Nghiên cứu phát hiện CD89 như một marker mới trong dự đoán tiến triển suy thận ở bệnh thận IgA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CD89 NHƯ MỘT MARKER MỚI<br /> TRONG DỰ ĐOÁN TIẾN TRIỂN SUY THẬN Ở BỆNH THẬN IgA<br /> Vương Tuyết Mai*, Leonid Padyukov**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Bệnh thận IgA là một trong những dạng thường gặp nhất của viêm cầu thận, đặc trưng bởi sự<br /> lắng đọng IgA trong khu vực gian mạch cầu thận. Lưu thông trong huyết tương, globulin miễn dịch A (IgA)<br /> được gắn với thụ thể Fc alpha (FCAR hoặc CD89) thành phức hợp hòa tan. Phức hợp sCD89-IgA đã được<br /> chứng minh có liên quan đến hình thành bệnh thận IgA.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Tìm hiểu mối liên quan của các điểm biến đổi của gen FCAR với sự hình thành và<br /> tiến triển bệnh thận IgA cũng như sự ảnh hưởng của nồng độ sCD89-IgA trong huyết thanh của bệnh nhân<br /> bệnh thận IgA.<br /> Đối tượng và phương pháp: Phương pháp ELISA gián tiếp phát hiện sCD89-IgA trong huyết thanh lần<br /> đầu tiên được áp dụng cho nghiên cứu trên 177 bệnh nhân bệnh thận IgA và 115 người khỏe mạnh. Chúng tôi<br /> cũng phân tích nồng độ sCD89-IgA trong 62 mẫu huyết thanh từ những bệnh nhân bệnh thận IgA được theo<br /> chiều dọc trong 15 năm. Kiểu gen của 05 điểm biến đổi (SNPs) của gen FCAR được thực hiện trong tất cả 689<br /> mẫu DNA bằng phương pháp phân tích di truyền allele dựa vào TaqMan.<br /> Kết quả: Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ thấp của phức hợp sCD89-IgA trong nhóm bệnh<br /> thận IgA tiến triển nặng với nhóm không tiến triển (p = 0,002, Mann-Whitney thử nghiệm). Những bệnh nhân<br /> có chức năng thận ổn định không tiến triển bệnh có nồng độ ổn định sCD-IgA cao, trái ngược với nồng độ thấp<br /> của sCD89 trong nhóm tiến triển suy thận nặng, kết quả được nghiên cứu trên những bệnh nhân có mẫu huyết<br /> thanh theo dõi từ 5 đến 15 năm.<br /> Kết luận: Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phức hợp sCD89-IgA có vai trò quan trọng trong dự đoán<br /> tiến triển suy thận ở bệnh thận IgA.<br /> Từ khoá: Gen FCAR, phức hợp sCD-IgA, bệnh thận IgA, điểm biến đổi gen, SNP.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> CD89 AS ONE OF BIOMARKERS FOR PROGRESSIVE RENAL FAILURE OF IgA NEPHROPATHY<br /> Vuong Tuyet Mai, Leonid Padyukov<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 3- 2012: 223 - 228<br /> Background:IgA nephropathy is the most common form of glomerulonephritis, characterized by IgA<br /> deposition in the mesangial region of the glomeruli. Fc alpha receptor (FcαRI or CD89) is involved in<br /> immunoglobulin A (IgA) complex formation in the circulation. CD89-IgA complexes have been suggested to be<br /> implicated in development of IgA nephropathy.<br /> Objective:Investigate genetic variations of the Fc alpha receptor(FCAR) gene in relation to susceptibility to<br /> IgAN and the expression of soluble IgA receptor (sCD89) in plasma of IgAN patients with or without disease<br /> progression and in healthy controls.<br /> Bộ môn Nội ĐH Y Hà Nội.<br /> Tác giả liên lạc: TS. Vương Tuyết Mai.<br /> *<br /> <br /> Chuyên Đề Thận Niệu 2012<br /> <br /> Viện Karolinska, Thụy Điển.<br /> ĐT: 0915518775.<br /> Email: vuongtuyetmai@gmail.com<br /> **<br /> <br /> 223<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012<br /> <br /> Patients and methods. Two hundred and twelve unrelated patients (146 males and 66 females), mean age<br /> 38.5±14.4 years (range 17 to 77 years) with biopsy-proven IgAN and 477 healthy (321 males and 156 females),<br /> mean age 44.8 ± 13.0 years (range 18 to 80 years) were included in the study. A sandwich ELISA method was<br /> developed. Soluble CD89 (sCD89) bound to IgA in human sera was analyzed in 177 IgAN patients and 115<br /> healthy controls. We also analysis the levels of sCD89 of 62 serum samples from seven longitudinal IgAN<br /> patients, who had followed up 15 years. Genotyping for 5 single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the FCAR<br /> gene was performed in all samples using a TaqMan allelic discrimination assay.<br /> Results. There was a significant difference between the levels of sCD89-IgA complexes in IgAN patients<br /> with and without disease progression (p=0.002, Mann-Whitney Test) and none significant difference was found<br /> in the disease control group (p=0.326, Mann-Whitney Test). The patients with non-progression had stable with<br /> high level of sCD89, in contrast to low level of sCD89 in progression group during up to 15 years of follow-up<br /> with repeated measures data.<br /> Conclusions. Our data ssuggested sCD89-IgA complexes in plasma as one of possible biomarkers for<br /> progressive renal failure of IgA Nephropathy.<br /> Key words: FCAR gene, sCD89-IgA, IgA nephropathy, polymorphism, SNP<br /> (146 nam và 66 nữ), tuổi trung bình 38,5 ± 14,4<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> (17 đến 77 tuổi) và 477 đối tượng khỏe mạnh<br /> Trong bệnh lý cầu thận, bệnh thận IgA là<br /> (321 nam và 156 nữ), tuổi trung bình 44,8 ± 13,0<br /> một trong những nhóm bệnh thường gặp nhất<br /> (18 đến 80 tuổi).<br /> với tiêu chẩn đoán xác định bệnh là sự lắng<br /> Tách chiết DNA được thực hiện bằng<br /> đọng của IgA tại gian mạch cầu thận. Sau thời<br /> phương pháp “salting-out” từ máu toàn phần<br /> gian mắc bệnh từ 10-20 năm, khoảng 30% bệnh<br /> đã được giữ trong trong EDTA hoặc từ phân<br /> nhân có thể sẽ tiến triển đến bệnh thận giai đoạn<br /> đoạn tế bào máu có nhân. Sau tách chiết chất<br /> cuối (end stage renal disease-ESRD) đòi hỏi phải<br /> lượng DNA hoà tan được xác định ở bước đặt<br /> điều trị thận thay thế(1; 2). Khi lưu thông trong<br /> 260/280 nm với spectrophotometer DU600 series<br /> huyết thanh, IgA gắn với CD89 thành một phức<br /> (Beckman Coulter, Bromma, Thụy Điển).<br /> hợp hòa tan, hoặc với hoặc các thụ thể tế bào(3; 4).<br /> Phương pháp phân tích di truyền Allele dựa<br /> Phức hợp IgA-CD89 được xác định có vai trò<br /> vào TaqMan (Allele-specific TaqMan assays của<br /> quan trọng trong lắng đọng IgA ở gian mạch<br /> Applied Biosystems, Foster City, Hoa Kỳ) cũng<br /> (5)<br /> cầu thận . Chúng tôi đặt giả thiết rằng phức<br /> được sử dụng cho việc xác định kiểu gen của rs<br /> hợp sCD89-IgA hoà tan trong huyết thanh có<br /> thuộc gen FCAR.<br /> thể là maker quan trọng cho sự hình thành bệnh<br /> Kỹ thuật ELISA gián tiếp được sử dụng để<br /> thận IgA và cũng có thể là yếu tố nguy cơ tiến<br /> phát hiện phức hợp CD89-IgA trong huyết<br /> triển đến suy thận ở bệnh nhân bệnh thận IgA.<br /> thanh. Kháng thể 1 được sử dụng là kháng thể<br /> Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm<br /> đơn dòng của chuột CD89 (A3) người (Abcam)<br /> mục đích tìm hiểu mối liên quan của các điểm<br /> và kháng thể thứ 2 được sử dụng là kháng thể<br /> biến đổi của gen FCAR với sự hình thành và<br /> thỏ cộng hợp alkaline phosphatase kháng IgA<br /> tiến triển bệnh thận IgA cũng như sự ảnh hưởng<br /> người (Dako, Glostrup, Denmark). Các mẫu<br /> của nồng độ sCD89-IgA trong huyết thanh của<br /> huyết thanh được pha loãng ở hai mức độ (1:10<br /> bệnh nhân bệnh thận IgA.<br /> và 1:1000) và pha loãng 4 mức độ theo cơ số 10<br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> (1:10-1:10000). Phản ứng với giữa alkaline<br /> Nghiên cứu được thực hiện trên 689 mẫu<br /> phosphatase và cơ chất (Sigma-Aldrich) được đo<br /> DNA di truyền từ hai trăm mười hai bệnh nhân<br /> ở bước sóng (OD) 405 nm trên máy Multiscan<br /> bệnh thận IgA không có quan hệ huyết thống<br /> MS spectrophotometer (Labsystems, Finland).<br /> <br /> 224<br /> <br /> Chuyên Đề Thận Niệu 2012<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012<br /> Để so sánh tỷ lệ phần trăm kiểu gen, allele<br /> và kiểu hình, test X bình phương và Fisher’s<br /> exact được sử dụng với phần mềm SPSS.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Haplotype được phân tích bằng chương trình<br /> HaploView.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Tỷ lệ kiểu gen và allele của SNPs thuộc gen FCAR trong bệnh thận IgA<br /> Bảng 1: Tỷ lệ kiểu gen của SNPs thuộc gen FCAR trong bệnh thận IgA và nhóm chứng.<br /> Tỷ lệ kiểu gen ở mô hình đồng phối hợp gen<br /> <br /> SNPs<br /> <br /> 2<br /> <br /> FCAR rs11084377<br /> <br /> Total<br /> <br /> AA<br /> <br /> AG<br /> <br /> GG<br /> <br /> Chứng<br /> <br /> 312<br /> <br /> 36 (11.5%)<br /> <br /> 130 (41.7%)<br /> <br /> 146 (46.8%)<br /> <br /> Bệnh<br /> <br /> 139<br /> <br /> 6 (4.3%)<br /> <br /> 67 (48.2%)<br /> <br /> 66 (47.5%)<br /> <br /> FCAR rs4806605<br /> <br /> Nhóm<br /> n=451<br /> <br /> Total<br /> <br /> CC<br /> <br /> CT<br /> <br /> TT<br /> <br /> Chứng<br /> Bệnh<br /> <br /> 310<br /> 140<br /> <br /> 207 (66.8%)<br /> 96 (68.6%)<br /> <br /> 93 (30%)<br /> 40 (28.6%)<br /> <br /> 10 (3.2%)<br /> 4 (2.8%)<br /> <br /> FCAR rs10402324<br /> Chứng<br /> Nhóm<br /> <br /> Total<br /> 302<br /> <br /> AA<br /> 135 (44.7%)<br /> <br /> AG<br /> 138 (45.7%)<br /> <br /> GG<br /> 29 (9.6%)<br /> <br /> n=444<br /> <br /> Bệnh<br /> <br /> 142<br /> <br /> 51 (35.9%)<br /> <br /> 71 (50%)<br /> <br /> 20 (14.1%)<br /> <br /> FCAR rs1865097<br /> <br /> Nhóm<br /> n=450<br /> <br /> Total<br /> <br /> AA<br /> <br /> AG<br /> <br /> GG<br /> <br /> Chứng<br /> Bệnh<br /> <br /> 312<br /> 131<br /> <br /> 33 (10.6%)<br /> 20 (15.3%)<br /> <br /> 143 (45.8%)<br /> 59 (45%)<br /> <br /> 136 (43.6%)<br /> 52 (39.7%)<br /> <br /> FCAR rs16986050<br /> <br /> Total<br /> <br /> AA<br /> <br /> AG<br /> <br /> GG<br /> <br /> Chứng<br /> <br /> 319<br /> <br /> 210 (65.8%)<br /> <br /> 93 (29.2%)<br /> <br /> 16 (5%)<br /> <br /> Bệnh<br /> <br /> 137<br /> <br /> 90 (65.7%)<br /> <br /> 44 (32.1%)<br /> <br /> 3 (2.2%)<br /> <br /> Nhóm<br /> n=443<br /> Nhóm<br /> n=456<br /> <br /> X<br /> <br /> p-value<br /> <br /> 6.335<br /> <br /> 0.04<br /> <br /> 0.155<br /> <br /> 0.93<br /> <br /> 3.918<br /> <br /> 0.14<br /> <br /> 2.039<br /> <br /> 0.36<br /> <br /> 2.117<br /> <br /> 0.35<br /> <br /> Bảng 2: Tỷ lệ allele của các SNPs thuộc gen FCAR trong bệnh thận IgA và nhóm chứng.<br /> Gen FCAR<br /> 2<br /> <br /> SNPs<br /> <br /> Số allele bệnh, chứng<br /> <br /> Tỷ lệ allele bệnh, chứng<br /> <br /> X<br /> <br /> P value<br /> <br /> rs11084377<br /> <br /> 309:117, 643:281<br /> <br /> 0.725, 0.696<br /> <br /> 1.218<br /> <br /> 0.27<br /> <br /> rs4806605<br /> <br /> 88:342, 176:746<br /> <br /> 0.205, 0.191<br /> <br /> 0.353<br /> <br /> 0.55<br /> <br /> rs10402324<br /> <br /> 158:272, 288:608<br /> <br /> 0.367, 0.321<br /> <br /> 2.756<br /> <br /> 0.09<br /> <br /> rs1865097<br /> <br /> 144:256, 305:617<br /> <br /> 0.360, 0.331<br /> <br /> 1.060<br /> <br /> 0.30<br /> <br /> rs16986050<br /> <br /> 338:68, 755:173<br /> <br /> 0.833, 0.814<br /> <br /> 0.684<br /> <br /> 0.41<br /> <br /> Chuyên Đề Thận Niệu 2012<br /> <br /> 225<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012<br /> <br /> Nồng độ phức hợp sCD89-IgA trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn<br /> tính giai đoạn cuối và nhóm không có suy thận<br /> <br /> Nhóm<br /> bệnh<br /> thận IgA không<br /> có tiến triển suy<br /> thận.<br /> <br /> Nhóm<br /> bệnh<br /> thận IgA tiến<br /> triển đến ESRD.<br /> <br /> Biểu đồ: Phân bố nồng độ của phức hợp sCD89-IgA trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn<br /> tính giai đoạn cuối và nhóm không có suy thận.<br /> của phân tử sCD89 được tiếp xúc với kháng thể.<br /> Phân bố cho thấy rất rõ ở nhóm bệnh thận<br /> Do đó khi phức hợp này đã được phân ly trong<br /> IgA không tiến triển đến suy thận có nồng độ<br /> ống nghiệm bằng chất tẩy rửa mạnh do vậy mà<br /> phức hợp sCD89-IgA cao hơn khác biệt có ý<br /> phản ứng trong trường hợp này không thực<br /> nghĩa thống kê với nhóm bệnh thận IgA tiến<br /> hiện được vì sự biến tính của kháng thể. Đây rất<br /> triển đến ESRD.<br /> có thể là lý do tại sao sCD89 chưa được công bố<br /> BÀN LUẬN<br /> định lượng ở huyết thanh người cho dù những<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển<br /> nghiên cứu về sCD89 đã được tiết hành rất đa<br /> một phương pháp mới để phát hiện CD89 hòa<br /> dạng trong phòng thí nghiệm và trong những<br /> tan trong huyết thanh thông qua xác định phức<br /> nghiên cứu thực nghiệm trên chuột (transgenic<br /> hợp sCD89-IgA trong huyết thanh người và<br /> mice)(5).<br /> phương pháp này đã được áp dụng cho 177<br /> Western blotting cũng có hiệu quả áp dụng<br /> bệnh nhân bệnh thận IgA và 115 người khỏe<br /> cao nhưng không phải là một phương pháp<br /> mạnh.<br /> định lượng chính xác. Chính vì vậy chúng tôi đã<br /> Trước chúng tôi đã có nhiều nhóm nghiên<br /> cứu khác đã cố gắng để định lượng được sCD89<br /> trực tiếp trong huyết thanh nhưng đã thất bại.<br /> Thực tế cho thấy rằng có thể là hầu như tất cả<br /> các sCD89 phân tử đều kết hợp chặt chẽ để IgA<br /> trong phức hợp CD89-IgA và chỉ một phần nhỏ<br /> <br /> 226<br /> <br /> quyết định giải quyết vấn đề bằng cách định<br /> lượng phức hợp sCD89-IgA thay vì sCD89 phân<br /> tử đơn độc, thông qua việc sử dụng các kháng<br /> thể kháng IgA là một loại kháng thể thứ hai<br /> trong một sandwich ELISA. Kết hợp với sCD89<br /> huyết thanh với một kháng thể đặc hiệu thứ<br /> <br /> Chuyên Đề Thận Niệu 2012<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 3 * 2012<br /> nhất, đơn dòng kháng thể CD89 đảm bảo độ đặc<br /> hiệu của phản ứng. Từ những nghiên cứu bước<br /> đầu thành công đã cho thấy phương pháp này<br /> có thể được sử dụng để phát hiện lưu hành<br /> sCD89 trong huyết thanh/plasma trong nhiều<br /> loại bệnh lý khác nhau.<br /> Kết quả nghiên cứu của của chúng tôi cho<br /> thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng<br /> độ thấp của phức hợp sCD89-IgA trong huyết<br /> thanh của bệnh nhân bệnh thận IgA tiến triển<br /> đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối so với<br /> nhóm chứng. Điều quan trọng là xét nghiệm<br /> cùng thời điểm nồng độ phức hợp sCD89-IgA<br /> và creatinine huyết thanh trong nhóm bệnh thận<br /> IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn<br /> cuối và nhóm không có suy thận cho thấy phân<br /> bố nồng độ của phức hợp sCD89-IgAổn định ở<br /> mức thấp trong khi nồng độ creatinine huyết<br /> thanh trong nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến<br /> bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối. Ngược lại<br /> nhóm không có suy thận thì nồng độ sCD89-IgA<br /> ổn định ở mức cao trong giai đoạn theo dõi liên<br /> tiếp từ 5-15 năm.<br /> Khi bắt bắt đầu tiến hành nghiên cứu, bước<br /> đầu tiên, chúng tôi xác định kiểu gen của FCAR<br /> và phân tích sự phân bố ở bệnh nhân bệnh thận<br /> IgA và người khoẻ mạnh. Việc lựa chọn maker<br /> dựa trên những kinh nghiệm của chúng tôi ở<br /> những nghiên cứu trước khi đã xác định kiểu<br /> gen trên những vị trí khác nhau của gen và chọn<br /> SNP ở các vị trí khác nhau sao cho bao phủ<br /> được hầu hết chiều dài của gen. Kết quả nghiên<br /> cứu của chúng tôi cho thấy sự tái tổ hợp gen<br /> tương đối thấp ở chủng tộc da trắng: trong tổng<br /> số 32 tái tổ hợp gen có thể có chúng tôi ghi nhận<br /> 8 tái tổ hợp là phổ biến nhất trong nhóm đối<br /> tượng nghiên cứu. Bằng chứng là LD rất mạnh ở<br /> khu vực này, như vậy về mặt lý thuyết là tăng<br /> khả năng cho sự phát hiện mối liên quan của<br /> SNP với bệnh thận IgA hoặc haplotype. Tuy<br /> nhiên chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt có<br /> ý nghĩa thống kê trong tỷ lệ kiểu gen và allele<br /> <br /> Chuyên Đề Thận Niệu 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> giữa nhóm bệnh nhân bệnh thận IgA và nhóm<br /> chứng.<br /> Điều quan trọng nhất của nghiên cứu là cho<br /> thấy là nồng độ huyết thanh của sCD89-IgA là<br /> ổn định ở mức thấp ở những bệnh nhân bị bệnh<br /> thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai<br /> đoạn cuối và liên tục cao ở bệnh nhân bị bệnh<br /> thận IgA nhưng triệu chứng ổn định và không<br /> có dấu hiệu tiến triển các cơ chế đằng sau tác<br /> dụng này vẫn chưa rõ ràng. Chúng tôi suy đoán<br /> rằng có thể sự thiếu hụt sCD89 đã là yếu tố<br /> tham gia vào làm tăng sự tiến triển nặng của<br /> bệnh nhân bệnh thận IgA và phức hợp này có<br /> thể được sử dụng như một biomarker cho dự<br /> đoán sự tiến triển nặng ở những bệnh nhân<br /> viêm cầu thận IgA.<br /> KẾT LUẬN<br /> Kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho phép<br /> kết luận rằng có mối liên quan giữa nồng độ<br /> thấp của phức hợp sCD89-IgA trong huyết<br /> tương và nguy cơ suy thận nặng của bệnh thận<br /> IgA. Có khả năng có sự tham gia của yếu tố gen<br /> di truyền trong tổng hợp và ảnh hưởng tới nồng<br /> độ sCD89-IgA trong huyết thanh. Những<br /> nghiên cứu tiếp theo về vai trò của gen FCAR và<br /> sự lưu hành phức hợp sCD89-IgA trong huyết<br /> thanh ảnh hưởng đến cơ chế bệnh sinh bệnh<br /> thận IgA rất cần được thực hiện.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> 2.<br /> 3.<br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Berthoux FC, Mohey H, Afiani A. Natural history of primary IgA<br /> nephropathy. Semin Nephrol 2008; 28: 4–9<br /> Donadio JV, Grande JP. IgA nephropathy. N Engl J Med. Sep 5<br /> 2002;347(10):738-748.<br /> Floege J, Feehally J. IgA nephropathy: recent developments. J Am<br /> Soc Nephrol. Dec 2000;11(12):2395-2403.<br /> Van der Boog PJ, van Kooten C, de Fijter JW, Daha MR. Role of<br /> macromolecular IgA in IgA nephropathy. Kidney Int. Mar<br /> 2005;67(3):813-821.<br /> Launay P, Grossetete B, Arcos-Fajardo M, et al. Fcalpha receptor<br /> (CD89) mediates the development of immunoglobulin A (IgA)<br /> nephropathy (Berger's disease). Evidence for pathogenic soluble<br /> receptor-Iga complexes in patients and CD89 transgenic mice. J<br /> Exp Med. Jun 5 2000;191(11):1999-2009.<br /> <br /> 227<br /> <br />