á loài sinh v t nh n

th t vùng ―b ến ổ ‖ v ri ble loop nối vùng ― m ‖ nti odon và vùng ánh

tay T C (T C-stem , hỉ hứ bp ít khi 5 bp, hỉ ó trnC) (Hình 3.4). V ấu

tr , ngoại tr tRN ủ Serine (trnS1), hầu nh tất ả tRNA v n huyển gen

tRN ủ mtDN H. taichui u ó ấu tr b h i suy diễn ó dạng nh hình ―lá ‖ lover-leaf). Chỉ duy nhất ấu tr ủ tRN v n huyển Serine (tRNASer1 hay trnS1(AGN) hay trnS1 ủ H. taichui bị khuyết cánh tay dihydrouridine (DHU-

H nh 3. . Mô h nh ấu tr dự oán ủ tRN trong hệ gen ty thể ủ Haplorchis taichui, ợ s p xếp theo thứ tự bảng h ái ủ á mino acid mà chúng v n huyển. Amino id mà m i tRNA (trn) v n huyển ợ viết t t theo bảng m t h cái ó tại Cơ s d liệu DDBJ (https://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbj/code-e.html . Cá hu i nu leotide kiến tạo nên á ánh t y rm ủ tRN ợ mô tả ụ thể trên h nh v ủ tRNAVal (trnV . Ở mtDN ủ H. taichui, tRN v n huyển Serine (tRNASer1 hay trnS1(AGN) bị khuyêt thiếu ánh t y DHU. H i tRN v n huyển Leucine và h i tRN v n huyển Serine ợ k m thêm ối mã mà h ng t ơng tá (trnL1(CUN) và trnL2(UUR); trnS1(AGN) và trnS2(UCN)).

arm), th y vào ó là m t v m ung ó nucleotide (Hình 3.4).

3.1.4. Đặc điểm v n h n m h ở mt N c sán lá ruột nhỏ

Haplorchis taichui

Vùng không mã hóa protein (NCR) mtDN ủ SLRN H. taichui, là vùng DN giới hạn gi gen tRNA, ó là tRN Glu và tRN Gly. Vùng NCR này ó

dài . bp mẫu Việt N m và .705 bp mẫu Lào , ợ hi làm h i tiểu vùng

hứ 5 ấu tr l p li n k . Tiểu vùng thứ nhất hứ ấu tr l p là TRU và TRU bp m i m t ấu tr , á h tRN Glu b i m t hu i nu leotide g i là

― o n à 1‖ Long Int seq. ó dài là bp mẫu Việt N m và

5 bp mẫu Lào, hênh lệ h 3 bp Bảng 3.1 . Tiếp theo là ― o n à 2‖

Long Int seq. ó dài là 7 bp ả hủng H. taichui ủ Việt N m và H.

taichui ủ Lào. Tiểu vùng thứ h i hứ 3 ấu tr l p, TRU3– –5 3 bp m i m t ấu tr kế tiếp s u ó là tRN Gly á h TRU5 với hu i nu leotide bp Bảng

3.1) Phụ lụ : H nh PL3. và PL3. .

Vùng NCR ủ mtDN ủ loài SLRN Metagonimus yokogawai Hàn

Quố Bảng PL3. ) ó dài . 89 bp t ơng tự nh NCR H. taichui và ũng

ợ chia thành 2 tiểu vùng: i) Tiểu vùng hứ 3, ơn vị l p li n k ng n STR1–

3.4 (174 bp m i m t hu i và ii Tiểu vùng hứ , ơn vị l p li n k dài LTR1–2.9 (311 bp m i m t hu i . tRNAGly ịnh vị ng y s u LTR uối ùng gần

với cox3.

3.1.5. Ph n thức s ụn nucl oti và iá tr độ lệch skew) trong hệ

n ty thể

ê kiến tạo toàn b mtDN 5. 0 bp , H. taichui Việt N m s dụng A =

19,56%, T = 39,71%, G = 28,34%, C = 12,39%, với t ng thể thành phần A+T là

59,27% và G+C là 40,73%. Giá trị lệ h skew skewness +T là lệ h m –

0,3 0 và G+C là lệ h d ơng 0,3 (Bảng 3. ).

T ng số 0. nu leotide ợ s dụng ể x y dựng gen mã hó protein

trong ó ó 7,0 % , ,.0 T , 7, % G và , % C , t ng thành phần

+T là 0,0 % và G+C là 3 , %, giá trị lệ h ũng t ơng tự nh toàn b

mtDNA, giá trị skew = –0, 33 ho +T và giá trị skew 0, 03 ho G+C Bảng

3.2). Hai gen MRG (16S (rrnL và S rrnS)) s dụng số nu leotide +T ít hơn

(57,22%) so với mtDN 59,27%) và PCG (60,08%); và số nu leotide G+C nhi u

hơn ,7 % so với mtDNA (40,43%) và PCG (39,92%), do v y giá trị lệ h

Bảng 3.2. Tỷ lệ s dụng thành phần nu leotide , T, G, C và giá trị lệ h skew skewness s dụng ủ á gen mã hó protein PCG , á gen ribosome ty thể MRG và toàn b mtDNA ủ á loài SLRN trong h Heterophyid e

skew cho G+C ũng thấp hơn (Bảng 3.2).

Lo i

ộ d i (bp)

A (%)

T (%)

G (%)

C (%)

A+T (%)

AT- skew

G+C (%)

GC- skew

HETEROPHYIDAE

mtDNA

15,120

19.56

39.71

28.35

12.38

59.27

–0.340

40.73

0.392

PCG

10,164

17.02

43.06

27.99

11.92

60.08

–0.433

39.92

0.403

Haplorchis taichui (VN) (MG972809)

MRG

1,730

22.25

34.97

29.36

13.42

57.22

–0.222

42.78

0.373

mtDNA

15,131

19.56

39.67

28.34

12.42

59.23

–0.340

40.97

0.390

PCG

10,164

17.02

43.08

27.96

11.93

60.11

–0.434

39.89

0.402

Haplorchis taichui (LA) (KF214770)

MRG

1,728

22.34

35.01

29.28

13.37

57.35

–0.221

42.65

0.373

mtDNA

15,258

17.79

37.89

30.11

14.21

55.68

–0.361

44.32

0.359

PCG

10,245

15.31

40.65

29.68

14.35

55.96

–0.453

44.04

0.348

Metagonimus yokogawai (KR) (KC330755)

MRG

1,736

19.93

34.22

30.82

15.03

54.15

–0.264

45.85

0.344

Ghi ch A: Adenine; T: Thymine; G: Guanine; C: Cytosine. PCG: protein-coding gene á gen mã hó protein); MRG: mitoribosomal gene á gen ribosome ty thể mtDN : hệ gen ty thể. VN: Việt N m L : Lào KR: Hàn Quố .

Ph ơng thứ s dụng nu leotide , T, G, C ủ H. taichui hủng ủ Lào

ũng t ơng tự nh ồng loài Việt N m. Trong khi ó m t loài SLRN khá hi

khá , nh loài Metagonimus yokogawai ó tỷ lệ s dụng +T thấp hơn mtDN :

55, % PCGs: 55, % MRGs: 5 , 5% và G+C o hơn mtDN : ,3 %

PCGs: ,0 % MRGs: 5, 5% so với loài H. taichui (Bảng 3.2).

3.1.6. Phân t ch đặc điểm n m h prot in và thiên v s ụn ộ m

(codon usage)

Hệ gen ty thể Haplorchis taichui s dụng Bảng mã di truy n ty thể

―Echinoderm Mitochondrial Code‖ Bảng trong Ng n hàng gen, t ơng tự nh

á loài sán d t khá ợ nghiên ứu ho ến n y (Le et al., 2002; 2004; Lee et al.,

2013). Tất ả b mã u ợ s dụng ho á gen PCG ủ H. taichui, trong ó

b mã TG s dụng ho gen) và GTG (cho 4 gen và h i b mã TG và GTG

ợ s dụng làm b mã kh i ầu. Cá b mã TAA và TAG ợ s dụng làm các

b mã kết th á gen PCG. Ở á loài sinh v t nh n th t met zo n , b mã TG ,

thông th ng là b mã kết th , nh ng SLRN H. taichui trong nghiên ứu này và

á loài sán d t nói chung, th TG mã hóa cho amino acid Tryptophan (W) (Le et

al., 2002). Loài M. yokogawai ủ Hàn Quố ó m t số gen mã hó protein ó mã

Bảng 3.3. Thống kê số l ợng và tỷ lệ s dụng b mã kiến tạo á gen PCG trong mtDNA ủ loài H. taichui Việt N m , H. taichui Lào và loài M. yokogawai Hàn Quố , h Heterophyid e

kh i ầu và mã kết th khá với H. taichui (Phụ lụ : Bảng PL3. ).

Htai (Việt Nam)

Htai (L o)

Myok (H n Quốc)

Htai (Việt Nam)

Htai (L o)

Myok (H n Quốc)

aa

Codon

aa

Codon

No

%

No

%

No

%

No

%

No

%

No

%

Ala

Pro

Cys

Gln

Asp

Arg

Glu

Phe

Gly

Ser

His

Ile

Thr

Lys

Val

Leu

Trp

Met

Tyr

Asn

Stop

36 9 82 21 89 12 61 10 63 15 301 37 136 42 92 32 47 7 69 95 13 45 224 151 56 19 98 16 113 30 35 6

1.06 0.27 2.42 0.62 2.63 0.35 1.80 0.30 1.86 0.44 8.88 1.09 4.01 1.24 2.72 0.94 1.39 0.21 2.04 2.80 0.38 1.33 6.61 4.46 1.65 0.56 2.90 0.47 3.34 0.89 1.03 0.18

37 10 79 20 90 11 61 10 63 15 295 41 136 42 92 32 46 8 69 93 14 44 226 150 54 20 99 16 112 31 35 6

GCG GCA GCT GCC TGT TGC GAT GAC GAG GAA TTT TTC GGG GGA GGT GGC CAT CAC ATA ATT ATC AAG TTG TTA CTG CTA CTT CTC ATG AAA AAT AAC

1.09 0.30 2.33 0.59 2.66 0.33 1.80 0.30 1.86 0.44 8.71 1.21 4.01 1.24 2.72 0.95 1.36 0.24 2.04 2.75 0.41 1.30 6.67 4.43 1.59 0.59 2.92 0.47 3.31 0.92 1.03 0.18

33 20 77 19 80 33 52 18 64 13 234 88 142 29 100 29 46 14 53 88 32 56 255 73 101 8 102 27 111 24 37 9

0.97 0.59 2.25 0.56 2.34 0.97 1.52 0.53 1.87 0.38 6.85 2.58 4.16 0.85 2.93 0.85 1.35 0.41 1.55 2.58 0.94 1.64 7.47 2.14 2.96 0.23 2.99 0.79 3.25 0.70 1.08 0.26

CCG CCA CCT CCC CAG CAA CGG CGA CGT CGC AGG AGA AGT AGC TCG TCA TCT TCC ACG ACA ACT ACC GTG GTA GTT GTC TGG TGA TAT TAC TAG TAA

16 15 45 16 19 5 24 7 30 5 70 26 61 21 39 20 100 12 20 10 47 10 132 64 171 37 71 46 145 30 9 3

0.47 0.44 1.33 0.47 0.56 0.15 0.71 0.21 0.89 0.15 2.07 0.77 1.80 0.62 1.15 0.60 2.95 0.35 0.59 0.23 1.39 0.30 3.90 1.89 5.05 1.09 2.10 1.36 4.28 0.89 0.27 0.09

16 15 45 16 19 5 24 7 31 5 71 27 61 20 39 18 102 13 21 8 49 10 132 63 173 37 71 46 145 30 9 3

0.47 0.44 1.33 0.47 0.56 0.15 0.71 0.21 0.92 0.15 2.10 0.80 1.80 0.59 1.15 0.53 3.01 0.38 0.62 0.24 1.45 0.30 3.90 1.86 5.11 1.09 2.10 1.36 4.28 0.89 0.27 0.09

27 14 44 17 21 11 23 8 32 7 71 24 53 13 54 21 96 26 25 7 50 7 183 37 146 39 92 36 99 53 10 2

0.79 0.41 1.29 0.50 0.61 0.32 0.67 0.23 0.94 0.21 2.08 0.70 1.55 0.38 1.58 0.62 2.81 0.76 0.72 0.21 1.46 0.21 5.36 1.08 4.28 1.14 2.69 1.05 2.90 1.55 0.29 0.06

Ghi ch : mino id ký hiệu bằng b h theo Cơ s d liệu DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub/ref2-e.html . Ký hiệu loài: Ht i Việt N m : Haplorchis taichui, hủng QT3 ủ Việt N m trong nghiên ứu này Genb nk: MG 7 0 Ht i Lào : H. taichui ủ Lào Genb nk: KF 770 Myok: Metagonimus yokogawai ủ Hàn Quố Genb nk: KC330755 . Stop: mã kết th gen mã hó protein. Cá b mã ợ s dụng nhi u nhất Phe-TTT; Leu-TTG và ít nhất Gln-C rg-CGC Thr- C Thr- CC H. taichui và M. yokogawai ợ bôi màu.

Không ó bất k tr ng hợp nào ó b mã kết th khiếm khuyết hỉ ó T

h y T ể kết th m t gen nh th ng thấy mtDNA nhi u loài ngành Giun

tròn (Nematoda) ho sinh v t nh n th t met zo n (Le et al., 2004). M t số b mã

bất th ng khá , nh T ho TT s dụng làm b mã kh i ầu, ã ó ghi nh n

m t số loài sinh v t nh n th t và TTG ho GTT m t số loài giun tr n, ũng

không ợ t m thấy loài sán lá H. taichui ng nghiên ứu y Bảng 3.1

Bảng PL3. ).

H. taichui s dụng 0. bp ho mã hó ho 3.37 mino id ể kiến tạo

gen PCG trong ó 3 nu leotide ho b mã kết th . Số l ợng b mã không

ợ s dụng ồng u. iểm ―t ên ‖ (codon bias) s dụng b mã nh thế

này ủ mtDN loài SLRN H. taichui thể hiện việ s dụng nhi u nhất là 30

b mã ho Phenyl l nine Phe-TTT), 224 b mã cho Leucine (Leu-TTG) và 171

cho Valine (Val-GTT). S dụng ít nhất H. taichui là hỉ ó 5 b mã lần l ợt ho

Glut mine Gln-C và rginine rg-CGC và b mã ho sp r gine sn-

AAC) (Bảng 3.3). T ơng tự, SLRN H. taichui Lào và SLRN M. yokogawai Hàn

Quố s dụng b mã nhi u nhất ho Phe-TTT và Leu-TTG và ít nhất ho Gln-

C rg-CGC. Ngoài r , M. yokogawai n s dụng á b mã ít nhất cho Thr-

C và Thr-ACC (Bảng 3.3).

3.1.7. ho n cách i truy n i plorchis t ichui và các loài sán lá

hác ở họ t rophyi và pisthorchii trên cộn h p mino ci c

ba gen (cob+nad1+cox1)

H i m ơi b (23) hu i nu leotide ng hợp 3 gen PCG gồm

cob+nad1+cox t 3 hủng 16 loài sán lá thu ph n b Opisthor hi t (liệt kê

Bảng PL2.2 ợ vào h ơng tr nh GENEDOC2.7, rồi huyển i s ng amino

id suy diễn bằng bảng mã di truy n ty thể và s p xếp so sánh ối hiếu

lignment ể ăn hỉnh h n l khối liên kết uối ùng bằng h ơng tr nh

MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016).

T khối ăn hỉnh uối ùng ủ 3 hủng loài ó, 3 hu i mino id

ng hợp ủ cob+nad1+cox1 (~1177–1186 aa) ủ 3 hủng 7 loài thu Ph n b

Opisthor hi t gồm h i h là Heterophyidae và Opisthorchiidae, ợ ợ tính

toán khoảng á h di truy n p irwise geneti dist n e KCDT theo thông số ó

trong h ơng tr nh MEG 7.0.

Bảng 3. . Tính toán khoảng á h di truy n theo tỷ lệ s i khá % s dụng dài hu i mino id ng hợp ủ 3 gen cob+nad1+cox1 gi hủng nghiên ứu Htai-QT3-VN và Sfal-QN2-VN ủ Việt N m với á hủng loài trong h Heterophyid e và Opisthorchiidae

Chủng lo i

11 12

10

8

2

6

7

9

1

3

4

5

1 Htai-LA-KF214770

0.3

2 Htai-QT3-VN

3 Myok-KR-KC330755

16.8 17.2

27.6

Sfal-QN2-VN

26.3 26.6

5 Csin-Amur-RU-FJ381664

21.8

21.1 21.5

31.8

6 Csin-GD-CN-JF729303

22.1

0.3

21.3 21.6

31.9

7 Csin-KR-JF729304

22.1

0.2

0.3

21.4 21.7

32.0

8 Csin-ND-VN

22.0

0.8

0.4

21.3 21.6

31.8

9 Mori-HLJ-CN-KT239342

21.7

9.4

9.1

9.4

21.0 21.4

31.6

10 Ofel-UstTula-RU-EU921260

22.3

9.3

9.4

9.0

9.2 10.2

20.6 20.9

31.2

11 Oviv-BD1-VN

23.4

8.2 12.7

21.9 22.1

32.0 11.4 11.8 11.7 11.6

12 Oviv-KK-TH

23.5

8.2 12.8 0.5

22.0 22.1

31.9 11.4 11.8 11.7 11.6

13 Oviv-LA-JF739555

23.3

8.1 12.7 0.6 0.6

21.8 22.0

31.8 11.4 11.8 11.7 11.6

Ghi chú: 1. Htai-LA-KF214770: Haplorchis taichui Lào 2. Htai-QT3-VN: H. taichui Việt N m ; 3. Myok-KR- KC330755: Metagonimus yokogawai Hàn Quố ; 4. Sfal-QN2-VN: Stellantchasmus falcatus (Việt N m ; 5. Csin-Amur- RU-FJ381664: Clonorchis sinensis (Nga); 6. Csin-GD-CN-JF729303: C. sinensis Trung Quố ; 7. Csin-KR-JF729304: C. sinensis Hàn Quố ; 8. Csin-ND-VN: C. sinensis Việt N m ; 9. Mori-HLJ-CN-KT239342: Metorchis orientalis (Trung Quố ; 10. Ofel-UstTula-RU-EU921260: Opisthorchis felineus (Nga); 11. Oviv-BD1-VN: Opisthorchis viverrini Việt N m ; 12. Oviv-KK-TH: O. viverrini Thái L n ; 13. Oviv-LA-JF739555: O. viverrini Lào . Số ăng kí Ng n hàng gen nếu ó uối hu i. Số liệu KCDT gi loài H. taichui và S. falcatus so với á loài khá ợ bôi m và óng khung d . Phần bôi khung m là biểu thị KCDT n i loài ủ á hủng trong ùng m t loài.

M i b hủng 7 loài so sánh b o gồm hủng ủ 3 loài SLRN, trong ó

có loài Haplorchis taichui hủng Ht i-QT3-VN ủ Việt N m và m t hủng th m

hiếu ủ Lào, Htai-LA-KF214770), loài Stellantchasmus falcatus hủng Sfal-

QN2-VN ủ Việt N m) và m t loài SLRN Metagonimus yokogawai ủ Hàn Quố

( hủng Myok-KR-KC330755) thu h Heterophyid e. Chín hủng n lại là loài

thu h Opisthorchiidae, gồm loài sán lá g n nh ủ Việt N m, Clonorchis

sinensis và Opisthorchis viverrini (Csin-ND-VN và Oviv-BD1-VN , loài ủ Ng ,

C. sinensis và O. felineus (Csin- mur-RU-FJ3 và Ofel-UstTula-RU-

EU921260 , hủng ủ loài C. sinensis và Metorchis orientalis ủ Trung Quố

(Csin-GD-CN-JF7 303 và Mori-HLJ-CN-KT239342 , m t hủng ủ loài C.

sinensis ủ Hàn Quố Csin-KR-JF729304 , m t hủng ủ loài O. viverrini ủ

Thái Lan (Oviv-KK-TH và ủ Lào Oviv-LA-JF739555) (Bảng 3.4).

Kết quả ho thấy, s i khá gi á hủng ùng loài H. taichui gi Htai-

QT3-VN ủ Việt N m so với hủng ó nguồn gố tại Lào KF 770 hỉ là 0,3%

gi á hủng ủ Việt N m, Trung Quố và Hàn Quố trong ùng loài C. sinensis

là 0,2–0, %. Cá hủng nộ loà ủ O. viverrini ủ Việt N m, Thái L n và Lào và

gi loài O. viverrini với ngoại loài O. felineus ủ Ng (Ofel-UstTula-RU-

EU921260) trong cùng hi Opisthorchis ũng rất thấp, hỉ là 0,5–0,6% (Bảng 3.4).

Trong khi ó, khoảng á h di truy n n oạ loà gi loài H. taichui ủ Việt

Nam (Htai-QT3-VN với á loài SLRN khá ùng h Heterophyid e và khá h

(Opisthorchiidae) là rất o, t 17,2–26,6%; và gi loài SLRN S. falcatus ủ Việt

Nam (Sfal-QN2-VN với á loài khá ả h i h Heterophyid e và

Opisthorchiidae là o nhất ạt 26,3–32,0% (Bảng 3.4).

3.1. . ho n cách i truy n i plorchis t ichui và các loài sán lá

hác ở họ t rophyi và pisthorchii trên cộn h p mino ci c

12 PCG

Chín hu i nu leotide ng hợp gen PCG ủ hủng loài thu h

Heterophyid e và h Opisthor hiid e, gồm loài Haplorchis taichui hủng , loài

Metagonimus yokogawai hủng , loài Clonorchis sinensis 3 hủng , loài

Metorchis orientalis hủng , loài Opisthorchis felineus hủng và loài

Opisthorchis viverrini hủng thu ph n b Opisthor hi t liệt kê Bảng

PL2.2) ợ vào h ơng tr nh GENEDOC2.7, rồi huyển i s ng mino id

suy diễn bằng bảng mã di truy n ty thể và s p xếp so sánh ối hiếu lignment ể

ăn hỉnh h n l khối liên kết uối ùng (~2962–2974 aa) bằng h ơng tr nh

MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016). Khoảng á h di truy n ợ ợ tính toán theo

thông số (p-distance) ó trong h ơng tr nh MEG 7.0.

Cá hủng loài so sánh ủ h Heterophyidae b o gồm 3 hủng ủ loài

SLRN, trong ó ó loài Haplorchis taichui hủng Ht i-QT3-VN-MG972809 ủ

Việt N m và Ht i-L -KF 770 ủ Lào và loài SLRN Metagonimus yokogawai

ủ Hàn Quố hủng Myok-KR-KC330755). Cá hủng loài so sánh ủ h

Opisthorchiidae, gồm loài Clonorchis sinensis (Csin- mur-RU-FJ3 ủ Ng

Csin-GD-CN-JF7 303 ủ Trung Quố và Csin-KR-JF729304 ủ Hàn Quố ,

loài Metorchis orientalis (Mori-HLJ-CN-KT239342 ủ Trung Quố , loài

Opisthorchis felineus (Ofel-UstTula-RU-EU921260 ủ Ng và loài Opisthorchis

Bảng 3.5. Tính toán khoảng á h di truy n theo tỷ lệ s i khá % s dụng dài hu i mino id ng hợp ủ gen mã hó protein gi hủng nghiên ứu Htai-QT3-VN với á hủng loài trong h Heterophyid e và Opisthorchiidae

viverrini (Oviv-LA-JF739555 ủ Lào) (Bảng 3.5).

Chủng lo i

1

2

3

4

5

6

7

8

1 Htai-QT3-VN-MG972809

2 Htai-LA-KF214770

0.46

3 Myok-KR-KC330755

27.06

26.83

4 Csin-Amur-RU-FJ381664

31.18

31.47

31.31

5 Csin-GD-CN-JF729303

31.24

31.57

0.37

31.37

6 Csin-KR-JF729304

31.18

31.51

0.37

0.40

31.31

7 Mori-HLJ-CN-KT239342

31.41

31.44

13.31

13.45

13.48

31.57

8 Ofel-UstTula-RU-EU921260

30.98

32.17

12.58

12.75

12.62

13.38

31.21

9 Oviv-LA-JF739555

31.47

32.57

14.58

14.77

14.64

13.41

15.14

31.64 Ghi chú: 1. Htai-QT3-VN-MG972809: Haplorchis taichui Việt N m ; 2. Htai-LA-KF214770: H. taichui Lào 3. Myok-KR-KC330755: Metagonimus yokogawai Hàn Quố ; 4. Csin-Amur-RU-FJ381664: Clonorchis sinensis (Nga); 5. Csin-GD-CN-JF729303: C. sinensis Trung Quố ; 6. Csin-KR-JF729304: C. sinensis Hàn Quốc); 7. Mori-HLJ-CN- KT239342: Metorchis orientalis Trung Quố ; 8. Ofel-UstTula-RU-EU921260: Opisthorchis felineus (Nga); 9. Oviv- LA-JF739555: Opisthorchis viverrini Lào . Số ăng kí Ng n hàng gen ghi uối m i hu i. Số liệu KCDT gi loài H. taichui so với á loài khá ợ bôi m h số. Phần bôi khung là biểu thị KCDT n i loài ủ á hủng trong ùng m t loài Haplorchis taichui gi hủng ho Clonorchis sinensis gi 3 hủng .

Kết quả tính toán KCDT ho thấy, sai khác nộ loà gi á hủng ùng loài

H. taichui gi Htai-QT3-VN ủ Việt N m so với hủng Ht i-L -KF 770 ủ

Lào hỉ là 0, % gi á hủng ủ Nga, Trung Quố và Hàn Quố trong ùng

loài Clonorchis sinensis là 0,37–0,4%.

Trong khi ó, khoảng cách di truy n n oạ loà gi H. taichui ủ Việt N m

(Htai-QT3-VN) và H. taichui ủ Lào (Htai-LA-KF214770) với loài SLRN

Metagonimus yokogawai ủ Hàn Quố Myok-KR-KC330755) ùng h

Heterophyidae là , 3–27,06%; và với á loài Clonorchis sinensis, Metorchis

orientalis, O. felineus và O. viverrini khá h (Opisthorchiidae) là rất o, 31,21–

31,64% (Bảng 3.5).

3.1.9. Phân t ch ph hệ sán lá ruột nhỏ trên chu i mino ci cộn

h p c n m h prot in co n 1 cox1

Hình 3.5 tr nh bày y phả hệ dự trên hu i mino id ng hợp (~1177–

1186 aa) ợ mã hó t 3 gen cob+nad1+cox1 thể hiện mối qu n hệ v loài ủ

3 hủng loài sán lá liệt kê Bảng PL .2). Cá hủng loài nghiên ứu gồm 2 h

Heterophyidae và Opisthorchiidae thu ph n b Opisthor hi t , h

E hinostom tid e và Fasciolidae (thu ph n b E hinostom t ) và m t loài sán

máng (Trichobilharzia regenti) thu h Schistosomatidae làm nhóm ngoại hợp.

Trong số ó, ó hủng SLRN H. taichui (Htai-QT3-VN) và S. falcatus (Sfal-QN2-

VN) ủ Việt N m trong nghiên ứu này và hủng ại diện ho á loài sán lá

th m hiếu ã ợ xá ịnh hính xá v loài thu nh n t Ng n hàng gen ho t

á ông bố tr ớ y Le et al., 2001; Shekhovtsov et al., 2010; Cai et al., 2012;

Lee et al., 2013; Liu et al., 2014; Ma et al., 2016).

Kết quả thể hiện trên y phả hệ Hình 3.5 ho thấy, 3 hủng sán lá ủ

Việt N m và thế giới s p xếp vào 5 nhóm hính:

+ Nhóm thứ nhất h Heterophyidae) gồm hủng thu 3 loài, trong ó ó

hủng ủ Việt N m là H. taichui (Htai-QT3-VN) và S. falcatus (Sfal-QN2-VN),

ùng với loài th m hiếu H. taichui ủ Lào và loài M. yokogawai ủ Hàn Quố ó

hệ gen ty thể ã ợ ăng kí trong Ng n hàng gen (Lee et al., 2013). Nhóm H.

taichui và M. yokogawai vị trí ― n ‖ ― m‖ , n S. falcatus vị trí ―lệ

‖ với nhóm h Opisthorchiidae

+ Nhóm thứ hai h Opisthorchiidae) gồm á hủng ủ loài C. sinensis,

O. viverrini, O. felineus và Metorchis orientalis có mtDNA ã ợ nghiên ứu,

ông bố ho ăng ký trong Ng n hàng gen (Shekhovtsov et al., 2010; Na et al.,

2016).

H i nhóm ủ h i h Opisthorchiidae và Heterophyidae nằm trong m t

nhánh, ó mối qu n hệ ph n loại thu vị trí ― n ‖ ‖ m‖ monophyleti

position gần nh u, thu Liên h Opisthor hioide , ph n b Opisthorchiata, ã

ợ khẳng ịnh trong m t số ông bố gần y Thaenkham et al., 2011; Le et al.,

Hình 3.5. C y phả hệ xá ịnh mối qu n hệ v loài dự trên ph n tí h hu i mino id suy diễn ng hợp t cob+nad1+cox1 gi á hủng SLRN loài H. taichui và S. falcatus ủ Việt N m dấu h nh thoi và á loài sán lá khá ại diện 5 h Opisthor hiid e, Heterophyid e, E hinostom tid e, F s iolid e và h S histosom tid e ngoại hợp . Ghi chú: C y phả hệ ợ x y dựng bằng h ơng tr nh MEG 7.0, ph ơng pháp “kết n l ền kề” (Neighbor-joining , với hệ số tin y bootstr p là 000 lần l p lại Kumar et al., 2016 . Dấu h nh thoi hỉ h i loài H. taichui và S. falcatus ủ Việt N m thu ối t ợng nghiên ứu. Ký hiệu quố gi theo bảng qui ịnh quố tế (http://www.nationsonline.org/oneworld/country_code_list.htm , ví dụ VN: Việt N m TH: Thái L n CN: Trung Quố . Ký hiệu hủng trong ngo lấy t tên ị ph ơng ph n l p nếu ó và ký hiệu loài ợ liệt kê tại Bảng PL2.2. Hệ số tin t ng bootstr p ợ ghi ng y tại m i nhóm ph n nhánh. Số ăng ký Ng n hàng gen ợ t uối hu i ho ó là á hủng thu nghiên ứu này. Vạ h ng ng uối h nh 0.05 biểu thị s i khá nu leotide 5 00 nu leotide m i nhánh.

2017) H nh 3.5 .

+ Nhóm thứ b h Echinostomatidae) gồm 3 loài E. caproni, E. paraensei

và Hypoderaeum conoideum) có mtDNA ã ông bố ho ăng ký trong Ng n hàng

gen (Yang et al., 2015a).

+ Nhóm thứ t h Fasciolidae) gồm 5 loài Fasciolopsis buski, F. hepatica,

F. gigantica, F. jacksoni và Fascioloides magna) có mtDNA ã ông bố ho ăng

ký trong Ngân hàng gen (Le et al., 2001; Liu et al., 2014; Ma et al., 2016; 2017).

H i nhóm ủ h i h Echinostomatidae và Fasciolidae nằm trong m t

nhánh, ó mối qu n hệ ph n loại thu vị trí ― n ‖ ‖ m‖ monophyleti

position gần nh u, thu Liên h E hinostom toide , ph n b Echinostomata (Cai

et al., 2012; Liu et al., 2014; Ma et al., 2016; Yang et al., 2015a; Le et al., 2001;

2020b) H nh 3.5).

+ Nhóm thứ năm h Schistosomatidae là nhóm ngoại hợp, hỉ h n m t

loài (Trichobilharzia regenti) làm ại diện trong ph n tí h phả hệ.

Ph n tí h phả hệ ủ m t số loài sán lá ủ Việt N m và thế giới thể hiện

trên y phả hệ Hình 3.5 dự trên ph n tí h hu i mino id ng hợp suy diễn

ủ 3 gen PCG (cob+nad1+cox1) ho thấy, trong mẫu nghiên ứu th mẫu Htai-

QT3-VN ợ xá ịnh hính xá thu loài Haplorchis tachui và mẫu Sf l-QN2-

VN thu loài Stellantchasmus falcatus, ó vị trí ph n loại thu h Heterophyid e

Liên h Opisthor hioide , ph n b Opisthor hi t và Lớp Trem tod .

Cá loài Haplorchis spp. luôn luôn nhóm h p ùng nhóm trong h

Heterophyid e và luôn luôn xếp vị trí ― n ‖ h y vị trí ― m‖ sister

monophyly với nhóm ủ á loài Clonorchis spp. và Opisthorchis spp. thu h

Opisthorchiidae, nh nhi u ông bố ã khẳng ịnh qu n hệ v loài và vị trí ph n

loại ủ h ng (Olson et al., 2003; Thaenkham et al., 2011; Pérez-Ponce de León,

Hernández-Mena, 2019).

3.1.10. Phân t ch ph hệ sán lá ruột nhỏ trên chu i mino ci cộn

h p c toàn ộ 12 n m h prot in

H nh 3.6 là y phả hệ ợ x y dựng t kết quả ph n tí h so sánh 3

hủng 32 loài sán lá liệt kê Bảng PL2.3 thu á h Cy lo oelid e

Echinochasmidae; Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae;

Gastrothylacidae; Heterophyidae Him sthlid e Opisthor hiid e và

P r mphistom tid e, trong ó ó 3 hủng ủ loài Haplorchis taichui và

Metagonimus yokogawai và m t hủng ủ loài Schistosoma haematobium (h

Hình 3.6. C y phả hệ xá ịnh mối qu n hệ loài và phả hệ dự trên ph n tí h hu i mino id suy diễn ng hợp t 12 PCG ủ ty thể. Ghi ch Mối qu n hệ v loài ợ xá ịnh gi á hủng SLRN ủ Việt Nam dấu h nh thoi h Heterophyidae và cá loài sán lá khá (h Cyclocoelidae; Echinochasmidae; Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae; Gastrothylacidae; Himasthlidae; Opisthorchiidae; Paramphistomatidae) và h S histosom tid e ngoại hợp . C y phả hệ ợ x y dựng bằng h ơng tr nh MEG X, ph ơng pháp “t ếp ận ạ ” M ximum likelihood, ML , với hệ số tin t ng bootstrap là 000 lần l p lại Kum r et al., 0 . Dấu h nh thoi hỉ h i loài H. taichui ủ Việt N m và SLRN thu ối t ợng nghiên ứu óng khung bên trong . Nhóm ủ Ph n b Opisthor hi t và Liên h Opisthor hioide ợ óng khung ngoài. Mũi tên hỉ 3 n t hính ph n ịnh á Liên h Opisthor hioide , E hinostom toide và P r mphistomoide . Ở m i hu i, b t ầu là tên loài toàn b tên , tiếp theo là ký hiệu hủng trong ngo lấy t tên ị ph ơng ph n l p nếu ó và số ăng ký Ng n hàng gen nếu ó , liệt kê tại Bảng PL2.3. Hệ số tin t ng bootstr p ợ ghi ng y tại m i nhóm ph n nhánh. Số ăng ký Ng n hàng gen ợ t uối hu i. Vạ h ng ng uối h nh 0. biểu thị s i khá nu leotide 00 nu leotide m i nhánh.

Schistosomatidae) làm nhóm ngoại hợp.

Kết quả H nh 3.6 ho thấy, ngoài nhóm ngoại hợp Schistosoma

haematobium, h S histosom tid e , 0 h th m gi ph n tí h phả hệ ợ ph n

hi vào 3 nhóm lớn, thu 3 liên h E hinostom toide , Opisthor hioide và

P r mphistom toide và ũng là ại diện ủ 3 ph n b th ơng ứng là

E hinostom t , Opisthor hi t và Prono eph l t .

Cụ thể:

i Nhóm thứ nhất liên h E hinostom toide ph n b E hinostom t : gồm

5 h , trong ó ó:

+ H E hinostom tid e ó hủng loài th m gi ó nguồn gố t nhi u

quố gi trên thế giới, ó là Hypoderaeum conoideum-(Hubei)-KM111525 (China);

Echinostoma sp.-JM2019-MH212284; Artyfechinostomum sufrartyfe-(Shill)-

KY548763 (India); Echinostoma caproni-(SEMEA)-AP017706 (Egypt);

Echinostoma paraensei- UNM -KT00 005 và Echinostoma miyagawai-(Hunan)-

MN116740 (China) (Yang et al., 2015a; Fu et al., 2019);

+ H F s iolid e gồm 7 hủng loài ó nguồn gố t nhi u quố gi trên thế

giới ó là Fasciolopsis buski-(Jangxi)-KX169163 (China); Fascioloides magna-

(Koko)-KU060148 (Czek); Fasciola jacksoni-(Madu)-KX787886 (Sri Lanka);

Fasciola hepatica-(Oregon)-AP017707 (United States); Fasciola hepatica-(GL)-

AF216697 (Australia); Fasciola sp. hybrid - GHL - KF5 33 3 Chin và Fasciola

gigantica-(GX)-KF543342 (China) (Cai et al., 2012; Liu et al., 2014; Ma et al.,

2016; Yang et al., 2015a);

+ H E hino h smid e ó hủng loài là Echinochasmus japonicus-(PT)-

KP844722 (Vietnam) t Việt N m (Le et al., 2016);

+ H Him sthlid e ó hủng loài là Acanthoparyphium sp.-(WAK2018)-

MG792058 (Kuwait);

+ H Cy lo oelid e ó hủng loài là Uvitellina sp.-(SSS2019)-

MK227160 (Pakistan) và Tracheophilus cymbius-(HLJ)-MK355447 (China)

(Suleman et al., 2019a; Li et al., 2020);

ii Nhóm thứ h i liên h Opisthorchioidea ph n b Opisthorchiata ó 7

loài hủng trong 2 h , trong ó á loài SLRN thu ối t ợng nghiên ứu:

+ H Heterophyid e gồm loài 3 hủng: Haplorchis taichui-(QT3)-Vietnam-

MG972809; Haplorchis taichui- L -L os-KF 770 và Metagonimus

yokogawai-Korea-KC330755 (Lee et al., 2013);

+ H Opisthor hiid e gồm loài hủng: Metorchis orientalis-(HLJ)-

China-KT239342; Opisthorchis viverrini-Laos-JF739555; Opisthorchis felineus-

(UstTula)-Russia-EU921260; Clonorchis sinensis-(Amur)-Russia-FJ381664;

Clonorchis sinensis-(GD)-China-JF729303; Clonorchis sinensis-Korea-JF729304

(Shekhovtsov et al., 2010; Cai et al., 2012; Liu et al., 2014).

iii Nhóm thứ b liên h P r mphistomoide ph n b Prono eph l t gồm

h P r mphistom tid e và G strothyl id e và 7 hủng 7 loài trong h ó:

+ H P r mphistom tid e gồm á loài Explanatum explanatum-(Hunan)-

China-KT198989; Paramphistomum leydeni-(Nimu)-China-KP341657;

Paramphistomum cervi- QH -Chin -KF 75773 và Calicophoron

microbothrioides-(Hunan)-China-KR337555 (Yan et al., 2013; Ma et al., 2015).

+ H G strothyl id e gồm á loài Gastrothylax crumenifer-(Hubei)-China-

KM400624; Fischoederius elongatus- Hubei -Chin -KM3 73 và Fischoederius

cobboldi-China-KX169164 (Yang et al., 2015b).

+ Ngoài r , s p xếp trong y phả hệ n ó h G strodi id e, thự sự không

ph n ịnh vào liên h ph n b nào mà hỉ ợ t tạm th i vào nhóm d nh pháp

ó vị trí h h h n, ng xem x t Digenea: icertae sedis) (H nh 3.6).

3.2. K t quả nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome lo i Haplorchis taichui v lo i

H. pumilio mẫu Việt Nam

3.2.1. ấu trúc và s p xếp n c đ n v m h ri osom c Haplorchis

t ichui và . pumilio

Ch ng tôi s dụng á mồi hung liệt kê Bảng PL .4 ể thự hiện

LPCR PCR PCR oạn dài và PCR thông th ng ể thu nh n á sản ph m ó

dài khá nh u ủ rTU ủ t ng loài H. taichui và H. pumilio và giải tr nh tự sản

ph m thu ợ . M t số sản ph m LPCR/PCR ại diện thu ợ s dụng á p

mồi t ơng ứng ợ tr nh bày H nh 3.7. Thành phần phản ứng, thự hiện PCR và

Hình 3.7. H nh ảnh iện di sản ph m LPCR PCR ủ rTU thu ợ t sán lá ru t nh H. taichui và H. pumilio. Ghi h : M: Th ng DN L md HindIII , , , : sản ph m LPCR PCR ủ rTU t khuôn H. taichui (Htai); 3, 5, 7, 8, 9: sản ph m LPCR PCR ủ rTU t khuôn H. pumilio (Hpum). Thông tin hu i mồi ó tại Bảng PL2.4. Tên p mồi s dụng và dài ủ m i sản ph m t ơng ứng ợ ghi trên h nh k m sản ph m.

kiểm tr sản ph m ợ tr nh bày Phụ lụ II.

Sau khi giải tr nh tự và x lý hu i thô, h ng tôi thu ợ hu i nucleotide

uối ùng ủ toàn b phần mã hó rTU (coding rDNA) ủ rTU t ầu t n ùng

5‘ ủ gen 18S rRNA ến ầu t n ùng 3‘ ủ gen 28S rRNA ủ m i loài (H nh

3.8 Bảng 3.6). Chu i nu leotide ủ vùng bản l IGS không thu ợ . H nh 3.

ũng tr nh bày ấu tr s p xếp gen vùng gi o gen ủ toàn b phần mã hó rTU

ủ h i loài SLRN ủ h Heterophyid e ã ông bố ho trong Ng n hàng gen

(Sato et al., 2010).

Toàn phần ph n oạn mã hó rTU tạm ký hiệu là rTU* b o gồm:

i Chu i nu leotide ủ toàn phần mã hó ribosome ủ loài H. taichui (Htai-

QT3-VN ó dài là 7. bp, riêng vùng IGS h thu nh n ợ

ii) Chu i nu leotide ủ phần mã hó ribosome ủ loài H. pumilio (Hpum-

HPU8-VN ó dài là 7. bp, n thiếu vùng IGS h thu nh n ợ .

Tr nh tự thu ợ trong nghiên ứu này là toàn b phần mã hó ribosome

(coding region) ủ rTU ủ ả h i loài H. taichui và H. pumilio b sung ho d

liệu mà tr ớ y mới ông bố m t phần ủ h ng tôi (Le et al., 2017). Trong

phần rTU* này ủ ả h i loài Haplorchis ó 5 ph n oạn của 3 gen rRNA và 2

vùng gi o gen ITS ã ợ xá ịnh, bao gồm: Toàn b gen S rRN , toàn b

vùng gi o gen ITS- , toàn b gen 5. S rRN , toàn b vùng gi o gen ITS- và toàn

b gen S rRN H nh 3.8).

H nh 3.8. Tr t tự s p xếp gen ủ phần mã hó ủ ơn vị mã hó ribosome sán lá ru t nh h Heterophyid e gồm Haplorchis taichui Việt N m , H. pumilio (Việt N m , Cryptocotyle lingua (Nga) và Euryhelmis costaricensis (Nh t Bản . TRU: t ndem repe t unit: á ấu tr hu i l p li n k , H. taichui ó 3 TRU TRU –3 , H. pumilio ó 5 TRU TRU –5) và Eu. costaricensis ó ,5 TRU TRU –2.5). Loài Cryptocotyle lingua không hứ TRU ITS- và ITS-2. H nh 3. minh h tr t tự s p xếp và ấu tr l p TRU t m thấy trong vùng

gi o gen ITS ITS- ho ITS- rTU ủ á loài H. taichui Việt N m , H.

pumilio Việt N m và Euryhelmis costaricensis Nh t Bản riêng loài

Cryptocotyle lingua không hứ bất ứ TRU nào ITS- ho ITS- . Diễn giải s p

xếp á gen và vùng gi o gen trong rTU và á ấu tr l p ó trong ITS- ủ loài

H. pumilio và ấu tr l p ó trong ITS- ủ loài H. taichui ợ tr nh bày H nh

PL3.3 và PL3. Phụ lụ .

3.2.2. Độ ài n rRNA và vùng giao gen ở đ n v m h ri osom c

các loài Haplorchis t ichui và aplorchis pumilio

Dự trên m t số công bố tr ớ y v ấu tr gen và s p xếp gen ủ rTU

của m t số loài sán d t (Briscoe et al., 2016; Su et al., 2018; Le et al., 2017; 2020a)

và d liệu rTU ã ợc phân tích công bố ó trong Ngân hàng gen, h ng tôi ã xá

ịnh ợ kí h th ớc và vị trí của t ng gen vùng gi o gen trong phần rTU* của

Bảng 3.6. Vị trí gen và vùng gi o gen ủ ơn vị mã hó ribosome ủ á loài sán lá ru t nh ủ Việt N m, Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN, 7. bp và H. pumilio (Hpum-HPU8-VN, 7.416 bp)

t ng loài Haplorchis.

Cấu tr c lặp

Ghi chú

Vị tr (5'->3')

K ch thƣ c (bp)

Vùng giao gen (bp)

GenBank: KX815126

1–1992 1993–2779 2790–2949 2950–3393 3071–3155 3156–3238 3239–3323 3394–7268 //

TRU1 TRU2 TRU3

1992 797 160 444 85 83 85 3875 //

0 0 0 +121 0 0 +70

Gen rRNA Không ó ấu tr l p Gen rRNA bp ến TRU1 Cấu tr l p li n k Cấu tr l p li n k Cấu tr l p li n k Gen rRNA Ch hoàn thành

GenBank: KX815125

1–1992 1993–3098 2059–2194 2195–2330 2331–2466 2467–2582 2590–2705 2706–3098 3099–3258 3259–3546 3547–7416 //

1992 1106 136 136 136 116 116 393 160 280 3870 //

Gen rRNA bp ến TRU1 Cấu tr l p li n k Cấu tr l p li n k Cấu tr l p li n k Cấu tr l p li n k Cấu tr l p li n k Chu i nối Gen rRNA Không ó ấu tr l p Gen rRNA Ch hoàn thành

Gen/ Vùng giao gen H. taichui 7.268 bp 18S ITS1 5.8S ITS2 28S IGS H. pumilio 7.416 bp 18S ITS1 5.8S ITS2 28S IGS

TRU1 TRU2 TRU3 TRU4 TRU5 Int seq.

0 +66 0 0 0 +7 0 0 0 0

Ghi ch TRU: t ndem repe t unit á ấu tr l p li n k .

Vị trí gen và vùng giao gen ủ ơn vị mã hó ribosome ủ á loài SLRN

ủ Việt N m, Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN, 7.268 bp), H. pumilio (Hpum-

HPU8-VN, 7.416 bp) bao gồm toàn b vùng DN mã hó ho S rRN , vùng

gi o gen ITS , vùng gen 5. S rRN , vùng gi o gen ITS và toàn b vùng gen S

rRNA ã ợ xá ịnh Bảng 3.6).

Bảng 3.6 cho thấy, á gen S rRN và 5. S rRN ủa cả loài u ó

dài hoàn toàn giống nhau, cụ thể là .992 bp gen 18S rRNA, 160 bp gen 5.8S

rRNA. Tuy nhiên, gen S rRN ủ loài ó dài khá nh u, 3. 75 bp loài H.

taichui và 3. 70 bp loài H. pumilio. M t khá , dài vùng giao gen ITS m i

loài ũng khá nh u và ấu tr hu i nu leotide trong m i vùng gi o gen ITS h i

loài ũng khá nh u.

Cụ thể:

- Vùng giao gen ITS-1 loài H. taichui ó dài là 7 7 bp, không hứ ấu

tr l p li n k t ndem repe t unit , trong khi ó ITS- loài H. pumilio ó dài

. 0 bp hứ 5 ấu tr l p li n k (TRU1–5 , trong ó 3 TRU TRU –3 ó

dài 3 bp m i m t ấu tr và TRU TRU –5 ó dài bp m i m t ấu

tr H nh 3. Bảng 3. H nh PL3.3; Hình PL3.4 Phụ lụ ).

- Vùng giao gen ITS-2 loài H. taichui ó dài là bp hứ 3 ấu tr

l p li n k TRU , trong ó TRU TRU và TRU3 ó dài 5 bp m i m t ấu

tr , n TRU là 3 bp. Trong khi ó, ITS- loài H. pumilio ó dài 0 bp

không hứ bất k ấu tr l p nào H nh 3.8 Bảng 3.6; H nh PL3.3; H nh

PL3. Phụ lụ .

- Vùng bản l IGS nằm ầu cuối 3‘ ủa rTU gi S ủ rTU tr ớ và

18S ủ rTU s u ả h i loài u h xá ịnh ợ .

3.2.3. Đặc điểm cấu trúc ậc h i gen rRNA (5.8S, 18S, 28S rRNA)

3.2.3.1 ểm ấ t bậ n S RN

Chu i nu leotide gen 5. S rRN ủ á loài SLRN ó dài là 0 bp và

gấp kh tạo nên ấu tr b h i H nh 3.9). Mô h nh ấu tr b h i ợ x y

dựng bằng h ơng tr nh RN fold ó tại: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-

H nh 3. . Mô h nh ấu tr b h i ủ gen 5. S rRN ribosome ủ loài sán lá ru t nh . Ghi h : . Haplorchis taichui. B. Haplorchis pumilio. C. Cryptocotyle lingua. D. Euryhelmis costaricensis. ng ph n á h hỉ r phần ấu tr , trong ó m t phần hoàn toàn ồng nhất, phần ki ủ Eu. costaricensis ó sự khá biệt với 3 loài n lại mũi tên hỉ dẫn . Mô h nh x y dựng bằng h ơng tr nh RN fold dạng kết phẳng, với năng l ợng tối thiểu kết nối á nu leotide (MFE = –54.20 kcal/mol).

bin/RNAWebSuite/ (Gruber et al., 2008).

Cấu tr b h i ủ m i hu i gen 5. S rRN u ó á ―k p t ‖ và

― m‖ n i gen ó kí h th ớ ng n và không phứ tạp. B loài H. taichui (Htai-QT3-

VN), H. pumilio (Hpum-HPU8-VN) và C. lingua (Clin-Kartesh-RU) ó ấu tr

b h i gần nh giống nh u hoàn toàn H nh 3. , B, C , tuy nhiên, loài Eu.

costaricensis E os-Fuku-JP ó ―k p t ‖ nhánh hính ph n thêm 3 nhánh phụ

uối nhánh H nh 3. D .

3.2.3 2 ểm ấ t gen 18S rRNA ribosome

Cá hu i nu leotide ủ gen S rRN ủ h i loài SLRN H. taichui (Htai-

QT3-VN và H. pumilio Hpum-HPU -VN ó dài nh nh u bp ợ nạp

vào h ơng tr nh RN lifold ể x y dựng mô h nh ấu tr b h i. M t khá , tất

ả á hu i S rRN trên thế giới ó trong Ng n hàng gen ủ loài H. pumilio

gồm hủng Thái L n: hủng HpNP1/HM004194, HpNP2/HM004195 và HpNP3

HM004196 và m t hủng ủ Isr el, AY245706 , ủ loài H. taichui gồm hủng

Thái L n: hủng N HM004197, NA2/HM004213 và N 3 HM004201 và m t

hủng ủ Isr el, AY245705) (Thaenkham et al., 2010; Dzikowski et al., 2004)

ũng ợ thu nh n và s p xếp so sánh với m i hu i S rRN ủ m i loài H.

pumilio ho H. taichui ủ Việt N m .

H nh 3. 0. Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i gen 1 S rRN ủ sán lá ru t nh Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio. Ghi h : A. H. taichui Việt N m . B. Chu i ― n t ận‖ 5 hủng ủ H. taichui. C. H. pumilio Việt N m . D. Chu i ― n t ận‖ 5 hủng ủ H. pumilio. ng ph n ách chia r 3 t hợp (I, II, III), trong ó ấu tr b h i ủ á t hợp giống gần nh hoàn toàn với hu i ― n t ận‖ t ơng ứng m i loài và gi h i loài Haplorchis. Mũi tên hỉ ầu 5‘ ủ hu i gen. Mô h nh x y dựng bằng h ơng tr nh RNAalifold dạng kết phẳng, với năng l ợng kết nối tối thiểu (MFE = –674.30 kcal/mol).

Chu i nu leotide trí h xuất t khối ăn hỉnh ủ nhi u hu i t nhi u hủng

so sánh ó ợ g i là hu i ― n t ận‖ (consensus sequence . Chu i ― n

t ận‖ ủ m i m t loài H. pumilio ho H. taichui ợ nạp vào h ơng tr nh

RN lifold ể x y dựng mô h nh ấu tr b h i. Kết quả á mô h nh b h i x y

dựng ơ ợ tr nh bày H nh 3.10.

Cũng giống nh ấu tr ủ á rRN ribosome khá ủ sinh v t, hu i

gen 18S rRNA ủ SLRN Haplorchis spp. và á hu i ― n t ận‖ u h nh

thành ấu tr b h i khá phứ tạp, y b o gồm 3 t hợp ấu tr tạm ký hiệu là

I, II, III, trong ó, m i m t t hợp u hứ á ―k p t ‖ gồm nhánh hính và

nhánh phụ và á ― m‖ ó sự g n kết uối m i nhánh ―k p t ‖ với số l ợng

nhi u H nh 3. 0 . T hợp ấu tr I, II và III ủ gen S rRN ó ấu tr b h i

ủ á t hợp giống gần nh hoàn toàn với hu i ― n t ận‖ t ơng ứng m i

loài (H nh 3. 0A,B và 3.10C,D) và giống nh u ủ á t hợp gi h i loài

Haplorchis nghiên ứu này H nh 3.10B, D).

Cấu tr ―k p t ‖ ợ h nh thành t sự b t p á nu leotide hạy ối

ng ợ gi -T và G-C. Sự b t p n ợ h nh thành ng y ả á ầu uối 5‘

và 3‘ ủ á nu leotide, ó là ―k p t ‖ gi á nu leotide b t p ối xứng h i

hi u hạy và m t ―v m‖ không kh p kín liên kết á nu leotide t n ùng ủ

iểm m t ủ m i ầu 5‘ và 3‘ H nh 3. 0).

3.2.3 3 ểm ấ t n 2 S RN bo om

Chu i nu leotide toàn phần gen S rRN ủ loài SLRN H. taichui Ht i-

QT3-VN và H. pumilio (Hpum-HPU8-VN) ó dài lần l ợt là 3. 75 bp và 3. 70

bp, ợ nạp vào h ơng tr nh RN fold ể x y dựng mô h nh ấu tr b h i, thể

hiện H nh 3. 1.

Cũng giống nh á rRN ribosome khá và S rRN , hu i gen 28S

rRNA ủ H. taichui và H. pumilio ũng h nh thành ấu tr b h i phứ tạp. Có

thể ph n hi làm t hợp I và II ầu và uối gen, á t hợp ó ấu tr hơi

khá biệt gi h i loài và H. pumilio ó v phứ tạp hơn. Ở ả loài u ó m t

― m‖ tự do h nh thành gi gen. M i m t t hợp I ho II u hứ á ―k p t ‖

gồm nhánh hính và nhánh phụ và uối m i nhánh ―k p t ‖ u ó á ― m‖ g n

kết H nh 3. 1).

H nh 3.11. Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i gen S rRN ủ Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio. Ghi h : ng ph n nhánh hi làm t hợp (I và II) ầu và uối gen, á t hợp ó ấu tr hơi khá biệt gi h i loài và H. pumilio ó v phứ tạp hơn. Mũi tên ơn hỉ ầu 5‘ ủ m i hu i gen mũi tên ôi hỉ ― m‖ tự do gi gen. Mô h nh x y dựng bằng h ơng tr nh RNAfold với năng l ợng kết nối tối thiểu (MFE = –1488.00 kcal/mol).

T hợp I ủ gen S rRN ủ H. pumilio ó ấu tr b h i phứ tạp hơn

H. taichui, với số l ợng ―k p t ‖ và ― m‖ với số l ợng nhi u hon và sự ph n

nhánh ũng dạng hơn. Ngoài r , h i loài, ó rất nhi u á ấu tr ―k p t ‖ rất

dài ến trên 50 p nu leotide ợ h nh thành t sự b t p á nu leotide hạy

ối ng ợ . Cũng t ơng tự nh gen S rRN , sự b t p n ợ h nh thành ng y

ả á ầu uối 5‘ và 3‘ ủ á nu leotide tạo nên ―k p t ‖ với số l ợng khá

nhi u H nh 3. .

3.2.4. Đặc điểm cấu trúc v n i o n T (ITS-1, ITS-2)

H nh 3.12. Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nu leotide vùng gi o gen ITS- ủ Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio. Ghi h : Cá t hợp ó ấu tr khá biệt gi h i loài phần n ối và phần không n ối. Mũi tên ơn hỉ ầu 5‘ ủ m i hu i gen mũi tên ầu ôi hỉ ấu tr ủ vùng hứ 5 hu i l p TRU –5 H. pumilio. Mô h nh x y dựng bằng h ơng tr nh RN fold, dạng kết v ng entroid form với năng l ợng kết nối tối thiểu MFE –243.90 kcal/mol).

3.2.4 1 ểm ấ t ùn o n TS-1

Mô h nh ấu tr b h i ủ vùng gi o gen ITS- ủ loài H. taichui 7 7

nu leotide, không hứ ấu tr l p và H. pumilio . 0 nu leotide, hứ 5 ấu

tr l p ợ x y dựng bằng h ơng tr nh RN fold thể hiện dạng kết v ng

H nh 3. . Mô h nh hi thành phần: phần n ối và không n ối. Ở H.

taichui, t ầu 5‘ ến uối 3‘ ó nh ng hu i nu leotide ối ng ợ tạo nên á ―k p

tó ‖ số l ợng khoảng –30 , trong ó ó nhi u nhánh ―k p t ‖ không ó ― m‖

uối do á nu leotide b t p hoàn hỉnh với nh u, ó thể oi là phần n ối ủ

ấu tr H nh 3. .

Ở H. pumilio, mô h nh hi làm phần r rệt, ấu tr ủ vùng hứ 5 hu i

l p TRU –5 ó á nhánh ―k p t ‖ ó thể oi là rất n ối và phần n lại hứ

á ―k p t ‖ dài ng n khá nh u là phần không n ối H nh 3. B . Phần n ối

ủ ITS- ủ H. taichui ợ tạo thành do kết nối ầu 5‘ và uối hu i 3‘ trong

khi ó kết nối 5‘ và 3‘ ủ ITS- ủ H. pumilio không n ối là á nhánh dài

ng n khá nh u và liên kết tự do.

H nh 3. 3. Mô h nh ấu tr b h i ủ hu i nu leotide vùng gi o gen ITS- ủ Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, Cryptocotyle lingua và loài Euryhelmis costaricensis. Ghi h : Cấu tr b h i ủ ITS- loài (Htai, Hpum, Clin, Ecos) u ó mô h nh hung gồm nhánh hính (1, 2, 3, , riêng ITS- ủ H. taichui ó thêm nhánh phụ 3 và 3b. ầu 5‘ ủ chu i gen ợ ghi r ; khung vuông hỉ vùng khá bảo tồn gồm nhánh , , và ợ phóng to ể qu n sát. Mô h nh x y dựng bằng h ơng tr nh RN fold dạng kết phẳng, với năng l ợng kết nối tối thiểu MFE = –187.70 kcal/mol).

3.2.4 2 ểm ấ t ùn o n TS-2

H nh 3. 3 ho thấy mô h nh ấu tr b h i ủ vùng gi o gen ITS- ủ

loài H. taichui nu leotide, hứ 3 hu i TRU nh , H. pumilio (280 nucleotide,

không chứ TRU và ủ h i loài ùng h Heterophyid e là loài Cryptocotyle

lingua (279 nucleotide, không hứ TRU) và loài Euryhelmis costaricensis (289

nu leotide, hứ 2,5 hu i TRU nh ợ x y dựng bằng h ơng tr nh RN fold

sản ph m dạng kết phẳng.

ồ h ho thấy, vùng gi o gen ITS- ủ ả loài u tạo h nh ấu tr b

h i gồm nhánh ―k p t ‖ hính , , 3, là mô h nh hung ủ ITS- bảo tồn

nhi u loài sinh v t n g i là dạng ―b n n n tay‖ bảo tồn Schultz et al., 2005;

Voronova, Chelomina, 2018). Mô h nh ấu tr ITS- u hứ 3 nhánh , , ó

số l ợng nhánh, dài nhánh và h nh dạng bảo tồn ả loài H nh 3. 3 . Riêng

ITS- ủ H. taichui ó thêm nhánh phụ 3 và 3b ợ h nh thành hủ yếu t

b t p hu i nu leotide ối ng ợ ủ á ấu tr l p nh ó trong ITS- ủ loài

này.

3.2.5. ết qu phân t ch ph n thức s ụn nucl oti tron đ n v m

h ri osom

Hiện n y h Heterophyid e hỉ mới ó loài ó d liệu phần mã hó rTU

rTU* ăng ký trong Ng n hàng gen là Cryptocotyle lingua, hủng K rtesh ủ

Ng Clin-K rtesh-RU, số ăng ký: MW3 0 và loài Euryhelmis costaricensis,

hủng Fuku ủ Nh t Bản E os-Fuku-JP, AB521797) (Sato et al., 2010).

Trong quá tr nh ph n tí h iểm gen, ấu tr b h i và phả hệ

Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN) và Haplorchis pumilio Hpum-HPU -VN ủ

nghiên ứu này, h ng tôi s dụng á d liệu gen ủ rTU* ủ loài SLRN này

ùng h Heterophyid e ể so sánh. Thành phần nu leotide , T, G, C và giá trị

lệ h skew skewness ủ toàn b phần mã hó ủ ơn vị mã hó ribosome

rTU , ủ t ng gen S rRNA, 28S rRNA và ng hợp h i gen S rRN + S

rRN ủ 4 loài SLRN, ợ thống kê tại Bảng 3.7.

ê kiến tạo rTU* (7.268 bp), H. taichui Việt N m s dụng A = 22.77%, T

= 25.67%, G = 29.21%, C = 22.34%, với t ng thể thành phần A+T là 48.44% và

G+C là 5 .5 %. Giá trị lệ h skew skewness +T là lệ h m –0.0 0 và

G+C là lệ h d ơng 0. 33 . Loài H. pumilio kiến tạo rTU* (7. bp bằng á h s

dụng A = 23.13%, T = 25.96%, G = 28.64%, C = 22.28%, với t ng thể A+T là

49.09% và G+C là 50. %. Giá trị lệ h skew skewness +T là lệ h m –

0.05 và G+C là lệ h d ơng 0. 5 Bảng 3.7).

Bảng 3.7. Tỷ lệ s dụng thành phần nu leotide , T, G, C và giá trị lệ h skew skewness ủ t ng gen S rRNA, 28S rRN , ng hợp h i gen S+ S rRN và toàn b ơn vị mã hó ribosome ủ á loài sán lá ru t nh Heterophyidae, Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, Cryptocotyle lingua và Euryhelmis costaricensis

Lo i

Chu i nucleotide

A (%)

T (%)

G (%)

C (%)

A+T (%)

AT- skew

G+C (%)

GC- skew

ộ d i (bp)

HETEROPHYIDAE

rTU*

7268

22.77

25.67

29.21

22.34

48.44

–0.060

51.56

0.133

Htai-QT3-VN (KX815126)

18S rRNA

1992

23.39

25.65

28.87

22.09

49.04

–0.046

50.96

0.133

28S rRNA

3875

23.61

24.67

30.04

21.68

48.28

–0.020

51.72

0.162

18S+28S

5867

23.54

25.00

29.64

21.82

48.54

–0.030

51.46

0.152

rTU*

7416

23.13

25.96

28.64

22.28

49.09

–0.058

50.91

0.125

Hpum-HPU8-VN (KX815125)

18S rRNA

1992

22.96

25.49

29.14

22.41

48.45

–0.052

51.55

0.131

28S rRNA

3870

23.37

24.12

30.61

21.67

47.49

–0.016

52.28

0.171

18S+28S

5862

23.23

24.58

30.11

22.07

47.81

–0.028

52.18

0.154

rTU*

7301

22.39

26.05

29.31

22.24

48.44

–0.060

51.56

0.133

Clin-Kartesh-RU (MW361240)

18S rRNA

1991

23.46

25.82

28.68

22.05

49.28

–0.048

50.72

0.131

28S rRNA

3879

23.33

24.52

30.37

21.78

47.85

–0.025

52.15

0.165

18S+28S

5870

23.37

24.96

29.80

21.87

48.33

–0.033

51.67

0.154

rTU*

7093

22.66

25.67

29.28

22.39

48.33

–0.062

51.67

0.133

Ecos-Fuku-JP (AB521797)

18S rRNA

1990

23.37

25.58

28.74

22.31

48.95

–0.045

51.05

0.126

28S rRNA

3879

23.43

24.36

30.34

21.86

47.79

–0.019

52.21

0.163

18S+28S

5870

23.42

24.77

29.80

22.01

48.19

–0.028

51.81

0.150

Ghi ch Ht i-QT3-VN: Loài Haplorchis taichui hủng QT3, Việt N m Hpum-HPU -VN: loài Haplorchis pumilio hủng HPU , Việt N m Clin-K rtesh-RU: loài Cryptocotyle lingua, hủng K rtesh ủ Ng E os- Fuku-JP: loài Euryhelmis costaricensis, hủng Fuku ủ Nh t Bản. rTU*: Chỉ tính hu i nu leotide ủ phần mã hó oding sequen e ủ ơn vị mã hó ribosome rTU .

Cùng với H. taichui và H. pumilio, iểm gen h ribosome ủ h i loài

Cryptocotyle lingua và Euryhelmis costaricensis ùng h Heterophyidae ũng ợ

vào ph n tí h. H i loài này C. lingua ó rTU* 7.30 bp và Eu. costaricensis

ó rTU* 7.0 3 bp ũng ó ph ơng thứ s dung nu leotide t ơng tự thể hiện tỷ

lệ s dụng t ng nu leotide, tuy ũng ó sự xê dị h không áng kể, ó là khoảng A:

22–23%, T: 25–26%, G: –30% và C: 22–23%. T ng +T vào khoảng – % và

G+C khoảng 5 –5 % ho giá trị lệ h m +T là –0.05 ến –0.0 và lệ h

d ơng G+C là 0. 5 và 0. 33 (Bảng 3.7). Tỷ lệ s dụng loại nu leotide ủ rTU

loài SLRN ng ph n tí h ó thể nh n thấy theo mô h nh t ơng tự nh nh u,

nhi u nhất là G, tiếp ến là T và ít nhất là và C (với tỷ lệ s dụng gần nh nh u),

tạo nên ông thứ : G T ≈ C.

Tỷ lệ s dụng , T, G, C và +T, G+C á gen S 0–1992 bp), 28S

(3870–3 7 bp h y ả h i gen ng hợp S+ S rRN 5 –5 70 bp ả

loài SLRN ũng t ơng tự nh toàn b phần mã hó rTU. Tuy nhiên, giá trị

lệ h m +T thấp hơn –0.0 ến –0.052) và G+C ó phần o hơn, ạt ến

0.165/0.171 (Bảng 3.7).

3.2.6. ết qu phân t ch t n đ n nucl oti c các n r N và ph n

Bảng 3. . Mứ t ơng ồng nu leotide % ủ t ng gen S rRN , S rRN , ng hợp h i gen 18S+ S rRN và phần mã hó ơn vị mã hó ribosome rTU* ủ bốn loài sán lá ru t nh h Heterophyid e, Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, Cryptocotyle lingua và Euryhelmis costaricensis

m h ri osom c sán lá ruột nhỏ họ t rophyi

Gen 18S rRNA

Gen 28S rRNA

STT

Tên chủng lo i (GenBank)

98.94

97.39

97.80

98.01

96.02

95.13

97.69

98.83

95.60

97.52

97.64

94.65 18S rRNA + 28S rRNA

Ph n mã hóa rTU (rTU*)

97.92

97.30

96.63

96.12

95.52

94.91

96.32

97.97

95.07

97.45

95.68

94.47

Htai-QT3-VN (KX815126) Hpum-HPU8-VN (KX815125) Clin-Kartesh-RU (MW361240) Ecos-Fuku-JP (AB521797) Htai-QT3-VN (KX815126) Hpum-HPU8-VN (KX815125) Clin-Kartesh-RU (MW361240) Ecos-Fuku-JP (AB521797)

Ghi ch Ht i-QT3-VN: Loài Haplorchis taichui hủng QT3, Việt N m Hpum-HPU -VN: loài Haplorchis pumilio hủng HPU , Việt N m Clin-K rtesh-RU: loài Cryptocotyle lingua, hủng K rtesh ủ Ng E os- Fuku-JP: loài Euryhelmis costaricensis, hủng Fuku ủ Nh t Bản. Số ăng ký Ng n hàng gen GenB nk ợ ung ấp m i loài. Tỷ lệ ồng nhất o nhất và thấp nhất gi loài SLRN ợ bôi m và tô màu.

Mứ t ơng ồng nu leotide % ủ t ng gen S rRN , S rRN ,

ng hợp h i gen S rRN + S rRN và ủ rTU* gi bốn loài SLRN h

Heterophyidae, b o gồm Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN), H. pumilio (Hpum-

HPU8-VN), Cryptocotyle lingua (Clin-Kartesh-RU) và Euryhelmis costaricensis

(Ecos-Fuku-JP ợ tính toán và tr nh bày Bảng 3.8.

Mứ t ơng ồng nu leotide % ủ H. taichui với 3 loài SLRN ơn

vị so sánh là rất o, S rRN : , % H. pumilio; 97,80%/C. lingua;

97,69%/Eu. costaricensis S rRN : 7,39%/H. pumilio; 96,02%/C. lingua;

95,60%/Eu. costaricensis S+ S rRN : 7, % H. pumilio; 96,63%/C.

lingua; 96,32%/Eu. costaricensis và rTU*: 7,30% H. pumilio; 95,52%/C.

lingua; 95,07%/Eu. costaricensis (Bảng 3. ).

Ở ả tất ả ơn vị so sánh, tỷ lệ t ơng ồng ạt o nhất là gi loài H.

taichui và H. pumilio S S S+ S rTU* lần l ợt là , % 7,3 %

7, % 7,30% và tỷ lệ t ơng ồng thấp nhất là gi loài H. pumilio và Eu.

costaricensis (18S/ 28S S+ S rTU* lần l ợt là 7, % , 5% 5,5 %

94,47%) (Bảng 3.8).

3.2.7. Phân t ch ph hệ c . t ichui và . pumilio trên chu i

nucl oti n 2 ri osom toàn ph n

Ch ng tôi t vấn giải tr nh tự ể thu nh n toàn b hu i nu leotide gen

28S rRNA nhằm ung ấp d liệu và s dụng ho nghiên ứu phả hệ, trong ó ó

m t số loài ủ h Heterophyid e và á h khá trong lớp Sán lá Le et al., 2020a).

B m ơi bốn 3 hu i gen S rRN toàn phần 3.861–3.924 bp) (Bảng

PL2.5), ủ loài 7 h , b o gồm hu i ủ loài SLRN Việt N m, H. taichui và

H. pumilio h Heterophyidae) trong nghiên ứu này và 32 hu i ủ á loài sán lá

thu 6 h Nanophyetidae, Collyriclidae, Opisthorchiidae, Heterophyidae,

E hinostom tid e và F s iolid e ợ s dụng so sánh hu i và ph n tí h phả hệ.

Chu i gen 28S rRNA của loài Schistosoma japonicum (h S histosom tid e ợc

h n làm nhóm ngoại hợp. C y phả hệ ủ 3 hủng 28 loài ợ x y dựng bằng

phần m m MEG X s dụng ph ơng pháp ‖t ếp ận ạ ‖ Maximum

likelihood (ML)), mô h nh th y thế Maximum Composite Likelihood, với hệ số tin

t ng (bootstrap) 1000 lần l p lại (Kumar et al., 2018).

Hình 3.14. C y phả hệ xá ịnh mối qu n hệ loài và phả hệ dự trên ph n tí h hu i gen S rRNA toàn phần 3. –3. kb ủ H. taichui và H. pumilio ủ Việt N m và á loài sán lá khá . Ghi ch Cá loài H. taichui và H. pumilio ủ Việt N m ánh dấu h nh tr n và óng khung ùng với Cryptocotyle lingua và Euryhelmis costaricensis ùng h Heterophyid e và cá loài sán lá khá ại diện h Nanophyetidae; Paragonimidae; Collyriclidae; Opisthorchiidae; E hinostom tid e và F s iolid e) và h S histosomatidae ngoại hợp . C y phả hệ ợ x y dựng bằng h ơng tr nh MEG X, ‖t ếp ận ạ ‖ Maximum likelihood (ML)), với hệ số tin t ng bootstr p là 000 lần l p lại Kum r et al., 2018). Mũi tên hỉ n t hính ph n ịnh Liên h Opisthor hioide . Ở m i hu i, b t ầu là ký hiệu tên loài, tiếp theo là ký hiệu hủng và quố gi ph n l p nếu ó , s u ó là gen S với số nu leotide so sánh trong ngo ) và uối ùng là số ăng ký Ng n hàng gen nếu ó , liệt kê tại Bảng PL2.5. Hệ số tin t ng bootstr p ợ ghi ng y tại m i nhóm ph n nhánh. Vạ h ng ng uối h nh 0.02) biểu thị s i khá nu leotide 00 nu leotide m i nhánh. H nh 3. ho thấy, trên y phả hệ, bên cạnh nhóm ngoại hợp (S.

japonicum, h S histosom tid e , ó 3 nhóm hính ợ h nh thành mà m i nhóm

là ại diện ho m i ph n b tá h biệt nh u khá r ràng, gồm:

i Ph n b Troglotrem t b o gồm 3 ph n nhóm, m i m t nhóm là m t h

ợ s p t là:

+ Ph n nhóm là h N nophyetid e gồm 5 hủng 3 loài Nanophyetus

japonensis Nh t Bản, Nj p-NJ -JP-LT7 70 và Njap-NJ161-JP), Nanophyetus

salminicola (Nga, Ns l-K rp5 -RU-LN 7 và Nsal-Karp55-RU-LN871823); và

Nanophyetus schikhobalowi (Nga, Nsch-03Karp1442-RU-LN871820);

+ Ph n nhóm là h P r gonimid e gồm hủng 5 loài ó là P.

heterotremus (Phet-LC-VN), P. ohirai (Pohi-Kino-JP), P. iloktsuenensis (Pilo-

Amami-JP), P. miyazakii Pmiy-OkuST -JP và P. westermani hủng Ấn :

Pwes-Megha(2n)-IN và hủng Hàn Quố : Pwes-Bogil(3n)-KR);

+ Ph n nhóm 3 là h Collyri lid e hỉ gồm loài duy nhất là Collyriclum faba

(S , Cfab-Orlicke-CZ-JQ231122).

ii Ph n b Opisthor hi t gồm á h Opisthorchiidae, Heterophyid e ,

trong ó:

+ H Opisthorchiidae ó 7 hủng 5 loài b o gồm á loài Clonorchis sinensis

Việt N m: Csin-NH-VN; Trung Quố : Csin-CSD-CN-MK450526); Opisthorchis

felineus (Nga: Ofel-UstTula-RU), Metorchis orientalis Trung Quố : Mori-MOE-

CN-MK482055; Mori-MOB-CN-MK482052); O. viverrini Việt Nam: Oviv-PY2-

VN) và O. parageminusi Việt N m: Opar-PC6-VN);

+ H Heterophyidae ó hủng loài b o gồm á loài Haplorchis taichui

Việt N m: Htai-QT3-VN-KX815126), Haplorchis pumilio Việt N m: Hpum-

HPU8-VN-KX815125), Cryptocotyle lingua (Clin-Kartesh-RU-MW361240) và

Euryhelmis costaricensis (Ecos-Fuku-JP-AB521797). H i loài C. lingua và Eu.

costaricensis s p xếp ùng nh u, nằm gần Opisthor hiid e và gi h này và h

Heterophyidae (H nh 3. ).

iii) Ph n b E hinostom t b o gồm á h E hinostom tid e và

Fasciolidae, trong ph n nhóm:

+ Ph n nhóm là h E hinostom tid e gồm 5 loài hủng là Echinostoma

miyagawai Trung Quố : Emiy-HLJ-CN-MH7 7 và Thái Lan: Emiy-RED11-

TH); Echinostoma revolutum Thái L n: Erev-MSD15-TH); Echinostoma

malayanum (Thái L n: Emal-EMI3-TH); Hypoderaeum conoideum Thái L n:

H on-RED -TH và Isthmiophora hortensis (Nh t Bản: Ihor-Waka-JP-

AB189982);

+ Ph n nhóm là h F s iolid e gồm hủng/5 loài là Fasciola gigantica

Việt N m: Fgig-NB-VN-MN 7000 và Fgig-T4V-VN-MN970010); Fasciola

hepatica (Australia: Fhep-Geelong-AU-MN97000); Fasciola sp. hybrid Việt

Nam: Fsp(hyb)-DL11-VN-MN970008); Fasciola jacksoni (Sri Lanka: Fjac-Madu-

LK-MN97000 và Fasciolopsis buski (Việt N m: Fbus-HT-VN-MN970005).

Hai loài Haplorchis (H. taichui và H. pumilio ã ợ xá ịnh nằm trong

t p hợp ủ h Heterophyidae, ùng với h Opisthor hiid e thu liên h

Opisthorchioidea, ph n b Opisthor hiata (Hình 3.14).

3.2.8. Phân t ch ph hệ c . t ichui và . pumilio trên cộn h p

toàn ph n hai gen rRNA (18S + 28S rRNA)

C ng hợp toàn b hu i nu leotide ủ gen S rRN + S rRNA nhằm

xem x t qu n hệ loài và phả hệ ký sinh trùng ã ợ nhi u nghiên ứu th nh n

ó ph n giải vị trí ph n loại loài hính xá hơn so với s dụng ơn l t ng gen,

t ng phần gen (Lockyer et al., 2003; Waeschenbach et al., 2007; 2017). Ch ng tôi

thu th p tr nh tự rTU hiện ó ủ 3 hủng 7 loài (Bảng PL .6) và trí h xuất phần

gen 18S rRNA (1.984–1. bp và S rRN 3.859–3. 7 bp và nối kết làm

hu i ng hợp gen S+ S 5. –5. 70 bp ể ph n tí h phả hệ.

H i m ơi b 3 hu i gen ng hợp S+ S rRN toàn phần 5.846–

5.870 bp) (Bảng PL . , ủ 3 hủng 7 loài h thu 3 ph n b Opisthor hi t ,

E hinostom t và Strigeidid ợ s dụng so sánh hu i và ph n tí h phả hệ, b o

gồm hu i ủ loài SLRN Việt Nam, H. taichui và H. pumilio h

Heterophyidae trong nghiên ứu này và 0 hu i ủ sán lá thu 5 h

Heterophyidae, Opisthorchiidae, Fasciolidae, Philophthalmidae, E hinostom tid e

và m t hu i ủ loài Schistosoma edwardiense h Schistosom tid e ợ h n

làm nhóm ngoại hợp. C y phả hệ ủ 3 hủng 7 loài ợ x y dựng bằng phần

m m MEG X s dụng ph ơng pháp ‖t ếp ận ạ ‖ Maximum likelihood

(ML)), với hệ số tin t ng (bootstrap) 1000 lần l p lại (Kumar et al., 2018).

Hình 3.15. C y phả hệ xá ịnh mối qu n hệ loài và phả hệ dự trên ph n tí h hu i gen ng hợp S+ S rRN toàn phần 5. –5. 70 bp ủ SLRN H. taichui và H. pumilio ủ Việt N m và á loài sán lá khá . Ghi ch Cá loài SLRN H. taichui và H. pumilio ủ Việt N m ánh dấu h nh tr n và á loài sán lá khá ại diện 5 h Heterophyidae, Opisthorchiidae, Fasciolidae, Philophthalmidae, Echinostomatidae) và h S histosom tid e ngoại hợp . C y phả hệ ợ x y dựng bằng h ơng trình MEGA X, ‖t ếp ận ạ ‖ (maximum likelihood (ML), với hệ số tin t ng (bootstrap) 1000 lần l p lại (Kumar et al., 2018). Khung vuông bôi màu ph n ịnh h i ph n b Opisthor hi t và E hinostom t . Ở m i hu i, b t ầu là ký hiệu tên loài, tiếp theo là ký hiệu hủng và quố gi ph n l p, s u ó là số ăng ký Ng n hàng gen nếu ó liệt kê tại Bảng PL .6. Hệ số tin t ng bootstr p ợ ghi ng y tại m i nhóm ph n nhánh. Vạ h ng ng uối h nh 0.0 biểu thị s i khá nu leotide 00 nu leotide m i nhánh.

H nh 3. 5 ho thấy, trên y phả hệ, bên ạnh nhóm ngoại hợp (S.

edwardiense, h S histosom tid e , ó t p hợp hính mà m i t p hợp là ại diện

ho m i ph n b Opisthor hi t và E hinostom t , tá h biệt nh u r ràng, gồm:

i Ph n b Opisthor hi t ó h ợ s p t là:

+ H Heterophyid e ó hủng loài, trong ó ó loài ủ nghiên ứu

này, Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN-KX815126) và Haplorchis pumilio (Hpum-

HPU8-VN-KX815125) và loài Cryptocotyle lingua (Clin-Kartesh-RU) và

Euryhelmis costaricensis (E os-Fuku-JP . Loài H. taichui và H. pumilio vị trí ― hị

em‖ monophyleti , loài C. lingua và Eu. costaricensis vị trí ph n á h ―ph n vị‖

(paraphyleti với loài Haplorchis (H nh 3.15).

+ H Opisthor hiid e ó hủng loài b o gồm á loài Clonorchis sinensis

Việt N m: Csin-NH-VN Trung Quố : Csin-CSC-CN-MK450525; Csin-CSD-CN-

MK450526; Csin-CSE-CN-MK450527); Opisthorchis felineus (Nga: Ofel-UstTula-

RU), Metorchis orientalis Trung Quố : Mori-MOB-CN-MK482052; Mori-MOD-

CN-MK482054; Mori-MOE-CN-MK482055); O. viverrini Việt N m: Oviv-PY2-

VN). M dù là SLRN, nh ng loài Cryptocotyle lingua (Clin-Kartesh-RU) và

Euryhelmis costaricensis (Ecos-Fuku-JP s p xếp vị trí n n gi nhóm ủ á

loài ủ h Heterophyidae và Opisthorchiidae (H nh 3. 5).

ii Ph n b E hinostom t ó 3 h ợ s p t là:

+ H F s iolid e gồm hủng 5 loài b o gồm á loài sán lá g n lớn

Fasciola spp. và sán lá ru t lớn Fasciolopsis buski.

+ H E hinostom tid e gồm hủng loài là Isthmiophora hortensis Nh t

Bản: Ihor-Waka-JP-AB189982 và Echinostoma miyagawai Thái L n: Emiy-

RED11-TH), luôn luôn vị trí hị em với nhóm ủ á loài thu h Fasciolidae.

+ H Philophth lmid e ó loài Philophthalmus gralli (Philipin: Pgra-PH191-

PE-JQ627832) ợ s p xếp vị trí ―lệ ‖ với nhóm ủ h i h trên (H nh 3. 5).

Nh v y, sự s p xếp ph n loại ủ SLRN H. taichui và H. pumilio hoàn toàn

ồng nhất y phả hệ khi s dụng ả loại hỉ thị ơn gen S rRN toàn phần

ho ng hợp thêm gen S rRN toàn phần ảm bảo tin y o hơn.

CHƢƠNG 4

BÀN LUẬN KẾT QUẢ

tài ã thự hiện thành ông á n i dung nghiên ứu, áp ứng á mụ

tiêu r . Lu n án ã x y dựng, hoàn thành và ung ấp á kết quả nghiên ứu ạt

ợ , trong ó ó m t số iểm n i b t mà h ng tôi ho rằng nh ng kết quả ó ã

góp phần óng góp ho nghiên ứu gen h mtDN và rTU ủ á loài SLRN nói

riêng và sán lá nói hung Việt N m và trên thế giới. Kết quả ủ lu n án t ng

b ớ áp ứng nhu ầu ần thiết v nghiên ứu xá ịnh loài, h n oán, dị h tễ h ,

phả hệ, tiến hó và di truy n quần thể n thiếu hi Haplorchis trong h

Heterophyidae. Lu n án ũng ã áp ứng ầy ủ yêu ầu t r ể giải quyết ủ

tài v h i l nh vự nghiên ứu iểm gen ủ hệ gen ty thể và ơn vị mã hó

ribosome với ối t ợng là sán lá ru t nh , mà y là loài Haplorchis taichui và

Haplorchis pumilio.

Có thể liệt kê m t số iểm lớn ã ạt ợ và ó ũng là óng góp n i b t

ủ nghiên ứu trong lu n án:

1 N ên ứ ệ n ty t ể

- ã giải tr nh tự thành ông và thu ợ toàn b hệ gen ty thể ủ loài

SLRN Haplorchis taichui xá ịnh ấu tr và s p xếp gen hệ gen ty thể ủ SLRN

H. taichui.

- ã ph n tí h ầy ủ iểm gen và ấu tr b h i ủ MRG S và

S , á gen tRN và vùng không mã hó ủ mtDN ủ H. taichui.

- ã ph n tí h ph ơng thứ s dụng nu leotide, giá trị lệ h ―skew‖

trong mtDNA, iểm gen và sự ―thiên vị‖ s dụng b mã ủ PCG và khoảng

á h di truy n gi H. taichui và á loài sán lá khá h Heterophyid e và h

Opisthor hiid e dự trên ng hợp mino id ủa ba PCG (cob+nad1+cox1) và 12

PCG.

- ã ph n tí h mối qu n hệ v loài và x y dựng thành ông phả hệ SLRN

dự trên hu i mino id ng hợp ủ b gen mã hó protein cob+nad1+cox1) và

và ủ 12 PCG.

2 N ên ứ n m bo om

- ã giải tr nh tự thành ông và thu ợ toàn b phần mã hó ribosome ủ

loài SLRN Haplorchis taichui và H. pumilio, xá ịnh ấu tr rTU và s p xếp

gen vùng gi o gen.

- ã ph n tí h ầy ủ iểm gen và ấu tr b h i ủ á gen 5.8S,

18S, 28S rRNA, vùng gi o gen ITS- và ITS-2 ủ rTU ủ Haplorchis taichui và

H. pumilio.

- ã ph n tí h ph ơng thứ s dụng nu leotide, giá trị lệ h ―skew‖

trong rTU, khoảng á h di truy n và mứ t ơng ồng ủ gen 18S, 28S,

S+ S rRN và phần mã hó rTU gi H. taichui và các loài SLRN khá h

Heterophyidae dự trên á gen rRN và phần mã hó ribosome.

- ã ph n tí h mối qu n hệ v loài và x y dựng thành ông phả hệ H. taichui

và H. pumilio dựa trên m t gen 28S rRNA toàn phần và ng hợp hai gen 18S+28S

rRNA toàn phần.

Bên ạnh ó, ơ s d liệu mtDN ủ SLRN H. taichui thu th p tại Việt

Nam hủng QT3 ợ so sánh với loài H. taichui mẫu ủ Lào và M. yokogawai

mẫu Hàn Quố v á iểm gen hệ gen và phả hệ.

T ơng tự, ơ s d liệu rTU ủ H. taichui và H. pumilio thu th p tại Việt

N m ũng ợ so sánh với á loài SLRN ùng h Heterophyidae, là á loài

Cryptocotyle lingua (Nga) và Euryhelmis costaricensis (Nh t Bản , v á iểm

gen vùng gi o gen, ấu tr b h i, t ơng ồng và phả hệ.

Trong lu n án, nghiên ứu d liệu rTU ủ á loài SLRN H. taichui và H.

pumilio thu th p tại Việt N m ã ợ thự hiện, ó ũng là nguồn d liệu rất giá trị

ho á l nh vự nghiên ứu ơ bản hiện n y, song song ùng d liệu gen h

mtDN ể kh i thá s dụng. y là nguồn qu n tr ng b sung kh i thá ể xác

ịnh loài, h n oán, ph n biệt, phả hệ, tiến hó và di truy n quần thể trong á ịnh

h ớng ứng dụng ph ng hống bệnh KST Việt N m và thế giới.

Ch ng tôi xin ó m t số bàn lu n ụ thể nh s u:

4.1. V nghiên cứu hệ gen ty thể sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui

4.1.1. V thu nhận liệu n học hệ n ty thể

Trong nghiên ứu này, hu i nu leotide ủ mtDN hoàn hỉnh ủ

Haplorchis taichui hủng QT3 ủ Việt N m ã ợ giải tr nh tự và á

iểm gen h mtDN ủ loài này ã ợ mô tả ầy ủ. Hệ gen ty thể ầy ủ ủ

loài Haplorchis taichui Nishigori, , mẫu Việt N m, ó kí h th ớ 5.120 bp.

Trong khi tài thự hiện, ho ến hiện n y, hỉ mới ó h i mtDN hoàn hỉnh ủ

SLRN, ó là mtDNA H. taichui mẫu ủ Lào, dài 5. 3 bp và mtDN ủ

loài Metagonimus yokogawai mẫu ủ Hàn Quố , dài 5. 5 bp . Hệ gen ty thể

H. taichui mẫu ủ Lào do nhóm nghiên ứu Hàn Quố thự hiện n thiếu nhi u

số liệu ph n tí h iểm gen hệ gen, ấu tr l p, ấu tr b h i ủ rRN ty

thể, tính toán khoảng á h di truy n và ph n tí h phả hệ.

Nh v y, với việ hoàn thành giải tr nh tự, h giải và ph n tí h ầy ủ

iểm gen hệ gen mtDN ủ H. taichui mẫu ủ Việt N m so sánh với H. taichui

hủng ủ Lào và loài Metagonimus yokogawai hủng ủ Hàn Quố ùng h

Heterophyidae, h ng tôi ã ung ấp thêm d liệu gen h hoàn hỉnh ủ loài H.

taichui ho b s u t p d liệu mtDNA h Heterophyidae trên thế giới. Bên ạnh ó,

nh ng kết quả thu ợ qu ph n tí h so sánh iểm gen hệ gen, thành phần

nu leotide, ph ơng thứ s dụng nu leotide và b mã, ấu tr gen RN và tRN

ty thể, mối qu n hệ v loài và phả hệ gi H. taichui và á loài ùng h

Heterophyid e, ùng ph n b Opisthor hi t với á loài ph n b khá àng làm

sáng t vị trí ủ loài H. taichui trong lớp Sán lá. Do v y, d liệu do h ng tôi thự

hiện rất kịp th i, ó giá trị ho á nghiên ứu và ứng dụng tiếp theo ủ hi

Haplorchis và ủ h Heterophyid e, ph n b Opisthor hi t ũng nh ủ Lớp

Sán lá trên thế giới.

Giải tr nh tự và kh i thá d liệu mtDN ủ SLRN b h th ng g p gây

nhiễm trong ng ồng (Heterophyidae, E hinostom tid e và E hino h smid e và

100

h i h gần gũi là Opisthor hiid e và F s iolid e hiện ng ợ y mạnh. Kết quả

nghiên ứu ủ h ng tôi góp phần áp ứng nhu ầu ó.

Công bố trên thế giới ho thấy á loài trong 5 h ó qu n hệ m t thiết với

nh u, gồm 3 h thu SLRN Heterophyid e, E hinostom tid e và

E hino h smid e và h thu sán lá g n Opisthor hiid e và F s iolid e v

ph n loại và ó tầm qu n tr ng trong dị h tễ h ng ồng (Le et al., 2002; De, Le,

2011; Thaenkham et al., 2010; 2011; 2012; Tkach et al., 2016; Pérez-Ponce de

León et al., 2019). V v y, ối với á loài trong 5 h này, nghiên ứu ph n tí h so

sánh á iểm h nh thái, ph n loại, thu nh n mtDN và rTU tạo ơ s d liệu

ể nghiên ứu di truy n phả hệ và tiến hó ó ý ngh biệt qu n tr ng ho

ph ng hống bệnh KST do h ng g y r . M t lý do khá ũng không k m phần

qu n tr ng là á loài trong 5 h này u ó ph ơng thứ truy n l y qu á là thứ

ăn, nguồn ung ấp thự ph m và tiếp x hàng ngày trong ng ồng và h ng là

tá nh n g y á bệnh KST VLSN khá ph biến á n ớ vùng nhiệt ới.

4.1.2. V đặc điểm hệ n ty thể c sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui

- V s p xếp tr t tự gen, mtDN hoàn hỉnh ủ H. taichui ủ Việt N m ó

tr t tự s p xếp gen, vùng gi o gen và vùng không mã hó (NCR) giống nh số

á loài sán lá, ngoại tr sán lá á loài sán máng h S histosom tid e Le et al.,

2002 . Nếu m v ng ầu 5‘ ủ gen cox3, th dãy ấu tr s p xếp gen và vùng

giao gen ủ mtDN H. taichui là: {5‘-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-

nad2-VAD-nad1-NPIK-nad3-S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-

nad5-E-NCR[TRU1-5]-G-3‘} H nh 3.2). Tuy nhiên, s p xếp vị trí ủ tRN v n huyển nằm uối hệ gen mtDNA ó khá , ó là tRN Glu tiếp ến là tRN Gly và là sự ảo vị trí so với nhi u loài sán lá nói hung (tRNAGly - tRNAGlu) ã ông bố tr ớ y. Ở nhi u loài sán lá, tiếp ến ng y s u gen nad5 là tRN Gly rồi ến tRNAGlu ngay s u ó, nh mtDN ủ sán lá ph i Paragonimus spp. h

Paragonimidae, sán lá g n lớn Fasciola spp. và sán lá ru t lớn Fasciolopsis buski

h F s iolid e (Le et al., 2001; 2019; Liu et al., 2014; Ma et al., 2017; Rajapakse et al., 2020). Ở H. taichui, ngay sau gen nad5 là tRN Glu ợ ảo vị trí lên tr ớ ,

101

s u ó là tRN Gly nh ng không gần nh u mà á h biệt nh u b i m t vùng không mã hó và tRN Gly tiếp gần với cox3. y là n t tr ng s p xếp tRNAGly H.

taichui khá với mtDN ủ nhi u loài sán lá khá .

- V kí h th ớ hệ gen, mtDN hoàn hỉnh ủ Haplorchis taichui Việt

N m ó dài 5. 0 bp t ơng ơng hủng ủ Lào 5. 3 bp và không hênh

lệ h l m so với Metagonimus yokogawai ùng h Heterophyidae 5. 5 bp,

KC330755 . Kí h th ớ khoảng 5 kb ủ mtDN SLRN thu vào nhóm loài ó

mtDNA kí h th ớ trên trung b nh, ng n hơn so với m t số loài trong h

E hinostom tid e nh Echinostoma revolutum (17.030 bp, Le et al., 2020b;

MN496162 và E. paraensei 0. bp, KT00 005 , nh ng dài hơn so với m t số

loài sán lá h F s iolid e với dài trung b nh khoảng . bp Fasciola

hepatica (Le et al., 2001; F 7 và lớn hơn rất nhi u so với loài C. sinensis

(13.877–13.879 bp, Cai et al., 2012) h Opisthor hiid e, ho loài Tracheophilus

cymbius (13.760 bp, Li et al., 2020, MK355 7 h Cy lo oelid e. Ở sán lá ru t

nh và sán lá nói hung, dài hu i nu leotide vùng mã hó t cox3 ến nad5 gần

nh biến ng không lớn khoảng 3, kb ến 3,5 kb . Sự hênh lệ h dài ủ

toàn b mtDN á loài, hủ yếu là do vùng NCR ó kí h th ớ khá nh u, v ó

hứ ho không hứ á ấu tr l p TRU với số l ợng và dài ủ ủ t ng

ấu tr l p ó khá nh u.

- V iểm gen RN ribosome ty thể 16S/rrnL và 12S/rrnS), MRG

ủ Haplorchis taichui Việt N m ó dài m i gen 0 bp S và 750 bp/12S) và

vị trí s p xếp trong mtDN là giống nh H. taichui hủng Lào và Metagonimus

yokogawai Hàn Quố thu loại ng n nhất nh Paragonimus ohirai (Le et al.,

2019 , nh ng ng n hơn nhi u so với nhi u loài sán lá h F sciolidae hay

Opisthorchiidae (Le et al., 2001; Shekhovtsov et al., 2010; Cai et al., 2012). Vị trí

s p xếp trong mtDN ủ vùng gen theo thứ tự S- S là bảo tồn tuyệt ối trong

m i loài sán lá Le et al., 2002; Lee et al., 2013). Cũng nh m i RN ribosome,

MRG ũng u n kh tạo nên ấu tr b h i nh mô h nh ã ợ xá ịnh bằng

h ơng tr nh RN fold ủ MRG S và S ủ H. taichui (H nh 3.3 giống nh

102

Fasciola hepatica và sán lá khá Le et al., 2001; Blair, 2006).

- V iểm ủ tRN v n huyển, mtDN ủ SLRN H. taichui Việt

N m ó tRNA u ó ấu tr b h i h nh ―lá ‖ hoàn hỉnh, m t dạng ấu

tr th ng g p ủ tRN á loài sinh v t nói hung và sán lá nói riêng (H nh

3.4 , với sự ph n phối u h ớng ủ ― ánh t y‖ th m gi hoạt ng v n huyển

amino acid (Le et al., 2002 . Ở mtDN ủ H. taichui, duy nhất hỉ ó tRN v n huyển Serine 1 (tRNASer1 hay trnS1(AGN) bị khuyết thiếu ánh t y dihydrouridine

(DHU). Khuyết thiếu ánh t y DHU tRN ủ mtDN H. taichui ũng là n t

iểm th ng g p m t số sán lá khá nh Fasciola hepatica (Le et al., 2001),

F. jacksoni (Rajapakse et al., 2020), Fascioloides magna (Ma et al., 2016),

Echinostoma miyagawai (Li et al., 2019) và Echinostoma revolutum (Le et al.,

2020b). Ngoài r , khuyết thiếu ánh t y DHU tRN mtDNA n là iểm

th ng g p tRNA ủ Serine và (trnS1 và trnS2) và tRN v n huyển

Leucine (trnL1 và trnL2) và ó thể Cystein (trnC tuy hiếm g p hơn ó là

iểm ấu tr khuyết ủ tRN ủ nhi u loài sán d t (Le et al., 2002; 2020b).

- V ph ơng thứ s dụng nu leotide, R ràng tỷ lệ s dụng nu leotide

mtDNA, PCG và MRG ủ H. taichui Việt N m u thống nhất theo mô h nh T

G C và ―thiên ‖ v s dụng A+T hơn G+C +T G+C . Do ó, nh

mtDNA, giá trị ộ lệ skewness ũng thiên v lệ h m –0.3 0 , t ơng tự nh H.

taichui ủ Lào, nh ng thấp hơn loài SLRN Metagonimus yokogawai ủ Hàn

Quố . T ng thể toàn b thành phần s dụng ―t ên ‖ +T hơn G+C mtDN ủ

H. taichui ũng t ơng tự nh m t số loài sán lá g n lớn Fasciola spp. h

Fasciolid e và sán lá g n nh Clonorchis sinensis và Opisthorchis spp. (h

Opisthor hiid e , vào khoảng 0% , nh ng khá x và ít hơn nhi u so với á loài

sán máng Schistosoma spp. thu h S histosom tid e. Ở á loài này ―thiên vị‖

nhi u hơn v s dụng +T, th ng là khoảng 70% +T trong t ng số nu leotide

(A+T >> G+C) (Le et al., 2002).

M i mtDN ủ m i loài kể ả SLRN ợ x y dựng t loại nu leotide

, T, G, C theo tỷ lệ s dụng t ng loại nu leotide khá nh u. Gen PCG, gen

103

MRG, gen tRN và vùng NCR ó ph ơng thứ s dụng nu leotide không ồng

u, tùy thu vào nhu ầu , T biểu thị: +T và G, C biểu thị G+C ủ t ng

vùng DN ủ hệ gen. Tính toán tỷ lệ s dụng % ủ +T và G+C ủ nh ng

vùng DN này và toàn b mtDN ho biết ph ơng thứ s dụng và lệ h

skewness ể biết sự n bằng nu leotide, kể ả á nu leotide ủ á b mã s

dụng odon us ge trong á gen PCG Perna, Kocher, 1995).

- V ph ơng thứ s dụng b mã odon us ge , H. taichui, nhi u nhất

thu v b mã ủ Phenyl l nine Phe-TTT và Leu ine Leu-TTG , ít s dụng

nhất là nh ng b mã Glut mine Gln-C , rginine rg-CGC và M.

yokogawai n ó thêm b mã Thr- C CC. Ph ơng thứ s dụng nhi u nhất và

mã ít nhất t p trung vào á b mã này u phản ánh t ơng tự tính thiên vị b mã

odon bi s th ng g p mtDN ủ á loài sán lá ã ông bố Le et al., 2004;

2020b; Chen et al., 2013).

- V iểm h nh ủ vùng NCR, ó là sự hiện diện ủ 5 ấu tr l p

li n k (TRU1–5/182– 3 bp m i m t ấu tr ủ mtDN ủ H. tachui là n t

tr ng ủ loài SLRN này. iểm này là iển h nh ủ ấu tr h nh

polymorphism th ng g p rất nhi u loài SLRN trong h E hinostom tid e

E hino h smid e và á loài sán lá trong á h khá . Số l ợng á TRU t –3

ến ơn vị và dài hu i nu leotide ủ m i m t TRU m i loài ó khá

nh u, t vài hụ 0 bp –87 bp g p Fasciola spp. ến vài trăm nu leotide

(317–319 bp Echinostoma spp. (Le et al., 2020b ợ biết ho ến n y. Sự hiện

diện ủ á TRU với số l ợng m t vài ến hàng hụ ơn vị ã làm ho vùng NCR

ó kí h th ớ khá nh u á loài, do ó, mtDN ủ m t số loài sán lá, kể ả

SLRN Haplorchis spp., ạt ến xấp xỉ 5– 7 kb, th m hí gần kb nh m t số

loài Echinostoma spp. (Le et al., 2020b). Sự ó m t ủ á TRU trong mtDN

nhi u loài h h n là m t trong nh ng iểm gen h th vị nhất, xá ịnh tính

h nh o (polymorphism) ủ NCR ủ mtDN SLRN nói riêng và sán lá nói

chung. Ngoài r , m dù sự ó m t TRU trong mtDN là khá ph biến, nh ng ho

ến n y, v i tr hứ năng ủ h ng vẫn h ợ hiểu hoàn toàn (Gemayel et

104

al., 2010). M t số nghiên ứu ho rằng sự ó m t ủ á ấu tr l p li n k TRU

với số l ợng nhi u th m hí ó số l ợng th y i á hủng ùng loài ph n l p

á vùng ị lý khá nh u Le et al., 2019 , nhằm tăng ng mứ tiến hó và ó

thể liên qu n ến kiểm soát s o h p hệ gen ty thể Lunt et al., 1998; Gemayel et

al., 2010).

Vùng NCR ó ấu tr l p li n k là nét tr ng mtDN ủ nhi u loài

sán lá, nh b t g p trong mtDN ủ á loài sán lá h F s iolid e nh sán lá gan

lớn Fasciola hepatica, F. gigantica, F. jacksoni (Cai et al., 2012; Liu et al., 2014;

Rajapakse et al., 2020) sán lá ru t lớn Fascioloides magna, Fasciolopsis buski (Ma

et al., 2016; 2017), h E hino h smid e và E hinostom tid e nh sán lá ru t

Echinostoma revolutum, E. miyagawai, E. paraensei, E. hortense, Echinochasmus

japonicus, Artyfechinostomum sufrartyfex) (Li et al., 2019; Fu et al., 2019; Le et al.,

2016; 2020b); h Opisthor hiid e sán lá g n nh Clonorchis sinensis,

Opisthorchis viverrini, O. felineus) (Shekhovtsov et al., 2010; Kinkar et al., 2020)

và h S histosom tid e (sán máng Schistosoma spp. và nhi u loài KST khá

ợ biết ho ến n y, tạo nên ấu tr h nh m ng tính di truy n quần thể và tiến

hó ph n t Le et al., 2002; 2020b; Lunt et al., 1998; Gemayel et al., 2010).

4.1.3. V một s ứn ụn mt N tron n hiên cứu i truy n và ph hệ

- V ứng dụng d liệu mtDN trong nghiên ứu di truy n, khoảng á h di

truy n gi á loài SLRN và sán lá trong h i h Heterophyid e và Opisthor hiid e

dự trên ph n tí h ng hợp hu i mino id ủ 3 gen PCG (cob+nad1+cox1 và

ủ gen PCG ã ợ thự hiện (Bảng 3.4; 3.5 . R ràng, tỷ lệ s i khá gi á

hủng trong ùng m t loài nộ loà là rất thấp hỉ là 0,3–0,8%/3 PCG; 0,37–

0,46%/12 PCG , h y nói á h khá mứ ồng nhất là rất o trên , %/3 PCG;

99,63%/12 PCG), trong khi ó, KCDT gi á hủng khá loài n oạ loà ùng

và khá h là rất o, nh gi á loài H. taichui với S. falcatus, M. yokogawai, C.

sinensis và Opisthorchis spp. (O. viverrini và O. felineus) ạt ến , % 3 PCG và

31,64%/12 PCG. Kết quả ho thấy, KCDT gi á hủng trong ùng m t loài nộ

loài là thấp, d ới %, trong khi ó KCDT gi á hủng khá loài n oạ loà ) là

105

rất o, ến –32%. Khoảng á h di truy n biểu thị gần và x v loài, phản ánh

ng s i khá n i loài và ngoại loài sinh v t. Tỷ lệ này ho ph p xá ịnh ợ

khoảng á h ―gần‖ h y ―x ‖ gi á loài với nh u, t ó ho biết mối qu n hệ v

loài và mối qu n hệ ph n loại ủ h ng trong m t hi, gi á hi, á h và liên

h . Tính toán KCDT h n á hủng loài trong ùng hi h y khá hi, ùng h với

h gần ể so sánh, trong khi p n t p ệ nới r ng hơn b o gồm á hủng loài

ùng h và khá h , th m hí trong nhi u liên h và ph n b khá nh u.

- V mối qu n hệ v phả hệ, h ng tôi ã thự hiện ph n tí h hu i gen và

x y dựng y phả hệ dự trên d liệu ng hợp on ten ted mino id ủ m t

số gen 3 PCG, cob+nad1+cox1 và toàn b số gen PCG ủ mtDN ủ H.

taichui v thu nh n. Mụ í h ủ ph n tí h phả hệ là kiểm tr mối qu n hệ v loài

và sự s p xếp chính xác nhất ó thể ủ vị trí ph n loại ủ H. taichui trong h

Heterophyidae t ơng qu n với á h ó qu n hệ gần là Opisthorchiidae, và t ơng

quan trong á ph n b Opisthor hi t , E hinostom t trên y phả hệ.

Trong nghiên ứu phả hệ và qu n hệ v loài ng v t nói hung và áp dụng

ho KST sán lá, sán d y , việ s dụng d liệu toàn b á PCG ể ph n tí h và

x y dựng y phả hệ là ó mứ tin t ng o nhất (Boore, 2006; Littlewood,

2008; Lee et al., 2013; Le et al., 2002; 2019; 2020b; Fu et al., 2019). Tuy nhiên, do

nguồn d liệu ung ấp toàn b mtDN ủ á loài qu n t m nghiên ứu n hạn

hế, nên việ áp dụng ho nhi u h và ph n b n h ầy ủ và h b o phủ.

Trong nghiên ứu này, h ng tôi ã thự hiện nghiên ứu ph n tí h phả hệ dự trên

d liệu 3 gen cob+nad1+cox và d liệu PCG ủ toàn b mtDN ủ SLRN

H. taichui á hủng ủ Việt N m và Lào , M. yokogawai Hàn Quố , KC330755

ể ph n tí h so sánh với mtDN ủ á loài sán lá khá hiện ó.

Các phân tích phả hệ dự trên mino id ng hợp t 3 PCG b o phủ h

gần nh u Heterophyid e, Opisthor hiid e, E hinostom tid e và F s iolid e h y

dự trên 12 PCG ủ á loài trong 0 h , mà ngoài h trên n ó thêm h

khá r ng hơn (Bảng PL .3) ã ợ thự hiện. Kết quả ủ tất ả ph n tí h phả hệ

u ho thấy H. taichui Việt N m và Lào u s p xếp ùng loài M. yokogawai

106

trong m t nhóm, ó là nhóm ủ h Heterophyid e. Nhóm h Heterophyidae này

luôn luôn ó qu n hệ gần nhất, s p xếp vị trí ― m‖ h y vị trí ― n

‖ monophyly với nhóm h Opisthor hiid e, với hệ số tin t ng bootstr p luôn

luôn mứ giá trị o và 00% H nh 3.5 và 3.6 . Vị trí ph n loại và mối qu n

hệ v loài ph n ấp ― m‖ (sister) ủ á loài trong h Heterophyid e và gi

h này với h Opisthor hiid e hoàn toàn ợ khẳng ịnh m t á h h h n nh

á kết quả ông bố nhi u nghiên ứu tr ớ y (Olson et al., 2003; Tkach et al.,

2016; Le et al., 2019; Rajapakse et al., 2020; Le et al., 2020b).

R ràng, m tr n topology ủ y phả hệ s dụng hu i mino id t

gen c ng hợp H nh 3. ho thấy sự s p t rất r ràng á vị trí ủ á loài trong

m t h và ủ á h trong á nhóm ó liên kết phả hệ với nh u với mứ ph n

giải rất o. ph n giải àng o gi á loài ùng h và á h ùng ph n b

àng i h i ó d liệu so sánh ấp loài với số l ợng PCG lớn hơn tứ là toàn b

PCG ủ mtDN hoàn hỉnh . B iểm n t qu n tr ng ại diện ho 3 t p hợp

lớn là á liên h Opisthor hioide , E hinostom toide và P r mphistom toide ,

trong ó liên h Opisthor hioide và E hinostom toide nằm vị trí ―đ n v ‖ h y

― m‖ monophyly , n Liên h P r mphistom toide vị trí ―lệch v ‖

p r phyly với h i nhóm trên H nh 3.6).

Nhóm liên h Opisthor hioide ó h i h Heterophyid e và Opisthor hiid e

thu ph n b Opisthor hi t , luôn luôn t p hợp ùng nh u, nh kết quả ph n tí h

phả hệ s dụng á hỉ thị ty thể và rDN ribosome khá (Olson et al., 2003;

Thaenkham et al., 2011; Le et al., 2017; Pérez-Ponce de León, Hernández-Mena,

2019 . Chỉ số tin t ng bootstr p ó giá trị tuyệt ối 00% ả 3 n t hính nơi

ph n ịnh liên h và – 00% á n t ph n ịnh á h ho thấy mối qu n hệ

loài gi á loài SLRN trong h Heterophyid e và qu n hệ phả hệ gi á loài sán

lá với nh u trong nghiên ứu này là rất r ràng. Ph n tí h phả hệ s dụng mino

id suy diễn m t lần n ũng ho ph p khẳng ịnh nh n x t v sự s p xếp gần

nh u ủ h Heterophyid e và Opisthorchiidae, vị trí ― m‖ trong ph n b

Opisthorchiata. T ơng tự, á h Fasciolidae và Echinostomatidae ũng luôn luôn

107

là ― m‖ trong ph n b Echinostomata nh m t số suy x t tr ớ y Thaenkham

et al., 2011; Le et al., 2017; 2019; 2020a,b; Pérez-Ponce de León, Hernández-Mena,

2019).

4.1.4. V đ n p cun cấp c sở liệu hệ n ty thể

Cho ến n y mới ó khoảng 80 ến 0 hủng ủ 0–70 loài sán lá ó d

liệu mtDN hoàn hỉnh và gần hoàn hỉnh, h b o phủ hết tất ả á hi và á

h trong lớp sán lá Trem tod , kể ả h sán lá ru t nh Heterophyidae (GOBASE:

http://gobase.bcm.umontreal.ca/) và d liệu ăng ký Ng n hàng gen GenB nk:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Gần nhất với h Heterophyid e là h Opisthorchiidae, ùng liên h

Opisthor hioide và ùng ph n b Opisthor hi t , b o gồm á loài sán lá g n nh ,

trong số ó ó loài O. viverrini g y ung th tiên phát ng i hol ngio r inoma).

ã ó nhi u d liệu gen h mtDNA qu n tr ng ủ h Opisthor hiid e ợ thu

nh n và ph n tí h, trong ó ó tất ả loài g y bệnh trên ng i và ng v t, ó là:

i Loài Clonorchis sinensis gồm hủng ủ Ng Shekhovtsov et al., 2010,

GenBank: FJ3 , ủ Trung Quố Cai et al., 2012; JF729303), củ Hàn Quố

(Cai et al., 2012; GenBank: JF7 30 và m t số hủng ủ Việt N m h ông

bố ủ h ng tôi ii Loài Opisthorchis felineus ủ Ng Shekhovtsov et al.; 2010,

GenB nk: EU 0 iii Loài O. viverrini ủ Lào Cai et al., 2012; GenBank:

JF739555), và m t số hủng ủ Việt N m h ông bố iv Loài O. sudarikovi

(Suleman et al., 2019b; GenBank: MK033132); v Loài Metorchis orientalis (Na et

al., 2016; GenB nk: KT 3 3 vi Loài Amphimerus sp. hủng JM- 0 ủ

Ecuador (Ma et al., 2019; GenBank: MK238506).

Gần y số l ợng mtDN ủ á loài sán lá ru t h E hinostom tid e và

E hino h smid e thu ph n b E hinostom t , ũng tăng áng kể. Cá h này

hứ á loài SLRN ó qu n hệ loài gần gũi với SLRN h Heterophyid e. Có thể kể

ến d liệu mtDN ủ á loài trong h E hinostom tid e là:

i Loài Hypoderaeum conoideum ủ Trung Quố (Yang et al., 2015a;

GenBank: KM111525); ii) Loài Echinostoma miyagawai ủ Trung Quố , gồm

108

hủng Hun n Fu et al., 2019; GenB nk: MN 7 0 và hủng Hubei (Li et al.,

2019; GenBank: MH393928) iii Loài E. hortense, hủng ủ Trung Quố Liu et

al., 2016; GenB nk: KR0 iv Loài E. revolutum, á hủng ủ Thái L n

(Le et al., 2020b; GenB nk: MN và Trung Quố Ran et al., 2020;

GenBank: MN116706); v ăng ký trong Ng n hàng gen n ó d liệu gen h

mtDN ủ á loài: loài Artyfechinostomum sufrartyfex Ấn GenB nk:

KY5 7 3 loài E. caproni Ai C p GenB nk: P0 770 loài E. paraensei

GenB nk: KT00 005 loài Echinostoma sp. hủng JM- 0 ủ Trung Quố

(GenBank: MH212284).

D liệu mtDN ủ á loài trong h E hino h smid e hỉ ó duy nhất m t

loài là Echinochasmus japonicus ợ thu nh n và ph n tí h mtDN (Le et al.,

2016; GenBank: KP844722).

M t h khá , h F s iolid e ũng thu ph n b E hinostom t , gồm á

loài sán lá g n lớn Fasciola spp. và sán lá ru t lớn Fascioloides magna và

Fasciolopsis buski), ũng là ối t ợng so sánh với h Heterophyid e v qu n hệ loài

và s p xếp khi ph n tí h phả hệ. Cho ến n y, mtDN ủ hầu hết á loài ại diện

h F s iolid e ã ợ thu nh n và ph n tí h, trong ó ó loài sán lá g n lớn

Fasciola hepatica, Australia (Le et al., 2001; GenBank: F 7 và m t hủng

ủ M GenBank: P0 7707 . Bên ạnh ó, loài ―thuần‖ F. gigantica, Trung

Quố Liu et al., 2014; GenBank: KF5 33 và loài ―lai‖ h y loài ―trung gian‖

Fasciola sp. ủ Trung Quố Liu et al., 2014; GenBank: KF543343) và nhi u

hủng loài ủ Việt N m. Ngoài r , loài F. jacksoni, Sri L nk , g y bệnh trên voi ã

ợ thu nh n và ph n tí h Rajakakse et al., 2020; GenBank: KX787886).

Ngoài chi Fasciola r , h F s iolid e n ó m t số loài khá ó mtDN

ũng ã ợ ông bố, gồm Fasciolopsis buski hủng ủ Trung Quố Ma et al.,

2017; GenB nk: KX 3 và ủ Ấn GenB nk: KX 33 và loài

Fascioloides magna chủng ủ S Ma et al., 2016; GenBank: KU060148).

R ràng, so với á h ó qu n hệ phả hệ kể trên, d liệu mtDN ủ SLRN

thu h Heterophyid e n thiếu rất nhi u. Tuy nhiên, ý thự ợ tầm qu n tr ng

109

ủ mtDN ủ SLRN ung ấp nguồn d liệu rất giá trị ho á l nh vự ứng dụng

xá ịnh loài, h n oán, ph n biệt, phả hệ, tiến hó , di truy n quần thể và ph ng

hống, nghiên ứu gen h mtDN ủ h Heterophyid e ng ợ y mạnh

trong ó ó nh ng ịnh h ớng nghiên ứu á loài SLRN ó tại Việt N m. Cơ s

d liệu mtDN ủ h ng tôi thu ợ t Haplorchis spp., mẫu ủ Việt N m,

ng là nh ng óng góp ể ạt ợ mụ tiêu ó.

4.2. V nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome H. taichui v H. pumilio

4.2.1. V thu nhận liệu n học đ n v m h ri osom

Trong nghiên ứu này, lần ầu tiên vùng mã hó toàn phần ủ rTU (rTU*)

ủ h i loài SLRN ủ Việt N m, Haplorchis taichui hủng QT3 và Haplorchis

pumilio hủng HPU ã ợ thu nh n và mô tả ầy ủ. Cá iểm gen và

vùng gi o gen ã ợ ph n tí h, tuy nhiên, vùng bản l IGS nối ầu 3‘ gen S

rRN với ầu 5‘ gen S rRN kế tiếp n h thu nh n ợ . Vùng mã hó

rTU ủ H. taichui Nishigori, , mẫu Việt N m, ó kí h th ớ 7.268 bp; và ủ

H. pumilio Looss, 1899, mẫu Việt N m, ó dài là 7. bp, b o phủ t ầu 5‘

ủ S ến uối 3‘ ủ S, hứ gen S rRN , 5. S rRN , 28S rRNA hoàn

hỉnh và vùng gi o gen ITS- và ITS- xen k gi á gen trên H nh 3.8).

Cho ến gần y, trong ơ s d liệu ơn vị mã hóa ribosome, hỉ mới ó

rTU hoàn hỉnh ủ SLRN, ó là rTU ủ loài Cryptocotyle lingua hủng K rtesh

ủa Ng , dài 7.615 bp, trong ó rTU* là 7.30 bp và rTU* ủ loài Euryhelmis

costaricensis ( hủng Fuku ủ Nh t Bản, dài 7.0 3 bp) (Sato et al., 2010) ợ

s dụng ể so sánh. Thự tế, rTU ủ loài C. lingua ó ả vùng IGS (7.615 bp),

nh ng nghiên ứu ủ h ng tôi hỉ lấy phần rTU* 7.30 bp ể ph n tí h so sánh.

Nh v y, ùng với d liệu ủ h i loài SLRN này, việ hoàn thành giải tr nh tự, h

giải và ph n tí h ầy ủ iểm gen vùng gi o gen rTU* ủ H. taichui và H.

pumilio mẫu ủ Việt N m ủ h Heterophyid e, ã ung ấp thêm d liệu gen

h ó giá trị ủ SLRN Haplorchis spp. ho b s u t p d liệu rTU trên thế giới.

Hơn n , H. taichui và H. pumilio là SLRN VLSN, ngh là ó khả năng g y

nhiễm trên ng i, trong khi ó h i loài C. lingua và Eu. costaricensis là SLRN ủ

110

riêng ng v t (Sato et al., 2010). Bên ạnh ó, nh ng kết quả thu ợ qu ph n

tí h so sánh iểm gen vùng gi o gen, thành phần và ph ơng thứ s dụng

nu leotide, ấu tr b h i ủ á gen 18S, 5.8S, 28S rRNA ribosome và vùng

gi o gen ITS- và ITS-2, mối qu n hệ v loài và phả hệ gi H. taichui và H.

pumilio với á loài ùng h Heterophyidae và ph n b Opisthor hi t àng làm

sáng t vị trí ủ Haplorchis spp. trong lớp Sán lá. Do v y, ũng nh mtDN , d

liệu rTU do h ng tôi thự hiện rất kịp th i, ó giá trị ho á nghiên ứu và ứng

dụng tiếp theo ủa chi Haplorchis và ủ h Heterophyid e, ph n b Opisthor hi t

ũng nh ủ Lớp Sán lá Việt N m và trên thế giới.

Theo ông bố và ăng ký trong Ng n hàng gen, ho ến n y mới ó khoảng

35 d liệu rTU gần hoàn hỉnh ủ khoảng 25 loài sán lá, trong ó mới ó loài

SLRN kể trên, ùng với loài ủ hi Haplorchis mà h ng tôi v thu nh n. Chính

v v y, giải tr nh tự và kh i thá d liệu rTU ủ SLRN hiện nay ng ợ y

mạnh. Kết quả nghiên ứu rTU ủ h ng tôi góp phần áp ứng nhu ầu ó.

4.2.2. V đặc điểm đ n v m h ri osom c sán lá ruột nhỏ plorchis

t ichui và . pumilio

- V s p xếp tr t tự gen, vùng mã hó toàn phần rTU* ủ h i loài H. taichui

và H. pumilio ủ Việt N m ó tr t tự s p xếp gen rRNA, vùng gi o gen ITS giống

nh á loài sán lá và nh s p xếp t hợp rTU ủ tất ả á loài ng v t bào

(Blair, 2006; Greber, Ban, 2016). Dãy ấu tr s p xếp gen và vùng gi o gen ủ

rTU* H. taichui và H. pumilio là: {5‘-18S-ITS1-5.8S-ITS2- S-3‘}, ũng giống

nh rTU m i loài sinh v t Blair, 2006). Khá với mtDN ó nhi u loại gen và số

l ợng nhi u PCG, MRG và tRN , nên vùng gi o gen mtDN ng n vài

ến vài hụ nu leotide, ngoại tr vùng NCR , rTU hỉ ó 3 gen mã hó RN S,

5. S và S nên á vùng gi o gen hính là là ITS-1 và ITS-2 ó dài vài trăm

ến trên m t ngh n nu leotide và ó ũng là á ơn vị ấu tr ủ rTU, ngoại tr

vùng bản l IGS dài ng n khá nh u theo loài (Schultz et al., 2005; Blair, 2006;

Greber, Ban, 2016; Briscoe et al., 2016; Cerqueira, Lemos, 2019).

- V kí h th ớ ơn vị mã hó ribosome, rTU* phần mã hó ủ

111

Haplorchis taichui Việt N m ó dài mứ trung b nh 7. bp và ủ H.

pumilio Việt N m ó dài lớn hơn 7. bp . So sánh với loài SLRN khá ùng

h Heterophyid e th rTU* ủ Haplorchis spp. s p t theo ấp dài là:

Hpum/(7.416 bp) > Clin/(7.301 bp) > Htai/(7.268 bp) > Ecos/(7.093 bp) (Bảng 3. .

Kí h th ớ rTU* ủ H. pumilio (Việt N m) lớn nhất trong số loài SLRN y là

do ITS-1 (1.106 bp) ủ loài này hứ nhi u ấu tr l p li n k TRU Bảng 3.6).

Cá gen mã hó rRN á loài trong h Heterophyid e ó dài t ơng ơng

á loài sán lá ợ biết ho ến n y SrRN là khoảng 50– 000 bp, 5. S

rRN ồng nhất là 0 bp và S rRN là khoảng 3,8–3,9 kb. Ở nghiên ứu này

h ng tôi h thu nh n ợ rTU hoàn hỉnh n thiếu IGS , nh ng qu ph n tí h

rTU hoàn hỉnh ủ SLRN loài Cryptocotyle lingua (Clin-Kartesh-RU, 7.615bp;

MW361240) và sán lá nói hung (Zheng et al., 2014; Su et al., 2018; Qiu et al.,

2019), h ng tôi ó nh n x t là sự hênh lệ h dài ủ toàn b rTU hủ yếu là do

vùng bản l IGS và vùng gi o gen ITS ó kí h th ớ khá nh u. Nh ng vùng giao

gen này ó hứ ho không hứ á ấu tr l p TRU với số l ợng và dài ủ

t ng TRU ó khá nh u (Brabec et al., 2015; Briscoe et al., 2016; Qiu et al., 2019).

- V iểm ấu tr b h i ủ gen rRNA và vùng gi o gen ITS:

Cấu tr b h i ủ gen 5.8S tất ả loài SLRN u giống nh u, tr m t

vài ph n nhánh nh gi gen, n lại u ó m t mô h nh ồng nhất H nh 3. ).

Gen 5.8S rRNA là m t gen ng n, bảo tồn rất o v thành phần nu leotide nên ấu

tr b h i ũng rất giống nh u, không nh ng SLRN và sán lá, mà n tất ả

á loài sinh v t. H i gen S rRN và S rRN , ũng tạo nên ấu tr b h i

phứ tạp hơn trong ó ó nh ng phần hoàn toàn ồng nhất và ó m t số phần ó

khá nh u, số l ợng và h nh dạng nhánh ―k p t ‖ và á ― m‖, ng y ả á

loài ùng h Blair, 2006). Nh ng phần giống nh u là ợ tạo nên b i á hu i

ồng nhất và bảo tồn, n phần s i khác là do á mi n biến i v ri ble dom in

trong gen. Mứ bảo tồn ủ hu i gen S rRN á hủng ùng loài là rất

cao (Lockyer et al., 2003 , o hơn rất nhi u so với hu i gen S rRN , do v y,

ấu tr b hai ủ hu i ― n t ận‖ nhi u hủng ùng loài ủ S rRN ó xu

112

h ớng rất giống nh u, tạo nên m t mô h nh hung H nh 3. 0 nh nh n thấy H.

taichui và H. pumilio trong nghiên ứu này. ối với gen S rRN ủ H. taichui

và H. pumilio, ồ h ấu tr b hai ợ hi làm phần, m t phần gi gen

và phần ki tạo thành do kết nối tr nh tự ối ng ợ á hu i ầu ầu 5‘ và ầu

uối 3‘ ủ gen (H nh 3. . Ở S rRN , á nhánh ―k p t ‖ ó số l ợng nhi u

hơn và dài nhánh ũng dài hơn và á ― m‖ tự do ũng nhi u hơn so với gen

S rRN . Chu i gen S rRN ó mứ s i khá o hơn rất nhi u so với gen

S rRN nên ấu tr b h i ũng dạng và phứ tạp hơn.

Cấu tr b h i ủ vùng gi o gen ITS- loài SLRN H. taichui và H.

pumilio ó xu h ớng hi làm phần, phần ― n ối‖ và phần ―không n ối‖

(H nh 3. . Ở ả phần, ấu tr b h i ITS- ủ h i loài Haplorchis vẫn là

t p hợp á nhánh ―k p t ‖ và á ― m‖, nh ng xuất hiện nhi u nhánh dài và

nhi u v m tự do hơn. Ở H. taichui, phần n ối h nh thành t sự b t p hu i

nu leotide ối ng ợ ầu ầu 5‘ và ầu uối 3‘ ủ ITS-1, trong khi ó phần n

ối H. pumilio nằm gi ITS- nơi ó 5 TRU tr ng ủ vùng gi o gen ITS-

ủ loài này. Phần không n ối ITS- ủ H. pumilio gồm nhi u nhánh và v m

tự do hơn H. taichui.

Cấu tr b h i ủ vùng gi o gen ITS- H. taichui và H. pumilio tu n thủ

theo mô h nh hung ủ ITS- loài, ó là sự tạo h nh dạng n n ―b n n án ‖

h y n g i là ―b n n n t y‖ (four finger), m t mô h nh bảo tồn ủ ITS- tất ả

loài sinh v t kể ả sán lá nh sán lá ph i (Schultz et al., 2005; Voronova,

Chelomina, 2018 . Dạng n n ấu tr b h i ―b n n n t y‖ ITS- ũng ợ

thấy H. taichui và H. pumilio và ả loài SLRN Cryptocotyle lingua (Clin-

K rtesh-RU và Euryhelmis costaricensis (Ecos-Fuku-JP) ùng h Heterophyid e

(H nh 3. 3 . Tuy nhiên, H. taichui ITS- ó thêm nhánh phụ ợ h nh thành

thêm t b t p nu leotide ối ng ợ ủ á ấu tr l p nh TRU ó trong ó.

Chu i gen rRN và vùng gi o gen ITS ủ rTU m i loài b o gi ũng ó

hứ á vùng mi n bảo tồn và biến i. Do 5. S, S và S rRN th m gi làm

thành phần ấu tr ủ ribosome, nên bảo tồn ấu tr b h i là hết sứ qu n

113

tr ng và ó là sự tạo h nh t á vùng mi n bảo tồn ủ rRN Schultz et al.,

2005; Blair, 2006 . M t khá , ấu tr b h i ó t vùng mi n biến i là ần

thiết ho sự dạng ủ loài. M t khá , ác nghiên ứu hứ năng rRN và vùng

gi o gen ITS ũng nh ph n tí h phả hệ yêu ầu sự liên kết ó tin y o t ơng

ồng vị trí ủ nucleotide ủ rRN /ITS ể h trợ ăn hỉnh và á vùng mi n bảo

tồn theo loài, theo h và o hơn ã h trợ ho á ph n tí h ph n giải bảo tồn và

tiến hó trong nghiên ứu qu n hệ loài và phả hệ (Caetano-Anolles, 2002; Coleman,

2003; Blair, 2006).

- V ph ơng thứ s dụng nu leotide và mứ t ơng ồng rTU ủ H.

taichui và H. pumilio, khá với mtDNA, s dụng A+T và G+C là t ơng ối n

bằng ả bốn ơn vị so sánh rTU*, S rRN , S rRN và S+ S rRN tuy

+T ít hơn G+C không áng kể, khoảng –2%, do ó, giá trị ộ lệ skewness

thiên v lệ h m rất thấp (–0.0 ến –0.060) (Bảng 3.7). H i loài SLRN ùng h ,

C. lingua Ng và Eu. costaricensis Nh t Bản ũng ó t ng thể A+T và G+C

ợ s dụng và giá trị lệ h theo mô h nh t ơng tự nh H. taichui và H. pumilio.

Ở ả tất ả ơn vị so sánh, mứ t ơng ồng ạt o nhất là gi loài H.

taichui và H. pumilio phản ánh ng tỷ lệ s dụng nu leotide trong ùng m t hi

H plor his và nhất là gi H. pumilio và Eu. costaricensis là tỷ lệ s dụng

nu leotide khá hi trong m t h (Bảng 3. ). Nh n hung, ph ơng thứ s dụng

nu leotide và mứ t ơng ồng rTU hoàn toàn khá với mtDN do thù

rRN ần ó ấu tr b h i v ng b n th m gi vào kiến tạo ơn vị ribosome ủ

tế bào Caburet et al., 2005; Schultz et al., 2005; Voronova, Chelomina, 2018).

Chính v t ơng ồng o và ó giá trị v mứ ấp h f mily nên hu i gen

rRN và rTU ít ợ s dụng ể tính toán khoảng á h di truy n loài, mà thiên v

t n dụng nh mã vạ h DN -b r oding gi á hi và h Littlewood, 2008).

4.2.3. V một s ứn ụn rT tron n hiên cứu i truy n và ph hệ

i u khá biệt là việ t m thấy á TRU trong ITS- loài H. pumilio và

trong ITS-2 loài H. taichui. Tr ớ y, m t số nghiên ứu ũng ã hỉ r , do ó

m t á TRU nên việ s dụng ITS- h y ITS- ho ph n tí h so sánh xá ịnh loài

114

và phả hệ ủ Haplorchis spp. g p khó khăn Olson et al., 2003; Van et al., 2009;

Skov et al., 2009). Kết quả ủ nghiên ứu này ã khẳng ịnh sự hiển diện TRU

trong vùng gi o gen ITS không thí h hợp ho việ s dụng á hỉ thị ITS trong

ph n tí h hu i xá ịnh phả hệ và ph n loại. ồng th i nghiên ứu này ũng ã

ung ấp hỉ thị gen S rRNA và S rRNA toàn phần th y thế trong s dụng

nghiên ứu so sánh hu i gen và ph n tí h phả hệ.

Cho ến n y, trong khi h ó ầy ủ hu i gen S rRN toàn phần ủ

á loài sán lá ng ợ qu n t m, th việ s dụng m t phần (khoảng 3 ầu gen

ph n oạn D –D3, khoảng . 00–1.500 bp) vẫn là tiêu hí thông dụng ho nghiên

ứu phả hệ, nguồn gố và tiến hó á loài sán lá Olson et al., 2003; Blair, 2006;

Littlewood, 2008; Thaenkham et al., 2011; Tkach et al., 2016 . Tuy nhiên, sự biến

i trong ph n oạn D –D3 h ủ ể phủ hết dạng loài hủng cho việ so sánh

liên h h y ph n b trong lớp Sán lá. i u này b t bu ần phải ó thêm nh ng d

liệu ầy ủ ủ toàn b gen S rRN , ụ thể là toàn phần hu i gen S rRN ể

so sánh ph n tí h. L ó, m t phần ủ S D –D3 ó thể s hỉ ể s dụng nh

m t hỉ thị mã vạ h b r ode ể tầm soát loài ho m t h trong nghiên ứu Blair,

2006; Littlewood, 2008). Trong nghiên ứu này, h ng tôi ph n tí h s dụng hỉ thị

S rRN toàn phần và ng hợp S+ S rRN ủ rTU ủ H. taichui và H.

pumilio và ứng dụng thành ông ho nghiên ứu phả hệ. So sánh tr nh tự hu i và

ph n tí h phả hệ s dụng S rRN toàn phần 3,7–3,8 kb) và ng hợp S+ S

toàn phần 5, –5,7 kb) ho nghiên ứu ph n tí h phả hệ lần ầu tiên ợ thự

hiện với á loài trong h Heterophyidae.

V mối qu n hệ phả hệ ợ x y dựng dự trên d liệu hỉ thị gen S

rRN toàn phần 3, kb và ng hợp S+ S rRN toàn phần (~5,8 kb) ũng

hoàn toàn ho kết quả s p xếp h i loài H. taichui và H. pumilio ùng nh u hi

Haplorchis) và s p xếp vị trí ― m‖ ủ hai h Heterophyidae và h

Opisthor hiid e trong Ph n b Opisthor hi t H nh 3. và 3.15). Tuy nhiên, ả

h i y phả hệ m t gen 28S rRNA toàn phần và ng hợp hai gen 18S+28S rRN

toàn phần , nhóm ủ h i loài Cryptocotyle lingua Clin-K rtesh-RU và

115

Euryhelmis costaricensis (Ecos-Fuku-JP) ó xu h ớng s p xếp gần, hiếm vị trí

― n ‖ ‖ m‖ với nhóm h Opisthorchiidae. Nhóm ủ Haplorchis spp. bị y

r vị trí ―lệ ‖ paraphyly) so với nhóm h Opisthorchiidae. Nh v y, trong mối

qu n hệ gần gi h i h Heterophyid e và Opisthor hiid e, á loài á hi khá

nh u trong h Heterophyidae ũng ó vị trí ph n loại khá nh u trong m t h và tạo

ảnh h ng t ơng qu n ph n ấp gi á h gần gũi. Có thêm d liệu nhi u loài

SLRN khá ủ á hi khá ung ấp hỉ thị rRN , th ph n giải ph n loài và

phân h s ợ làm sáng t hơn. Nh v y, ng hợp toàn phần gen rRN

(18S+ S ó lợi thế ph n tá h r ràng hơn mối qu n hệ v loài và v h

Heterophyidae do ảnh h ng ủ b sung ph n tí h k p á hỉ thị này mà rất nhi u

nghiên ứu ã t ng ghi nh n (Lockyer et al., 2003; Waeschenbach et al., 2007).

X t v vị trí ủ liên h và á ph n b , á h Heterophyidae và

Opisthorchiidae này u s p xếp trong liên h Opisthor hioide ph n b

Opisthorchiata) tá h biệt nh u khá r ràng với á h trong Ph n b E hinostom t

ó á h E hinostom tid e, F s iolid e và Ph n b Troglotrem t á h

Paragonimidae, Nanophyetidae, Collyriclidae) so sánh y, mà m t số nghiên ứu

tr ớ y ũng ã t ng ghi nh n khi ph n tí h á hỉ thị rRN và mtDN ơn l

ho hợp nhất (Olson et al., 2003; Thaenkham et al., 2011; Tkach et al., 2016; Le et

al., 2017; 2019; 2020b; Rajapakse et al., 2020; Pérez-Ponce de León, Hernández-

Mena, 2019). Tuy nhiên, số l ợng ơn vị loài h Heterophyidae vào ph n tí h

phả hệ n giới hạn, do v y, nhu ầu ần ó thêm nguồn d liệu rTU á loài khá

trong và ngoài h Heterophyidae là rất ần thiết.

Nghiên ứu giải tr nh tự toàn b rTU, ho ít nhất là vùng mã hó ủ rTU là

giải pháp tốt ể ó d liệu ung ấp toàn phần ủ gen S rRN và gen S rRN

ho ph n tí h so sánh hu i nu leotide và ph n tí h phả hệ gi á loài. Nghiên

ứu ủ h ng tôi ã góp phần ung ấp d liệu rTU ủ SLRN Haplorchis spp. và

ít nhất ó là hu i gen S rRN toàn phần ủ m t số loài trong h Heterophyid e

ể s dụng ph n tí h phả hệ và á ứng dụng khá .

116

4.2.4. V đ n p cun cấp c sở liệu đ n v m h ri osom

Sán lá ru t nh truy n qu á thu h Heterophyid e ph biến rất nhi u

n ớ trên thế giới, trong ó ó hàng hụ loài ký sinh ng i, m t số áng h ý là

á loài á hi Haplorchis, Metagonimus, Stellantchasmus, Centrocestus,

Procerovum và Heterophyes (Chai et al., 2020 . Nghiên ứu SLRN n ó nh ng

m t hạn hế nhất ịnh trên thế giới và Việt N m, trong ó n ó nhi u phiến diện

v á l nh vự nghiên ứu. Cho ến gần y, kiểm tr HTH vẫn là ph ơng thứ

ứng dụng phụ vụ giám ịnh và ph n loại. Có nhi u loài SLRN ó ngoại h nh và

kí h th ớ t ơng ối giống nh u, th ng tồn tại nhiễm trên m t v t hủ, nên

việ ph n biệt HTH, biệt là so sánh á mẫu không nguyên v n và lẫn tạp, nhi u

l ho kết quả n h th t hính xá De et al., 0 Trung Dũng. 0 5

Ng Văn Th nh et l., 0 Ch i, Jung, 0 ).

Với kết quả nghiên ứu ủ h ng tôi, d liệu rTU thế giới ã ó thêm phần

mã hó hoàn hỉnh ủ rTU t loài SLRN Haplorchis taichui (và Haplorchis

pumilio ký sinh g y bệnh trên ng i. M t số nghiên ứu tr ớ y ũng thu ợ

rTU hoàn hỉnh ủ á loài Cryptocotyle lingua (7.615bp; MW361240)

Euryhelmis costaricensis (7.049 bp; GenBank: AB521797; Sato et al., 2010).

Trình tự rTU hoàn chỉnh của sán lá ã ợ ông bố với số l ợng và hủng

loại ngày àng tăng. Có thể kể r m t số nhóm loài qu n tr ng, b o gồm: loài

Brachycladium goliath (9.296 bp; GenBank: KR703279; Briscoe et al., 2016); loài

Clinostomum complanatum 7. 73 bp GenB nk: MK 0 loài Clonorchis

sinensis năm hủng, 8.049–8.391 bp; GenBank: MK450523–MK450527; Qiu et

al., 2019); loài Collyriclum faba (7.265 bp; GenBank: JQ231122; Heneberg,

Literák, 2013) loài Diplostomum pseudospathaceum (7.991 bp; GenBank:

KR269766; Brabec et al., 2015); loài Diplostomum spathaceum (7.993 bp;

GenBank: KR269766; Brabec et al., 2015 loài Diplostomum ardeae (7.744 bp;

GenBank: MT259036; Locke et al., 2020); loài Eurytrema pancreaticum gồm 5

hủng là 8.310 bp, 8.309 bp, 8.310 bp, 8.306 bp và 8.309 bp; GenBank:

KY490000–KY490004; Su et al., 2018 loài sán lá g n lớn Fasciola hepatica

117

(7.657 bp; GenBank: MN970007; Le et al., 2020a và Fasciola gigantica hủng:

.7 bp GenB nk: MN 700 0 và .7 bp GenB nk: MN 7000 loài Fasciola

sp. (hybrid) (7.966 bp; GenBank: MN970008; Le et al., 2020a loài Fasciola

jacksoni (7.781 bp; GenBank: MN970006; Le et al., 2020a loài sán lá ru t lợn

Fasciolopsis buski (8.361 bp; GenBank: MN970005; Le et al., 2020a loài

Hysteromorpha triloba (8.020 bp; GenBank: MH521250; Locke et al., 2020 loài

sán lá ph i h u M Paragonimus kellicotti (5.338 bp; GenBank: HQ900670) loài

Metorchis orientalis năm hủng, 7. –9.162 bp; GenBank:

MK482051−MK482055; Qiu et al., 2019 loài Nanophyetus salmincola hủng,

. bp hủng; GenBank: LN871822–LN 7 3 loài Paramphistomum cervi

gồm 5 hủng ( . 3 bp, . 0 bp, 0.05 bp, 0. 7 bp, và 0. bp) (GenBank:

KJ459934; Zheng et al., 2014) loài sán máng Schistosoma japonicum (8.271–8.857

bp; Zhao et al., 2011); loài Schistosoma hippopotami (6.637 bp; GenBank:

AY197343; Morgan et al., 2003); loài Haplorchis taichui (7.268 bp; GenBank:

KX815126 loài sán lá ru t nh Haplorchis pumilio 7. bp GenB nk:

KX 5 5 loài Cryptocotyle lingua 7. 5bp MW3 0 loài Euryhelmis

costaricensis (7.049 bp; GenBank: AB521797; Sato et al., 2010); loài Isthmiophora

hortensis (6.871 bp; GenBank: AB189982) loài Philophthalmus gralli (7194 bp;

GenBank: JQ627832).

Chỉ thị trí h xuất t hu i nu leotide ủ mtDN và rTU rDN h y mino

id suy diễn t á PCG ủ mtDN là nh ng hỉ thị ph n t lý t ng ể phối hợp

với ph ơng pháp kiểm tr HTH trong ph n loại, giám ịnh loài, phát hiện, h n

oán, ịnh type, dị h tễ ph n t , phả hệ, tiến hó , nguồn gố và di truy n quần thể

(Le et al., 2002; Olson et al., 2003; Thaenkham et al., 2011; 2012; Pérez-Ponce de

León, Hernández-Mena, 2019). ấy là nh ng dấu tr ng theo loài, nh ng qu n

hệ phả hệ và nguồn gố ủ nhóm loài và ùng hung m t số iểm gen h ủ

m t hi, m t h ể so sánh và ph n tí h Wey-Fabrizius et al., 2013; Johansen et

al., 2015; Crampton-Platt et al., 2018). Muốn ó ợ hỉ thị ph n t ơn phần h y

phần ủ m t gen h y nhi u gen, h y ả toàn b m t hệ gen, kể ả ơn nguyên

118

mtDN ho rTU ủ m t loài, th ông việ tr ớ hết là giải tr nh tự và ph n tí h

gen hệ gen Blair, 2006; Le et al., 2002; 2017). Nh ng d liệu thu ợ ủ àng

nhi u loài àng tốt, v nh v y, d liệu ph n t ợ ung ấp àng loài

hủng và dạng ể so sánh Littlewood, 2008; Chan et al., 2021).

119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. ã nghiên ứu giải tr nh tự thành ông toàn b mtDNA ủ loài SLRN H.

taichui h Heterophyid e, mẫu Việt N m ã xá ịnh ấu tr và s p xếp gen trong

hệ gen, ph n tí h ầy ủ iểm gen, tính toán khoảng á h di truy n á loài

trong h Heterophyid e và h Opisthor hiid e và x y dựng phả hệ SLRN với á

loài sán lá. Toàn b mtDNA hoàn hỉnh ủ loài H. taichui ó dài 5. 0 bp

(MG972809), hứ 3 gen, gồm 12 gen mã hó protein, PCG (cox1–3; nad – và

nad4L; cob và atp6), 2 gen ribosome ty thể, MRG (16S/rrnL và S rrnS), 22 gen

v n huyển mino acid (tRNA) và m t vùng không mã hóa (NCR), hứ 5 ơn vị

ấu tr l p li n k , TRU1–5/ và 3 bp m i m t hu i.

2. T ng thành phần A+T và G+C s dụng theo mô h nh +T G+C , giá trị

ộ lệ (skew/skewness) s dụng A+T thiên v lệ h m và G+C lệ h d ơng. Sự

―t ên ‖ b mã s dụng nhi u nhất và ít nhất; và khoảng á h di truy n gi á

loài SLRN h Heterophyid e và h Opisthor hiid e ũng ã ợ xá ịnh. ã

ph n tí h mối qu n hệ v loài và x y dựng thành ông phả hệ SLRN dự trên hu i

mino id ng hợp ủ 3 PCG (cob+nad1+cox1) và PCG, xá ịnh vị trí ― n

‖ ‖ m‖ sister monophyly ủ h Heterophyid e với h Opisthor hiid e.

3. ã nghiên ứu giải tr nh tự thành ông toàn b phần mã hó ủ rTU ký

hiệu rTU* ủ SLRN Haplorchis taichui và H. pumilio, mẫu Việt N m, xá ịnh

ấu tr và s p xếp gen vùng gi o gen trong rTU*, ph n tí h ầy ủ iểm

gen vùng gi o gen, ấu tr b h i, tính toán khoảng á h di truy n á loài trong

h Heterophyid e và h Opisthor hiid e; và x y dựng phả hệ SLRN h

Heterophyid e và á loài sán lá khá . Vùng mã hó rTU ủ H. taichui có kích

th ớ 7. bp và ủa H. pumilio ó dài là 7. bp, hứ gen S rRNA, 5.8S

rRNA và S rRNA hoàn hỉnh và vùng gi o gen ITS- và ITS-2, biệt ã t m

thấy á ấu tr l p ó 5 TRU) trong ITS- loài H. pumilio và trong ITS-2 ó 3

TRU) loài H. taichui.

120

4. Tỷ lệ s dụng nu leotide theo mô h nh (G >> T > A≈ C), t ng thể A+T và

G+C (A+T < G+C), giá trị ộ lệ (skew/skewness) s dụng A+T là lệ h m rất

thấp và G+C ó lệ h d ơng không o. Mứ d t ơng ồng nộ loài gi á loài

SLRN là rất o và n oạ loà trong h Heterophyid e và h Opisthor hiid e là thấp

hơn. ã ph n tí h mối qu n hệ v loài và x y dựng thành ông phả hệ SLRN dự

trên m t gen S rRN toàn phần 3,7–3, kb và ng hợp S+ S rRN 5, –

5, kb , xá ịnh vị trí ― n ‖ ‖ m‖ sister (monophyly) ủ nhóm h

Heterophyidae với h Opisthor hiid e và vị trí ―lệ ‖ p r phyly ủ nhóm hi

Haplorchis so với á loài SLRN khá ùng h Heterophyidae.

KIẾN NGHỊ

1. Ở h Heterophyidae d liệu toàn b mtDNA và rTU n rất thiếu, do v y,

ần nghiên ứu giải tr nh tự thêm nhi u loài SLRN khá nhằm ung ấp ơ s d

liệu gen h mtDNA và rTU b o phủ á hi khá ể kh i thá ứng dụng.

2. Do qu n hệ loài và phả hệ gi h Heterophyid e và á h khá trong liên

h Opisthor hioide n là vấn phứ tạp, nên việ nghiên ứu tiến hó , phả hệ,

nguồn gố ủ Haplorchis spp. và á loài SLRN khá là ấp thiết, tiến tới làm sáng

t d nh pháp, loài, h , vị trí ph n loại và xuất ph ơng thứ ph ng hống bệnh do

á loài KST này g y nên.

121

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Ã CÔNG B

LIÊN QUAN ẾN Ề TÀI

1. Lê Thị Việt Hà, Nguyễn Thị Khuê, Nguyễn Thị Bí h Ng , oàn Thị Th nh

H ơng, Trung Dũng, ồng Văn Quy n, Lê Thanh Hòa (2015) iểm

gen h và ph n loại ủ á loài sán lá ru t nh (Haplorchis pumilio; H.

taichui; Stellantchasmus falcatus thu h Heterophyid e thu th p trên

ng i tại Việt N m‖, Tạp K o Q N K o T n ên à

ôn n ệ 31(4S): 63–71.

2. Lê Thị Việt H Nguyễn Thị Khuê, ồng Văn Quy n, Lê Thanh Hòa (2019)

Khoảng á h di truy n và t ơng qu n phả hệ ủ sán lá ru t h

Heterophyidae Việt N m, Tạp ôn n ệ S n 17(1): 59–66.

3. Le Thi Viet Ha, Nguyen Thi Khue, Dong Van Quyen, Thanh Hoa Le (2020)

Phylogenetic analyses of ribosomal transcription units from Haplorchis

taichui and H. pumilio species of Heterophyidae (Platyhelminthes:

4. Lê Thị Việt H Nguyễn Thị Khuê, ồng Văn Quy n, Lê Thanh Hòa (2021)

Opisthorchiata). Vietnam Journal of Biotechnology 18(4): 643–652.

So sánh iểm hệ gen ty thể ủ sán lá ru t nh Haplorchis taichui với

Metagonimus yokogawai và ơn vị mã hó ribosome với H. pumilio (h

Heterophyidae). Tạp ôn n ệ S n 19(1): 69–84.

122

SUMMARY OF THE DISSERTATION

Study on characteristics of the mitochondrial genome and ribosomal

transcription units of some zoonotic minute intestinal flukes

of Heterophyidae in Vietnam

Introduction

Minute intestinal flukes (MIFs) of Heterophyidae infect humans through

fish (by eating undercooked fish) and contain at least 29 species in 13 genera

worldwide distributed. More than 7 million people are infected with MIFs

(heterophyidiasis), most of whom live in Asian countries, including Korea, China,

Taiwan, Vietnam, Laos, Thailand, Malaysia, Indonesia, the Philippines and India. In

fact, reporting on MIF infection and prevention is still incomplete due to lack of

diagnosis and detection and inaccurate data from many countries. Some of their

developmental forms, ie., eggs, redia, cercariae and metacercariae, are

morphologically similar to other species. Despite this, over the past 100 years, MIF

species have been placed into their respective separate genera on the basis of

morphological taxonomy, with the addition of combined molecular data.

Molecular genetic markers and molecular technologies and tools have

contributed greatly to applied research. The source of molecular markers is the

DNA and deduced amino acid sequences (if any) of the mitochondrial genome

(mtDNA) and nuclear genome (nDNA), primarily the ribosomal coding unit (rTU).

The mtDNA sequences required for use include the entire genome, partial or

complete protein-coding genes (PCG) and the mitochondrial ribosomal RNA genes

(mitoribosomal gene, MRG). Ribosomal DNA sequences of rTU data were also

used. The need for molecular application to clarify taxonomic conditions and

positions, species/genus/family/interfamily and interfamily/suborder relationships is

very timely. For MIFs, further taxonomic studies based on analysis of molecular

markers of the family Heterophyidae and the superfamily

Opisthorchioidea/suborder Opisthorchiata are needed to confirm the correct

123

nomenclature of each species/genus/family. It is also the data served for exploration

making the basis for prevention and control programs for food/fish-born MIFs

emerged worldwide.

In order to supplement the mtDNA and rTU data of some MIFs circulating in

Vietnam and worldwide, we have ondu ted the topi : ―Study on characteristics

of the mitochondrial genome and ribosomal transcription units of some

zoonotic minute intestinal flukes of Heterophyidae in Vietnam‖ with the ims:

―Obtaining the entire mitochondrial genome and ribosomal transcription units of

some zoonotic parasitic minute intestinal flukes of Heterophyidae in Vietnam;

analyzing the characteristics of the genes and genomes in order to generate data

for applied research on molecular epidemiology, diagnosis and taxonomic

classification‖. In this study, we focus on the completion of the following contents:

1. To study on the sequencing of the mitochondrial genome of the minute intestinal

trematode Haplorchis taichui, analyzing genomic characteristics and building

phylogeny.

2. To study on sequencing ribosomal coding units of some minute intestinal fluke

species (Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio), analyzing genomic characteristics

and building phylogeny.

New contributions of this thesis to science

+ To have obtained and analyzed the genomic characteristics of the complete

mtDNA of Haplorchis taichui (the QT3 strain of Vietnam) and determined the

structure and mitochondrial genomic/genetic arrangement of H. taichui; and fully

analyzed the genomic and secondary structure of mitoribosomal genes, MRG (12S

and 16S), tRNA genes and non-coding regions of mtDNA of H. taichui.

+ To have an lyzed nu leotide us ge, ―skew‖ v lue in mtDN , gene

h r teristi s nd ―bi s‖ in codon usage in protein-coding genes (PCGs) and

genetic distance among H. taichui and other fluke species in the family

Heterophyidae and family Opisthorchiidae based on amino acid concatenation of

three PCGs (cob+nad1+cox1) and 12 PCGs; and analyzed taxonomic relationships

124

and phylogeny based on concatenated amino acid sequences of three PCGs

(cob+nad1+cox1) and of 12 PCGs.

+ To have obtained and analyzed the coding transcription unit (rTU) of

species Haplorchis taichui and H. pumilio, and determined the rTU structure and

gene arrangement/genomic region; and fully analyzed the genomic characterization

and secondary structure of 5.8S, 18S, 28S rRNA genes, ITS-1 and ITS-2 intergenic

spacers of rTU of H. taichui and H. pumilio.

+ To have an lyzed nu leotide us ge, ―skew‖ v lue in rTU, genetic distance

and identity of 18S, 28S, 18S+28S rRNA genes and coding rTU among H. taichui

and other MIF species in the family Heterophyidae based on rRNA and rTU genes;

and analyzed the taxonomic relationship and phylogeny of H. taichui and H.

pumilio based on single 28S rRNA and concatenated 18S+28S rRNA sequences.

Besides, the mtDNA database of H. taichui collected in Vietnam (strain

QT3) was compared with H. taichui (Laos sample) and Metagonimus yokogawai

(Korean sample) for genetic characterization and phylogeny. Similarly, the rTU

database of H. taichui and H. pumilio collected in Vietnam was also compared with

those species of the family Heterophyidae, Cryptocotyle lingua (Russia) and

Euryhelmis costaricensis (Japan), in terms of RNA genes/intergenic spacers,

secondary structure, identity and phylogeny.

+ From the results of the dissertation, four articles in Vietnamese and in

English were published in the prestigious national journals. The dissertation has

solved the study with the results of the successful sequenced mtDNA and rTUs of

H. taichui and H. pumilio, contributing to providing the necessary

genomic/proteomic data for the studies of evolution, phylogeny, origination and

clarification of nomenclature, species identification and fundamental data for

proposed methods of prevention of parasitic diseases.

Thesis layout

The thesis consists of 149 pages, including Introduction (2 pages),

Con lusion nd Re ommend tion p ges , List of the uthor‘s publi tions

125

page), Summary of the dissertation (8 pages), and Litst references (20 pages). In

addition to Acknowledgments; List of content; Table of content; List of

abbreviations; List of Tables; List of Figures; the Thesis includes 4 Chapters:

Chapter 1: Overview (40 pages); Chapter 2: Materials and Methods (15 pages);

Chapter 3: Research Results (39 pages); Chapter 4: Discussion (22 pages). The

Thesis includes 11 main Tables, 29 main Figures, 7 appendix Tables, 5 appendix

Figures. The List of References contains 178 references (14 in Vietnamese and 164

documents in English).

Thesis content

1. Mitochondrial genomics of the Vietnamese Haplorchis taichui

The entire mtDNA of the Vietnam sample H. taichui (Htai-QT3-VN)

registered in GenBank (no: MG972809), has a length of 15,120 bp, 11 bp shorter

compared to the Laos strain (15,131 bp). The circular mtDNA contains 36 genes,

including 12 PCGs, 2 MRGs, 22 tRNAs, and a non-coding region (NCR). The

mtDNA contained 12 PCGs, e.g., a complex of cytochrome oxidase subunit 1–3

(cox1; cox2; cox3); a complex of nicotinamide dehydrogenase subunit 1–6 (nad1;

nad2; nad3; nad4; nad4L, nad5; nad6); cytochrome b (cob or cytB) and adenosine

triphosphate synthase Fo subunit 6 (atp6). There is no atp8. Opened at cox3, the

linear structure is as follows: 5‘-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-nad2-VAD-

nad1-NPIK-nad3-S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-nad5-E-NCR

[TRU1–5]-G-3‘ (Fig. 3.2). The NCR was determined by the recognition of boundaries between tRNAGlu (trnE) and tRNAGly (trnG) which contains 5 TRUs

(182 and 183 bp/each unit).

In the mtDNA of H. taichui (Vietnam), the A+T use is 59.27% and the G+C is

40.73%, the skew/skewness value for A+T is negative (–0.340) and for G+C is

positive (0.392). To build 12 PCGs, the total A+T content is 60.08% and G+C is

39.92%, the skew value = –0.433 for (A+T) and 0.403 for (G+C). For two MRGs,

16S (rrnL) and 12S (rrnS), the use is less for A+T (57.22%) and more for G+C

(42.78%) than that of mtDNA and PCGs, thus the skew value is lower. The Laos

126

strain also has similar nucleotide usages (Table 3.2).

Two MRGs, such as rrnL (16S) and rrnS (12S), are separated by tRNACys

(trnC); and has a typical secondary structure. Length of 22 tRNAs is ranging, from 60 bp (at tRNAVal) to 73 bp (at tRNAGlu), mostly 62 to 64 bp, and the structure is ― lover le f‖-like; with one exception that is only tRNASer1 lacking the DHU-arm.

All 64 genetic codons are used in PCGs; initiation codon is ATG (for 8 genes)

and GTG (4 genes); the TAA and TAG are stop codons; and TGA for Tryptophan

(W). H. taichui mtDNA used 10,164 bp to encode 3,376 amino acids, making up 12

PCGs. Codon bias in H. taichui mtDNA showed up the mostly used as 301 for Phe-

TTT, 224 for Leu-TTG, 171 for Val-GTT; and the leastly used as 5 for Gln-CAA

and Arg-CGC, respectively.

The estimation of genetic distance rate (%) was inferred from the pairwise

comparison of concatenated amino acid sequences from 3 PCGs (cob+nad1+cox1)

between H. taichui and 12 members of Opisthorchioidea indicated that the rate was

low (only 0.3%) within the same species (intra-specific); and high within and

between the families Heterophyidae and Opisthorchiidae (17.4–26.6%; and 26.3–

32.0%).

A phylogenetic tree of 23 strains/16 species (Table PL2.2) of 6 families, of

which 4 strains of 3 species (H. taichui, M. yokogawai and S. falcatus) including

Htai-QT3-VN and Sfal-QN2-VN based on the amino acid alignment of

concatenated cob+nad1+cox1 was reconstructed. The topology indicated that H.

taichui was placed into the family Heterophyidae, together with the reference H.

taichui of Laos and the Korean M. yokogawai. The two families, Heterophyidae and

Opisthorchiidae, have a monophyletic (sister) relationship in the Opisthorchioidea,

which has been recently confirmed by many authors worldwide (Fig. 3.5).

A phylogenetic tree of 36 strains/32 species of trematodes providing amino

acids inferred from concatenated 12 PCGs (Table PL2.3) has also been constructed.

Strains/species belonged to 10 families, e.g., Cyclocoelidae; Echinochasmidae;

Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae; Gastrothylacidae; Heterophyidae;

127

Himasthlidae; Opisthorchiidae; Paramphistomatidae. The topology of the

phylogenetic tree indicated that the monophyletic position of the two families,

Heterophyidae and Opisthorchiidae, in the superfamily Opisthorchioidea of the

suborder Opisthorchiata has been solved (Fig. 3.6). The nodal bootstrap value of

100% for all main nodes (at superfamilies) and 98–100% for the branch nodes (at

families) well supported the clear taxonomic relationships between strains.

2. Genomics of ribosomal transcription units of the Vietnamese Haplorchis

taichui and H. pumilio

The coding rTU sequence of Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN) has a length

of 7,268 bp, and that of H. pumilio (Hpum-HPU8-VN) has a length of 7,416 bp, for

both of which the IGS regions not to be obtained. Five regions were fully defined as

18S rRNA, ITS-1, 5.8S rRNA, ITS-2, and 28S rRNA. In both species, 18S rRNA is

1,992 bp and 5.8S is 160 bp, but the 28S rRNA is 3,875 bp in H. taichui and 3,870

bp in H. pumilio. ITS-1 in H. taichui is 797 bp, and does not contain any TRU,

whereas ITS-1 in H. pumilio (1,106 bp) posseses 5 TRUs (TRU1–3/136 bp/each

and TRU4–5 /116 bp/each). In addition, ITS-2 in H. pumilio (280 bp) has no TRUs,

but ITS-2 in H. taichui (444 bp) contains 3 TRUs (83–85 bp/each).

The rRNA and ITS genes both have a secondary structure consisting of many

complex of "hairpin"s and "loop"s. 18S rRNA and its consensus sequence of H.

taichui/H. pumilio formed conserved secondary structure. ITS-2s of all four species

of Heterophyidae (H. taichui, H. pumilio, C. lingua and Eu. costaricensis) have a

common pattern called "four finger" structure.

The usage of nucleotides in four species of MIFs has a similar pattern, with the

most being G, followed by T, and le st nd C re ting the formul : G T ≈

C; and the use of A+T was less than G+C (A+T < G+C).

Phylogenetic analyses and tree construction using a 28S rRNA (3.859–3.879

bp) of 34 strains/28 species and concatenated 18S+28S rRNA (5.846–5.870 bp) of

23 strains/17 species (Tables PL2.5 and PL2.6) have been made. Topologies of both

showed that at the family level, Heterophyidae arranged "sister"/(monophyletic)

128

position with the family Opisthorchiidae, suborder Opisthorchiata. The suborder

Opisthorchiata is far distinct from the suborders Echinostomata (Echinostomatidae,

Fasciolidae) and suborder Troglotremata (Paragonimidae, Nanophyetidae,

Collyriclidae) (Figs 3.14 and 3.15). However, at the species level, the presence of

MIFs from other genera (species Cryptocotyle lingua and Euryhelmis costaricensis)

rendered the Haplorchis spp. in a paraphyletic position with the family

Opisthorchiidae. To solve hogher resolution, more rTU data from many other MIF

species are needed to elucidate the subspecies/family positions in the families

Heterophyidae/Opisthorchiidae of the suborder Opisthorchiata.

Thesis conclusion

1. To have sequenced complete mtDNA of Haplorchis taichui, Vietnamese

sample (Heterophyidae); determined the structure and arrangement of genes in the

genome, fully analyzed gene features, estimated the genetic distances of species in

the family Heterophyidae and family Opisthorchiidae and built MIF phylogeny. The

complete mtDNA of H. taichui is 15,120 bp in length (MG972809), containing 36

genes, including 12 PCGs (cox1–3; nad1–6 and nad4L; cob and atp6), 2 MRG

(16S/rrnL and 12S/rrnS), 22 tRNAs and a noncoding region (NCR) containing 5

tandem repeats (TRU1–5/182 and 183 bp/each).

2. Overall nucleotide usage of A+T and G+C was according to model (A+T

> G+C), the skew/skewness value of A+T was negative and of G+C positive; and

the codon usage and the most and least used codon for 12 PCGs were identified.

The genetic distances among the MIF species of the family Heterophyidae and the

family Opisthorchiidae were also identified. The taxonomic relationships and

phylogeny based on concatenated amino acid sequences of three PCGs

(cob+nad1+cox1) and of 12 PCGs, rendered the family Heterophyidae in the

‖sister‖ position monophyly with the family Opisthorchiidae.

3. To have sequenced the entire coding part of rTU (marked rTU*) of

Haplorchis taichui and H. pumilio, Vietnamese sample, determined the structure

and arrangement of RNA genes/intergenic spacer regions in rTU*, analyzed

129

gene/genomic regions, secondary structure, estimated genetic distances of species in

the family Heterophyidae and family Opisthorchiidae; and built a phylogeny of

species in the family Heterophyidae and other flukes. The rTU* of H. taichui is

7,268 bp and that of H. pumilio is 7,416 bp, containing the complete 18S rRNA,

5.8S rRNA and 28S rRNA genes; and 2 internal transcribed spacers, ITS-1 and ITS-

2, specifically tandem repeats (5 TRUs) found in ITS-1 in H. pumilio and (3 TRUs)

in ITS-2 in H. taichui.

4. To have found the pattern of nucleotide usage G T ≈ C , over ll

less A+T use than G+C (A+T < G+C), very low negative skew/skewness value of

A+T use and very low positive G+C use. The level of intra-specific identity among

MIF species is very high and the inter-specific identity within the Heterophyidae

and between Heterophyidae and Opisthorchiidae families is lower. Taxonomic

relationships were analyzed and MIF phylogenetic trees were successfully built

based on the analyses of complete 28S rRNA (3.7–3.8 kb) and concatenated

18S+28S rRNA (5.8–5.9 kb), that the families Heterophyidae and Opisthorchiidae

were rendered in the "sister"/(monophyletic) position.

Recommendations

1. In the family of Heterophyidae, the data of the entire mtDNA and rTU is

still lacking for many species, therefore, the study of sequencing and annotation for

more MIFs of different genera is necessary.

2. Due to the complicatedness of the taxonomic and phylogenetic relationships

between species in the family Heterophyidae and other families in the superfamily

Opisthorchioidea, the study of evolution, phylogeny, and origination of Haplorchis

spp. and other MIFs are essential. This is timely because of providing the

genomic/proteomic data which are needed to elucidate nomenclature, species, and

family relations making necessary suggestions for parasitic prevention and control.

130

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Amunts A, Brown A, Toots J, Scheres SHW, Ramakrishnan V (2015) The

structure of the human mitochondrial ribosome. Science 348 (6230): 95–98.

2. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, De-Bruijn MH, Coulson AR, Drouin

J, Eperon IC, Nlerlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJ, Staden R,

Young IG (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial

genome. Nature 290: 457–465.

3. Anh NTL, Phuong NT, Johansen MV et al. (2009a) Prevalence and risks for

fishborne zoonotic trematode infections in domestic animals in a highly

endemic area of North Vietnam. Acta Trop 112: 198–203.

4. Anh NTL, Phuong NT, Murrell KD, Johansen MV, Dalsgaard A, Thu LT, Chi

TTK, Thamsborg SM (2009b). Animal reservoir hosts and fish-borne zoonotic

trematode infections on fish farms, Vietnam. Emerg Infect Dis 15(4): 540–546.

5. Belizario VY Jr, de Leon WU, Bersabe MJ, Purnomo, Baird JK, Bangs MJ

(2004) A focus of human infection by Haplorchis taichui (Trematoda:

Heterophyidae) in the southern Philippines. J Parasitol 90(5): 1165–1169.

6. Benson G (1999) Tandem repeats finder: a program to analyze DNA

sequences. Nucleic Acids Res 27: 573–580.

7. Bernhart SH, Hofacker IL, Will S, Gruber AR, Stadler PF (2008) RNAalifold:

improved consensus structure prediction for RNA alignments. BMC

Bioinformatics 9: 474.

8. Bernt M, Braband A, Schierwater B, Stadler PF (2013a) Genetic aspects of

mitochondrial genome evolution. Mol Phylogenet Evol 69(2): 328–338.

9. Bernt M, Donath A, Jühling F, Externbrink F, Florentz C, Fritzsch G, Pütz J,

Middendorf M, Stadler PF (2013b) MITOS: improved de novo metazoan

mitochondrial genome annotation. Mol Phylogenet Evol 69: 313–319.

131

10. Betson M, Alonte AJI, Ancog RC, Aquino AMO, Belizario VY Jr, Bordado

AMD, Clark J, Corales MCG, Dacuma MG, Divina BP et al. (2020) Zoonotic

transmission of intestinal helminths in southeast Asia: Implications for control

and elimination. Adv Parasitol 108: 47–131.

11. Blair D (2006) Ribosomal DNA variation in parasitic flatworms. In: Maule

AG, Mark NJ (editors). Parasitic Flatworms: Molecular Biology,

Biochemistry, Immunology and Control. CAB International pp. 96–123.

12. Boore JL (1999) Animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Res 27: 1767–

1780.

13. Boore JL (2006) The use of genome-level characters for phylogenetic

reconstruction. Trends Ecol Evol 21(8): 439–446.

14. Brabec J, Kostadinova A, Scholz T, Littlewood DTJ (2015) Complete

mitochondrial genomes and nuclear ribosomal RNA operons of two species of

Diplostomum (Platyhelminthes: Trematoda): a molecular resource for

taxonomy and molecular epidemiology of important fish pathogens. Parasit

Vectors 8: 336.

15. Briscoe AG, Bray RA, Brabec J, Littlewood DTJ (2016) The mitochondrial

genome and ribosomal operon of Brachycladium goliath (Digenea:

Brachycladiidae) recovered from a stranded minke whale. Parasitol Int 65(3):

271–275.

16. Caburet S, Conti C, Schurra C, Lebofsky R, Edelstein SJ, Bensimon A (2005)

Human ribosomal RNA gene arrays display a broad range of palindromic

structures. Genome Res 15(8): 1079–1085.

17. Caetano-Anollés G (2002) Tracing the evolution of RNA structure in

ribosomes. Nucleic Acids Research 30: 2575–2587.

18. Cai XQ, Liu GH, Song HQ, Wu CY, Zou FC, Yan HK, Yuan ZG, Lin RQ,

Zhu XQ (2012) Sequences and gene organization of the mitochondrial

genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis

(Trematoda). Parasitol Res 110(1): 235–243.

132

19. Castellani CA, Longchamps RJ, Sun J, Guallar E, Arking DE (2020) Thinking

outside the nucleus: Mitochondrial DNA copy number in health and disease.

Mitochondrion 53: 214–223.

20. Castresana J (2000) Selection of conserved blocks from multiple alignments

for their use in phylogenetic analysis. Mol Biol Evol 17: 540–552.

21. Cerqueira AV, Lemos B (2019) Ribosomal DNA and the Nucleolus as

Keystones of Nuclear Architecture, Organization, and Function. Trends Genet

35(10): 710–723.

22. Chai JY (2019) Chapter 1. Heterophyids in Human Intestinal Flukes: From

Discovery to Treatment and Control. Springer, Dordrecht 2019. ISBN: 978-94-

024-1702-9.

23. Chai JY, Jung BK (2017) Fishborne zoonotic heterophyid infections: An

update. Food Waterborne Parasitol 8-9: 33–63.

24. Chai JY, Jung BK (2019) Epidemiology of Trematode Infections: An Update.

Adv Exp Med Biol 1154: 359–409.

25. Chai JY, Jung BK (2020) Foodborne intestinal flukes: A brief review of

epidemiology and geographical distribution. Acta Trop 201: 105210.

26. Chai JY, Shin EH, Lee SH, Rim HJ (2009) Foodborne intestinal flukes in

Southeast Asia. Korean J Parasitol 47 Suppl: S69–102. Review

27. Chai JY, Sohn WM, Na BK, Yong TS, Eom KS, Yoon CH, Hoang EH, Jeoung

HG, Socheat D (2014) Zoonotic trematode metacercariae in fish from Phnom

Penh and Pursat, Cambodia. Korean J Parasitol 52: 35–40

28. Chai JY, Yong TS, Eom KS, Min DY, Jeon HK, Kim TY, Jung BK, Sisabath

L, Insisiengmay B, Phommasack B, Rim HJ (2013) Hyperendemicity of

Haplorchis taichui infection among riparian people in Saravane and

Champasak Province, Lao PDR. Korean J Parasitol 51: 305–311.

29. Chai JY, Yong TS, Eom KS, Min DY, Shin EH, Banouvong V, Insisiengmay

B, Insisiengmay S, Phommasack B, Rim HJ (2010) Prevalence of the intestinal

flukes Haplorchis taichui and H. yokogawai in a mountainous area of

Phongsaly Province, Lao PDR. Korean J Parasitol 48(4): 339–342.

133

30. Chan AHE, Chaisiri K, Saralamba S, Morand S, Thaenkham U (2021)

Assessing the suitability of mitochondrial and nuclear DNA genetic markers

for molecular systematics and species identification of helminths. Parasit

Vectors 14: 233.

31. Chawin JF, Oster G, Glick BS (1998) Strong precursor-pore interactions constrain

models for mitochondrial protein import. Biophys J 74: 1732–1743.

32. Chen L, Yang DY, Liu TF, Nong X, Huang X, Xie Y, Fu Y, Zheng WP,

Zhang RH, Wu XH, Gu XB, Wang SX, Peng XR, Yang GY (2013)

Synonymous codon usage patterns in different parasitic platyhelminth

mitochondrial genomes. Genet Mol Res 12(1): 587–596.

33. Chen XJ, Butow RA (2005) The organization and inheritance of the

mitochondrial genome. Nat Rev Genet 6(11): 815–825.

34. Chi TT, Dalsgaard A, Turnbull JF, Tuan PA, Murrell KD (2008) Prevalence of

zoonotic trematodes in fish from a Vietnamese fish-farming community. J

Parasitol 94(2): 423–428.

35. Chontananarth T, Anucherngchai S, Tejangkura T (2018) The rapid detection

method by polymerase chain reaction for minute intestinal trematodes:

Haplorchis taichui inintermediate snail hosts based on 18S ribosomal DNA. J

Parasit Dis 42(3): 423–432.

36. Chontananarth T, Wongsawad C, Chomdej S, Krailas D, Chai JY (2014)

Molecular phylogeny of trematodes in Family Heterophyidae based on

mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (mCOI). Asian Pac J Trop Med

7(6): 446–450.

37. Choudhary K, Verma AK, Swaroop S, Agrawal A (2015) A review on the

molecular characterization of digenean parasites using molecular markers with

special reference to ITS region. Helminthologia 52(3): 167–187.

38. Coleman AW (2003) ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary

comparisons. Trends Genet 19: 370–375.

39. Crampton-Platt A, Yu DW, Zhou X, Vogler AP (2016) Mitochondrial

metagenomics: letting the genes out of the bottle. Gigascience 5: 15. Review.

134

40. Crimi M, Rigolio R (2008) The mitochondrial genome, a growing interest

inside an organelle. Int J Nanomed 3(1): 51–57.

41. D‘Souz R, Min zuk M 2018) Mitochondrial transcription and translation:

overview. Essays Biochem 62: 309–320.

42. De NV, Le TH (2011) Human infections of fish-borne trematodes in Vietnam:

prevalence and molecular specific identification at an endemic commune in

Nam Dinh province. Exp Parasitol 129: 355–361.

43. De NV, Le TH, Murrell KD (2012) Prevalence and intensity of zoonotic

fishborne trematodes in cultured freshwater fish from rural and urban areas of

Northern Vietnam. J Parasitol 98(5): 1023–1025.

44. De NV, Murrell KD, Cong LD, Cam PD, Chau LV, Toan ND, Dalsgaard

(2003) The food-borne trematode zoonoses of Vietnam. The current status of

parasitic diseases in Vietnam. Southeast Asian J Trop Med Pub Health

34(suppl 1): 12–34.

45. Desprès L, Imbert ED, Combes C, Monnerot M (1993) Molecular

characterization of mitochondrial DNA provides evidence for the recent

introduction of Schistosoma mansoni into America. Mol Biochem Parasitol 60:

221–230.

46. Trung Dũng 0 5 . Nghiên ứu iểm h nh thái và sinh ho ph n t

sán lá ru t nh trên ng i m t số tỉnh và hiệu quả i u trị tại ng ồng,

năm 0 0 - 2013. ận án T ến huyên ngành Ký sinh trùng . Viện Sốt r t–

Ký sinh trùng và Côn trùng trung ơng, Hà N i 0 5.

47. Trung Dũng, Nguyễn Văn , Trần Th nh D ơng và Lê Thanh Hòa

0 M t số iểm h nh thái h và xá ịnh loài sán lá ru t nh

Stellantchasmus falcatus và Echinochasmus japonicus s dụng hỉ thị S

ribosome. Tạp P n n bện S t ét à á bện K n t ùn 6: 51–59. 48. Trung Dũng, Trần Th nh D ơng, Nguyễn Thị Hợp, Lê Thanh Hòa,

Nguyễn Văn , Urus Thaenkham và Jitra Waikagul (2014b) iểm h nh

thái h m t số loài sán lá ru t nh h Heterophyid e ký sinh trên ng i tại

Việt N m. Tạp P n n bện S t ét à á bện K n t ùn 2: 66–74.

135

49. Trung Dũng, Trần Th nh D ơng, Nguyễn Văn và Lê Thanh Hòa

0 5 M t số iểm ph n t sán lá Stellantchasmus falcatus và

Echinochasmus japonicus kí sinh trên ng i tại Việt N m. Báo áo Kho h

toàn văn H i nghị Kí sinh trùng h toàn quố lần thứ Nghệ n, -

3/4/2015). N à ất b n K o T n ên à ôn n ệ 2015: 43–51.

50. Doanh PN, Horii Y, Nawa Y (2013) Paragonimus and paragonimiasis in

Vietnam: an update. Korean J Parasitol 51(6): 621–627.

51. Dung DT, De NV, Waikagul J, Dalsgaard A, Chai JY, Sohn WM, Murrell KD

(2007) Fishborne zoonotic intestinal trematodes, Vietnam. Emerg Infect Dis

13(12): 1828–1833.

52. Dung DT, Hop NT, Thaenkham U, Waikagul J (2013) Genetic differences

among Vietnamese Haplorchis taichui populations using the COI genetic

marker. J Helminthol 87(1): 66–70.

53. Dzikowski R, Levy MG, Poore MF, Flowers JR, Paperna I (2004) Use of

rDNA polymorphism for identification of Heterophyidae infecting freshwater

fishes. Dis Aquat Organ 59(1): 35–41.

54. El-Azazy OM, Abdou NE, Khalil AI, Al-Batel MK, Majeed QA, Henedi AA,

Tahrani LM (2015) Potential zoonotic trematodes recovered in stray cats from

Kuwait Municipality, Kuwait. Korean J Parasitol 53: 279–287.

55. Fraija-Fernández N, Waeschenbach A, Briscoe AG, Hocking S, Kuchta R,

Nyman T, Littlewood DTJ (2021) Evolutionary transitions in broad tapeworms

(Cestoda: Diphyllobothriidea) revealed by mitogenome and nuclear ribosomal

operon phylogenetics. Mol Phylogenet Evol 163: 107262.

56. Friedman JR, Nunnari J (2014) Mitochondrial form and function. Nature

505(7483): 335–343.

57. Fu YT, Jin YC, Li F, Liu GH (2019) Characterization of the complete

mitochondrial genome of the echinostome Echinostoma miyagawai and

phylogenetic implications. Parasitol Res 118(10): 3091–3097.

136

58. Gemayel R, Vinces MD, Legendre M, Verstrepen KJ (2010) Variable tandem

repeats accelerate evolution of coding and regulatory sequences. Annu Rev

Genet 44: 445–477.

59. Gray MW (2012) Mitochondrial evolution. Cold Spring Harb Perspect Biol

4(9): a011403.

60. Greber BJ, Ban N (2016) Structure and Function of the Mitochondrial

Ribosome. Annu Rev Biochem 85: 103–132.

61. Greiner S, Lehwark P, Bock R (2019) OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW)

version 1.3.1: expanded toolkit for the graphical visualization of organellar

genomes. Nucleic Acids Res 47(W1): W59–W64.

62. Gruber AR, Lorenz R, Bernhart SH, Neuböck R, Hofacker IL (2008) The

Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Res 36(Suppl 2): W70–W74,

63. Heneberg P, Literák I (2013) Molecular phylogenetic characterization of

Collyriclum faba with reference to its three host-specific ecotypes. Parasitol

Int 62(3): 262–267.

64. Hotez PJ (2019) The rise or fall of neglected tropical diseases in East Asia

Pacific. Acta Trop 202: 105–182.

65. Hu M, Gasser RB (2006) Mitochondrial genomes of parasitic nematodes -

progress and perspectives. Trends Parasitol 22(2): 78–84.

66. Johansen MV, Lier T, Sithithaworn P (2015) Towards improved diagnosis of

neglected zoonotic trematodes using a One Health approach. Acta Trop

141(B): 161–169.

67. Katoh K, Standley DM (2013) MAFFT multiple sequence alignment software

version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol 30: 772–780.

68. Khalifa R, El-Naffar MK, Arafa MS (1977) Studies on heterophyid cercariae

from Assiut Province, Egypt. I. Notes on the life cycle of Haplorchis pumilio

(Looss, 1896) with a discussion on previously described species. Acta

Parasitol Pol 25: 25–38

137

69. Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn , Nguyễn Thị Bí h Ng ,

Nguyễn Thị Tuyết Nhung, nders D lg rd 007 Ph n biệt sán lá ru t nh

Haplorchis taichui và H. pumilio với á loài sán lá khá s dụng hỉ thị ITS-2

(internal transcribed spacer). Tạp chí Khoa h c và Phát triển 1(5): 36–42.

70. Kinkar L, Young ND, Sohn W-M, Stroehlein AJ, Korhonen PK, Gasser RB

(2020) First record of a tandem-repeat region within the mitochondrial genome

of Clonorchis sinensis using a long-read sequencing approach. PLoS Negl

Trop Dis 14(8): e0008552.

71. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K (2018)

MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing

platforms. Mol Biol Evol 35: 1547–1549.

72. Kumar S, Stecher G, Tamura K (2016) MEGA7: molecular evolutionary

genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol 33: 1870–1874.

73. Kuroiwa T, Nishida K, Yoshida Y, Fujiwara T, Mori T, Kuroiwa H, Misumi O

(2006) Structure, function and evolution of the mitochondrial division

apparatus. Biochim Biophys Acta 1763(5-6): 510–521.

74. Lan-Anh NT, Madsen H, Dalsgaard A, Phuong NT, Thanh DT, Murrell KD

(2010) Poultry as reservoir hosts for fishborne zoonotic trematodes in

Vietnamese fish farms. Vet Parasitol 169(3-4): 391–394.

75. Laslett D, Canback B (2008) ARWEN: a program to detect tRNA genes in

metazoan mitochondrial nucleotide sequences. Bioinformatics 24: 172–175

76. Le TH, Blair D, McManus DP (2001) Complete DNA sequence and gene

organization of the mitochondrial genome of the liver fluke, Fasciola hepatica

(Platyhelminthes; Trematoda). Parasitology 123: 609–621.

77. Le TH, Blair D, McManus DP (2002) Mitochondrial genomes of parasitic

flatworms. Trends Parasitol 18: 206–213.

78. Le TH, Blair D, McManus DP (2004) Codonusage and bias in mitochondrial

genome of platyhelminths. Korean J Parasitol 42(4): 159–167.

138

79. Le TH, Nguyen KT, Nguyen NT, Doan HT, Dung DT, Blair D (2017) The

ribosomal transcription units of Haplorchis pumilio and H. taichui and the use

of 28S sequences for phylogenetic identification of common heterophyids in

Vietnam. Parasit Vectors 10: 17.

80. Le TH, Nguyen KT, Nguyen NTB, Doan HTT, Agatsuma T, Blair D (2019)

The complete mitochondrial genome of Paragonimus ohirai (Paragonimidae:

Trematoda: Platyhelminthes) and its comparison with P. westermani

congeners and other trematodes. Peer J 7: e7031.

81. Le TH, Nguyen NT, Nguyen KT, Doan HT, Dung DT, Blair D (2016) A

complete mitochondrial genome from Echinochasmus japonicus supports the

elevation of Echinochasminae Odhner, 1910 to family rank (Trematoda:

Platyhelminthes). Infect Genet Evol 45: 369–377.

82. Le TH, Pham KLT, Doan HTT, Le TKX, Nguyen KT, Lawton SP (2020a)

Description and phylogenetic analyses of ribosomal transcription units from

species of Fasciolidae (Platyhelminthes: Digenea). J Helminthol 94: e136.

83. Le TH, Pham LTK, Doan HTT, Le XTK, Saijuntha W, Rajapakse RPVJ,

Lawton SP (2020b) Comparative mitogenomics of the zoonotic parasite

Echinostoma revolutum resolves t xonomi rel tionships within the ‗E.

revolutum‘ spe ies group nd the E hinostom t Pl tyhelminthes: Digene .

Parasitology 147: 566–576.

84. Lê Th nh H 007 Ch n oán ph n loại ký sinh trùng bằng á ph ơng

pháp truy n thống và sinh h ph n t . Tạp Y t àn p M n

11(PB2): 1–8.

85. Lê Thanh Hòa 007b Chỉ thị di truy n ph n t s dụng trong giám ịnh,

h n oán, ph n loại, phả hệ, dị h tễ h và di truy n quần thể ký sinh trùng.

Tạp Y t àn p M n 11(PB2): 9–14.

86. Lee D, Choe S, Park H, Jeon HK, Chai JY, Sohn WM, Yong TS, Min DY,

Rim HJ, Eom KS (2013) Complete mitochondrial genome of Haplorchis

taichui and comparative analysis with other trematodes. Korean J Parasitol

51(6): 719–726.

139

87. Li T, He S, Zhao H, Zhao G, Zhu XQ (2010) Major trends in human parasitic

diseases in China. Trends Parasitol 26: 264–270.

88. Li Y, Ma XX, Lv QB, Hu Y, Qi HY, Chang QC, Wang CR (2020)

Characterization of the complete mitochondrial genome sequence of

Tracheophilus cymbius (Digenea), the first representative from the family

Cyclocoelidae. J Helminthol 94: E101.

89. Li Y, Qiu YY, Zeng MH, Diao PW, Chang QC, Gao Y, Zhang Y, Wang CR

(2019) The complete mitochondrial genome of Echinostoma miyagawai:

Comparisons with closely related species and phylogenetic implications. Infect

Genet Evol 75: 103961.

90. Littlewood DTJ (2008) Platyhelminth systematics and the emergence of new

characters. Parasite 15: 333–341

91. Littlewood DTJ, Lockyer AE, Webster BL, Johnston DA, Le TH (2006) The

complete mitochondrial genomes of Schistosoma haematobium and

Schistosoma spindale and the evolutionary history of mitochondrial genome

changes among parasitic flatworms, Mol Phylogenet Evol 39: 452–467.

92. Liu GH, Gasser RB, Young ND, Song HQ, Ai L, Zhu XQ (2014) Complete

mito hondri l genomes of the ‗intermedi te form‘ of Fasciola and Fasciola

gigantica, and their comparison with F. hepatica. Parasit Vectors 7: 150.

93. Liu ZX, Zhang Y, Liu YT, Chang QC, Su X, Fu X, Yue DM, Gao Y, Wang

CR (2016) Complete mitochondrial genome of Echinostoma hortense

(Digenea: Echinostomatidae). Korean J Parasitol 54(2): 173-179.

94. Locke SA, Drago FB, Núñez V, Souza GTRE, Takemoto RM (2020)

Phylogenetic position of Diplostomum spp. from New World herons based on

complete mitogenomes, rDNA operons, and DNA barcodes, including a new

species with partially elucidated life cycle. Parasitol Res 119(7): 2129–2137.

95. Lockyer AE, Olson PD, Littlewood DTJ (2003) Utility of complete large and

small subunit rRNA genes in resolving the phylogeny of the Neodermata

(Platyhelminthes): implications and a review of the cercomer theory. Biol J

Linn Soc Lond 78(2): 155–171.

140

96. Logan DC (2006) The mitochondrial compartment. J Exp Bot 57(6): 1225–

1243.

97. Lopez Sanchez MIG, Krüger A, Shiriaev DI, Liu Y, Rorbach J (2021) Human

Mitoribosome Biogenesis and Its Emerging Links to Disease. Int J Mol Sci 22:

3827.

98. Lowe TM, Chan PP (2016) tRNAscan on-line: Search and contextual analysis

of transfer RNA genes. Nucl. Acids Res 44: W54–57.

99. Lunt DH, Whipple LE, Hyman BC (1998) Mitochondrial DNA variable

number tandem repeats (VNTRs): utility and problems in molecular ecology.

Mol Ecol 7: 1441–1455.

100. M J, He JJ, Liu GH, Leontovyč R, K šný M, Zhu XQ 0 Complete

mitochondrial genome of the giant liver fluke Fascioloides magna (Digenea:

Fasciolidae) and its comparison with selected trematodes. Parasit Vectors 9:

429.

101. Ma J, He JJ, Liu GH, Zhou DH, Liu JZ, Liu Y, Zhu XQ (2015) Mitochondrial

and nuclear ribosomal DNA dataset supports that Paramphistomum leydeni

(Trematoda: Digenea) is a distinct rumen fluke species. Parasit Vectors 8: 201.

102. Ma J, He JJ, Zhou CY, Sun MM, Cevallos W, Sugiyama H, Zhu XQ,

Calvopiña M (2019) Characterization of the mitochondrial genome sequences

of the liver fluke Amphimerus sp. (Trematoda: Opisthorchiidae) from Ecuador

and phylogenetic implications. Acta Trop 195: 90–96.

103. Ma J, Sun MM, He JJ, Liu GH, Ai L, Chen MX, Zhu XQ (2017) Fasciolopsis

buski (Digenea: Fasciolidae) from China and India may represent distinct taxa

based on mitochondrial and nuclear ribosomal DNA sequences. Parasit

Vectors 10(1): 101.

104. Martin WF, Müller M (Eds) (2007) Origin of mitochondria and

hydrogenosomes. Springer Verlag, Heidelberg.

105. McManus DP, Le TH, Blair D (2004) Genomics of parasitic flatworms. Int J

Parasitol 34(2): 153–158.

141

106. McStay B (2016) Nucleolar organizer regions: genomic 'dark matter' requiring

illumination. Genes Dev 30(14): 1598–1610.

107. Morgan JA, DeJong RJ, Kazibwe F, Mkoji GM, Loker ES (2003) A newly-

identified lineage of Schistosoma. Int J Parasitol 33(9): 977–985.

108. Na L, Gao JF, Liu GH, Fu X, Su X, Yue DM, Gao Y, Zhang Y, Wang CR

(2016) The complete mitochondrial genome of Metorchis orientalis

(Trematoda: Opisthorchiidae): Comparison with other closely related species

and phylogenetic implications. Infect Genet Evol 39: 45–50.

109. Ngô Thị H ơng 00 . Nghiên ứu giải mã m t phần hệ gen ty thể ủ loài

sán lá g n nh Opisthorchis viverrini mẫu Việt N m và so sánh với á

hủng ủ thế giới bằng á ph ơng pháp sinh h ph n t . ận án T ến

n . Viện Công nghệ sinh h , Viện Hàn l m Kho h và Công nghệ

Việt N m.

110. Ng Văn Th nh 0 . Thự trạng nhiễm sán lá truy n qu á trên ng i, yếu

tố liên qu n và hiệu quả m t số giải pháp n thiệp tại huyện Ng Sơn, Th nh

Hó năm 0 3–2014. ận án T ến Y huyên ngành Ký sinh trùng .

Tr ng ại h Y Hà N i 0 .

111. Nguyen ST, Nguyen DT, Van Nguyen T, Huynh VV, Le DQ, Fukuda Y,

Nakai Y (2012) Prevalence of Fasciola in cattle and of its intermediate host

Lymnaea snails in central Vietnam. Trop Anim Health Prod 44(8): 1847–1853.

112. Nguyen TBN, De NV, Nguyen TKL, Quang HH, Doan HTT, Agatsuma T, Le

TH (2018) Distribution status of hybrid types in large liver flukes, Fasciola

species (Digenea: Fasciolidae), from ruminants and humans in Vietnam.

Korean J Parasitol 56(5): 453–461.

113. Nguyen TH, Dorny P, Nguyen TGT, Dermauw V (2021) Helminth infections

in fish in Vietnam: A systematic review. Int J Parasitol Parasites Wildl 14:

13–32.

142

114. Nguyễn Thị Khuê, Trung Dũng và Lê Thanh Hòa 0 5 Ph n tí h t ơng

ồng gen ty thể cox1 và th m ịnh loài sán lá ru t nh Haplorchis taichui và

H. pumilio (Platyhelminthes: Trem tod : Heterophyid e thu th p á tỉnh

phí b Việt N m. Báo áo Kho h toàn văn H i nghị Kí sinh trùng h

toàn quố lần thứ Nghệ n, -3/4/2015). N à ất b n K o t n ên

à ôn n ệ 2015: 64–71.

115. Nguyễn Thị Khuê, Lê Th nh H 0 Giám ịnh sán lá ru t nh

Haplorchis taichui và H. pumilio á tỉnh phí B Việt N m bằng hỉ thị

gen ty thể o 1 Tạp K o K t ật t y 21(5): 48–53

116. Nguyễn Văn , Lê Th nh Hoà 00 Xá ịnh loài sán d y Taenia

saginata và Taenia asiatica g y bệnh trên ng i Việt N m bằng sinh h ph n

t . Tạp Y V ệt N m 318(1): 42–50.

117. Nguyễn Văn , Lê Th nh H 00 b Xá ịnh thành phần loài sán lá g n

nh ký sinh trên ng i tại 0 tỉnh Việt N m bằng ph ơng pháp sinh h

ph n t hệ gen ty thể. Tạp N ên ứ Y 5: 14–18.

118. Nguyễn Văn , Lê Th nh H , Nguyễn Thị Hợp 00 Xá ịnh loài sán lá

ru t nh sm ll intestin l flukes ký sinh trên ng i Việt N m. Tạp Y

t àn 9: 65–68.

119. Nolan MJ, Cribb TH (2005) The use and implications of ribosomal DNA

sequencing for the discrimination of digenean species. Adv Parasitol 60: 101–

163.

120. Okimoto R, Wolstenholme DR (1990) A set of tRNAs that lack either the TpsiC

arm or the dihydrouridine arm, towards a minimal tRNA adaptor. EMBO J 9:

3405–3411.

121. Olson PD, Cribb TH, Tkach VV, Bray RA, Littlewood DTJ (2003) Phylogeny

nd l ssiﬁ tion of the Digene Pl tyhelminthes: Trem tod . Int J Parasitol

33: 733–755.

122. Ozawa T (1995) Mechanism of somatic mitochondrial DNA mutations

associated with age and diseases. Biochim Biophys Acta 1271(1): 177–189.

143

123. Pearson JC, Ow-Yang CK (1982) New species of Haplorchis from Southeast

Asia, together with keys to the Haplorchis-group of heterophyid trematodes of

the region. Southeast Asian J Trop Med Public Health 13: 35–60.

124. Pérez-Ponce de León G, Hernández-Mena DI (2019) Testing the higher-level

phylogenetic classification of Digenea (Platyhelminthes, Trematoda) based on

nuclear rDNA sequences before entering the age of the 'next-generation' Tree

of Life. J Helminthol 93(3): 260–276.

125. Perna NT, Kocher TD (1995) Patterns of nucleotide composition at fourfold

degenerate sites of animal mitochondrial genomes. J Mol Evol 41: 353–358

126. Phan VT, Ersbøll AK, Bui TQ, Nguyen HT, Murrell D, Dalsgaard A (2010a)

Fish-borne zoonotic trematodes in cultured and wild-caught freshwater fish

from the Red River Delta, Vietnam. Vector Borne Zoonotic Dis 10(9): 861–

866.

127. Phan VT, Ersbøll AK, Do DT, Dalsgaard A (2011) Raw-fish-eating behavior

and fishborne zoonotic trematode infection in people of northern Vietnam.

Foodborne Pathog Dis 8(2): 255–260.

128. Phan VT, Ersbøll AK, Nguyen TT, Nguyen KV, Nguyen HT, Murrell D,

Dalsgaard A (2010b) Freshwater aquaculture nurseries and infection of fish

with zoonotic trematodes, Vietnam. Emerg Infect Dis 16(12): 1905–1909.

129. Potapova TA, Gerton JL (2019) Ribosomal DNA and the nucleolus in the

context of genome organization. Chromosome Res 27(1-2): 109–127.

130. Qiu YY, Gao Y, Li Y, Ma XX, Lv QB, Hu Y, Qiu HY, Chang QC and Wang

CR (2019) Comparative analyses of complete ribosomal DNA sequences of

Clonorchis sinensis and Metorchis orientalis: IGS sequences may provide a

novel genetic marker for intraspecific variation. Infect Genet Evol 78: 104–

125.

131. Radomyos P, Wongsaroj T, Wilairatana P, Radomyos P, Praevanich R,

Meesomboon V, Jongsuksuntikul P (1998) Opisthorchiasis and intestinal fluke

infections in northern Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health 29:

123–127.

144

132. Rajapakse RPVJ, Pham KLT, Karunathilake KJK, Lawton SP, Le TH (2020)

Characterization and phylogenetic properties of the complete mitochondrial

genome of Fascioloides jacksoni (syn. Fasciola jacksoni) support the

suggested intergeneric change from Fasciola to Fascioloides (Platyhelminthes:

Trematoda: Plagiorchiida). Infect Genet Evol 82: 104281.

133. Ran R, Zhao Q, Abuzeid AMI, Huang Y, Liu Y, Sun Y, He L, Li X, Liu J, Li

G (2020) Mitochondrial Genome Sequence of Echinostoma revolutum from

Red-Crowned Crane (Grus japonensis). Korean J Parasitol 58(1): 73–79.

134. Rim HJ, Chai JY, Min DY, Cho SY, Eom KS, Hong SJ, Sohn WM, Yong TS,

Deodato G, Standgaard H, Phommasack B, Yun CH, Hoang EH (2003)

Prevalence of intestinal parasite infections on a national scale among primary

schoolchildren in Laos. Parasitol Res 91: 267–272.

135. Saccone BC, De Giorgi C, Gissi C, Pesole G, Reyes A (1999) Evolutionary

genomics in Metazoa: the mitochondrial DNA as a model system. Gene 238(1):

195–209.

136. Salim D, Gerton JL (2019) Ribosomal DNA instability and genome

adaptability. Chromosome Res 27(1-2): 73–87.

137. Santos CP, Borges JN (2020) Current Knowledge of Small Flukes (Digenea:

Heterophyidae) from South America. Korean J Parasitol 58(4): 373–386.

138. Saraste M (1999) Oxidative phosphorylation at the fin de siecle. Science 283:

1488–1493.

139. Sato H, Ihara S, Inaba O, Une Y (2010) Identification of Euryhelmis

costaricensis metacercariae in the skin of Tohoku hynobiid salamanders

(Hynobius lichenatus), northeastern Honshu, Japan. J Wildl Dis 46(3): 832–

842.

140. Sayasone S, Vonghajack Y, Vanmany M, Rasphone O, Tesana S, Utzinger J,

Akkhavong K, Odermatt P (2009) Diversity of human intestinal helminthiasis

in Lao PDR. Trans R Soc Trop Med Hyg 103(3): 247–254.

145

141. Schultz J, Maisel S, Gerlach D, Müller T, Wolf M (2005) A common core of

secondary structure of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) throughout the

Eukaryota. RNA 11(4): 361–364.

142. Shekhovtsov SV, Katokhin AV, Kolchanov NA, Mordvinov VA (2010) The

complete mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis felineus and

Clonorchis sinensis (Trematoda). Parasitol Int 59(1): 100–103.

143. Skov J, Kania PW, Dalsgaard A, Jørgensen TR, Buchmann K (2009) Life

cycle stages of heterophyid trematodes in Vietnamese freshwater fishes traced

by molecular and morphometric methods. Vet Parasitol 160(1-2): 66–75.

144. Su X, Zhang Y, Zheng X, Wang XX, Li Y, Li Q, Wang CR (2018)

Characterization of the complete nuclear ribosomal DNA sequences of

Eurytrema pancreaticum. J Helminthol 92: 484–490.

145. Suleman, Khan MS, Heneberg P, Zhou CY, Muhammad N, Zhu XQ, Ma J

(2019a) Characterization of the complete mitochondrial genome of Uvitellina

sp., representative of the family Cyclocoelidae and phylogenetic implications.

Parasitol Res 118: 2203–2211.

146. Suleman, Ma J, Khan MS, Sun MM, Muhammad N, He JJ, Zhu XQ (2019b)

Mitochondrial and nuclear ribosomal DNA dataset suggests that Hepatiarius

sudarikovi Feizullaev, 1961 is a member of the genus Opisthorchis Blanchard,

1895 (Digenea: Opisthorchiidae). Parasitol Res 118(3): 807–815.

147. Symonová R (2019) Integrative rDNAomics—Importance of the Oldest

Repetitive Fraction of the Eukaryote Genome. Genes 10(5): 345.

148. Tang JX, Thompson K, Taylor RW, Oláhová M (2020) Mitochondrial

OXPHOS Biogenesis: Co-Regulation of Protein Synthesis, Import, and

Assembly Pathways. Int J Mol Sci 21: 3820

149. Telford MJ, Herniou EA, Russell RB, Littlewood DT (2000) Changes in

mitochondrial genetic codes as phylogenetic characters: two examples from

the flatworms. Proc Natl Acad Sci USA 97(21): 11359–11364.

146

150. Thaenkham U, Blair D, Nawa Y, Waikagul J (2012) Families Opisthorchiidae

and Heterophyidae: are they distinct? Parasitol Int 61(1): 90–93.

151. Thaenkham U, Dekumyoy P, Komalamisra C, Sato M, Dung do T, Waikagul J

(2010) Systematics of the subfamily Haplorchiinae (Trematoda:

Heterphyidae), based on nuclear ribosomal DNA genes and ITS2 region.

Parasitol Int 59(3): 460–465.

152. Thaenkham U, Nawa Y, Blair D, Pakdee W (2011) Confirmation of the

paraphyletic relationship between families Opisthorchiidae and Heterophyidae

using small and large subunit ribosomal DNA sequences. Parasitol Int 60(4):

521–523.

153. Thaenkham U, Phuphisut O, Nuamtanong S, Yoonuan T, Sa-Nguankiat S,

Vonghachack Y, Belizario VY, Dung DT, Dekumyoy P, Waikagul J (2017)

Genetic differences among Haplorchis taichui populations in Indochina

revealed by mitochondrial COX1 sequences. J Helminthol 91(5): 597–604.

154. Thien PC, Dalsgaard A, Thanh BN, Olsen A, Murrell KD (2007) Prevalence of

fishborne zoonotic parasites in important cultured fish species in the Mekong

Delta, Vietnam. Parasitol Res 107: 1277–1284

155. Thu ND, Dalsgaard A, Loan LTT, Murrell KD (2007) Survey for zoonotic

liver and intestinal trematode metacercariae in cultured and wild fish in An

Giang Province, Vietnam, Korean J Parasitol 45(1): 45–54.

156. Tkach VV, Kudlai O, Kostadinova A (2016) Molecular phylogeny and

systematics of the Echinostomatoidea Looss, 1899 (Platyhelminthes: Digenea).

Int J Parasitol 46(3): 171–185.

157. Toledo R, Esteban JG (2016) An update on human echinostomiasis. Trans R

Soc Trop Med Hyg 110(1): 37–45.

158. Tomal A, Kwasniak-Owczarek M, Janska H (2019) An Update on

Mitochondrial Ribosome Biology: The Plant Mitoribosome in the Spotlight.

Cells 8: 1562.

147

159. Tran TK, Murrell KD, Madsen H, Nguyen VK, Dalsgaard A (2009) Fishborne

zoonotic trematodes in raw fish dishes served in restaurants in Nam Dinh

Province and Hanoi, Vietnam. J Food Prot 72(11): 2394–2399.

160. Turowski T, Tollerve D (2015) Cotranscriptional events in eukaryotic

ribosome synthesis. WIREs RNA 6: 129–139.

161. Van KV, Dalgaard A, Blair D, Le TH (2009) Haplorchis pumilio and H.

taichui in Vietnam discriminated using ITS-2 DNA sequence data from adults

and larvae. Exp Parasitol 123: 146–151.

162. Voronova A, Chelomina GN (2018) Genetic diversity and phylogenetic

relations of salmon trematode Nanophyetus japonensis. Parasitol Int 67(3):

267–276.

163. Waeschenbach A, Littlewood DTJ (2017) Chapter 22: A molecular framework

for the Cestoda. In: Caira JN, Jensen K (editors). Planetary Biodiversity

Inventory (2008–2017): Tapeworms from the Vertebrate Bowels of the Earth.

Publisher: University of Kansas, Natural History Museum, Special Publication

No. 25, pp. 431–451.

164. Waeschenbach A, Webster BL, Bray RA, Littlewood DTJ (2007) Added

resolution among ordinal level relationships of tapeworms (Platyhelminthes:

Cestoda) with complete small and large subunit nuclear ribosomal RNA genes.

Mol Phylogenet Evol 45(1): 311–325.

165. Waeschenbach A, Webster BL, Littlewood DTJ (2012) Adding resolution to

ordinal level relationships of tapeworms (Platyhelminthes: Cestoda) with large

fragments of mtDNA. Mol Phylogenet Evol 63: 834–847.

166. Weider LJ, Elser JJ, Crease TJ, Mateos M, Cotner JB, Markow TA (2005) The

functional significance of ribosomal rDNA variation: Impacts on the

evolutionary ecology of organisms. Annu Rev Ecol Evol Syst 36: 219–242.

167. Wey-Fabrizius AR, Podsiadlowski L, Herlyn H, Hankeln T (2013) Platyzoan

mitochondrial genomes. Mol Phylogenet Evol 69(2): 365–375.

148

168. Wijit A, Morakote N, Klinchid J (2013) High prevalence of haplorchiasis in

Nan and Lampang Provinces, Thailand, proven by adult worm recovery from

suspected opisthorchiasis cases. Korean J Parasitol 51: 767–769.

169. Wolstenholme DR (1992) Animal mitochondrial DNA, structure and evolution,

Int Rev Cytol 141: 173–216

170. Wongsawad C, Wongsawad P (2012) Opisthorchis viverrini and Haplorchis

taichui: development of a multiplex PCR assay for their detection and

differentiation using specific primers derived from HAT-RAPD. Exp Parasitol

132: 237–242.

171. Yan HB, Wang XY, Lou ZZ, Li L, Blair D, Yin H, Cai JZ, Dai XL, Lei MT,

Zhu XQ, Cai XP, Jia WZ (2013) The mitochondrial genome of

Paramphistomum cervi (Digenea), the first representative for the family

Paramphistomidae. PLoS One 8(8): e71300.

172. Yang X, Gasser RB, Koehler AV, Wang L, Zhu K, Chen L, Feng H, Hu M,

Fang R (2015a) Mitochondrial genome of Hypoderaeum conoideum -

comparison with selected trematodes. Parasit Vectors 8: 97.

173. Yang X, Zhao Y, Wang L, Feng H, Tan L, Lei W, Zhao P, Hu M, Fang R

(2015b). Analysis of the complete Fischoederius elongatus

(Paramphistomidae, Trematoda) mitochondrial genome. Parasit Vectors 8:

279.

174. Yusoff AAM (2015) Role of mitochondrial DNA mutations in brain tumors: A

mini-review. J Can Res Ther 11: 535–544.

175. Zarowiecki MZ, Huyse T, Littlewood DTJ (2007) Making the most of

mitochondrial genomes – Markers for phylogeny, molecular ecology and

barcodes in Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea). Int J Parasitol 37: 1401–

1418.

176. Zhang DX, Hewitt GM (1997) Insect mitochondrial control region: a review of

its structure, evolution and usefulness in evolutionary studies, Biochem Syst

Eco 25: 99–120.

149

177. Zhao YY, Yang X, Chen HM, Wang LX, Feng HL, Zhao PF, Tan L, Lei WQ,

Ao Y, Hu M, Fang R (2017) The complete mitochondrial genome of

Orthocoelium streptocoelium (Digenea: Paramphistomidae) for comparison

with other digeneans. J Helminthol 91(2): 255–261.

178. Zheng X, Chang QC, Zhang Y, Tian SQ, Lou Y, Duan H, Guo DH, Wang CR,

Zhu XQ (2014) Characterization of the complete nuclear ribosomal DNA

sequences of Paramphistomum cervi. Scientific World J 2014: 751907.

Bảng PL2.1. Danh sách mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui (mẫu QT3, Việt Nam)

Chuỗi mồi (5’ -> 3’)

Vị trí

Tên mồi

PNAD1F* JNAD1R* TRECOBF* TRECOBR* URNLF* URNSR* JB3F* JB4.5R* UNI16F* UNI16R* UNI12F* UNI12R* GLYF* GLYR* HTA1F HTA2R HTA3F HTA4R HTA5F HTA6F HTA6R HTAF HTAR Hsp9F HTA12R HTA13R HTA14F HTA15R HTA16F HTA17R HTA18F

GATTATGGTGAGTCTGAAAGTGAG CTCACTTTCAGACTCACCATAATC CAGATGTCYTATTGGGCTGC GAACHRVCCACARYCCCTTAAAC AGCCAGGTTGGTTCTTATCTAT TACCWTGTTACGACTTAHCWCA TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG TGGCCGCAGTATHTTGACTGTGC TCTCGGGGTCTTTCCGTCT GGTACAYACCGCCCGTC GACGGGCGGTRTGTACC AGTATKYYGTCTTTCCAAGTC ACKAGACCHCYGACTTGGAAAGAC TCTTATTTACTATCGGGGGGGTGAC TCAAACAACACTCCCCAAACAGAC GACTTGGGGGATTATGCGTTACTG TGTAGACCGCTCACGAGAAACTTC GGTCGTTTTTGGGGTTTGCG GTGAATAAGGGTTATGTCGAG CTCGACATAACCCTTATTCAC CGTGTGTCATAAGAGATGGTCCG CCCCAACTAAATCCCCCTTC ATGATGTGGTGGCTACTCG GCCCCATGTGAACCAAGAAC CTATACCCACCATAACCACTC GGGACCTGATGGGCTTATCG CGACCCACATAACGGGACAA ACCTCGTGGTAACTTCGTCG CACCCTCACCCCCAATAACC CCTTTTATTGGGGAGGGGCT

nad1 nad1 cob cob rrnL rrnS cox1 cox1 rrnL rrnL rrnS rrnS trnG trnG cox1 cox1 rrnS rrnS nad1 nad3 nad3 rrnS rrnS nad4 cob cox3 nad5 nad5 rrnS nad5 trnE

Ghi ch : D u sao (*): Các mồi chung của hệ gen ty thể sán lá (trematode) Bảng PL2 2. Danh sách 23 chủng 6 loài thuộc ph n bộ Opisthorchiata cung c p chu i gen cob, nad1 và cox1 của mtDN ể ph n t ch ác nh quan hệ phả hệ của loài sán lá ruột nhỏ h Heterophyidae

ọ/ oài

Nguồn gốc

Lào Việt Nam Hàn Quốc Việt Nam Lào Việt Nam Thái Lan

Kí hiệu chủng LA QT3 n/a QN2 n/a PY2 KK

UstTula Nga

Heterophyidae* 1 Haplorchis taichui 2 Haplorchis taichui 3 Metagonimus yokogawai Stellantchasmus falcatus 4 Opisthorchiidae* 5 Opisthorchis viverrini 6 Opisthorchis viverrini 7 Opisthorchis viverrini 8 Opisthorchis felineus 9 Clonorchis sinensis 10 Clonorchis sinensis 11 Clonorchis sinensis 12 Clonorchis sinensis 13 Metorchis orientalis

Kí hiệu loài Htai Htai Myok Sfal Oviv Oviv Oviv Ofel Csin Csin Csin Csin Mori

Số đăng kí Ngân hàng gen KF214770 MG972809 KC330755 Nghiên cứu này JF739555 Chưa công bố Chưa công bố EU921260 Chưa công bố Việt Nam JF729303 Trung Quốc JF729304 Hàn Quốc Nga FJ381664 Trung Quốc KT239342

NH GD n/a Amur HLJ

GX GL

Oregon M Madu Jiangxi Koko

SAMEA i Cập

Fasciolidae 14 Fasciola gigantica 15 Fasciola hepatica 16 Fasciola hepatica 17 Fasciola jacksoni 18 Fasciolopsis buski 19 Fascioloides magna Echinostomatidae 20 Echinostoma caproni 21 Echinostoma paraensei 22 Hypoderaeum conoideum Schistosomatidae 23 Trichobilharzia regenti**

Fgig Fhep Fhep Fjac Fbus Fmag Ecap Epar Hcon Treg

Trung Quốc KF543342 AF216697 Australia AP017707 Sri Lanka KX787886 Trung Quốc KX169163 KU060148 S c AP017706 KT008005 n/a Trung Quốc KM111525 n/a

DQ859919

UNM Hubei n/a

Số đăng k

ọ/ oài

i

N c ph n p

K hiệu chủng/

ài iệu h kh o (n u c )

Ghi chú: Trong ngo c n () là số lư ng loài, sau g ch ch o ( ) là số chủng trong một h sử dụng trong nghiên cứu này D u (*): Mư i ba chủng/7 loài (Heterophyidae và Opisthorchiidae) ư c sử dụng t nh toán KCDT D u (**): Loài Trichobilharzia regent ư c sử dụng làm nh m ngo i h p (outgroup); n/a: không có thông tin. Bảng PL2.3. Danh sách 36 chủng 32 loài cung c p 2 gen PCG của mtDN ể ph n t ch quan hệ phả hệ của các loài sán lá ruột nhỏ h Heterophyidae và các h hác trong l p Trematoda Số TT

Cyclocoelidae (2)/2 Uvitellina sp. (SSS2019) Tracheophilus cymbius Echinochasmidae (1)/1 Echinochasmus japonicus Echinostomatidae (6)/6 Artyfechinostomum sufrartyfex Echinostoma caproni Echinostoma miyagawai Echinostoma paraensei Echinostoma sp. Hypoderaeum conoideum Fasciolidae (6)/7 Fasciola gigantica Fasciola sp. (hybrid) Fasciola hepatica Fasciola hepatica Fasciola jacksoni Fascioloides magna Fasciolopsis buski Gastrodiscidae (1)/1

Heterophyidae (2)/3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Homalogaster paloniae Gastrothylacidae (3)/3 Fischoederius cobboldi 18 19 Fischoederius elongatus 20 Gastrothylax crumenifer 21 Haplorchis taichui 22 Haplorchis taichui 23 Metagonimus yokogawai Himasthlidae (1)/1 Acanthoparyphium sp. 24 Opisthorchiidae (4)/6 25 Clonorchis sinensis 26 Clonorchis sinensis 27 Clonorchis sinensis 28 Metorchis orientalis 29 Opisthorchis felineus 30 Opisthorchis viverrini Paramphistomidae (5)/5 31 Calicophoron microbothrioides 32 Explanatum explanatum 33 Orthocoelium streptocoelium Paramphistomum cervi 34 Paramphistomum leydeni 35 Schistosomatidae* (1)/1 Schistosoma haematobium 36

Uvite sp. Tcym Ejap Asuf Ecap Emiy Epar Echino sp. Hcon Fgig Fsp. Fhep Fhep Fjac Fmag Fbus Hpal Fcob Felo Gcru Htai Htai Myok Acanth Csin Csin Csin Mor Ofel Oviv Cmic Eexp Ostr Pcer Pley Shaem

SSS2019 HLJ PT Shill SAMEA Hunan UNM JM2019 Hubei GX GHL GL Oregon Madu Koko Jiangxi Hubei Không r Hubei Hubei LA QT3 Không r WAK2018 Amur GD Không r HLJ UstTula Không r Hunan Hunan Tianmen QH Nimu N10

Suleman et al., 2019 Li et al., 2019 Le et al., 2016 GenBank GenBank Fu et al., 2019 GenBank GenBank Yang et al., 2015a Liu et al., 2014 Liu et al., 2014 Le et al., 2001 GenBank Ma et al., 2016 Ma et al., 2017 Yang et al., 2016b GenBank Yang et al., 2015b Yang et al., 2016a Lee et al., 2013) Le et al. (own data) GenBank GenBank Shekhovtsov et al., 2010 Cai et al., 2012 Cai et al., 2012 Na et al., 2016 Shekhovtsov et al., 2010 Cai et al., 2012 GenBank GenBank Zhao et al., 2016 Yan et al., 2013 Ma et al., 2015 Littlewood et al., 2006

MK227160 MK355447 KP844722 KY548763 AP017706 MN116740 KT008005 MH212284 KM111525 KF543342 KF543343 AF216697 AP017707 KX787886 KU060148 KX169163 KX169165 KX169164 KM397348 KM400624 KF214770 MG972809 KC330755 MG792058 FJ381664 JF729303 JF729304 KT239342 EU921260 JF739555 KR337555 KT198989 KM659177 KF475773 KP341657 DQ157222

Pakistan Trung Quốc Việt Nam n ộ i Cập Trung Quốc Không r Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Australia Không r Sri Lanka S c Trung Quốc China Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Lào Việt Nam Hàn Quốc Cô-o t Nga Trung Quốc Hàn Quốc Trung Quốc Nga Lào Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Mali

hi ch Loài Chủng: Trong ngo c n () là số loài trong một h ; sau g ch ch o ( ) là số chủng của các loài trong h cung c p chu i nucleotide cho ph n t ch phả hệ trong nghiên cứu này D u (*): Chu i ngo i h p (outgroup) ư c sử dụng là loài Schistosoma haematobium (Schistosomatidae). Bảng PL2 4. Danh sách các mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự n v m h a ribosome (rTU) các loài SLRN trong h Heterophyidae

Tên mồi

Chuỗi nucleotide (5'–3')

Gen/ ùng đích

AACCTGGTTGATCCTGCCAG GTAGTCATATGCTTGTCTC GCGAATGGCTCATTAAATCAGC GGTTCTGTTCTAATAAATCCAC CCGTCGCCGACACAAGGCCGAC GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC GGCCTGCTTTGAGCACTC TCGTGACTGGGATCGGGGC TGAATGGTTTAGCAAGGTCCTCGG GGAACCAATCCGAGGACCTTGC CACCTACGGAAACCTTGTTACGACTT GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG CGACCCTCGGACAGGCG CTTAAGCATATCACTAAGCGGAGG CACAAACAACCCGACTCCAAGG CCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAG CTAACAAGGATTCCCTTAGTAAC ACAACCCGACTCCAAGGTC TCGGAGACGGCGGCTTG ATCACCGGCCCGTCCCATG GTCTTTCGCCCCTATACTCAC GCTATCCTGAGGGAAACTTCG GTGTAACAACTCACCTGCCGAATC AGGCCGTACCCATATCCGC GACCCGAAAGATGGTGAACTATGC TTCTGACTTAGAGGCGTTCAGTC

18S (F) 18S (F) 18S (F) 18S (R) 18S (R) 18S (F) 18S (R) 18S (F) 18S (F) 18S (R) 18S (R) 5.8S (F) 5.8S (R) 28S (F) 28S (R) 28S (F) 28S (F) 28S (R) 28S (F) 28S (F) 28S (R) 28S (R) 28S (F) 28S (F) 28S (F) 28S (R)

Tài liệu tham kh o Olson et al., 2003 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2020 Le et al., 2020 Le et al., 2020 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Le et al., 2017 Olson et al., 2003 Le et al., 2020 Le et al., 2020 Le et al., 2020 Le et al., 2020

Nhiệ độ (°C) 59 48 57 50 67 66 59 64 61 63 60 67 64 56 57 61 52 59 63 65 57 57 58 56 57 55

Độ dài (bp) 20 19 22 22 22 21 18 19 24 22 26 26 17 24 22 25 23 19 17 19 21 21 24 19 24 23

UD18SF NS1F U18SF* U18S2R* U18SAR* NS2F* NS2R* U18S2F NS5F* U18SR* NS8R* U3SF U3SR LSU1F LSU1R LSU3F U28SF* U28S2R* U28F* U28S2F* U28SR 1500R=LSU3R U28SF1 U28SF2 U28SF3 28ENDR Vi t t t: F, mồi uôi; R, mồi ngư c; Tm: Nhiệt ộ n ng chảy của mồi *Các mồi chủ y u d ng giải trình tự Bảng PL2 5 Danh sách và thông tin của 34 chủng 28 loài cung c p chu i 28S rDN toàn ph n ( 3 8–3 9 b) sử dụng ể ph n t ch mối quan hệ của các loài và y dựng c y phả hệ của SLRN H. taichui và H. pumilio của Việt Nam và các loài sán lá hác

STT

ọ/ oài

K hiệu chuỗi

K hiệu oài

Số đăng k Ng n hàng g n

Heterophyidae (4)/4

Haplorchis taichui Haplorchis pumilio Cryptocotyle lingua Euryhelmis costaricensis

Opisthorchiidae (5)/7

Clonorchis sinensis Clonorchis sinensis Metorchis orientalis Metorchis orientalis Opisthorchis felineus Opisthorchis parageminus Opisthorchis viverrini

Collyriclidae (1)/1

Collyriclum faba

Paragonimidae (5)/6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Paragonimus heterotremus Paragonimus ohirai Paragonimus iloktsuenensis Paragonimus miyazakii Paragonimus westermani Paragonimus westermani

Htai Hpum Clin Ecos Csin Csin Mori Mori Ofel Opar Oviv Cfab Phet Pohi Pilo Pmiy Pwes Pwes

Htai-QT3-VN Hpum-HPU8-VN Clin-Kartesh-RU Ecos-Fuku-JP Csin-NH-VN Csin-CSD-CN Mori-MOB-CN Mori-MOE-CN Ofel-UstTula-RU Opar-PC6-VN Oviv-PY2-VN Cfab-Orlicke-CZ Phet-LC-VN Pohi-Kino-JP Pilo-Amami-JP Pmiy-OkuST1-JP Pwes-Megha(2n)-IN Pwes-Bogil(3n)-KR

N c ph n p/ u Việt Nam Việt Nam Nga Nhật Bản Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Nga Việt Nam Việt Nam S c Việt Nam Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản n ộ Hàn Quốc

Nghiên cứu này Nghiên cứu này MW361240 AB521797 Lê Thanh Hoà et al., 2019 MK450526 MK482052 MK482055 Lê Thanh Hoà et al., 2019 Lê Thanh Hoà et al., 2019 Lê Thanh Hoà et al., 2019 JQ231122 Nguyen et al., 2020 Nguyen et al., 2020 Nguyen et al., 2020 Nguyen et al., 2020 Nguyen et al., 2020 Nguyen et al., 2020

Nanophyetidae (3)/5

Nanophyetus japonensis Nanophyetus japonensis Nanophyetus salminicola Nanophyetus salminicola Nanophyetus schikhobalowi

Echinostomatidae (4)/4

Echinostoma miyagawai Echinostoma revolutum Hypoderaeum conoideum Isthmiophora hortensis

Fasciolidae (5)/6

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Fasciola gigantica Fasciola gigantica Fasciola hepatica Fasciola sp. (hybrid) Fasciola jacksoni Fasciolopsis buski Schistosomatidae* (1)/1 Schistosoma japonicum

Njapo Njapo Nsal Nsal Nsch Emiy Erev Hcon Ihor Fgig Fgig Fhep Fsp(hyb) Fjac Fbus Sjap

Njap-NJ142-JP Njap-NJ161-JP Nsal-Karp51-RU Nsal-Karp55-RU Nsch-03Karp1442-RU Emiy-HLJ-CN Erev-KK-TH Hcon-RED42-TH Ihor-Waka-JP Fgig-NB-VN Fgig-T4V-VN Fhep-Geelong-AU Fsp(hyb)-DL11-VN Fjac-Madu-LK Fbus-HT-VN Sjap-S15-PH

Nhật Bản Nhật Bản Nga Nga Nga Trung Quốc Thái Lan Thái Lan Nhật Bản Việt Nam Việt Nam Australia Việt Nam Sri Lanka Việt Nam Philipin

LT796170 LT796169 LN871822 LN871823 LN871820 MH748722 Chưa công bố Chưa công bố AB189982 MN970009 MN970010 MN970007 MN970008 MN970006 MN970005 AY157607

K hiệu chuỗi

GenBank

N c

STT

hi ch Loài Chủng: Trong ngo c n () là số loài trong một h ; sau g ch ch o ( ) là số chủng của các loài trong h cung c p chu i nucleotide cho ph n t ch phả hệ trong nghiên cứu này D u (*): Chu i ngo i h p (outgroup) ư c sử dụng là loài Schistosoma japonicum (Schistosomatidae). Bảng PL2 6 Danh sách và thông tin 23 chủng 7 loài ư c giải trình tự toàn bộ n v m h a ribosome cung c p chu i gen 8S+28S rRN cộng h p cho nghiên cứu phả hệ Độ ài (bp)

18S+28S (bp)

hi ch ài iệu h kh o

hủng/ oài/họ/ ph n ộ Opisthorchiata

Heterophyidae

5867 5862 5870 5869

Nghiên cứu này Nghiên cứu này GenBank Sato et al., 2010

Haplorchis taichui Haplorchis pumilio Cryptocotyle lingua Euryhelmis costaricensis Opisthorchiidae

Qiu et al., 2019

Lê Thanh Hoà et al., 2019

Qiu et al., 2019

5851 5851 5851 5868 5868 5868 5869 5869 5869

KX815126 7268 7416 KX815125 7615 MW361240 AB521797 7093 8391 MK450525 8049 MK450526 8049 MK450527 7296 7839 7261 9162 MK482052 9355 MK482054 9162 MK482055

Htai-QT3-VN Hpum-HPU8-VN Clin-Kartesh-RU Ecos-Fuku-JP Csin-CSC-CN Csin-CSD-CN Csin-CSE-CN Csin-NH-VN Oviv-PY2-VN Ofel-UstTula-RU Mori-MOB-CN Mori-MOD-CN Mori-MOE-CN

Việt Nam Việt Nam Nga Nhật Bản Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Việt Nam Việt Nam Nga Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc

1 2 3 4 Clonorchis sinensis 5 Clonorchis sinensis 6 Clonorchis sinensis 7 Clonorchis sinensis 8 Opisthorchis viverrini 9 10 Opisthorchis felineus 11 Methorchis orientalis 12 Methorchis orientalis 13 Methorchis orientalis Echinostomata

Le et al., 2020

Australia Việt Nam Việt Nam Việt Nam Sri Lanka Việt Nam

7194 6873 6854

5852 5852 5852 5852 5852 5851 5848 5846 5849

Peru Nhật Bản Thái Lan

7657 MN970007 6794 MN970010 6794 MN970009 7966 MN970008 7781 MN970006 8361 MN970005 JQ627832 AB189982

Fhep-Geelong-AU Fgig-T4V-VN Fgig-NB-VN Fsp-DL11-VN Fjac-Maduru-LK Fbus-HT-VN Pgra-PH191-PE Ihor-Waka-JP Emiy-RED11-TH

GenBank GenBank Nghiên cứu này

14 15 16 17 18 19 20 21 22

Fasciolidae Fasciola hepatica Fasciola gigantica Fasciola gigantica Fasciola sp. (hybrid) Fasciola jacksoni Fasciolopsis buski Philophthalmidae Philophthalmus gralli Echinostomatidae Isthmiophora hortensis Echinostoma miyagawai Strigeidida

Uganda

6750

AY197344

Sedw-Edward-UG

5861

GenBank

Schistosomatidae *Schistosoma edwardiense

hi ch *Chu i ngo i h p (outgroup)

Bảng PL3 V tr của gen và các c iểm gen trong mtDNA hoàn chỉnh của loài SLRN Metagonimus yokogawai (Hàn Quốc) 5 258 bp GenBank: KC330755)

Đối củ tRNA

Gen

ị í (5’ > 3’)

Đ c đi [bp/aa(start/stop)] à c c ùng g n 666/221/(ATG/TAG) 66 1137/375/(ATG/TAG) 264/90/(ATG/TAG) 1284/427/(ATG/TAG) 65 62 63 516/171/(ATG/TAG) 876/291/(ATG/TAG) 63 64 62 909/302/(ATG/TAG) 70 67 64 66 357/118/(ATG/TAG) 59 64 1539/512/(GTG/TAA) 63 974 63 762

672/223/(GTG/TAG) 462/153/(GTG/TAG)

cox3 tRNAHis (trnH) cob nad4L nad4 tRNAGln (trnQ) tRNAPhe (trnF) tRNAMet (trnM) atp6 nad2 tRNAVal (trnV) tRNAAla (trnA) tRNAAsp (trnD) nad1 tRNAAsn (trnN) tRNAPro (trnP) ttRNAIle (trnI) tRNALys (trnK) nad3 tRNASer1(AGN) (trnS1) tRNATrp (trnW) cox1 tRNAThr (trnT) rrnL (16S) tRNACys (trnC) rrnS (12S) cox2 nad6 tRNATyr (trnY) tRNALeu1(CUN) (trnL1) tRNASer2(UCN) (trnS2) tRNALeu2(UUR) (trnL2) tRNAArg (trnR) nad5 tRNAGlu (trnE) Repeat reg. 1

STR1 (174) STR2(174) STR3(174) STR3.4(43) Int. Seq. 1

Repeat reg. 2

LTR1 (311) LTR2 (311) LTR2.9 (311) Int. Seq. 2 tRNAGly (trnG)

unique seq.

1-666 689-754 764-1891 1904-2167 2129-3411 3417-3481 3493-3554 3555-3617 3618-4133 4154-5029 5031-5093 5102-5166 5168-5229 5230-6138 6161-6230 6231-6297 6298-6361 6365-6430 6434-6790 6793-6851 6861-6924 6929-8467 8473-8535 8536-9509 9510-9572 9573-10334 10335-11006 10993-11454 11455-11518 11523-11588 11586-11643 11653-11720 11726-11792 11793-13364 13367-13432 13466-14030 13466-13639 13640-13813 13814-13987 13988-14030 14031-14210 14211-14967 14211-14521 14532-14832 14833-14967 14968-15121 15122-15186 15187-15258

64 66 58 68 67 1572/523/(ATG/TAA) 66 565 174 174 174 43 180 311 311 288 154 65 72

huỗi gi o gen nối i p (bp) +22 +9 +12 -40 +5 +11 0 0 +20 +1 +8 +1 0 +22 0 0 +3 0 +2 +9 +4 +5 0 0 0 0 -14 0 +4 -3 +9 +5 0 +2 +33 0 0 0 0 +180 0 0 +154 +72

GTG TTG GAA CAT TAC TGC GTC GTT TGG GAT CTT GCT TCA TGT GCA GTA TAG TGA TAA TCG TCC TCC

bp: base pair; aa: amino acid; start: start: m h i u; stop: m t th c; tRN : RN vận chuyển; Int seq : Chu i giao gen (+ Số nucleotide trư c gen ti p sau ; -, Số nucleotide lồng vào gen ti p sau ); *D u sao: RN vận chuyển (tRN ) huy t thi u cánh tay DHU-arm Repeat reg và 2: V ng chứa các c u tr c l p li n Int seq và 2: Chu i giao gen số và 2 STR: C u tr c l p li n ng n ( 74 bp m i một); LTR: C u tr c l p li n dài (3 bp m i một); unique seq : Chu i nucleotide nối gen tRNAGly và cox3.

nh 3. nh à i n gi i g n à ùng gi o g n củ mtDNA hoàn ch nh ( 5.120 bp) oài Haplorchis taichui củ iệ N (chủng Htai-QT3-VN/GenBank: MG972809)

nh 3. nh à i n gi i g n à ùng gi o g n củ mtDNA hoàn ch nh ( 5 3 p)

oài Haplorchis taichui củ ào (Htai-LA/GenBank: MG972809)

nh 3 3. Trình bày di n giải gen và v ng giao gen của đ n ị h ribosome, ph n m h a loài Haplorchis taichui của Việt Nam (chủng Htai-QT3- VN) (7.268 bp)

nh 3 Trình bày di n giải gen và v ng giao gen của đ n ị h ribosome, ph n m h a của loài Haplorchis pumilio của Việt Nam (chủng Hpum-HPU8-VN) (7.416 bp)

PL2.1. P ương p áp tá ết DNA tổng số từ mẫu ng ên ứu

DN tổng số của từng mẫu riêng biệt ư c tách chi t bằng bộ sinh phẩm

DNeasy Blood and Tisue kit (Qiagen Inc.. M ) ho c GeneJET Genomic DN

Purification Kit (Thermo Scientific Inc , M , US ) theo hư ng dẫn của nhà sản

u t DN tổng số ư c tách chi t từ SLRN Haplorchis spp nguyên con sán

trư ng thành và thu nhận v i dung t ch hoảng 5 –100 L/mẫu.

n n n p m DNeasy Blood

and Tissue kit (Qiagen Inc.. ỹ) :

- M i mẫu sán lá ruột nhỏ ( con) ư c nghi n trong 8 µL dung d ch

Tissue Lysis buffer (ATL) và bổ sung 2 µL proteinase-K ( mg ml) ủ 56oC 2 gi cho n hi mô ư c ph n giải hoàn toàn

- Ti p tục bổ sung 2 µL dung d ch L l c u ủ 56oC/30 phút.

- Thêm 2 µL Ethanol ( %), trộn u, sau chuyển toàn bộ h n d ch

sang cột c màng l c và ly t m vòng ph t trong ph t, lo i bỏ ph n d ch

ph a dư i cột l c

- Thêm 5 µL dung d ch Washing buffer ( W ) vào cột l c, ly t m

3 vòng ph t trong ph t, bỏ d ch ly t m bên dư i cột l c

- Ti p tục thêm 5 µL dung d ch Washing buffer 2 ( W2) vào cột l c ể

rửa DN , ly t m 3 vòng ph t trong ph t, bỏ d ch bên dư i, rồi ly t m l i

3 vòng ph t trong 2 ph t ể làm hô màng

- Chuyển cột sang Eppendorf m i, thêm 6 µL dung d ch Elution buffer

(EL), ể nhiệt ộ phòng hoảng 2–3 ph t, sau ly t m 3 vòng ph t trong

2 ph t Bỏ cột, thu d ch bên dư i là DN tổng số, ghi hiệu mẫu và bảo quản mẫu DN –20oC cho n hi sử dụng

- Kiểm tra hàm lư ng DN tổng số bằng cách o h p phụ quang h c

(OD, optical density) trên máy o quang phổ NanoDrop®ND-1000 UV-Vis

Spectrophotometer (Thermo Scientific Inc.) DN tổng số ư c pha thành nồng

ộ 5 ng L, sử dụng 1–2 L cho m i phản ứng PCR có dung tích 50 L.

PL2.2. P ương p áp t ết ế m ung v m u mtDNA

Các mồi chung (g i là mồi ty thể chung cho sán d t, universal-

platyhelminth primers) ư c thi t ể thu toàn bộ mtDN sán d t trong c

SLRN ư c liệt ê các công bố trư c y (Le et al., 2 2; 2 6; 2 9)

ho c và cải ti n bổ sung thêm ể thực hiện PCR dài (long-PCR L-PCR) v i mục

tiêu thu nhận o n mtDN c ộ dài cao nh t c thể, 4–6 b ho c dài h n (Bảng

PL2 ) Một số c p mồi c hiệu mtDN của H. taichui cũng ư c thi t ể

thu nhận sản phẩm PCR ng n ( ,5–3 b) từ huôn DN tổng số ho c và từ

huôn là sản phẩm LPCR ư c thu nhận và các primer này cũng ư c sử

dụng ể giải trình tự Chu i mồi ư c thi t bằng chư ng trình Primer3Plus

(https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/).

n n n m

Sử dụng các c p mồi: i) URNLF URNSR thu v ng gen rrnL-rrnS (~980

bp); ii) TRECOBF/TRECOBR thu o n gen cob (~650 bp); iii)

PN D F JN D R thu o n gen nad1 (~400 bp); iv) JB3F JB4 5R thu o n gen

cox (444 bp), giải trình tự Các chu i này ư c sử dụng ể thẩm nh loài danh

pháp và thi t các mồi c hiệu h i iểm cho các phản ứng PCR L-PCR Một

số gen c mức ộ bảo tồn cao như 6S (rrnL) hay 12S (rrnS) hay chu i nucleotide của tRN Gly nh v sau gen nad5 ư c sử dụng thi t các mồi l n

lư t là UNI 6F và UNI 6R (trên rrnL), UNI 2F và UNI 2R (trên rrnS), GLYF và GLYR (trên tRNAGly) cho các phản ứng L-PCR qua các v ng m h a và

hông m h a của mtDN (Bảng PL2 )

ể thực hiện PCR thu nhận mtDN của H. taichui, Bảng PL2 liệt ê t t

cả mồi chung ( 4 mồi) và c hiệu ( 7 mồi) ư c thi t và sử dụng ể thu

sản phẩm PCR ch thư c hác nhau Trên c s trình tự nucleotide của các

chu i thu nhận, ti p tục thi t mồi và giải trình tự bằng phư ng pháp ti p

lồng vào nhau, hay còn g i là phư ng pháp “l o m ” trực ti p từ sản phẩm

ho c và sau hi tách dòng. Giải trình tự ư c thực hiện t i các c s d ch vụ:

Macrogen (Hàn Quốc) t i (https://www.macrogen.com/en/main/); và Công ty

Nam Khoa (Việt Nam): (http://biotechem.com.vn/).

PL2.3. P ương p áp t ết ế m g t n t ơn v m osom

ể thực hiện PCR thu nhận rTU của H. taichui và H. pumilio của Việt

Nam, Bảng PL2 4 liệt ê t t cả mồi ư c sử dụng ể thu sản phẩm PCR ch

thư c hác nhau Trên c s trình tự nucleotide của các chu i thu nhận, ti p

tục thi t mồi và giải trình tự bằng phư ng pháp ti p lồng vào nhau, hay còn

g i là phư ng pháp “l o m ” trực ti p từ sản phẩm ho c và sau hi tách dòng.

Giải trình tự ư c thực hiện t i các c s d ch vụ: Macrogen (Hàn Quốc) t i

(https://www.macrogen.com/en/main/); và Công ty Nam Khoa (Việt Nam):

(http://biotechem.com.vn/).

Mồi sử dụng ể thu nhận rTU của H. taichui và H. pumilio của Việt Nam

(Bảng PL2 4) ư c thừa từ các nghiên cứu trư c y và ư c thi t bổ sung

dựa trên một số công bố v rTU c trên Ng n hàng gen ho c d liệu của

ch ng tôi công bố và hiện ang c (Le et al., 2017; 2020b) ho c ư c sưu t m ể

t h p sử dụng (Olson et al., 2003; Tkach et al., 2016). PCR LPCR ư c áp

dụng phối h p các c p mồi hác nhau và lệch nhau ể thu các ph n DN (ph n

o n) dài ng n hác nhau

Toàn bộ m i n v rTU (5 8S-ITS -5 8S-ITS2-28S-IGS 3 ) của sán lá,

ư c bi t cho n nay c ộ dài hoảng từ 7–8 cho n 9– b, t y thuộc m i

loài Ph n m h a (coding region) ư c t nh từ u 5 của gen 8S cho n h t

u 3 của gen 28S, ộ dài thư ng là hoảng 6–7 ho c 8 b, dài ng n hác nhau

Các gen 8S, 5 8S, 28S rRN c bản c ộ dài cố nh các loài trong một chi,

thậm ch trong một h Tuy nhiên, v ng ITS- (gi a gen 8S và gen 5 8S) và

ITS-2 (gi a gen 5 8S và gen 28S) và v ng bản l IGS, một số loài c thể c

nhi u c u tr c l p li n c số lư ng hác nhau, nên tổng ch thư c s hác

nhau C một số mẫu chỉ thu ư c và giải trình tự ư c toàn bộ ph n m h a,

hông thu ư c v ng bản l (IGS)

PL2.4. n p n p n ứng t n P v m t s n p m

Phản ứng PCR c thể i u chỉnh thành ph n và chu trình nhiệt ph h p ể

thu sản phẩm PCR tốt nh t c thể thu nhận các ph n o n của mtDN và của

rTU Ch ng tôi gi i thiệu phản ứng c hiệu su t tốt nh t ư c thực hiện

Phản ứng c tổng thể t ch 5 µL, gồm: 25 µL PCR mastermi (Thermo

Fisher Scientific, MA, USA), 2 µL m i lo i mồi ( pmol µL), 2 µL huôn DN

(25–5 ng µL), 2 µL DMSO (dimethyl sulfo ide) và 7 µL nư c hử ion DEPC,

ư c thực hiện trên máy MJ PTC- (US ) Chu trình nhiệt gồm: chu ỳ

95oC 5 ph t, 35 chu ỳ [94oC/1 phút, 52oC/1 phút; 72oC/2–6 ph t], chu ỳ cuối 72oC/10 phút.

Phản ứng L-PCR ư c thực hiện v i en yme Phusion DN polymerase

(Thermo Fisher Scientific Inc ), sản phẩm thu ư c c ộ dài 4–6 b v i ch t

lư ng tốt

Sản phẩm PCR LPCR thu ư c ư c iện di iểm tra trên th ch agarose

% nhuộm ethidium bromide, so sánh ộ dài v i chỉ th DN Lamda (HindIII).

Sản phẩm PCR n b ng ư c tinh s ch trực ti p bằng bộ sinh phẩm GeneJET

PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc ) V i sản phẩm a b ng, thì b ng

DN ng ch thư c dự t nh ư c ph n lập từ th ch agarose bằng bộ sinh phẩm

GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc.). Các sản phẩm PCR ư c

tinh s ch bằng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit và ư c gửi i

giải trình tự t i các c s d ch vụ gi i thiệu

PL2.5. P ương p áp tá dòng t u DNA pl sm d tá tổ ợp

Sản phẩm PCR ho c ư c giải trình tự trực ti p, n u c ch t lư ng tốt và

hàm lư ng ủ theo yêu c u Một số sản phẩm ư c tách dòng sử dụng vector T

cloning thư ng m i là pCR2 TOPO (Invitrogen) ho c TOPO XL PCR

Cloning Kit (Invitrogen Inc) (n u sản phẩm PCR <2 b, nhi u trư ng h p 2

b, cho n 4 b), ch n l c plasmid tái tổ h p ể giải trình tự DN của plasmid

tái tổ h p ư c tách chi t v i bộ hoá ch t GeneJET Plasmid Miniprep Kit

(Thermo Fisher Scientific Inc.).

n p m PCR vào pl m vector: Do sản phẩm PCR (sử dụng

enzyme Taq DNA polymerase) thông thư ng ư c g n thêm denine ( ) u

3 , nên hi nối v i vector c u lồi là Thymine (T) ư c các h ng sinh phẩm

thi t từ trư c, thì hai nucleotide này s g n nối bổ sung cho nhau nh en yme

nối T4-DN ligase ho c en yme topoisomerase (Hình PL2 )

V tr ể nối sản phẩm PCR vào ư c bố tr trong chu i gen lacZ, gen

mã h a và sản u t en yme β-galactosidase, c tác dụng c tác thủy ph n một

lo i h a ch t c tên g i là X-gal ể t o nên các dẫn ch t c màu anh Vi huẩn

hông mang plasmid tái tổ h p s t o nên huẩn l c màu anh Khi sản phẩm

ư c nối vào v tr nối thành công, thì o n DN ngo i lai làm b t ho t gen lacZ

hông cho n sản u t ra en yme β-galactosidase, và do vậy, vi huẩn mang

plasmid tái tổ h p s hông c en yme β-galactosidase ph n hủy c ch t X-gal

Hình PL2 C u tr c của vector pCR®2 TOPO (Invitrogen Inc ) c u lồi T (Thymine) ể ti p nhận và g n sản phẩm PCR c u lồi ( denine) nh en yme TOPO.

và huẩn l c s mang màu tr ng hi nuôi trên môi trư ng c chứa X-gal.

T àn p ần p n ứn Vector pCR2.1TOPO: 1 µL

1 µL Nư c tinh hi t:

3 µL Sản phẩm PCR:

1 µL Dung d ch muối:

6 µL Tổng số:

C n n p và n n T bào sử dụng ể chuyển n p là t bào

hả bi n (competent cells) E. coli chủng DH5αT ho c Top (Invitrogen) L y

2–3 µL sản phẩm của phản ứng nối-gh p, chuyển vào ống chứa 5 µL ho c

µL t bào hả bi n DH5αT ; Ủ trên á trong 45 ph t, ử l nhiệt (heat-shoc ) 42oC/45 giây và lập tức chuyển vào trong á và ể 2 ph t Thêm 5 µL dung d ch SOC (dung d ch giàu dinh dưỡng), l c 2 vòng ph t 37oC gi 3 ph t;

rồi ti p tục l y toàn bộ h n h p dàn trên m t th ch (LB agar ,5%) c chứa kháng sinh Kanamycin (hay Ampicillin) và X-gal và ủ tủ m 37oC trong 18–20

gi Sau hi ủ, n u c huẩn l c phát triển trên m t th ch (sau 8–2 gi ), thì ưa ĩa th ch vào hoang l nh ( oC) trong tủ l nh ể X-gal ư c ph n giải hoàn toàn,

gi p nhận bi t d dàng huẩn l c tr ng và anh trong quá trình ch n l c huẩn l c

C ọn lọ k n l và n on m ườn lỏn Ch n l y một số

huẩn l c màu tr ng (4–6 huẩn l c) ể nuôi c y trong các ống chứa môi trư ng

LB lỏng c háng sinh Kanamycin ( µL Kanamycin (5 mg ml) cho ống LB

nuôi c y) Ch n huẩn l c màu tr ng ngà là tốt nh t Bổ sung thêm 7 µL X-gal

(4 mg ml) vào môi trư ng ể ph n biệt vi huẩn tái tổ h p phát triển ( hông c

màu anh) và lo i bỏ vi huẩn hông tái tổ h p (ống c màu anh) Sau hi c y huẩn l c, ống môi trư ng ư c l c 22 vòng ph t trong 6–2 gi 37oC cho

vi huẩn nhân lên.

T pl m ợp Sử dụng bộ it QI prep Spin

Miniprep của h ng QI GEN theo hư ng dẫn của nhà sản u t

- L y ,5 mL dung d ch t bào vi huẩn tái tổ h p ư c nuôi c y qua

êm, ly t m vòng ph t trong 4–5 ph t ể thu c n t bào Thêm 25 µL

dung d ch P ể hòa tan c n, h t nh nhàng lên uống vài l n rồi cho ti p 25

µL dung d ch P2; ể nhiệt ộ phòng trong 3–4 phút.

- Thêm 35 µL dung d ch N3, trộn nh ; ly t m 3 vòng ph t trong

ph t Thu d ch trong bên trên ( 8 µL) cho lên trên b m t màng của cột l c t

trong ống hứng (collection tube); ly t m 3 vòng ph t trong ph t, bỏ

d ch bên dư i

- Thêm 5 µL dung d ch PB lên trên màng l c ể rửa màng l c c DN của

plasmid; ly tâm 13.000 vòng ph t trong ph t, bỏ ph n d ch bên dư i

- Thêm 75 µL dung d ch PE lên trên màng l c ể ti p tục rửa màng l c;

ly t m 3 vòng ph t trong ph t, bỏ ph n d ch bên dư i

- Cuối c ng, ly t m ti p 3 vòng ph t trong ph t cho màng chứa

DN của plasmid tái tổ h p thật hô, bỏ ph n d ch bên dư i Chuyển cột l c

sang ống Eppendorf m i và thêm 5 µL dung d ch EB lên trên màng l c, ể

nhiệt ộ phòng 3–4 phút.

- Ly t m 3 vòng ph t trong –2 ph t DN của plasmid tái tổ h p

ư c “thôi” ra c ng v i dung d ch EB (5 µL) và thu DN của plasmid tái tổ h p trong ống, hiệu và bảo quản –20oC cho n hi sử dụng

C k m ợp L y L DN plasmid tái tổ h p, d ng en yme gi i h n EcoRI c t DN plasmid, ủ 37oC trong 2 gi ; iện di trên th ch

agarose % và iểm tra ộ dài của các b ng thu ư c ể t nh toán ộ dài của sản

phẩm PCR ngo i lai c trong plasmid vector Sản phẩm DN plasmid tái tổ h p

giải trình tự sử dụng mồi chung M 3F (5 - GT CG CGGCC G-3 ) ho c

M13R (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´).

PL2.6. P ương p áp g t n t v xử lý uỗ nu l ot d

Sản phẩm PCR ng n (< ,2– ,3 b) ư c giải trình tự trực ti p bằng mồi

uôi và mồi ngư c bám vào hai u biên (flan ing primers) cũng ch nh là c p

primer ư c sử dụng thực hiện phản ứng PCR t o nên sản phẩm Trong

trư ng h p giải trình tự v i sản phẩm PCR dài ( ,3 b, n vài b), n u sản

phẩm c ch t lư ng n nh t, r , tốt, ngoài c p mồi hai u biên tham gia giải

trình tự, ch ng tôi thi t các mồi ti p cho chu i sau lồng bám vào chu i

trư c (g i là “l o m ”, “primer-walking” strategy) (Le et al., 2 7) ể thu chu i

hai chi u V i o n DN ch n vào plasmid tái tổ h p, sử dụng mồi chung

M13F (5 -GT CG CGGCC G-3 ) và M 3R (5 -

C GG C GCT TG C-3 ), ho c các mồi ư c thi t thêm bên trong

(internal primers) ể giải trình tự Chu i nucleotide s c p do c s d ch vụ cung

c p ư c biên tập (editing) từ giản ồ trình tự (chromatogram) ể thu chu i thứ

c p bằng chư ng trình ChromasPro

(http://technelysium.com.au/wp/chromaspro/), sau s p p và thu chu i cuối

c ng bằng chư ng trình GENEDOC 2 7 (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/)

Ph n t ch phả hệ bằng chư ng trình MEG 7 ho c MEG X

(https://www.megasoftware.net/) sử dụng phư ng pháp ”k n l n k ”

(Neighbor-Joining, NJ) ho c ” p n ” (Ma imum li elihood, ML) v i

hệ số tin cậy (bootstrap) l n l p l i (Kumar et al., 2016; 2018).

PL2.7. P ương p áp t u p t u t p uỗ so sán v s p xếp n n

Sau hi c chu i cuối c ng, việc u tiên là ác nh chu i c ng

chu i của loài ang c n hông Việc giám nh chu i ư c thực hiện bằng cách

truy cập vào Ng n hàng gen sử dụng chư ng trình BL ST

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ể em t thu nhận các chu i tư ng

ứng c ng và hác loài chi h ể so sánh ối chi u Nhi u trư ng h p, chu i ư c

giám nh bằng cách so sánh v i các chu i trong ho d liệu của ch ng tôi (D

liệu các loài sán d t)

Một số lư ng vài chục chu i (n u c ) của các chủng loài g n gũi và của

các chủng loài trong các chi h liên h ph n bộ tư ng ứng ư c thu nhận từ m i

nguồn ể sử dụng s p p c n chỉnh (alignment) S p p c n chỉnh c thể thực

hiện trực tuy n (online) qua chư ng trình Gene Infinity

(http://www.geneinfinity.org/) ho c các chư ng trình so sánh chu i c t i trang

Web Expasy (https://www.expasy.org/) Tuy nhiên ch ng tôi sử dụng chư ng

trình GENEDOC 2 7 và MEG 7 ho c MEG X Từng trư ng h p sử dụng s

ư c gi i thiệu chi ti t các mục tư ng ứng

PL2.8. P ương p áp t u n n DNA osom á lo sán lá u t n

L-PCR ư c áp dụng thu nhận toàn bộ ho c một ph n ba ( 3) n một

nửa ( ) v ng sao ch p rTU ( ộ dài hoảng 3 b n 4–5 b, ho c c thể n 6

b cho m i sản phẩm) Các sản phẩm c ch thư c dự t nh và c ch t lư ng tốt

(r , ậm trên th ch agarose) ư c ti p tục sử dụng giải trình tự trực ti p từ hai

u biên ho c và làm huôn cho PCR LPCR m i bên trong ể c sản phẩm

ti p tục giải trình tự

Ph n l n sản phẩm PCR ư c giải trình tự trực ti p sau hi tinh s ch sử

dụng bộ sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA,

US ) theo hư ng dẫn của nhà sản u t. Chu i nucleotide của từng ph n o n

sau hi biên tập (editing) bằng chư ng trình ChromasPro, ư c lồng nối liên ti p

v i nhau ể thu nhận hoàn toàn trình tự rTU của m i loài Sử dụng chu i

nucleotide biên tập cuối c ng ể ác nh gen, ph n t ch c u tr c, s p p gen,

v ng biên, c iểm chu i nucleotide nội gen và vùng giao gen. Các chư ng

trình ChromasPro, BioEdit, GENEDOC2 7 ư c sử dụng ể thu nhận, ử l ,

ph n t ch các chu i nucleotide, c iểm các gen ribosome ( 8S, 5 8S, 28S) và

v ng giao gen gồm ITS-1 và ITS-2 và v ng bản l IGS