Luận án tiến sĩ Công nghệ sau thu hoạch: Nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM AFLATOXIN VÀ ĐỀ XUẤT

MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN LẠC

SAU THU HOẠCH Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VÀ BẮC

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

Hà Nội - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM AFLATOXIN VÀ ĐỀ XUẤT

MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN LẠC

SAU THU HOẠCH Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VÀ BẮC

VIỆT NAM

Ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 9540104

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS. TS. HÀ DUYÊN TƯ

2. PGS. TS. PHẠM XUÂN ĐÀ

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu bởi bản thân tôi

dưới sự hướng dẫn của tập thể hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận

án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm

Thay mặt tập thể giáo viên hướng dẫn Tác giả luận án

PGS. TS Phạm Xuân Đà Lê Thị Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học

Bách khoa Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã

giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án.

Tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các giáo viên hướng

dẫn khoa học: GS. TS. Hà Duyên Tư - nguyên phó hiệu trưởng trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội và PGS. TS. Phạm Xuân Đà - Cục trưởng Cục công tác phía

Nam; Các thầy cô: PGS. TS. Lê Thanh Mai, PGS. TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm,

PGS. TS. Nguyễn Thị Minh Tú, TS. Vũ Hồng Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt

nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô Bộ môn Quản lý chất lượng, các

thầy cô Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm đã đóng góp ý kiến và hướng

dẫn tôi, các cán bộ phụ trách đào tạo - Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại

học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành mọi

thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh.

Tôi trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo và các đồng nghiệp

công tác tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ

tôi trong quá trình thu thập dữ liệu, cung cấp tài liệu cần thiết cho luận án, cũng

như có những ý kiến đóng góp quý báu trong quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Phạm Anh Tuấn - Viện

trưởng Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tận tình giúp

đỡ tôi về chuyên môn trong quá trình nghiên cứu.

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều

kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu.

Quá trình thực hiện luận án còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được

sự góp ý của Quý Thầy/Cô để bản thân có thể khắc phục những hạn chế và hoàn chỉnh luận án, đóng góp tích cực cho ngành.

Trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận án

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..................................... ix

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... xii

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ............................................................ xiv

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................................ 2

4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................................2

4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................................3

5. Những đóng góp mới của luận án........................................................................... 3

6. Cấu trúc của luận án ............................................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 5

1.1. Cây lạc ................................................................................................................. 5

1.1.1. Giới thiệu chung về cây lạc ..............................................................................................5

1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lạc trên thế giới và Việt Nam.........................................7

1.1.3. Quy định về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc ........................................... 11

1.2. Aflatoxin ............................................................................................................ 12

1.2.1. Tính chất hóa lý của aflatoxin ....................................................................................... 12

1.2.2. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe .................................................................. 13

iii

1.2.3. Các phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân tích aflatoxin .................................... 15

1.2.4. Tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc ................................................................................ 17

1.3. Aspergillus trên lạc ............................................................................................ 19

1.3.1. Tình hình nhiễm nấm mốc trên lạc ............................................................................... 19

1.3.2. Aspergillus flavus .......................................................................................................... 21

1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin của A. flavus ........... 23

1.4.1. Ảnh hưởng của độ ẩm và hoạt độ nước ....................................................................... 24

1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................................ 28

1.4.3. Ảnh hưởng của nấm mốc đến chất lượng lạc trong quá trình bảo quản .................... 29

1.4.4. Ảnh hưởng của tinh dầu tới sự phát triển và sinh aflatoxin của Aspergillus flavus .. 30

1.4.5. Ảnh hưởng của môi trường không khí đến chất lượng lạc trong quá trình bảo quản 33

1.5. Các biện pháp kiểm soát aflatoxin nhiễm trong lạc và nông sản khô sau thu hoạch

trên thế giới và Việt Nam ......................................................................................... 35

1.5.1. Kiểm soát chất lượng sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản .............................. 35

1.5.2. Đóng gói điều biến khí quyển ....................................................................................... 38

1.5.3. Các loại bao bì dùng trong bảo quản lạc ...................................................................... 40

1.5.4. Bảo quản hoặc giảm nhiễm aflatoxin bằng phương pháp hóa học ............................ 41

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 43

2.1.1. Nguyên vật liệu .............................................................................................................. 43

2.1.2. Hóa chất sử dụng ........................................................................................................... 43

2.1.3. Thiết bị sử dụng chính ................................................................................................... 43

2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 44

2.2. Phương pháp lấy mẫu ........................................................................................ 45

2.3. Phương pháp phân tích hóa lý ........................................................................... 45

2.3.1. Xác định độ ẩm .............................................................................................................. 45

2.3.2. Xác định hàm lượng aflatoxin ...................................................................................... 47

2.3.3. Đánh giá về mặt cảm quan của các mẫu lạc thu thập mùa thu năm 2013 ................. 50

2.4. Phương pháp phân tích sinh học ........................................................................ 51

2.4.1. Xác định tổng số bào tử nấm men - mốc ..................................................................... 51

2.4.2. Phân lập nấm mốc sinh độc tố từ lạc ............................................................................ 52

2.4.3. Định danh nấm mốc Aspergillus flavus ....................................................................... 52

2.4.3. Chuẩn bị dịch bào tử Aspergillus flavus với hàm lượng khác nhau ........................... 54

2.5. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc ..................................... 55

2.5.1. Đánh giá trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập tại Bắc Giang, Thanh

Hóa và Nghệ An vào mùa hè .................................................................................................. 55

2.5.2. Đánh giá mức nhiễm AF, nấm mốc trên lạc củ và lạc nhân vào mùa thu ................ 55

2.6. Phương pháp công nghệ ................................................................................................... 56

2.6.1. Điều chỉnh độ ẩm của lạc thí nghiệm ........................................................................... 56

2.6.2. Thiết kế thí nghiệm: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh

aflatoxin trên lạc của Aspergillus flavus ................................................................................. 56

2.6.3. Thiết kế thí nghiệm nghiên cứu các giải pháp và đề xuất một số quy trình nhằm giảm

nhiễm aflatoxin trong lạc ......................................................................................................... 62

2.7. Xử lý số liệu....................................................................................................... 63

2.8. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................... 66

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................... 67

3.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên lạc tại Nghệ An, Thanh

Hóa và Bắc Giang ..................................................................................................... 67

3.1.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang

húng lìu thu thập vào mùa hè .................................................................................................. 67

3.1.2. Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và AF trong lạc trên địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh

Bắc Giang vào mùa thu ........................................................................................................... 75

3.1.3. Phân lập và xác định chủng sinh aflatoxin trên lạc...................................................... 79

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trên lạc của Aspergillus flavus

BG1 ........................................................................................................................... 85

3.2.1. Đánh giá sự thay đổi độ ẩm của các mẫu lạc trong các loại bao bì khác nhau .......... 85

3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển và sinh AF của chủng Aspergillus flavus

BG1 trên lạc .............................................................................................................................. 86

3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và sinh AF của Aspergillus flavus BG1

trên lạc ....................................................................................................................................... 92

3.2.4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến sự sinh AF trên lạc ................................... 96

3.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc

của A. flavus BG1................................................................................................................... 100

3.2.6. Phân tích mối quan hệ của các yếu tố đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của

A. flavus BG1 ......................................................................................................................... 102

3.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu hồi, quế đến khả năng ức chế sự phát triển của

A. flavus................................................................................................................................... 108

3.3. Khảo nghiệm và đề xuất quy trình bảo quản nhằm tránh nguy cơ nhiễm aflatoxin

trong lạc .................................................................................................................. 117

3.3.1. Khảo nghiệm quy trình bảo quản lạc nhân bằng giải pháp kiểm soát chất lượng trước

khi bảo quản ........................................................................................................................... 117

3.3.2. Quy trình bảo quản lạc bằng đóng gói hút chân không............................................. 120

3.3.3. Quy trình bảo quản lạc nhân bằng cách sử dụng tinh dầu hồi, quế .......................... 123

3.3.4. Đề xuất quy trình bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong lạc ........... 127

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 130

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN................. 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 133

PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VA ̀

AFLATOXIN TRONG LẠC...................................................................................... 1

1.1. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân thu thập vào mùa hè tại

các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An ............................................................................1

1.2. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa hè tại các

tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An ..................................................................................3

1.3. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin của lạc rang húng lìu thu thập tại các tỉnh

Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An ..........................................................................................5

1.4. Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và AF trong lạc nhân thu thập

vào mùa thu tại Bắc Giang .........................................................................................................7

1.5. Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập

vào mùa thu tại Bắc Giang .........................................................................................................9

PHỤ LỤC 2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH AF TRÊN LẠC CỦA

A. FLAVUS BG1 ....................................................................................................... 11

2.1. Ảnh hưởng của độ ẩm ...................................................................................................... 11

2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................................... 12

2.3. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không ...................................................................... 13

2.4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến khả năng sinh Aflatoxin trên lạc ................ 14

2.5. Ảnh hưởng của tinh dầu quế đến khả năng phát triển của A. flavus trên đĩa thạch ...... 15

PHỤ LỤC 3. XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................................ 18

3.1. Phần mềm xử lý số liệu R 3.4.1 ....................................................................................... 18

3.2. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc....................................... 19

3.2.1. So sánh mức nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc nhân giữa các tỉnh Nghệ

An, Thanh Hóa và Bắc Giang ................................................................................................. 19

3.2.2. So sánh mức nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc củ giữa các tỉnh Nghệ

vii

An, Thanh Hóa và Bắc Giang ................................................................................................. 20

3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của A. flavus và sinh AF trên lạc 21

3.3.1. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của độ ẩm ............................................... 21

3.3.2. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................ 22

3.3.3. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus ....................... 23

3.3.4. Phân tích mô hình hồi quy tuyến tính đa biến......................................................... 24

PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH AFLATOXIN ............................... 26

4.1. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm ....................................... 26

4.2. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ .................................... 27

4.3. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện hút chân không ....... 27

viii

4.4. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus BG1 ..... 28

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chú giải

Ký hiệu, chữ viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh

AF Aflatoxin Aflatoxin

ALARA Thấp ở mức có thể đạt được as low as reasonably achievable

Acetonitrin Acetonitrile AN

Acid deoxyribonucleic ADN

Tiêu chuẩn thông tin Akaike Akaike Information Criterion AIC

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích Association of Official Analytical

Chemists

ATCC Bộ sưu tập chủng của Mỹ American Type Culture Collection

Adenosine Triphosphate ATP

Tiêu chuẩn thông tin Bayesian Bayesian Information Criterion BIC

BLAST Công cụ BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Mô hình trung bình Bayes Bayesian Model Average BMA

Bộ Y tế BYT

Cặp điện cực Calliper Electronic CE

Đơn vị khuẩn lạc Colony Forming Unit CFU

Thạch Czapeck Dox Czapek Dox Agar CZA

Dichloran Glycerol Dichloran Glycerol DG

ĐHBKHN Đại học Bách khoa Hà Nội

Bộ phát hiện bắt điện tử Electron Capture Detector ECD

Ethylenediaminetetraacetic acid EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

immunosorbent ELISA

Hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme Enzyme-linked assay

FAO Tổ chức nông lương thế giới Agriculture and

Food Organization

Sự phân cực huỳnh quang Fluorescence Polarization FP

Sắc ký khí Gas Chromatography GC

Liquid Performance HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Chromatography

sodium calcium HSCAS Thuỷ hợp natri canxi nhôm silicat Hydrated aluminosilicate

ITS Vùng đệm trong được sao mã Internal Transcribed Spacer

ISO for

Tổ chức tiêu chuẩn hóa thế giới International Organization Standardization

KEBS Văn phòng tiêu chuẩn Kenya Kenya Bureau of Standards

KPH Không phát hiện

KQĐ Không quy định

LOD Giới hạn phát hiện Limit of Detection

LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantitation

MEA Thạch chiết xuất malt Malt Extract Agar

MeOH Methanol Methanol

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Inhibitory

Minimum Concentration

MIP In dấu phân tử polymer Molecularly Imprinted Polymer

MIR Mid-infrared Giữa hồng ngoại

ML Maximum limit Giới hạn tối đa

MS Mass spectrometry Khối phổ

NAFDAC

Cơ quan hành chính và kiểm soát thuốc và thực phẩm National Agency for Food and Drug Administration and Control

NCBI

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia National Center for Biotechnology Information

NIR Hồng ngoại gần Near-infrared

OD Optical density Mật độ quang

OPP Oriented Polypropylene

Bao bì màng phức hợp polypropylene

PCR Polymerase Chain Reaction

“Phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen”

PDA Potato Dextrose Agar

Môi trường thạch khoai tây dextrose

PE Polyethylene Polyethylene

PP Polypropylene Polypropylene

PVC Vinylchoride Vinylchoride

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

QĐ Quyết Định

SDA Thạch Sabouraud Dextrose Sabouraud Dextrose Agar

SĐH Sau Đại Học

SDS Natri dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate

SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extract

RF Quang phổ hồng ngoại Red Fluorescent

TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography

USDA Phòng nông nghiệp Hoa kỳ

United States Department of Agriculture

UV Cực tím Ultra Violet

YEP xuất nấm men Yeast Extract Phosphate

Chiết Phosphate

YPD Yeast Extract Peptone Dextrose

Chiết xuất nấm men Peptone Dextrose

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. 1. Diện tích, sản lượng và lượng tiêu thụ lạc của Việt Nam .............................. 8

Bảng 1. 2. Quy định mức tối đa cho phép nhiễm aflatoxin trong lạc ............................ 12

Bảng 2. 1. Chương trình gradient phân tích aflatoxin .................................................. 47

Bảng 3. 1. Số lượng mẫu nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân ................ 68

Bảng 3. 2. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc nhân ............. 69

Bảng 3. 3. Số mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ ........................................ 70

Bảng 3. 4. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ ................. 71

Bảng 3. 5. Số mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang húng lìu ...................... 72

Bảng 3. 6. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang ............. 73

Bảng 3. 7. Tỉ số nguy cơ nhiễm AF với tình trạng của mẫu lạc nhân ........................... 76

Bảng 3. 8. Tỉ số nguy cơ nhiễm AF với tình trạng của mẫu lạc củ ............................... 78

Bảng 3. 9. Nồng độ DNA sau khi tách chiết của các chủng.......................................... 82

Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế............................................ 83

Bảng 3. 11. Khả năng sinh AF của ba chủng phân lập từ lạc ........................................ 84

Bảng 3. 12. Sự thay đổi độ ẩm của mẫu lạc nhân trong các bao bì khác nhau ............. 85

Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của A. flavus BG1 và sinh AF.... 86

Bảng 3. 14. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự phát triển của nấm mốc A. flavus BG1 .......... 92

Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của lượng nấm mốc đến sự phát triển của A. flavus BG1 ....... 96

Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của áp lực hút chân không đến sự phát triển của A. flavus BG1

..................................................................................................................................... 100

Bảng 3. 17. Mối liên quan giữa mức độ sinh trưởng của A. flavus BG1 và hàm lượng

AF ................................................................................................................................ 103

Bảng 3. 18. Bốn mô hình tối ưu và các thông số ......................................................... 106

Bảng 3. 19. Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A. flavus BG1 trên môi trường

PDA với nồng độ tinh dầu quế khác nhau ................................................................... 109

Bảng 3. 20. Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A. flavus BG1 trên môi trường

xii

PDA với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau ................................................................... 111

Bảng 3. 21. Mức nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo

thời gian ....................................................................................................................... 113

Bảng 3. 22. Mức nhiễm AF trên lạc có nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian

..................................................................................................................................... 114

Bảng 3. 23. Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo

thời gian ....................................................................................................................... 115

Bảng 3. 24. Mức nhiễm AF trên các mẫu có nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời

gian .............................................................................................................................. 116

Bảng 3. 25. Hàm lượng AFB1 (µg/kg) của lạc nhân bảo quản bằng kiểm soát quá trình

..................................................................................................................................... 119

Bảng 3. 26. Kết quả hàm lượng aflatoxin B1 (µg/kg) của lạc nhân đóng gói hút chân

không ........................................................................................................................... 122

Bảng 3. 27. Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu quế khác nhau theo

thời gian ....................................................................................................................... 124

Bảng 3. 28. Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu hồi khác nhau theo

thời gian ....................................................................................................................... 125

xiii

Bảng 3. 29. Tinh chi phí có và không sử dụng tinh dầu trong bảo quản lạc ............... 126

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1. 1. Tổng diện tích/sản lượng lạc thế giới từ năm 2012 đến 2016 ....................... 8

Hình 1. 2. Hình minh họa giống lạc L14 ........................................................................ 9

Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 ............ 13

Hình 1. 4. Sự đồng hóa aflatoxin trong gan................................................................... 14

Hình 1. 5. Màu sắc của Aspergillus flavus: a-trên hạt; b-trên môi trường thạch Czapek

Dox ................................................................................................................................ 21

Hình 1. 6. Hình ảnh cuống bào tử Aspergillus flavus ................................................... 22

Hình 1. 7. Hình ảnh bào tử Aspergillus flavus............................................................... 22

Hình 1. 8. Đẳng nhiệt hút ẩm của thực phẩm ................................................................ 24

Hình 1. 9. Hoạt độ nước và sự ổn định của thực phẩm ................................................ 25

Hình 1. 10. Cân bằng hoạt độ nước và hàm lượng nước .............................................. 26

Hình 1. 11. Độ ẩm không khí trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013

....................................................................................................................................... 27

Hình 1. 12. Nhiệt độ trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 ............ 29

Hình 1. 13. Cơ chế tác động của tinh dầu lên tế bào vi sinh vật .................................. 31

Hình 2. 1. Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxin............................................................. 48

Hình 2. 2. Sắc đồ các điểm chuẩn Aflatoxin B1 ........................................................... 49

Hình 2. 3. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB1 ............................................................... 49

Hình 2. 4. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB2 ............................................................... 49

Hình 2. 5. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG1 ............................................................... 50

Hình 2. 6. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG2 ............................................................... 50

Hình 2. 7. Mô phỏng quá trình pha loãng dịch bào tử A. flavus.................................... 54

Hình 2. 8. Mô phỏng quá trình cấy dịch bào tử pha loãng trên đĩa thạch ..................... 54

Hình 2. 9. Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm tới sự phát triển và sinh AF ...... 58

Hình 2. 10. Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và sinh AF . 59

Hình 2. 11. Mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus B1 .......................... 59

Hình 2. 12. Mẫu thí nghiệm điều kiện hút chân không ................................................. 60

xiv

Hình 2. 13. Mô hình thực nghiệm hút chân không ........................................................ 60

Hình 2. 14. Đo kích thước đường kính A. flavus ........................................................... 61

Hình 2. 15. Thí nghiệm ảnh hưởng của tinh dầu trên lạc thí nghiệm ............................ 62

Hình 2. 16. Mô phỏng phát hiện lạc nhiễm AF bằng đèn UV ở bước sóng 365 nm ..... 63

Hình 2. 17. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................ 66

Hình 3. 1. Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và

Bắc Giang ...................................................................................................................... 74

Hình 3. 2. Tỉ lệ nhiễm AF trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang . 74

Hình 3. 3. Các đĩa nuôi cấy: a) không có nấm mốc; b) và c) có nấm mốc và nấm men

....................................................................................................................................... 75

Hình 3. 4. Mặt trước (a) và mặt sau (b) của đĩa nuôi cấy sau 3 ngày ............................ 79

Hình 3. 5. Hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường SDA ................... 80

Hình 3. 6. Chủng phân lập từ lạc (a, b) và ATCC 204304 (c) cấy điểm trên SDA sau 5

ngày................................................................................................................................ 80

Hình 3. 7. Bọng nấm hình chùy đến cầu, thể bình 1 lớp (a), thể bình hai lớp (b); Bào tử

nấm hình cầu đến gần cầu, màu xanh (c,d) ................................................................... 81

Hình 3. 8. Ảnh hiển vi điện tử quét chủng nấm A1....................................................... 81

Hình 3. 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS; (+): Đối chứng A. flavus ATCC

204304, (-): Đối chứng âm ............................................................................................ 83

oC ................................................................................................................................... 84

Hình 3. 10. Mẫu lạc nhiễm A. flavus BG1 phát huỳnh quang sau 10 ngày nuôi cấy ở 25

Hình 3. 11. Sắc đồ AFB1 của chuẩn (a) và mẫu (c); sắc ký đồ AFB2 của chuẩn (b) và

mẫu (c) ........................................................................................................................... 85

Hình 3. 12. Màu sắc của A. flavus BG1 phát triển trên lạc ........................................... 89

Hình 3. 13. Biểu đồ AFB1 và AF tổng số trong các mẫu có độ ẩm khác nhau; AFB1-

10% (mẫu có độ ẩm 10 %); AFs-10% (mẫu có độ ẩm 10%); ML-AFB1 (Ngưỡng cho

phép của AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số) ................................ 90

Hình 3. 14. Aflatoxin nhiễm trong các mẫu ở nhiệt độ khác nhau; AFB1-25 (AFB1

trong mẫu ở điều kiện 25oC); AFs-25 (AF tổng số ở điều kiện 25 oC); ML-AFB1

(Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số) ......... 94

Hình 3. 15. Xác suất phân phối mật độ cho biến nhiệt độ (Tem) .................................. 95

Hình 3. 16. Kết quả phân tích AF trong thí nghiệm ảnh hưởng mức nhiễm A. flavus

theo tuần; AFB1-10^1 (AFB1 trong mẫu nhiễm 101 CFU A. flavus/g); AFs-10^1 (AF

tổng số trong mẫu nhiễm 101 CFU A. flavus/g); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của

AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số) ................................................ 99

Hình 3. 17. Kết quả phân tích AFB1 theo tuần trong thí nghiệm điều kiện hút chân

không ........................................................................................................................... 102

Hình 3. 18. Biểu đồ mối tương quan giữa các biến (Thời gian – Week, Độ ẩm – Moi,

Nhiệt độ - Tem, Mức nhiễm A. flavus – Flavus, AFB1 và AF tổng số - AFTotal) ..... 105

Hình 3. 19. Các mô hình được BMA lựa chọn ............................................................ 107

Hình 3. 20. Khuẩn lạc phát triển trên các đĩa thạch: a) đối chứng - không bổ sung tinh

dầu; b) bổ sung tinh dầu Quế 0,0125 %; c) bổ sung tinh dầu Quế 0,025%; d) bổ sung

tinh dầu Hồi 0,2 %; e) bổ sung tinh dầu Hồi 0,4 %; f) bổ sung tinh dầu Hồi 0,8 % ... 108

Hình 3. 21. Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu quế ..... 110

Hình 3. 22. Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu hồi ...... 112

Hình 3. 23. Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát quá trình ...... 118

Hình 3. 24. Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng đóng gói hút chân không

..................................................................................................................................... 121

Hình 3. 25. Quy trình bảo quản lạc nhân có sử dụng tinh dầu .................................... 123

Hình 3. 26. Quy trình bảo quản lạc đề xuất ................................................................. 127

Hình 3. 27. Mô hình băng tải kiểm tra phát hiện AF trong lạc ................................... 128

xvi

Hình 3. 28. Máy đóng túi hút chân không ................................................................... 129

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Aflatoxin là độc tố vi nấm có thể bị nhiễm trong nhiều lương thực thực phẩm.

Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới xếp aflatoxin vào nhóm chất có độc tính gây ung

thư loại 1, là nguyên nhân chính gây ung thư gan, giảm miễn dịch và tình trạng còi

cọc ở trẻ. Aflatoxin nhiễm trong thực phẩm ảnh hưởng đến kinh tế và thương mại

trong mọi giai đoạn trên thị trường tiêu thụ và xuất khẩu.

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm

mốc phát triển, đặc biệt là nấm mốc sinh độc tố aflatoxin [16, 104]. Trong số nấm

mốc đã được phân loại có 30-40 % có thể sinh độc tố với liều lượng khác nhau. Nhiều

loài nấm mốc khác nhau có thể sinh ra cùng một loại độc tố. Một loài nấm mốc cũng

có thể sinh ra nhiều độc tố khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường và cơ chất

[4]. Lạc là cơ chất thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin [35, 110].

Cây lạc là cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí quan trọng trong

nền kinh tế thế giới. Lạc được dùng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp,

công nghiệp và là nguồn nguyên liệu cho các ngành phụ trợ khác. Việt Nam có sản

lượng lạc xếp thứ 15 trong số 118 nước trồng lạc [62] và có sản lượng lạc xuất khẩu

đứng thứ 10 trên thế giới [126]. Lạc cũng là một trong những loài cây lương thực

quan trọng đối với đời sống và kinh tế của Việt Nam.

Sau thu hoạch lạc được bảo quản và tích trữ để phục vụ cho sản xuất và chế biến

các sản phẩm trong công nghiệp, nông nghiệp và thực phẩm quanh năm. Lạc có thể

bị nhiễm nấm mốc và aflatoxin xuất phát từ: nhiễm trong quá trình trồng trọt, sơ chế

và bảo quản. Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh độc tố của nấm mốc

bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, môi trường không khí và tình trạng nhiễm nấm mốc ban

đầu của lạc. Ngoài ra, khả năng sinh aflatoxin trong lạc còn phụ thuộc vào loài nấm

mốc bị nhiễm trong lạc.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và khảo sát về tình trạng nhiễm nấm mốc

và aflatoxin trong lạc nhưng chưa có nghiên cứu nào định danh đến chủng cụ thể để

từ đó tìm giải pháp bảo quản hạn chế sự phát triển và sinh độc tố của chủng phân lập

được. Đề tài này đã thực hiện nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin trong lạc, phân lập

và định danh nấm mốc sinh độc tố, sau đó tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng

đến sự phát triển và sinh aflatoxin, nghiên cứu một số giải pháp bảo quản nhằm giảm

nhiễm aflatoxin trên lạc, từ đó đề xuất quy trình bảo quản lạc sau thu hoạch.

Xuất phát từ những phân tích trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo

quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam".

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm nấm

mốc và aflatoxin trên lạc tại một số tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam.

- Đề xuất được giải pháp công nghệ bảo quản lạc có hiệu quả ngăn ngừa nguy cơ

nhiễm aflatoxin trong lạc.

3. Nội dung nghiên cứu

Để đánh giá được thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm nấm

mốc và aflatoxin trong lạc, từ đó đề xuất quy trình bảo quản lạc có hiệu quả ngăn

ngừa nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc, đề tài đã nghiên cứu các vấn đề liên quan có

nội dung chính như sau:

- Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc, aflatoxin trong lạc và một số yếu tố liên

quan tại miền Bắc (Bắc Giang) và miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An). Phân lập

chủng sinh độc tố aflatoxin từ lạc.

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của

chủng nấm phân lập được.

- Khảo nghiệm và đề xuất quy trình giải pháp bảo quản lạc có hiệu quả ngăn

nhiễm aflatoxin.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1. Ý nghĩa khoa học

- Qua các số liệu khảo sát và phân tích, đề tài đã đánh giá được thực trạng nhiễm

nấm mốc và aflatoxin trong lạc ở 3 vùng trồng lạc: Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc

Giang góp phần cảnh báo nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc; đã xác định được

các yếu tố nguy cơ tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhiễm nấm mốc và aflatoxin

trong lạc. Đây là cơ sở khoa học để có hướng bảo quản lạc sau thu hoạch có chất

lượng ổn định. Đề tài cũng phân lập và định danh được một số chủng sinh

aflatoxin trong lạc, đánh giá khả năng sinh aflatoxin trong lạc của các chủng

này, từ đó lựa chọn được chủng có khả năng sinh aflatoxin cao nhất để phục vụ

cho nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng.

- Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, mức nhiễm nấm sinh độc

tố đến sự phát triển và sinh độc tố của Aspergillus flavus, đã đưa ra được mô

hình tiên đoán ảnh hưởng của các yếu tố độ ẩm và mức nhiễm Aspergillus flavus

đến khả năng sinh aflatoxin trên lạc theo thời gian.

- Việc áp dụng có hiệu quả tinh dầu hồi và quế gợi ý cho các nhà khoa học mở

rộng phạm vi sử dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học để hạn chế sự phát triển

và sinh aflatoxin trên lạc nhân của Aspergillus flavus.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc sinh độc

tố, điều kiện đóng gói hút chân không, nồng độ tinh dầu hồi/ quế, trong bao bì

đóng kín và bảo quản là cơ sở để đề xuất giải pháp công nghệ có tính khả thi

trong điều kiện ứng dụng ở quy mô hộ gia đình tại Việt Nam.

- Góp phần giải quyết được khó khăn của người dân do nấm mốc phát triển và

sinh độc tố aflatoxin trong bảo quản lạc nhân, giảm tổn thất sau thu hoạch, gia

tăng giá trị và sức cạnh tranh của lạc nhân Việt Nam.

5. Những đóng góp mới của luận án

- Đã phân lập và định danh được một số chủng nấm mốc có khả năng sinh

aflatoxin từ lạc, trong đó xác định được Aspergillus flavus BG1 sinh lượng

aflatoxin cao nhất.

- Nghiên cứu đã tìm ra được mối liên quan giữa các yếu tố chất lượng và tình

trạng nhiễm aflatoxin trên lạc, tìm ra các yếu tố bất lợi có nguy cơ là nguyên

nhân nhiễm aflatoxin trên lạc nhân và lạc củ.

- Đã nghiên cứu đưa ra được mối quan hệ tuyến tính của các yếu tố ảnh hưởng

(độ ẩm và mức nhiễm A. flavus BG1) tới mức nhiễm aflatoxin theo thời gian.

- Đề xuất được giải pháp công nghệ bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát chất lượng

trước bảo quản, đóng gói hút chân không và bảo quản bằng sử dụng tinh dầu

quế, hồi với quy mô hộ gia đình đảm bảo hiệu quả kinh tế.

- Bảo quản lạc bằng cách sử dụng tinh dầu hồi (quế) mở ra một hướng mới trong

giải pháp bảo quản thực phẩm an toàn và thân thiện với môi trường.

6. Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 143 trang (không kể phụ lục), 32 bảng, 56 hình và 130 tài liệu

tham khảo, được trình bày 4 chương trong 8 phần lớn: Mở đầu (4 trang); Tổng quan

(38 trang); Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (24 trang); Kết quả và bàn

luận (63 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang ); Danh mục các công trình đã công

bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (11 trang); Phụ lục (28 trang).

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Cây lạc

1.1.1. Giới thiệu chung về cây lạc

Cây lạc (Arachis hypogaea Linn.) có tên bắt nguồn từ hai từ Hy lạp: Arachis là

họ đậu đỗ, hypogaea là dưới lòng đất, do quả lạc hình thành trong đất. Lạc trồng rộng

rãi ở khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới và khí hậu ấm. Ban đầu cây lạc được trồng ở

Nam Mỹ, tiếp đó được thuần hóa ở Tây Ban Nha, người Tây Ban Nha đã mang lạc

đến châu Âu, sau đó các nhà buôn đã mang lạc đến châu Á và châu Phi [59].

Lạc được trồng rộng rãi tại Việt Nam cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao. Lạc

là cây công nghiệp ngắn ngày được sử dụng trong công nghiệp, nông nghiệp và các

ngành phụ trợ. Trong công nghiệp lạc được dùng cho công nghiệp thực phẩm để chế

biến bánh kẹo, ép lạc lấy dầu. Dầu lạc còn được dùng cho các ngành công nghiệp

khác như: làm chất dẻo, xi mực in, dầu diesel, làm dung môi cho thuốc bảo vệ thực

vật ... . Trong nông nghiệp, vỏ quả (chiếm 25 - 30 % trọng lượng quả) sau khi tách

phần hạt được nghiền thành cám để dùng cho chăn nuôi. Cám vỏ quả lạc có thành

phần dinh dưỡng tương đương với cám gạo để nuôi lợn, gà vịt công nghiệp rất tốt.

Các phụ phẩm của hạt lạc như khô dầu lạc, thân và lá của lạc cũng được dùng làm

thức ăn chăn nuôi. Ngoài ra, các vi sinh vật cộng sinh cố định đạm như Rhizobium

vigna có thể tạo nốt sần ở rễ một số cây họ đậu, trong đó lạc tạo được nốt sần lớn và

khả năng cố định đạm cao hơn cả, do tác dụng cải tạo đất tốt nên lạc là cây quan trọng

nhất trong hệ thống luân canh cây trồng đạt hiệu quả cao.

Hạt lạc (hay đậu phộng) là lương thực thực phẩm quen thuộc, là nguồn thức ăn

giàu chất béo và đạm có giá trị dinh dưỡng cao trong bữa ăn hàng ngày của người

dân. Hạt lạc nằm trong vỏ mày, mỗi quả có từ 1 - 3 nhân. Tỉ lệ vỏ mày khoảng 14 -

33 %. Lạc nhân có vỏ mỏng màu hồng, nâu sáng, nâu đỏ hoặc đỏ thẫm. Khối lượng

1.000 hạt dao động trong khoảng 300 - 1.300 g. Thành phần sinh hoá của lạc có thể

thay đổi phụ thuộc vào giống, sự biến động của điều kiện khí hậu giữa các năm, vị trí

của hạt ở quả khác nhau cũng ảnh hưởng đến thành phần sinh hoá của hạt lạc. Hạt lạc

chứa rất ít tinh bột. Các chất dinh dưỡng của hạt lạc chủ yếu ở dạng chất béo và

protein, trong đó hàm lượng chất béo khá cao - trung bình khoảng 50 % (chủ yếu ba

axit béo oleic, linolic và palmitic), protein chiếm khoảng 20 - 37 % [8], cacbonhydrat

chiếm khoảng 15,5 % và là nguồn cung cấp các chất khoáng (Kali, Phospho, Magnesi,

Mangan, Sắt, Natri, Kẽm, Đồng), các Vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, Folat), các

Acid amin [28].

Thành phần dinh dưỡng của lạc bao gồm:

Lipit (Chất béo): Theo hiệp hội lạc của Mỹ, chất béo lạc có chứa 50 % acid béo

đơn không no (MUFAs), 33 % Para formadehyde (PFAs) and 14 % acid béo bão hòa

là hỗn hợp acid béo tốt cho tim mạch. Với lượng acid béo đơn không no cao trong

chất béo lạc làm giảm tổng cholesterol trong cơ thể tới 11 % và cholesterol LDL xấu

tới 14 % trong khi cholesterol HDL tốt được duy trì giảm triglyceride. Việc tiêu thụ

các sản phẩm chất béo từ lạc làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, và cung cấp năng

lượng tốt đối với trẻ suy dinh dưỡng [112]. Trong chất béo của lạc, Oleic acid chiếm

tỉ lệ cao (38 - 54 %), sau đó đến Linoleic acid (29 - 37 %), Palmitic acid (10 - 13 %),

Steric acid (2 - 3 %), còn lại các acid béo: arachidic, eicosenoic, behenic và lignoseric

(1 - 3 %) [57, 91, 114].

Protein: Lạc có chứa 20 acid amin và là lượng cung cấp arginine lớn, acid amin

trong lạc có thể là nguồn bổ sung protein trong bữa ăn. Protein trong lạc có hoạt tính

nhũ tương hóa, khả năng nhũ tương hóa ổn định, khả năng tạo bọt, khả năng giữ ẩm

cao, tính hòa tan cao, và là thành phần nguyên liệu cung cấp protein cao trong công

nghiệp thực phẩm. Arginine hay L-arginine là acid amin cần thiết cho gan, da, khớp

và các cơ khỏe mạnh. Arginine giúp tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể; điều hòa

hormone, đường máu và cải thiện khả năng sinh sản của nam giới; arginine còn là

một trong những chất dinh dưỡng có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa [112].

Chất xơ: Lạc cũng là nguồn cung cấp chất xơ. Cacbonhydrat trong lạc bao gồm

chất xơ và tinh bột là hai dạng cacbonhydrat có ảnh hưởng thấp và ít tới đường huyết.

Hiệp hội tiểu đường Mỹ xếp lạc vào siêu thực phẩm của bệnh tiểu đường [112].

Các vitamin: Việc tiêu thụ 100 g lạc đáp ứng tới 75 % lượng Niacin khuyến

nghị ăn vào hàng ngày (RDA), 60 % RDA của folat, 55,5 % RDA của vintamin E,

53 % RDA của thiamin, 35 % RDA của pantothenic acid, 27 % RDA của pyridoxin

và 10 % RDA của riboflavin. Nguồn niacin cao rất quan trọng cho chức năng của hệ

thống tiêu hóa, thần kinh da, giúp chuyển hóa thực phẩm thành năng lượng và hỗ trợ

chống bệnh Alzheimer và sự giảm nhận thức. Tiêu thụ lạc có thể cung cấp vitamin E

giúp chống bệnh tim mạch. Lạc cũng chứa folat là chất đặc biệt quan trọng đối với

trẻ nhỏ và phụ nữ có thai trong việc sản sinh và duy trì các tế bào [112]. Hàm lượng

α-, β-, γ- và δ-Tocopherol trong lạc tương ứng là 10,9; 0,5; 10,8 và 1,1 mg/100g

(tính theo chất khô) [74].

Các khoáng chất: Tiêu thụ 100 g lạc có thể đáp ứng 127 % RDA đồng, 84 %

RDA mangan, 57 % RDA sắt, 54 % RDA phosphor, 42 % RDA magnesi làm giảm

chứng viêm và giảm nguy cơ hội chứng chuyển hóa và tiểu đường type II [112].

Các hoạt chất sinh học: Lạc có chứa các hoạt chất sinh học tốt cho sức khỏe

như phenolic acid và flavonoid. Phytosterol (sterol thực vật và stanol ester) là một

nhóm các hợp chất tìm thấy trong màng tế bào hạt lạc có khả năng ngăn hấp thu

cholesterol và giảm cholesterol trong máu [112].

Với thành phần chất béo không bão hòa, các vitamin và khoáng chất, các hoạt

chất sinh học trong hạt lạc có tác dụng phòng ung thư. Phytoterol trong lạc giảm sự

phát triển của khối u đến 50 %. Resveratrol trong lạc cũng giúp ngừng cung cấp máu

cho khối u phát triển và ngăn tế bào ung thư phát triển [112].

Do tác dụng của cây lạc đối với đời sống nên cây lạc chiếm một vị trí quan trọng

trong nền kinh tế thế giới, là lương thực thực phẩm quan trọng thứ 13 và quan trọng

thứ 4 trong số các loại hạt có dầu quan trọng nhất trên thế giới [49], đồng thời nhu

cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng tăng đã và đang khuyến khích đầu tư phát triển

sản xuất lạc với quy mô ngày càng mở rộng ở các quốc gia trên thế giới.

1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lạc trên thế giới và Việt Nam

Lạc được trồng rộng rãi trên thế giới ở 119 nước, trong đó chủ yếu là châu Á

(chiếm tỉ lệ 60,4 %), sau đó đến châu Phi (29,7 %), châu Mỹ (9,8 %) và châu Đại

dương (0,1 %). Diện tích trồng lạc trên toàn thế giới năm 2012 là 25.563.601 ha, đến

năm 2016 là 27.660.802 ha. Sản lượng lạc trung bình trên thế giới năm 2012 là

42.020.180 tấn, đến năm 2016 là 43.982.066 tấn [62]. Tổng diện tích và sản lượng

lạc trung bình trên thế giới có chiều hướng phát triển ngày càng tăng (hình 1.1).

Hình 1. 1. Tổng diện tích/sản lượng lạc thế giới từ năm 2012 đến 2016 (nguồn [62])

Sản lượng lạc của Việt Nam được xếp thứ 10 trên thế giới [126]. Theo kết quả

điều tra diện tích trồng lạc của các vùng trong cả nước cho thấy: ba vùng miền Bắc

bao gồm đồng bằng sông Hồng (Vĩnh Phúc), Đông Bắc (Bắc Giang), Bắc Trung Bộ

(Thanh Hóa, Nghệ An) có tổng diện tích trồng lạc khoảng chiếm 58,6 % tổng diện

tích trồng lạc trên cả nước. Tổng diện tích sản xuất lạc khu vực miền Trung và khu

vực miền Nam hàng năm chiếm tỉ lệ tương ứng 10,2 % và 19,6 % diện tích trồng lạc

cả nước [11]. Theo số liệu của Tổng cục thống kê Việt Nam, sản lượng lạc trong cả

nước năm 2012 là 470 nghìn tấn, với sản lượng theo địa phương từ 6,3 - 39,7 nghìn

tấn. Trong đó Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang là trong số các tỉnh phía Bắc và

Bắc Trung bộ có sản lượng lạc cao tương ứng là 39,7; 25,6 và 28,3 nghìn tấn [18].

Cho đến năm 2016, kết quả thống kê sản lượng lạc và tình hình tiêu thụ lạc tại Việt

Nam như bảng 1.1.

Bảng 1. 1. Diện tích, sản lượng và lượng tiêu thụ lạc của Việt Nam

Năm

2012

2013

2014

2015

Sơ bộ 2016

Các thông số

Diện tích trồng trọt (nghìn ha)

219,3

216,3

208,7

199,9

191,3

Sản lượng (nghìn tấn)

468,5

491,9

453,3

454,1

441,4

Năng suất trung bình (tấn/ha)

2,14

2,27

2,17

2,27

2,31

Nguồn: tổng cục Thống kê việt Nam [20]

Qua bảng 1.1 ta thấy, mặc dù diện tích trồng lạc trên cả nước có giảm đi qua các

năm, diện tích trồng lạc năm 2016 giảm 12,7 % so với năm 2012. Tuy nhiên năng

suất tăng dần theo năm, năng suất năm 2016 tăng 7,9 % so với năm 2012.

Các giống lạc mới đã góp phần nâng cao năng suất lạc, trong đó một số giống

lạc mới có tiềm năng như: LO2, 1660, LVT, LO5, L14, LO8, MD7, L15, VD1 đã

được đưa vào sản xuất [15]. Cơ cấu giống được sử dụng trong sản xuất của nông dân

miền Bắc nhiều nhất là L14 và MD7 chiếm tỉ lệ 68,7 %, tiếp đó đến giống sen lai, sen

thất, L12, L18, L23, V78 [11]. Giống lạc L14 là giống nhập từ Trung Quốc. Cây có

dạng thân đứng, lá xanh đậm, chống đổ tốt, kháng bệnh bạc lá, đốm nâu, gỉ sắt, đốm

đen, chết ẻo. Quả to, eo nông, gân quả nông, vỏ lụa màu hồng. Khối lượng 100 quả

khoảng 150 - 155 g, 100 hạt khoảng 55 - 58 g. Thời gian sinh trưởng vụ Xuân là 115

- 120 ngày; vụ Thu và vụ Đông là 100 - 105 ngày. L14 là giống chịu thâm canh tốt,

năng suất 40 - 45 tạ/ha. Giống lạc MD7 có thời gian sinh trưởng 120 ngày trong vụ

Xuân, sinh trưởng tốt, cây cao 49,2 cm. Khối lượng 100 hạt là 51 g, chịu hạn tốt, chịu

đất ướt tốt. Năng suất 35 tạ/ha, là giống yêu cầu thâm canh [3]. Hình ảnh giống lạc

L14 như hình 1.2.

Hình 1. 2. Hình minh họa giống lạc L14

Thời vụ trồng lạc ở các tỉnh phía Bắc [3]:

- Vụ Xuân: gieo tốt nhất trong tháng 2 dương lịch, thu hoạch vào cuối tháng 6,

trước khi bước sang tháng 7.

- Vụ Thu: gieo tháng 7-8, thu hoạch tháng 11-12.

- Vụ Đông: gieo tháng 8-9, thu hoạch tháng 12 năm trước tới tháng 1 năm tiếp

theo.

Tại miền Bắc và miền Trung, lạc thường được trồng luân canh với cây trồng

màu vào vụ Xuân hoặc Đông Xuân. Điều kiện sinh thái trong mùa Xuân của miền

Bắc thích hợp cho lạc phát triển, do đó hầu hết diện tích đất màu ở khu vực này được

nông dân sử dụng để trồng lạc Xuân. Tại Bắc Giang đa số các hộ dân trồng lạc trong

tháng 2 (chiếm 78,9 %). Tại Bắc Trung Bộ đa số hộ dân trồng lạc từ giữa tháng 1 đến

đầu tháng 2 (chiếm 83,2 %) [11]. Theo kết quả tổng điều tra dinh dưỡng gần đây nhất,

mức tiêu thụ hạt có dầu (lạc, vừng) trung bình của mỗi người là 2,37 g/người/ngày;

khu vực tiêu thụ nhiều nhất là vùng Trung du và miền núi phía Bắc với mức trung

bình là 5 g/người/ngày [6]. Việc duy trì diện tích và sản lượng lạc tại Việt Nam qua

các năm đã nói lên được khả năng thích nghi và vai trò của cây lạc trong nền nông

nghiệp, đóng góp vào thu nhập của người nông dân nói riêng và thu nhập chung của

nền kinh tế quốc dân trong cả nước nói chung, đặc biệt là người dân miền Bắc và

Trung bộ.

Thống kê lượng lạc nhân xuất nhập khẩu của Việt Nam từ năm 2009 đến 2013

cho thấy lượng xuất khẩu giảm từ 55.921 tấn (năm 2009) xuống 8.477 tấn vào năm

2013. Trong khi đó, lượng nhập khẩu tăng từ 1.812 tấn (năm 2009) lên 5.000 tấn

(năm 2013) [61], điều đó chứng tỏ nhu cầu tiêu thụ lạc của Việt Nam được duy trì

không giảm.

Mức nhập khẩu lạc của các nước trên thế giới theo tỉ lệ phần trăm lượng nhập

khẩu trên toàn thế giới như sau: cao nhất là châu Âu (chiếm tỉ lệ 46,3 %), sau đó đến

châu Á (30,8 %), châu Mỹ (14,6 %), châu Phi (7 %) và châu Đại dương (1,3 %) [60].

Theo kết quả thống kê của ngân hàng thế giới từ năm 2002 đến 2010 thì thực

phẩm của Việt Nam nhiễm mycotoxin bị từ chối nhập khẩu vào các nước như Mỹ,

châu Âu và Nhật bản tương ứng là 32, 23 và 7 lần [118].

Mycotoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm nói chung chủ yếu là aflatoxin.

Thực phẩm nhiễm aflatoxin đã gây nhiều tổn thất về kinh tế, Cục Dược và Thực phẩm

của Nigeria đã tiêu hủy thực phẩm nhiễm aflatoxin trị giá 200.000 đô la Mỹ, việc đưa

ra quy định mức chấp nhận tối đa hàm lượng aflatoxin nhiễm trong thực phẩm của

cộng động châu Âu vào năm 1997 đã ảnh hưởng đến xuất khẩu ngũ cốc, hoa quả khô

và các loại hạt ăn được của châu Phi làm tổn thất ước tính 400 triệu đô la Mỹ. Nghiên

cứu của ngân hàng thế giới cho thấy quy định của cộng đồng châu Âu về aflatoxin

làm chín nước châu Phi tổn thất trong xuất khẩu ngũ cốc, hoa quả khô và hạt tới 750

triệu đô la Mỹ mỗi năm [50, 123].

Miền Bắc là vùng có diện tích trồng lạc lớn nhất, trong đó các tỉnh có sản lượng

lớn là Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An; Trung du và miền núi phía Bắc là những

vùng tiêu thụ lạc nhiều nhất. Vì vậy nghiên cứu thực hiện đánh giá mức độ nhiễm

nấm mốc và aflatoxin trong lạc tại các địa bàn này.

L14 và MD7 là giống lạc được trồng phổ biến tại miền Bắc, với ưu thế về tính

thích nghi và chống chịu sâu bệnh của L14 nên giống lạc này được trồng rộng rãi

trên các tỉnh này, do đó L14 là giống lạc được sử dụng trong nghiên cứu này.

1.1.3. Quy định về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc

Theo tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn Codex về lạc, quy định số hạt lạc bị

mốc cho phép tối đa không quá 0,2 % khối lượng, nhân lạc mốc được xác định là

nhân có hình sợi mốc có thể quan sát bằng mắt thường [23, 39].

Phòng Nông nghiệp của Hoa Kỳ (USDA) quy định mức nhiễm nấm mốc trong

lạc không vượt quá 100 MPN/g [121]. Cục Dược phẩm và Thực phẩm của Philipin

quy định mức nhiễm nấm mốc trong lạc phơi nắng (sun dried peanut) cho phép tối đa

là 102 CFU/g [63].

Việt Nam không quy định giới hạn cho phép mức nhiễm nấm men - mốc cho

lạc, nhưng quy định với các sản phẩm “ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột, miến, mì sợi”

trong quyết định số 46/2007/QĐ-BYT, giới hạn cho phép tổng số bào tử nấm men -

mốc là 103 CFU/g đối với sản phẩm có xử lý nhiệt trước khi sử dụng, và 102 CFU/g

đối với sản phẩm dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng [2].

Quy định mức tối đa cho phép aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số (B1, B2, G1,

G2) trong lạc trên thế giới và Việt Nam như bảng 1.2.

Bảng 1. 2. Quy định mức tối đa cho phép nhiễm aflatoxin trong lạc

Sản phẩm

Hàm lượng aflatoxin (µg/kg)

Quy định của các nước

Tổng số (B1, B2, G1,G2)

KQĐ

Lạc nhân

Thái Lan [85]

CODEX [40] Lạc có xử lý nhiệt trước khi sử dụng

KQĐ

USDA [122] Lạc nhân dùng trong chế biến

KQĐ

Cộng đồng châu Âu [117]

Lạc dùng để phân loại, hoặc xử lý vật lý, trước khi sử dụng cho con người hoặc làm nguyên liệu thực phẩm

Lạc và sản phẩm lạc đã chế biến, dùng cho ăn liền hoặc nguyên liệu thực phẩm ăn liền

Việt Nam [1] Lạc phải sơ chế trước khi tiêu thụ

Lạc sử dụng trực tiếp không cần phải sơ chế

Ghi chú: “KQĐ” nghĩa là “Không quy định”.

Aflatoxin được xác định là nhóm chất gây ung thư rõ rệt trên người [108] nên

các cơ quan quốc tế và Châu Âu không thiết lập một lượng chấp nhận ăn vào hàng

ngày cho aflatoxin, mức tối đa cho phép được thiết lập ở mức thấp có thể đạt được

(ALARA) [40, 117].

1.2. Aflatoxin

Aflatoxin là từ ghép của A = Aspergillus, fla = flavus và toxin = độc. Afatoxin

là một nhóm khoảng 20 đồng phân, trong tự nhiên aflatoxin thường xuất hiện một

nhóm 4 đồng phân chính (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) và hai sản phẩm đồng hóa là

AFM1 và AFM2 được tách từ sữa của động vật có vú ăn phải thức ăn nhiễm aflatoxin

[44]. Các chất này có tính chất hóa lý như sau.

1.2.1. Tính chất hóa lý của aflatoxin

Aflatoxin (B1, B2, G1, G2) được phân biệt bởi màu huỳnh quang của chúng

dưới ánh sáng cực tím có bước sóng dài, aflatoxin có màu xanh dương (B = Blue)

hoặc màu xanh lục (G = Green). Phổ hấp thụ cực tím của các đồng phân này tương

tự nhau, ở bước sóng: 223, 265 và 363 nm [44].

Các đồng phân chính của aflatoxin có công thức phân tử là:

• AFB1: C17H12O6 • AFB2: C17H14O6

• AFG1: C17H12O7 • AFG2: C17H14O7

Với cấu trúc hóa học như hình 1.3.

Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 (nguồn [86])

AFM1 và AFM2 là hai sản phẩm trao đổi chất 4-hydroxy aflatoxin B1 và 4-

dihydroxy aflatoxin B2. AFB2 và AFG2 là dẫn xuất dihydroxy của AFB1 và AFG1.

Với tác dụng của chất xúc tác hydro hóa, sau khi kết thúc quá trình hydrogen hóa

AFB1 hấp thụ ba phân tử hydro và tạo dẫn xuất tetrahydrodeôxy, trường hợp quá

trình hydrogen hóa giữa chừng AFB1 hấp thu một phân tử hydro sẽ tạo thành AFB2.

AFB1 cũng phản ứng với nhóm hydrôxyl dưới tác dụng xúc tác của acid mạnh. Sự

phân giải ozon làm phân giải AFB1 thành levulinic, succinic, malonic và glutaric

acid. Aflatoxin có thể bị phân hủy từng phần trong dung dịch cồn dưới tác dụng của

ánh sáng và nhiệt [44].

1.2.2. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe

Aflatoxin (AF) ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật, làm giảm khả

năng miễn dịch, kém tăng trưởng và thấp còi ở trẻ [72]. Trẻ em ăn phải thực phẩm

nhiễm AF kết hợp với dinh dưỡng trong khẩu phần ăn thấp cũng góp phần đáng kể

trong việc nhiễm một số bệnh truyền nhiễm, ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch và

không tăng trưởng phát triển [53], việc phơi nhiễm AF cũng liên quan với tình trạng

trẻ còi cọc và thiếu cân [68].

Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (IARC) phân loại AF là các chất gây ung

thư thuộc nhóm 1. Thực phẩm thường nhiễm đồng thời AFB1 và AFB2 hoặc AFG1

và AFG2. Hoạt tính sinh học của AFB2 và AFG2 hạn chế, không đủ bằng chứng về

tác dụng gây ung thư đối với động vật. AFG1 ít gây đột biến hơn AFB1. AFM1 và

AFM2 chỉ có trong sữa và các sản phẩm của sữa và ít gây ung thư hơn AFB1 [108].

Ung thư là nguyên nhân chính của bệnh tật và tử vong [46]. Thống kê tỉ lệ chết

năm 2012 cho thấy ung thư gan là nguyên nhân chính thứ hai gây chết người do ung

thư trên toàn thế giới. Ung thư gan xếp thứ năm trong số các bệnh ung thư thông

thường ở đàn ông (554.000 trường hợp chiếm tỉ lệ 8 % trên tổng số) và thứ chín trong

các bệnh ung thư thông thường ở phụ nữ (228.000 trường hợp, chiếm 3 % tổng số).

Tỉ lệ ung thư gan cao nhất ở khu vực châu Á và châu Phi mà nguyên nhân chính là

nhiễm virus viêm gan B, virus viêm gan C và do nhiễm AF [93]. AF trong thực phẩm

sau khi hấp thu qua dạ dày, tới gan AFB1 sẽ bị enzym microsomal đồng hóa thành

các đồng phân khác nhau qua hydrôxyl hóa, thủy hóa, khử methyl và epoxit hóa như

AFM1, AFQ1, AFB2, AFP1. Cơ chế đồng hóa AF trong gan [44] như hình 1.4.

Hình 1. 4. Sự đồng hóa aflatoxin trong gan

Để xác định mức độ ảnh hưởng của AF trong lạc đối với sức khỏe, đánh giá phơi

nhiễm AF trong khẩu phẩn ăn có chứa lạc cũng là vấn đề được quan tâm. Đánh giá

phơi nhiễm khẩu phần ăn với aflatoxin B1, orchatoxin A và fumonisin đối với người

lớn tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam cho thấy phơi nhiễm khẩu phần ăn với aflatoxin B1

là 39,4 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày [33]. Tuy nhiên trong báo cáo vắn tắt về đánh

giá nguy cơ đối với mycotoxin trong chuỗi thức ăn của con người và động vật của cơ

quan an toàn thực phẩm Pháp [129] và đánh giá của JECFA về mức cho phép ăn vào

hàng ngày [125] cho thấy aflatoxin là nhóm được xác định là chất gây ung thư rõ rệt

trên người nên các cơ quan quốc tế và Châu Âu không thiết lập một lượng chấp nhận

ăn vào hàng ngày đối với aflatoxin.

Aflatoxin được phát hiện và định lượng bằng các phương pháp được giới thiệu

dưới đây.

1.2.3. Các phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân tích aflatoxin

Để kết quả phân tích phản ánh trung thực, đại diện chất lượng sản phẩm thì

phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu phải được lựa chọn và áp dụng phù hợp. Một số

thuật ngữ về lấy mẫu được hiểu như sau:

- Lô hàng: Lượng xác định vật liệu (lạc hoặc sản phẩm lạc) mà từ đó mẫu được

lấy ra và kiểm tra để xác định một (hoặc nhiều) đặc tính.

- Mẫu ban đầu: Lượng vật liệu được lấy tại một thời điểm từ các điểm lấy mẫu

riêng lẻ trong khắp lô hàng.

- Mẫu chung: Mẫu gộp - Tập hợp của hai hoặc nhiều mẫu ban đầu, được lấy

mẫu thực tế trong khắp lô hàng, được gộp lại và trộn đều.

- Mẫu phòng thử nghiệm: Mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn đều và chia mẫu

chung để gửi đến phòng thử nghiệm và dùng để kiểm tra hoặc thử nghiệm.

Các phương pháp lấy mẫu quy định trên thế giới và Việt Nam như:

- Theo hướng dẫn của CODEX STAN 209 [37] và CODEX STAN 193-1995 sửa

đổi năm 2015 [40]: lượng mẫu ban đầu phải từ 200 g trở lên, tùy theo số lượng

mẫu ban đầu để lấy được lượng mẫu chung là 20 kg. Để đảm bảo sự đồng nhất

của mẫu, mẫu chung phải gộp từ nhiều phần nhỏ hoặc mẫu ban đầu thu thập từ

nhiều vị trí khác nhau của lô. Nếu mẫu chung nhiều hơn lượng muốn lấy thì ta

phải trộn và chia nhỏ đến khi đạt được lượng mẫu phân tích. Với mẫu ở trạng

thái tĩnh, mẫu chung phải được gộp từ những phần mẫu ban đầu được lấy ngẫu

nhiên từ các vị trí khác nhau của lô. Đối với các lô tĩnh được đóng trong những

bao túi đơn lẻ, số túi lấy mẫu được tính theo công thức:

SF = (LT × IS)/(AS × IP) (1)

Trong đó: SF - tần suất lấy mẫu hay số túi mẫu được lấy,

LT - trọng lượng của lô,

IS – khối lượng của mẫu ban đầu,

AS – trọng lượng của mẫu chung và

IP – trọng lượng của từng bao túi lẻ.

Số lượng mẫu ban đầu, tùy theo khối lượng của lô, số mẫu lấy từ 10 đến 100

mẫu.

- Quy định của cộng đồng châu Âu (EC) No 401/2006 [130]: lượng mẫu ban đầu

khoảng 300 g, trường hợp mẫu đóng túi có khối lượng nhỏ hơn 300 g thì lấy 2

túi hoặc nhiều hơn. Mẫu thử nghiệm từ 1 đến 10 kg.

Mẫu lạc thu thập ngoài chợ có thể ở dạng đống, các dụng cụ chứa, hoặc đóng

Trọng lượng của lô × Trọng lượng của mẫu ban đầu

bao, túi bán lẻ. Số mẫu ban đầu (n) được tính theo công thức:

(2) n= Trọng lượng của mẫu chung ×Trọng lượng của bao gói lẻ

Trong đó: Trọng lượng tính bằng kg

Số mẫu ban đầu n là số nguyên đã được làm tròn

Số lượng mẫu ban đầu, tùy theo khối lượng của lô, số mẫu lấy từ 10 đến 100

mẫu.

- Theo hướng dẫn lấy mẫu của cơ quan tiêu chuẩn Anh [64]: lượng mẫu chung

tối thiểu là 1 kg, số mẫu ban đầu từ 5 đến 100 mẫu.

- Theo tiêu chuẩn Việt Nam [25]: lượng mẫu ban đầu tối thiểu là 400 g đến 3000g.

Mẫu phòng thử nghiệm từ 1 kg đến 10 kg. Số mẫu ban đầu từ 10 đến 100 mẫu.

Các quy định về lấy mẫu lạc để phân tích aflatoxin hiện hành, chưa có quy định

hoặc hướng dẫn lấy mẫu lạc trên thị trường. Các quy định về lấy mẫu trên thế giới

cũng như Việt Nam quy định số lượng mẫu ban đầu từ 5 đến 100 mẫu, lượng mẫu

chung từ 1 kg đến 20 kg, lượng mẫu ban đầu từ 200 g trở lên.

Sự có mặt của aflatoxin có thể được phát hiện bằng các thiết bị phân tích hấp

thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay), sắc

ký lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) hoặc các kit thử dùng để phát hiện

aflatoxin [47], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [32] và Sắc ký lỏng khối phổ (LC-

MSn) [82]. Ngoài ra, dựa vào đặc tính phát huỳnh quang màu xanh, aflatoxin B còn

được phát hiện dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm lên huỳnh quang màu xanh dương,

aflatoxin G lên huỳnh quang màu xanh lục [128]. Kết quả phát hiện nhanh aflatoxin

bằng TLC và ELISA trong các mẫu lạc thu thập trên thị trường và tại các nông trại ở

Kenya phát hiện mức nhiễm từ 6,9 tới 88,7 ppb [47].

Aflatoxin được định lượng bằng các thiết bị TLC, HPLC, GC và LC/MS-MS.

Các mẫu lạc được phân tích hàm lượng AF đồng thời bằng TLC và HPLC, kết

quả cho thấy độ thu hồi của kết quả phân tích bằng TLC là 79 % trong khi HPLC là

95 %; giới hạn phát hiện (LOD) của AF bằng HPLC là 0,4 g/kg trong khi TLC là

0,8 g/kg [128]. Các mẫu lạc phân tích bằng HPTLC có LOD được xác định là 0,84

g/kg [90]. Giới hạn định lượng (LOQ) của AF trong gạo và lạc phân tích bằng LC-

MS/MS được xác định trong khoảng 0,9-2 g/kg [82]. LOQ gấp 3,3 lần LOD [26],

do đó qua các kết quả nghiên cứu trên ta thấy LC-MS/MS là thiết bị hiện đại và có

độ nhạy cao, đáp ứng được yêu cầu kiểm soát mức độ nhiễm AF trong lạc.

1.2.4. Tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc

Aflatoxin nhiễm trong nhiều thực phẩm, trong đó lạc là cơ chất thích hợp cho

nấm mốc phát triển và sinh aflatoxin.

Tại Brazil, 101 mẫu thu thập tại 5 thành phố của bang Rio Grande do Sul từ năm

2009 và 2010, kết quả phát hiện có 14 % số mẫu có hàm lượng AFB1 vượt quá giới

hạn cho phép (20 µg/kg). Trong khi kết quả đánh giá trong vòng 2 năm từ 2000 đến

2002, trong số 664 mẫu lạc và sản phẩm lạc phát hiện 31,3 % mẫu phân tích bị nhiễm

AF ở mức 92,1 đến 5476,0 µg/kg [83].

Nghiên cứu mức độ nhiễm AF trong lạc nhân tại 5 tỉnh của Perak được thực

hiện trên 210 mẫu, kết quả có 129 mẫu phát hiện AFB1 trong khoảng 0,7 - 547,5

µg/kg (chiếm tỉ lệ 61 %), 118 mẫu phát hiện AFG1 trong khoảng 0,3 - 376,0 µg/kg

(chiếm tỉ lệ 56 %), có 92 % nhiễm AF tổng số trong khoảng 0,3 - 762,1 µg/kg [70].

Trong số 260 mẫu lạc nhân được lấy tại bang Kaduna ở Tây Bắc Nigeria (2015),

có 28,75 % số mẫu phát hiện nhiễm AF, trong đó có 9,2 % vượt quá ngưỡng cho phép

(20 µg/kg) theo quy định của Cục Dược và Thực phẩm của Nigeria (NAFDAC) [73].

1.263 mẫu lạc và sản phẩm lạc thu thập tại miền Tây Nyanza và tỉnh Nairobi

của Kenya để phân tích AF, kết quả có 37 % số mẫu vượt quá ngưỡng cho phép (10

µg/kg) theo quy định của Văn phòng tiêu chuẩn Kenya (KEBS), lạc củ có tỉ lệ nhiễm

AF thấp nhất với 96 % thấp hơn 4 µg/kg và 4 % hơn 10 µg/kg. Hầu hết AF nhiễm

trong các sản phẩm bơ lạc (69 %) và lạc hỏng (75 %) [92].

110 mẫu lạc nhân và lạc củ được thu thập vào mùa ẩm tháng 2 năm 2004 tại

miền Tây Java, Indonesia, trong đó có 53 mẫu lạc củ (13 mẫu lấy từ 12 hộ nông dân

và 40 mẫu lấy từ 23 người thu mua), 57 mẫu lạc nhân được lấy (7 mẫu lạc khô lấy từ

người thu mua, 5 mẫu lấy từ 2 nhà buôn và 45 mẫu lấy từ 45 nhà bán lẻ trên thị trường

truyền thống). Số mẫu lạc bị nhiễm AFB1 cao hơn ngưỡng cho phép của CODEX

(15 µg/kg) có tỉ lệ cao nhất trong các mẫu lạc thu từ nhà buôn là 80 %, tiếp đến nhà

bán lẻ (75,6 %), hộ nông dân (38,3 %) và người thu mua 30,0 và 14,3 %) [98].

Nghiên cứu mức nhiễm AFB1 trong các mẫu lạc thu thập từ các tỉnh Hà Tây,

Thanh Hóa, Nghệ An và Đồng Nai bảo quản sau 5 - 6 tháng phát hiện 41/200 mẫu

nhiễm AFB1 (chiếm tỉ lệ 20,5 %); Tỉ lệ nhiễm AFB1 theo tỉnh Hà Tây, Thanh Hóa,

Nghệ An và Đồng Nai tương ứng là 30 %, 20 %, 16 % và 16 %; khoảng nhiễm theo

từng tỉnh tương ứng: 5 - 170 µg/kg; 3 - 90 µg/kg; 3 - 100 µg/kg; 3 - 90 µg/kg [11].

Nghiên cứu mức độ nhiễm AF trong lạc và ngô tại 3 xã huyện Tân Kỳ, Nghệ

An đã thực hiện với 243 mẫu nông sản, có tới 232 mẫu (95,4 %) phát hiện AF, trong

đó có 56 mẫu (23 %) có lượng AF vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế. Trong

đó số mẫu phát hiện nhiễm AF từ lượng vết với từng đối tượng là lạc vỏ (98,3 %),

ngô bột (87,5 %) và ngô hạt (98,4 %). Trong 90 mẫu lạc vỏ phát hiện 98,3 % nhiễm

AF (vết) với 33,3 % nhiễm >2 µg/kg; 6,6 % nhiễm >10 µg/kg; 5 % nhiễm >20 µg/kg

và 1,6 % nhiễm >100 µg/kg [7].

Qua các kết quả nghiên cứu tình hình nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc ta

thấy nấm mốc nhiễm và sinh độc tố trên lạc chủ yếu là thuộc nhóm Aspergillus, trong

đó Aspergillus flavus cần được quan tâm nhiều nhất do khả năng sinh độc tố aflatoxin,

đặc biệt chất có độc tính mạnh nhất là aflatoxin B1. Đồng thời thực trạng nhiễm

aflatoxin trong lạc cũng là vấn đề an toàn thực phẩm cần được quan tâm.

1.3. Aspergillus trên lạc

1.3.1. Tình hình nhiễm nấm mốc trên lạc

Nấm mốc phát triển yêu cầu một nguồn cung cấp năng lượng ở dạng

cacbonhydrat, chất béo từ thực vật, nguồn nitơ vô cơ hoặc hữu cơ, các kim loại ở

lượng vết và độ ẩm đủ để sinh trưởng và sinh độc tố. Nguồn cung cấp năng lượng từ

cơ chất đóng vai trò quan trọng trong việc tạo điều kiện hay ức chế sự phát triển của

của các chủng sinh độc tố. Các chủng Aspergillus flavus sinh độc tố được phân lập

nhiều nhất từ lạc, hạt bông, sau đó đến gạo và cây cao lương [99]; 1.400 loài nấm

được phân lập từ lạc của Ai cập, các nấm mốc này chủ yếu thuộc các giống như

Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus và Epicoccum; loài Aspergillus có mặt

chủ yếu là A. niger, A. parasiticus, A. flavus và A. tereus [50], trong đó A. flavus và

A. parasiticus là các loài sinh aflatoxin chủ yếu [67].

Nấm mốc sinh AF phân lập được từ lạc chủ yếu là Aspergillus flavus [9, 96,

123]. Kết quả thử khả năng sinh AF của các chủng Aspergillus phân lập được cho

thấy A. flavus sinh AFB1 và AFB2, trong khi A. parasiticus sinh AFB1, AFB2, AFG1

và AFG2 [36, 43, 50, 123].

Nghiên cứu sự có mặt của nấm mốc và mức độ nhiễm AF trong hạt lạc giai đoạn

thu hoạch và tích trữ ở bang Kaduna, Nigeria đã chỉ ra rằng có đến 85 % các chủng

phân lập từ lạc là nấm mốc sinh AF, trong chủng Aspergillus flavus chiếm 65 %;

chủng Aspergillus parasiticus chiếm 20,3 %; chủng Aspergilus niger chiếm 7 % và

chủng Aspergillus tereus là 1,2 % [73].

210 mẫu lạc nhân thu được tại 5 tỉnh của Perak có hoạt độ nước trong khoảng

0,72 - 0,75 và mức nhiễm A. flavus trong khoảng 1,0×102 đến 1,1×105 CFU/g,

161/210 mẫu nhiễm nhóm A. flavus (chiếm tỉ lệ 77 %) [70].

270 mẫu lạc nhân thu thập tại Đông Ethiopia vào năm 2010 được phân tích cho

thấy tỉ lệ nhiễm nấm 50-80 % chủ yếu là các loài Aspergillus niger, Aspergillus flavus,

Aspergillus ochaceus, Aspergillus paraciticus và Penicilium [30].

110 mẫu lạc nhân và lạc củ được lấy vào mùa ẩm tháng 2 năm 2004 tại miền

Tây Java, Indonesia, gồm 53 mẫu lạc củ (13 mẫu lấy từ 12 hộ nông dân và 40 mẫu

lấy từ 23 người thu mua) và 57 mẫu lạc nhân (7 mẫu lạc khô lấy từ người thu mua, 5

mẫu lấy từ 2 nhà buôn và 45 mẫu lấy từ 45 nhà bán lẻ trên thị trường truyền thống).

Tỉ lệ nhiễm A. flavus cao nhất ở các nhà bán buôn cũng như bán lẻ (100 %), sau đó

đến các mẫu từ người thu mua (85-85,7 %) và hộ nông dân (84,6 %). [98].

Các nghiên cứu về tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc cho thấy lạc

bị nhiễm nấm mốc sinh AFB1 chủ yếu là Aspergilus flavus [54, 73].

Tại Việt Nam, kết quả định danh bước đầu các nấm mốc trên hạt lạc trong khu

vực chợ Xuân Khánh, Thành phố Cần Thơ năm 2009 phát hiện được các loài:

Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum [9].

Nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc vàng (A. flavus) trên lạc thu thập tại nhà dân, chợ

và đại lý ở các miền Bắc - Trung - Nam cho kết quả tỉ lệ nhiễm nấm mốc vàng là

79,33 %, trong đó mức nhiễm nấm mốc vàng tại miền Bắc là cao nhất do đặc điểm

khí hậu miền Bắc có độ ẩm cao, nóng ẩm thất thường [11]. Các mẫu lạc thu thập tại

các tỉnh miền Bắc Việt Nam như Nghệ An, Hải Dương và Hà Nội được phân lập, thu

được 30 chủng A. flavus và 3 chủng A. niger, kết quả phát hiện bốn gien đích ver-1,

omt-1, nor-1 và apa-2 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp AF bằng phản ứng PCR

cho thấy có 19 chủng A. flavus chứa cả bốn gen đích, 8 chủng A. flavus chứa ít hơn

bốn gen đích, 3 chủng A. flavus và 3 chủng A. niger không chứa bất kỳ gien đích nào.

Chủng A. flavus sinh AF phát hiện cả bốn gien đích, không phát hiện gien đích nào

trong hai chủng A. niger và các chủng A. flavus không sinh độc tố [17].

Như vậy nấm mốc sinh độc tố phát hiện trên lạc chủ yếu là A. flavus và A.

parasiticus. A. flavus chủ yếu sinh AFB1 và AFB2, trong khi A. parasiticus sinh

AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2.

Qua kết quả nghiên cứu tình hình nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc cho

thấy Aspergillus flavus là nấm sinh aflatoxin phổ biến trong lạc. Do đó A. flavus được

quan tâm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh

aflatoxin trên lạc.

1.3.2. Aspergillus flavus

Sự có mặt của Aspergilus flavus được phát hiện bước đầu thông qua những đặc

điểm hình thái mô tả khóm nấm mốc và bào tử nấm mốc dưới đây.

1.3.2.1. Khóm nấm mốc

A. flavus sinh trưởng trên hạt lạc thường có màu vàng xanh nhạt, vàng xanh

đậm, nâu olive, hoặc nâu (hình 1.5.a) [109]. Trên môi trường thạch Czapek Dox, các

khóm nấm mốc có hạt, phẳng, thường có rãnh tia, ban đầu màu vàng nhưng nhanh

chóng chuyển từ màu vàng-xanh sáng đến vàng-xanh đậm theo tuổi (hình 1.5.b) [45].

Hình 1. 5. Màu sắc của Aspergillus flavus: a-trên hạt; b-trên môi trường thạch Czapek Dox

Màu của khuẩn lạc thay đổi khi môi trường nuôi cấy thay đổi, A. flavus được

cấy trên bốn môi trường (PDA, SDA, MEA và thạch Czapecks). Khuẩn lạc có màu

xanh trên môi trường SDA, màu xanh lục trên môi trường MEA, màu vàng xanh trên

môi trường PDA và màu vàng trên môi trường CZA [96]. A. flavus cũng có thể phân

biệt dựa trên mặt sau của đĩa thạch. Trên môi trường PDA: ban đầu khuẩn lạc có màu

trắng, sau 3 ngày nuôi cấy bào tử nấm có màu oliu và xanh lục đậm, viền xung quanh

khuẩn lạc có màu trắng, mặt sau của khuẩn lạc có màu vàng nhạt; Trên môi trường

SDA: ban đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau 4 ngày nuôi cấy bào tử có màu vàng xanh

và ôliu, viền xung quanh khuẩn lạc màu trắng, viền trắng sẽ mất đi khi khuẩn lạc phát

triển rộng ra và sinh nhiều bào tử, mặt sau tạo rãnh có màu nâu nhạt; Trên môi trường

RBCA: bào tử có màu vàng nhạt sau chuyển sang xanh đậm và ôliu sau 6 ngày nuôi

cấy, mặt sau của khuẩn lạc không có màu; Trên môi trường MEA: bào tử có màu ôliu

và xanh đậm, mặt sau của khuẩn lạc có màu nâu nhạt hoặc nâu sáng [81].

1.3.2.2. Bào tử nấm

Cuống bào tử (hình 1.6.a) phình ở đầu và chứa một số bào tử đính chứa các tế

bào hình ống với chuỗi bào tử đính khô dài. Đầu bào tử đính thường có hình cầu chia

thành nhiều ống (hình 1.6.b) [109]. Cuống bào tử trong suốt và thô ráp, thể bình 1 lớp

hoặc hai lớp, vách cuống xù xì, cuống bào tử đính hình cầu hoặc hình quả lê, bông

tỏa hình tia hoặc đôi khi tạo cột (hình 1.6.c) [45, 109].

Hình 1. 6. Hình ảnh cuống bào tử Aspergillus flavus

Bào tử của A. flavus có hình cầu đến gần cầu, màu xanh nhạt (hình 1.7.a) [45,

109]. Khi sử dụng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Micoroscopy-SEM)

có thể cho thấy rõ đặc điểm bào tử A. flavus với bề mặt tương đối mỏng và hơi xù xì,

bào tử của A. flavus có hình cầu đến hình elip (hình 1.7.b) [101].

Hình 1. 7. Hình ảnh bào tử Aspergillus flavus

1.3.2.3. Các phương pháp phát hiện Aspergillus flavus

Các phương pháp phát hiện A. flavus dựa vào: 1) Đặc điểm hình thái: sự phát

triển của A. Flavus trên môi trường thạch, dựa vào màu sắc và hình dạng của nấm; 2)

Khả năng sinh độc tố aflatoxin; và 3) so sánh trình tự gen trên ngân hàng gen thế giới.

Dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc trên môi trường SDA, sau bốn ngày

nuôi cấy bào tử nấm mốc có màu vàng-xanh và oliu, viền xung quanh khuẩn lạc màu

trắng, viền trắng sẽ mất đi khi khuẩn lạc phát triển rộng ra và sinh nhiều bào tử, mặt

sau tạo rãnh có màu nâu nhạt [81].

Dựa vào màu sắc và hình dạng của A. flavus: Các loài Aspergillus được xác định

dựa trên sự sắp xếp đầu bào tử, hình dạng và kích thước của bọng, cấu trúc và chiều

dài của cuống, hình dạng, cấu trúc và màu của bào tử đính. Đường kính của bọng

trong khoảng 10 - 65 mm [43].

Khẳng định thông qua khả năng sinh aflatoxin: các loài A. flavus khác nhau

được nuôi cấy trên môi trường thạch và quan sát dưới ánh sáng đèn UV ở bước sóng

365 nm lên huỳnh quang màu xanh dương [128].

Aspergillus flavus sinh ra một loạt các chất đồng hóa thứ cấp bao gồm aflatoxin,

cyclopiazonic acid, aflatrem, aflavin, kojic acid, aspergillus acid, neoaspergillic acid,

b-nitropropionic acid và paspalinine. Trong số đó aflatoxin là mối đe dọa lớn đối với

sức khỏe con người và động vật [43].

Để nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển và sinh độc tố của A. flavus, việc

phân lập và khẳng định chủng sinh độc tố aflatoxin trên lạc là cần thiết, từ đó nghiên

cứu các giải pháp hạn chế sự sinh aflatoxin của chủng được phân lập.

1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin của

A. flavus

Để tìm được các giải pháp kiểm soát nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc, chúng

ta cần nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc và sinh

aflatoxin trên lạc, đặc biệt là A. flavus.

Nấm mốc phát triển trên lạc sử dụng dinh dưỡng của hạt lạc để cung cấp năng

lượng và phát triển tế bào. Nấm mốc hấp thu dinh dưỡng qua thành tế bào trong điều

kiện môi trường thích hợp để duy trì sự sống và phát triển, sinh độc tố. Các yếu tố

ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của nấm mốc như: nhiệt độ, môi trường không khí,

pH…, quan trọng nhất là hoạt độ nước không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của

nấm mốc mà còn là nguyên nhân gây hư hỏng lạc.

1.4.1. Ảnh hưởng của độ ẩm và hoạt độ nước

Độ ẩm hay hàm lượng nước là một thành phần quan trọng ảnh hưởng đến hệ vi

sinh vật, độ ổn định hóa học và vật lý của thực phẩm. Độ ẩm trong thực phẩm bao

gồm nước liên kết và nước tự do và được xác định bằng phương pháp sấy. Nước liên

kết hóa học không hỗ trợ sự phát triển của vi sinh vật hoặc ảnh hưởng đến chất lượng

thực phẩm. Nước tự do ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và các tính chất

của thực phẩm, người ta thường được đề cập đến hoạt độ nước (aw).

Hoạt độ nước nằm trong khoảng từ 0 ≤ aw ≤ 1. Hoạt độ nước có thể xác định

bởi áp suất hơi nước bên trên thực phẩm (p) và áp suất bay hơi của nước tinh khiết

(p0) ở cùng nhiệt độ, hoặc có thể xác định bởi độ ẩm cân bằng tương đối (ERH, %)

𝐸𝑅𝐻

của không khí xung quanh mẫu trong buồng đo [106]:

(3)

=

𝑎𝑤 =

100

𝑝 𝑝0

1.4.1.1. Mối quan hệ giữa độ ẩm và hoạt độ nước

Mối quan hệ giữa độ ẩm và hoạt độ nước được biểu thị bằng biểu đồ đẳng nhiệt

hút ẩm và nhả ẩm của thực phẩm, sự khác biệt giữa đường hút ẩm và nhả ẩm gọi là

độ trễ. Biểu đồ này được chia thành 3 vùng: vùng I - các sản phẩm giàu đường hoặc

pectin (ví dụ: táo sấy), tổng độ trễ lớn nhất ở hoạt độ nước 0,65; vùng II - thực phẩm

giàu protein (như thịt lợn), độ trễ trung bình bắt đầu ở hoạt độ nước 0,85; vùng III -

thực phẩm giàu tinh bột, độ trễ lớn nhất ở hoạt độ nước khoảng 0,7 [88] như hình 1.8.

Hình 1. 8. Đẳng nhiệt hút ẩm của thực phẩm

Biểu đồ 1.8 thể hiện độ trễ nhiệt động của quá trình hấp thu (hút ẩm) và khử

nước (nhả ẩm), các quá trình này làm thay đổi đặc tính vật lý của thực phẩm trong

quá trình thêm hoặc loại nước. Qua biểu đồ ta cũng thấy ở thực phẩm bất kỳ, quá

trình nhả ẩm cũng chứa nhiều nước hơn hút ẩm. Độ ẩm và hoạt độ nước của sản phẩm

có quan hệ chặt chẽ với nhau và có ý nghĩa rất lớn trong công nghệ bảo quản. Đối

với sản phẩm dạng khô, có độ ẩm thấp, có thể hút ẩm trở lại và làm thay đổi aw, ngược

lại sản phẩm có độ ẩm cao với tác động của nhiệt độ và thời gian có thể khử nước tạo

ra sản phẩm có hoạt độ nước cao hơn là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển.

Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt độ nước tới sự phát triển của A. flavus và sinh

AF trong ngô có độ ẩm cao sau thu hoạch, ngô được điều chỉnh về aw 0,92 và 0,95

bằng cách tính toán để thêm lượng nước khác nhau rồi để cân bằng ở 4 oC qua đêm,

sau đó gây nhiễm 104 bào tử A. flavus/g rồi để ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, ở

điều kiện aw 0,95 A. flavus phát triển gấp 10 lần so với aw 0,92 [102]. 210 mẫu lạc

nhân thu được tại 5 tỉnh của Perak có hoạt độ nước trong khoảng 0,72-0,75 phát hiện

nhiễm A. flavus trong khoảng 1,0 × 102 đến 1,1 × 105 CFU/g [70].

Nhiệt động hấp thu ẩm là công cụ quan trọng cho các nhà khoa học trong việc

dự đoán độ ổn định của thực phẩm. Hầu hết các thực phẩm đều có hoạt độ nước tới

hạn, dưới ngưỡng đó mức độ giảm chất lượng không đáng kể [88] do vi sinh vật

không thể phát triển được. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của aw đến độ ổn định của thực

phẩm như hình 1.9.

Hình 1. 9. Hoạt độ nước và sự ổn định của thực phẩm (nguồn [88])

Hình 1.9 cho thấy vùng liên kết ion có aw dao động từ 0÷0,25 là vùng tuyệt

đối an toàn, các emzym và các phản ứng đều không xảy ra, vi sinh vật không thể tồn

tại. Khi aw dao động từ 0,3÷0,8 ở vùng liên kết đồng hóa trị, một số enzym bắt đầu

hoạt động, các phản ứng ôxy hóa lipit, hydrô hóa, các phản ứng enzym bắt đầu xảy

ra, tại aw ≥ 0,6 độ ẩm của sản phẩm tăng lên. Ở cuối vùng liên kết đồng hóa trị có sự

xuất hiện của các vi sinh vật như nấm men, nấm mốc, vi khuẩn. Tốc độ phát triển của

chúng đạt cực đạt khi aw dao động từ 0,8÷1 và gây hại nghiêm trọng cho sản phẩm.

Đường cân bằng giữa aw và độ ẩm trong thực phẩm thể hiện như hình 1.11.

Hình 1. 10. Cân bằng hoạt độ nước và hàm lượng nước (nguồn [52])

Như vậy hoạt độ nước và độ ẩm có mối quan hệ chặt chẽ, người ta có thể ước

tính hoạt độ nước thông qua độ ẩm dựa vào đường đẳng nhiệt hấp thu.

1.4.1.2. Ảnh hưởng của độ ẩm

Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sự sinh AF trong lúa mạch được thực

hiện bằng cách lấy từng 50 g lúa mạch đã được tiệt trùng bề mặt cho vào bình 4-oz

và thêm 1 mL bào tử A. parasiticus vào mỗi bình, thêm nước cất vừa đủ theo lý thuyết

để tăng độ ẩm của mẫu ở các mức khác nhau: 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31 và 37 %.

Sự cân bằng của độ ẩm được điều chỉnh bằng cách lắc lọ trong 10 phút. Các lọ này

được cho vào túi nhựa (7×9 inch) có chứa giấy lọc được làm ẩm. Túi được đóng lại

và chuyển vào hộp giữ ở 25 oC, để đến 50 ngày. Không phát hiện sinh AF ở độ ẩm

13,5 % trở xuống, có phát hiện vết ở độ ẩm 16,5 %. Hàm lượng AF cao nhất phát

hiện trong khoảng độ ẩm 28 - 31 % [71].

Nghiên cứu ảnh hưởng của công nghệ sau thu hoạch tới sự phát triển và sinh

AF trên lạc của A. flavus đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng độ ẩm của hạt lạc (10, 12,

14, 16 %). Kết quả sau 10 tháng bảo quản cho thấy các mẫu lạc có độ ẩm 16 % có tỉ

lệ nhiễm nấm cao nhất, thấp nhất ở độ ẩm 10 % [13].

Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến tình trạng nhiễm AF, trên ngô nguyên hạt

và hạt bị vỡ có độ ẩm ban đầu 10,5 và 13,5 % được cấy chủng A. flavus và A.

parasiticus tỉ lệ (50:50), bảo quản trong 4 tuần rồi xác định tổng số nấm mốc và hàm

lượng AF. Kết quả cho thấy ngô có độ ẩm 10,5 % ở độ ẩm tương đối 70 %, nấm mốc

không phát triển ở cả ngô hạt nguyên và ngô hạt vỡ. Các mẫu ngô có độ ẩm ban đầu

13,5 %, độ ẩm tương đối 70 % phát hiện nấm mốc là 3 CFU/10 g sau tuần đầu tiên

và ngô hạt vỡ nhiễm AFB1 cao hơn ngô hạt nguyên (34,0 > 12,0 ng/g). Từ đó nghiên

cứu đề xuất ngô hạt có thể bảo quản trong thời gian dài, ngăn được nấm mốc phát

triển và sinh AF, khi làm khô đến độ ẩm thấp hơn 11 % ở điều kiện môi trường: 25 

3 oC, độ ẩm tương đối 70 - 75 % [65].

Theo chuyên khảo về sự hình thành AF trong lạc thì lạc tích trữ an toàn ở độ ẩm

tương đối cân bằng 70 %, ở điều kiện này nấm mốc ít phát triển. Sự phát triển của A.

flavus hạn chế ở độ ẩm tương đối 80 % [120]. Việt Nam là nước có khí hậu nóng ẩm,

tại khu vực trồng lạc nhiều của Việt Nam như miền Bắc và miền Trung [11], độ ẩm

trung bình các tháng theo năm qua thống kê cho thấy các vùng này có độ ẩm trung

bình của không khí nhìn chung > 80 % từ tháng 1 - 4, tháng 7 - 12 trong năm, còn

các tháng 5, 6 và 12 có độ ẩm trung bình của không khí < 80 % [19], hình 1.11.

Hình 1. 11. Độ ẩm không khí trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 (nguồn [19])

Như vậy hoạt độ nước và độ ẩm không chỉ đóng vai trò quan trọng trong việc

xác định mức độ hoạt động của enzym và hàm lượng vitamin trong thực phẩm, nguyên

nhân chính tác động tới màu sắc, mùi vị. Muốn kéo dài thời gian bảo quản của các

sản phẩm, người ta thường kiểm soát độ ẩm ở mức an toàn để nhằm hạn chế các ảnh

hưởng xấu đến chất lượng của sản phẩm.

1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nấm mốc có thể phát triển và sinh độc tố ở nhiệt độ tối ưu thông thường trong

khoảng 20 đến 30 oC [99].

Aflatoxin có thể được sinh ra trong mọi điều kiện môi trường nhưng tỉ lệ cao

nhất là ở khu vực địa lý nóng ẩm. Aflatoxin có thể được phát hiện trong đất ở khu

vực có nhiệt độ ấm nhiều hơn khu vực nhiệt đới hoặc khu vực nhiệt độ mát. Aflatoxin

hiếm có ở nhiệt độ trên 45 oC, trong lạc aflatoxin thường phát hiện trong điều kiện

nhiệt độ môi trường dưới 35 oC [54].

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của các

chủng Aspergillus kết hợp với hạt kê tích trữ ở Sokoto xác định sự phát triển của các

oC, 35 oC và 40 oC. Kích thước phát triển của khuẩn lạc được đo hàng ngày và giá trị

chủng Aspergillus trong đĩa môi trường đặt trong tủ ấm ở các điều kiện nhiệt độ 30

trung bình của 3 đĩa lặp được coi như tỉ lệ phát triển của mỗi chủng nấm mốc. Nhìn

chung các chủng phát triển cao ở điều kiện nhiệt độ 30 oC và 35 oC [75].

Thí nghiệm sự sinh aflatoxin của các chủng A. flavus và A. paraciticus theo thời

gian trên lạc tiệt trùng nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (20, 25, 30, 35,

oC, 20 oC , nhiệt độ 45 oC ức chế sự phát triển của A. flavus trong lạc và 50 oC ngăn

40, 45 và 50 oC). Kết quả cho thấy A. flavus phát triển tối ưu ở 30 oC, sau đó đến 25

A. flavus phát triển trong 24 giờ. A. parasiticus sinh AFB1 tối đa ở 30 đến 35 oC và

AFG1 tối đa ở 25 đến 30 oC [119]. Nghiên cứu sự hình thành bào tử A. flavus trên

môi trường làm từ cuống ngô và môi trường CZA ở điều kiện nhiệt độ khác nhau cho

thấy A. flavus phát triển tối ưu trên các môi trường này ở các nhiệt độ tương ứng là

20 - 25 oC và 30 - 35 oC [103].

Tại khu vực trồng lạc nhiều của Việt Nam, miền Bắc và miền Trung [11], nhiệt

độ trung bình các tháng theo năm qua thống kê từ năm 2012 đến 2017 cho thấy các

vùng này có nhiệt độ trung bình trong khoảng 25-30 oC diễn ra từ tháng 4 - 10, các

tháng còn lại trong năm có nhiệt độ thấp hơn 25 oC [19], hình 1.12.

Hình 1. 12. Nhiệt độ trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 (nguồn [19])

Qua các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cho thấy A. flavus phát

triển và sinh aflatoxin ở nhiệt độ < 45 oC, ở nhiệt độ từ 45 oC có thể ức chế sự phát

triển và sinh aflatoxin của A. flavus. Các chủng này có thể phát triển tối ưu ở khoảng

nhiệt độ 20 - 35 oC tùy theo môi trường cơ chất.

Qua các kết quả nghiên cứu 1.4.1 và 1.4.2 ta thấy cần tìm ra độ ẩm lạc nhân mà

có khả năng ức chế sự phát triển và sinh aflatoxin của A. flavus. Cần tìm ra nhiệt độ

tối ưu mà A. flavus phát triển và sinh độc tố để có thể phòng tránh. Cần tìm ra mối

quan hệ giữa mức nhiễm Aflatoxin với độ ẩm của lạc, nhiệt độ và mức nhiễm A. flavus

theo thời gian.

Miền Bắc và miền Trung Việt Nam có điều kiện khí hậu thích hợp cho nấm mốc

phát triển và sinh Aflatoxin.

1.4.3. Ảnh hưởng của nấm mốc đến chất lượng lạc trong quá trình bảo

quản

Kết quả khảo sát mức độ nhiễm A. flavus và aflatoxin trong lạc tại Indonesia

[98] cho thấy lạc nhiễm A. flavus cao nhất ở những hộ kinh doanh và bán lẻ lạc (chiếm

tỉ lệ 100 %), sau đó đến các hộ thu mua lạc (85 %) và hộ nông dân (84,6 %). Mức

nhiễm aflatoxin B1 trên 15 µg/kg cao nhất ở các hộ kinh doanh (80,0 %), sau đó đến

các hộ bán lẻ (75,6 %), hộ nông dân (38,5 %) và hộ thu mua (30 %).

Giống Aspergillus có khoảng 180 loài. Chi Flavi được chia thành hai nhóm

loài, một nhóm gồm các loài A. flavus, A. parasiticus và A. nomius gây ra những vấn

đề nghiêm trọng cho các mặt hàng nông nghiệp; một nhóm khác gồm các loài không

có gen sinh độc tố aflatoxin như A. oryzae, A. sojae và A. tamarii dùng trong sản xuất

các sản phẩm lên men trong thực phẩm của các nước châu Á. Các loài A. parasiticus

và A. nomius sinh cả aflatoxin B và G nhưng không phát hiện sản phẩm đồng hóa thứ

cấp là Cyclopiazonic acid; A. flavus được phát hiện sinh aflatoxin B1 và B2 và

Cyclopiazonic acid [101].

Nghiên cứu tỉ lệ nhiễm Aspergillus flavus và aflatoxin nhiễm trong lạc tại các

tỉnh khác nhau của Ấn độ cho thấy không có sự tương quan giữa nhiễm A. flavus và

nhiễm aflatoxin trong hạt lạc. Mẫu lấy tại tỉnh Telangana, ở Nizambad có mức nhiễm

A. flavus 90,7 % có hàm lượng aflatoxin ở mức thấp (4,9 µg/kg), ở Mahaboobnagar

nhiễm A. flavus 42 % có hàm lượng aflatoxin ở mức 11,5 µg/kg [78].

Như vậy, nấm sinh độc tố aflatoxin trên lạc chủ yếu là Aspergillus flavus. Tuy

nhiên mức độ nhiễm aflatoxin còn tùy thuộc vào chủng A. flavus đã nhiễm trên lạc.

1.4.4. Ảnh hưởng của tinh dầu tới sự phát triển và sinh aflatoxin của

Aspergillus flavus

Trong tự nhiên tinh dầu đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật. Tinh dầu

có chứa các chất đồng hóa thứ cấp có thể ức chế, làm chậm sự phát triển của vi khuẩn,

nấm men và nấm mốc. Các hoạt chất của tinh dầu tác động đến màng tế bào, nguyên

sinh chất và thậm chí làm biến dạng hình thái tế bào [58] do đặc tính kỵ nước của tinh

dầu là nguyên nhân phá vỡ cấu trúc vi khuẩn dẫn đến tăng tính thấm do không thể

tách tinh dầu ta khỏi màng tế bào vi khuẩn. Khả năng chống thấm của màng tế bào

cần thiết đối với nhiều chức năng của tế bào bao gồm duy trì trạng thái năng lượng

của tế bào, các quá trình chuyển hóa năng lượng, vận chuyển và chuyển hóa chất tan.

Tinh dầu làm xuống cấp thành tế bào, làm hỏng màng tế bào chất, đông tụ tế bào chất,

làm hỏng các màng protein, tăng tính thẩm thấu dẫn đến rò rỉ làm giảm lượng ATP

trong tế bào do giảm tổng hợp ATP và tăng sự thủy phân [58]. Cơ chế tác động của

tinh dầu tới tế bào vi sinh vật như mô tả trong hình 1.13.

Hình 1. 13. Cơ chế tác động của tinh dầu lên tế bào vi sinh vật (nguồn [58])

Như vậy với cơ chế tác động của tinh dầu tới tế bào vi sinh vật mở ra một hướng

mới trong bảo quản thực phẩm từ nguồn nguyên liệu tự nhiên không ảnh hưởng tới

sức khỏe con người và có khả năng tăng tính chất cảm quan đối với một số sản phẩm.

Quế là cây nhiệt đới được trồng rộng rãi trên các vùng núi khắp cả nước Việt

Nam. Quế được dùng trong thực phẩm, y dược, sản xuất công nghiệp, làm gỗ và củi.

Các cây này không chỉ có tác dụng phủ xanh đất rừng để bảo vệ môi trường mà còn

được đánh giá mang lại hiệu quả kinh tế cao [27, 29]. Nghiên cứu khả năng ức chế

sự phát triển của nấm sinh aflatoxin ở quy mô phòng thí nghiệm cho thấy: tinh dầu

quế (mua từ Hong Huad Co. Ltd, Bangkok, Thailand) có thể ức chế tối đa sự phát

triển của Aspergillus flavus IMI 242684 trên môi trường PDA ở hàm lượng 50 %

(v/v) [48], tinh dầu quế ( mua từ Sigma Aldrich, USA) ức chế sự phát triển của sợi

nấm Aspergillus parasiticus (phân lập từ lạc tại Georgia - USA) trên môi trường PDA

ở hàm lượng 1000 ppm (0,1 %) [84].

Ít nhất 46 hợp chất được phát hiện trong tinh dầu quế [100]. Tinh dầu quế chiết

bằng các phương pháp khác nhau như chưng cất hơi nước và chiết Soxhlet bằng các

dung môi khác nhau thu được các hoạt chất với hàm lượng khác nhau nhưng nhiều

nhất vẫn là Trans-cinnamaldehyde (68,47 - 86,67 %), sau đó đến 2H-1-Benzopyran-

2-one (6,51 - 10,59 %); 1,2-Napthalenedione (0 - 9,03 %); Benzaldehyde (0 - 2,76

%); Borneol (0 - 1,03 %); α-Calacorene 3-methyl-4-undecene (0 - 1,13 %); Ethanone

(0 - 1,11 %) và một số hoạt chất khác (3-cyclohexene-1 methanol, Bicyclohexane-2-

ol, p-menth-1-en-8-ol, 3-cyclohenene-1-ol, 13-cyclohenene-1-methanol, …) [97].

Thành phần các chất bay hơi chiết xuất trong lá của cây quế (Cinnamomum

zeylanicum Blum) của Sri Lanka tìm thấy nhiều nhất là Eugenol (74,9 %), sau đó đến

β-caryophyllene (4,1 %), Benzyl benzoate (3,0 %), Linalool (2,5 %), Eugenyl acetate

(2,1 %) và Cinnayl acetate (1,8 %) [51].

Một số tinh dầu có khả năng kháng Aspergillus flavus như: tinh dầu xả và đinh

hương có thể ức chế sự phát triển sợi của A. flavus khi thêm 3 µL dầu vào đĩa petri;

tinh dầu cây chè, tinh dầu cây quảng hoắc hương, tinh dầu hạt thìa là đen cũng có tác

dụng kháng A. flavus; trans-cinnamaldehyde trong tinh dầu quế xâm nhập vào chu

chất của tế bào và phá vỡ chức năng của tế bào [79], tinh dầu quế cũng ức chế sự phát

triển của các loài Aspergillus, ngoài ra quế được sử dụng trong dược phẩm và được

thừa nhận là an toàn (GRAS) [127].

Cây hồi là một cây gia vị quan trọng ở Việt Nam, cây hồi được trồng nhiều ở

Lạng Sơn, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Cao Bằng và Quảng Ninh. Lạng Sơn là vùng trồng

hồi quan trọng nhất với tổng diện tích trồng trên 9.000 ha. Nhà nước có kế hoạch

trồng hồi lên đến 20.000 ha. Tinh dầu hồi có mùi đặc trưng của hoa hồi và có màu từ

trong suốt đến vàng xanh. Hàm lượng anethole trong dầu tinh khiết lên đến 85 - 90

%, các hợp chất khác tìm thấy trong tinh dầu bao gồm: methyl chavicol, α-pinene,

limonene và phellandrene [34]. Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển của nấm

sinh độc tố A. flavus và A. parasiticus quy mô phòng thí nhiệm cho thấy tinh dầu hồi

có thể ức chế sự phát triển và sinh độc tố của hai loài nấm mốc này hoàn toàn ở hàm

lượng 200 ppm (0,02 %) [115].

Tại Việt Nam sản phẩm lạc rang húng lìu là sản phẩm truyền thống phổ biến

trên thị trường, nguyên liệu chế biến sản phẩm này bao gồm cả gia vị sử dụng có

nguồn gốc từ hồi và quế, sản phẩm có hương thơm đặc trưng của hồi và quế làm

hương vị thêm phần hấp dẫn. Các nghiên cứu chỉ ra rằng tinh dầu nói chung có tác

dụng ức chế sự phát triển và phá vỡ chức năng tế bào của vi sinh vật nói chung và A.

flavus nói riêng. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào chỉ ra mức độ ức chế sự phát triển

và sinh độc tố của A. flavus trên cơ chất lạc của tinh dầu hồi và quế.

Lạc rang là sản phẩm dân dã được nhiều người ưa chuộng với hương vị hồi và

quế, tinh dầu hồi và quế có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm mốc nói chung và

A. flavus nói riêng, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về khả năng ức chế sự phát

triển và sinh Aflatoxin trên lạc.

1.4.5. Ảnh hưởng của môi trường không khí đến chất lượng lạc trong quá

trình bảo quản

Trong không khí sạch và khô (không chứa hơi nước và những hạt chất rắn và

chất lỏng nào cả) có chứa hàm lượng các chất như sau: 78,08 % Nitơ; 20,95 % Ôxy;

0,93 % Argon; 0,03 % CO2 và một lượng nhỏ các khí khác (Neon, Methan, Kripton,

Hydro, Oxit nitơ,…) [10]. Ảnh hưởng của các thành phần khí trong không khí đến

chất lượng thực phẩm trong quá trình bảo quản được phân tích dưới đây.

1.4.5.1. Ảnh hưởng của khí nitơ

Nitơ (N2) là khí trơ, chiếm 78,08 % về thể tích trong không khí và hầu như

không tham gia hấp thụ năng lượng và chuyển thành hợp chất trong khí quyển. Trong

lớp thổ nhưỡng có một số loại vi khuẩn sử dụng nitơ chuyển vào thành phần cơ thể

sống và thải vào khí quyển một lượng không lớn 2-Oxit nitơ (N2O) có mặt trong tầng

đối lưu khoảng 3,5×10-5 % thể tích, khí này sau đó có thể tạo ra Ôxit nitơ (NO) [10].

Vì đặc tính trơ của nitơ nên trong công nghiệp thực phẩm khí này thường được sử

dụng đóng gói có tác dụng chống ôxy hóa, tuy nhiên việc đóng gói khí nitơ không có

tác dụng kìm hãm đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật [113].

1.4.5.2. Ảnh hưởng của khí ôxy

Hạt lạc sau thu hoạch vẫn tiếp tục sự sống và cần năng lượng cho các tế bào

sống thông qua sự hô hấp. Sự hô hấp có thể là hiếu khí (có ôxy) hoặc yếm khí (không

có ôxy). Hô hấp hiếu khí tiêu thụ ôxy sinh CO2 và nước [8]. Giảm hô hấp có thể giảm

thay đổi chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản bằng cách bảo quản nhiệt độ thấp

và hàm lượng O2 thấp [76].

Lạc có hàm lượng chất béo cao nên hiện tượng ôxy hóa chất béo thường xuyên

xảy ra ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan (màu sắc, mùi vị), hình thành các thành

phần không có lợi cho sức khỏe và giảm thời hạn bảo quản của lạc. Quá trình ôxy

hóa chất béo xảy ra một chuỗi các phản ứng, liên quan đến ba giai đoạn: 1) ban đầu:

tách nguyên tử hydrô từ một nhóm methylene tạo thành gốc alkyl (R⚫); 2) tiếp theo:

gốc alkyl tác dụng với ôxy tạo thành gốc peroxy (ROO⚫ ) có khả năng phản ứng với

các acid béo chưa no hình thành hydroperoxide (ROOH); 3) bước cuối cùng: hình

thành các gốc không tự do bằng sự tương tác giữa gốc R⚫ và ROO⚫ .(trong đó: R⚫ -

gốc acid béo, ROOH - hydroperoxide acid béo; ROO⚫ - gốc peroxy). Các quá trình

phản ứng này làm thay đổi một chút chất béo và nhanh chóng thay đổi mùi [55].

Nghiên cứu nhu cầu ôxy của loài Aspergillus cho thấy Aspergillus flavus không

phát triển, chậm sinh bào tử hoặc không có bào tử ở điều kiện môi trường không có

ôxy hoặc nồng độ ôxy thấp. A. flavus phát triển ở môi trường ôxy từ 0,1 % [77].

Qua đó ta thấy, sự có mặt của ôxy trong môi trường bảo quản lạc không chỉ

ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan mà còn là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát

triển và sinh độc tố.

1.4.5.3. Ảnh hưởng của khí CO2

CO2 là chất khí không màu, không mùi và không độc, CO2 có khả năng ngăn

hoạt động vi sinh vật, ngăn quá trình ôxy hóa chất béo, có tính khuếch tán, thấm qua

bao bì và tan trong thực phẩm. CO2 tan trong thực phẩm tốt hơn so với ôxy [56].

Nghiên cứu ảnh hưởng của khí CO2 đối với sự phát triển của A. flavus trong ngô

sau thu hoạch được thực hiện ở bốn chế độ: 1) không khí thường (21 % O2; 0,03 %

CO2; 79 % N2); 2) 25 % CO2; 3) 30 % CO2 và 4) 75 % CO2. Các mẫu này được kiểm

tra mật độ A. flavus sau 7, 14 và 21 ngày. Kết quả cho thấy sự phát triển của A. flavus

giảm đáng kể khi hàm lượng CO2 tăng so với không khí thư, tương ứng là 40 %, 70

% và 90 % [102].

1.4.5.4. Ảnh hưởng của Argon và một số khí trơ khác

Argon (cũng như Neon và Kripton) hầu như bị động, các chất khí nặng nên

không có trong tầng nhiệt quyển. Heli được tạo thành khi có phản ứng phóng xạ [10].

Do tác động của môi trường khí đối với chất lượng sản phẩm trong quá trình

bảo quản, điều biến khí cũng là một giải pháp cần được nghiên cứu và đưa ra khuyến

nghị cho người dân trong bảo quản tránh nhiễm aflatoxin trong lạc.

1.5. Các biện pháp kiểm soát aflatoxin nhiễm trong lạc và nông

sản khô sau thu hoạch trên thế giới và Việt Nam

Mặc dù với nỗ lực của các nhà nông học để giảm thiểu nguy cơ sinh aflatoxin

trong quá trình trước thu hoạch nhưng các sản phẩm sau thu hoạch vẫn có nguy cơ

nhiễm aflatoxin. Nghiên cứu các giải pháp bảo quản lạc sau thu hoạch nhằm giảm

nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc là cần thiết.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng điều kiện bảo quản sau thu hoạch tác

động đáng kể đến sự xuất hiện aflatoxin trong lạc [42]. Lạc sau khi thu hoạch đến tay

người tiêu dùng, nhà sản xuất trong vòng khoảng 2 - 6 tháng (thu hoạch, làm khô, lưu

kho, vận chuyển, phân phối, sơ chế - bóc vỏ) nên cần được bảo quản tốt trong khoảng

thời gian này. Các biện pháp bảo quản lạc và nông sản khô bao gồm: kiểm soát chất

lượng lạc sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản; đóng gói điều biến khí; và bảo

quản bằng sử dụng các chất hóa học có tác dụng phòng chống nấm mốc, giảm độc tố

trong sản phẩm.

Nghiên cứu về thực trạng sản xuất lạc ở các tỉnh trồng lạc chính [11] cho thấy:

Khí hậu nóng ẩm trong vụ Xuân của miền Bắc rất thuận lợi cho các đối tượng sâu

bệnh phát triển và tấn công lạc. Phương thức thu hoạch ở miền Bắc thường là thủ

công (nhổ và bứt quả bằng tay hoặc đập). Sau khi vặt xong lạc được phơi khô dưới

nắng, thời gian phơi khô phụ thuộc vào điều kiện thời tiết tại thời điểm thu hoạch;

Hầu hết các gia đình miền Trung cũng thu hoạch thủ công, quá trình làm khô lạc được

thực hiện bằng phơi cả cây dưới nắng, sau khi khô lạc được bứt và bán ra thị trường.

1.5.1. Kiểm soát chất lượng sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản

Nghiên cứu về thực trạng bảo quản lạc ở các tỉnh trồng lạc chính cho thấy: Tại

miền Bắc phương thức bảo quản của nông dân thường phụ thuộc vào mục đích sử

dụng của từng hộ gia đình, đa số nông dân (chiếm 95,0 %) có thời gian bảo quản

ngắn, vì sản phẩm sẽ được bán ngay sau thu hoạch để lấy lại vốn tái sản xuất. Có

khoảng 10,0 % số hộ nông dân bảo quản dài vì mục đích kinh doanh, chờ lên giá hoặc

để bán giống cho vụ sau. Miền Trung có khoảng 3,0 % số hộ nông dân bảo quản dài

vì mục đích kinh doanh, chờ lên giá hoặc để bán giống cho vụ sau [11].

Chất lượng lạc có thể biến đổi trong quá trình bảo quản làm giảm chất lượng và

giá trị sử dụng của lạc. Sự biến đổi chất lượng có thể do yếu tố bên ngoài hoặc quá

trình nội tại, các quá trình biến đổi bao gồm: vật lý, hóa học và vi sinh vật [41].

Quá trình vật lý: Đối với hạt lạc tươi, sự bốc hơi nước làm thay đổi trọng lượng

và trạng thái vật lý của hạt. Đối với hạt khô, việc hấp thu nước làm thay đổi trạng thái

giòn của hạt.

Hạt lạc chưa phát triển hoàn chỉnh, sau khi làm khô sẽ bị nhăn lại (hạt nhăn/lép).

Hạt lạc có thể bị biến màu sẫm hơn màu vàng nhạt hoặc có nhiều đốm màu vàng nhạt;

và/hoặc lớp vỏ bị biến màu thành nâu sẫm, xám sẫm, xanh sẫm hoặc đen [23].

Hạt lạc bị sứt, vỡ trong quá trình thu hoạch là một trong những nguyên nhân

quan trọng hình thành aflatoxin do nhiễm A. flavus [35].

Quá trình sinh hóa: Các thành phần hóa học của lạc có thể bị biến đổi trong quá

trình bảo quản do phản ứng của các thành phần chất trong lạc với các yếu tố bên

ngoài, ví dụ như ôxy. Sự ôi khét diễn ra do phản ứng thủy phân/ phân giải lipit và

phản ứng ôxy hóa.

Trong quá trình bảo quản tế bào sống tiếp tục hô hấp. Ôxy trong không khí cắt

mạch cacbonhydrat trong thực vật thành carbon dioxide và nước, phản ứng này sinh

năng lượng dạng nhiệt, tiêu hao tinh bột là chủ yếu. Các chất dinh dưỡng của hạt bị

ôxy hóa sinh năng lượng, một phần năng lượng đó cung cấp cho tế bào để duy trì sự

sống, phần lớn năng lượng còn lại thoát ra môi trường xung quanh. Chất béo trong

lạc bị tiêu hao một phần nhờ phản ứng hô hấp hiếu khí phân hủy chất béo Tripalmictic

((C15H31COO)3C3H5). Sản phẩm cuối cùng của quá trình hô hấp hiếu khí là CO2 và

nước. Sản phẩm cuối cùng của quá trình hô hấp yếm khí là CO2 và rượu. Lượng nhiệt

hô hấp yếm khí thoát ra ít hơn nhiều so với hô hấp hiếu khí [8].

Việc giảm chất béo trong hạt bị giảm chất lượng do hai enzym chính là Lipase

và Lipoxygenase. Lipase có thể tăng do hoạt tính có sẵn trong nguyên liệu hoặc do vi

sinh vật sinh ra và làm tăng acid béo tự do. Lipase trong vi sinh vật thủy phân

triglyceride nhanh chóng. Lipoxygenase ôxy hóa chuỗi acid béo không bão hòa và

este hóa thành Hydroperoxide, chất này sau đó phân hủy thành keton, aldehyt, acid

và các thành phần phân tử thấp hơn. Một số thành phần này là nguyên nhân mất mùi

và vị của hạt tàng trữ. Các thành phần này cũng phản ứng với Protein, Acid amin và

Vitamin làm giảm chất lượng của hạt [31]. Hàm lượng Tocopherol (vitamin E) trong

lạc giảm cùng với sự tăng của peroxide trong quá trình tàng trữ, α-Tocopherol giảm

tới 95 % sau 40 ngày tàng trữ ở 50 oC [74].

Sự biến đổi do vi sinh vật: Sự phát triển của một loại vi sinh vật trong quá trình

tàng trữ thực phẩm phụ thuộc vào các yếu tố quan trọng như: mức nhiễm vi sinh vật

ở giai đoạn bắt đầu tàng trữ; đặc tính hóa lý của thực phẩm như độ ẩm, pH, chất bảo

quản; phương pháp chế biến sử dụng trong sản xuất thực phẩm; và môi trường bên

ngoài của thực phẩm như thành phần khí xung quanh và nhiệt độ tàng trữ [41]. Có

nhiều chủng Aspergillus flavus sinh aflatoxin được phân lập nhiều nhất từ lạc, hạt

bông, sau đó đến gạo và cây cao lương [99]. Aflatoxin ảnh hưởng đến mô thực vật,

với hàm lượng 25 µg/mL có thể ức chế sự này mầm, với hàm lượng 10 µg/mL có thể

tác động và sự tổng hợp chlorophyll làm mất màu hạt [67].

Để đảm bảo phòng tránh nhiễm aflatoxin trong lạc, trên thế giới đã có các quy

định để kiểm soát chất lượng như sau:

- Kiểm soát độ ẩm: Độ ẩm là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và

sinh aflatoxin của A. flavus trên cơ chất tự nhiên như lạc. Theo quy phạm thực

hành để ngăn và giảm nhiễm aflatoxin trong lạc của Codex, trong quá trình lưu

kho và vận chuyển phải kiểm soát hoạt độ nước nhỏ hơn 0,7 và độ ẩm tương đối

70 % [38]. Codex cũng quy định độ ẩm của lạc tối đa là 10 % đối với lạc củ và

9,0 % đối với lạc nhân [39]. Tiêu chuẩn Việt Nam quy định độ ẩm lạc tối đa là

10 % đối với lạc củ và 9,0 % đối với lạc nhân [23]. Nghiên cứu phòng chống

nhiễm A. flavus và aflatoxin trong lạc khuyến nghị lạc nên được làm khô ngay

sau khi thu hoạch đến độ ẩm hạt dưới 12 % [12].

- Kiểm soát nhiệt độ: Bảo quản lạc ở nhiệt độ thấp cũng là phương pháp hiệu quả.

Theo quy phạm thực hành ngăn và giảm nhiễm AF trong lạc của Codex, nhiệt

độ môi trường trong quá trình lưu kho và vận chuyển phải được kiểm soát trong

khoảng 0 - 10 oC để giảm thiểu sự hư hỏng do nấm mốc phát triển [38]. Nghiên

cứu trên lạc có độ ẩm 12 %, trong kho mát có điều hòa ở nhiệt độ 18 - 22 oC bảo

quản được 10 tháng, trong kho thường chỉ bảo quản được 4 tháng [12].

- Sử dụng bao bì phù hợp: Theo quy phạm thực hành để ngăn và giảm nhiễm

aflatoxin trong lạc của Codex, lạc được đóng gói trong bao tải đay, thùng carton

hoặc bao PE. Tất cả các bao bì/ thùng carton phải được xác định lô để truy xuất

nguồn gốc của sản phẩm trước khi đổ ra để kiểm soát điều kiện lưu trữ và vận

chuyển [38]. Nghiên cứu bảo quản lạc trong các bao bì khác nhau cho thấy, lạc

trong bao dứa PP và bao PE nhiễm aflatoxin tổng số nhiều hơn trong bao đay

tương ứng là 5,6 % và 13,4 %. Bao đay dễ hút ẩm nhưng cho phép thông gió tốt

hơn bao dứa PP và bao PE [92]. Lạc có độ ẩm 12 % bảo quản trong bao bì hai

lớp sau 10 tháng hàm lượng aflatoxin bị nhiễm trong hạt cao hơn bao dứa 1 lớp

và dùng cót [12]. Lạc nhân có độ ẩm ban đầu 7 % bảo quản trong các bao bì

khác nhau: bao đay, bao polypropylen (PP), bao hai lớp gồm bao đay và bao

polyethylen trong 6 tháng ở điều kiện khí quyển. Kết quả mức nhiễm aflatoxin

cao nhất ở bao đay (> 30 ppb), sau đó đến bao PP (23 ppb), bao hai lớp (17-19

ppb) [116]. Các kết quả này cho thấy cùng loại bao bì nhưng các nghiên cứu

khác nhau có kết quả khác nhau, do đó ngoài tính chất của bao bì còn ảnh hưởng

của độ ẩm của lạc, điều kiện môi trường không khí bên ngoài.

1.5.2. Đóng gói điều biến khí quyển

Đóng gói điều biến khí (MAP) là đóng gói thực phẩm trong bao bì kín mà khí

quyển bên trong được thay thế hoặc thay đổi để tăng thời hạn sử dụng và duy trì chất

lượng thực phẩm. Điều biến khí quyển (MA) có thể đạt được bằng cách chủ động

hoặc bị động, trong khi Kiểm soát khí quyển (CA) thành phần khí được điều khiển

nghiêm ngặt trong suốt quá trình. Điều biến khí chủ động liên quan đến thay thế kiểm

soát hỗn hợp khí mong muốn. Điều biến khí bị động xảy ra là kết quả của quá trình

hô hấp và/ hoặc quá trình đồng hóa của vi sinh vật liên quan đến thực phẩm [69].

Điều biến khí quyển trong môi trường đóng gói là biện pháp giảm lượng ôxy

trong môi trường không khí, từ đó giảm quá trình ôxy hóa chất béo có trong lạc và

giảm khả năng hô hấp của nấm mốc để hạn chế quá trình phát triển và sinh độc tố.

Tác giả Philippe Villers đã chỉ ra rằng việc đóng gói kín với hàm lượng ôxy thấp 3 %

và nồng độ khí CO2 lên đến 90 % hoặc nhiều hơn ngăn được nhiễm côn trùng và

aflatoxin [105]. Nghiên cứu kiểm soát nồng độ hỗn hợp khí O2 và CO2 ở quy mô

phòng thí nghiệm cho thấy hỗn hợp khí O2 và CO2 (3,0 % : 40 %) đã ức chế mạnh

nấm mốc vàng sau 7 ngày và ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc vàng trên

lạc sau 30 ngày. Ở nồng độ O2 lớn hơn 3,0 % ức chế sự phát triển của nấm mốc vàng

yếu hơn nhưng cũng ức chế được hoàn toàn sau 30 ngày [11].

Có ba khí chính dùng trong MAP là O2, CO2 và N2. Ngoài ra argon, CO và SO2

cũng được sử dụng trong MA. Hỗn hợp khí dùng trong MAP của các thực phẩm khác

nhau dựa vào bản chất và cơ chế hư hỏng của thực phẩm. Khi thực phẩm hư hỏng do

vi sinh vật, thành phần khí phổ biến là 30 - 60 % CO2 và 40 - 70 % N2. Đối với sản

phẩm nhạy cảm với ôxy do sự ôxy hóa làm ôi khét, thường thay thế 100 % N2 hoặc

N2/CO2. Đối với sản phẩm hô hấp, tránh vi khuẩn kỵ khí bằng cách tránh CO2 quá

cao hoặc O2 quá thấp [69].

Có hai kỹ thuật khác nhau để thay thế không khí: Xả khí và Bù chân không.

Kỹ thuật xả khí là thực hiện thay thế khí bên trong bao bì được bằng một dòng

khí liên tục, dòng khí này đuổi khí trong bao bì ra trước khi hàn kín. Phương pháp

này đuổi khí không hiệu quả nên nồng độ ôxy còn dư trong bao bì thường là 2-5%

O2. Vì vậy, phương pháp này không phù hợp với sản phẩm nhạy cảm với ôxy. Ưu

điểm lớn nhất của kỹ thuật xả khí là công suất của máy cao do quá trình vận hành đơn

giản và liên tục.

Kỹ thuật bù chân không được thực hiện qua hai giai đoạn: Giai đoạn hút chân

không (rút khí ra khỏi bao bì); Giai đoạn xả khí (không khí điều biến được xả vào

bao bì). Giai đoạn rút khí ra khỏi bao bì làm lượng ôxy còn lại trong bao bì thấp hơn

kỹ thuật xả khí. Do đó kỹ thuật này phù hợp để bảo quản các sản phẩm nhạy cảm với

ôxy, nhưng kỹ thuật bù khí diễn ra hai giai đoạn làm cho tốc độ đóng gói chậm hơn.

Đóng gói hút chân không (VP) được coi như một dạng đặc biệt của MAP, chỉ

qua giai đoạn thứ nhất, khoảng trống trong bao bì bị thay thế và không kiểm soát

lượng khí. VP được vận hành ở áp suất 40 kPa trong khi đóng gói điều biến khí (MAP)

hoặc đóng gói kiểm soát khí (CAP) hầu hết ở áp suất 101 kPa [76]. 1 kPa tương đương

7,5 mmHg, như vậy 40 kPa = 300 mmHg.

Côn trùng gây hại cũng là một trong những nguyên nhân tạo điều kiện thuận lợi

cho nấm mốc phát triển. Nghiên cứu của Philips và cộng sự cho thấy môi trường áp

suất thấp có thể kiểm soát côn trùng trong bảo quản. Trứng của Rhyzopertha dominica

(F.). P.interpunctella, và Tribolium castaneum khi tiếp xúc với áp suất 32,5 mmHg

trong phòng kín ở nhiệt độ 25, 33, 37 và 40 oC trong thời gian từ 30 phút đến 144

giờ dẫn đến tử vong. Tỷ lệ tử vong của các loài côn trùng tiếp xúc với áp suất thấp là

do tác dụng sinh lý với oxy thấp, tại áp suất 32,5 mmHg tương ứng nồng độ oxy thấp

khoảng 0,9 %. Ngoài ra nghiên cứu cũng chỉ ra rằng đối với trứng của sâu và bọ cánh

cứng có thể bị giết chết ở áp suất chân không 200 mmHg [66].

Bao bì sử dụng trong MAP cũng cần xem xét các đặc tính quan trọng như: tính

thấm khí và thấm hơi nước, tính chất cơ lý, khả năng hàn và tính trong [69]. Hiện nay

polyethylene (PE) và polyvinyl chloride (PVC) là các vật liệu polyme được sử dụng

thông dụng nhất [76].

1.5.3. Các loại bao bì dùng trong bảo quản lạc

Bao bì thực phẩm hiện hữu trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước

đây. Từ thời nguyên thủy con người sử dụng lá và vỏ cây để chứa đựng thực phẩm.

Hiện nay bao bì được sử dụng đa dạng về chủng loại và công dụng. Bao bì dùng để

vận chuyển, bảo quản, chống ô nhiễm và chống tái nhiễm. Vật liệu bao bì có thể là

nhựa, màng kim loại, giấy, và sợi dệt. Bao bì đóng vai trò quan trọng trong an toàn

thực phẩm [87]. Trong bảo quản lạc người ta thường dùng các loại bao bì và vật liệu

như nhựa, bao tải dứa, bao đay, và các loại dụng cụ thông dụng khác trong gia đình.

Nhựa là bao bì được sử dụng nhiều nhất trong thực phẩm, nhựa được sử dụng

thay thế các loại bao bì truyền thống do chi phí thấp và năng lượng tiêu thụ để sản

xuất nhựa thấp. Các loại bao bì nhựa như PE, PP, PVC, PS [107] là các loại vật liệu

thông dụng có thể sử dụng đựng lạc bao gồm:

Polyethylene (PE) là sản phẩm trùng hợp của khí ethylene có công thức là

(CH2)n. Tùy theo quá trình sản xuất, có hai loại sản phẩm PE là LDPE và HDPE.

LDPE được tạo thành ở áp suất cao (1000-3000 atm), tạo thành chuỗi nhánh dài

liên kết với nhau yếu bởi lực Van Der Waal nhưng chịu lực mạnh theo chiều dài. Các

chuỗi cạnh nhau có thể trượt qua nhau nên vật liệu này dễ dàng uốn (mềm dẻo). LDPE

có mật độ thấp và chuỗi dài nên các phân tử không thể kết hợp chặt chẽ với nhau, vật

liệu này dễ nóng chảy. LDPE dẻo dai, bán truyền qua (độ trong kém). LDPE bền với

hầu hết hóa chất ở dưới 60 oC, chịu nước ở mức vừa phải, ngăn khí (O2) kém.

HDPE được sản xuất ở nhiệt độ thấp và áp suất khoảng 10 atm. HDPE dùng

làm chai lọ, túi, ống, thìa dĩa nhựa,… HDPE chịu chất béo và dầu tốt hơn LDPE, tuy

nhiên không dễ hàn.

Polypropylene (PP) là đơn hợp có công thức CH2CH-CH3. PP có độ trong và

bóng cao, cứng, chịu nhiệt (điểm mềm 150 oC). Có tính chống xước, chống thủng và

cứng. PP có tính ngăn ẩm tuyệt vời và ngăn khí trung bình. PP có khả năng hàn tốt.

PP được kéo thành sợi rồi dệt thành các loại bao bì gọi là bao tải dứa.

Polyvinyl chloride (PVC) là đơn hợp có công thức CH2CH-Cl. PVC có độ truyền

qua tốt khi tinh khiết, cứng và rắn hơn PE. PVC có độ trơ cao, ngăn ẩm, béo và khí.

Polyamides (nylon) được làm bằng cách cô đặc một diacid (như adipic acid) và

một diamine (như hexanmethylene diamine). Polyamide có độ trong suốt cao, dai,

chống xước, mềm dẻo, điểm chảy và điểm mềm (225 oC), đồng thời khả năng chịu

hóa chất tốt, nhưng khả năng ngăn nước thấp và khả năng thấm khí cao.

Như vậy trong các lọai bao bì trên (PE, PP, PVC và PS), PVC là vật liệu ngăn

ẩm và chống thấm khí tốt nhất.

1.5.4. Bảo quản hoặc giảm nhiễm aflatoxin bằng phương pháp hóa học

Sử dụng hóa chất nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn

nuôi đã được nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam. Nghiên cứu sử dụng 3 %

hydrogen peroxide, 75 % methanol, 5 % dimethylamine hydrochloride hoặc 3 %

perchloric acid có thể giảm hàm lượng aflatoxin xuống dưới mức 20 µg/kg, nhưng

xử lý bằng cách này có thể giảm trọng lượng, protein và lipit. Ngô được xử lý bằng

calcium hydroxide cũng giảm đáng kể hàm lượng aflatoxin. Thức ăn chăn nuôi với

ngô mốc được xử lý bằng calcium hydroxide phục hồi được giá trị dinh dưỡng. Tuy

nhiên theo báo cáo của FAO, cho đến nay không có hóa chất hoặc chất phụ gia nào

được chấp nhận [105]. Nghiên cứu của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau

thu hoạch về khả năng khử aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng khí amoniac ở quy mô

phòng thí nghiệm cho thấy khí amoniac lỏng có tác dụng khử aflatoxin tới 90 % [11].

Trong số nhiều giải pháp bảo quản thực phẩm thì giải pháp ức chế sự phát triển

của vi sinh vật được ứng dụng nhiều nhất. Xu hướng sử dụng các sản phẩm tự nhiên

thân thiện với môi trường, hạn chế sử dụng chất bảo quản tổng hợp trong thực phẩm

đang được xã hội quan tâm. Muối và đường là những sản phẩm tự nhiên có khả năng

ức chế sự phát triển của vi sinh vật nhưng hiện nay người tiêu dùng có xu hướng giảm

nhu cầu tiêu thụ muối và đường. Việc sử dụng tinh dầu mở ra một hướng mới trong

bảo quản thực phẩm. Nhiều thành phần tinh dầu được Cộng đồng châu Âu chấp nhận

dùng làm chất tạo hương trong thực phẩm như: linalool, thymol, eugenol, carvone,

cinnamaldehyde, vanillin, carvacrol, citral và limonene là những chất được xem như

không có tác hại đến sức khỏe người tiêu dùng. Cục Dược và thực phẩm (FDA) của

Hoa Kỳ cũng phân loại những chất trên là những chất được thừa nhận chung là an

toàn (generally recognized as safe - GRAS) [89]. Nghiên cứu ứng dụng tinh dầu xạ

hương để bảo quản cá filet được thực hiện bằng cách dùng trực tiếp 10 mL dung dịch

tinh dầu đã pha loãng theo nồng độ mong muốn (nước: propyleneglycol: tween = 80:

20: 0,02 % v/v) lên cá fillet để 1 ngày trong tủ lạnh (2 - 4 °C) để tinh dầu phân bố

đều, sau đó bảo quản lạnh cho thấy việc sử dụng tinh dầu làm giảm sự ôxy hóa sản

phẩm [124]. Nghiên cứu khả năng chống nấm mốc của tinh dầu xạ hương trên hạt lúa

mạch cho thấy, tinh dầu tiếp xúc trực tiếp với hạt lúa mạch có hiệu quả chống nấm

đặc biệt nhưng ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt, trong khi tinh dầu tiếp xúc

gián tiếp giảm khả năng nhiễm nấm mốc nhưng không ảnh hưởng đến sự nảy mầm

của hạt [111]. Các nghiên cứu khả năng ức chế của tinh dầu tới sự phát triển của vi

sinh vật gây bệnh trong thực phẩm cho thấy tinh dầu quế, bạc hà, sả, gừng và tinh dầu

chanh có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh [5, 94, 95].

Qua tổng hợp các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy việc bảo quản lạc có thể

dựa trên nguyên tắc điều chỉnh độ ẩm của lạc đưa vào bảo quản, nhiệt độ môi trường,

thành phần khí đóng gói, sử dụng tinh dầu nhằm hạn chế được quá trình phát triển

và sinh aflatoxin của nấm mốc trên lạc.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên vật liệu

- Lạc nhân và lạc củ giống L14, giống đang được trồng phổ biến tại các tỉnh miền

Bắc và miền Trung; và lạc rang húng lìu.

- Chủng chuẩn đối chứng: Aspergillus flavus ATCC 204304 được cung cấp từ thư

viện chủng quốc gia Mỹ.

- Tinh dầu hồi và tinh dầu quế được mua của Công ty TNHH chế biến và xuất

khẩu nông lâm sản Lạng Sơn. Tinh dầu quế đựng trong chai thủy tinh màu nâu,

hai lớp nút chai, dung tích 20 mL, đặt trong hộp giấy. Tinh dầu hồi đựng trong

chai thủy tinh màu nâu dung tích 100 mL, hai lớp nút chai, đặt trong hộp giấy.

2.1.2. Hóa chất sử dụng

- Các dung môi dùng cho phân tích bao gồm: acetonitrile, methanol, chloroform

(loại dùng cho phân tích HPLC), được cung cấp bởi Meck.

- Các dung môi và hóa chất khác như: các dung môi methanol, benzen,

chloroform, dichlomethan, n-hexan, acetone; muối natri clorua, amoni acetat

(loại tinh khiết phân tích) được cung cấp bởi Meck.

- Chất chuẩn aflatoxin B1, B2, G1, G2 có độ tinh khiết 99% được cung cấp bởi

Supelco.

- Cột chiết pha rắn SPE-IM được cung cấp bởi Supelco, Mỹ.

- Các hóa chất và dung môi khác sử dụng trong phòng thí nghiệm

2.1.3. Thiết bị sử dụng chính

- Cân phân tích độ chính xác ± 0,1 mg, xuất xứ: Thụy sĩ.

- Cân kỹ thuật độ chính xác ± 0,01 g, xuất xứ: Nhật.

- Tủ sấy Shellab, duy trì nhiệt độ ở 105 ± 2 oC, xuất xứ: Đức.

- Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): AB Sciex Triple Quad 5500 xuất xứ: Mỹ.

Nguồn ion hóa: Electrospray (ESI).

- Cột sắc ký pha đảo C18 Dionex hoặc tương đương: 150 mm  2,5 mm  3,5m.

- Tủ sấy Shellab, duy trì nhiệt độ ở 105 ± 2 oC, xuất xứ: Đức.

- Tủ ấm FOC 225E, có thể duy trì nhiệt độ 20, 25, 30, 35, 30 ± 1 oC, xuất xứ: Ý.

- Kính hiển vi để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ

khuếch đại từ 250 - 1.000 lần), kính hiển vi soi nổi OPTIKA - xuất xứ: Ý.

- Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 CFL - xuất xứ: Đức; kính hiển vi CX32 -

xuất xứ: Nhật bản.

- Máy đếm khuẩn lạc, xuất xứ: Anh.

- Tủ an toàn sinh học cấp 2, TELSTAR Model BIO-II-A, xuất xứ: Tây Ban nha.

- Máy PCR S1000, xuất xứ: Mỹ.

- Máy NanoDropTM1000, xuất xứ: Mỹ.

- Các dụng cụ và thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm.

2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2013 đến năm 2018.

- Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc, mẫu lạc được thu

thập vào năm 2013 tại Nghệ An (Diễn Châu và thành phố Vinh), Thanh Hóa

(Nga Sơn, thành phố Thanh Hóa), Bắc Giang (Lục Nam, thành phố Bắc Giang).

- Chuẩn bị bao bì thí nghiệm tại Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu

hoạch.

- Phân tích và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin

trên lạc của Aspergillus flavus được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ

sinh thực phẩm quốc gia.

Để đạt được các nội dung của đề tài, luận án đã sử dụng các phương pháp nghiên

cứu sau đây:

2.2. Phương pháp lấy mẫu

(4)

* Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu mô tả như sau:

𝛼 2

2 𝑛 = 𝑍1− 𝑝(1−𝑝) 𝑑2

Theo nghiên cứu đánh giá ô nhiễm aflatoxin trong lạc tại 3 xã huyện Tân Kỳ

tỉnh Nghệ An [7], tỉ lệ mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin là 98 %; Độ chính xác tuyệt đối

d= 0,05 và Z = 1,96 với độ tin cậy α = 0,05. Từ công thức (4) ta tính được số mẫu lạc

cần lấy là n = 30.

* Lượng mẫu lấy:

- Trong nghiên cứu mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin: Lạc củ lấy 3

kg/mẫu; Lạc nhân lấy 1 kg/mẫu; Lạc rang húng lìu lấy nguyên túi, lượng tối

thiểu 500 g/mẫu, trường hợp đóng túi nhỏ hơn thì lấy nhiều hơn 1 túi để đảm

bảo ít nhất 500 g/mẫu.

- Trong nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì đối với sự thay đổi độ ẩm của lạc,

nghiên cứu khảo nghiệm các giải pháp bảo quản lạc, lượng mẫu lấy tối thiểu là

25 kg và tổng lượng mẫu đảm bảo đủ cho từng thiết kế thí nghiệm.

* Lấy mẫu vào mùa hè: Mẫu được lấy tại các chợ trên địa bàn các tỉnh Nghệ An

(Diễn Châu, Thành Chương và Thành phố Vinh), Thanh Hóa (Bỉm Sơn, Nga Sơn và

thành phố Thanh Hóa), Bắc Giang (Lục Nam và thành phố Bắc Giang).

Nghiên cứu thực hiện thu thập 90 mẫu/tỉnh bao gồm: 30 mẫu lạc nhân, 30 mẫu

lạc củ và 30 mẫu lạc rang húng lìu.

* Lấy mẫu vào mùa thu: Mẫu được thu thập tại các hộ gia đình và hộ kinh doanh lạc

trên địa bàn của tỉnh được lựa chọn trong 3 tỉnh trên. Nghiên cứu thu thập 30 mẫu

lạc nhân và 30 mẫu lạc củ.

2.3. Phương pháp phân tích hóa lý

2.3.1. Xác định độ ẩm

Độ ẩm của lạc được xác định theo TCVN 2384-1993. Phương pháp sấy đến

khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 ± 2 oC trong 5 h [21].

Chuẩn bị mẫu: Bóc khoảng 20 g lạc củ đã loại tạp chất, xác định riêng khối

lượng hạt (m1) và vỏ (m2) với độ chính xác 0,1 mg, phần vỏ xay nhỏ và đựng trong

bình tam giác có nút kín, phần hạt thái lát ngang hạt lạc có độ dày dưới 2 mm bằng

dao lưỡi mỏng và cho vào bình tam giác có nút đậy kín; Lạc nhân cân khoảng 15 g

và cũng cắt thành lát mỏng.

Tiến hành thử: Chén cân đã sấy khô và đã xác định khối lượng (m3). Cân khoảng

5 g lạc hạt (hoặc lạc vỏ) lấy từ bình tam giác đậy nút ở trên, cho vào chén cân có nắp.

Xác định khối lượng chén cân và mẫu (m4). Đặt chén cân vào tủ sấy, mở nắp chén

cân, sấy ở nhiệt độ 105 ± 2 oC trong 5 h. Làm nguội chén cân trong bình hút ẩm

khoảng 30 phút, cân và ghi khối lượng chén cân chứa mẫu đã sấy. Tiếp tục sấy khoảng

45 phút, làm nguội và cân lần thứ hai (m5). Sai lệch giữa hai lần cân không vượt quá

0,001 g.

- Tính toán kết quả:

Độ ẩm lạc hạt (Xh) hoặc độ ẩm của lạc vỏ (Xv) tính bằng % khối lượng theo

công thức:

𝑚4−𝑚5 𝑚4−𝑚3

× 100 (5) 𝑋ℎ(ℎ𝑜ặ𝑐 𝑋𝑣) =

Độ ẩm của lạc củ (Xc) được tính bằng % khối lượng theo công thức:

𝑚1𝑋ℎ+𝑚2𝑋𝑣 𝑚1+𝑚2

× 100 (6) 𝑋𝑐 =

Trong đó:

m1: khối lượng hạt lạc trong mẫu thử, tính bằng g;

m2: khối lượng vỏ lạc trong mẫu thử, tính bằng g;

m3: khối lượng chén cân, tính bằng g;

m4: khối lượng chén cân và mẫu thử, tính bằng g;

m5: khối lượng chén cân và mẫu thử sau khi sấy, tính bằng g;

Kết quả về độ ẩm lạc hạt hoặc lạc vỏ là số trung bình của hai phép thử song

song. Không được lệch quá 0,3 % và được tính với độ chính xác 0,1 %.

2.3.2. Xác định hàm lượng aflatoxin

Hàm lượng AF trong lạc được xác định bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

theo phương pháp đã được công nhận phù hợp theo yêu cầu của TCVN ISO/IEC

17025 tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Quá trình phân tích

hàm lượng AF trong lạc được thực hiện và tính toán kết quả như sau:

Tách chiết aflatoxin: Cân khoảng 25 g mẫu, thêm 5 g NaCl và 125 mL dung

dịch MeOH 60 %. Lắc ngang 140 v/p trong 30 phút, lọc qua giấy lọc, lấy 15 mL dịch

lọc và thêm 30 mL nước. Lấy 15 mL dịch lọc vừa thu được đem làm sạch [22].

Làm sạch trên cột SPE-IM: Gỡ nắp đậy phía trên và dưới cột ái lực rồi gắn vào

giá đỡ của bộ chiết pha rắn. Đổ dung dịch thử ở trên vào xilanh. Điều chỉnh bơm sao

cho tốc độ qua cột khoảng 1 giọt/giây. Rửa tạp bằng 15 mL nước cất, tốc độ 1

giọt/giây. Rửa giải bằng 1 mL MeOH, tốc độ 1 giọt/giây, rồi bơm vào LC-MS/MS.

Phân tích bằng LC-MS/MS: hệ thống AB Sciex Triple Quad 5500 [80]. Pha

động chạy theo chương trình gradient như sau:

Bảng 2. 1. Chương trình gradient phân tích aflatoxin

Thời gian (phút)

Tỷ lệ % MeOH

Tỷ lệ % Amoniacetat 10 mM

0,01

100

5,01

Thể tích bơm mẫu: 10 µL. Tốc độ dòng pha động: 0,4 mL/phút

- Điều kiện khối phổ:

+ Nguồn ion hóa: Electrospray (ESI)

+ Thế ion hóa: 4000 KV

+ Chế độ: Ion dương

+ Nhiệt độ nguồn: 300 oC

+ Khí: Curtain gas: 25 psi; Ion source gas 1 : 30 psi; Ion source gas 2 : 10 psi.

+ Năng lượng bắn phá: CE = 30 eV

+ Ion chọn lọc : B1 : 313 –> 241, CE=41 ; ->269 , CE=37 B2 : 315 -> 259 , CE=35 ; ->287 , CE=43 G1 : 329 ->243 , CE47 ; ->215 , CE=41 G2 : 331 ->245 , CE=39 ; ->285 , CE=33

- Kết quả hàm lượng aflatoxin (B1, B2, G1, G2) được tính như sau [22, 80]:

(7) X = V × K × Cm/m

Trong đó :

X: hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong mẫu phân tích (ng/g) V - Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy (mL) K: Hệ số pha loãng (nếu có) Cm - Nồng độ aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong dịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/mL). m - Khối lượng của mẫu phân tích (g)

Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử xác định: Giới hạn phát

hiện (LOD) là 0,1 µg/kg; Giới hạn định lượng (LOQ) là 0,3 µg/kg.

Phương pháp đảm bảo tính chọn lọc và tính đặc hiệu, thể hiện trong kết quả xác

nhận giá trị IP bằng cách kiểm tra phân mảnh của các AF (hình 2.1).

Hình 2. 1. Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxin

Thực hiện phân tích các mẫu trắng và kiểm tra tỷ lệ đáp ứng tín hiệu của ion

định lượng và ion định tính thực hiện trên chuẩn và trên mẫu lạc không có AF.

Mặt khác trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại các thời gian lưu của

các aflatoxin nghiên cứu. Còn trên sắc đồ mẫu thêm chuẩn có xuất hiện các pic tại

các thời gian lưu tương ứng. Như vậy phương pháp có tính đặc hiệu và chọn lọc đáp

ứng yêu cầu.

Sắc đồ các điểm chuẩn và đường chuẩn AFB1 như hình 2.2.

Hình 2. 2. Sắc đồ các điểm chuẩn Aflatoxin B1

Sắc đồ chuẩn AF và đường nền như các hình 2.3, 2.4, 2.5 và 2.6 dưới đây.

Hình 2. 3. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB1

Hình 2. 4. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB2

Hình 2. 5. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG1

Hình 2. 6. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG2

2.3.3. Đánh giá về mặt cảm quan của các mẫu lạc thu thập mùa thu năm

2013

Trong quá trình lấy mẫu vào mùa thu tại một tỉnh được lựa chọn trong 3 tỉnh

nghiên cứu, để đánh giá mối liên quan giữa tình trạng mẫu và tình trạng nhiễm

aflatoxin, nghiên cứu đã đánh giá về mặt cảm quan. Tình trạng mẫu khi lấy được ghi

chép lại và theo dõi đến khi có kết quả kiểm nghiệm (nguyên hạt/ hạt vỡ, dóc vỏ lụa/

không dóc vỏ lụa, hạt mẩy/ hạt nhăn/ hạt lép, màu khác thường - không hồng, không

đỏ, có vết màu khác so với những hạt bình thường: đen, vàng, ...).

Các yếu tố giả thiết là không có nguy cơ liên quan đến tình trạng nhiễm aflatoxin

trong lạc nhân như:

- Nguyên hạt: hạt còn nguyên vỏ lụa, không bị trầy xước, không bị vỡ.

- Hạt mẩy: hạt căng đầy, không có vết nhăn, bề mặt nhẵn.

- Dóc vỏ lụa: hạt lạc khô, dễ dóc vỏ lụa khi để xoa trên lòng bàn tay.

Các yếu tố giả thiết là có nguy cơ liên quan đến tình trạng nhiễm aflatoxin trong

lạc nhân như:

- Hạt vỡ (Nhân bị vỡ và tách đôi): nhân bị vỡ là nhân có phần vỡ lớn hơn một

phần tư nhân. Nhân tách đôi là nhân bị tách làm hai mảnh, hạt vỡ chiếm tới 3%

tổng số hạt trong mẫu lấy [23].

- Hạt nhăn/ lép: Nhăn do chưa phát triển hoàn chỉnh và nhăn lại, hạt nhăn chiếm

tới 5% tổng số hạt trong mẫu lấy [23].

- Hạt bị biến màu: Hạt bị biến màu sẫm hơn màu vàng nhạt hoặc có nhiều đốm

màu vàng nhạt; và/hoặc lớp vỏ bị biến màu thành nâu sẫm, xám sẫm, xanh sẫm

hoặc đen và lớn hơn 25 % nhân. Hạt bị biến màu chiếm tới 3 % tổng số hạt trong

mẫu lấy [23].

- Không dóc vỏ lụa: hạt lạc không dễ dóc vỏ lụa khi để xoa trên lòng bàn tay.

- Có mầm: hạt có mầm nhú ra khỏi vỏ áo, đã bị héo khô do quá trình làm khô hạt.

- Có mốc: có mốc nhìn thấy trên bề mặt hạt lạc.

Các yếu tố giả thiết là không có nguy cơ liên quan đến tình trạng nhiễm aflatoxin

trong lạc củ là lạc sạch: lạc không có lẫn các tạp chất hữu cơ và vô cơ.

Các yếu tố giả thiết là có nguy cơ liên quan đến tình trạng nhiễm aflatoxin trong

lạc củ như:

- Lạc có tạp: có lẫn tạp chất vô cơ hoặc hữu cơ không phải lạc (đá, bụi, thân cây,

hạt khác,…) từ 0,1 % số củ.

- Hạt mốc: có hình sợi mốc có thể quan sát được.

2.4. Phương pháp phân tích sinh học

2.4.1. Xác định tổng số bào tử nấm men - mốc

Xác định tổng số bào tử nấm men - mốc bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc theo

TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008) [24] như sau:

- Tiến hành thử: Cân 10 g mẫu thử vào 9 phần dung dịch muối pepton, trộn đều.

Dung dịch pha loãng ban đầu được pha loãng tiếp theo bằng cách lặp lại các thao

tác pha loãng cho đến khi thu được các dãy dung dịch pha loãng thập phân thích

hợp. Lắc các dung dịch pha loãng, dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 mL mẫu dạng

lỏng cho vào một đĩa thạch DG18, dùng các pipet vô trùng khác nhau để chuyển

các dung dịch pha loãng tiếp theo vào các đĩa thạch khác nhau. Ủ các đĩa này

trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳng đứng trong tủ ấm ở

25±1 oC trong 5 ngày đến 7 ngày.

- Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định: Chọn các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn

lạc/đĩa và đếm. Nếu trên các đĩa có nấm mốc phát triển quá nhanh thì có thể đếm

các khuẩn lạc sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày đến 7 ngày.

- Tính toán kết quả: Tính số lượng N vi sinh vật có mặt trong mẫu thử theo trung

∑ 𝐶

bình từ hai độ pha loãng liên tiếp. Kết quả được tính theo công thức sau:

(8)

N =

V×1,1×d

Trong đó:

C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng

liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

V là thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.

Làm tròn số các kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa.

Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương

ứng của 10, hoặc làm tròn số với hai chữ số có nghĩa.

2.4.2. Phân lập nấm mốc sinh độc tố từ lạc

- Phân lập nấm trên lạc theo Hướng dẫn định danh nấm mốc trên hạt cao lương

bằng hình ảnh [109] và TCVN 8275-2:2010 [24].

- Nhận diện nấm quan sát được theo mô tả hình thái của A. flavus trong Mô tả

nấm trong y học [45] và Hướng dẫn định danh nấm mốc trên hạt cao lương bằng

hình ảnh [109].

- Nấm được làm thuần bằng cách cấy chấm điểm trên đĩa thạch SDA.

2.4.3. Định danh nấm mốc Aspergillus flavus

Phương pháp định danh tham chiếu phương pháp định danh Aspergillus flavus

trên tạp chí ứng dụng vi sinh [101].

- Bào tử nấm được thu từ đĩa nuôi cấy bằng cách sử dụng 0,05 % Tween 80, ly

tâm 1000 vòng/ 5 phút, sau đó gạn lấy bào tử và bảo quản bằng glycerol 30 %

trong tủ lạnh đông.

- Tách chiết DNA bằng TES (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, SDS 1%),

cát trắng, ly tâm rồi thu phần trên.

- DNA được làm sạch bằng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol

(25:24:1), sodium acetate, ethanol; DNA được cô đặc bằng máy cô đặc miVAC,

sau đó thêm 100 L nước khử ion. Dựa vào khả năng hấp thu ánh sáng tử ngoại

ở bước sóng 260 nm (A260) của các phân tử ADN. Từ giá trị mật độ quang ở

bước sóng 260 nm của các mẫu đo bằng máy đo độ hấp thu ánh sáng tử ngoại

nanodrop, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50 µg/mL, chúng ta tính được

nồng độ DNA theo công thức C = A260 × 50 × n (trong đó n là số lần pha loãng).

Độ sạch của DNA được so sánh bằng đo tỉ số mật độ quang của mẫu DNA ở

bước sóng 260 nm và 280 nm, tỉ số A260/A280 trong khoảng 1,8 ÷ 2,2 thì DNA

chiết được là sạch.

- Khuếch đại DNA bằng PCR và điện di sản phẩm khuếch đại: nhằm tăng bản sao

đoạn DNA đoạn mồi ITS1 và ITS2. Khuếch đại PCR được thực hiện trên 50 L

hỗn hợp phản ứng: 25 µL của Master mix 2X, 19 µL H2O, 2 µL của mỗi mồi

(ITS1 và ITS2), và 2 µL dịch chiết DNA. Chương trình PCR thực hiện như sau:

1) 1 bước ở 96 ºC trong 4 phút; 2) 35 chu kỳ theo 3 bước: 45 giây ở 94 ºC, 1

phút gia nhiệt ở 57 ºC), 1 phút 20 giây ở 72 ºC; và 3) 1 bước cuối trong 8 phút

ở 72 ºC.

- Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel chứa 1,5 % agarose + 0,5 %

ethidium bromide trong đệm 1×TAE (40 mM Tris base; 40 mM acetic acid; 1,0

mM EDTA; pH 8,0) và quan sát dưới ánh sáng đèn UV. Sử dụng thang đo DNA

chuẩn để xác định chiều dài tương đối của sản phẩm PCR. Kết quả phân tích

được xem xét kết luận là có gen của A. flavus khi mẫu có sản phẩm khuếch đại

DNA với kích thước 600 bp.

- Giải trình tự gen, so sánh trên ngân hàng gen: Các mẫu giải trình tự tiến hành

tại công ty 1st BASE Sequencing INT, Hàn Quốc. Trình tự thô sẽ được xử lý tiếp

bằng phần mềm FinchTV để chọn những nucleotide phù hợp cho các sắc đồ.

Trình tự nucleotid chuẩn được chuyển lên công cụ BLAST tại NCBI so sánh với

chủng đã định danh có trình tự ITS được công bố tương đồng trên 98 %, lựa

chọn chủng có điểm tương đồng cao nhất.

- Khẳng định chủng đã phân lập được có khả năng sinh aflatoxin: 1 mL của dung

dịch bào tử thu được sau khi phân lập và làm thuần chủng, thêm vào 50 g lạc đã

tiệt trùng rồi nuôi cấy trong 10 ngày. Sau đó đem mẫu lạc này đi phân tích

aflatoxin bằng LC-MS/MS.

- Chọn một trong số các chủng phân lập được có khả năng sinh aflatoxin mạnh

nhất để sử dụng cho nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh

aflatoxin, chủng lựa chọn được đặt tên là Aspergillus flavus BG1.

2.4.3. Chuẩn bị dịch bào tử Aspergillus flavus với hàm lượng khác nhau

Để đạt được mức nhiễm A. flavus theo thiết kế thí nghiệm các yếu tố ảnh hưởng

đến sự phát triển và sinh aflatoxin của nấm mốc này, nghiên cứu cần thực hiện:

- Pha loãng dịch bào tử thu ban đầu (hình 2.7)

Hình 2. 7. Mô phỏng quá trình pha loãng dịch bào tử A. flavus

- Xác định bằng phương pháp đếm bào tử (buồng đếm hồng cầu) hoặc,

- Xác định lại nồng độ bằng kỹ thuật đổ đĩa bằng cách cấy 1 mL dịch pha loãng ở

mỗi nồng độ đã chọn vào các đĩa petri. Đổ 15 mL môi trường SDA vào các đĩa

vừa cấy, lắc đều. Dùng giấy sạch gói các đĩa lại, ủ ở 25 oC trong 5 ngày (hình 2.8).

Hình 2. 8. Mô phỏng quá trình cấy dịch bào tử pha loãng trên đĩa thạch

Từ kết quả đổ đĩa của dịch bào tử ở các nồng độ khác nhau, tính nồng độ của

dịch bào tử ban đầu theo công thức:

∑ 𝐶

(9)

N =

V×1,1×d

Trong đó:

C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng

liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

V là thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.

Làm tròn số các kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa.

Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa

tương ứng của 10, hoặc làm tròn số với hai chữ số có nghĩa.

2.5. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc

2.5.1. Đánh giá trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập tại Bắc

Giang, Thanh Hóa và Nghệ An vào mùa hè

* Nghiên cứu mô tả thực hiện tại các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang.

* Đối tượng mẫu gồm 3 loại sản phẩm: lạc củ, lạc nhân và lạc rang húng lìu.

* Thời gian thực hiện: tháng 6-7/2013.

* Chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 và Tổng số nấm mốc

trên lạc.

Từ kết quả nghiên cứu và so sánh, tỉnh có mức độ nhiễm nấm men-mốc và

aflatoxin trên lạc, chọn một trong 3 tỉnh trên để triển khai nghiên cứu tiếp theo.

2.5.2. Đánh giá mức nhiễm AF, nấm mốc trên lạc củ và lạc nhân vào mùa

thu

* Địa điểm: một trong ba tỉnh được lựa chọn nghiên cứu tiếp theo sau kết quả của

nghiên cứu 2.5.1.

* Thời gian thực hiện: tháng 9 - 10/2013 vào mùa thu.

* Ghi chép tình trạng mẫu trong quá trình thu thập mẫu.

* Chỉ tiêu phân tích: Độ ẩm, hàm lượng AFB1, B2, G1, G2 và Tổng số nấm mốc

trong lạc.

Từ kết quả phân tích độ ẩm, mức độ nhiễm aflatoxin và nấm mốc trên lạc, kết

hợp với tình trạng mẫu ghi chép trong quá trình lấy mẫu chúng tôi phân tích mối liên

quan giữa tình trạng mẫu và mức nhiễm aflatoxin trong lạc.

2.6. Phương pháp công nghệ

Trong nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trong

lạc của Aspergillus flavus, độ ẩm của lạc là một yếu tố quan trọng được quan tâm

đến, để đạt được độ ẩm của lạc theo thiết kế thí nghiệm, nghiên cứu thực hiện như

sau.

2.6.1. Điều chỉnh độ ẩm của lạc thí nghiệm

Nước cất được thêm vào trên bề mặt của lạc trong túi PVC vô trùng. Lắc, nhào,

trộn, túi sau đó được làm lạnh xuống 4 oC trong 48 h. Kiểm tra lại độ ẩm của lạc trước

khi đưa vào thí nghiệm, sai số cho phép là 0,3 %.

Cách tính lượng nước bổ sung vào lạc theo công thức sau:

(10)

=

𝑚1 𝑚0

𝑤2−𝑤0 𝑤1−𝑤2

Trong đó:

m1: lượng nước cần bổ sung vào (g/ mL)

m0: lượng lạc ban đầu (g)

w0: độ ẩm của lạc ban đầu (%)

w1: độ ẩm của nước dùng bổ sung = 100 (%)

w2: độ ẩm của lạc cần điều chỉnh đến (%)

Ghi chú: với các thí nghiệm có gây nhiễm A. flavus BG1, lượng nước tính toán

bổ sung sẽ trừ đi 1 mL/100 g lạc, do 1 mL dịch bào tử A. flavus.

2.6.2. Thiết kế thí nghiệm: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát

triển và sinh aflatoxin trên lạc của Aspergillus flavus

Độ ẩm là một trong những yếu tố quan trọng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển,

lạc trong quá trình bảo quản có thể hút ẩm từ môi trường bên ngoài, hoặc xảy ra hô

hấp hiếu khí hấp thu ôxy và tạo ra nước làm tăng độ ẩm của lạc. Bao bì chứa đựng

ngăn thấm khí tốt có thể hạn chế sự thay đổi độ ẩm trong lạc. Do đó luận án thực hiện

nghiên cứu ảnh hưởng của các loại bao bì đối với sự thay đổi độ ẩm của lạc.

2.6.2.1. Thiết kế nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì tới sự thay đổi độ ẩm của lạc

- Lạc củ, lạc nhân được thu thập tại các hộ gia đình tại địa bàn huyện Lục Nam,

tỉnh Bắc Giang, đây là lạc thu hoạch vào vụ Xuân khoảng tháng 5 - 6/2014.

- Bao bì sử dụng trong nghiên cứu: bao đay, bao tải hai lớp (lớp ngoài là bao tải

dứa làm từ vật liệu PP, lớp trong là túi PE có độ dày 80 µm), túi PE độ dày 80

µm, túi PVC độ dày 100 µm.

- Phương pháp truyền thống: lạc đựng trong bao đay, bao tải hai lớp. Mỗi bao

đựng 25 kg.

- Bảo quản trong phòng có kiểm soát nhiệt độ 25±2 oC.

- Độ ẩm được kiểm tra hàng tháng trong vòng 4 tháng.

Từ kết quả nghiên cứu sự thay đổi độ ẩm của lạc trong các loại bao bì, luận án

lựa chọn bao bì thích hợp đảm bảo chống thấm khí tốt để dùng cho các nghiên cứu

các yếu tố ảnh hưởng tiếp theo.

Thiết kế thí nghiệm chung cho các nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố độ ẩm,

nhiệt độ, mức nhiễm A. flavus và ảnh hưởng của áp lực hút chân không. Các điều

kiện: mức nhiễm A. flavus, nhiệt độ, độ ẩm được cố định như nhau trong các nghiên

cứu, đối với nghiên cứu yếu tố nào thì yếu tố đó sẽ được thay đổi còn các yếu tố còn

lại cố định ở một điều kiện. Điều kiện cố định chung của các nghiên cứu như sau:

* Lượng mẫu và quy cách đóng gói: 100 g lạc/túi hàn kín.

* Mẫu chứng 1 (C1): mẫu không gây nhiễm A. flavus, để ở điều kiện nhiệt độ phòng.

* Mẫu chứng 2 (C2): mẫu gây nhiễm 103 CFU A. flavus/g, ở điều kiện nhiệt độ phòng.

* Độ ẩm của lạc thí nghiệm: 10 %. Sau khi xác định độ ẩm ban đầu của lạc, lạc được

điều chỉnh đến độ ẩm thí nghiệm như mục 2.6.1.

* Mức nhiễm A. flavus: 103 CFU A. flavus /g.

* Nhiệt độ: 25 oC. Lạc thí nghiệm được để trong tủ ổn nhiệt với nhiệt độ 25±2 oC.

* Thời gian nghiên cứu và tần suất kiểm tra: Mẫu được bảo quản trong 4 tháng,

quan sát sự phát triển của A. flavus hàng tuần, định lượng aflatoxin trong lạc thực

hiện 2 tuần/lần, mỗi lần phân tích lấy ra 3 túi để đồng nhất mẫu và phân tích.

2.6.2.2. Thiết kế nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm

* Độ ẩm của lạc: Lạc đưa vào thí nghiệm được điều chỉnh đến độ ẩm 6, 8, 10, 12 và

14 % với ký hiệu tương ứng là: M11, M12, M13, M14 và M15.

* Các yếu tố còn lại: Mức nhiễm nấm A. flavus và nhiệt độ lưu giữ cố định chung

như các nghiên cứu khác.

* Số lượng túi mẫu cho thí nghiệm: Mỗi lần lấy 3 túi, đồng nhất mẫu và kiểm tra

hàm lượng AF. Thí nghiệm thực hiện trong 4 tháng, kiểm tra 2 lần/tháng. Tổng số túi

mẫu: 3 túi/mẫu × (5 mức độ ẩm + 2 mẫu chứng) × 8 lần = 168 túi (hình 2.9).

Hình 2. 9. Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm tới sự phát triển và sinh AF

2.6.2.3. Thiết kế nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ

* Nhiệt độ bảo quản: Các mẫu thí nghiệm để trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 20, 25, 30,

35 và 40  1 oC. Các mẫu được ký hiệu tương ứng: M21, M22, M23, M24 và M25.

* Các yếu tố còn lại: Mức nhiễm nấm A. flavus và độ ẩm cố định chung như các

nghiên cứu khác.

* Số lượng túi mẫu cho thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ: Tổng số túi mẫu chuẩn

bị: 3 túi/mẫu × 5 mức nhiệt độ × 8 lần/thí nghiệm = 120 túi (hình 2.10).

Hình 2. 10. Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và sinh AF

2.6.2.4. Thiết kế nghiên cứu ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến sự phát

triển và sinh aflatoxin trên lạc

* Mức nhiễm nấm A. flavus BG1 trong các mẫu: 100, 101, 102, 103, 104, 105 và 106

CFU A. flavus/g. Ký hiệu tương ứng là M51, M52, M53, M54, M55, M56, M57.

* Các yếu tố còn lại: độ ẩm và nhiệt độ cố định chung như các nghiên cứu khác.

* Số lượng túi mẫu cho thí nghiệm: Tổng số túi chuẩn bị là 3 túi/mẫu × 7 mức nhiễm

A. flavus BG1 × 8 lần = 168 túi (hình 2.11).

Hình 2. 11. Mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus B1

2.6.2.4. Thiết kế nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện hút chân không đến sự

phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của A. flavus BG1

* Áp lực hút chân không của các mẫu là 50, 100, 150, 200 và 350 mmHg có ký hiệu

tương ứng là M31, M32, 33, M34 và M35.

* Các yếu tố còn lại: Mức nhiễm nấm A. flavus, nhiệt độ và độ ẩm cố định chung

như các nghiên cứu khác.

* Số lượng túi mẫu cho thí nghiệm: Tổng số túi chuẩn bị là 3 túi/mẫu × 5 mức áp

lực hút chân không × 8 lần = 120 túi (hình 2.12).

Hình 2. 12. Mẫu thí nghiệm điều kiện hút chân không

Mô hình thực nghiệm hút chân không như hình 2.13.

Hình 2. 13. Mô hình thực nghiệm hút chân không

Ghi chú: 1) Bao bì nguyên liệu; 2) Bơm hút chân không; 3) Đồng hồ đo ấp suất chân không

2.6.2.4. Thiết kế nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu hồi, quế đến khả năng ức

chế sự phát triển của chủng đã phân lập

a) Nghiên cứu khả năng ức chế của tinh dầu hồi, quế đến sự phát triển của chủng

phân lập được trên môi trường thạch

Nồng độ tinh dầu được chọn theo phương pháp nhân đôi để tìm ra nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC), sử dụng. (hồi, quế) với dãy 9 nồng độ từ: 0,0125; 0,025; 0,05;

0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 và 3,2 %v/v.

Lượng thạch đổ đĩa là 30 mL/đĩa, tinh dầu không tan trong thạch nên chúng tôi

đã tiến hành thử với lượng tinh dầu nhiều nhất trong một đĩa là 10,666 mL (tương

đương với 3,2 %v/v) cần dùng một lượng 440 L tween 20 để hòa tan được tinh dầu

trong thạch. Mỗi thí nghiệm được chuẩn bị cho 6 đĩa × 9 nồng độ tinh dầu × 2 loại

tinh dầu = 108 đĩa.

Chuẩn bị thạch cho mỗi nồng độ tinh dầu: đổ 50 mL thạch ấm vào ống đong

dung tích 200 mL, thêm 440 mL tween 20, thêm lượng tinh dầu như đã tính toán

(bảng PL 2.5 trong phụ lục), rồi đổ thạch vào đến vạch 180 mL, đổ sang bình tam

giác, lắc đều rồi rót vào đĩa thí nghiệm đã ghi ký hiệu tinh dầu (Hồi - H, Quế - Q)

cùng nồng độ tương ứng.

Chủng A. flavus hàm lượng 103 CFU/mL được cấy điểm 10 L trên môi trường

thạch, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 25±2 oC trong vòng 1 tháng. Đo đường kính phát

triển của khuẩn lạc được đo lần đầu sau 3 ngày, sau đó 2 ngày/lần cho đến khi nấm

phát triển tràn đĩa (100 %). Khả năng ức chế của tinh dầu đối với sự phát triển của A.

flavus BG1 được đánh giá thông qua đo đường kính phát triển của khuẩn lạc bằng

thước đo có độ chính xác 0,1cm (hình 2.14).

Hình 2. 14. Đo kích thước đường kính A. flavus

Mỗi lần đo 4 đĩa/nồng độ với mỗi loại tinh dầu để tính đường kính trung bình.

Lần đầu đo sau 3 ngày nuôi cấy, sau đó đo 2 ngày/lần, thực hiện như sau: điểm

0 của thước được đặt thẳng hàng với mắt nhìn và viền ngoài màu trắng của khuẩn lạc,

lấy điểm 0 của thước làm tâm điểm, xoay đầu còn lại của thước và quan sát vạch chia

của thước trùng với viền ngoài màu trắng của khuẩn lạc đến khi đọc được giá trị lớn

nhất thì ghi kết quả đến 0,1 cm.

b) Nghiên cứu khả năng ức chế của tinh dầu hồi, quế đến sự phát triển của chủng

phân lập được trên lạc nhân thí nghiệm

Từ kết quả xác định hàm lượng tinh dầu có khả năng ức chế sự phát triển của A.

flavus. Chọn 4 nồng độ tinh dầu để thí nghiệm trong nghiên cứu này.

Chuẩn bị thí nghiệm (hình 2.15): Cân 50 g lạc nhân vào đĩa petri  140 sạch,

cho 1 mL dịch bào tử rải đều trên bề mặt hạt lạc, nhỏ tinh dầu theo tính toán lên giấy

lọc Whatman đã tiệt trùng, đậy nắp, bọc giấy parafilm, cho lên máy lắc ngang lắc

trong 24 h ở 25 oC, sau đó theo dõi thí nghiệm ở điều kiện nhiệt độ 25±2 oC.

Hình 2. 15. Thí nghiệm ảnh hưởng của tinh dầu trên lạc thí nghiệm

Số đĩa petri chuẩn bị cho thí nghiệm: 4 nồng độ × 3 đĩa/lần kiểm tra × 5 lần kiểm

tra × 2 loại tinh dầu + 3 đĩa đối chứng × 5 lần kiểm tra = 140 đĩa (mỗi lần phân tích

tổng nấm và aflatoxin, chọn 3 đĩa/lần để đồng nhất rồi phân tích mẫu).

Thời gian phân tích tổng nấm và aflatoxin: 7 ngày/lần, trong vòng 28 ngày.

2.6.3. Thiết kế thí nghiệm nghiên cứu các giải pháp và đề xuất một số quy

trình nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong lạc

2.6.3.1. Bảo quản lạc nhân ở điều kiện kiểm soát chất lượng trước khi đưa vào

bảo quản lạc và điều kiện môi trường trong quá trình bảo quản lạc

Lạc nhân trước khi bảo quản được kiểm tra chất lượng theo đề xuất từ kết quả

của nghiên cứu 2.6.2 về: độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và chưa bị nhiễm aflatoxin.

Việc kiểm tra phát hiện lạc nhiễm aflatoxin theo mô hình hình 2.16. Lạc được loại

những hạt mốc, lép, nhăn, hạt biến màu.

Hình 2. 16. Mô phỏng phát hiện lạc nhiễm AF bằng đèn UV ở bước sóng 365 nm

- Điều kiện bảo quản: lạc đóng bằng bao tải hai lớp, 50 kg/bao, để trên kệ gỗ,

trong phòng ở điều kiện nhiệt độ 25±2 oC trong 6 tháng.

- Các mẫu được kiểm tra aflatoxin hàng tháng, mẫu được lấy từ các bao tại các vị

trí: bên trên, giữa và đáy bao với lượng mẫu chung là 1 kg.

2.6.3.2. Bảo quản lạc nhân bằng cách sử dụng tinh dầu hồi hoặc quế

Từ kết quả nồng độ tinh dầu có thể ức chế sự phát triển và sinh AF của nấm mốc

trên lạc nhân thí nghiệm trong nghiên cứu 2.6.2.4. Chọn 3 nồng độ tinh dầu để thực

hiện khảo nghiệm quy trình bảo quản bằng tinh dầu quy mô hộ gia đình như sau: Bao

tải hai lớp có thể đóng được 5 kg lạc nhân. Cho tinh dầu tự nhiên được thấm vào giấy

lọc và cho vào các bao mẫu với các nồng khác nhau. Giấy lọc được đặt vào bên trong

ở giữa bao, sau đó đổ lạc nhân vào 2 bên giấy lọc rồi đóng gói kín.

Tần suất kiểm tra: Phân tích tổng số bào tử nấm, hàm lượng aflatoxin sau các

khoảng thời gian 1 tháng/lần, trong 12 tháng.

2.7. Xử lý số liệu

Xử lý số liệu thông qua phân tích thống kê sử dụng phần mềm R [14].

- So sánh sự khác biệt giữa các tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc

tại các tỉnh khác nhau, sử dụng hàm prop.test sau đó dùng kiểm định Khi bình

phương (2) cho biết trên phương diện thống kê các tỉ lệ này có khác nhau không.

- Để tìm được mối liên quan giữa tình trạng mẫu với tình trạng nhiễm aflatoxin

trong lạc ta sử dụng tỉ số nguy cơ (Relative Risk hay Risk Ratio – RR). Nhóm

n1 các mẫu lạc có yếu tố có được cho là yếu tố bất lợi liên quan đến tình trạng

nhiễm aflatoxin trong lạc, có k1 mẫu phát hiện nhiễm AF, p1=k1/n1; nhóm n2

các mẫu có các yếu tố được cho là có lợi, không có nguy cơ có liên quan đến

tình trạng nhiễm aflatoxin trong lạc, có k2 mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin,

p2=k2/n2. Ta có tỉ số RR = p1/p2.

+ Nếu RR = 1 (tức là p1=p2): ta nói rằng không có mối liên hệ nào giữa yếu

tố nguy cơ và khả năng nhiễm aflatoxin;

+ Nếu RR > 1 (tức là p1>p2), cúng ta có thể phát biểu rằng yếu tố nguy cơ làm

tăng khả năng nhiễm aflatoxin;

+ Nếu RR < 1 (tức là p1

nhiễm aflatoxin.

- So sánh sự khác biệt giữa độ ẩm lạc thu thập tại hộ gia đình và hộ kinh doanh

bằng hàm t-test cho biết trên phương diện thống kê độ ẩm của lạc thu thập từ

hai loại hình này có khác nhau không.

- Để xác định một yếu tố có liên hệ tuyến tính với mức nhiễm aflatoxin trong lạc,

chúng ta phân tích hồi quy tuyến tính đơn giản. Mô hình hồi quy tuyến tính đơn

giản (simple linear regression model) là mô hình có một yếu tố duy nhất (là x)

được diễn đạt qua phương trình:

y =  + x +  (11)

- Dùng phân tích BMA để tìm ra mô hình tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng sinh aflatoxin trong lạc bằng chương trình phần mềm phân tích thống kê

R [14]. Mô hình tối ưu tìm được là mô hình có ít yếu tố nhiễu nhất, có thông số

BIC (Bayesian Information Criteria) nhỏ nhất và xác xuất cho mô hình là cao

nhất (post prob).

- Sau khi tìm được mô hình tối ưu ở trên, chúng ta sử dụng mô hình hồi quy tuyến

tính đa biến (multiple linear regression) để tìm ra phương trình hồi quy tuyến

tính mô phỏng khả năng nhiễm aflatoxin trong lạc với các yếu tố ảnh hưởng

trên. Đối với mô hình hồi quy tuyến tính đa biến ta có phương trình:

(12) yi =  + 1x2 + 2x2 +…+ kxk +I

- Để xác định mối tương quan giữa các biến ta dùng lệnh “pairs.panels” trong R

để tìm mối tương quan, tỉ số tương quan giữa hai biến càng lớn thể hiện mối

quan hệ phụ thuộc giữa hai biến càng cao.

- Trường hợp yếu tố ảnh hưởng có tỉ số tương quan với mức nhiễm aflatoxin thâm

và hai biến này không có quan hệ tuyến tính, để xác định điểm tối ưu của yếu tố

đó ảnh hưởng đến phát hiện sinh aflatoxin, dùng lệnh “hist” và “plot(density)”

để vẽ biểu đồ tần suất phân phối chuẩn.

2.8. Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2. 17. Sơ đồ nghiên cứu

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên lạc

tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang

Miền Bắc có diện tích trồng lạc lớn nhất trong cả nước, đặc biệt là các tỉnh Bắc

Giang, Thanh Hóa và Nghệ An. Nghiên cứu đã tiến hành lấy mẫu đánh giá mức độ

nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập vào

mùa hè và mùa thu tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An.

Tại các tỉnh phía Bắc và miền Trung thường trồng lạc vào vụ Xuân và vụ Đông

[11], thời điểm thu hoạch vào khoảng tháng 6-7 và tháng 12 năm trước đến tháng 1

năm sau [3], nông dân miền Bắc có đến 95 % bảo quản trong thời gian ngắn còn miền

Trung chỉ có 3 % bảo quản thời gian dài [11], do đó đa số lạc thu thập ngoài thị trường

vào mùa hè (tháng 7-8) và mùa thu (tháng 9-10) có thời gian bảo quản trong khoảng

3-8 tháng.

Theo kết quả thống kê về điều kiện nhiệt độ và độ ẩm trung bình các tháng của

năm 2013 cho thấy [20], các mẫu lạc thu thập vào mùa hè chịu 4 tháng (từ tháng 1-

4) là thời gian có điều kiện nhiệt độ và độ ẩm không khí thích hợp cho nấm mốc phát

triển, còn các mẫu lạc thu thập vào mùa thi có 3 tháng có điều kiện thích hợp cho nấm

mốc phát triển (từ tháng 7 đến tháng 10).

3.1.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên lạc nhân,

lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập vào mùa hè

Nghiên cứu đã thu thập 90 mẫu lạc nhân, 90 mẫu lạc củ và 90 mẫu lạc rang húng

lìu được thu thập tại các chợ ở các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang như mô

tả trong mục 2.3. Kết quả phân tích tổng số bào tử nấm men-mốc và hàm lượng AF

trong các mẫu lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu của cả ba tỉnh được tập hợp tại

các bảng tương ứng: PL1.1, PL1.2 và PL1.3 trong Phụ lục I.

3.1.1.1. Mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên các mẫu lạc nhân

Kết quả phân tích tổng số bào tử nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân,

thể hiện trong bảng PL 2.1 tại Phụ lục I, được tóm tắt tại bảng 3.1.

Bảng 3. 1. Số lượng mẫu nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân

Tỉnh lấy mẫu

Nghệ An Thanh Hóa Bắc Giang

Các thông số

Số mẫu đã lấy

> 101 CFU/g (*)

Số mẫu nhiễm nấm men- mốc

≥ 102 CFU/g (**)

> 0,1 µg/kg (*)

Số mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin

AFB1 > 8 g/kg (***)

Ghi chú:

(*) ngưỡng phát hiện của phương pháp (**) ngưỡng tối đa cho phép mức nhiễm nấm mốc trong lạc của USDA và FDA - Philipin (***) ngưỡng tối đa cho phép mức nhiễm aflatoxin B1 trong lạc theo QCVN 8-1:2011/BYT

Từ số liệu bảng 3.1, mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin các mẫu lạc nhân

thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang có kết quả như sau:

- Số mẫu phát hiện nhiễm nấm men-mốc trong các tỉnh trên lần lượt là 14; 16 và

18 mẫu; chiếm tỉ lệ nhiễm tương ứng là 46,7 %, 53,3 % và 60 %. Trong đó số

mẫu vượt ngưỡng cho phép (102 CFU/g) tương ứng là 10; 10 và 12 chiếm tỉ lệ

30 %; 30 % và 40 %.

- Số mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin trong các tỉnh trên lần lượt là 12; 9 và 13 mẫu;

chiếm tỉ lệ nhiễm tương ứng là 40 %, 30 % và 53,3 %. Trong đó số mẫu nhiễm

aflatoxin B1 vượt ngưỡng cho phép (>8 µg/kg) tương ứng là 5; 3 và 5 chiếm tỉ

lệ 16,7 %; 10,0 % và 16,7 %

Để biết tỉ lệ mức nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin giữa các tỉnh có khác nhau

hay không, sử dụng lệnh prop.test trong chương trình phân mềm phân tích dữ liệu R

cho kết quả như mục 3.2.1 tại Phụ lục 3. Kết quả phân tích thống kê như bảng 3.2.

Bảng 3. 2. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc nhân

Chỉ tiêu đánh giá

Tỉ lệ nhiễm (%)

Giá trị

2

p

Nghệ An Thanh Hóa Bắc Giang

Tổng số bào tử nấm

46,7

53,3

60,0

1,0714

0,5853

men-mốc

Aflatoxin

40,0

30,0

53,3

3,3962

0,183

Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc nhân của các tỉnh như sau: 46,7 % tại Nghệ

An; 53,3 % tại Thanh Hóa và 60,0 % tại Bắc Giang, tuy nhiên kiểm định 2 cho biết

trên phương diện thống kê, các tỉ lệ này không khác nhau, vì trị số p = 0,5853.

Tỉ lệ nhiễm aflatoxin trong lạc nhân của các tỉnh như sau: 40,0 % tại Nghệ An;

30,3 % tại Thanh Hóa và 53,3 % tại Bắc Giang, tuy nhiên kiểm định 2 cho biết trên

phương diện thống kê, các tỉ lệ này không khác nhau, vì trị số p = 0,183.

Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy nấm mốc nhiễm trong lạc chủ yếu là

Aspergillus flavus [73], trong đó nghiên cứu mức nhiễm A. flavus trong lạc tại Perak

có mức nhiễm trong khoảng 1,0×102 đến 1,1×105 CFU/g với tỉ lệ số mẫu nhiễm chiếm

tỉ lệ 77 % [70]. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích tổng số nấm men-mốc với

mức nhiễm trong khoảng 1,3×101 đến 9,3×108 CFU/g, mức nhiễm thấp nhất thấp hơn

và mức nhiễm cao nhất cũng cao hơn nghiên cứu tại Perak, với tỉ lệ nhiễm tại ba tỉnh

trong khoảng 46,7 - 60 %, thấp hơn nghiên cứu tại Perak.

Aflatoxin nhiễm trong lạc nhân tại các tỉnh trong nghiên cứu này trong khoảng

0,34 đến 10.498 g/kg, thấp hơn kết quả mức nhiễm cao nhất trong thời gian xảy ra

ngộ độc cấp tại Kenya vào năm 2004 (aflatoxin nhiễm trong thực phẩm ở mức 1 -

46.400 µg/kg) với 7 % số mẫu vượt mức 1.000 µg/kg [72], còn trong nghiên cứu này

có 1 mẫu vượt 1.000 µg/kg (chiếm tỉ lệ 1,1 %), trong thời gian nghiên cứu không có

vụ việc ngộ độc cấp do nhiễm aflatoxin tại Việt Nam. Mức nhiễm cao nhất trong

nghiên cứu này cao hơn ở Brazil năm 2010 (5476,0 µg/kg) [83], cao hơn tại Perak

(762,1 µg/kg) [70]. Số mẫu nhiễm trong nghiên cứu này chiếm tỉ lệ 30 - 53,3 % cao

hơn tại Brazil (31,3 %) [83], Tây Bắc Nigeria (28,75 %) [73], thấp hơn so với Perak

(61 %) [70].

3.1.1.2. Mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên mẫu lạc củ

Kết quả phân tích tổng số bào tử nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc củ, thể

hiện ở bảng PL 1.2 của Phụ lục I, được tóm tắt trong bảng 3.3.

Bảng 3. 3. Số mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ

Tỉnh lấy mẫu

Nghệ An Thanh Hóa Bắc Giang

Các thông số

Số mẫu đã lấy

> 101 CFU/g (*)

Số mẫu nhiễm nấm men- mốc

≥ 102 CFU/g (**)

> 0,1 µg/kg (*)

Số mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin

AFB1 > 8 g/kg (***)

Ghi chú:

(*) ngưỡng phát hiện của phương pháp

(**) ngưỡng tối đa cho phép mức nhiễm nấm mốc trong lạc của USDA và FDA – Philipin

(***) ngưỡng tối đa cho phép mức nhiễm aflatoxin B1 trong lạc theo QCVN 8-1:2011/BYT

Từ số liệu bảng 3.3, mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin các mẫu lạc củ

thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang có kết quả như sau:

- Số mẫu phát hiện nhiễm nấm men-mốc trong các tỉnh trên lần lượt là 16; 13 và

17 mẫu; chiếm tỉ lệ nhiễm tương ứng là 53,3 %; 43,3 % và 56,7 %. Trong đó số

mẫu vượt ngưỡng cho phép (> 102 CFU/g) tương ứng là 10; 9 và 11 chiếm tỉ lệ

33,3 %; 30,0 % và 36,7 %.

- Số mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin trong các tỉnh trên lần lượt là 12; 9 và 12 mẫu;

chiếm tỉ lệ nhiễm tương ứng là 40 %, 30 % và 40,0 %. Trong đó số mẫu nhiễm

aflatoxin B1 vượt ngưỡng cho phép tương ứng là 3; 3 và 4 chiếm tỉ lệ 10,0 %;

10,0 % và 13,3 %.

Để biết tỉ lệ mức nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc củ giữa các tỉnh có

khác nhau hay không, sử dụng lệnh prop.test trong chương trình phân mềm phân tích

dữ liệu R như mục 3.2.2 tại Phụ lục 3. Kết quả phân tích thống kê như bảng 3.4.

Bảng 3. 4. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ

Chỉ tiêu đánh giá

Tỉ lệ nhiễm (%)

2

Giá trị p

Nghệ An Thanh Hóa Bắc Giang

53,3

43,3

56,7

1,1561

0,561

Tổng số bào tử nấm men-mốc

Aflatoxin

30,0

26,7

40,0

1,3228

0,5161

Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc củ của các tỉnh như sau: 53,3 % tại Nghệ

An; 43,3 % tại Thanh Hóa và 56,7 % tại Bắc Giang, tuy nhiên kiểm định 2 cho biết

trên phương diện thống kê, các tỉ lệ này không khác nhau, vì trị số p = 0,561.

Tỉ lệ nhiễm aflatoxin trong lạc nhân của các tỉnh như sau: 30,0 % tại Nghệ An;

26,7 % tại Thanh Hóa và 40,0 % tại Bắc Giang, tuy nhiên kiểm định 2 cho biết trên

phương diện thống kê, các tỉ lệ này không khác nhau, vì trị số p = 0,5161.

Tổng số nấm men-mốc trong các mẫu lạc củ với mức nhiễm trong khoảng

1,3×101 đến 7,5×108 CFU/g, mức nhiễm thấp nhất thấp hơn và mức nhiễm cao nhất

cũng cao hơn nghiên cứu tại Perak, với tỉ lệ nhiễm tại ba tỉnh trong khoảng 43,3 -

56,7 %, thấp hơn nghiên cứu tại Perak (77 %) [70].

Aflatoxin nhiễm trong lạc củ trong khoảng 0,64 đến 215 g/kg, mức nhiễm thấp

hơn ở Brazil năm 2010 (5476,0 µg/kg) [83], Perak (762,1 µg/kg) [70]. Tỉ lệ số mẫu

nhiễm trong nghiên cứu này chiếm tỉ lệ 26,7-40 % cao hơn tại Brazil (31,3 %) [83],

Tây Bắc Nigeria (28,75 %) [73], thấp hơn so với Perak (61 %) [70] và thấp hơn tỉ lệ

nhiễm trong lạc vỏ trong nghiên cứu của Lê Văn Giang công bố năm 2011 (98,3 %

phát hiện vết) [7].

Kết quả trên cũng cho thấy, các mẫu nhiễm aflatoxin đều phát hiện nhiễm nấm

mốc, nhưng không phải tất cả những mẫu nhiễm nấm mốc đều phát hiện aflatoxin.

Như vậy, nấm mốc nhiễm trong lạc có cả các chủng sinh aflatoxin và chủng không

sinh aflatoxin.

Các mẫu nhiễm nấm vượt ngưỡng (>102 CFU/g) là những mẫu phát hiện

aflatoxin.

Kết quả trong các bảng trên cũng cho thấy tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin

trong lạc nhân cao hơn trong lạc củ, như vậy lạc củ bảo quản tránh nhiễm nấm mốc

và aflatoxin tốt hơn lạc nhân.

3.1.1.3. Mức độ nhiễm nấm men-mốc và AF trên mẫu lạc rang húng lìu

Kết quả phân tích tổng số nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc rang húng lìu,

thể hiện trong bảng PL 1.3 tại Phụ lục I, được tóm tắt trong bảng 3.5.

Bảng 3. 5. Số mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang húng lìu

Tỉnh lấy mẫu

Nghệ An

Thanh Hóa Bắc Giang

Các thông số

Số mẫu đã lấy

> 101 CFU/g (*)

Số mẫu nhiễm nấm men-mốc

≥ 102 CFU/g (**)

> 0,1 µg/kg (*)

Số mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin

AFB1 > 4 g/kg (***)

Ghi chú:

(*) ngưỡng phát hiện của phương pháp

(**) ngưỡng tối đa cho phép mức nhiễm nấm mốc trong lạc của USDA và FDA – Philipin

(***) ngưỡng tối đa cho phép mức nhiễm aflatoxin B1 trong lạc theo QCVN 8-1:2011/BYT

Từ số liệu bảng 3.5, mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin các mẫu lạc rang

húng lìu thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang có kết quả như sau:

- Số mẫu phát hiện nhiễm nấm men-mốc trong các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và

Bắc Giang lần lượt là 9; 7 và 11 mẫu; chiếm tỉ lệ nhiễm tương ứng là 30,0 %;

23,3 % và 36,7 %. Trong đó số mẫu vượt ngưỡng cho phép (> 102 CFU/g) tương

ứng là 3; 4 và 4 chiếm tỉ lệ 10,0 %; 13,3 % và 13,3 %.

- Số mẫu phát hiện nhiễm aflatoxin trong các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc

Giang lần lượt là 2; 1 và 4 mẫu; chiếm tỉ lệ nhiễm tương ứng là 6,67 %; 3,33 %

và 13,3 %. Trong đó không có mẫu nào nhiễm aflatoxin B1 vượt ngưỡng cho

phép (> 4 µg/kg).

Để biết tỉ lệ mức nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc rang giữa các tỉnh

có khác nhau hay không, sử dụng lệnh prop.test trong chương trình phân mềm phân

tích dữ liệu R. Kết quả phân tích thống kê như bảng 3.6.

Bảng 3. 6. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang

Chỉ tiêu đánh giá

Tỉ lệ nhiễm (%)

2

Giá trị p

Nghệ An Thanh Hóa Bắc Giang

30,0

23,3

36,7

1,2698

0,53

Tổng số bào tử nấm men-mốc

Aflatoxin

6,67

3,33

13,3

2,1687

0,3381

Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc củ của các tỉnh như sau: 30,0 % tại Nghệ

An; 23,3 % tại Thanh Hóa và 36,7 % tại Bắc Giang, tuy nhiên kiểm định 2 cho biết

trên phương diện thống kê, các tỉ lệ này không khác nhau, vì trị số p = 0,53.

Tỉ lệ nhiễm aflatoxin trong lạc nhân của các tỉnh như sau: 6,67 % tại Nghệ An;

3,33 % tại Thanh Hóa và 13,3 % tại Bắc Giang, tuy nhiên kiểm định 2 cho biết trên

phương diện thống kê, các tỉ lệ này không khác nhau, vì trị số p = 0,3381.

Kết quả cũng cho thấy:

- Mức nhiễm nấm men-mốc của lạc rang trong ba tỉnh nằm trong khoảng 1,1×101

đến 1×103 CFU/g, mức nhiễm này thấp hơn nhiều so với trong lạc nhân (1,3×101

- 9,3×108 CFU/g) và trong lạc củ (1,1×101 - 7,5×108 CFU/g). Tỉ lệ số mẫu nhiễm

nấm men-mốc trong khoảng 26,7 - 40,0 % cũng thấp hơn trong lạc nhân (46,7 -

60 %) và trong lạc củ (43,3 - 56,7 %).

- Mức nhiễm aflatoxin trong lạc rang húng lìu trong khoảng 0,65 - 2,3 g/kg. Mức

nhiễm này thấp hơn nhiều trong lạc nhân (0,34 – 10.498 g/kg) và trong lạc củ

(0,64 - 215 g/kg). Tỉ lệ nhiễm aflatoxin trong lạc rang húng lìu trong ba tỉnh

nằm trong khoảng 6,7 - 13,3 %, thấp hơn nhiều trong lạc nhân (30 - 53,3 %) và

trong lạc củ (26,7 - 40 %), không có mẫu nào vượt ngưỡng cho phép (4 g/kg).

Kết quả tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc của lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu tại 3

tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang được biểu diễn như hình 3.1.

Hình 3. 1. Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang

Biểu đồ hình 3.1 cho thấy tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong các mẫu lạc nhân thu

thập tại các tỉnh đều là cao nhất, sau đó đến lạc củ và thấp nhất là lạc rang húng lìu.

Tỉ lệ các mẫu có mức nhiễm nấm men-mốc vượt ngưỡng cho phép (>102 CFU/g),

thấp nhất trong lạc rang húng lìu, sau đó đến lạc củ và cao nhất trong lạc nhân. Điều

này chứng tỏ lạc đã qua chế biến có thể giảm mức nhiễm nấm men-mốc.

Kết quả tỉ lệ nhiễm aflatoxin trong lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu được

biểu diễn như hình 3.2.

Hình 3. 2. Tỉ lệ nhiễm AF trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang

Biểu đồ hình 3.2 cho thấy tỉ lệ nhiễm AF trong các mẫu lạc nhân thu thập tại

các tỉnh đều là cao nhất, sau đó đến lạc củ và thấp nhất là lạc rang húng lìu. Tỉ lệ

các mẫu có mức nhiễm AF vượt ngưỡng cho phép (> 8 µg/kg) cao nhất trong lạc

nhân, sau đó đến lạc củ, không có mẫu lạc rang húng lìu nào có hàm lượng AF vượt

ngưỡng cho phép (> 4 µg/kg). Đều này chứng tỏ lạc đã qua chế biến có nguy cơ

nhiễm AF thấp hơn lạc chưa chế biến.

Nghiên cứu tiếp theo được thực hiện thu thập mẫu vào mùa thu, trên địa tỉnh

Bắc Giang, tại huyện Lục Nam. Lục Nam là một huyện miền núi có diện tích trồng

lạc lớn ở Bắc Giang. Các mẫu lạc nhận và lạc củ thu thập được đánh giá mức độ

nhiễm nấm mốc và AF.

3.1.2. Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và AF trong lạc trên địa bàn huyện

Lục Nam, tỉnh Bắc Giang vào mùa thu

Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin thực hiện với 30 mẫu lạc nhân

và 30 mẫu lạc củ được thu thập tại các hộ gia đình và hộ kinh doanh lạc của huyện

Lục Nam, tỉnh Bắc Giang như mô tả trong mục 2.2.

Quá trình thu thập mẫu được thực hiện ghi chép tình trạng mẫu với từng mẫu

lấy, tình trạng bảo quản trước khi lấy mẫu như mục 2.3.3.

Các mẫu phân tích tổng số bào tử nấm, nghiên cứu chỉ thực hiện đếm những

khuẩn lạc của nấm mốc, là những khuẩn lạc có sợi khí sinh, như hình 3.3.b) và 3.3.c).

Hình 3. 3. Các đĩa nuôi cấy: a) không có nấm mốc; b) và c) có nấm mốc và nấm men

3.1.2.1. Mức độ nhiễm aflatoxin và các yếu tố nguy cơ nhiễm aflatoxin trên mẫu

lạc nhân

Kết quả khảo sát thực trạng sử dụng công cụ chứa đựng bảo quản lạc nhân, tình

trạng mẫu, độ ẩm, mức độ nhiễm nấm mốc, hàm lượng aflatoxin và thông tin về mẫu

lạc nhân được tổng hợp trong bảng PL 1.4 tại Phụ lục 1.

Kết quả khảo sát cho thấy đa số người dân sử dụng bao tải hai lớp để chứa đựng

và bảo quản lạc nhân (14/30) chiếm tỉ lệ 46,7 %; sau đó đến bao tải một lớp (10/30)

chiếm tỉ lệ 33,3 %; 3 trường hợp đựng trong bao nilon, chiếm tỉ lệ 10 %; còn lại 10

% chứa trong các loại dụng cụ khác (chậu, rổ tre và đổ dưới sàn nhà).

Độ ẩm các mẫu lạc nhân trong khoảng 5,1 - 12,8 %. Các mẫu phát hiện nhiễm

AF có độ ẩm từ 9,5 % trở lên. Các mẫu nhiễm AF đều phát hiện nhiễm nấm mốc và

không được bảo quản trong bao tải hai lớp.

Tổng số bào tử nấm mốc phát hiện trong 15/30 mẫu lạc nhân trong khoảng

1,0×101-7,0×103 CFU/g (chiếm tỉ lệ 50 %), thấp hơn mẫu thu thập mùa hè (60 %). Số

mẫu vượt ngưỡng 102 CFU/g là 10 mẫu (chiếm tỉ lệ 33,3 %).

Hàm lượng AF phát hiện trong 14/30 mẫu lạc nhân trong khoảng 0,66-115 µg/kg

(chiếm 46,7 %), tỉ lệ này thấp hơn so với mẫu thu thập vào mùa hè (53,3 %) tại cùng

địa bàn Bắc Giang. Sự khác biệt này do đặc điểm khí hậu trong thời gian bảo quản

của mẫu thu thập vào mùa hè nóng ẩm, còn mẫu thu thập mùa thu được bảo quản

trong thời gian khí hậu mát mẻ và khô ráo hơn. Hàm lượng AFB1 phát hiện từ 0,66 -

115 µg/kg, trong đó có 2/30 mẫu (6,7 %) có hàm lượng AFB1 vượt quá ngưỡng cho

phép (>8 g/kg) theo QCVN 8-1:2011/BYT.

Mối liên quan giữa tình trạng mẫu và tình trạng nhiễm aflatoxin được đánh giá

thông qua tỉ số nguy cơ (RR) với tiêu chí đánh giá là mẫu lạc phát hiện aflatoxin. Các

yếu tố bất lợi trong lạc nhân được giả thiết gồm: hạt vỡ, lép/nhăn, có màu khác

thường, không dóc vỏ, có mầm. Các yếu tố có lợi: nguyên hạt, hạt mẩy, hạt dóc vỏ

lụa. So sánh hai nhóm yếu tố có lợi và bất lợi. Kết quả tỉ số nguy cơ như bảng 3.7.

Bảng 3. 7. Tỉ số nguy cơ nhiễm AF với tình trạng của mẫu lạc nhân

Các thông số

Hạt

Màu sắc

Có mầm Mức độ khô

Độ căng của hạt

vỡ

mẩy

có

không

nguyên nhăn/ lép

biến màu

bình thường

không dóc vỏ

dóc vỏ

Số mẫu nhiễm AF (a)

Tổng số mẫu (N) 18

Nguy cơ p=a/N p1 = 0,67

p2 = 0,17

p1 = 0,75

p2 = 0,28

p1 = 0,75

p2 0,36

p1 = 1,00

p2 = 0,38

p1 0,72

p2 = 0,08

4,0

2,7

2,1

2,6

8,7

Tỉ số nguy cơ (RR=p1/p2)

Kết quả cho thấy các tỉ số nguy cơ đã tính toán đều có giá trị RR >1. Chứng tỏ

các yếu tố về tình trạng mẫu như: nguyên hạt, hạt mẩy, hạt dóc vỏ lụa đều là các yếu

tố có lợi và có khả năng giảm nguy cơ nhiễm AF trong lạc.

Kết quả tại bảng 3.7 cũng cho thấy các mẫu thỏa mãn cả 3 yếu tố có lợi về tình

trạng mẫu (hạt mẩy, nguyên hạt, hạt dóc vỏ lụa) đều là những mẫu không phát hiện

nhiễm AF trong lạc nhân.

Những mẫu có lạc nhân phát hiện nhiễm AF có độ ẩm từ 9,2 % trở lên, các mẫu

có thể dóc vỏ lụa có độ ẩm trong khoảng từ 5,1 - 7,2 %.

3.1.2.2. Mức độ nhiễm và các yếu tố nguy cơ nhiễm aflatoxin trên mẫu lạc củ

Kết quả khảo sát thực trạng sử dụng công cụ chứa đựng bảo quản lạc củ, tình

trạng mẫu, độ ẩm, mức độ nhiễm nấm mốc, hàm lượng aflatoxin và thông tin về mẫu

lạc củ được tổng hợp trong bảng PL 1.5 tại Phụ lục 1.

Qua ghi chép trong quá trình lấy mẫu cho thấy, đa số các trường hợp lạc củ được

bảo quản trong bao tải hai lớp (22/30) chiếm tỉ lệ 73,3 %, còn lại 8/30 trường hợp

(26,7 %) sử dụng bao tải một lớp. So sánh cách thức bảo quản lạc nhân và lạc củ trên

cùng địa bàn cho thấy, lạc củ thường được đóng trong bao tải hai lớp là chính, một

phần đóng trong bao tải một lớp vì lạc củ được người dân bảo quản trong thời gian

dài hơn, đến vụ sau hoặc để làm giống. Còn lạc nhân thường chuẩn bị ở dạng thương

phẩm hoặc sử dụng trong thời gian ngắn hơn nên bao bì chứa đựng đa dạng hơn.

Các mẫu lạc củ khảo sát có độ ẩm từ 5,94 - 10,19 %, trong đó các mẫu phát

hiện aflatoxin có độ ẩm từ 8,70 % trở lên và đều phát hiện có nấm mốc.

Phát hiện nấm mốc trong 8/30 mẫu lạc củ với mức 1×101 - 3×102 CFU/g (chiếm

tỉ lệ 26,7 %).

Hàm lượng AFB1 phát hiện từ 0,46 - 2,5 µg/kg trong 8/30 mẫu lạc củ (chiếm

tỉ lệ 26,7 %), tuy nhiên không có mẫu nào bị vượt quá giới hạn cho phép theo QCVN

8-1:2011/BYT. Tỉ lệ này thấp hơn trong mẫu thu thập vào mùa hè tại Bắc Giang (40

%). Trong số 8 mẫu phát hiện AFB1 chỉ có 1 mẫu phát hiện AFB2 (chiếm tỉ lệ 3,3

%). Không phát hiện AFG1 và AFG2 trong 30 mẫu thu thập.

Mối liên quan giữa tình trạng mẫu tại thời điểm lấy mẫu và tình trạng nhiễm

aflatoxin được đánh giá thông qua tỉ số nguy cơ (RR) với tiêu chí đánh giá là phát

hiện aflatoxin trong mẫu. Trong mẫu lạc củ chúng ta giả thiết các biến cố bất lợi bao

gồm: lạc không sạch (có lẫn tạp), có củ mốc. Các yếu tố có lợi là: lạc sạch, không bị

mốc. Chúng ta tiến hành so sánh hai nhóm: nhóm có yếu tố có lợi và nhóm có yếu tố

không có lợi. Kết quả tỉ số nguy cơ thể hiện trong bảng 3.8.

Bảng 3. 8. Tỉ số nguy cơ nhiễm AF với tình trạng của mẫu lạc củ

Độ sạch

Có hạt mốc

Các thông số

có tạp

sạch

không

có

Số mẫu nhiễm AF (a)

Tổng số mẫu (N)

Nguy cơ p=a/N

p1 = 0,71

p2 = 0,09

p1 = 1,00

p2 =0,18

8,2

5,6

Tỉ số nguy cơ (RR=p1/p2)

Kết quả cho thấy các tỉ số nguy cơ đã tính toán đều có giá trị RR >1. Chứng tỏ

các yếu tố về tình trạng mẫu như: lạc sạch, lạc không có hạt mốc đều là các yếu tố có

lợi và có khả năng giảm nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc.

Như vậy, các yếu tố chất lượng để kiểm soát nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc

nhân bao gồm: nguyên hạt, hạt mẩy, hạt dóc vỏ lụa; trong lạc củ bao gồm: lạc sạch,

lạc không có củ mốc.

Mức nhiễm nấm mốc, tỉ lệ nhiễm và hàm lượng aflatoxin trong các mẫu lạc

nhân và lạc củ lấy vào mùa hè cao hơn mẫu lấy tại mùa thu tại cùng địa bàn lấy mẫu.

Nguyên nhân sự khác biệt này có thể do khí hậu mùa hè nóng ẩm thích hợp cho nấm

mốc phát triển và sinh AF, mặt khác những mẫu lấy vào mùa hè là mẫu thu thập

ngoài chợ, các mẫu lấy vào mùa thu là mẫu thu thập tại các hộ gia đình và hộ kinh

doanh lạc nên điều kiện bảo quản lạc cũng tốt hơn điều kiện bảo quản ngoài chợ.

Như vậy, kết quả nghiên cứu 3.1.1. và 3.1.2. cho thấy:

- Không phát hiện aflatoxin G1 và G2 trong các mẫu lạc thu thập tại các tỉnh

nghiên cứu.

- Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc không tỉ lệ thuận với tỉ lệ nhiễm aflatoxin

trong lạc.

- Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin tại các tỉnh khác biệt không có ý nghĩa

thống kê.

- Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin tại Bắc Giang trong lạc thu thập vào mùa

hè cao hơn các mẫu thu thập vào mùa thu.

3.1.3. Phân lập và xác định chủng sinh aflatoxin trên lạc

3.1.3.1. Phân lập khuẩn lạc nghi là Aspergillus flavus từ lạc mốc

Các mẫu lạc dùng để phân lập nấm lấy từ 23 mẫu có phát hiện nấm nghi ngờ là

A. flavus trong nghiên cứu 3.1.2 ở trên. Có nhiều nấm mốc có màu sắc khác nhau,

màu vàng xanh, màu trắng, màu đen được phát hiện trong quá trình cấy hạt lạc trên

môi tường thạch. Các mẫu phát hiện nấm nghi là A. flavus theo như đặc điểm hình

thái về màu sắc của khuẩn lạc phù hợp với kết quả nghiên cứu của Matome Gabriel

Thathana và cộng sự [81], trên môi trường SDA bào tử nấm có màu vàng xanh, mặt

sau có vết loang hình rãnh màu nâu nhạt (hình 3.4).

Hình 3. 4. Mặt trước (a) và mặt sau (b) của đĩa nuôi cấy sau 3 ngày

Quá trình nuôi cấy để phân lập khuẩn lạc, nghiên cứu thu được 28 chủng nghi

ngờ là A. flavus được đánh số từ A1 đến A28. Các khuẩn lạc nghi ngờ và chủng chuẩn

A. flavus ATCC 204304 được nuôi cấy trên môi trường SDA ở 25 oC để so sánh đặc

điểm hình thái. Sau 3 ngày nuôi cấy, các chủng có hình thái quan sát được tương đồng

với chủng chuẩn được chọn để theo dõi, dưới đây là hình ảnh của các chủng phân lập

từ mẫu A1, A12, A14, A15 và A28 (Hình 3.5).

Hình 3. 5. Hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường SDA

Các chủng nghi ngờ được lấy khuẩn lạc cho bước làm thuần chủng sau đây.

3.1.3.2. Làm thuần và định danh Aspergillus flavus thông qua cấu tạo hình thái

Để làm thuần và nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu tạo vi thể,

những khuẩn lạc này được xác định lại bằng cách cấy điểm trên môi trường SDA nuôi

ở 25±1 oC sau 5 ngày. Hình ảnh cấy điểm của chủng phân lập từ chủng A1 và chủng

đối chứng ATCC204304 như hình 3.6.

Hình 3. 6. Chủng phân lập từ lạc (a, b) và ATCC 204304 (c) cấy điểm trên SDA sau 5 ngày

Các chủng sau phân lập được làm tiêu bản nhuộm Lactophenol Amann, soi dưới

kính hiển vi quang học, so với các đặc điểm của chủng đối chứng. Kết quả có 20

chủng phân lập được có đặc điểm tương đồng với đặc điểm của A. flavus ATCC

204304 như: Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 lớp và 2 lớp, thân nhám, bào tử hình

cầu hoặc gần cầu, đó là: A1÷A10, A12÷A16, A18, A21, A25, A26 và A28.

Hình thái của nấm A. flavus thu được sau phân lập của mẫu A1 được chụp bằng

kính hiển vi CX31 xuất xứ Nhật bản với độ khuếch đại 40 lần (Hình 3.7. a, b) và kính

hiển vi soi ngược Axiovert 40 CFL xuất xứ Đức có độ khuếch đại 250 đến 1.000 lần

(Hình 3.7. c, d). Kết quả hình thái nấm: Bông hình chùy đến cầu, tạo cột, thể bình 1

hoặc 2 lớp; Bào tử đính hình cầu đến gần cầu, màu xanh nhạt, đường kính 3-6 µm.

Hình 3. 7. Bọng nấm hình chùy đến cầu, thể bình 1 lớp (a), thể bình hai lớp (b); Bào tử nấm hình cầu

đến gần cầu, màu xanh (c,d)

Để thu được kết quả chính xác nhất chúng tôi đã tiến hành chụp ảnh hiển vi điện

tử quét, bào tử đính của chủng nấm nghi ngờ là A. flavus như hình 3.8.

Hình 3. 8. Ảnh hiển vi điện tử quét chủng nấm A1

Hình 3.8 cho thấy cuống bào tử xù xì, đường kính 12,9 µm, Kết quả ảnh hiển vi

điện tử quét được so sánh với kết quả của Rodrigues P. và cộng sự [101] cho thấy đây

là bào tử đính điển hình của A. flavus.

Dựa vào đặc điểm hình thái của 20 chủng nấm lựa chọn để soi tiêu bản và chụp

ảnh kính hiển vi điện tử, chúng tôi chọn được 11 chủng bao gồm: A1, A3, A6, A12,

A14, A15, A16, A18, A21, A25 và A28. Các chủng này sẽ tiếp tục định danh ở bước

tiếp theo.

3.1.3.3. Định danh nấm Aspergillus flavus bằng giải trình tự gen ITS

a) Tách chiết và nhân DNA

DNA tổng số của 11 chủng đã chọn ở trên và A. flavus ATCC 204304. Chất

lượng của các mẫu DNA tổng số được kiểm tra theo phương pháp đo quang phổ hấp

thụ ở bước sóng λ= 260 và 280 nm (bảng 3.9).

Bảng 3. 9. Nồng độ DNA sau khi tách chiết của các chủng

Chủng

Nồng độ (ng/ µL)

A260/A280

20,39

1,87

46,99

1,94

62,62

1,83

A12

20,52

1,88

A14

38,88

2,03

A15

53,25

1,86

A16

42,86

1,91

A18

46,80

1,87

A21

69,21

2,05

A25

40,60

2,12

A28

35,63

2,01

57,32

1,81

A. flavus ATCC 204304

Có thể thấy rằng các mẫu DNA đều có tỷ số A260/280 trong khoảng 1,8 đến 2,2

chứng tỏ DNA thu được sạch, không lẫn protein và RNA. Như vậy các mẫu DNA

tổng số thu được theo phương pháp tách chiết này đảm bảo chất lượng.

Các mẫu DNA tổng số được sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng PCR đặc hiệu

với cặp mồi ITS1 và ITS2. Các mẫu DNA tổng số thu được có nồng độ phù hợp được

dùng là khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS2. Kết quả điện di

sản phẩm của phản ứng PCR (hình 3.9).

Hình 3. 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS; (+): Đối chứng A. flavus ATCC 204304, (-): Đối

chứng âm

Trên hình 3.9: Băng M là băng thang chuẩn DNA có kích thước từ 100 đến 1500

bp, băng sáng nhất ở giữa có kích thước 650 bp, các mẫu băng lên rõ ràng, không có

băng phụ, kích thước đoạn ITS 600 bp phù hợp với kết quả trong nghiên cứu của tác

giả P. Rodrigues và cộng sự [101], và thích hợp để giải trình tự.

b) Giải trình tự gen ITS

Chúng tôi chọn 5 sản phẩm PCR từ 5 chủng A1, A12, A14, A15 và A28 để giải

trình tự. Dựa vào mức độ tương đồng giữa chủng phân tích và chủng đã công bố trên

ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh và dùng phần mềm BLAST để so sánh độ

tương đồng. Kết quả tìm kiếm sự tương đồng như trong bảng 3.10.

Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế

Loài xác định

Mẫu nấm

Đoạn ADN so sánh

Chủng, trình tự trên ngân hàng gen quốc tế

Phần trăm đoạn so sánh (%)

Mức đồng nhất trình tự (%)

TUHT115

ITS1, ITS2 Aspergillus flavus

100

A12 KP214054.1

ITS1, ITS2 Aspergillus flavus

100

A15 MTCC 8654

ITS1, ITS2 Aspergillus flavus

100

A16 ZJ4-A

ITS1, ITS2 Aspergillus flavus

100

A28

ITS1, ITS2 Không định được loài

Không có trình tự tương đồng

Trong 5 chủng được giải trình tự có 4 chủng được định danh là A. flavus và 1

chủng chưa định danh được do trình tự gen không tương thích với ngân hàng gen. Từ

kết quả trong bảng 3.10, chúng tôi lựa chọn 3 chủng để kiểm tra khả năng sinh

Aflatoxin trên lạc bao gồm: A1, A12 và A15.

c) Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của các chủng phân lập được từ lạc

Sau khi định danh được A. flavus, các chủng A1, A12 và A15 được thu thập và

nhiễm vào lạc nhân đã tiệt trùng trong 10 ngày với mức nhiễm 107 CFU/g. Dựa vào

đặc tính phát quang của aflatoxin, mẫu này sau đó được quan sát sự phát huỳnh quang

của mẫu để xác định mẫu có nhiễm aflatoxin không. Kết quả quan sát dưới đèn UV

(bước sóng 365 nm) được thể hiện trên hình 3.10.

Hình 3. 10. Mẫu lạc nhiễm A. flavus BG1 phát huỳnh quang sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 oC

Sau khi quan sát dưới đèn UV, những vùng phát quang màu xanh lam cho thấy

đã có aflatoxin được sinh ra. Mẫu tiếp tục được tiến hành phân tích hàm lượng

aflatoxin bằng LC-MS/MS, kết quả phát hiện AFB1 và AFB2 trên các mẫu như sau:

Bảng 3. 11. Khả năng sinh AF của ba chủng phân lập từ lạc

Chủng nấm

Hàm lượng AFB1 (µg/kg)

Hàm lượng AFB2 (µg/kg)

25,2

1310

23,7

A12

975

22,8

A15

763

Kết quả tại bảng 3.11 cho thấy các chủng phân lập được chỉ phát hiện sinh AFB1

và AFB2, kết quả này tương tự kết quả nghiên cứu của E.M. Embaby và Mona M.

Abdel-Galel [50], chỉ phát hiện AFB1 và AFB2 sinh ra từ chủng A. flavus phân lập

từ lạc. Trong đó, chủng A1 có khả năng sinh AFB1 mạnh mẽ nhất tới 1.310 µg/kg.

Sắc đồ phân tích aflatoxin trong lạc của chủng A1 như hình 3.11.

Hình 3. 11. Sắc đồ AFB1 của chuẩn (a) và mẫu (c); sắc ký đồ AFB2 của chuẩn (b) và mẫu (c)

Để xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của A. flavus và sinh

độc tố trên lạc, chủng A1 phân lập được từ nghiên cứu này được lưu trữ để phục vụ

cho các nghiên cứu tiếp theo, chủng này sau đây được gọi là Aspergillus flavus BG1.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trên lạc

của Aspergillus flavus BG1

3.2.1. Đánh giá sự thay đổi độ ẩm của các mẫu lạc trong các loại bao bì

khác nhau

Thiết kế nghiên cứu sự thay đổi độ ẩm của lạc trong các bao bì khác nhau như

mục 2.6. Kết quả độ ẩm của lạc được tổng hợp trong bảng 3.12.

Bảng 3. 12. Sự thay đổi độ ẩm của mẫu lạc nhân trong các bao bì khác nhau

Độ ẩm lạc nhân (%)

Độ ẩm lạc củ (%)

Độ ẩm/ tháng

T0

T1

T2

T3

T4

T0

T1

T2

T3

T4

Loại bao bì

Bao đay

6,35 6,43

6,56

7,68

7,68 6,35

6,56

7,09 7,72 7,79

Bao tải hai lớp 7,48 7,61

7,63

7,87

8,08 5,18

5,74

6,41 6,52 6,57

Túi PE

6,29 6,31

6,65

6,60

6,55 5,54

5,78

6,73 6,88 7,00

Túi PVC

6,37 6,42

6,46

6,52

6,66 5,60

5,72

6,40 6,57 6,59

Ghi chú: T0 là độ ẩm ban đầu trước khi đưa vào bảo quản

T1, T2, T3, T4 là độ ẩm sau 1, 2, 3, 4 tháng bảo quản.

Kết quả cho thấy:

- Độ ẩm của lạc nhân sau 4 tháng thay đổi nhiều đối với lạc đựng trong bao đay

và bao PE (chênh độ ẩm sau 4 tháng là 19,0 và 8,8 %) còn với bao tải hai lớp và

bao PVC thì chênh lệch độ ẩm đều là 4,0 %.

- Độ ẩm của lạc củ sau 4 tháng thay đổi nhiều đối với lạc đựng trong bao đay và

bao PE (chênh độ ẩm sau 4 tháng là 20,4 và 9,8 %) còn với bao tải hai lớp và

bao PVC thì chênh lệch độ ẩm tương ứng là 2,9 và 2,2 %.

Qua kết quả trên ta thấy, quá trình hô hấp của lạc khô không mạnh mẽ nên không

thay đổi độ ẩm nhiều sau 4 tháng bảo quản. Ta cũng thấy lạc đựng trong bao bì hai

lớp hoặc bao bì PVC có độ ẩm chênh lệch giữa tháng đầu tiên và tháng thứ tư ít hơn

bao đay và bao PE. Điều đó chứng tỏ bao hai lớp và bao PVC ngăn thấm khí tốt.

Lạc khô đưa vào bảo quản trong bao bì kín thay đổi độ ẩm không đáng kể. Sự

thay đổi độ ẩm của lạc trong bao PVC là thấp nhất.

3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển và sinh AF của chủng

Aspergillus flavus BG1 trên lạc

Thí nghiệm được tiến hành như mô tả trong mục 2.6.2.

3.2.2.1. Sự phát triển của Aspergillus flavus BG1 ở các độ ẩm khác nhau

Kết quả theo dõi sự phát triển của A. flavus BG1 trong 4 tuần đầu được ghi chép

cùng với ghi nhận kết quả soi UV ở bước sóng 365 nm như trong Bảng 3.13.

Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của A. flavus BG1 và sinh AF

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Độ ẩm (%)

Ký hiệu Quan sát

Soi UV

Tuần 1

không quan sát thấy có nấm phát triển

M11

không quan sát thấy có nấm phát triển

M12

không quan sát thấy có nấm phát triển

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Độ ẩm (%)

Ký hiệu Quan sát

Soi UV

M13

thưa thớt

vàng nhạt

có 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm màu vàng nhạt thưa thớt quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

M14

thưa thớt

vàng nhạt

có 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm màu vàng nhạt thưa thớt quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

M15

thưa thớt

trắng

có 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

Tuần 2

không quan sát thấy có nấm phát triển

M11

không quan sát thấy có nấm phát triển

M12

không quan sát thấy có nấm phát triển

M13

thưa thớt

vàng xanh

có nấm màu vàng xanh quanh hạt lạc, một số sợi nấm chuyển sang xanh lục, có 1 số sợi nấm trắng xuất hiện

M14

thưa thớt

vàng nhạt, vàng xanh

có nấm màu vàng nhạt quanh hạt lạc, 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm vàng xanh thưa thớt, có 1 số có sợi nấm trắng

M15

thưa thớt

trắng

có nấm trắng xung quanh hạt lạc

Tuần 3

không quan sát thấy nấm phát triển

6 M11

thưa thớt

vàng nhạt nấm vàng nhạt phát triển thưa thớt, sợi

ngắn, sợi mỏng

8 M12

thưa thớt

vàng nhạt nấm vàng nhạt phát triển thưa thớt, sợi

ngắn, mỏng manh

10 M13

mọc nhiều

vàng xanh, xanh lục

nấm màu vàng xanh xung quanh hạt, sợi mỏng, ngắn, có một số nấm chuyển màu xanh lục, phát hiện một số nấm trắng

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Soi UV

Độ ẩm (%)

Ký hiệu Quan sát

12 M14

thưa thớt

vàng nhạt

nấm vàng lẫn vàng xanh, nấm trắng rải rác khắp các vị trí

14 M15

thưa thớt

trắng

nấm trắng xuất hiện nhiều rải rác khắp các vị trí

Tuần 4

không quan sát thấy nấm phát triển

M11

thưa thớt

vàng nhạt

sợi nấm vàng nhạt mọc lưa thưa, mỏng manh

M12

thưa thớt

vàng nhạt, vàng xanh

sợi nấm vàng nhạt mọc lưa thưa, mỏng manh

M13

mọc nhiều

vàng xanh, xanh lục

nấm màu vàng xanh xung quanh hạt, sợi mỏng, ngắn, có một số nấm chuyển màu xanh lục, một số nấm trắng

M14

C mọc rõ rệt vàng nhạt,

nấm vàng lẫn vàng xanh, nấm trắng rải rác khắp các vị trí

trắng

M15

mọc nhiều

nấm trắng xuất hiện nhiều rải rác khắp các vị trí

Ghi chú:

C: có quan sát thấy nấm/ có phát quang; K: không quan sát thấy nấm / không phát quang

Mẫu chứng C1: có độ ẩm 5,98 % và không nhiễm A. flavus

Mẫu chứng C2: có độ ẩm 5,98 % và nhiễm A. flavus ở mức 103 CFU/g

- Các mẫu đối chứng C1 và C2 là các mẫu có độ ẩm ban đầu 3,2 % không quan

sát thấy nấm phát triển trong 16 tuần nghiên cứu.

- Các mẫu có độ ẩm 6 % không quan sát thấy nấm phát triển trong 2 tuần đầu,

nấm bắt đầu phát triển từ tuần thứ 4 nhưng ở mức độ thưa thớt và có màu vàng

nhạt, sau tuần thứ năm nấm bắt đầu chuyển sang màu vàng xanh và không phát

triển thêm vào các tuần tiếp theo.

- Các mẫu có độ ẩm 8 % không quan sát thấy nấm phát triển trong 2 tuần đầu,

nấm bắt đầu phát triển từ tuần thứ 4 nhưng ở mức độ thưa thớt và có màu vàng

nhạt, sau tuần thứ tư nấm bắt đầu chuyển sang màu vàng xanh và không phát

triển thêm vào các tuần tiếp theo.

- Các mẫu có độ ẩm 10 %, 12 % và 14 %, nấm bắt đầu xuất hiện thưa thớt màu

vàng xanh ngay từ tuần đầu tiên, và bắt đầu chuyển sang màu xanh từ tuần thứ

hai, một phần chuyển sang xanh lục từ tuần thứ tư trở đi.

Hình ảnh màu sắc của nấm được mưu tả như hình 3.12.

Hình 3. 12. Màu sắc của A. flavus BG1 phát triển trên lạc

Ngoài việc quan sát sự phát triển của nấm mốc, trong quá trình nghiên cứu các

mẫu thí nghiệm được soi UV ở bước sóng 365 nm và phân tích hàm lượng aflatoxin.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm tới mức độ nhiễm aflatoxin trên lạc

Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm tại bảng

PL2.1 trong Phụ lục 2, một số sắc đồ phân tích aflatoxin trong các mẫu nghiên cứu

tại phụ lục 4. Kết quả cho thấy:

- Các mẫu chứng C1 và C2 không phát hiện sinh AF sau 16 tuần nghiên cứu.

- Các mẫu có độ ẩm 6 % và 8 % không phát hiện sinh AF sau 16 tuần nghiên cứu.

- Chỉ phát hiện AFB1 và AFB2, không phát hiện AFG1 và AFG2 trong các mẫu

nghiên cứu. Các mẫu có độ ẩm 10 %, 12 % và 14 % phát hiện sinh AFB1 sau 2

tuần nghiên cứu, hàm lượng AF sinh ra theo thời gian (hình 3.13).

AF (µg/kg)

AFB1-10%

AFB1-12%

AFB1-14%

ML-AFB1

ML-AFs

AFs-10%

AFs-12%

AFs-14%

0 Thời gian (Tuần)

Hình 3. 13. Biểu đồ AFB1 và AF tổng số trong các mẫu có độ ẩm khác nhau; AFB1-10% (mẫu có độ

ẩm 10 %); AFs-10% (mẫu có độ ẩm 10%); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs

(Ngưỡng cho phép của AF tổng số)

- Sau 2 tuần nghiên cứu, các mẫu có độ ẩm 10 %, 12 % và 14 % phát hiện sinh

AFB1 nhưng dưới ngưỡng cho phép (>8 g/kg) theo QCVN 8-1:2011/BYT. Sau

4 tuần các mẫu thí nghiệm có độ ẩm từ 10 % đến 14 % đều có hàm lượng AFB1

vượt ngưỡng cho phép. Các mẫu thí nghiệm vượt ngưỡng cho phép trên 2 lần

sau 10 tuần đối với các mẫu có độ ẩm 12 % (gấp 2,0 lần) và 14 % (gấp 2,1 lần)

còn mẫu có độ ẩm 10 % sau 12 tuần (gấp 2,97 lần). Các mẫu độ ẩm từ 10 % đến

14 % đều có hàm lượng AFB1 vượt ngưỡng cho phép trên 3 lần sau 14 tuần đối

với các mẫu có độ ẩm 12 % (gấp 3,23 lần) và 14 % (gấp 3,47 lần) còn mẫu có

độ ẩm 10 % sau 16 tuần (gấp 3,24 lần). Sau 16 tuần hàm lượng AFB1 của các

mẫu có độ ẩm 12 % cao gấp 4,47 lần và các mẫu có độ ẩm 14 % cao gấp 3,61

lần so với ngưỡng cho phép.

- Chỉ phát hiện AFB2 trong các mẫu độ ẩm 14 % sau 4 tuần thí nghiệm , nhưng

đến tuần thứ 6 bắt đầu phát hiện được AFB2 trên các mẫu độ ẩm 10 %, 12 % và

14 %. Hiện các văn bản quy phạm pháp luật không quy định ngưỡng cho phép

cho riêng AFB2. Hàm lượng AF tổng số bắt đầu vượt ngưỡng cho phép (>15

µg/kg) ở tất cả các mẫu sau 8 tuần nghiên cứu. Các mẫu thí nghiệm vượt ngưỡng

cho phép trên 2 lần sau 16 tuần đối với các mẫu có độ ẩm 10 % (gấp 2,37 lần),

mẫu có độ ẩm 12 % (gấp 2,49 lần) và 14 % (gấp 2,97 lần).

Kết quả cho thấy, lạc có độ ẩm 6 % và 8 % không phải là điều kiện thuận lợi

cho nấm sinh độc tố phát triển. Với độ ẩm từ 10 % và 12 % nấm phát triển tốt và sinh

độc tố AFB1 sau 2 tuần, sinh AFB2 sau 8 tuần. Với độ ẩm 14 % nấm phát triển tốt

và sinh độc tố AFB1 sau 2 tuần, phát hiện AFB2 sau 4 tuần và định lượng được AFB2

sau 6 tuần. Các mẫu có độ ẩm 10 %, 12 % và 14 % phát hiện hàm lượng AFB1 vượt

ngưỡng cho phép sau 4 tuần.

Để xác định mối quan hệ giữa độ ẩm và hàm lượng aflatoxin có tuyến tính

không, nghiên cứu thực hiện phân tích hồi quy tuyến tính bằng chương trình R 3.4.1,

trong đó hàm lượng AFB1 là biến phụ thuộc và các biến liên tục là phần trăm độ ẩm

bắt đầu từ 10 % và thời gian theo tuần. Kết quả phân tích như trong mục 3.3.1 tại Phụ

lục 3 cho thấy mối quan hệ giữa độ ẩm và sự sinh AF có ý nghĩa thống kê (p< 0,05).

Ta có phương trình hồi quy tuyến tính quan hệ giữa mức nhiễm AFB1 (Y1) theo độ

ẩm (x1) và thời gian - tuần (x2)như sau:

(13) Y1 = -78,19 + 7,56 x1 + 2,0 x2

Phương trình trình (12) có nghĩa là với độ ẩm từ 10 % trở lên, độ ẩm tăng lên 1

% thì hàm lượng AFB1 tăng lên 7,56 g/kg; thời gian tăng lên thêm 1 tuần thì hàm

lượng AFB1 tăng 2,0 g/kg.

Kết quả phân tích thống kê cũng cho ta phương trình hồi quy tuyến tính quan hệ

giữa mức nhiễm aflatoxin tổng số (Y) theo độ ẩm (x1) và thời gian - tuần (x2) cho

thấy mối liên hệ này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Ta có phương trình tiên đoán

như sau:

(14) Y = -76,91 + 7,24 x1 + 2,6 x2

Phương trình trình (13) có nghĩa là với độ ẩm từ 10 % trở lên, độ ẩm tăng lên

1% thì hàm lượng AF tổng số tăng lên 7,24 g/kg; thời gian tăng lên thêm 1 tuần thì

hàm lượng AFB1 tăng 2,6 g/kg. Như vậy hàm lượng aflatoxin trong các mẫu lạc có

độ ẩm càng tăng thì mức nhiễm càng tăng, nguyên nhân do độ ẩm cao là điều kiện

thuận lợi cho A. flavus phát triển và sinh aflatoxin.

Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm lạc củ của

tác giả Nguyễn Văn Thắng [13] cho thấy độ ẩm càng cao các mẫu lạc có độ ẩm 16 %

có tỉ lệ nhiễm nấm cao nhất, thấp nhất ở độ ẩm 10 %, tuy nhiên nghiên cứu này chưa

đưa ra được mối quan hệ tuyến tính của mức nhiễm aflatoxin với độ ẩm của lạc.

Như vậy ở nhiệt độ 25 oC, độ ẩm từ 10 % là điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát

triển và sinh độc tố AF của A. flavus, độ ẩm càng cao thì mức nhiễm aflatoxin càng

cao, aflatoxin nhiễm trong lạc tăng lên theo thời gian.

3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và sinh AF của

Aspergillus flavus BG1 trên lạc

Thí nghiệm được tiến hành như mô tả trong mục 2.6.2.3.

Các mẫu được được quan sát sự phát triển của nấm A. flavus và soi UV sau mỗi

tuần (kết quả ghi chép như bảng 3.14); phân tích AF sau mỗi 2 tuần.

Bảng 3. 14. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự phát triển của nấm mốc A. flavus BG1

Nhiệt độ

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Ký hiệu

Quan sát

Soi UV

(0C)

Tuần 1

20 M21

không quan sát thấy có nấm màu vàng phát triển, có một số sợi nấm trắng thưa thớt

25 M22

thưa thớt

vàng nhạt

có 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm màu vàng nhạt thưa thớt quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

30 M23

thưa thớt vàng nhạt,

xuất hiện nấm màu vàng sáng mọc thưa thớt sợi nhỏ liti, nấm trắng mọc nhiều hơn

trắng

35 M24

thưa thớt vàng nhạt,

xuất hiện nấm màu vàng sáng mọc thưa thớt sợi nhỏ liti, nấm trắng mọc nhiều hơn

trắng

40 M25

thưa thớt vàng nhạt,

xuất hiện nấm màu vàng sáng mọc thưa thớt sợi nhỏ li ti, nấm trắng mọc nhiều hơn

trắng

Tuần 2

20 M21

thưa thớt

vàng nhạt

quan sát thấy có nấm màu vàng phát triển thưa thớt, có một số sợi nấm trắng thưa thớt

25 M22

mọc nhiều

vàng xanh, xanh lục

nấm mọc rõ nét màu vàng xanh, xanh lục, xen lẫn một số sợi nấm trắng

30 M23

thưa thớt vàng xanh

một số hạt xuất hiện nấm màu vàng xanh, xen lẫn nấm màu trắng

Nhiệt độ

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Ký hiệu

Quan sát

Soi UV

(0C)

35 M24

thưa thớt vàng xanh,

trắng

xuất hiện nấm màu vàng ánh xanh mọc thưa thớt, nấm trắng mọc nhiều hơn

40 M25

thưa thớt vàng nhạt,

trắng

nấm màu vàng sáng mọc thưa thớt sợi nhỏ liti, nấm trắng mọc nhiều hơn

Tuần 3

20 M21

thưa thớt vàng nhạt,

nấm vàng nhạt, sợi mỏng, nhỏ, mỏng manh

25 M22

mọc nhiều

vàng xanh, xanh lục

nấm màu vàng xanh xung quanh hạt, có một số nấm chuyển màu xanh lục, phát hiện một số nấm trắng

30 M23

thưa thớt vàng xanh, vàng nhạt

nấm vàng xanh phát triển thưa thớt, nấm vàng nhạt phát triển ít

35 M24

thưa thớt vàng xanh, vàng nhạt

nấm vàng xanh phát triển trên những hạt lạc bị tổn thương, nấm vàng sáng phát triển thưa thớt

40 M25

thưa thớt

vàng nhạt

nấm vàng nhạt phát triển lấm tấm, sợi mỏng, ngắn

Tuần 4

20 M21

thưa thớt

vàng nhạt

nấm vàng nhạt, sợi mỏng, nhỏ, mỏng manh, nấm vàng xanh phát triển thưa thớt ở 1 số hạt lạc

25 M22

mọc nhiều

vàng xanh, xanh lục

nấm màu vàng xanh xung quanh hạt, có một số nấm chuyển màu xanh lục, một số nấm trắng

30 M23

thưa thớt

Vàng, vàng xanh, trắng

nấm vàng xanh phát triển thưa thớt, nấm vàng nhạt phát triển ít, xuất hiện nấm trắng mọc vượt lên

35 M24

thưa thớt vàng xanh, vàng nhạt

nấm vàng có ánh xanh phát triển trên 1 số hạt lạc, nấm vàng sáng phát triển thưa thớt

40 M25

thưa thớt

vàng nhạt

nấm vàng nhạt phát triển lấm tấm, sợi mỏng manh, ngắn

Ghi chú: C: có quan sát thấy nấm/ có phát quang; K: không quan sát thấy nấm /không phát quang

Kết quả quan sát hàng tuần cho thấy:

Các mẫu bảo quản ở 20 oC nấm phát triển chậm, trong vòng 2 tuần đầu chỉ thấy

các sợi nấm trắng thưa thớt, sau 4 tuần thấy nấm có màu vàng tươi rồi chuyển sang

xanh và xanh thẫm từ tuần thứ 6. Trong khi đó các mẫu bảo quản ở 25 oC nấm phát

triển mạnh mẽ trong 2 tuần đầu, trong vòng 2 tuần đầu chỉ thấy các sợi nấm trắng

thưa thớt, sau 4 tuần thấy nấm có màu vàng tươi rồi chuyển sang xanh và xanh thẫm

từ tuần thứ 6.

Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ được tâp

hợp tại bảng PL 2.2 trong Phụ lục 2. Kết quả cho thấy các mẫu M22 (nhiệt độ 25 oC)

có mức nhiễm AF cao nhất, hàm lượng AF tăng dần từ tuần thứ hai đến tuần thứ 10,

sau đó hầu như không tăng trong các tuần tiếp theo.

Hàm lượng AFB1 và AF tổng số theo thời gian (tuần) trong các mẫu thí nghiệm

ở nhiệt độ 20, 25, 30 và 35 oC được biểu diễn trong hình 3.14.

AF (µg/kg)

AFB1-20

AFB1-25

AFs-25

AFs-30

AFs-35

ML-AFB1

ML-AFs

0 Thời gian (Tuần)

Hình 3. 14. Aflatoxin nhiễm trong các mẫu ở nhiệt độ khác nhau; AFB1-25 (AFB1 trong mẫu ở điều

kiện 25oC); AFs-25 (AF tổng số ở điều kiện 25 oC); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs

(Ngưỡng cho phép của AF tổng số)

Qua biểu đồ hình 3.14 ta thấy, A. flavus sinh độc tố trong điều kiện thí nghiệm

tăng dần từ tuần thứ 2 đến tuần thứ 10, các tuần sau đó hầu như thay đổi không đáng

kể, có thể do lượng ôxy trong bao gói không đủ cho sự phát triển và sinh aflatoxin.

Kết quả nghiên cứu cho thấy 25 oC là nhiệt độ tốt nhất cho A. flavus phát triển

sinh AFB1 và AFB2 trên lạc, 40 oC là nhiệt độ hạn chế sự phát triển và sinh AF của

A. flavus. Điều này hoàn toàn phù hợp với công bố của Enjie Diao và cộng sự về việc

AF trong lạc thường thấy ở nhiệt độ dưới 35 oC mà hiếm thấy ở nhiệt độ 45 oC [54].

Tuy nhiên đối với nghiên cứu trên hạt kê ở Nigeria [75] cho thấy nấm phát triển ở

điều kiện RH cao và khoảng nhiệt độ 30 - 35 oC nên hạt kê được khuyến cáo bảo quản

ở điều kiện dưới nhiệt độ môi trường hoặc từ 40 oC trở lên và RH thấp hơn 55%.

AFB1 phát hiện có trong các mẫu ở nhiệt độ 20, 25 và 30 oC sau 2 tuần nghiên

cứu. Sau 4 tuần hàm lượng AFB1 trong các mẫu để ở 25 oC cao hơn 8 µg/kg, ML-

oC, sau 8 tuần với các mẫu để ở 20 oC, và sau 12 tuần với các mẫu để ở 35 oC.

AFB1 theo QCVN 8-1:2011/BYT, tương tự sau 6 tuần với các mẫu để ở nhiệt độ 30

Để xác định mối quan hệ giữa nhiệt độ và mức aflatoxin sinh ra có tuyến tính

không, nghiên cứu đã thực hiện phân tích hồi quy tuyến tính bằng chương trình R

3.4.1, trong đó hàm lượng AFB1 là biến phụ thuộc và các biến liên tục là nhiệt độ

(Tem) oC và thời gian theo tuần (Week). Kết quả phân tích như trong mục 3.3.2 tại

phụ lục 3 cho thấy mối quan hệ giữa nhiệt độ và sự sinh AF không có ý nghĩa thống

kê (p = 0,1042 > 0,05.

Để biểu diễn tần số các mẫu phát hiện AFB1 của biến nhiệt độ (Tem), dùng lệnh

hist(Tem) và plot(density) ta có biểu đồ đồ thị phân phối xác suất như hình 3.15.

Hình 3. 15. Xác suất phân phối mật độ cho biến nhiệt độ (Tem)

Biểu đồ hình 3.15 cho thấy, các mẫu phát hiện AFB1 có tần suất phân phối nhiệt

độ ở đỉnh cao nhất là nhiệt độ 25 oC.

Qua phân tích trong phần tổng quan tài liệu, tham khảo một số kết quả nghiên

cứu [54, 75] và từ kết quả nghiên cứu thực tế cho rằng yếu tố nhiệt độ cần duy trì

nhiệt độ dưới 25 oC sẽ làm giảm khả năng phát triển và sinh aflatoxin của A. flavus

trong quá trình bảo quản lạc. 40 oC đã có khả năng ức chế sự phát triển của A. flavus,

tuy nhiên nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho chất béo trong lạc bị ôxy hóa dẫn

đến hiện tượng chảy dầu và ôi khét của lạc. Nhiệt độ trong khoảng 25 - 30 oC là nhiệt

độ thích hợp cho A. flavus phát triển và sinh aflatoxin, trong đó 25 oC và độ ẩm lạc

10% là điều kiện tối ưu. Nhiệt độ càng thấp càng thuận tiện cho quá trình bảo quản

lạc, tuy nhiên để giảm nhiệt độ xuống dải nhiệt độ thấp sẽ làm tăng chi phí và tốn

kém năng lượng của thiết bị. Do vậy, nhiệt độ lựa chọn trong thấp hơn 25 oC là phù

hợp với điều kiện thực tiễn của Việt Nam.

3.2.4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến sự sinh AF trên lạc

Thí nghiệm được tiến hành như mô tả trong mục 2.6.2.4.

Các mẫu được được quan sát sự phát triển của nấm A. flavus và soi UV sau mỗi

tuần (như bảng 3.15); phân tích AF sau mỗi 2 tuần.

Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của lượng nấm mốc đến sự phát triển của A. flavus BG1

Mức nhiễm

Màu sắc

Ghi chú khác

Ký hiệu Quan sát

Mức độ

Soi UV

(CFU/g)

Tuần 1

100

M51

Chưa phát hiện nấm phát triển

101

M52

Chưa phát hiện nấm phát triển

102

M53

thưa thớt

vàng nhạt 1 số sợi nấm mới nhú màu vàng thưa thớt quanh hạt lạc, một số nấm trắng vượt lên

103

M54

vàng nhạt

thưa thớt

có 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm màu vàng nhạt thưa thớt quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

104

M55

thưa thớt

vàng ánh xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

105

M56

C mọc rõ

vàng ánh xanh

nét

sợi nấm vàng ánh sáng mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

Mức nhiễm

Màu sắc

Ghi chú khác

Ký hiệu Quan sát

Mức độ

Soi UV

(CFU/g)

106

M57

C mọc rõ

vàng ánh xanh

nét

sợi nấm vàng ánh sáng mọc xung quanh hạt lạc, có 1 số sợi nấm trắng mờ nhạt xuất hiện

Tuần 2

100

M51

thưa thớt

vàng nhạt Lác đác 1 vài sợi nấm mới nhú màu vàng nhạt thưa thớt, ngắn, khó quan sát mọc quanh 1 hạt lạc

101

M52

vàng nhạt 1 số sợi nấm mới nhú màu vàng thưa thớt

quanh hạt lạc

thưa thớt

102

M53

C mọc rõ

vàng ánh xanh

sợi nấm màu vàng ánh xanh quang hạt lạc, một số nấm vàng sáng

nét

103

M54

C mọc rõ

nét

vàng xanh, xanh lục

sợi nấm màu vàng nhạt, vàng xanh, xanh lục mọc quanh hoạt lạc, một số chỗ nấm mọc thành cụm

104

M55

C mọc rõ

vàng ánh xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc, xen lẫn nấm trắng

nét

105

M56

C mọc rõ

vàng ánh xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc, xen lẫn nấm trắng

nét

106

M57

C mọc rõ

vàng ánh xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc, xen lẫn nấm trắng

nét

Tuần 4

100

M51

vàng nhạt

1 số sợi nấm màu vàng nhạt thưa thớt quanh 1 hạt lạc

thưa thớt

101

M52

vàng nhạt

1 số sợi nấm màu vàng ánh xanh thưa thớt quanh 1 số hạt lạc

thưa thớt

102

M53

vàng sáng, xám

nấm vàng sáng phát triển, xuất hiện một số cụm nấm màu xám

mọc nhiều

103

M54

vàng xanh, lục

mọc nhiều

nấm màu vàng xanh xung quanh hạt, sợi mỏng, ngắn, có một số nấm chuyển màu xanh lục, phát hiện một số nấm trắng

104

M55

mọc nhiều

vàng xanh, lục, trắng

nấm xanh lục mọc dày đặc, xuất hiện nấm màu trắng phát triển xen kẽ nấm vàng xanh

105

M56

vàng xanh, lục

nấm màu xanh lục phát triển nhiều, nấm vàng xanh mọc dày đặc

mọc nhiều

106

M57

vàng xanh

sợi nám vàng xanh mọc nhiều, sợi mỏng manh

mọc nhiều

Ghi chú: C: có quan sát thấy nấm/ có phát quang; K: không quan sát thấy nấm / không phát quang

Kết quả quan sát hàng tuần cho thấy:

Các mẫu nhiễm nấm ở mức 103 CFU/g phát triển mạnh nhất và chậm phát triển

sau 8 tuần.

Các mẫu nhiễm nấm ở mức 101 CFU/g phát triển nhanh ở tuần thứ nhất, bào tử

nấm phát triển và già dần ở các tuần tiếp theo và chậm phát triển sau 8 tuần.

Các mẫu nhiễm nấm ở mức 102 CFU/g phát triển nhanh ở tuần thứ nhất, bào tử

nấm phát triển và già dần ở các tuần tiếp theo và chậm phát triển sau 10 tuần.

Các mẫu nhiễm nấm ở mức 104, 105 và 106 CFU/g phát triển nhanh ở tuần thứ

nhất, bào tử nấm chậm phát triển và không già đi nhiều ở các tuần tiếp theo và chậm

phát triển sau 8 tuần.

Giới hạn cho phép mức nhiễm nấm men-mốc trong ngũ cốc và hạt có dầu (có

xử lý nhiệt trước khi sử dụng) theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT là 103 CFU/g

[2], trong nghiên cứu này các mẫu nhiễm ở mức 103 đến 106 CFU A. flavus/g sinh

AFB1 sau 2 tuần và vượt ngưỡng cho phép sau 4 tuần nghiên cứu.

Hàm lượng aflatoxin trong thí nghiệm ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus tổng

hợp tại bảng PL2.4 trong Phụ lục 2.

Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin cho thấy chủ yếu phát hiện AFB1, một

số mẫu phát hiện AFB2, không phát hiện AFG1 và AFG2 trong các mẫu nghiên cứu.

Các mẫu nhiễm ở mức 100 CFU A. flavus/g không phát hiện sinh AF sau 16 tuần

nghiên cứu.

Các mẫu nhiễm ở mức 101 CFU A. flavus/g sinh AFB1 sau 8 tuần nghiên cứu,

mức nhiễm AFB1 không vượt ngưỡng cho phép sau 16 tuần nghiên cứu. AFB2 không

sinh ra sau 16 tuần nghiên cứu.

Các mẫu nhiễm mức 102 CFU A. flavus/g sinh AFB1 sau 4 tuần và vượt ngưỡng

cho phép sau 14 tuần nghiên cứu. AFB2 không sinh ra sau 16 tuần nghiên cứu.

Các mẫu nhiễm ở mức 103 CFU A. flavus/g sinh AFB1 sau 2 tuần và vượt

ngưỡng cho phép sau 4 tuần nghiên cứu. AFB2 sinh ra sau 6 tuần nghiên cứu.

Các mẫu nhiễm ở mức 104, 105, 106 CFU A. flavus/g sinh AFB1 sau 2 tuần và

vượt ngưỡng cho phép sau 4 tuần nghiên cứu. AFB2 sinh ra sau 4 tuần nghiên cứu.

Hàm lượng AFB1 và AF tổng số trong các mẫu nhiễm từ 101 CFU A. flavus/g

được thể hiện trong hình 3.16.

AF (µg/kg)

AFB1-10^1

AFB1-10^3

AFB1-10^2

AFs-10^3

AFB1-10^4

AFs-10^4

AFB1-10^5

AFs-10^5

AFB1-10^6

AFs-10^6

ML-AFB1

ML-AFs

0 Thời gian (Tuần)

Hình 3. 16. Kết quả phân tích AF trong thí nghiệm ảnh hưởng mức nhiễm A. flavus theo tuần; AFB1-

10^1 (AFB1 trong mẫu nhiễm 101 CFU A. flavus/g); AFs-10^1 (AF tổng số trong mẫu nhiễm 101 CFU

A. flavus/g); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số)

Kết quả trong hình 3.17 cho thấy mức nhiễm A. flavus BG1 càng cao thì khả

năng nhiễm AF trong mẫu càng cao.

Để xác định mối quan hệ giữa mức nhiễm A. flavus BG1và sự sinh aflatoxin có

tuyến tính không, chúng tôi phân tích hồi quy tuyến tính bằng chương trình R 3.4.1,

trong đó hàm lượng AFB1 là biến phụ thuộc và các biến liên tục là mức nhiễm A.

flavus BG1 bắt đầu từ 100 CFU/g và thời gian theo thời gian (Tuần). Kết quả phân

tích như trong mục 3.3.3 tại phụ lục 3 cho thấy mối quan hệ giữa mức nhiễm A. flavus

và sự sinh AF có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Ta có phương trình hồi quy tuyến tính

quan hệ giữa mức nhiễm AFB1 (Y1) theo mức nhiễm A. flavus BG1 (x3) và thời gian

(x2) như sau:

(15) Y1 = 0,93 + 5,99×10-6 x3 + 2,0 x2

Phương trình trình (14) có nghĩa là với độ ẩm từ 10 % trở lên, mức nhiễm A.

flavus tăng lên 1 CFU thì hàm lượng AFB1 tăng lên 5,99×10-6 g/kg; thời gian tăng

lên thêm 1 tuần thì hàm lượng AFB1 tăng 2,0 g/kg.

3.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không đến sự phát triển và sinh

aflatoxin trên lạc của A. flavus BG1

Thí nghiệm được tiến hành như mô tả trong mục 2.6.2.5.

Các mẫu được được quan sát sự phát triển của nấm A. flavus sau mỗi tuần và

phân tích AF sau mỗi 2 tuần. Sự phát triển của nấm được quan sát hàng tuần, kết quả

ghi chép như bảng 3.16.

Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của áp lực hút chân không đến sự phát triển của A. flavus BG1

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Ký hiệu

Quan sát

Soi UV

Áp lực hút chân không (mmHg)

Tuần 1

M41

vàng xanh sợi nấm vàng ánh sáng mọc thưa

mọc rõ nét

thớt xung quanh hạt lạc

100

M42

thưa thớt vàng xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc

150

M43

thưa thớt vàng xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc

200

M44

thưa thớt vàng xanh có 1 số hạt có xuất hiện sợi nấm màu vàng nhạt , một số sợi nấm vàng xanh thưa thớt quanh hạt lạc

250

M45 K

Chưa phát hiện nấm phát triển

Tuần 2

M41

vàng xanh

mọc rõ nét

sợi nấm màu vàng nhạt, vàng xanh

100

Mức độ Màu sắc

Ghi chú khác

Soi UV

Ký hiệu

Quan sát

Áp lực hút chân không (mmHg)

100

M42

vàng xanh

sợi nấm màu vàng ánh xanh quang hạt lạc

mọc rõ nét

150

M43

vàng xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc

mọc rõ nét

200

M44

vàng xanh

sợi nấm vàng ánh xanh mọc thưa thớt xung quanh hạt lạc

mọc rõ nét

250

M45 K

Chưa phát hiện nấm phát triển

Tuần 4

M41

vàng xanh nấm màu vàng xanh xung quanh

mọc rõ nét

hạt

100

M42

vàng xanh nấm màu vàng xanh xung quanh

mọc rõ nét

hạt

150

M43

vàng xanh nấm màu vàng xanh xung quanh

mọc rõ nét

hạt

200

M44

vàng xanh nấm màu vàng xanh xung quanh

mọc rõ nét

hạt

250

M45 K

Chưa phát hiện nấm phát triển

Ghi chú: C: có quan sát thấy nấm/có phát quang; K: không quan sát thấy nấm/không phát quang

Kết quả quan sát định kỳ hàng tuần cho thấy: Các mẫu đóng gói hút chân không

ở áp lực 250 mmHg không quan sát thấy nấm phát triển sau 16 tuần nghiên cứu. Các

mẫu đóng gói hút chân không ở áp lực 50, 100, 150 và 200 mmHg quan sát thấy có

nấm mọc sau 2 tuần.

Kết quả mức nhiễm AF trong các mẫu thí nghiệm tại bảng PL2.3 trong phụ lục

2. Sắc đồ phân tích AF trong các mẫu này tại phụ lục 4.

Hàm lượng AF trong các mẫu áp lực hút chân không 50, 100, 150 và 200 mmHg

101

theo thời gian được biểu diễn như hình 3.17.

AF (µg/kg)

50 mmHg 100 mmHg 150 mmHg 200 mmHg ML-AFB1 ML-AFs

Thời gian (Tuần)

Hình 3. 17. Kết quả phân tích AFB1 theo tuần trong thí nghiệm điều kiện hút chân không

Các mẫu được đóng gói với áp lực hút chân không 50 mmHg có mức nhiễm

AFB1 cao nhất và phát hiện AFB1 từ sau 2 tuần với mức nhiễm AFB1 gấp 3,3 lần so

với ngưỡng cho phép (<8 g/kg) theo QCVN 8-1:2011/BYT.

Các mẫu được đóng gói với áp lực hút chân không 100 mmHg phát hiện AFB1

từ sau 2 tuần với mức nhiễm AFB1 gấp 2,9 lần so với ngưỡng cho phép.

Các mẫu được đóng gói với áp lực hút chân không 150 mmHg phát hiện AFB1

từ sau 2 tuần với mức nhiễm AFB1 gấp 1,97 lần so với ngưỡng cho phép.

Các mẫu được đóng gói với áp lực hút chân không 200 mmHg phát hiện AFB1

từ sau 2 tuần với mức nhiễm AFB1 thấp hơn so với ngưỡng cho phép.

Lạc được bảo quản bằng đóng gói hút chân không ở điệu kiện áp lực hút chân

không càng cao thì khả năng ức chế sự phát triển và sinh AF của A. flavus BG1 càng

cao. A. flavus BG1 không phát triển và sinh AF sau 4 tháng ở điều kiện đóng gói hút

chân không với áp lực hút 250 mmHg.

3.2.6. Phân tích mối quan hệ của các yếu tố đến sự phát triển và sinh

aflatoxin trên lạc của A. flavus BG1

3.2.6.1. Mối liên quan giữa sự phát triển của nấm, sự phát quang và phát hiện AF

trên lạc

Tổng hợp các yếu tố quan sát và phân tích được về sự phát triển của A. flavus,

102

kết quả soi UV của mẫu và kết quả phân tích AF như bảng 3.17.

Bảng 3. 17. Mối liên quan giữa mức độ sinh trưởng của A. flavus BG1 và hàm lượng AF

Sau 2 tuần thí nghiệm

Sau 4 tuần thí nghiệm

Điều kiện thí nghiệm

màu sắc

màu sắc Soi UV

Soi UV

Hàm lượng AF tổng số (g/kg)

KPH

M-6%

KPH

vàng nhạt

KPH

M-8%

vàng nhạt K

KPH

vàng, xanh K

KPH

M-10%

112,08

vàng, xanh

124,03

vàng xanh

M-12%

4,23

5,91

vàng xanh, lục

vàng xanh

M-14%

trắng

KPH

trắng

KPH

M-20oC

vàng nhạt K

KPH

vàng nhạt

KPH

M-25oC

xanh, lục C

112,77

130,26

vàng xanh, lục

M-30oC

18,32

vàng xanh

21,32

vàng xanh

M-35oC

KPH

vàng nhạt, vàng xanh

vàng xanh

M-40oC

vàng nhạt K

KPH

vàng nhạt

KPH

M-100CFU

vàng nhạt K

KPH

vàng nhạt

KPH

M-101CFU

vàng nhạt K

KPH

vàng xanh

15,75

M-102CFU

KPH

xanh, lục

30,13

vàng xanh

M-103CFU

xanh, lục C

128,05

xanh, lục

63,71

M-104CFU

14,62

xanh, lục

15,8

vàng xanh

M-105CFU

12,72

xanh, lục

15,1

vàng xanh

103

Sau 2 tuần thí nghiệm

Sau 4 tuần thí nghiệm

Điều kiện thí nghiệm

màu sắc

màu sắc Soi UV

Soi UV

Hàm lượng AF tổng số (g/kg)

M-106CFU

12,87

vàng xanh

14,69

vàng xanh

26,4

26,5

M-50mmHg vàng xanh

vàng xanh

23,3

23,97

vàng xanh

M- 100mmHg

vàng xanh

15,75

18,14

vàng xanh

M- 150mmHg

vàng xanh

3,12

4,23

vàng xanh

M- 200mmHg

KPH

M- 250mmHg

Ghi chú: C: có phát quang; K: không quan sát thấy nấm phát triển/ không phát quang

C1, C2: mẫu đối chứng

Kết quả tại bảng 3.17 cho thấy, khi A. flavus BG1 phát triển đến quan sát thấy

có màu xanh thì bắt đầu phát hiện có aflatoxin (có phát ánh sáng xanh dưới đèn UV

365 nm), mẫu phát hiện có phát huỳnh quang có thể chưa đủ để phân tích được

aflatoxin, tuy nhiên tất cả các mẫu phát hiện aflatoxin thì trước khi phân tích đều phát

hiện có phát huỳnh quang dưới đèn UV 365 nm, đa số các mẫu có hàm lượng AF cao

đều quan sát thấy A. flavus BG1 có màu xanh lục, thể hiện bào tử đã già.

Như vậy, Aspergillus flavus BG1 phát triển đến khi bào tử có màu xanh mới bắt

đầu sinh AF, mẫu có AF có phát ánh sáng xanh dưới đèn UV bước sóng 365 nm.

3.2.6.2. Phân tích mối tương quan giữa các yếu tố và xây dựng mô hình hồi quy

logistic

Từ kết quả mức nhiễm AF trong các mẫu thí nghiệm với các yếu tố ảnh hưởng:

độ ẩm, nhiệt độ và mức nhiễm A. flavus khác nhau chúng ta phân tích mối tương quan

104

giữa các yếu tố ảnh hưởng và mức nhiễm AF như biểu đồ hình 3.18.

Hình 3. 18. Biểu đồ mối tương quan giữa các biến (Thời gian – Week, Độ ẩm – Moi, Nhiệt độ - Tem,

Mức nhiễm A. flavus – Flavus, AFB1 và AF tổng số - AFTotal)

Trên biểu đồ hình 3.18, các hình vuông trong đường chéo biểu diễn phân phối

chuẩn của các biến. Biến thời gian (Week) phân phối chuẩn do tất cả các thí nghiệm

thiết kế thời gian như nhau. Biến Độ ẩm (Moi) phân bố lệch chuẩn do đa số các mẫu

thí nghiệm thiết kế độ ẩm 10 %, sau đó mới đến độ ẩm 12 % và 14 %. Biến nhiệt độ

(Tem) cũng có phân bố chuẩn do đa số các thí nghiệm bố trí ở nhiệt độ 25 oC, một số

ít thí nghiệm bố trí ở 20 oC, 30 oC và 35 oC. Biến mức nhiễm A. flavus (Flavus) cũng

không phân bố chuẩn, do đa số thí nghiệm bố trí ở mức nhiễm 103 CFU/g, một số ít

105

các thí nghiệm bố trí các mức nhiễm khác nhau. Biến AFB1 và AF tổng số (AFTotal)

phân bố lệch chuẩn do đa số các mẫu thí nghiệm có mức nhiễm aflatoxin ở hàm lượng

thấp, số mẫu có hàm lượng cao giảm dần.

Mức nhiễm AFB1 và AF tổng số có mối tương quan lớn nhất với chỉ số tương

quan tương ứng là 0,95 và có mối quan hệ tuyến tính thể hiện ở đường thẳng tuyến

tính biểu diễn mối quan hệ của hai biến này. Sau đó đến mối tương quan giữa mức

nhiễm aflatoxin (AF tổng số và AFB1) với thời gian (Week) tương ứng là 0,62 và

0,59. Tiếp theo là mối tương quan giữa mức nhiễm AFB1 và độ ẩm (Moi) với hệ số

tương quan là 0,52. Tỉ số tương quan giữa mức nhiễm AF tổng số và độ ẩm là 0,32.

Sử dụng hàm bic.glm trong chương trình phân tích dữ liệu R [14] để tìm các yếu

tố ảnh hưởng đến khả năng sinh AF trong lạc. Các biến độc lập gồm: Thời gian

(Week), Độ ẩm (Moi), Nhiệt độ (Tem) và Mức nhiễm A. flavus (Flavus). Kết quả

phân tích cho ta 4 mô hình tối ưu được lựa chọn như trong bảng 3.18.

Bảng 3. 18. Bốn mô hình tối ưu và các thông số

Mô hình

Các biến

BIC

Xác xuất

Mô hình 1

Thời gian, Độ ẩm, Mức nhiễm A. flavus

-3,518e+02

0,535

Mô hình 2

Thời gian, Mức nhiễm A. flavus

-3,509e+02

0,344

Mô hình 3

-3,480e+02

0,081

Thời gian, Nhiệt độ, Độ ẩm, Mức nhiễm A. flavus

Mô hình 4

Thời gian, Nhiệt độ, Mức nhiễm A. flavus

-3,466e+02

0,039

Kết quả tại bảng 3.18 cho thấy xác xuất xuất hiện của mô hình 1 là lớn nhất

(53,5 %) và chỉ số BIC của mô hình này là nhỏ nhất, do đó mô hình này là mô hình

tối ưu trong số 4 mô hình tốt nhất được lựa chọn.

Sử dụng hàm imageplot.bma(s) trên phần mềm R, kết quả phân tích như trong

mục 3.2.4 tại phục lục 3 cho thấy các yếu tố: thời gian (Tuần) và mức nhiễm A. flavus

BG1 ảnh hưởng đến sự sinh AF có tính nhất quán cao nhất, các yếu tố này xuất hiện

cao nhất trong mô hình (100 %); Độ ẩm xuất hiện trong mô hình 61,6 %; Nhiệt độ

xuất hiện trong mô hình 12,2 %. Điều đó chứng tỏ thời gian và mức nhiễm A. flavus

BG1 là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sinh AF trong lạc, sau đó đến độ ẩm

106

và yếu tố nhiệt độ. Các mô hình hồi quy được BMA lựa chọn thể hiện như hình 3.19.

Hình 3. 19. Các mô hình được BMA lựa chọn

Kết quả trong bảng 3.18 và hình 3.19 cho ta thấy mô hình 1 là mô hình tối ưu.

Sử dụng hàm glm để dự đoán công thức hồi quy tuyến tính đa biến cho biến phụ

thuộc AFB1 (Y1) vào các yếu tố thời gian (x2) , độ ẩm (x1) và mức nhiễm A. flavus

BG1 (x3) như sau:

Y1 = -80,365 + 1,997 x2 + 7,969 x1 + 1,135×10-5 x3 (16)

Phương trình (15) cho biết khi thời gian tăng lên 1 tuần thì hàm lượng AFB1

tăng lên 1,997 g/kg; độ ẩm tăng lên 1 % thì hàm lượng AFB1 tăng lên 7,969 g/kg;

mức nhiễm A. flavus BG1 tăng lên 1 CFU/g thì AFB1 tăng 1,135×10-5 g/kg.

Phương trình hồi quy tuyến tính đa biến cho biến phụ thuộc AF tổng số (Y) vào

các yếu tố độ ẩm (x1), mức nhiễm A. flavus BG1 (x2) và thời gian - tuần (x3) như sau:

(17) Y = -82,41 + 7,65 x1 + 1,14×10-5 x3 + 2,6 x2

Phương trình trình (16) có nghĩa là độ ẩm tăng 1 % thì hàm lượng AF tổng số

tăng lên 7,65 g/kg; mức nhiễm A. flavus BG1 tăng lên 1 CFU/g thì AF tổng số tăng

lên 1,14×10-5 g/kg; thời gian tăng lên thêm 1 tuần thì AF tổng số tăng 2,6 g/kg.

Như vậy, với độ ẩm của lạc từ 10 % trở lên, lạc nhiễm A. flavus BG1 sẽ có hàm

lượng AF tăng dần theo thời gian và độ ẩm tăng. Đề tài tiếp tục nghiên cứu giải pháp

ức chế khả năng phát triển và sinh AF của A. flavus BG1 bằng các hoạt chất từ thiên

nhiên đảm bảo an toàn thực phẩm, tinh dầu hồi, quế được tính đến trong nghiên cứu

107

tiếp theo.

3.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu hồi, quế đến khả năng ức chế

sự phát triển của A. flavus

3.2.7.1. Nghiên cứu trên môi trường thạch

Khả năng ức chế của các tinh dầu đơn hồi (quế) đối với sự phát triển của A.

flavus BG1 trên môi trường PDA được đánh giá dựa trên kết quả đo đường kính của

khuẩn lạc theo thời gian như mô tả trong mục 2.6.2.4.

Quan sát sự phát triển của A.flavus BG1 ta thấy: trên đĩa thạch có bổ sung tinh

dầu khuẩn lạc phát triển chậm hơn, có rìa trắng rõ nét và tròn đều; đĩa thạch không

bổ sung tinh dầu khuẩn lạc phát triển nhanh với rìa trắng không rõ nét và không tròn

đều (hình 3.20).

Hình 3. 20. Khuẩn lạc phát triển trên các đĩa thạch: a) đối chứng - không bổ sung tinh dầu; b) bổ sung

tinh dầu Quế 0,0125 %; c) bổ sung tinh dầu Quế 0,025%; d) bổ sung tinh dầu Hồi 0,2 %; e) bổ sung

tinh dầu Hồi 0,4 %; f) bổ sung tinh dầu Hồi 0,8 %

Như vậy trong điều kiện không bị ức chế các bào tử của A.flavus BG1 có thể dễ

dàng lan rộng ra. Sự có mặt của tinh dầu quế hoặc hồi, các bào tử này không dễ dàng

lan rộng ra, thậm chí không thể phát triển khi tinh dầu ở nồng độ cao.

Đường kính của khuẩn lạc được đo lần đầu sau 3 ngày, sau đó đo 2 ngày/lần,

mỗi lần đo 4 đĩa/nồng độ tinh dầu.

a. Thí nghiệm với tinh dầu quế

Kết quả đo đường kính khuẩn lạc 4 đĩa/nồng độ/ lần đo được như trong Phụ lục

2 tại bảng PL2.6. Kết quả trung bình của đường kính khuẩn lạc đo được như trong

108

bảng 3.19.

Bảng 3. 19. Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A. flavus BG1 trên môi trường PDA với nồng

độ tinh dầu quế khác nhau

Hàm lượng tinh dầu quế (% v/v)

0,0125 0,025 0,05

0,1

0,2

0,4

0,8

1,6

3,2

Thời gian nuôi cấy (ngày)

3,2

3,1

1,9

5,4

5,3

4,5

6,6

5,0

7,6

7,5

6,5

9,0

7,1

9,0

Đ ư ờ n g k í n h k h u ẩ n l ạ c ( c m

9,0

)

9,0

Qua bảng 3.19 ta thấy sau 13 ngày, khuẩn lạc phát triển tràn đầy trên các đĩa đối

chứng, các đĩa có nồng độ tinh dầu quế từ 0,0125 % và 0,025 %, những đĩa có nồng

độ tinh dầu quế từ 0,05 % khuẩn lạc không phát triển được cho đến 29 ngày. Như

vậy, môi trường PDA bổ sung tinh dầu quế nồng độ ≥ 0,05 %v/v có thể ức chế sự

phát triển của A. flavus BG1 ở điều kiện nhiệt độ 25 oC.

Sự phát triển của nấm trên các đĩa thí nghiệm có bổ sung tinh dầu quế với nồng

độ từ 0 % (mẫu đối chứng) đến 0,025 % được tính phần trăm đường kính phát triển

109

so với đường kính của đĩa và được biểu diễn trên biểu đồ hình 3.21.

Tỉ lệ (%) 110.0

100.0

90.0

80.0

70.0

Mẫu đối chứng

60.0

Quế 0,0125%

50.0

Quế 0,025%

40.0

30.0

20.0

Thời gian (ngày)

10.0

Hình 3. 21. Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu quế

Qua biểu đồ hình 3.21 ta thấy A. flavus BG1 nuôi cấy trong môi trường thạch

không có nồng độ tinh dầu 0 %v/v (mẫu đối chứng) và thạch bổ sung tinh dầu quế

0,0125 % phát triển gần giống nhau, còn mẫu bổ sung tinh dầu quế 0,025 % phát triển

chậm hơn do sự có mặt của tinh dầu làm ức chế sự phát triển của nấm. Các mẫu bổ

sung tinh dầu quế ở nồng độ 0,05 % đến 3,2 % nấm không phát triển được.

Gọi nhóm mẫu chứng là nhóm 1, nhóm bổ sung tinh dầu quế 0,0125 % là nhóm

2, nhóm bổ sung tinh dầu quế 0,025 % là nhóm 3. Phân tích số liệu trong bảng 3.19

bằng phần mềm R để xác định mức độ khác biệt cũng như khoảng tin cậy 95 % giữa

các nhóm. Sử dụng hàm aov (analysis of variance) và hàm TukeyHSD (HSD - Honest

Significant Difference). Kết quả cho thấy ở khoảng tin cậy 95 %, kết quả so sánh giữa

nhóm có bổ sung tinh dầu và nhóm không bổ sung tinh dầu có sự khác biệt đáng kể

(p<0,05). Tuy nhiên sự khác biệt giữa các nhóm có bổ sung tinh dầu ở hàm lượng

0,0125 % và 0,025 % là không đáng kể (p = 0,316).

Môi trường thạch có bổ sung tinh dầu quế nồng độ từ 0,0125 % trở lên có tác

dụng hạn chế sự phát triển đối với A. flavus BG1, tinh dầu quế nồng độ từ 0,05 % trở

110

lên có tác dụng ức chế A. flavus BG1 không phát triển được ở nhiệt độ 25 oC.

b. Thí nghiệm với tinh dầu hồi

Kết quả đo đường kính phát triển của nấm trên các đĩa thạch trong thí nghiệm

sử dụng tinh dầu hồi được tổng hợp trong Phụ lục 2 tại bảng PL2.6. Kết quả trung

bình của đường kính nấm như bảng 3.20.

Bảng 3. 20. Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A. flavus BG1 trên môi trường PDA với nồng

độ tinh dầu hồi khác nhau

Hàm lượng tinh dầu hồi (% v/v)

0,0125

0,025

0,05

0,1

0,2

0,4

0,8

1,6

3,2

Thời gian nuôi cấy (ngày)

3,2

3,0

2,1

1,8

1,4

0,4

5,4

4,1

4,0

3,8

2,6

0,8

0,6

6,6

6,5

6,4

5,9

4,8

2,5

1,6

7,6

7,7

7,6

7,3

7,1

4,8

3,1

9,0

7,7

6,3

9,0

7,8

9,0

Đ ư ờ n g k í n h k h u ẩ n l ạ c ( c m

)

9,0

Qua bảng 3.20 ta thấy, A. flavus BG1 nuôi cấy trong môi trường thạch không

bổ sung tinh dầu (mẫu đối chứng) và thạch bổ sung tinh dầu hồi 0,0125 % phát triển

gần giống nhau, còn mẫu bổ sung tinh dầu hồi từ 0,1 % đến 0,4 % phát triển chậm

hơn rõ nét do sự có mặt của tinh dầu làm ức chế sự phát triển của nấm. Các mẫu bổ

111

sung tinh dầu hồi ở nồng độ 0,8 %, 1,6 % và 3,2 % nấm không phát triển được.

Sự phát triển của khuẩn lạc trên các đĩa thí nghiệm có nồng độ tinh dầu hồi từ

0% (mẫu đối chứng) đến 0,4 % được tính phần trăm đường kính phát triển so với

đường kính của đĩa và được biểu diễn trên biểu đồ hình 3.22.

Tỉ lệ (%)

120.0

100.0

Hồi 0,0125%

Hồi 0,025%

80.0

Hồi 0,05%

60.0

Hồi 0,1%

Hồi 0,2%

40.0

Hồi 0,4%

20.0

mẫu đối chứng

0.0

Thời gian (ngày)

Hình 3. 22. Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu hồi

Qua biểu đồ hình 3.24 ta thấy: sau 11 ngày, các mẫu chứng và mẫu có nồng độ

tinh dầu hồi từ 0,0125 % đến 0,1 % nấm mọc đến 100 % diện tích đĩa thạch. Nấm

mọc đến 100 % diện tích đĩa thạch sau 13 ngày với các đĩa thạch có nồng độ tinh dầu

hồi 0,2 %, sau 15 ngày với đĩa thạch có nồng độ tinh dầu hồi 0,4 %. Các đĩa thạch có

nồng độ tinh dầu 1,6 % và 3,2 % nấm không phát triển được.

Gọi nhóm mẫu chứng là nhóm 1, nhóm bổ sung tinh dầu hồi 0,0125 % là nhóm

2, nhóm bổ sung tinh dầu hồi 0,025 % là nhóm 3, nhóm bổ sung tinh dầu hồi 0,05 %

là nhóm 4, nhóm bổ sung tinh dầu hồi 0,1 % là nhóm 5, nhóm bổ sung tinh dầu hồi

0,2 % là nhóm 6, nhóm bổ sung tinh dầu hồi 0,4 % là nhóm 7. Phân tích số liệu bằng

phần mềm R để xác định mức độ khác biệt cũng như khoảng tin cậy 95 % giữa các

nhóm, sử dụng hàm ANOVA. Qua kết quả trung bình bình phương (mean square)

của bảy nguồn dao động của đường kính nấm phát triển, chúng ta thấy ảnh hưởng của

lần đo có vẻ quan trọng hơn là ảnh hưởng của nồng độ tinh dầu thí nghiệm. Kết quả

của các lần đo với các nồng độ khác nhau của tinh dầu hồi khác nhau có ý nghĩa thống

112

kê, vì trị số p = 0,0423 (<0,05).

Như vậy, nồng độ tinh dầu hồi bổ sung vào môi trường thạch càng cao thì càng

hạn chế sự phát triển của A. flavus BG1. Khuẩn lạc phát triển chậm hơn khi nồng độ

tinh dầu hồi tăng từ 0,0125 %v/v đến 0,4 %v/v trong từng lần đo. Khuẩn lạc A. flavus

BG1 bị ức chế không phát triển được với hàm lượng tinh dầu hồi từ 0,8 %v/v.

Từ các kết quả trên ta thấy tinh dầu quế nồng độ 0,05 %v/v và tinh dầu hồi ở

nồng độ 0,8 %v/v có thể ức chế sự phát triển của A. flavus BG1 trên môi trường thạch

trong 28 ngày nghiên cứu.

3.2.7.2. Nghiên cứu ứng dụng tinh dầu trong bảo quản lạc nhân quy mô phòng thí

nghiệm

Từ các kết quả trên ta thấy tinh dầu quế ở hàm lượng 0,05 %v/v và tinh dầu hồi

ở hàm lượng 0,8 %v/v có thể ức chế sự phát triển của A. flavus BG1, từ đó nghiên

cứu tiếp theo về khả năng ức chế sự phát triển của A. flavus BG1 trên lạc được nhóm

nghiên cứu thực hiện với các hàm lượng tinh dầu quế là: 0,0125; 0,025; 0,05 và 0,1

%v/v. Còn tinh dầu hồi thực hiện với các hàm lượng là: 0,4; 0,8, 1,6 và 3,2 %v/v.

a. Khả năng ức chế của tinh dầu quế đối với sự phát triển và sinh aflatoxin của

A. flavus BG1 trên lạc

Kết quả phân tích tổng số bào tử nấm mốc trong các mẫu lạc (mẫu đối chứng và

mẫu bổ sung tinh dầu quế từ 0,0125 đến 0,1 %v/v ) từng tuần như bảng 3.21.

Bảng 3. 21. Mức nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian

Mức nhiễm nấm (CFU/g)

Hàm lượng tinh dầu (% v/w)

C (-)

C (+)

0,0125

0,025

0,05

0,1

Thời gian (ngày)

1,0 × 104 1,8 × 102 1,1 × 102 KPH

KPH

1,3 × 105 2,6 × 103 1,8 × 102 1,0 × 101 KPH

6,6 × 105 3,3 × 104 2,7 × 102 2,2 × 101 KPH

1,4 × 106 3,4 × 105 5,1 × 102 5,5 × 101 KPH

Ghi chú: C(-) là mẫu chứng không bổ sung chủng nấm và không bổ sung tinh dầu C(+) là mẫu chứng có bổ sung chủng nấm và không bổ sung tinh dầu

Kết quả phân tích tổng số bào tử nấm mốc phát triển sau các tuần khác nhau cho

113

thấy: mẫu chứng (nồng độ tinh dầu 0 %v/w), số bào tử nấm tăng lên từng tuần và tăng

đến 1,4×106 sau 28 ngày nuôi cấy. Lạc bổ sung tinh dầu quế hàm lượng 0,0125 %v/w

và 0,025 %v/w được kiểm tra sau 7 ngày, số bào tử nấm thấp hơn so với lượng bổ

sung ban đầu. Với hàm lượng tinh dầu quế 0,05 %v/w nấm bị ức chế không phát triển

sau 1 tuần và bắt đầu phát triển sau tuần thứ hai. A. flavus BG1 bắt đầu bị ức chế và

không phát triển được với hàm lượng tinh dầu quế 0,1 %v/w. Trong khi đó kết quả

nghiên cứu trên môi trường thạch ở trên có kết quả nồng độ ức chế của tinh dầu quế

là 0,05 %v/v, kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu về khả năng kháng nấm

của tinh dầu xạ hương khi tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm có hiệu quả ức chế sự phát

triển của A. flavus cao hơn tiếp xúc gián tiếp [111]. Kết quả này tương đương với khả

năng ức chế sự phát triển sợi nấm A. parasiticus phân lập từ lạc của tinh dầu quế ở

hàm lượng 1.000 ppm (tương đương 0,1 %) trên môi trường thạch [84].

Như vậy, tinh dầu quế từ hàm lượng 0,0125 % đã hạn chế sự phát triển của A.

flavus BG1 trên lạc nhưng đến hàm lượng 0,1 % mới ức chế hoàn toàn sự phát triển

của A. flavus BG1. Tinh dầu quế tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhiễm A. flavus BG1

có hiệu quả ức chế cao hơn việc tiếp xúc gián tiếp.

Kết quả kiểm tra hàm lượng AF trong các mẫu đối chứng âm (lạc tiệt trùng

không gây nhiễm A. flavus BG1) không phát hiện AF, còn trong các mẫu đối chứng

dương (lạc tiệt trùng có gây nhiễm A. flavus BG1 nhưng không sử dụng tinh dầu) và

các mẫu bổ sung tinh dầu quế được tổng hợp trong bảng 3.22. Các mẫu thí nghiệm

chỉ phát hiện AFB1, không phát hiện AFB2, G1, G2.

Bảng 3. 22. Mức nhiễm AF trên lạc có nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian

Hàm lượng tinh dầu (% v/w)

Hàm lượng Aflatoxin B1 (µg/kg)

Thời gian (ngày)

C+

0,0125

0,025

0,05

0,1

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

3,01

3,30

KPH

KPH KPH

Kết quả cho thấy mẫu đối chứng dương (C+) và mẫu bổ sung tinh dầu quế hàm

114

lượng 0,0125 % sinh AFB1 sau 28 ngày, còn các mẫu bổ sung tinh dầu quế từ hàm

lượng 0,025 % không sinh AF sau 28 ngày. Tuy nhiên lạc bổ sung A. flavus BG1 mức

103CFU/g với độ ẩm 10 % ở điều kiện nhiệt dộ 25 oC cho đến 28 ngày, lượng AFB1

phát hiện không vượt quá giới hạn cho phép (≤8 g/kg) theo QCVN 8-1:2011.

Kết quả tại bảng 3.21 và 3.22 cũng cho thấy

Như vậy, tinh dầu quế hàm với hàm lượng 0,025 % đã ức chế sự phát triển và

sinh Aflatoxin trên lạc của A. flavus BG1 sau 28 ngày nghiên cứu.

b. Khả năng ức chế của tinh dầu hồi đối với sự phát triển và sinh aflatoxin trên

lạc của A. flavus BG1

Kết quả phân tích tổng số bào tử nấm trên lạc có bổ sung tinh dầu hồi (hàm

lượng từ 0,4 % đến 3,2 %) từng tuần được tổng kết trong bảng 3.23.

Bảng 3. 23. Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian

Hàm lượng tinh dầu (% v/w)

Mức nhiễm nấm (CFU/g)

Thời gian (ngày)

0,4

0,8

1,6

3,2

1,8 × 101

KPH

1,4 × 102

KPH

2,5 × 103

1,1 × 101

KPH

3,4 × 104

1,4 × 101

KPH

Kết quả cho thấy lạc bổ sung tinh dầu hồi với hàm lượng 0,4 % sau 2 tuần đầu

số bào tử nấm mốc giảm so với ban đầu và bắt đầu phát triển sau tuần thứ hai và thứ

ba, có thể do tinh dầu trong mẫu lạc bắt đầu bị khuếch tán và giảm tác dụng. Với lạc

bổ sung tinh dầu hồi 0,8 % nấm không phát triển được trong 2 tuần đầu và bắt đầu

phát triển chậm ở tuần thứ ba và thứ tư, tuy nhiên với lượng thấp hơn lượng bổ sung

ban đầu. Từ hàm lượng tinh dầu hồi 1,6 % nấm không phát triển được trên lạc. Kết

quả nồng độ tinh dầu hồi tối thiểu ức chế sự phát triển (MIC) của A. flavus BG1 trên

môi trường thạch và cơ chất lạc tiệt trùng tương đương nhau, trong khi kết quả MIC

của tinh dầu quế trên môi trường thạch thấp hơn trên cơ chất lạc tiệt trùng, có thể do

MIC của tinh dầu hồi cao hơn (1,6 %) so với tinh dầu quế (0,05 %) nên khả năng

115

khuếch tán làm giảm hiệu quả ức chế thấp hơn.

Nghiên cứu này cho kết quả mức MIC của tinh dầu hồi cao hơn trong nghiên

cứu của khả năng chống mycotoxin và chống ôxy hóa [115], tinh dầu hồi ở nồng độ

200 ppm (0,02 %) đã ức chế hoàn toàn sự phát triển của A. flavus và A. parasiticus

phân lập từ ngô. Sự khác biệt này có thể xuất phát từ chủng A. flavus trong hai nghiên

cứu là khác nhau, nguồn gốc tinh dầu hồi của hai nghiên cứu cũng khác nhau nên

hàm lượng các hoạt chất có chứa trong tinh dầu cũng khác nhau về tỉ lệ.

Như vậy, tinh dầu hồi sử dụng trong nghiên cứu này với nồng độ 1,6 %v/w có

khả năng ức chế sự phát triển của A. flavus BG1.

Kết quả hàm lượng AF trong các mẫu bổ sung tinh dầu hồi như bảng 3.24. Chỉ

phát hiện AFB1 trong mẫu có nồng độ tinh dầu hồi 0,4 %. Các mẫu có nồng độ tinh

dầu hồi: 0,8 %; 1,6 % và 3,2 % không phát hiện AF. Không phát hiện AFB2, G1, G2.

Bảng 3. 24. Mức nhiễm AF trên các mẫu có nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian

Hàm lượng Aflatoxin B1 (µg/kg)

Hàm lượng tinh dầu (%v/w)

0,4

0,8

1,6

3,2

Thời gian (ngày)

KPH

2,31

KPH

Kết quả cho thấy mẫu bổ sung tinh dầu hồi nồng độ 0,4 %v/w sinh AF sau 28

ngày, còn các mẫu bổ sung tinh dầu hồi với nồng độ ≥ 0,8 %v/w không sinh AF sau

28 ngày. Tuy nhiên lạc gây nhiễm A. flavus BG1 ở mức 103 CFU/g với độ ẩm 10 %

ở điều kiện nhiệt độ 25 oC sinh AF sau 28 ngày nhưng hàm lượng AF không vượt quá

giới hạn cho phép (≤ 8 g/kg) theo QCVN 8-1:2011.

Như vậy, tinh dầu hồi nồng độ 0,8 %v/w đã ức chế khả năng sinh aflatoxin trên

116

lạc sau 28 ngày nghiên cứu.

3.3. Khảo nghiệm và đề xuất quy trình bảo quản nhằm tránh nguy

cơ nhiễm aflatoxin trong lạc

3.3.1. Khảo nghiệm quy trình bảo quản lạc nhân bằng giải pháp kiểm soát

chất lượng trước khi bảo quản

3.3.1.1. Quy trình khảo nghiệm

Mục đích của giải pháp:

Bảo quản lạc bằng kiểm soát quá trình kể từ giai đoạn sau thu hoạch được triển

khai tại quy mô hộ gia đình với các biện pháp kiểm soát từng bước trước khi đưa vào

bảo quản nhằm giảm thiểu các nguy cơ tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát

triển và sinh aflatoxin. Thời gian bảo quản tối thiểu là 6 tháng (tính đến vụ thu hoạch

lạc tiếp theo), đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm.

Nguyên tắc giải pháp:

Lạc nhân phải được kiểm soát chất lượng trước và trong quá trình bảo quản để

đảm bảo không nhiễm Aflatoxin trong quá trình bảo quản (tối thiểu là 6 tháng). Quy

trình dễ áp dụng với quy mô hộ gia đình.

117

Quy trình bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát quá trình như sơ đồ hình 3.23.

Hình 3. 23. Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát quá trình

3.3.1.2. Kết quả khảo nghiệm

Lạc được khảo nghiệm bảo quản theo quy trình 3.23 được so sánh với mẫu lạc

đối chứng (lạc đưa vào bảo quản không theo các bước của quy trình, đóng trong bao

tải một lớp), mỗi loại bao bì được đóng 3 bao, mỗi bao 50 kg. Kết quả khảo nghiệm

như sau:

Kiểm tra chất lượng ban đầu của lạc trước khi đưa vào bảo quản:

- Kiểm tra độ khô của lạc đưa vào bảo quản:

Kiểm tra về mặt cảm quan: mẫu lạc xoa trên lòng bàn tay, vỏ lụa bong ra dễ

118

dàng.

Kiểm tra độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi: 3 mẫu lạc

được lấy tại ba vị trí khác nhau của lạc đưa vào khảo nghiệm cho kết quả độ ẩm ban

đầu của lạc là 8,04 %.

Như vậy độ ẩm của lạc (8,04 %) và dóc vỏ lụa đưa vào bảo quản đạt yêu cầu

theo quy trình đề xuất.

- Kết quả kiểm tra mức nhiễm nấm mốc ban đầu của lạc khảo nghiệm: mức nhiễm

nấm mốc ban đầu của lạc đưa vào khảo nghiệm là 1,2×102 CFU/g.

- Kết quả kiểm tra sàng lọc tình trạng nhiễm AF trong lạc: lạc nhân được dàn trên

khay, sau đó đưa vào máy quét đèn UV ở bước sóng 365 nm để kiểm tra. Toàn

bộ lạc đưa vào khảo nghiệm không phát hiện có phát quang màu xanh.

- Lạc khảo nghiệm được loại tạp theo quy trình, lạc đối chứng không loại tạp.

Kiểm tra tình trạng nhiễm aflatoxin hàng tháng của các mẫu lạc khảo nghiệm:

Kết quả kiểm tra hàng tháng hàm lượng AF trên mẫu lạc khảo nghiệm và lạc

đối chứng, chỉ phát hiện AFB1 trong mẫu đối chứng sau 4 tháng thí nghiệm (bảng

3.25).

Bảng 3. 25. Hàm lượng AFB1 (µg/kg) của lạc nhân bảo quản bằng kiểm soát quá trình

Thời gian (tháng)

Lạc nhân

Đối chứng

KPH KPH KPH KPH 3,56

9,75 15,32

Khảo nghiệm

KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH

Kết quả tại bảng 3.25 cho thấy, mẫu lạc khảo nghiệm không phát hiện AF sau

6 tháng thí nghiệm, mẫu lạc đối chứng phát hiện AF sau 4 tháng thí nghiệm và vượt

ngưỡng cho phép (8 µg/kg). Kết quả bảng này khác biệt với kết quả trong nghiên cứu

3.2.7.2, lạc tiệt trùng có độ ẩm cao và nhiễm 103 CFU/g A. flavus BG1 phát hiện

AFB1 sau 28 ngày (1 tháng) còn mẫu lạc có độ ẩm 8 % nhiễm nấm mốc (bao gồm cả

nấm mốc không phải A. flavus) ở mức 1,2×102 CFU/g và không được loại tạp phát

hiện aflatoxin B1 sau 6 tháng nghiên cứu. Còn mẫu có độ ẩm 8 % có mức nhiễm nấm

mốc ban đầu là 1,2×102 CFU/g nhưng đã loại tạp, loại hạt nhăn, hạt biến màu thì

119

không phát hiện AFB1 sau 4 tháng nghiên cứu.

Kết quả khảo nghiệm cho thấy:

Lạc nhân bảo quản theo quy trình đề xuất không phát hiện có nguy cơ nhiễm

aflatoxin sau 6 tháng khảo nghiệm.

Lạc nhân trước khi đưa vào bảo quản phải đảm bảo đạt độ khô, loại tạp, loại

những hạt nhăn, lép, mốc và biến màu. Lạc đóng gói trong bao tải hai lớp, đóng gói

kín, để trong điều kiện khô thoáng ở 20 oC và ngăn côn trùng xâm nhập.

3.3.2. Quy trình bảo quản lạc bằng đóng gói hút chân không

3.3.2.1. Quy trình khảo nghiệm

Mục đích của giải pháp:

Lạc được đóng gói hút chân không kể từ giai đoạn sau thu hoạch được triển

khai tại quy mô hộ gia đình bằng máy đóng gói hút chân không trước khi đưa vào bảo

quản nhằm giảm thiểu các nguy cơ nhiễm nấm mốc, giảm điều kiện thuận lợi cho

nấm mốc này phát triển và sinh AF. Thời gian bảo quản tối thiểu là 6 tháng (tính đến

vụ thu hoạch lạc tiếp theo).

Nguyên tắc giải pháp:

Lạc nhân phải được đóng gói hút chân không trước khi bảo quản để đảm bảo

không nhiễm AF sau quá trình bảo quản (tối thiểu là 6 tháng). Quy trình dễ áp dụng

với quy mô hộ gia đình.

Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân đóng gói hút chân không như sơ đồ

120

hình 3.24.

Hình 3. 24. Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng đóng gói hút chân không

3.3.2.2. Kết quả khảo nghiệm

Lạc được khảo nghiệm bảo quản theo quy trình đề xuất được so sánh đối chứng

với lạc đưa vào bảo quản không theo các bước của quy trình 3.24, bao bì sử dụng là

túi PVC, mỗi túi đóng 1 kg. Kết quả khảo nghiệm như sau:

Kiểm tra chất lượng ban đầu của lạc trước khi đưa vào bảo quản:

- Kiểm tra độ khô của lạc đưa vào bảo quản:

Kiểm tra về mặt cảm quan: mẫu lạc xoa trên lòng bàn tay, vỏ lụa bong ra dễ

dàng.

Kiểm tra độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi: 3 mẫu lạc

được lấy tại ba vị trí khác nhau của lạc đưa vào khảo nghiệm cho kết quả độ ẩm ban

121

đầu của lạc là 8,13 %.

Như vậy độ ẩm của lạc (8,15 %) và dóc vỏ lụa đưa vào bảo quản đạt yêu cầu

theo quy trình đề xuất.

- Kết quả kiểm tra mức nhiễm nấm mốc ban đầu của lạc khảo nghiệm: mức nhiễm

nấm mốc ban đầu của lạc đưa vào khảo nghiệm là 1,1×102 CFU/g.

- Kết quả kiểm tra sàng lọc tình trạng nhiễm AF trong lạc: lạc nhân được dàn trên

khay, sau đó đưa vào máy quét đèn UV ở bước sóng 365 nm để kiểm tra. Toàn

bộ lạc đưa vào khảo nghiệm không phát hiện phát quang màu xanh.

- Lạc khảo nghiệm được loại tạp theo quy trình 3.26, lạc đối chứng không đóng

gói hút chân không.

Kiểm tra tình trạng nhiễm aflatoxin hàng tháng của các mẫu lạc khảo nghiệm:

Kết quả kiểm tra hàng tháng hàm lượng AF trên mẫu lạc khảo nghiệm và lạc

đối chứng, chỉ phát hiện AFB1 trong mẫu đối chứng sau 4 tháng thí nghiệm (bảng

3.26).

Bảng 3. 26. Kết quả hàm lượng aflatoxin B1 (µg/kg) của lạc nhân đóng gói hút chân không

Tháng

Mẫu

KPH KPH KPH KPH 3,56

9,75 15,32 19,74 25,31 39,55 53,14 76,43 85,58

Đối chứng

KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH

Khảo nghiệm

Kết quả tại bảng 3.26 cho thấy, mẫu lạc khảo nghiệm không phát hiện AF sau

12 tháng thí nghiệm, mẫu lạc đối chứng phát hiện AF sau 4 tháng thí nghiệm và vượt

ngưỡng cho phép (8 µg/kg) sau 5 tháng thí nghiệm. Kết quả bảng này khác biệt với

kết quả trong nghiên cứu 3.2.7.2, lạc tiệt trùng có độ ẩm cao và nhiễm 103 CFU/g A.

flavus BG1 phát hiện AFB1 sau 28 ngày (1 tháng), còn mẫu có độ ẩm 8,13 % có mức

nhiễm nấm mốc ban đầu là 1,1×102 CFU/g đóng gói hút chân không không phát hiện

aflatoxin B1 sau 4 tháng nghiên cứu.

Kết quả khảo nghiệm cho thấy:

Lạc nhân bảo quản theo quy trình đề xuất không phát hiện có nguy cơ nhiễm

122

aflatoxin sau 12 tháng khảo nghiệm.

Lạc nhân trước khi đưa vào bảo quản phải đảm bảo đạt độ khô, loại tạp, loại

những hạt nhăn, lép, mốc và biến màu. Lạc đóng gói hút chân không ở điều kiện nhiệt

độ phòng.

3.3.3. Quy trình bảo quản lạc nhân bằng cách sử dụng tinh dầu hồi, quế

3.3.3.1. Quy trình khảo nghiệm

Mục đích của giải pháp:

Tinh dầu ứng dụng trong bảo quản lạc nhân nhằm ức chế sự phát triển và sinh

AF trên lạc của nấm mốc, bảo quản lạc nhân bằng tinh dầu có nguồn gốc tự nhiên là

giải pháp thân thiện với môi trường, tinh dầu tồn dư trong sản phẩm không ảnh hưởng

đến an toàn thực phẩm. Thời gian bảo quản 12 tháng.

Nguyên lý của giải pháp:

Tinh dầu có tác dụng ức chế sự phát triển và phá vỡ chức năng tế bào của vi

sinh vật, cụ thể là A. flavus BG1 làm ức chế sự phát triển và sinh AF trên lạc nhân.

Quy trình bảo quản lạc nhân bằng tinh dầu hồi (quế) như hình 3.25.

Hình 3. 25. Quy trình bảo quản lạc nhân có sử dụng tinh dầu

3.3.3.2. Kết quả khảo nghiệm quy trình

Lạc được khảo nghiệm bảo quản theo quy trình 3.27 so sánh đối chứng với lạc

đưa vào bảo quản cùng chất lượng không sử dụng tinh dầu. Kiểm tra hàm lượng AF

123

trong lạc đối chứng và lạc khảo nghiệm hàng tháng, bảo quản lạc trong 12 tháng.

Kết quả kiểm tra chất lượng ban đầu như sau:

- Độ ẩm ban đầu của lạc đưa vào bảo quản được xác định là 8,57 %.

- Tổng số bào tử nấm men-mốc trong lạc nhân là 1,2×102 CFU/g.

- Kiểm tra sàng lọc không phát hiện aflatoxin trong lạc nhân đưa vào khảo

nghiệm.

Kết quả kiểm tra hàng tháng như sau:

Kết quả phân tích cho thấy, chỉ phát hiện AFB1 trong mẫu đối chứng và mẫu

có hàm lượng tinh dầu thấp nhất sau 3 tháng khảo nghiệm, không có mẫu nào phát

hiện AFB2, G1, G2.

a. Thí nghiệm bằng tinh dầu quế

Kết quả phân tích AF trong các mẫu thí nghiệm tinh dầu quế và mẫu đối chứng

như trong bảng 3.27.

Bảng 3. 27. Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu quế khác nhau theo thời gian

Nồng độ tinh dầu (%v/w)

0,0125

0,025

0,05

0,1

Mẫu đối chứng

Thời gian (tháng)

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

3,67

3,62

KPH KPH KPH

7,48

6,00

KPH KPH KPH

9,73

8,56

KPH KPH KPH

13,54

10.92 KPH KPH KPH

15,77

13,85 KPH KPH KPH

19,26

15,72 KPH KPH KPH

24,48

18,99 KPH KPH KPH

29,63

24,78 KPH KPH KPH

34,15

27,47 KPH KPH KPH

40,09

35,59 KPH KPH KPH

124

Kết quả cho thấy: mẫu đối chứng và mẫu bổ sung tinh dầu quế hàm lượng 0,0125

% có sinh AFB1 sau 2 tháng, tuy nhiên hàm lượng AFB1 phát hiện chưa vượt quá

giới hạn cho phép (≤8 g/kg) theo QCVN 8-1:2011. Mẫu lạc bổ sung tinh dầu quế từ

0,025 % không phát hiện sinh AF sau 12 tháng thí nghiệm.

Như vậy, cùng mức bổ sung tinh dầu quế nhưng lạc có độ ẩm cao hơn và mức

nhiễm A. flavus BG1 cao hơn thì sinh aflatoxin trong thời gian ngắn hơn. Tuy nhiên

với lượng tinh dầu sử dụng là 0,025 % thì đều ức chế sự phát triển và aflatoxin dù ở

độ ẩm khác nhau và mức nhiễm A. flavus BG1 khác nhau (1,2×102 và 103 CFU/g).

b. Thí nghiệm bằng tinh dầu hồi

Kết quả phân tích aflatoxin trong các mẫu thí nghiệm khả năng ức chế của tinh

dầu hồi đến khả năng sinh aflatoxin như trong bảng 3.28.

Bảng 3. 28. Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian

Nồng độ tinh dầu (%v/w)

0,4

0,8

1,6

3,2

Thời gian (tháng)

KPH

3,58

KPH

5,99

KPH

8,55

KPH

12,78

KPH

16,54

KPH

20,69

KPH

25,85

KPH

30,04

KPH

35,99

KPH

40,11

KPH

Kết quả cho thấy, mẫu bổ sung tinh dầu hồi hàm lượng 0,4 % sinh AFB1 sau 3

125

tháng, tuy nhiên hàm lượng AFB1 phát hiện chưa vượt quá giới hạn cho phép theo

QCVN 8-1:2011 sau 5 tháng thí nghiệm. Mẫu lạc bổ sung tinh dầu hồi từ 0,8 % không

phát hiện sinh AF sau 12 tháng thí nghiệm.

Như vậy, cùng mức bổ sung tinh dầu quế nhưng lạc có độ ẩm cao hơn và mức

nhiễm A. flavus BG1 cao hơn thì sinh aflatoxin trong thời gian ngắn hơn. Tuy nhiên

với lượng tinh dầu sử dụng là 0,8 % thì đều ức chế sự phát triển và aflatoxin dù ở độ

ẩm khác nhau và mức nhiễm A. flavus BG1 khác nhau (1,2×102 và 103 CFU/g).

Tính toán chi phí của việc sử dụng tinh dầu (hồi, quế) và không sử dụng tinh

dầu (lạc nhân bị nhiễm aflatoxin phải loại bỏ) như bảng 3.30 sau đây:

Bảng 3. 29. Tinh chi phí có và không sử dụng tinh dầu trong bảo quản lạc

Nguyên liệu

Đơn giá

Lượng dùng Chi phí (vnđ)

Tỉ lệ chi phí (%)

0,44

Tinh dầu quế

700.000 vnđ/1000 mL 1,25 mL

875 vnđ

9,09

Tinh dầu hồi

500.000 vnđ/1000 mL 40 mL

20.000 vnđ

100

Lạc nhân

40.000 vnđ/kg

5 kg

200.000 vnđ

Như vậy sử dụng tinh dầu quế trong bảo quản lạc, chi phí cho sử dụng tinh dầu

quế chiếm tỉ lệ 0,44 % so với đầu tư ban đầu, chi phí cho sử dụng tinh dầu hồi chiếm

tỉ lệ 9,09 % so với đầu tư ban đầu, trường hợp không sử dụng tinh dầu thì sau 3 tháng

bảo quản với mức nhiễm nấm mốc 1,2×102 CFU/g có nguy nhiễm Aflatoxin, số lạc

này phải bỏ đi không sử dụng gây tổn thất thực phẩm 100 %.

Trong hai loại tinh dầu thí nghiệm, hàm lượng tinh dầu quế (0,025 %) có khả

126

năng ức chế sự sinh aflatoxin trên lạc thấp hơn hàm lượng tinh dầu hồi (0,8 %).

3.3.4. Đề xuất quy trình bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm aflatoxin

trong lạc

3.3.4.1. Đề xuất quy trình bảo quản lạc

Hình 3. 26. Quy trình bảo quản lạc đề xuất

3.3.4.2. Thuyết minh quy trình bảo quản lạc

Từ các kết quả khảo nghiệm trên nghiên cứu đề xuất quy trình bảo quản lạc.

Lạc sau thu hoạch được làm sạch được làm khô, kiểm tra chất lượng ban đầu

127

của lạc và bảo quản theo các bước sau:

Bước 1. Kiểm tra chất lượng ban đầu của lạc trước khi đưa vào bảo quản

- Kiểm tra độ khô:

Bằng cảm quan: lạc dóc vỏ lụa, vỏ lụa có thể tróc ra khi xoa hạt lạc trên lòng

bàn tay.

Độ ẩm của lạc không quá 9,0 %.

- Mức nhiễm nấm mốc: không quá 1,2×102 CFU/g.

- Kiểm tra sàng lọc Aflatoxin:

Cho lạc trên băng chuyền chạy qua buồng có đèn UV bước sóng 365 nm (hình

3.27), nếu có viên lạc nào phát hiện có phát quang màu xanh thì loại bỏ, phần còn lại

không phát hiện có phát quang màu xanh thì thực hiện bước tiếp theo để bảo quản.

Hình 3. 27. Mô hình băng tải kiểm tra phát hiện AF trong lạc

Bước 2. Đóng bao và bảo quản

Cách 1: Đóng bao 50 kg/bao trong bao tải hai lớp. Dùng máy khâu bao bằng

tay hoặc quấn mép bao rồi khâu chéo. Bảo quản ở nhiệt độ 20±2 oC trong phòng kín.

Bảo quản trong 6 tháng.

Cách 2: Đóng 1 kg trong túi PVC, đóng gói hút chân không với áp lực hút 200

mmHg bằng máy đóng túi hút chân không (hình 3.28). Bảo quản trong 12 tháng ở

128

điều kiện nhiệt độ thường.

Hình 3. 28. Máy đóng túi hút chân không

Cách 3: bảo quản bằng sử dụng tinh dầu

Chuẩn bị giấy lọc thấm tinh dầu: Giấy lọc Whatman số 1, kích thước 350×450

mm. Được thấm lượng 1,25 mL tinh dầu quế (hoặc 40 mL tinh dầu hồi) cho bao lạc

đóng 5 kg/bao.

Bao tải hai lớp (lớp bao dứa bên ngoài và lớp bao nilon bên trong). Bao bì sạch,

khô, không bị rách. Đặt giấy lọc đã thấm tinh dầu vào giữa bao tải hai lớp. Cân 5 kg

lạc nhân, rải đều vào 2 bên giấy thấm đã đặt trong bao tải. Dùng máy khâu bao bằng

129

tay hoặc quấn mép bao rồi khâu chéo.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu, Nghiên cứu sinh đã rút ra được một số kết luận sau:

1. Đã xác định được mức nhiễm nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trong lạc của

3 tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang.

- Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu tương ứng

là 46,7 - 60 % (nhiễm ở mức 1,3×10 - 9,3×108 CFU/g); 26,7 - 56,7 % (1,1×10 -

7,5×108 CFU/g); 10 - 23,3 % (1,1×10 - 15×103 CFU/g). Tỉ lệ nhiễm nấm men -

mốc vượt ngưỡng tương ứng là 33,3 - 40,0 %; 30,0 - 36,7 % và 10,0 - 13,3 %.

- Tỉ lệ nhiễm aflatoxin trong lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu tương ứng là

30 - 53,3 % (với hàm lượng 0,34 - 1.498 µg/kg); 26,7 - 40 % (với hàm lượng

0,64 - 215 µg/kg); 3,3 - 23,3 % (với hàm lượng 0,65 - 2,3 µg/kg). Tỉ lệ nhiễm

aflatoxin vượt ngưỡng cho phép trong lạc nhân và lạc củ tương ứng là 10 - 16,7

%; 10 - 13,3 %; không phát hiện aflatoxin vượt ngưỡng cho phép trong lạc rang

húng lìu.

- Nghiên cứu đã phân lập được 20 chủng nấm mốc từ lạc mốc của Bắc Giang,

định danh và khẳng định được 4 chủng là Aspergillus flavus, trong số đó có

chủng A. flavus BG1 có khả năng sinh AFB1 và AFB2 cao tương ứng là 1.310

và 25,2 µg/kg sau 10 ngày nuôi cấy trên lạc tiệt trùng.

2. Đã xác định được ảnh hưởng của các yếu tố đến sự phát triển của A. flavus BG1

và mức sinh aflatoxin trên lạc:

- Lạc nhân có độ ẩm từ 10 - 14 %, A. flavus BG1 đều có thể phát triển và AFB1

vượt ngưỡng cho phép sau 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ 25 oC. Lạc có độ ẩm

oC. Độ ẩm có quan hệ tuyến tính với mức nhiễm aflatoxin trên lạc theo thời gian.

không vượt quá 8 % không sinh aflatoxin sau 4 tháng bảo quản ở nhiệt độ 25

- Nhiệt độ từ 40 oC có khả năng ức chế sự phát triển và sinh aflatoxin của A. flavus

BG1. Ở điều kiện nhiệt độ 25, 30, 35 và 20 oC, A. flavus BG1 sinh AFB1 vượt

ngưỡng cho phép sau thời gian tương ứng là 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần và 12 tuần.

Nhiệt độ không có quan hệ tuyến tính với mức nhiễm AF trên lạc, A. flavus BG1

130

phát triển và sinh aflatoxin ở khoảng nhiệt độ ≤ 35 oC.

- Đã xác định được phương trình hồi quy tuyến tính của ba yếu tố: khi thời gian

tăng lên 1 tuần thì hàm lượng AFB1 tăng lên 1,997 µg/kg; độ ẩm tăng lên 1 %

thì hàm lượng AFB1 tăng lên 7,969 µg/kg; mức nhiễm A. flavus tăng lên 1

CFU/g thì AFB1 tăng lên 1,135×10-5 µg/kg.

- Với nồng độ tinh dầu quế 0,025 % v/w hoặc tinh dầu hồi 0,8 % v/w có khả năng

ức chế nấm mốc phát triển và không phát hiện aflatoxin sau 5 tháng nghiên cứu.

3. Đã đề xuất giải pháp bảo quản lạc nhằm tránh nguy cơ nhiễm nấm mốc và

aflatoxin.

- Đã đề xuất được giải pháp bảo quản lạc hiệu quả ở quy mô hộ gia đình bằng các

cách: kiểm soát chất lượng, sử dụng tinh dầu hồi (hoặc quế), đóng gói hút chân

không với áp lực hút chân không 200 mmHg, bảo quản lạc được ít nhất 12 tháng.

Kiến nghị:

- Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng các giải pháp bảo quản lạc ở quy mô lớn hơn, đặc

biệt quy trình bảo quản lạc bằng kiểm soát chất lượng để nâng cao thời hạn bảo

quản.

- Nghiên cứu mở rộng việc áp dụng tinh dầu trong bảo quản và chế biến các sản

phẩm của lạc để có được công nghệ chế biến sản phẩm từ lạc không chỉ an toàn

131

còn mang lại giá trị cảm quan tốt cho sản phẩm.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Lê Thị Hồng Hảo, Lê Thị Phương Thảo, Nguyễn Hùng Long, Phạm Xuân

Đà, Hà Duyên Tư (2014) Đánh giá mức độ ô nhiễm mycotoxin trong ngô, lạc ở một

số xã tại huyện Lục Nam Bắc Giang năm 2013; Tạp chí Dinh dưỡng và Thực phẩm,

Tập 10 - số 3 - tháng 9 năm 2014, tr. 76-84.

2. Lê Thị Phương Thảo, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Hùng Long, Phạm Xuân

Đà, Hà Duyên Tư (2014) Kiến thức, thực hành của người dân trong xử lý và bảo

quản lạc sau thu hoạch tại một số xã huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang năm 2013; Tạp

chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 10(159), tr. 96-100.

3. Le Thi Phuong Thao, Le Thi Hong Hao, Ta Thi Yen, Pham Xuan Da, Le

Thanh Mai, Ha Duyen Tu (2017) Isolation and Selection of Aflatoxin producing

Aspergillus flavus from peanut; Viet Nam Journal of Science and Technology, Vol.

55 (5A), pp 125-133.

4. Nguyễn Thành Trung, Phạm Như Trọng, Lê Thị Hồng Hảo, Lê Thị Phương

Thảo (2017) Xây dựng phương pháp phân lập, định danh nấm Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus từ lạc; Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Tập 22, số

3/2017, tr. 128-131.

5. Le Thi Phuong Thao, Le Thi Hong Hao, Pham Xuan Da, Le Thanh Mai, Ha

Duyen Tu (2017) Effect of Some Factors on Aflatoxins Production of Aspergillus

flavus in Peanut of Vietnam; Hội thảo khoa học ASEAN lần thứ 15 (15th Asean Food

132

Conference) tháng 11/2017. ISBN: 978-604-67-1007-3, pp 169-175.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1]

Bộ Y tế (2011), QCVN 8-1:2011/BYT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn độc tố vi nấm trong thực phẩm, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành kèm theo Thông tư số 02/2011/TT-BYT ngày 13 tháng 01 năm 2011.

[2]

Bộ Y tế (2007), Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm, 6.5. Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc, Bộ Y tế, Hà Nội, tr. 61.

[3] Dự án Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp No.2283-VIE(SF) (2014), Kỹ

thuật trồng lạc, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.

[4]

Lê Ngọc Tú, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thủy, Trần Thị Xô, Tô Kim Anh, Nguyễn Trọng Cẩn, Lưu Duẩn, Quản Lê Hà, Ngô Đăng Nghĩa, Nguyễn Xuân Sâm, Nguyễn Thị Sơn, Lê Thị Liên Thanh, Đặng Thị Thu, Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Tiến Vĩnh, (2006), Độc tố học và An toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 396.

[5]

Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Bình, Vũ Đình Huyên, Trịnh Thị Thanh Nga, Nadia Oulaha, (2014), "Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu quế đối với vi khuẩn Listeria innocua LRGIAO1". Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 52(5C), tr. 115-120.

[6]

Lê Thị Hợp, Lê Danh Tuyên (2010), Tổng điều tra dinh dưỡng 2009-2010, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, 248.

[7]

Lê Văn Giang, Phan Thị Kim (2011), "Đánh giá ô nhiễm Aflatoxin trong lạc, ngô và thử nghiệm áp dụng biện pháp phòng trừ cho sản phẩm chế biến tại 3 xã huyện Tân Kỳ tỉnh Nghệ An". Tạp chí Y học thực hành. 6/2011(767), tr. 80-82.

[8] Mai Lê, Bùi Đức Hợi và Lương Hồng Nga (2013), Bảo quản lương thực, Nhà

xuất bản Bách khoa - Hà Nội, 232.

[9] Nguyễn Thu Mai và Nguyễn Bảo Lộc và Lâm Thị Việt Hà (2009), "Phân lập và định danh sơ bộ một số loài Aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh - TP Cần Thơ". Tạp chí Khoa học. 11, tr. 301-3909.

[10] Nguyễn Văn Thắng (2016), Vật lý khí quyển, Nhà xuất bản Tài nguyên - Môi

trường và Bản đồ Việt Nam, Hà Nội, 171.

[11] Nguyễn Văn Thắng (2017), Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật phòng chống xâm nhiễm của nấm Aspergillus flavus gây độc tố Aflatoxin đối với lạc, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội.

133

[12] Nguyễn Văn Thắng, Phan Quốc Gia, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Chỉnh, Nguyễn Xuân Thu, (2010), "Ảnh hưởng của công nghệ sau thu hoạch tới sự

phát triển của nấm A. flavus và khả năng sinh độc tố Aflatoxin ở lạc". Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam. 3(16), tr. 87-93.

[13] Nguyễn Văn Thắng, Phan Quốc Gia, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Chỉnh, Nguyễn Xuân Thu, (2011), "Ảnh hưởng của công nghệ sau thu hoạch tới sự phát triển của nấm A. flavus và khả năng sinh độc tố Aflatoxin ở lạc". Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam. 3(16), tr. 87-93.

[14] Nguyễn Văn Tuấn (2014), Phân tích dữ liệu với R, Nhà xuất bản tổng hợp

thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, 518.

[15] Nguyễn Văn Viết, Tạ Kim Bình, Nguyễn Thị Yến, (2006), Kỹ thuật trồng một số giống lạc và đậu tương mới trên đất cạn miền núi, Tái bản lần 4, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

[16] Phạm Thị Tố (2003), Nấm mốc lương thực, thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo

dục, Hà Nội, 119.

[17] Phạm Xuân Hội và Đàm Quang Hiếu (2010), "Phát hiện nấm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trên lạc ở miền bắc Việt nam bằng phản ứng multiplex PCR". Tạp chí Sinh học. 32(2), tr. 54-59.

[18] Tổng Cục Thống kê (2013), Sản lượng lạc phân theo địa phương, truy cập ngày 15/4-2013, tại trang web https://gso.gov.vn/default.aspx?tabid.

[19] Tổng cục thống kê (2018), Số liệu thống kê, truy cập ngày 17/10-2018, tại

trang web tps://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=713.

[20] Tổng Cục Thống kê (2018), Số liệu thống kê - Danh sách, truy cập ngày 30/4-

2018, tại trang web https://gso.gov.vn/default.aspx?tabid=717.

[21] Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng (1993), TCVN 2384:1993: Lạc

quả và lạc hạt - Phương pháp thử, Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường.

[22] Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng (2004), TCVN 7407:2004: Ngũ cốc, đậu đỗ và hạt có dầu - Xác định Aflatoxin bằng phương pháp sử dụng cột ái lực miễn dịch, Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường.

[23] Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng (2008), TCVN 2843-2008: Lạc -

Peanuts, Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường, tr. 3-5.

[24] Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng (2010), TCVN 8275-2:2010/ ISO 21527-2:2008. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp đinh lượng nấm men và nấm mốc. Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95. 15 tr.

134

[25] Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng (2011), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu, TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009), Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường, Hà Nội, tr. 19.

[26] Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thành Trung, Phạm Gia Huệ, Bùi Thanh Nhã, (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản hoa học và kỹ thuật, 93.

[27] Trần Kim Ngọc, Phạm Duy Hưng, Nguyễn Văn Lợi, (2017), "Nghiên cứu tuyển chọn cây trội giống quế bản địa (Cinnamomum Cassia BL.) ở huyện Trà Bồng, Tỉnh Quảng Ngãi". Tạp chí Khoa học & Công nghệ Nông nghiệp. 1(2), tr. 321-330.

[28] Viện Dinh dưỡng - Bộ Y tế (2007), Bảng thành phần thực phẩmViệt Nam,

Nhà xuất bản y học, 527.

[29] Vũ Thị Hường, Triệu Thị Hồng Hạnh (2015), "Đánh giá tình hình sinh trưởng và hiệu quả kinh tế của mô hình rừng trồng quế (Cinnamomum Cassia Blume) tại xã Yên cư - huyện cợ mới - tỉnh Bắc Cạn". Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp. 3-2015, tr. 11-16.

Tiếng Anh

[30] Abdi Mohammed and Alemayehu Chala (2014), "Incidence of Aspergillus contamination of groundnut (Arachis hypogaea L.) in Eastern Ethiopia". African Journal of Micobiology Research. 8(8), pp. 759-765.

[31] Allen J. St. Angelo and Robert L. Ory (1983), Lipid Degradation During Seed Deterioration Symposium: Deterioration Mechanisms in Seeds, The American Phytopathological Society, New Orleans, LA, pp. 315-317.

[32] Biljana Stojanovska - Dimzoska, Zehra Hajrulai - Musliu, Elizabeta Dimitrieska - Stojkovic, Risto Uzunov, Pavle Sekulovski, (2013), "Occurrence of Aflatoxins in Peanuts and Peanut Products Determined by Liquid Chromatography With Flourescence Detection". Journal of Natural Science 124, pp. 27-35.

[33] Bui Thi Mai Huong et al. (2016), "Dietary Exposure to Aflatoxin B1, Orchatoxin a and Fumonisins of Adults in Lao Cai Province, Viet Nam: A Total Dietary study Approach". Food Chemical Toxicology. 98(Pt B), pp. 127- 133.

[34] C. K. George, Peermade Development Society, India, (2004), "Star anise". in Peter, K. V., Editor, Handbook of Herbs and Spices, Woodhead Publishing, p. 360.

[35] C.W. Hesseltine, O.L. Shotwell, J.J. Ellis and R.D. Stubblefield, (1996), "Aflatoxin Formation by Aspergillus flavus". Bacteriological review. 30(4), pp. 795-805.

[36] Carl A. Batt, Mary Lou Tortorello (2014), "Encyclopedia of Food

135

Microbiology". Academic Press is an imprint of Elsevier, London.

[37] Codex Alimentatius (2001), Maximum level and sampling plan for total aflatoxins in peanuts intended for further processing, CODEX STAN 209- 1999, Rev. 1-2001, Codex Alimentarius.

[38] Codex Alimentatius International Food Standards Code of practice for the prevention and reduction of aflatoxin contamination in tree nuts, CAC/RCP 59-2005.

[39] Codex Alimentatius International Food Standards

(1995), CODEX STANDARD FOR PEANUTS, CODEX STAN 200-1995, Codex Alimentatius International Food Standards.

[40] Codex Alimentatius International Food Standards (1995), General Standards for contaminants and toxin in food and feed, CODEX STAN 193-1995, Codex Alimentatius International Food Standards, p. 9.

[41] CRC Press Boca Raton Boston New York Washington DC (2000), The stability and shelf-life of food, ed. David Kilcast and Persis Subramaniam, Woodhead Publishing limited, 340.

[42] Cynthia Bley N'Dede, Curtis M. Jolly, Davo Simplice Vodouhe and Pauline E. Jolly, (2013), "Aflatoxin and Peanut Production Risk and Net Incomes". Aflatoxins - Recent Advances and Future Prospects, INTECH.

[43] D Bhatnagar, K C Ehrlich, G G Moore, and G A Payne, (2014), "Aspergillus flavus". in Carl A. Batt, Mary Lou Tortorello, Editor, Encyclopedia of Food Microbiology, Academic Press is an imprint of Elsevier, London, pp. 77-92.

[44] D. Dhanasekaran, S. Shanmugapriya, and N. Thajuddin and A. Panneerselvam (2011), "Aflatoxins and Aflatoxicosis in Human and Animals". in Guevara- Gonzalez, Ramon G., Editor, Aflatoxins - Biochemistry and Mocular Biology, INTECH, pp. 221-254.

[45] David Ellis, et al. (2007), Descriptions of medical fungi, Mycology unit, Women’s and children’s hospital, School of Molecular & Biomedical Science University of Adelaide, Adelaide, Australia.

[46] David Forman and Jacques Ferlay (2014), "The global and regional burden of cancer". World cancer report 2014, International Agency for Research on Cancer, World Health Organization., p. 16.

[47] David Ondieki, et al. (2014), "Rapid assessment of aflatoxin contamination of groundnuts by thin layer chromatography and competitive enzyme linked immunosorbent assay from selected divisions of Busia county in Kenya". African Journal of Food Science and Technology. 5(1), pp. 12-20.

136

[48] Dusanee Thanaboripat, Yaowapa Suvathi, Prapaporn Srilohasin, Saowalak Sripakdee, Orphan Pathanawanitchai án Sittichai Charoensettasilp, (2007), "Inhibitory effect of essential oils on the Growth of Aspergillus flavus". KMITL Sci Tech J. 7(No. 1 Jan. - Jun. 2007), p. 7.

[49] E.C. Surendranatha Reddy and C. Sudhakar and N.P. Eswara Reddy (2011), "Afflatoxin contamination in groundnut induced by Aspergillus flavus type fungi: A critical review". International Journal of applied biology and pharmaceutical technology, India. Vol. 2(issue 2), pp. 180-192.

[50] E.M. Embaby and Mona M. Abdel-Galel (2014), "Detection of fungi and aflatoxins contaminated peanut samples (Arachis hypogaea L.)". Journal of Agricultural Technology 10(2), pp. 423-437.

[51] EErich Schmidt, Leopold Jirovetz, Gerhard Buchbauer, Gernot A. Eller, Ivanka Stoilova, Albert Krastanov, Albena Stoyanova and Margit Geissler, (2006), "Composition and Antioxidant Activities of the Essential Oil of Cinnamon (Cinnamomum Zeylanicum Blume) Leaves from Sri Lanka". Jeobp. 9(2), pp. 170-182.

2017-2017, accessed Dec,

[52] Elisaveta Sandulachi (2012), Water Activity Concept and Its Role in Food Preservation from 10 https://www.researchgate.net/publication/310605656_WATER_ACTIVITY_ CONCEPT_AND_ITS_ROLE_IN_FOOD_PRESERVATION.

[53] Elsasser, T.J., Klasing, K.C., and Filipov N. and Thompson F. (2000), The metabolic consequences of stress: Targets for stress and priorities of nutrient use, The Biology of Animal Stress. CABI Publishing, New York.

[54] Enjie Diao, et al. (2015), "Factors Influencing Aflatoxin Contamination in Before and After Harvest Peanuts: A review". Journal of Food Research. Vol. 4, No. 1; 2015, pp. 148-154.

[55] Erwin Wasowicz, Anna Gramza, Marzanna Hes, Henryk H. Jelen, Józef Korczak, Maria Malecka, Sylwia Mildner-Szkudlarz, Magdalena Rudziñska, Urszula Samotyja, Renata Zawirska-Wojtasiak, (2004), "Oxidation of Lipids in Food". Polish Journal of Food and Nutrition Sciences. 13/54(SI 1), pp. 87- 100.

[56] Estelle Chaix, Carole Guillaume and Valérie Guillard (2014), "Oxygen and Carbon Dioxide Solubility and Diffusivity in Solid Food Matrices: A Review of Past and Current Knowledge". Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 13, 2014, pp. 261-286.

[57] FAYYAZ-UL-HASAN and MUKHTAR AHMED (2012), "Oil and Fatty Acid composition of peanut cultivars grown in Pakistan ". Pak. J. Bot. 44(2), pp. 627-630.

[58] Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Laura De Martino, Raffaele Coppola and Vincenzo De Feo, (2013), "Effect of Essential Oils on Pathogenic Bacteria". Pharmaceuticals. 6, pp. 1451-1474.

[59] Food and Agriculture Organization of the United Nations (2002), Groundnut:

137

Post-harvet Operation, Danilo Mejia, Beverly Lewis, 'Editor', AGSI/FAO.

[60] Food and Agriculture Organization of the United Nations (2017), Commodity balances - Crops Primary Equivalent, accessed December 24-2017, from http://www.fao.org/faostat/en/#data/BC/visualize.

[61] Food and Agriculture Organization of the United Nations (2018), Import - export trends in Viet Nam 2009 - 2013, accessed May 02-2018, from http://www.fao.org/faostat/en/#data/BC/visualize.

[62] Food and Agriculture Organization of the United Nations (2018), Production from accessed April 30-2018, groundnuts, with shell,

of http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC.

[63] Food and Drug Administration (2013), Revised Guidelines for the Assessment of Microbiological Quality of Processed Foods, FDA Circular No. 2013-010, Health, Department of, Department of Health, Republic of Philipin, Filinvest Corporate City; Alabang, MuntinlupaCity, p. 11.

[64] Food Standards Agency (2016), Mycotoxins sampling guidance, Agency,

Food Standards, Food Standards Agency UK, p. 35.

[65] G.H.C.M. Hettiarachchi and Jaanaki Gooneratne and W.K. Hirimburegama (2001), "Effect of initial moisture content and relative humidity on the accumulation of aflatoxin in maize grain (zee mays) during storage ". J. Natn. Sci. Foundation Sri Lanka 2001. 29(1&2), pp. 29-34.

[66] George N. Mbata and Thomas W. Phillips (2001), "Effects of Temperature and Exposure Time on Mortality of Stored-Product Insects Exposed to Low Pressure". Journal of Economic Entomology. Oct 2001, pp. 1302-1307.

[67] Gerald N. Wogan (1996), "Chemical Nature and Biological Effects of the

Aflatoxins". Bacteriological review. 30(2), pp. 460-470.

[68] Gong, Y.Y., et al. (2002), "Dietary aflatoxin exposure and impaired growth in young children from Benin and Togo: Cross sectional study". Br. Med. J. 2002. 325, pp. 20-21.

[69] Gordon L. Robertson (2009), "Foof packaging". in Campbell-Platt, Geoffrey, Editor, Food Science and Technology, Wiley-Blackwell A John Willey & Son, Ltd, Publication, pp. 279-298.

[70] H. Abidin, S.Mohd, and Rosni và A.Hazniza (2003), "Status of aflatoxin contamination in groundnut from five districts in Perak". J. Trop. Agric. and Fd. Sc. 31(2, 2003), pp. 199-205.

[71] H.G. Chang and P.Markakis (1981), "Effect of Moisture Content on Aflatoxin Production in Barley". American Association of Cereal Chemists, Inc. Vol. 58, No.2, pp. 89-91.

[72]

138

International Agency for Research on Cancer (2015), Mycotoxin control in low- and middle- income countries, Christopher P. Wild, J. David Miller, and

John D. Groopman,, 'Editor', International Agency for Research on Cancer, Geneva.

[73]

J.R.Wartu, C.M.Z.Whong, and V.J.Umoh and A.W.Diya (2015), "Occurrence of Aflatoxin Levels in Harvest and Stored Groundnut Kernels in Kaduna State, Nigeria., Toxicology and Food Technology (IOSR-JESTFT)". IOSSR Journal of Environmental Science. Volume 9(Issue 1 Ver.II), pp. 62-66.

[74]

Ji-Yeon Chun (2002), Vitamin E content and stability in peanut product during processing and storage Doctor of Philosophy, Philosophy, The university of Georgia in Partial, Athens, Georgia.

[75] K. Shehu and M.T. Bello (2011), "Effect of Enviromental Factors on the Growth of Asspergillus Species Associated with stored Millet Grains in Sokoto". Nigerian Journal of Basic and Applied Science. 19(2), pp. 218-223.

[76] Leon G. M. Gorris and Herman W. Peppelenbos (2007), "Modified- Atmosphere Packaging of Produce". in M. Shafiur Rahman, Editor, Handbook of Food Preservation, CRC Press Taylor & Francis Group, London, pp. 316- 329.

[77] Linda A. Hall and D. W. Denning (1994), "Oxygen requirements of

Aspergillus scpecies". Journal of Medical Microbiology. 41, pp. 311-315.

[78] M. Ravi Teja, K. Vijay Krishna Kumar, P. Srilakshmi, H. Sudini, P. Kishore Varma and S. R. Koteswara Rao, (2017), "Prevalence of Aspergillus flavus Infection and Aflatoxin Contamination of Groundnut in Telangana and Andhra Pradesh". International Journal of Pure and Applied Bioscience. 5(5), pp. 1603-1614.

[79] Mallappa Kumara, Mohd Sayeed Akkhtar and Uma Rani Sinniah (2016), "Antimicrobial Properties of Plant Essential Oils against Human Pathogens and Their Mode of Action: An Updates Review". Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, p. 21.

[80] Masako Takino and Toshitsugu Tanaka (2008), Determination of aflatoxins in

food by LC/MS/MS, Agilent Technology.

[81] Matome Gabriel Thathana, Hunja Murage, Akebe Luther King Abia and Michael Pillay, (2017), "Morphological Characterization and Determination of Aflatoxin-Production Potentials of Aspergillus flavus Isolated from Maize and Soli in Kenya". Agriculture. 7(80), p. 14.

[82] Mehdi Sameni, Arne Dũbecke and Jean-Frédéric F Weber (2014), "Simultaneous Multi-Residue Determination of Mycotoxins in Foods Using LC-MS/MS". Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 5(2), p. 6.

139

[83] Michele Hoeltz, et al. (2012), "The occurrence of Aflatoxin B1 contamination in Peanuts and Peanut Products Marketed in Southern Brazil". Brazilian Archives of Biology and Technology. Vol.55, n.2, pp. 313-317.

[84] Mina M. Yooussef, Quyen Pham, Premila N. Achar, Marikunte Yanjarappa Sreenivasa, (2016), "Antifungal activity of essential oils on Aspergillus parasiticus isolated from peanuts". Journal of Plant Protection Research. 56(2), pp. 139-142.

[85] Ministry of Agriculture and Cooperatives (2011), Thai Agricultural standard: TAS 4700-2011 - Dried peanut, Standards, National Bureau of Agricultural Commodity and Food.

[86] Mohamed A. Zain (2011), "Impact of mycotoxins on humans and animals".

Journal of Saudi Chemical Society. 15, pp. 129-144.

[87] Mohammad Shafiur Rahman (2007), "Packaging as a Preservation Technique". in Rahman, M. Shafiur, Editor, Handbook of Food Preservation, CRC Press Taylor & Francis Group, pp. 907-914.

[88] Mohammad Shafiur Rahman and Theodore P. Labuza "Water Activity and Food Preservation". in Rahman, M. Shafiur, Editor, Handbook of Food Preservation, CRC Press Taylor & Francis Group, London, pp. 447-471.

[89] Morten Hydgaard, Tina Mygind and Rikke Louse Meyer (2012), "Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components". Frontiers in Microbiology. 3(12), p. 12.

[90] Mukund Nagarnaik, Arun Sarjoshi, Neeta Phatak, Mangesh Wandhare, Meenal Dhabale, and Girish Pandya, (2014), "A Validation Study of Aflatoxin in Real Samples of Peanuts and Dry Fruits in Urban City by HPTLC". Journal of Food and Dairy Technology. 2(2), pp. 13-20.

[91] Musa Özcan and Serap Seven (2003), "Physical and Chemical analysis and fatty acid composition of peanut, peanut oil and peanut butter from ÇOM and NC-7 cultivars". Grasas y Aceites. Vol. 54. Fasc. 1(2003), pp. 12-18.

[92] Mutegi C.K., et al. (2013), "Effect of storage conditions on quality and aflatoxin contamination of peanuts (Arachis hypogae L.)". International Journal of AgriScience. Vol. 3(10), pp. 746-758.

[93] Neil D. Theise (2014), "Liver cancer". World Cancer Report 2014, International Agency for Research on Cancer, World Health Organization., p. 403.

[94] Nga-Thi-Thanh Trinh, Raja Lejmi, Adem Gharsallaoui, Emilie Dumas, Pascal Degraeve, Mai Le Thanh and Nadia Oulahal, (2015), "Effect of emulsification the antilisterial activity of and spray-drying microencapsulation on transcinnamaldehyde". Journal of Microencapsulation, p. 5.

140

[95] Nga Thi Thanh Trinh, et al. (2013), "Study of the antimicrobial effect of essential oils from Vietnam to assess their potential application to food preservation". Tạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam. 51(6A), pp. 346- 352.

[96] Nida’a Shihab Hamed and Abeer Fauzi Murad and Eman Abdul-Wahed Abdul-Rahim (2016), "Molecularly Diagnostic of Aflatoxigenic Aspergillus flavus Isolated from Nuts". Research Journal of Environmental Toxicology. 10(1), pp. 39-49.

[97] Nur Nasulhah Kasim, Syarifah Nursyimi Azlina Syed Ismail, N.D. Masdar, Fatimah Ab Hamid, W.I Nawawi, (2014), "Extraction and Potential of Cinnamon Essential Oil towards Repellency and Insecticidal Activity". International Journal of Scientific and Research Publications. 4(7).

[98] Okky Setyawati Dharmaputra (2005), "Aspergillus flavus infection and aflatoxin contamination in peanuts at various stages of the delivery chains in cianjur regency". west java, Indonesia, Biotropia. No.24, 2005, pp. 1-19.

[99] Olusegun Atanda, Hussaini Anthony Makun, Isaac M. Ogara, Mojisola Edema, Kingsley O. Idahor, Margaret E. Eshiett and Bosede F. Oluwabamiwo, (2013), "Fungal and Mycotoxin Contamination of Nigerian Foods and Feeds". Mycotoxin and Food Safety in Dveloping Countries, INTECH.

[100] P. A. Paranagama, S. Wimalasena, G. S. Jayatilake, A. L. Jayawardena, U. M. Senanayake and A. M. Mubarak, (2001), "A Comparison of Essential Oil Constituents of Bark, Leaf, Root and Fruit of Cinnamon (Cinnamomum Zeylanicum Blum) Growth on Sri Lanka". J. Natn. Sci. Foundation Sri Lanka 2001. 29(3&4), pp. 147-153.

[101] P. Rodrigues, et al. (2007), "Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins". Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. 2(1), pp. 527-534.

[102] Paola Giomi, et al. (2008), "Effect of aw and CO2 level on Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in high moisture maize post-harvest". International Journal of Food Microbioly 122(2008), pp. 109-113.

[103] Paola GIORNI, et al. (2012), "Comparison of temperature and moisture requirements for sporulation of Aspergillus flavus sclerotia on natural and artificial substrates". Fungal Biology 116, pp. 637-649.

[104] Peter J. Cotty, Ramon Jaime-Garcia (2007), "Influences of climate on aflatoxin producing fungi and aflatoxin contamination". International Journal of Food Microbiology. 119(2007), pp. 109-115.

[105] Philippe Villers (2017), "Food Safety and Aflatoxin Control". Journal of Food

Research. 6(2), p. 12.

[106] Richard A. Frazier (2009), "Food chemistry". in Geoffrey Campbell-Platt, Editor, Food Science and Technology, A John Willey & Son Ltd. Publication, New Delhi, pp. 25-31.

141

[107] Robert H. Driscoll and Mohammad Shafiur Rahman (2007), "Types of Packaging Materials Used for Foods". in Rahman, M. Shafiur, Editor,

Handbook of Food Preservation, CRC Press Taylor & Francis Group, pp. 917- 938.

[108] Ronal T. Riley (2014), "Naturally occurring chemical carcinogens". World Cancer Report 2014, International Agency for Research on Cancer, World Health Organization, France.

[109] S S Navi, et al. (1999), "A Pictorial Guide for the Identification of Mold Fungi on Sorghum Grain". International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics - Patancheru 502 324 - Andhra Pradesh, India and Natura Resources Institute - Central Avenue - chatham Maitime - Kent ME4 4TB - UK. Information Bulletin No. 59, pp. 24-25.

[110] S.A. Bankole and A. Adebanjo (2003), "Review Mcotoxins in food in West Africa: current situation and posibilities of controlling it". African Journal of Biotechnology. 2(9), pp. 254-263.

[111] Sabina Anžlovar, Matevž Likar, Jasna Dolenc Koce, (2016), "Antifungal potential of thyme essential oil as a preservative for storage of wheat seeds". Acta Bot. Croat. 76(1), pp. 64-71.

[112] Shalini S. Arya, Akshata r. Salve, S. Chauhan, (2016), "Peanuts as functional

food: a review". Journal of Food Science and Technology. 53(1), pp. 31-41.

[113] Shigenobu Koseki and Kazuhiko Itoh (2002), "Effect of Nitrogen Gas Packaging on the Quality and Microbial Growth of Fresh-Cut Vegetables under Low Temperatures". Journal of Food Protection. 65(2), pp. 326-332.

[114] SHIV K. BERRY (1982), "Fatty Acid Composition of 16 Groundnut (Arachis hypoaea L.) cultivars grown under Malaysian conditions". Pertanika. 5(1), pp. 20-324.

[115] Soher E. Aly, Bassem A. Sabry, Mohamed S. Shaheen, Amal S. Hathout, (2014), "Assessment of antimycotoxigenic and antioxidant activity of star anise (Illicium verum) in vitro". Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences. 15, pp. 20-27.

[116] Sonia S.P. Bulaong and Okky S. Dharmaputra (2002), "Fungal population, Aflatoxin and free fatty acid contents of peanuts packed in different bag types". BIOTROPIA: . 19, pp. 1 - 25.

[117] The Commission of the European Communities (2006), Commission Regulation (EC) No 1881/2006 of 19 December 2006: Setting maximum levels for certain contaminants on food stuffs, Official Journal of the European Uniion L. 364/5, commission, European Union, p. 20.

[118] The World Bank (2016), Vietnam Food Safety ríks management: Challenges

142

and Opportunities, Washington DC 20433.

[119] Urban L. Diener and Norman D. Davis (1977), Factor influencing production of Aflatoxin in peanuts, Aflatoxin formation in peanuts by Aspergillus flavus, Agricultureral Expiriment Station, Auburn University, Auburn, Alabama.

[120] Urban L. Diener and Norman D. Davis (1977), Aflatoxin formation in peanuts by Aspergillus Flavus. Alabama Agricultural Experiment Station, BULLETIN 493.

[121] USDA (2010), USDA Commodity Requirements - Peanut Products for use in

Domestic Programs, PP12, Agriculture, United States Department of, p. 7.

[122] USDA (2016), USDA Commodity Requirements - Peanut Products for use in International Food Assistance programs, PP11, United States Department of Agriculture, p. 3.

[123] WHO (2006), Impacts of Aflatoxins on Health and Nutrition, Report of an expert group meeting, Brazzaville, World Health Organization regional office for Africa.

[124] Williams ALBARRACÍN H., Christian ALFONOSO A., Iván C. SÁNCHEZ B., (2012), "Application of essential oils as a preservative to improve the shelf life of nile tilapia (Oreochoromisniloticus)". VITAE, REVISTA DE LA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA. 19(1), pp. 34-40.

[125] World Health Organization (2014), Evaluations of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA), accessed 4/3/2017, from apps.who.int/food-additives-contaminations-jecfa- database/search.aspx?fcc=2.

[126] Worldatlas (2018), Top Peanut (Groundnut) Producing Countries, accessed 19 April-2018, from https://www.worldatlas.com/articles/top-peanut-groundnut- producing-countries.html.

[127] Yaru Li, Ying Nie, Linyan Zhou, Shutong Li, Xuanming Tang, Yang Ding and Shuying Li, (2014), "The posible mechanism of antifungal activity of cinnamon oil against Rhizopus nigricans". Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 6(5), pp. 12-20.

[128] Younis M. H. Younis and Kamal. M. Malik (2003), "TLC and HPLC assays of aflatoxin contamination in Sudanese peanuts and peanut products". Kuwait J. Sci. Eng. . 30(1), pp. 79-92.

[129] French Food Safety agency (2006), Summary report: Risk assessment for

mycotoxins in human and animal food chains.

143

[130] European Parliament and Council (2006), Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs, L 70/12, Official journal of the European Union.

PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN TRONG LẠC

1.1. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân thu thập vào mùa hè tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh

Hóa và Nghệ An

Bảng PL1. 1. Kết quả phân tích Tổng số bào tử nấm men-mốc và AF trong các mẫu lạc nhân thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang năm 2013

Nghệ An

Thanh Hóa

Bắc Giang

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

TS BT nấm men-mốc (CFU/g)

KPH

5 × 10

KPH KPH

2 × 102

KPH

0,76

KPH

2,1 × 105

8,4

KPH

KPH KPH

3 × 103

KPH

648

KPH

2 × 104

1,5

KPH

KPH KPH

1,1 × 102

KPH

3,1

KPH

7,5 × 108

122

KPH

5 × 101

KPH KPH

8 × 101

KPH

KPH KPH

KPH

1,5 × 105

1,9

KPH

1 × 102

0,74

KPH

9 × 101

KPH

0,66

KPH

1,5 × 101 KPH KPH

KPH

2 × 101

KPH KPH

KPH

KPH KPH

3 × 105

KPH

5,8 × 102

0,76

KPH

1 × 102

KPH KPH

1,2 × 102

KPH

2,4

KPH

9 × 104

16,6

KPH

6 × 102

KPH

0,76

KPH

KPH KPH

KPH

2,1 × 102

2,1

KPH

4,6 × 101

2,1

KPH

7,5 × 102

1,3

KPH

1,2 × 105

KPH

9567

931

KPH

KPH KPH

3 × 103

KPH

5,2

KPH

9,8 × 105

151

Nghệ An

Thanh Hóa

Bắc Giang

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

TS BT nấm men-mốc (CFU/g)

3,5 ×103

0,81

KPH

2,5 × 105

KPH

7,5 × 106

6,6

KPH

KPH KPH

KPH

8 × 102

1,2

KPH

9,3 × 108

115

KPH

8,8

KPH

5 × 103

1,5

KPH

5 × 102

0,74

KPH

4,7 × 105

252

KPH

4 × 106

160

KPH

KPH KPH

KPH

6,4 × 104

KPH

KPH KPH

5.3 × 101

KPH

KPH KPH

KPH

7 × 101

1,3

KPH

KPH KPH

KPH

1,3 × 101

KPH

9,2 × 101

0,34

KPH

4 × 101

KPH KPH

KPH

1.7 × 101

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

9 × 101

1,5

KPH

2 × 10

KPH KPH

KPH

8,5 × 101

1,4

KPH

6,7 × 102

2,8

KPH

KPH KPH

KPH

9,5 × 102

8,2

KPH

KPH KPH

KPH

1,4

5,6 × 102

KPH

TS BT nấm men-mốc: Tổng số bào tử nấm men-mốc

KPH Ghi chú: KPH – Không phát hiện (nghĩa là dưới ngường phát hiện của phương pháp)

1.2. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa hè tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa

và Nghệ An

Bảng PL1. 2. Kết quả phân tích Tổng số bào tử nấm men-mốc và AF trong các mẫu lạc củ thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang năm 2013

Nghệ An

Thanh Hóa

Bắc Giang

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

TS BT nấm men-mốc (CFU/g)

KPH

KPH KPH

KPH

2,5 × 101

KPH

7,3 × 101 KPH

KPH

KPH KPH

KPH

4,5 × 101

1,5

4 × 102

KPH

0,7

KPH

KPH KPH

KPH

2 × 101

KPH

9 × 101

0,64

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

3 × 102

KPH

2,1

KPH

3,7 × 105

215

KPH

KPH KPH

KPH

7 × 102

KPH

4,3

KPH

5,6 ×102

2,6

KPH

4 ×102

3,7

9,3 × 101

KPH

2 × 103

9,8

KPH

6 × 101

KPH

1,6 × 103

9,6

1,1 × 101

KPH

KPH KPH

KPH

1,5 × 102

KPH

3,5 × 102

KPH

KPH KPH

KPH

3,4 × 105

KPH

3 × 101

KPH

6,6 × 102

5,8

1,4 × 105

KPH

17,4

KPH

8 × 102

2,5

KPH

KPH KPH

KPH

5 × 101

KPH

6 × 103

KPH

7 × 101

KPH

5 × 102

3,9

1 × 102

KPH

1,7

KPH

7,3 × 102

6,7

KPH

Nghệ An

Thanh Hóa

Bắc Giang

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

TS BT nấm men-mốc (CFU/g)

KPH

KPH KPH

KPH

3,5 × 104

KPH

4.5 × 102

4,6

KPH

2 × 102

KPH

KPH KPH

KPH

1 × 102

KPH

2,5 × 102

KPH

0,67

KPH

5,2 × 102

KPH

3 × 10

KPH

4,9 × 102

6,4

KPH

5 × 103

KPH

7 × 102

5,8

KPH

KPH KPH

KPH

2,7

KPH

4 × 102

KPH

9,3 × 10

KPH

6 × 103

KPH

KPH KPH

KPH

2,8

KPH

6 × 102

KPH

KPH KPH

KPH

5,6 × 10

KPH

KPH KPH

KPH

3,1

KPH

9 x 102

KPH

2,9 × 104

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

Ghi chú: KPH – Không phát hiện (nghĩa là dưới ngường phát hiện của phương pháp)

TS BT nấm men-mốc: Tổng số bào tử nấm men-mốc

1.3. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin của lạc rang húng lìu thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và

Nghệ An

Bảng PL1. 3. Kết quả phân tích Tổng số bào tử nấm men-mốc và AF trong các mẫu lạc rang húng lìu thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang năm 2013

Nghệ An

Thanh Hóa

Bắc Giang

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

TS BT nấm men-mốc (CFU/g)

8 × 101

KPH

2,4 × 102

0,84

KPH

1 × 103

0,65

KPH

1,3 × 101

KPH

2,4 × 102

KPH

1,5 × 101

KPH

1,2 × 102

KPH

3,6 × 101

KPH

5 × 101

KPH

4,2 × 101

KPH

4,9 × 102

KPH

3,6 × 101

KPH

5 × 101

KPH

12 × 102

1,9

KPH

5 × 101

KPH

Nghệ An

Thanh Hóa

Bắc Giang

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

AF B1 (g/kg)

AF B2 (g/kg)

AF G1 (g/kg)

AF G2 (g/kg)

TS BT nấm men-mốc (CFU/g)

KPH

1,1 × 102

KPH

8 × 101

KPH

1 × 103

0,78

KPH

2,4 × 102

KPH

1,1 × 101

KPH

2,5 × 102

2,3

KPH

4 × 102

KPH

2 × 102

KPH

4,2 × 101

KPH

4,9 × 102

KPH

3 × 102

2,1

KPH

2,5 × 102

2,3

KPH

Ghi chú: KPH – Không phát hiện (nghĩa là dưới ngường phát hiện của phương pháp)

TS BT nấm men-mốc: Tổng số bào tử nấm men-mốc

1.4. Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và AF trong lạc nhân thu thập vào mùa thu tại Bắc Giang

Bảng PL1. 4. Tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và AF trong mẫu lạc nhân

Bao bì chứa đựng

Tình trạng mẫu

Hàm lượng Aflatoxin (µg/kg)

Độ ẩm (%)

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

Tổng số bào tử nấm mốc (CFU/g)

Độ nguyên vẹn của hạt

Độ căng của hạt

Màu sắc của hạt

Hạt có mầm

Mức độ khô của hạt

KPH KPH KPH

KPH

8,1

KPH

1 Bao tải hai lớp

KPH KPH KPH

KPH

9,2

KPH

2 Bao tải hai lớp

1,7

KPH KPH

KPH

10,5

1 × 102

3 Bao tải một lớp

1,8

KPH KPH

KPH

11,3

3 × 102

4 Chậu nhôm

KPH KPH KPH

KPH

9,7

KPH

5 Bao tải hai lớp

1,3

KPH KPH

KPH

2,3 × 101

11,0

6 Bao tải một lớp

6,5

KPH KPH KPH

KPH

7 Bao tải một lớp

11,4

0,74

KPH KPH

KPH

2 × 101

8 Bao nilon

7,1

KPH KPH KPH

KPH

9 Bao tải hai lớp

9,5

KPH KPH KPH

KPH

1 × 101

10 Bao tải một lớp

5,3

KPH KPH KPH

KPH

11 Bao tải hai lớp

12,6

6,6

KPH KPH

KPH

5 × 102

12 Đổ trên sàn nhà

5,7

KPH KPH KPH

KPH

13 Bao tải hai lớp

6,2

KPH KPH KPH

KPH

14 Bao tải hai lớp

12,8

1,4

KPH KPH

KPH

4 × 102

15 Bao nilon

6,9

KPH KPH KPH

KPH

16 Bao tải hai lớp

11,6

KPH KPH

KPH

1,5

2 × 102

17 Bao nilon

12,5

18 Trên bao tải dưới sàn nhà

KPH KPH

KPH

4,7 × 103

Bao bì chứa đựng

Tình trạng mẫu

Hàm lượng Aflatoxin (µg/kg)

Độ ẩm (%)

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

Tổng số bào tử nấm mốc (CFU/g)

Độ nguyên vẹn của hạt

Độ căng của hạt

Màu sắc của hạt

Hạt có mầm

Mức độ khô của hạt

19 Bao tải hai lớp

7,1

KPH KPH KPH

KPH

20 Bao tải hai lớp

6,8

KPH KPH KPH

KPH

21 Bao tải hai lớp

5,9

KPH KPH KPH

KPH

22 Phơi dưới nền sân gạch

12,7

115

8,8

KPH

7 × 103

23 Bao tải hai lớp

5,1

KPH KPH KPH

KPH

24 Bao tải một lớp

10,9

0,67

KPH KPH

KPH

4 × 102

25 Bao tải một lớp

9,7

0,66

KPH KPH

KPH

2,7 × 101

26 Trong rổ tre

11,3

2,4

KPH KPH

KPH

2,5 × 102

27 Bao tải hai lớp

6,5

KPH KPH KPH

KPH

28 Bao tải một lớp

10,7

1,5

KPH KPH

KPH

2 × 102

29 Bao tải hai lớp

7,2

KPH KPH KPH

KPH

30 Chậu nhựa

11,8

KPH KPH

KPH

1,9

3 × 102

Số phát hiện/(+)

Mức nhiễm/hàm lượng thấp nhất

5,1

0,66

8,8

1 × 101

Mức nhiễm/hàm lượng cao nhất

12,8

115

8,8

7 × 103

Ghi chú:

- Độ nguyên vẹn của hạt: (+) tức là nguyên hạt; (-) tức là mẫu lấy có tới 3% số hạt bị vỡ hoặc bị tách đôi - Độ căng của hạt: (+) tức là hạt mẩy; (-) tức là mẫu lấy có tới 5% tổng số hạt nhăn do chưa phát triển hoàn chỉnh và bị nhăn lại sau khi phơi - Màu sắc của hạt: (+) hạt có màu săc bình thường; (-) mẫu lấy có tới 3% tổng số hạt bị biến màu,sẫm hơn màu vàng nhạt hoặc có nhiều đốm màu vàng,

hoặc lớp vỏ biến thành nâu sẫm, xanh xẫm hoặc đen và lớn hơn 25% nhân.

- Hạt có mầm: (+) tức là hạt có mầm nhú ra khỏi vỏ áo, đã bị héo khô do quá trình làm khô hạt; (-) tức là hạt không có mầm Mức độ khô của hạt: (+) tức là hạt khô đến độ dễ dàng bó vỏ lụa khi xoa nhẹ trên lòng bàn tay; (-) tức là hạt khó bong vỏ lụa khi xoa trên lòng bàn tay

1.5. Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa thu tại Bắc Giang

Bảng PL1. 5. Tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và AF trong mẫu lạc củ

Bao bì chứa đựng

Tình trạng mẫu

Hàm lượng Aflatoxin (g/kg)

TT

Số bào tử nấm mốc (CFU/g)

Độ ẩm (%)

sạch

lẫn tạp

có củ mốc

B2

G1

G2

Tổng số

B1

10,19

KPH KPH

2,3

KPH

2,5 × 102

Bao tải một lớp

9,66

KPH KPH

KPH

Bao tải một lớp

8,76

KPH KPH

0,7

KPH

0,7

1,5 × 101

Bao tải một lớp

6,93

KPH

KPH KPH

KPH

1 × 101

Bao tải hai lớp

7,93

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

8,77

2,1

KPH

2,1

KPH KPH

2,7 × 102

Bao tải một lớp

6,63

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,69

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,68

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,21

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,37

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,52

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,74

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

5,94

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

5,94

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,70

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,52

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,37

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,29

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

Bao bì chứa đựng

Tình trạng mẫu

Hàm lượng Aflatoxin (g/kg)

TT

Số bào tử nấm mốc (CFU/g)

Độ ẩm (%)

sạch

lẫn tạp

có củ mốc

B2

G1

G2

Tổng số

B1

Bao tải hai lớp

6,18

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,18

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

6,53

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải một lớp

8,70

0,52

KPH

KPH KPH

0,52

3 × 101

Bao tải hai lớp

6,38

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải một lớp

9,33

0,46

KPH

KPH KPH

0,46

1,5 × 101

Bao tải hai lớp

6,72

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải một lớp

8,74

0,86

KPH

KPH KPH

0,86

2 × 101

Bao tải hai lớp

6,45

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải hai lớp

7,31

KPH

KPH KPH

KPH

Bao tải một lớp

9,53

2,5

KPH

KPH KPH

2,5

3 × 102

Số phát hiện/(+)

Mức nhiễm/hàm lượng thấp nhất

5,94

0,46

1 × 101

Mức nhiễm/hàm lượng cao nhất

10,19

2,5

3 × 102

Ghi chú: “+” tức là “có tình trạng như tiêu đề của cột tương ứng”; “-” tức là “không có tình trạng như tiêu đề của cột tương ứng”

PHỤ LỤC 2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH AF TRÊN LẠC CỦA A. FLAVUS BG1

2.1. Ảnh hưởng của độ ẩm

Bảng PL2. 1. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự sinh AF trên lạc theo thời gian

Sau 2 tuần

Sau 4 tuần

Sau 6 tuần

Sau 8 tuần

Độ ẩm

Ký hiệu

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

6% M11 KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

8% M12 KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

10% M13

4,28

KPH

4,28

10,97 KPH

KPH

10,97 16,69

0,42

KPH KPH

17,11

20,80

0,99

KPH

21,79

12% M14

5,19

KPH

5,19

12,84 KPH

KPH

12,84 18,45

0,69

KPH KPH

19,14

34,35

1,52

KPH

35,88

14% M15

6,68

KPH

6,68

15,70

0,30

KPH

16,00 36,03

0,76

KPH KPH

36,79

47,64

1,60

KPH

49,25

Sau 10 tuần

Sau 12 tuần

Sau 14 tuần

Sau 16 tuần

Độ ẩm

Ký hiệu

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

6% M11 KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

8% M12 KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

10% M13

26,28

1,65

KPH

27,93

26,73

3,08

KPH

29,80 26,39

3,87

KPH KPH

30,26

25,27

6,69

KPH

31,96

12% M14

45,41

1,79

KPH

47,20

48,64

3,88

KPH

52,52 51,72

4,51

KPH KPH

56,23

53,79

6,63

KPH

60,41

14% M15

57,62

1,85

KPH

59,47

61,51

3,91

KPH

65,42 62,99

5,89

KPH KPH

68,97

63,69

7,51

KPH

71,19

Ghi chú: KPH – Không phát hiện (nghĩa là dưới ngường phát hiện của phương pháp)

2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bảng PL2. 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh AF trên lạc theo thời gian

Sau 2 tuần

Sau 4 tuần

Sau 6 tuần

Sau 8 tuần

Nhiệt

Ký

độ

hiệu

AFB1 AFB2

AFG1

AFG2 Tổng

AFB1 AFB2

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFG1 AFG2 Tổng

KPH

KPH KPH

KPH

8,65

KPH KPH KPH

8,65

200C M21

4,28

KPH

4,28

10,97

KPH

10,97

16,69

0,42

KPH

17,11

20,80

0,99

KPH KPH

21,79

250C M22

4,61

KPH

4,61

7,92

KPH

7,92

12,82 KPH

KPH

12,82

15,86

KPH KPH KPH

15,86

300C M23

KPH

KPH KPH

1,66

KPH

1,66

3,73

KPH KPH KPH

3,73

350C M24

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

400C M25

Sau 10 tuần

Sau 12 tuần

Sau 14 tuần

Sau 16 tuần

Nhiệt

Ký

độ

hiệu

AFB1 AFB2

AFG1

AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

11,19

KPH

11,19

13,07

KPH

13,07

14,44 KPH

KPH

14,44

15,00

KPH KPH KPH

15,00

200C M21

26,28

1,65

KPH

27,93

26,73

3,08

KPH

29,80

26,39

3,87

KPH

30,26

25,27

6,69

KPH KPH

31,96

250C M22

17,52

KPH

17,52

19,54

KPH

19,54

19,83 KPH

KPH

19,83

20,22

KPH KPH KPH

20,22

300C M23

6,53

KPH

6,53

11,75

KPH

11,75

12,96 KPH

KPH

12,96

13,19

KPH KPH KPH

13,19

350C M24

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH

KPH

400C M25

LOQ – Giới hạn định lượng (

Ghi chú: KPH – Không phát hiện (nghĩa là dưới ngường phát hiện của phương pháp)

2.3. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không

Bảng PL2. 3. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không đến sự sinh AF trên lạc theo thời gian

Sau 2 tuần

Sau 4 tuần

Sau 6 tuần

Sau 8 tuần

Áp lực

Ký

(mmHg)

hiệu

AFB1 AFB2

AFG1

AFG2 Tổng

AFB1 AFB2

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFG1 AFG2 Tổng

50 M31

26,4

KPH

26,4

26,5 KPH KPH KPH

26,5

27,79 KPH KPH KPH

27,79

28,23 KPH KPH KPH

28,23

100 M32

23,3

KPH

23,3

23,97 KPH KPH KPH 23,97

25,5 KPH KPH KPH

25,5

26,12 KPH KPH KPH 26,12

150 M33

15,75 KPH

KPH

15,75

18,14 KPH KPH KPH 18,14

18,99 KPH KPH KPH

18,99

18,9 KPH KPH KPH

18,9

200 M34

3,12

KPH

3,12

4,23 KPH KPH KPH

4,23

4,62 KPH KPH KPH

4,62

4,62 KPH KPH KPH

4,62

250 M35 KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH

Áp lực

Ký

Sau 10 tuần

Sau 12 tuần

Sau 14 tuần

Sau 16 tuần

(mmHg)

hiệu

AFB1 AFB2

AFG1

AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

50 M31

28,73 KPH

KPH

28,73

28,92 KPH KPH KPH 28,92 29,15 KPH KPH KPH

29,15

29,56 KPH KPH KPH

29,56

100 M32

26,16 KPH

KPH

26,16

26,01 KPH KPH KPH 26,01 26,13 KPH KPH KPH 26,13

26,64 KPH KPH KPH 26,64

150 M33

19,15 KPH

KPH

19,15

19,53 KPH KPH KPH 19,53

19,6 KPH KPH KPH

19,6

19,8 KPH KPH KPH

19,8

200 M34

5,19

KPH

5,19

5,74 KPH KPH KPH

5,74

5,8

KPH KPH KPH

5,8

6,62 KPH KPH KPH

6,62

250 M35 KPH KPH

KPH

KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH

LOQ – Giới hạn định lượng (

Ghi chú: KPH – Không phát hiện (nghĩa là dưới ngường phát hiện của phương pháp)

2.4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến khả năng sinh Aflatoxin trên lạc

Bảng PL2. 4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến sự sinh AF trên lạc theo thời gian

A. flavus

Ký

Sau 2 tuần

Sau 4 tuần

Sau 6 tuần

Sau 8 tuần

hiệu

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

1CFU/g M31

KPH

KPH KPH

KPH

101CFU/g M32

KPH

KPH KPH

KPH

KPH KPH

KPH

0,91

KPH KPH

KPH

0,91

102CFU/g M33

KPH

0,89

KPH KPH

KPH

0,89

1,60 KPH KPH

KPH

1,60

4,63

KPH KPH

KPH

4,63

103CFU/g M34

4,28

KPH

4,28

16,69

10,97 KPH KPH KPH

10,97

0,42 KPH KPH

17,11

20,80

0,99 KPH KPH

21,79

104CFU/g M35

4,74

KPH

4,74

10,57

2,95 KPH

KPH

13,52

18,16

1,88 KPH

KPH

20,04

23,24

2,10 KPH

KPH

25,33

105CFU/g M36

9,45

KPH

9,45

15,99

1,92 KPH

KPH

17,92

17,82

6,40 KPH

KPH

24,22

23,84

10,08 KPH

KPH

33,92

106CFU/g M37

12,81

KPH

12,81

15,82

1,60 KPH

KPH

17,42

19,16

3,01 KPH

KPH

22,17

27,47

2,75 KPH

KPH

30,22

A. flavus

Ký

Sau 10 tuần

Sau 12 tuần

Sau 14 tuần

Sau 16 tuần

hiệu

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Tổng

1CFU/g M31

KPH

KPH KPH

KPH

101CFU/g M32

1,72

KPH KPH

KPH

1,72

3,10

KPH KPH

KPH

3,10

5,06

KPH KPH

KPH

5,06

5,76

KPH KPH

KPH

5,76

102CFU/g M33

5,67

KPH KPH

KPH

5,67

8,07

KPH KPH

KPH

8,07

12,72 KPH KPH

KPH

12,72

13,22 KPH KPH

KPH

13,22

103CFU/g M34

26,28

1,65 KPH

KPH

27,93

26,73

3,08 KPH KPH

29,80

26,39

3,87 KPH KPH

30,26

25,27

6,69 KPH KPH

31,96

104CFU/g M35

26,62

2,49

KPH

29,11

34,40

3,31 KPH

KPH

37,71

36,51

3,18 KPH

KPH

39,70

37,98

3,75 KPH

KPH

41,73

105CFU/g M36

28,37

18,56 KPH

KPH

46,93

39,21

20,27 KPH

KPH

59,49

39,81

27,07 KPH

KPH

66,88

41,48

31,61 KPH

KPH

73,09

106CFU/g M37

36,60

11,45 KPH

KPH

48,05

40,24

23,96 KPH

KPH

64,20

41,36

31,62 KPH

KPH

72,98

44,27

34,23 KPH

KPH

78,50

2.5. Ảnh hưởng của tinh dầu quế đến khả năng phát triển của A. flavus trên đĩa thạch

Bảng PL2. 5. Tính toán lượng tween và tinh dầu bổ sung vào môi trường thạch

Tính cho mỗi đĩa thạch (30mL)

Chuẩn bị cho 6 đĩa (180 mL)

Nồng độ tinh dầu (% v/v)

Lượng tween 20 (L) Lượng tinh dầu (L) Lượng tween 20 (mL) Lượng tinh dầu (mL)

2,64

0(*)

440

2,64

0,25

0,0125

440

41,7

2,64

0,5

0,025

440

83,3

2,64

0,05

440

166,7

2,64

0,1

440

333,3

2,64

0,2

440

666,7

2,64

0,4

440

1333,3

2,64

0,8

440

2666,7

2,64

1,6

440

5333,3

2,64

3,2

440

10666,7

Ghi chú: (*) Mẫu đối chứng, cho tween 20 nhưng không cho tinh dầu.

Bảng PL2. 6. Kết quả đo đường kính khuẩn lạc phát triển khi bổ sung tinh dầu quế trên đĩa thạch

Ngày

Nồng độ tinh dầu (%)

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

C(-)

3,2 3,0 3,2 3,3

5,4 5,5 5,3 5,2

6,5

6,6 6,6 6,6 7,5 7,4 7,8 7,7 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

C(+)

3,1 3,1 3,2 3,1

5,2 5,4 5,3 5,3

6,5

6,6 6,6 6,6 7,4 7,5 7,6 7,6 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

0,0125

2,1 1,7 2,0 1,8

4,5 4,6 4,3 4,4

5,0

5,1 4,9 5,1 6,5 6,4 6,5 6,5 7,1 7,0 7,2 7,1 9,0 9,0 9,0 9,0

0,025

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,05

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,1

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,2

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,4

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,8

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

1,6

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

3,2

Bảng PL2. 7. Kết quả đo đường kính khuẩn lạc phát triển khi bổ sung tinh dầu hồi trên đĩa thạch

Ngày

Nồng độ tinh dầu (%)

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

C(-)

3,2

3,0 3,2 3,3 5,4 5,5 5,3 5,2

6,5

6,6 6,6 6,6 7,5 7,4 7,8 7,7 9,0 9,0

9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

C(+)

3,1 3,0 3,0 2,9 4,1 4,2 4,1 4,0 6,6

6,5 6,5

6,5 7,7 7,8 7,6 7,8 9,0 9,0

9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

9,0

0,0125

2,1 2,2 2,0 2,1 4,1 4,0 4,0 4,0 6,3

6,4 6,4

6,4 7,5 7,6 7,6 7,5 9,0 9,0

9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

0,025

1,7 1,8 1,9 1,8 3,8 3,8 3,7 3,7 6,0

5,9 6,0 5,8 7,3 7,2 7,3 7,2 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

0,05

1,3 1,5 1,4 1,5 2,6 2,7 2,6 2,6 4,7

4,8 4,7 4,8 7,0 7,1 7,1 7,1 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

0,1

0,3 0,4 0,3 0,4 0,8 0,8 0,8 0,7 2,5

2,6 2,5 2,5 4,7 4,8 4,8 4,8 7,7 7,6 7,8 7,6 9,0 9,0 9,0 9,0

0,2

0,0 0,0 0,0 0,0 0,6 0,6 0,5 0,6 1,5

1,6 1,6 1,5 3,0 3,2 3,1 3,2 6,3 6,3 6,2 6,2 7,8 7,9 7,8 7,8

0,4

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,8

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

1,6

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

3,2

PHỤ LỤC 3. XỬ LÝ SỐ LIỆU

3.1. Phần mềm xử lý số liệu R 3.4.1

3.2. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc

3.2.1. So sánh mức nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc nhân giữa các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang

> nam = c(14, 16, 18)

> AF = c(12, 9, 16)

> Total = c(30, 30, 30)

> prop.test(nam, total)

> prop.test(AF, total)

3-sample test for equality of proportions without continuity correction

data X-squared df alternative hypothesis: two.sided p-value

sample estimates

prop 1 prop 2 prop 3

nam out of total 1.0714 0.4666667 0.5333333 0.6000000 0.5853 2

AF out of total 3.3962 0.4000000 0.3000000 0.5333333 0.183 2

3.2.2. So sánh mức nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc củ giữa các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang

> namcu = c(16, 13, 17)

> AFcu = c(9, 8, 12)

> Total = c(30, 30, 30)

> prop.test(namcu, total)

> prop.test(AFcu, total)

3-sample test for equality of proportions without continuity correction

data X-squared df alternative hypothesis: two.sided p-value

sample estimates

prop 1 prop 2 prop 3

namcu out of total 1.1561 0.5333333 0.4333333 0.5666667 2 0.561

AFcu out of total 1.3228 0.3000000 0.2666667 0.4000000 2 0.5161

3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của A. flavus và sinh AF trên lạc

a. Mối quan hệ giữa độ ẩm và thời gian tới hàm lượng AFB1 sinh ra

Phần dư của mô hình: 1Q -8.865

Median 1.743 9.418

Max 19.215

Min -24.968 Các hệ số:

Std. Error 10.2652 0.2537 0.9426

Estimate -78.1876 1.9971 7.5601

t value -7.617 7.873 8.020

Pr(>|t|) 3.32e-11 *** 1.02e-11 *** 5.15e-12 ***

(Intercept) Week Moi Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 10.9 on 85 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.5978, Adjusted R-squared: 0.5883 F-statistic: 63.16 on 2 and 85 DF, p-value: < 2.2e-16

Median -0.608

3Q 8.772

Max 40.996

-11.291

b. Mối quan hệ giữa độ ẩm và thời gian tới hàm lượng AF tổng số sinh ra: Phần dư của mô hình: Min 1Q -31.434 Các hệ số:

Estimate Std. Error -76.9121 15.0087 0.3709 2.6051 1.3782 7.2425

t value Pr(>|t|) -5.125 1.84e-06 *** 7.024 5.255

4.97e-10 *** 1.08e-06 ***

(Intercept) Week Moi Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 15.94 on 85 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.4752, Adjusted R-squared: 0.4628

F-statistic: 38.48 on 2 and 85 DF, p-value: 1.262e-12

3.3.1. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của độ ẩm

Mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian tới hàm lượng AFB1 sinh ra

Phần dư của mô hình:

Min

Median

Max

-28.364

-10.171

0.804

6.267

35.479

Các hệ số:

Estimate

Std. Error

t value Pr(>|t|)

(Intercept)

19.5715

11.4777

1.705

0.0918 .

Week

1.9971

0.3310

6.034

4.04e-08 ***

Tem

-0.6961

0.4238

-1.642

0.1042

Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Residual standard error: 14.23 on 85 degrees of freedom

Multiple R-squared: 0.3151, Adjusted R-squared: 0.299

F-statistic: 19.55 on 2 and 85 DF, p-value: 1.034e-07

3.3.2. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của nhiệt độ

a. Mối quan hệ giữa mức nhiễm A. flavus và thời gian tới hàm lượng AFB1 sinh ra

Phần dư của mô hình: 1Q -11.272

Median -0.695

3Q 6.792

Max 36.713

Min -27.124 Các hệ số:

Std. Error Estimate t value 9.297e-01 3.414e+00 0.272 1.997e+00 3.338e-01 5.984 5.987e-06 5.356e-06 1.118

Pr(>|t|) 0.786 5.02e-08 *** 0.267

(Intercept) Week Flavus --- Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 14.35 on 85 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.3036, Adjusted R-squared: 0.2872 F-statistic: 18.53 on 2 and 85 DF, p-value: 2.098e-07

b. Mối quan hệ giữa mức nhiễm A. flavus và thời gian tới hàm lượng AF tổng số sinh ra

Phần dư của mô hình: 1Q

Min

Median

Max

Các hệ số:

Estimate

Std. Error

t value

Pr(>|t|)

3.3.3. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus

a. Tìm mô hình tối ưu > search=glm(fx~., family="binomial", data=dat1) > step(search) Start: AIC=33.57 fx ~ Week + Moi + Tem + Flavus

3.3.4. Phân tích mô hình hồi quy tuyến tính đa biến

Df 1 1 1 1 Deviance AIC 24.275 3 29.489 35.454 45.223 2.275 37.489 43.454 53.223

- Tem - Moi - Flavus - Week Step: AIC=32.27 fx ~ Week + Moi + Flavus

Df 1 1 1 Deviance AIC 29.636 35.750 45.624 35.636 41.750 51.624

- Moi - Flavus - Week Call: glm(formula = fx ~ Week + Moi + Flavus, family = "binomial", data = dat1)

Coefficients: (Intercept) Week Moi Flavus -92.592468 0.665122 8.919759 0.001301

Degrees of Freedom: 87 Total (i.e. Null); 84 Residual; Null Deviance: 58.09; Residual Deviance: 24.27

AIC: 32.27

4 models were selected

p!=0 EV SD model 1 model 2 100 -58.617377 1.042e+04 -9.259e+01 -3.116e+00 100.0 0.644505 2.308e-01 6.651e-01 6.073e-01 61.6 5.507737 1.042e+03 8.920e+00 5.029e-02 . 12.1 0.009783 1.196e-03 1.301e-03 1.954e-03 100.0 0.001532 model 3 -9.629e+01 6.832e-01 . 9.036e+00 . 9.800e-02 1.099e-03 model 4 -4.289e+00 6.095e-01 . 4.660e-02 1.885e-03

3 2 3

-3.518e+02 -3.509e+02 0.344 0.535 4 -3.480e+02 0.081 -3.466e+02 0.039

Best 4 models (cumulative posterior probability = 1 ): Intercept Week Moi Tem Flavus nVar BIC post prob

PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH AFLATOXIN

4.1. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm

Sắc đồ phân tích các mẫu nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm sau 4 tuần:

Hình PL4. 1. Sắc đồ AFB1 của các mẫu độ ẩm 10%(M13), 12%(M14) và 14%(M15)

Hình PL4. 2. Sắc đồ AFB2 của mẫu độ ẩm 14%

4.2. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ

Sắc đồ phân tích các mẫu nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sau 4 tuần:

Hình PL4. 3. Sắc đồ AFB1 của mẫu 25oC và 30oC

4.3. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện hút chân không

Sắc đồ phân tích các mẫu nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện hút chân không sau 4 tuần:

Hình PL4. 4. Sắc đồ AFB1 trong nghiên cứu điều kiện hút chân không

4.4. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus BG1

Sắc đồ phân tích các mẫu nhiễm A. flavus BG1: 100 CFU/g (M51), 101 CFU/g (M52), 102 CFU/g (M53), 103 CFU/g (M54), 104 CFU/g (M55), 105 CFU/g (M56), 106 CFU/g (M57)