Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY

LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY

LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. THÁI XUÂN DU TS. NGUYỄN ĐÌNH LÂM

TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Vi c ng d ng c ng ngh sinh học sản xuất nhi n li u sinh học th y th nguồn

nhi n li u hó thạch ng ngày càng cạn ki t như hi n n y là một vấn ề áng qu n

tâm. Theo các tài li u nghi n c u và thực t sử d ng ở nhiều nước tr n th giới, nhi n

li u sinh học chủ y u gồm: eth nol sinh học và diesel sinh học. Eth nol sinh học có th

sản xuất từ nhiều nguồn nguy n li u khác nh u như sắn, mí , ng , ậu tương, mỡ cá,

còn diesel sinh học có th sản xuất từ các cây cọc rào, cọ dầu, hoàng li n mộc, văn

quan, bánh dầu, dừa.

Vi t N m, vi c sản xuất eth nol có nh ng hạn ch nhất nh. Di n tích ất n ng

nghi p hạn hẹp n n khả năng mở rộng di n tích trồng cây nguy n li u có nhiều khó

khăn, các cây nguy n li u cho sản xuất eth nol sinh học ều là nh ng cây lương thực

chủ y u, cây làm th c ăn chăn nu i có li n qu n n n ninh lương thực cần phải xem

xét c n trọng. Hơn n , sự phát tri n mạnh củ vi c trồng cây sắn tr n ất dốc s gây r

xói mòn ất (bồi lấp cử s ng, lòng hồ ập...). Cho n n, vi c nh hướng phát tri n

diesel sinh học s có nhiều thuận lợi hơn. Trong số nh ng loài cây có khả năng sản xuất

diesel sinh học thì cây cọc rào ược chú ý hơn cả do dễ trồng, bi n ộ sinh thái rộng,

khả năng chống ch u tốt và hàm lượng dầu trong hạt khá c o.

Chương trình phát tri n nhi n li u sinh học nói chung và cây cọc rào nói ri ng

nhận ược sự ủng hộ mạnh m củ Nhà nước. Ngày 20 tháng 11 năm 2007, Thủ

Tướng Chính Phủ r quy t nh số 177/2007/QĐ ˗ TTg về vi c ph duy t “Đề án

phát tri n nhi n li u sinh học n năm 2015, tầm nhìn n năm 2025”. Ngày 19 tháng

6 năm 2008, Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n r quy t nh số

1842/QĐ˗BNN˗LN về vi c ph duy t ề án “Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản

ph m cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Vi t N m gi i oạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn

n 2025”.

Hi n n y, cây giống cọc rào ược dùng phát tri n vùng nguy n li u chủ y u

ược gieo từ hạt và cành giâm. M i phương th c sản xuất giống ều có ưu và nhược

i m nhất nh. Cây giống ược gieo từ hạt có giá thành thấp nhưng b phân ly do cọc

rào là cây th phấn chéo nên khó ki m soát ược năng suất. Cây giống ược sản xuất

2

từ cành giâm cũng kh ng ảm bảo tính ồng nhất về mặt di truyền. Vì vậy, xu hướng

gần ây, các nhà kho học nghi n c u nhân giống theo quy trình kỹ thuật cơ bản như

s u: (1) Nhân giống in vitro một số cây ầu dòng tốt ược tuy n chọn. Nguy n li u

nu i cấy b n ầu có th là ỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2) Trồng nh ng

cây cấy m r ồng ruộng; (3) Chọn lọc lại và nhân giống bằng kỹ thuật nu i cấy ph i

som từ nh ng cây nu i cấy m nói tr n tăng h số nhân giống và làm hạ giá thành

cây giống.

Phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào là một phương pháp mới, nghi n c u về

khả năng bi t hó củ t bào. H thống t bào lớp mỏng với ặc tính mỏng có nhiều ưu

i m qu n trọng tái thi t lập chương trình cho vi c tạo ph i som . Sự thuận lợi củ

phương pháp nghi n c u lớp mỏng t bào là: tần số phát sinh cơ qu n c o, th i gi n

cho k t quả ngắn. N u chọn ược m i trư ng dinh dưỡng và nồng ộ chất iều hò

sinh trưởng thích hợp thì hầu như 100% mẫu cấy có phản ng. Phương pháp nu i cấy

lớp mỏng t bào cũng là một phương pháp mới, nghi n c u về khả năng bi t hó củ

t bào.

Chỉ th phân tử ược phát tri n và ng d ng từ ầu thập ni n 90 củ th kỷ XX.

Sự phát tri n và ng d ng củ chỉ th phân tử xác nh và sử d ng nh ng bi n ổi

củ DNA là một bước phát tri n qu n trọng nhất trong lĩnh vực di truyền chọn giống

thực vật. Cho n n y, nhiều loại chỉ th phân tử ược phát tri n và ư vào sử d ng.

M i loại chỉ th ều có nguy n lý, kỹ thuật, phạm vi ng d ng khác nh u và phù hợp

cho từng m c ích nghi n c u khác nh u. Trong số các chỉ th phân tử, RAPD ược

xem là kỹ thuật tương ối ơn giản và r tiền, ược ng d ng trong nghi n c u về tính

ổn nh di truyền củ cây giống nu i cấy m . Trong phạm vi nghi n c u củ luận án,

kỹ thuật RAPD ược sử d ng ánh giá ki m tr tính ổn nh di truyền củ cây con

cọc rào từ quy trình vi nhân giống.

Từ nh ng vấn ề n u tr n, luận án: “Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ

nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi

nhân giống” ược thực hi n nhằm ư r một phương pháp mới vi nhân giống hi u

quả số lượng lớn cây cọc rào chất lượng c o, ổn nh về mặt di truyền so với cây ầu

dòng.

3

2. Mục tiêu

- Nghi n c u sự phát sinh ph i som từ nu i cấy lớp mỏng t bào lá cây cọc rào.

- Xây dựng ược quy trình vi nhân giống hi u quả từ nu i cấy ph i som .

- Đánh giá m c ộ ổn nh di truyền ở cây cọc rào vi nhân giống tạo thành bởi

ph i som ược cảm ng từ m sẹo nu i cấy bằng kỹ thuật lớp mỏng t bào lá

làm cơ sở cho vi c sản xuất cây giống in vitro.

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Luận án nghi n c u tr n ối tượng cây cọc rào giống Ấn Độ. Giống này ược

nhập nội và khảo nghi m từ ề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn giống và công nghệ trồng

cây dầu mè Jatropha curcas L. để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô

nhiễm môi trường thành phố” ược thực hi n do B n quản lý Khu N ng nghi p

C ng ngh c o thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010. Lá củ nh ng cây

cọc rào trưởng thành ược thu nhận và sử d ng làm vật li u trong nghi n c u.

Phạm vi nghi n c u:

+ Sử d ng nh ng phương pháp nu i cấy m t bào thực vật trong xây dựng quy

trình vi nhân giống cây cọc rào từ ph i som ,

+ Sử d ng nh ng c ng c hi n ại trong ánh giá m c ộ ổn nh di truyền ở cây

giống từ ph i som ,

+ Sử d ng nh ng phương pháp giải phẫu m t bào thực vật và qu n sát hình thái

trong nghi n c u phát sinh hình thái.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

a. Ý nghĩa khoa học:

- Đây là một hướng nghi n c u mới trong nu i cấy in vitro tại Vi t N m tr n ối

tượng cây cọc rào.

- Đề tài óng góp một số k t quả nghi n c u về phát sinh hình thái, di truyền chọn

giống cũng như vi nhân giống cây thân g .

b. Ý nghĩa thực tiễn:

- Từ quy trình vi nhân giống củ luận án có th sản xuất cây giống cọc rào ổn nh

về mặt di truyền, có năng suất và hàm lượng dầu c o áp ng nhu cầu củ x hội.

- Một số cá nhân, cơ qu n có nhu cầu nghi n c u có th sử d ng th m khảo quy

trình c ng ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án.

4

- Một số cơ qu n nghi n c u, do nh nghi p cần ược chuy n gi o quy trình c ng

ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án.

5. Những đóng góp mới của luận án

Luận án xây dựng ược quy trình vi nhân giống từ ph i som cây cọc rào

th ng qu kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng t bào lá. Quy trình ảm bảo các m c ti u có

hi u suất nhân giống c o, ổn nh di truyền, chất lượng tốt. Đây là quy trình ược xây

dựng ầu ti n ở Vi t N m và có một vài i m cải ti n so với nh ng k t quả nghi n c u

tr n th giới.

Trong luận án này, các chất iều hò sinh trưởng thực vật ngoại sinh ược th y

th bằng một số cid mine và poly mine trong một số gi i oạn củ quá trình phát

sinh ph i som tr n cây cọc rào. Đây có th ược xem là tính mới củ luận án so với

nh ng k t quả nghi n c u trước ây.

K t quả củ luận án là tiền ề trong nh ng nghi n c u chuy n gen m c ti u vào

cây cọc rào.

5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ

CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1. Tổng quan về cây cọc rào

1.1.1. Vị trí phân loại

Giới (regnum) Plantae :

Ngành (divisio) Embryophyt (thực vật có ph i) :

: Lớp (class) Sperm topsid (thực vật có hạt)

: Bộ (ordo) M lpighi les (bộ sơ ri)

: Họ (f mili ) Euphorbiaceae (thầu dầu)

: Chi (genus) Jatropha (dầu mè, cọc rào)

: Loài (species) Jatropha curcas Linn

: T n ti ng Anh Physic nut

: T n ti ng Vi t Dầu mè, cọc rào, dầu l i …[6]

Tên Jatropha có nguồn gốc từ ti ng Hy Lạp, ghép từ hai ch Jatros (bác sĩ) và

Trophe (th c ăn) ám chỉ công d ng làm thuốc củ cây này. Curc s là t n thư ng gọi

của cây cọc rào ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông d ng ở các nước hi n nay là Jatropha.

Vi t Nam, tùy theo từng phương, cây này cũng có nh ng tên gọi khác nh u như:

Cọc giậu, ậu cọc rào, cọc rào, cây li, dầu mè (Võ Văn Chi, 1999; Nguyễn C ng Tạn,

2008) [6], [13].

1.1.2. Nguồn gốc và phân bố

Cọc rào (Jatropha curcas L.) có l ch sử hơn 70 tri u năm, nguồn gốc từ Mexico

(nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, ược ngư i Bồ Đào Nh ư

n ảo Cape Verde, rồi lan truyền s ng Châu Phi, Châu Á, s u ó ược trồng ở nhiều

nước và dần trở thành cây bản a ở hầu khắp các nước nhi t ới, cận nhi t ới trên

toàn th giới. Hi n nay, cây cọc rào ược trồng ở nhiều nước như: Ấn Độ, Indonesia,

Philippine, Trung Quốc, Vi t Nam, một số ảo ở Thái Bình Dương và Úc nhằm ph c

v nhu cầu năng lượng tại ch và xuất kh u (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008)

[111], [13].

6

Vi t Nam, cây cọc rào có mặt từ rất sớm (từ trước th kỷ XIV) và cho n

n y ược trồng rải rác ở nhiều phương: Đ c Trọng, Bắc Ninh, Lạng Sơn, Ninh

Thuận, Bình Thuận, Th nh Hó , Lào C i, Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh

(Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13].

1.1.3. Đặc điểm sinh học

1.1.3.1. Đặc điểm hình thái

Cọc rào là cây b i g mềm, vỏ xám nhẵn. Cây thư ng cao khoảng 3 ˗ 5 m với tán

cây rộng, vòng i tr n 50 năm. Trong iều ki n chăm sóc tốt, cây có th cao từ 8 ˗ 10

m và có th sống lâu hơn. Cành non mập và mọng nước, nhựa cây có màu trắng s a

hay màu vàng nhạt. Cây rậm lá, lá to bản có màu xanh hoặc xanh nhạt, hình ovan hoặc

hình trái tim, có lá ch 3 n 5 thùy. Lá sắp x p xen k nhau, 3 ˗ 5 lá ối x ng nhau

xoắn ốc quanh tr c (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Hoa cọc rào mọc thành c m ở ngọn h y nách lá, cây thư ng ra hoa vào mùa hè

khoảng tháng 4 ˗ 9 hàng năm. Ho có kích thước nhỏ, màu vàng và có mùi thơm. Ho

ực mọc ở ầu các nhánh với cuống ngắn có khuỷu, hoa cái mọc ở gi a nh ng nhánh

với nh ng cuống không khuỷu, ho lưỡng tính i khi cũng xuất hi n. Số lượng hoa

ực thư ng nhiều hơn ho cái. Ho ực có 10 nh ược chia thành 2 vòng riêng bi t: 5

nh ở vòng trong dính vào phần chân , 5 nh ở vòng ngoài k t lại thành bó. Hoa cái

thư ng r i rạc với bầu nh y hình elip có 3 noãn với ầu núm nh y ch i (Lele,

2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Quả mọc thành chùm và có dạng n ng, kích thước (2,5 ˗ 4,0) cm. Quả chia thành

3 ngăn có ch a hạt. Hạt chín có màu en, thu n dài, kích thước (2 × 1) cm, khối lượng

khoảng 5,8 g (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái

Cọc rào là loài cây có khả năng thích nghi c o. Khi gặp hạn hán, cây thích ng

bằng cách r ng hầu h t lá làm giảm sự thoát hơi nước. Cây có th trồng trên mọi

loại ất. Cây cũng có khả năng ch u ược sương mù nhẹ nhưng chỉ trong th i gian

ngắn. Cây càng già khả năng ch u ựng càng tốt. Tr i lạnh cũng làm cây r ng lá. Nhi t ộ thích hợp cho cây là 18,0 ˗ 28,5°C. Điều ki n hạt nảy mầm là khí hậu nóng m.

Th i gian ra quả trong vòng 6 tháng n 1 năm và có th kh i thác trong khoảng th i

gian ít nhất 40 năm (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

7

Nhu cầu nước của cây cọc rào rất thấp. Cây có th tồn tại ược với lượng mư

trung bình năm từ 250 n 350 mm. Vào nh ng tháng mù ng, cây cọc rào r ng lá

hình thành lớp che phủ b n dưới gốc cây giúp cây hạn ch sự thoát hơi nước (Lele,

2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Nguồn: 1. http://shop.theplantattraction.com/Jatropha-Curcas-Tree-Bio-Diesel-Fuel-Source-Physic-Nut-5-Seeds-S-Jatropha-Curcas-5.htm 2. http://www.alamy.com/stock-photo-physic-nut-jatropha-curcas-close-up-leaf-33120574.html

3. http://biofuelstp.eu/oil_crops.html

4. http://legalwealthcreation.com/2013/01/how-do-i-create-wealth-make-money-from-biodiesel-fuel-production-with-jatropha-

curcas.html

5. http://www.seedscollector.com/1000-jatropha-curcas--physic-nut-s1000.html)

6. https://en.wikipedia.org/wiki/Jatropha_curcas

Hình 1.1. Hình thái cây cọc rào a1: Cây cọc rào; b2: lá, c3: hoa, d4: quả, e5: mặt cắt hạt, f6: hạt

8

1.1.4. Giá trị sử dụng

1.1.4.1. Trong điều trị bệnh

Trong thành phần cây cọc rào, ngư i t phân tích ược nh ng hợp chất chủ

y u như terpen, fl von, coum rin, lipid, sterol, lk loid. Nhiều bộ phận củ cây này có

th ch b nh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ tr ti u vi m, cầm máu, tr ng ; dầu củ

hạt có tác d ng nhuận tràng; d ch nhự trắng ti t r từ v t thương củ cành có th dùng

ch b nh phong thấp, u răng, làm lành v t thương, ch tr b nh trĩ và m n

cơm; nước chi t từ lá có ch phytotoxin (curcin), chất này cũng có trong hạt cọc rào,

n u ược nghi n c u sâu hơn rất có th cung cấp cho chúng t một loại dược li u mới.

1.1.4.1. Cọc rào và nhiên liệu sinh học

Ngoài các tác d ng tr b nh k tr n, cây cọc rào ược sự chú ý ặc bi t bởi nó là

nguồn nguy n li u sản xuất nhi n li u sinh học. Hạt củ cây có ộ m (6,62%),

protein (18,2%), chất béo (38%), c rbohydr te (17,3%), sợi (15,5%) và tro (4,5%).

Dầu chi m 35 ˗ 40% hạt và 50 ˗ 60% nhân hạt. Trong dầu ch 21% các cid béo

kh ng b o hò . Hạt ược x y và ép lấy dầu hoặc dầu ược tách bằng các dung môi.

Dầu s u khi lọc ược sử d ng ng y như là nguồn nguy n li u sinh học ở dạng bổ sung,

dầu cọc rào có th trộn với dầu thư ng với tỷ l l n n 20%. Đây là nguồn năng

lượng mới, n toàn, chi phí thấp, tái sinh ược, h hẹn s là nguồn năng lượng th y

th cho thủy i n, dầu diesel, dầu lử , khí hó lỏng (LPG), th n, củi. Nguồn năng

lượng này s giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xó

i sự mất cân bằng về sử d ng năng lượng gi các vùng. Ưu i m là khói từ dầu cọc

rào không có mùi và kh ng c y như khói dầu hỏ và kh ng lại mùi cho th c ăn s u

khi nấu (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

1.1.4.3. Bảo vệ môi trường

Cọc rào là cây lâu năm, tuổi thọ củ cây là 50 năm phủ ất rất tốt, sinh trưởng

phát tri n ược ở hầu h t các loại ất xấu, nghèo dinh dưỡng, ất dốc, ất trơ sỏi á.

Vì vậy, cọc rào ược trồng tr n các vùng ất dốc s ược coi là cây “lấp ầy” l hổng

sinh thái ở các vùng sinh thái xung y u miền núi, sớm tạo r thảm thực vật bề mặt dày

ặc chống xói mòn, chống cháy, nâng c o ộ phì nhi u củ ất. Kh ng nh ng vậy, cây

còn có th trồng ở nh ng vùng ất s mạc hó , b i thải kh i thác khoáng sản, góp phần

9

ph c hồi h sinh thái các vùng này, tạo r hi u ng to lớn về bảo v m i trư ng (Lele,

2006) [111].

Cọc rào hấp th nhiều CO2 trong kh ng khí. Theo tính toán sơ bộ, một cây có

khả năng hấp th 100 g CO2/ngày trong kh ng khí, tính r m i cây có khả năng hấp

th 30 kg CO2/năm, m i h có th hấp th 48 tấn CO2/năm, góp phần giảm thi u khí

thải gây hi u ng nhà kính (Lele, 2006) [111].

1.1.4.4. Phân bón và thức ăn gia súc

S u khi ép dầu, b kh dầu có hàm lượng N 4,14 ˗ 4,78%; P2O5 0,50 ˗ 0,66%;

CaO 0,60 ˗ 0,65%; MgO 0,17 ˗ 0,21% ược sử d ng làm phân h u cơ rất tốt bón

cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất n ng nghi p h u cơ, n ng nghi p

sạch, vừ góp phần sản xuất sản ph m sạch, vừ nâng c o ộ phì nhi u củ ất

(Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13].

1.1.5. Nhân giống cây cọc rào

Nh ng nghi n c u về nhân giống cây cọc rào tr n th giới và ở Vi t N m còn rất

hạn ch . Cho n n y, phương pháp nhân giống cây cọc rào chủ y u vẫn theo phương

pháp chuyền thống là giâm cành và gieo hạt. Các phương pháp nhân giống hi n ại áp

d ng tr n cây cọc rào chỉ mới phát tri n trong khoảng hơn 10 năm trở lại ây.

1.1.5.1. Phương pháp nhân giống truyền thống

N m Phi, ngư i dân trồng cây cọc rào làm rào dậu hoặc trồng cây chống

xói mòn và bảo v ất. Họ thư ng sử d ng phương pháp giâm cành vì ưu i m củ

phương pháp này là nh nh chóng tạo ược cây trưởng thành. Cành ược cắt từ các cây

cọc rào trưởng thành cắm xuống ất, n u ược chăm sóc c n thận thì s u khoảng

h i n b tháng là có ược cây ủ lớn em trồng. Cây tạo r từ phương pháp giâm

cành s u khoảng 1 năm s bắt ầu cho quả.

Trồng cây kh i thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt

ược sử d ng nhiều hơn. Bởi nh ng nghi n c u chỉ r rằng, cây tạo thành từ nhân

giống bằng giâm cành có i sống ngắn hơn, khả năng chống hạn và b nh tật kém hơn

cây ược nhân giống bằng hạt. Rễ củ cây giâm cành phát tri n y u, dễ b g y ổ

(Heller, 1996) [85]. Hạt trước khi em gieo ược lự chọn là nh ng hạt to, chắc, m y.

Hạt ược ngâm nước qu m làm tăng tỷ l nảy mầm. S u ó, hạt ược gieo vào

trong các bầu ất. Hạt s nảy mầm s u khoảng 1 tuần và cây con có th em i trồng

10

s u 45 ngày. Rễ củ cây con mọc từ hạt phát tri n, thư ng có 1 rễ cái và 4 rễ b n. Cây

trồng ngoài thực s r ho s u khoảng 3 ˗ 4 năm (Heller, 1996) [82]. Nhược i m

củ phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con kh ng ồng nhất bởi cây

cọc rào là cây th phấn chéo n n gi các hạt có sự khác nh u về mặt di truyền. Chẳng

hạn như xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo r bằng gieo hạt có hàm

lượng dầu trong hạt kh ng ổn nh, gi o ộng từ 4 n 40% (Jh và cộng sự, 2007)

[89]. Do ó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt kh ng th áp ng ủ nhu cầu cây

giống chất lượng tốt cho vi c trồng cây tr n quy m c ng nghi p.

1.1.5.2. Phương pháp nhân giống hiện đại

Các nghiên cứu trên thế giới

Các phương pháp nhân giống hi n ại có ưu i m lớn là có khả năng tạo r cây

giống với số lượng lớn trong khoảng th i gi n ngắn với chất lượng c o và ồng nhất.

Tuy nhi n, nh ng nghi n c u này còn ít hoặc chư ược c ng bố.

Suj th và Mukt (1996) [181] phát tri n kỹ thuật tái sinh cây cọc rào từ nhiều

bộ phận khác nh u củ cây như phần tr hạ di p, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non

bất nh ược ch ng minh là hi u quả nhất ở m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l BA và

1,0 mg/l IBA. Chồi non hình thành ược nu i và tạo rễ trong m i trư ng MS kh ng bổ

sung chất iều hò sinh trưởng cho n khi phát tri n thành cây hoàn chỉnh ư r

vư n ươm.

Sự tái sinh cây con từ các mẫu cấy tr tr n lá mầm củ cây cọc rào cũng ược

Wei và cộng sự (2004) nghi n c u thành c ng [216]. Các mẫu cấy tr tr n lá mầm in

vitro ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung IBA và BA. Các chồi bất nh

ược hình thành trực ti p tr n bề mặt củ mẫu cấy tr tr n lá mầm trong iều ki n k t

hợp củ 0,1 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA với tỷ l tái sinh chồi c o nhất. Trong khi ó, sự

tái sinh chồi gián ti p th ng qu m sẹo cần phải có sự k t hợp 1,0 mg/l IBA và 0,5

mg/l BA. Chồi tái sinh có th hình thành rễ tr n m i trư ng MS kh ng có bổ sung các

chất iều hò sinh trưởng.

Suj th và cộng sự (2005) thành c ng trong nhân giống in vitro cây cọc rào

bằng phương pháp tạo c m chồi [181]. Nghi n c u tạo chồi non bằng cách nu i cấy

nách lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 ˗ 1,0 mg/l TDZ, s u ó chuy n

s ng m i trư ng MS bổ sung IBA và BA. Hi u quả tạo chồi c o 10,0 ˗ 12,3 chồi/mẫu

11

cấy. Vi c tạo chồi bất nh từ lá thu ược bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng

bổ sung 2,0 ˗ 10,0 mg/l BA và 1,0 mg/l IBA tạo thành m sẹo có màu trắng x nh,

các chồi bất nh s ược tạo thành s u khoảng 3 tuần, s u ó chuy n s ng m i trư ng

bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA.

Cây cọc rào ược tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy ốt thân (D tt và cộng sự,

2007) [47]. Các chồi ược tái sinh từ ốt thân tr n m i trư ng có bổ sung auxin và

cytokinin riêng l hoặc k t hợp. Các chồi ược cấy chuyền s ng m i trư ng khác

nhân nh nh số lượng chồi (D tt và cộng sự, 2007) hoặc cấy s ng m i trư ng chỉ có

uxin hình thành rễ. Cây con s u khi chuy n r vư n ươm thì cho tỷ l sống sót c o

(trên 80%) [47].

Nghi n c u tái sinh chồi từ hạt cũng ược thực hi n bởi W r k god và

Sub singhe (2009) [215]. Hạt củ cây cọc rào (chư trưởng thành, trưởng thành, hoàn

toàn trưởng thành) s u khi ược thu thập và khử trùng bề mặt s ược cấy vào m i

trư ng MS, WPM và B5, có hoặc kh ng có bổ sung 1,0 g/l th n hoạt tính. Hạt giống

trưởng thành trong m i trư ng B5 cho thấy tỷ l nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất

so với các hạt chư trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành trong m i trư ng B5, MS

và WPM. Các chồi ược nảy mầm từ hạt s ược cấy vào m i trư ng B5 có ch BA,

KIN, NAA ở các nồng ộ k t hợp khác nh u. Chồi ược nhân nh nh và phát tri n tr n

m i trư ng B5 có bổ sung 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l KIN và 2,0 mg/l NAA ạt số lượng

chồi c o nhất là 6,6 chồi/mẫu cấy. Bổ sung th n hoạt tính vào m i trư ng B5 kh ng có

ảnh hưởng áng k n sự nảy mầm củ hạt và sự tăng trưởng củ cây con.

Kaewpoo và Te˗ch to (2009) báo cáo về ảnh hưởng củ các loại mẫu cấy và

chất iều hò sinh trưởng l n sự hình thành chồi cây cọc rào [91]. Các loại mẫu cấy

khác nh u ( oạn thân, chồi b n, chồi ỉnh) ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung

BA và IBA ri ng l h y k t hợp với các nồng ộ khác nh u. K t quả ch ng minh rằng

các chồi b n cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l BA k t hợp với 0,25 mg/l

IBA ạt số chồi c o hơn so với các thí nghi m còn lại. Chồi tái sinh ược tạo rễ (60%)

tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 ˗ 40 ngày nu i cấy.

Phương pháp phát sinh ph i từ t bào som (som tic embryogenesis) ˗ một c ng

c mạnh củ ngành c ng ngh sinh học tạo giống cây trồng - ược áp d ng

thành c ng lần ầu ti n tr n cây cọc rào bởi Jh và cộng sự (2007) [89]. M sẹo có khả

12

năng phát sinh ph i ược thu nhận bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng MS có

bổ sung 2,0 mg/l KIN. Các khối m sẹo này ược chuy n s ng m i trư ng có bổ sung

0,5 mg/l KIN và 0,25 mg/l IBA cho thấy tần suất m sẹo phát sinh ph i hình cầu c o

nhất. Ph i ược kích thích phát tri n bằng cách bổ sung th m denine sulph te trong

m i trư ng nu i cấy. Các ph i trưởng thành s tạo các cây con tr n m i trư ng ½MS.

Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 ˗ 16 tuần. Quá trình phát sinh ph i som ở

cây cọc rào có th trở thành một h thống lý tưởng cho nghi n c u chuy n gen trong

tương l i.

Ismidi nty và Esy nti (2010) nghi n c u xác nh thành phần củ các cid béo

trong các ph i som ược nu i cấy bằng biore ctor với m c ích là thu nhận sinh khối

ph i som [88]. Điều ki n tối ưu lưu lượng kh ng khí cũng ược nghi n c u duy

trì sự tăng trưởng và tạo r thành phần cid béo ở ph i som thích hợp cho vi c tạo

dầu diesel sinh học. Các mẫu tr dưới lá mầm ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có

bổ sung vit min B5; 13,5 M 2,4˗D; 4,4 M kinetin và 30 g/l sucrose cảm ng m

sẹo có khả năng sinh ph i. Các m sẹo bở s u bốn tuần tuổi ược chuy n vào m i

trư ng MS lỏng có bổ sung vit min B5; 6,75 µM 2,4˗D; 0,4 µM kinetin và 20 g/l

sucrose khởi ầu nu i cấy tạo huyền phù các t bào ph i som .

Năm 2012, Son l và cộng sự nghi n c u khả năng phát sinh ph i som từ mẫu

lá mầm. M sẹo có khả năng phát sinh ph i ược hình thành tr n m i trư ng MS có bổ

sung 0,2 mg/l IAA s u 3 ˗ 4 tuần nu i cấy. S u ó, ph i som hình thành tr n m i

trư ng MS có bổ sung 0,2 mg/l IAA và 1,5 mg/l BAP. Đầu ti n, ph i hình cầu hình

thành trong khoảng 3 ˗ 4 tuần s u khi cấy và s u ó nh ng ph i này phát tri n thành

ph i dạng hình tim, hình thủy l i, lá mầm s u 6 tuần.Trong cùng m i trư ng tr n, các

ph i bi t hó tạo rễ, chồi và thành cây hoàn chỉnh s u 4 ˗ 5 tuần nu i cấy. Cây ược

chuy n r vư n ươm với tỷ l sống sót ạt 50% [174].

Năm 2014, Annggi Nindit và cộng sự báo cáo rằng ở cả h i dạng ph i: h i

tr c và lá mầm ược lấy từ hạt cọc rào chỉ có th hình thành ph i som tr n m i

trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l piclor m [24].

Năm 2014, M h l kshmi và cộng sự báo cáo về khả năng tái sinh thành cây

con từ ộ già củ các cuống lá khác nh u. Các cuống lá ược ánh số từ ỉnh: cuống

th nhất, th 2, th 3, th 4, th 5, th 6, th 7, th 8, th 9, th 10. Cuống lá ược

13

cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 0,2 mg/l kinetin cho tỷ l hình

thành m sẹo c o nhất ở cuống lá th nhất (83,24%), tỷ l hình thành ph i soma cao

nhất ở cuống lá th nhất (35,16%) tr n m i trư ng 0,5 mg/l TDZ và 0,4 mg/l GA3.

M i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP, 0,5 mg/l IAA và 0,25 mg/l kinetin cho phần

trăm tái sinh ph i som c o nhất (66,85%). M i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l TDZ, 0,1

mg/l BAP, 0,4 mg/l GA3 là m i trư ng tốt nhất kéo dài chồi. M i trư ng MS có sổ

sung 0,3 mg/l NAA cho tỷ l hình thành rễ c o hơn tr n m i trư ng có bổ sung IAA

h y IBA. Tỷ l sống sót củ cây con hình thành rễ trong in vitro ph thuộc vào loại

mẫu cấy và nó th y ổi từ 47 ˗ 60% [115].

Các nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 2009, Đ Vũ Tuy t Trinh nghi n c u sự tạo m sẹo có khả năng phát

sinh chồi và rễ từ nu i cấy lớp mỏng t bào mảnh lá cây cọc rào tr n m i trư ng WPM

có bổ sung 0,1 mg/l IBA và 1,0 mg/l BA. M i trư ng WPM có bổ sung 1,0 mg/l BA

thích hợp cho sự tái sinh chồi từ m sẹo trong khi NAA ở nồng ộ 1,0 mg/l có khả

năng kích thích sự tạo rễ từ m sẹo rất tốt [15].

Thái Xuân Du và Đ Đăng Giáp (2010) hoàn thi n quy trình vi nhân giống

bằng kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng lá cây cọc rào. Lớp mỏng t bào cắt ng ng lá in vitro

ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung TDZ với các nồng ộ khác nh u (0,1 ˗ 0,9

mg/l). K t quả thực nghi m cho thấy, tỷ l tạo chồi bất nh tốt nhất ược ghi nhận ở

m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l TDZ. Sự hình thành rễ ở nh ng chồi bất nh có k t

quả tốt tr n m i trư ng ½MS và bổ sung 1,0 mg/l IBA [7].

Bùi Văn Th Vinh và cộng sự (2011) nghi n c u tái sinh chồi trực ti p từ mẫu

cấy lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l KIN. Các

chồi này ược cấy chuyền s ng m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 20% nước

dừ kéo dài chồi và ngăn hi n tượng r ng lá. Các chồi phát tri n tốt ược chuy n

s ng m i trư ng MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA cảm ng r rễ. Cây tái sinh sau 4

tháng ược chuy n r vư n ươm với tỷ l sống sót ạt tr n 80%. Đây là một quy trình

hi u quả tái sinh chồi trực ti p từ mẫu cấy lá cây cọc rào, quy trình này có th ược

áp d ng trong các nghi n c u chuy n gen nhằm nâng c o hàm lượng dầu trong hạt mà

kh ng qu gi i oạn tạo m sẹo [17].

14

1.1.6. Tình hình nghiên cứu và triển khai canh tác cây cọc rào trên thế giới và ở

Việt Nam

Tình hình nghiên cứu sử dụng cây cọc rào trên thế giới

Từ năm 1991, Giáo sư ngư i Đ c, Kl use Becker, củ Trư ng Đại học Stuttg rt

nhận ơn ặt hàng củ Tập oàn D imler Chrysler hợp tác với 1 h ng tư vấn củ

Áo ti n hành nghi n c u cây cọc rào ở Nic r gu , làm nguy n li u sản xuất diesel

sinh học.

Năm 1996, Jo chim Heller nghi n c u thúc y vi c bảo tồn và sử d ng

úng m c giá tr cây cọc rào tại Rome, It ly.

Các nước nhi t ới, á nhi t ới ng phát tri n mạnh cây cọc rào. Thái L n hi n

có 1600 h , dự ki n s tăng l n 320 nghìn h trong vài năm tới. Indonesi ặt m c ti u

n năm 2010, nhi n li u sinh học áp ng 20% nhu cầu năng lượng trong ngành i n

và gi o th ng vận tải. Ấn Độ xác nh cọc rào là cây cho hạt có dầu thích hợp nhất

sản xuất diesel sinh học. Từ năm 2001, nhiều b ng ở Ấn Độ có chương trình

khuy n khích trồng tr n quy m lớn ở các vùng ất ho ng hó , ược nhà nước h trợ

giống và các nguồn vật tư ầu vào nhằm tạo vi c làm, xó ói giảm nghèo, phát tri n

bền v ng x hội n ng th n Ấn Độ. Cơ qu n k hoạch củ Chính phủ Ấn Độ ặt chỉ

ti u trồng 11 tri u h cây cọc rào vào năm 2012 có ủ nguy n li u sản xuất

biodiesel phối trộn theo tỷ l 20%. Trong tương l i, Ấn Độ ti p t c mở rộng trồng tr n

phạm vi cả nước, ư di n tích tr n 33 tri u h , trong số hơn 133 tri u h ất ng b

bỏ ho ng.

My nm r là nước phát tri n vi c trồng cây cọc rào với tốc ộ nh nh. Đ n 2006,

di n tích trồng ở My nm r ạt 800.000 h . Trung Quốc là nước qu n tâm phát tri n

mạnh cây cọc rào trong vài năm gần ây, chủ y u là 7 tỉnh gồm T Xuy n, Quý Châu,

Vân N m, Phúc Ki n, Quảng Tây, Quảng Đ ng và ảo Hải N m; trong ó, ở khu tự tr

Quảng Tây, n cuối năm 2007 trồng ược 15 nghìn h , dự nh ư l n khoảng 10

vạn h trong vài năm tới. Các tỉnh khác có iều ki n có k hoạch trồng tr n quy m

lớn trong mấy năm tới. Theo ước tính củ Giáo sư Kl use Becker, cho n 2009, cả

th giới trồng ược khoảng 5 tri u h cọc rào. Hi n n y, có khoảng 1000 nhóm

nghi n c u về diesel sinh học và cọc rào. Cho n th i i m này, ây vẫn là một cây

dại và mới ược ư vào ối tượng cây trồng ược khoảng tr n 15 năm, cũng có th

15

coi là cây nông ˗ lâm nghi p tr nhất trong l ch sử trồng cây nông ˗ lâm nghi p củ loài

ngư i.

Bahamas: Tháng mư i một năm 2013 vừ qu , c ng ty i n B h m Gr nd

(GBPC) tổ ch c lễ kh i mạc cho dự án nhi n li u sinh học củ họ. Hợp tác với cảng

Gr nd B h m , c ng ty phát tri n Gr nd B h m và G rden of the Groves, dự án tập

trung vào tính khả thi củ vi c c nh tác cây dầu mè sản xuất nhi n li u sinh học

chạy các ộng cơ tạo năng lượng i n.

Botswana: Tháng tám năm 2013, Botsw n ặt m c ti u nhằm ph duy t

chính sách năng lượng quốc gi n năm 2015, b o gồm một thành phần năng lượng

tái tạo lớn, trong ó có cả nhi n li u sinh học. Chính phủ làm vi c với ngư i Nhật

phát tri n các giống j troph có khả năng chống ch u với nh ng th y ổi th i ti t

khắc nghi t trong nước. Bộ trưởng năng lượng thừ nhận rằng sự thi u chính sách này

cản trở ầu tư vào nhi n li u sinh học cho n n y.

Costa Rica: Cuối tháng mư i h i năm 2013, Altern tive Fuels Americ bắt

ầu sản xuất thử nghi m b ph nhi n li u sinh học dầu mè. Các nguy n li u cho gi i

oạn 1 s n từ trồng AFAI trong Temp te, Cost Ric .

Ethiopia: Trong tháng bảy năm 2014, chính phủ Ethiopi ng ầu tư 2,8 tri u

, với sự giúp ỡ củ các nguồn tài trợ từ chính phủ N Uy, sản xuất 500 tri u lít

dầu diesel sinh học từ cây dầu mè m i năm. Dự án s diễn r tại 18 quận trong năm

ti u b ng và ước tính s giúp hơn 14 tri u n ng dân và ngư i chăn nu i có nguồn năng

lượng tái tạo sử d ng.

Ghana: Vào tháng tám năm 2013, c ng ty TNHH Sm rt Oil ký k t một thỏ

thuận cấp phép và các thoả thuận d ch v với QUINVITA. Thỏ thuận này cho phép

truy cập n ng học ti n ti n QUINVITA bi t làm th nào gieo hạt giống Jatropha

curcas tốt nhất củ QUINVITA (QVP). Niqel Ld , một c ng ty có tr sở hoạt ộng ở

Moz mbique trong vi c sản xuất năng lượng tái tạo từ Jatropha curcas, cũng ký

một thỏ thuận cấp phép và các thoả thuận d ch v với QUINVITA sản xuất năng

lượng sinh học từ cây dầu mè.

Sudan: Vào cuối năm 2012, có báo cáo rằng c ng ty củ Ả Rập S udi T l

hợp tác với Nov toàn cầu củ C n d tr n một dự án mí 650.000.000$ rằng s sản

16

xuất ư ng và eth nol tại ti u b ng Sinn r, cũng như một dự án dầu mè s cung cấp

dầu cho các h ng hàng kh ng Trung Đ ng. Dự án b o gồm khoảng 156.000 mẫu Anh.

Hoa Kỳ: H w ii, vi c thu hoạch cây dầu mè bắt ầu vào tháng 8 năm 2013 tại

n ng trư ng H w ii Pure Pl nt Oil (HIPPO) thành lập năm 2008 bởi ngư i ch và con

tr i ối tác Christi n và J mes Twigg-Smith. HIPPO trồng tổng cộng 200 mẫu cây

dầu mè ở quận Pun củ ảo H w ii với m c ích thu hoạch hạt và chi t xuất dầu

sản xuất dầu diesel sinh học. S u 5 năm thành lập các tr ng trại, nhà Twigg-Smiths

thi t lập hợp tác trực ti p với P cific Biodiesel Technologies thuộc dự án cây trồng

H w ii Milit ry Biofuel Crop. Dự án b o gồm vi c phát tri n các m hình sản xuất

cây dầu mè và các cây trồng khác chi s với ngư i trồng cây nhi n li u sinh học

tiềm năng tr n toàn ti u b ng.

Tình hình nghiên cứu sử dụng cây cọc rào ở Việt Nam

Từ năm 2008, Khi Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n ph duy t ề án

“Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản ph m cây cọc rào ở VN gi i oạn 2008 ˗ 2015

và tầm nhìn n 2025”. Theo ề án, m c ti u trong gi i oạn 2008 ˗ 2010 Vi t N m

trồng thử nghi m, khảo nghi m và sản xuất ở các vùng sinh thái khác nh u ạt quy m

di n tích khoảng 30.000 h . Gi i oạn 2011 ˗ 2015 và tầm nhìn n 2025 từng bước

mở rộng sản xuất quy m lớn theo nhu cầu th trư ng, n năm 2015 có th ạt di n

tích gây trồng trong cả nước khoảng 300.000 h và nh hướng tiềm năng n 2025 có

th ạt 500.000 h … Tổng nhu cầu vốn thực hi n cho ề án ước tính khoảng 2.320 tỉ

ồng trong ó nguồn vốn ngân sách Nhà nước khoảng 220 tỉ còn lại 2.100 tỉ là ầu tư

củ các do nh nghi p.

Từ năm 2007, Trung tâm C ng ngh sinh học (thuộc Vi n Kho học Lâm nghi p

Vi t N m) tri n kh i ề tài “Nghiên cứu gây trồng phát triển cây cọc rào (Jatropha

curcas)”; n n y thu thập ược 8 xuất x cọc rào (4 xuất x ở trong nước và 4

xuất x nhập từ nước ngoài) ồng th i tuy n chọn ược 29 cây trội với các ặc tính

vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt từ 2,5 ˗ 5,0 kg/cây và hàm lượng dầu trong hạt

ạt 25 ˗ 39%, nhưng theo k t quả theo dõi củ ề tài: cây mẹ có năng suất c o lại

kh ng trùng với cây mẹ có hàm lượng dầu c o. Đơn v này cũng phối hợp với c ng ty

GreenEnergy Vi t N m nghi n c u trồng thử nghi m tại nhiều tỉnh với tổng di n tích

là 38 h . Trong các m hình thử nghi m, vi c ti n hành áp d ng các bi n pháp kỹ thuật

17

lâm sinh nhằm nâng c o năng suất 15% so với b n ầu.

Trư ng Đại học Thành Tây cũng ng thực hi n ề tài “Chọn tạo giống và

nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật phát triển cây cọc rào thành vùng nguyên liệu sản

xuất diesel sinh học”. Nhà trư ng ng nghi n c u khảo nghi m các xuất x giống có

năng suất c o củ Vi t N m (40 ˗ 50 xuất x ) và một số nước trong khu vực như

Trung Quốc, Thái L n, Ấn Độ, M l ysi , Indonesi (5 xuất x ) nhằm ánh giá năng

suất và trồng thử nghi m ở một số tỉnh (vùng sinh thái khác nh u) củ Vi t N m.

Trư ng và ng trồng giống ưu tuy n số 6 củ Quảng Tây và giống nhập từ C n

Minh (Trung Quốc) tr n di n tích khá lớn ở Lạng Sơn. Trư ng cũng nghi n c u kỹ

thuật giâm hom và nhân giống bằng phương pháp nu i cấy m . Trư ng Đại học Thành

Tây xây dựng vư n giống từ gi i oạn cuối năm 2007 và hi n n y ng bắt ầu thu

hạt với m c ích nhằm tạo r năng lượng sinh học mới.

C ng ty Cổ phần Đầu tư và phát tri n Lũng L 5: ng thực hi n dự án “Phát

triển vùng chuyên canh cây Bã đậu nam (cọc rào) và xây dựng nhà máy chế biến

nhiên liệu sinh học, phụ phẩm kèm theo tại địa bàn tỉnh Quảng Trị; Năm 2008, C ng

ty ti n hành nhập các giống cọc rào từ một số quốc gi trong khu vực, dưới sự hợp

tác giúp ỡ củ chuy n gi Nhật Bản, hi n n y tạo ược vư n ươm di n tích tr n

1h với số lượng hàng vạn cây giống. Đơn v này hi n ng chu n b gi i oạn trồng

thử nghi m.

Vi n nghi n c u Dầu và cây có Dầu (Bộ C ng Thương) hi n và ng tri n

kh i ề tài “Nghiên cứu khả năng thích nghi của các giống Jatropha sử dụng làm

nguyên liệu để sản xuất dầu biodiesel” từ năm 2007 tới n y; thu thập và khảo

nghi m tập oàn gồm 41 mẫu giống trong và ngoài nước như: Úc, Pháp, Ấn Độ,

Br zil, Indonesi , Lào, Thái L n, Trung Quốc tại vư n lưu gi tập oàn tại Tây Ninh.

Hàm lượng dầu củ các mẫu giống từ 33 ˗ 39% ( m ộ hạt là 5%). Đ bố trí khảo

nghi m giống tại vùng Đ ng N m Bộ và Duy n hải Miền Trung ồng th i ti n hành

rất nhiều các nghi n c u thử nghi m về trồng trọt và kỹ thuật chăm sóc (kỹ thuật tạo

tán, mật ộ trồng, ch ộ bón phân, ch ộ tưới nước, các bi n pháp kỹ thuật giâm

cành cọc rào). Vi n ng hợp tác với số 1 ơn v củ Ấn Độ và Đ c trong lĩnh vực

nghi n c u chọn tạo giống, kỹ thuật c nh tác và ch bi n các sản ph m từ cọc rào.

18

Ngoài nh ng ơn v k tr n còn một số ơn v khác ở các tỉnh cũng th m gi vào

vi c nghi n c u, thử nghi m trồng cọc rào. Song, vấn ề qu n trọng nhất ng ược

ặt r là cần phải lự chọn ược giống cho năng suất hạt và hàm lượng dầu c o, thích

nghi ược với các iều ki n sinh thái khác nh u và có th gây trồng tr n di n rộng với

năng suất ổn nh.

1.2. Giới thiệu về hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào (Thin cell layer – TCL)

1.2.1. Khái niệm hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL)

Khi nghi n c u về h thống c ch , K. Trần Th nh Vân nghĩ n khái ni m về h

thống lớp mỏng t bào (Trần Th nh Vân, 2003) [198]. Với h thống này K. Trần

Th nh Vân cố gắng phân tách một hoặc một vài lớp trong nh ng t bào bi t hó từ

một h thống cơ qu n, m , hoặc t bào; và cố gắng chương trình hó lại chúng trong

nu i cấy in vitro, trong ó “bi t hó ” là một ti u chí qu n trọng. Thực vật có nh ng

ặc i m nổi bật là có th tái thi t lại chương trình bi t hó sự phát tri n củ cơ th và

có khả năng xây dựng quá trình phân chi ch c năng mới (m sẹo, rễ, chồi, ph i som

và ho ), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trư ng hợp hình thành cấu trúc mới là

chồi và ph i som , cá th mới có th hình thành mà kh ng cần quá trình giảm phân và

sinh sản h u tính. Sự phát tri n b n trong thực vật ược ki m soát về kh ng gi n và

th i gi n trong một mạng lưới các ơn v khác nh u: cơ qu n, m , t bào. N u như có

sự th y ổi trong mạng lưới này thì sự c ch ở m c cá th có th xảy r .

H thống TCL b o gồm các mẫu m có kích thước nhỏ ược thu nhận từ các cơ

qu n khác nh u củ thực vật (thân, rễ, lá, c m ho , chồi ho , các cơ qu n củ ho , lá,

mầm, m phân sinh, ỉnh sinh trưởng hoặc ph i). Khi mẫu ược thu nhận theo chiều

dọc gọi là lTCL (longitudi l TCL) và thu nhận theo chiều ng ng gọi là tTCL

(tr nsverse TCL). Các mẫu lTCL (1 mm × 0,5 mm h y 1,0 mm) b o gồm chỉ một dạng

m như một lớp ơn các t bào bi u bì (có th ược bóc khỏi cơ qu n) hoặc là vài lớp

(3 ˗ 6) t bào bi u bì, trong khi các mẫu tTCL (0,2 ˗ 0,5 mm h y dày vài mm) b o gồm

một số lượng nhỏ các t bào thuộc các dạng m khác nh u như: bi u bì, vùng thượng

tầng, bó g , bó mộc và các t bào nhu m (Tr n Th nh V n và Gendy, 1996) [199].

Ngoài r , còn có h thống TCL chỉ dày vài micromete phải dùng máy vi phẫu cắt

(Lee˗Stedlem mn và cộng sự, 1989), nhưng với kích thước này mẫu dễ b nhiễm

khu n hoặc ch t [110].

19

1.2.2. Đặc trưng của hệ thống TCL

Đặc trưng củ lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩ là một mẫu cấy có càng ít

t bào càng tốt. Đặc i m này là một trong nh ng iều qu n trọng các phân tử ánh

dấu (m rkers) củ quá trình bi t hó có th nh v in situ trong các t bào m c ti u

h y trong t bào cảm ng. Quá trình nh v này cho phép giới hạn các t bào cảm ng

kh ng mong muốn (Tr n Th nh V n, 2003) [198].

Quá trình cắt mẫu làm m thực vật b thương, nhiều enzyme h y polys cch ride

sinh r rất cần cho quá trình cảm ng sự sinh trưởng và phát tri n củ thực vật (Tr n

Th nh V n và Mut ffschiew, 1990) [200]. Lý do cơ bản ng d ng một vài t bào trong

h thống TCL là vì chúng có mối li n h mật thi t với các t bào b thương (nơi xảy r

sinh tổng hợp cấu tạo vách t bào và là nơi phóng thích oligos cch ride) và chất dinh

dưỡng cùng với các y u tố khác củ m i trư ng “ki m soát” sự phát sinh hình thái.

Một h thống bào như h thống TCL m ng sự tổ ch c kh ng gi n/th i gi n

củ cơ th b n ầu. Khác với khi sử d ng một t bào ơn h y thậm chí t bào trần, s u

khi tách chúng tạo n n vách t bào và hình thành n n c m t bào với tổ ch c kh ng

gi n/th i gi n khác bi t với tổ ch c trước khi ti n hành quá trình tách r từ m h y cơ

quan cho (Tran Thanh Van, 1973) [201].

Vi c giảm số lượng t bào trong phương pháp lớp mỏng t bào có ý nghĩ rất

qu n trọng n quá trình phát tri n hoặc các chương trình bi t hó m , cơ qu n. Các

chương trình bi t hó có th th y ổi từ vi c bi n ổi mối tương qu n gi cơ qu n/m

nu i cấy với kích thước khác nh u khi nu i cấy tr n m i trư ng có cùng tính chất. Lớp

cắt dọc 0,5 × 1,0 × 10 mm ược dùng phổ bi n và các dạng phát sinh hình thái mong

muốn có th tạo ược qu vi c iều khi n m c ộ tác ộng củ các nhân tố ngoại sinh.

B n cạnh ó, khoảng th i gi n củ quá trình phát sinh hình thái xuất hi n tương ối

ngắn (trung bình khoảng 14 ngày s u khi cấy), với tần số c o (gần 100% mẫu có phản

ng). Tỷ l gi số lượng t bào áp ng với tổng số t bào hi n di n tr n mẫu TCL

cao [198].

1.2.3. Sự phát sinh cơ quan

Nh ng cơ qu n như chồi h y rễ có th ược hình thành từ bất c loại m nào củ

cây, nh ng cơ qu n ược khởi tạo như vậy ược gọi là cơ qu n bất nh. Quá trình tái

sinh các cơ qu n bất nh gọi là sự phát sinh cơ qu n bất nh. ây, chồi h y rễ có

20

th hình thành từ một t bào ơn, h y một nhóm t bào. Các t bào này ược kích thích

bởi iều ki n m i trư ng trở thành trung tâm củ sự phân chi tích cực các t bào

(m phân sinh bất nh). Cơ ch iều hò phát sinh cơ qu n có th ược thấy rõ bằng

cách nu i cấy nh ng lớp mỏng chỉ gồm vài lớp t bào bi u bì và dưới bi u bì (Tr n

Thanh Van, 1980) [197].

Sự tái sinh ược nghi n c u in vitro tr n số lượng lớn cây trồng củ nhiều loài

khác nh u, nhưng kh ng phải khả năng tái sinh củ cây nào cũng như nh u. Thậm chí

trong cùng một giống cây trồng vẫn có sự khác nh u, ó có th là do tính áp ng in

vitro kém h y kh ng có khả năng tái tạo cơ qu n từ mẫu cấy b n ầu. Hơn n , ở một

số loài, khả năng tái sinh có th b mất s u quá trình chuy n gen. Ngư i t vẫn còn

chư bi t rõ tại s o một số cây trải qu quá trình phát sinh cơ qu n còn một số khác lại

kh ng. Một số giả thuy t ược ư r bởi Christi nson và W rnick (1984) giải thích

một chu i các quá trình củ sự phát sinh cơ qu n theo th i gi n [37]. Sugiy m (1999)

xác nh ược 3 gi i oạn củ sự phát sinh cơ qu n [180].

‒ Gi i oạn ầu: là gi i oạn ạt khả năng phát sinh cơ qu n, hoặc khả năng phản

ng với tín hi u cảm ng cơ qu n, th ng thư ng òi hỏi một bước bi t hó .

‒ Gi i oạn th 2: là gi i oạn các t bào có khả năng hình thành cơ qu n chuy n

bi t dưới ảnh hưởng củ sự cân bằng các hormon thực vật.

‒ Gi i oạn th 3: là gi i oạn sự phát sinh hình thái ược bắt ầu một cách ộc

lập từ tác nhân kích thích ngoại sinh ược sử d ng b n ầu.

a. Tái sinh trực tiếp

M phân sinh chồi hình thành trực ti p từ mẫu cấy thư ng ược khởi tạo bằng sự

phân bào sơ cấp s u 48 gi nu i cấy. K ti p m i quá trình phân bào sơ cấp là một quá

trình phân bào dài và ph c tạp hơn, k t quả hình thành n n các mầm chồi bất nh,

m i mầm chồi b o gồm nhiều t bào. Sự hình thành trực ti p này thư ng bắt nguồn từ

một h y một nhóm các t bào sinh dưỡng chư phân hoá. Broertjes và cộng sự (1976),

cho rằng trong suốt quá trình phát sinh cơ qu n trực ti p, các mầm chồi bất nh kh ng

phải lúc nào cũng ược hình thành từ nhiều t bào củ m . Một t bào bi u bì i khi

lại khởi i m cho quá trình phát tri n củ vùng phân sinh trung tâm là nguồn gốc củ 1

cho tới 22 chồi giống nh u. Các nghi n c u tr n một số cây trồng khác cũng khẳng

nh giả thuy t vùng m phân sinh có nguồn gốc từ một t bào [34].

21

Sự phát sinh chồi bất nh trực ti p thư ng bắt ầu từ các t bào nhu m nằm ở

trong bi u bì (Broertjes và V n H rte, 1978) [33]. Từ một nghi n c u tái sinh chồi từ

th khảm củ lá cây Saintpaulia Norris và Smith (1981) k t luận rằng sự khởi tạo vùng

m phân sinh tr n ỉnh li n qu n tới sự k t hợp củ các t bào dưới lớp bi u bì [143].

Chồi tr n m i trư ng nu i cấy lá Nicotiana tabacum phát sinh trực ti p từ các t bào

m giậu th t lá qu nh rì lá (Attfield và Ev ns, 1991) [25]. Th khảm cũng thấy ở

nhiều ối tượng cây trồng tái sinh khác (Broertjes và V n H rte, 1978) càng ch ng tỏ

nguồn gốc bào củ sự phát sinh chồi [33].

Attfield và Ev ns (1991) cho thấy rằng trong các nghi n c u từ lá cây Nicotiana

tabacum, rễ bất nh hình thành trực ti p từ b bó mạch và các mạch củ nhu m [25].

Sự hình thành rễ bất nh này tương tự như sự khởi tạo rễ có nguồn gốc bào từ các

mẫu cấy chồi cây Pisum sativum, rễ ược phát sinh từ các t bào nhu m và các mô

mạch có trước ó (G h n và cộng sự, 1984) [67]. B n cạnh ó, nh ng bi u hi n tác

ộng trực ti p từ tr n nh ng t bào xuất phát từ m mạch và có th là IAA h y chất

iều hò sinh trưởng thực vật khác khu ch tán vào các t bào và khởi ộng cho quá

trình phân bố mạch và tạo rễ.

b. Tái sinh gián tiếp

Sự hình thành các khối m sẹo từ mẫu cấy b n ầu s u khoảng th i gi n nu i cấy

nhất nh hình thành các chồi bất nh. Các chồi này phát tri n từ ngoại vi m sẹo

và kh ng có qu n h b n ầu với các m có mạch dẫn củ mẫu cấy. Sự hình thành cơ

qu n như th ược gọi là quá trình tái sinh gián ti p. Sự phát sinh gián ti p các cơ

qu n bất nh cũng tương tự như sự phát sinh trực ti p, bắt ầu bằng sự phân chi

nh nh các t bào dẫn tới sự hình thành vùng phân sinh. Ti p theo là sự xuất hi n

các mầm chồi và cuối cùng là chồi (Torrey, 1966) [195]. Vì vậy, rất khó phân bi t h i

hình th c phát sinh cơ qu n này. Th ng thư ng, sự phát sinh cơ qu n gián ti p xảy

r , các m sẹo hình thành từ mẫu cấy phải ược cấy chuyền s ng m i trư ng ch chất

iều hò sinh trưởng thực vật thích hợp cho quá trình bi t hó m sẹo.

Đối với m c ích nhân giống in vitro, n u cây tái sinh trực ti p từ mẫu cấy b n

ầu thì kh ng nh ng nh nh chóng thu ược cây, mà các cây này cũng khá ồng nhất

về mặt di truyền. T bào m sẹo s u khi cấy chuyền nhiều lần s kh ng ổn nh về mặt

22

di truyền. Đ tránh tình trạng ó, nhất thi t phải sử d ng loại m sẹo vừ phát sinh, t c

là m sẹo sơ cấp tái sinh cây thì hy vọng s thu ược cây tái sinh ồng nhất.

1.3. Giới thiệu về phôi soma

1.3.1. Sự hình thành phôi soma

Phôi của thực vật không nh ng chỉ ược phát sinh từ t bào tr ng th phấn

mà nó còn có th ược tạo ra một cách tự nhiên hoặc nhân tạo từ nhiều loại t bào

khác nhau, bao gồm cả t bào sinh dưỡng. Tất cả các t bào sinh dưỡng của thực vật

ều có ch a toàn bộ thông tin di truyền cần thi t cho sự hình thành nên một cơ th

thực vật hoàn chỉnh với ầy ủ các ch c năng cần thi t. Nh ng t bào có khả năng

phát sinh ph i có ặc i m là nhân nằm ở v trí trung tâm, có nh ng ống siêu nhỏ nổi

bật ở gần nhân và nh ng sợi nhỏ actin.

Phôi soma có th ược bi t hó trực ti p từ mẫu cấy kh ng cần i qu trung gi n

gi i oạn m sẹo, hoặc gián ti p th ng qu gi i oạn tạo m sẹo (Willi ms và

Maheswaran, 1986) [217]. Sh rp và cộng sự (1980) là nh ng ngư i ầu ti n ư r

thuật ng IEDC (induced embryogenic determined cell) nhằm m tả nh ng t bào có

khả năng sinh ph i xuất phát b n ầu là nh ng t bào kh ng sinh ph i [161]. Nh ng t

bào củ ph i hợp tử có sẵn chương trình bi u hi n củ các gen sinh phôi thì ược gọi

là PEDC (pre˗embryogenic determined cell). Cả IEDC và PEDC ều có ch c năng

tương tự nh u là nhằm m c ích tái sinh. N u m cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự

kích thích phân chi t bào là ủ hình thành ph i và quá trình này ược gọi là sự

hình thành ph i som trực ti p. Ngược lại, n u m cấy là nh ng t bào phân hó

kh ng còn khả năng sinh ph i thì chúng cần trải qu nhiều lần phân chi t bào li n

ti p, dưới sự cảm ng củ uxin trong suốt quá trình ược tái lập trình i vào con

ư ng phát sinh ph i. Quá trình này ược gọi là quá trình phát sinh ph i gián ti p vì

phải th ng qu gi i oạn tạo m sẹo. Các m sẹo có khả năng phát sinh ph i b o gồm

các c m tiền ph i (PEM ˗ proembryogenic m ss). PEM là bước khởi ầu cho sự phát

sinh ph i som , s u ó là sự hình thành ph i som , ph i trưởng thành, ph i ở gi i oạn

mi n trạng và cuối cùng là gi i oạn tái sinh cây.

Sự chuy n ti p từ PEM s ng ph i có v i trò rất qu n trọng, là k t nối gi sự

tăng sinh củ PEM và sự phát tri n có tổ ch c của ph i. Auxin tổng hợp như 2,4˗D ặc

bi t hi u quả trong vi c thúc y sự thi t lập và tăng sinh nu i cấy ph i hơn các loại

23

uxin khác. Do ó, kích thích tăng trưởng củ ph i som cần chuy n chúng s ng

m i trư ng kh ng có uxin. Khi m i trư ng nu i cấy thi u uxin các gen ngăn chặn

ph i chuy n s ng gi i oạn hình tim s kh ng bi u hi n ược (Zimmerm n, 1993)

[222].

Sự phát sinh ph i là một gi i oạn ph c tạp trong ó sự sống sót và tăng trưởng

củ thực vật có nguồn gốc từ ph i ph thuộc vào các iều ki n nu i cấy trong các gi i

oạn ầu. Do ó, phát tri n kỹ thuật nhân giống số lượng lớn bằng ph i som phải

loại trừ các nhân tố có th ảnh hưởng xấu n bi u hi n ex vitro củ thực vật. Chỉ có

các ph i trưởng thành với hình thái bình thư ng có tích lũy ầy ủ các hợp chất dự tr

và vượt qu gi i oạn làm kh là phát tri n thành cây bình thư ng ược. Các ph i

som thư ng phát tri n thành các cây con nhỏ khi nu i cấy tr n m i trư ng kh ng có

chất iều hò sinh trưởng. Tuy nhi n, có trư ng hợp uxin và cytokinin thúc y sự

nảy mầm. Hơn n , cần có vài bi n ổi trong m i trư ng cơ bản thúc y nảy mầm.

vài loài phải th m vào các hợp chất như glut mine và c sein hydrolys te. Khi các

cây con ạt n kích thước phù hợp chúng s ược chuy n s ng nu i cấy ex vitro.

Trong một vài báo cáo cho thấy cây phát sinh từ ph i som tăng trưởng tương tự như

các cây từ hạt bình thư ng. Tuy nhi n, ở vài loài cũng xảy r vấn ề bi n ổi gen trong

quá trình nu i cấy.

 Nhân giống bằng phôi vô tính có các ƣu điểm chính sau:

- H số nhân giống c o do các m và t bào sinh dưỡng nu i cấy in vitro có th

tạo r ph i v tính một cách trực ti p hoặc th ng qu gi i oạn trung gi n là m sẹo.

T bào m sẹo có th phân chi theo cấp số nhân và khi phân hoá thành ph i v tính s

tạo r số lượng ph i v tính khổng lồ trong th i gi n ngắn. Ví d , ở cà ph ngư i t có

th tạo ược 600.000 ph i v tính từ 1 g sinh khối b n ầu trong vài tháng với tỷ l tái

sinh cây từ ph i v tính ạt 47% (Ducos và cộng sự, 1993) [52].

- Ph i v tính ch một lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ củ ph i

h u tính, có mầm chóp rễ và chồi ỉnh, do vậy có th nảy mầm trực ti p thành cây

(Ammirrato, 1983) [21].

- Phôi vô tính sau khi tạo hạt nhân tạo có th bảo quản và lưu gi dài hạn.

- Khả năng c ng nghi p hoá và tự ộng hoá quá trình nhân giống quy m lớn,

ặc bi t là nhân giống bằng biore ctor (T k y m và Akit , 1994) [188].

24

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi soma

1.3.2.1. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

a. Cytokinin

Sử d ng cytokinin ri ng l tạo ph i som từ hợp tử non cũng ạt ược

nh ng thành c ng tr n một số loài, b o gồm cả thực vật hạt kín và hạt trần. N u dự

tr n giả thuy t PEDC, sự hình thành ph i som từ ph i hợp tử non ược kích thích bởi

cytokinin. Vì hợp tử có ch các m quy t nh sự hình thành ph i, do ó kh ng cần

thi t phải thi t lập một ki u bi u hi n gen nào cả. Th y vào ó, t bào cần phải ược

cho phép phân chi mà kh ng b kìm h m bởi các t bào xung qu nh, trong trư ng hợp

này thì cytokinin óng v i trò áng k .

Halperin (1970) báo cáo rằng khi nu i cấy cà rốt, sự hi n di n củ BAP trong

m i trư ng tăng sinh có th thúc y sự phân chi t bào, nhưng nó làm c ch tiềm

năng phát sinh ph i [78]. Tuy nhi n, một số nghi n c u khác ghi nhận các

cytokinin làm tăng hi u quả phát sinh ph i. Cũng trong nu i cấy m Cà rốt, Fujimur

và Kom mine (1975) qu n sát thấy rằng trong khi BAP và kinetin c ch khả năng tạo

ph i, thì ze tin ở nồng ộ là 0,1 M thúc y quá trình này [64]. Sự phát sinh ph i cây

cà ph có th ược cảm ng khi có sự hi n di n củ một cytokinin. Các m i trư ng

cảm ng ở cỏ linh lăng có ch 5 M và 2,4˗D (22,6 ˗ 45,2 M). Nồng ộ tương ối

củ chất iều hò sinh trưởng trong m i trư ng cảm ng xác nh ki u bi t hó phát

sinh hình thái s u khi chuy n s ng m i trư ng kh ng có ch chất iều hò sinh

trưởng.

Đối với sự phát sinh ph i gián ti p, sự k t hợp cytokinin ở một hàm lượng thấp

với uxin ạt ược hi u quả sinh ph i, tuy nhi n chư thấy có nh ng nghi n c u

nào về cơ ch tác ộng củ cytokinin trong cảm ng sinh tạo ph i.

b. Auxin

Auxin là y u tố cần thi t cho sự phát tri n củ ph i, nó ảnh hưởng khác nh u

trong từng gi i oạn củ quá trình sinh ph i. Sự hi n di n củ uxin ri ng l h y uxin

k t hợp với một cytokinin là cần thi t cho sự thành lập các t bào h y nhóm các t bào

có khả năng sinh ph i, tuy nhi n uxin lại cản trở sự sinh ph i ở các ph ti p theo.

Nhu cầu về loại uxin cũng như nồng ộ uxin cho sự cảm ng ph i th y ổi tùy thuộc

vào ki u gen củ thực vật cũng như loại m sử d ng trong nu i cấy. Trong số các loại

25

auxin thì 2,4˗D và NAA ược sử d ng nhiều nhất, 2,4˗D chi m 50% và NAA chi m

25% trong các trư ng hợp phát sinh phôi [168].

Auxin ược hấp thu rất nh nh, do ó, chỉ s u vài ngày nu i cấy là m i trư ng

cạn ki t uxin. K t quả là n u kh ng ược th y m i trư ng mới m i tuần thì ph i

som s khởi ộng ng y sự phát tri n củ nó. Sự tái sinh thành cây con in vitro thông

qu sự phát sinh ph i som ở tất cả các loài ngũ cốc chính và các loại cỏ ược báo

cáo. Trong ó, phần lớn các chất iều hò sinh trưởng ược thử nghi m, 2,4˗D có

hi u quả nhất cho nu i cấy phát sinh ph i. Khởi ầu cảm ng sinh ph i tr n m i

trư ng có ch 1 ˗ 2,5 mg/l 2,4˗D và sự phát tri n củ ph i ạt ược khi nồng ộ

2,4˗D giảm xuống khoảng 5 ˗ 10% so với m i trư ng b n ầu [168].

Tầm qu n trọng củ uxin trong phát sinh ph i cũng ược thấy khi nu i cấy tạo

m sẹo củ Citrus sinensis. B n ầu, m sẹo củ C. Sinensis cần IAA và kinetin cho

sự phát tri n và bi t hó ph i. Khi cấy chuyền các m sẹo lặp lại nhiều lần cho thấy

một sự suy giảm dần dần tiềm năng phát sinh phôi và s u khoảng 2 năm, một số dòng

m xuất hi n phytohormone nội sinh. Nh ng m này khi nu i cấy trong m i trư ng có

sự hi n di n củ IAA ở nồng ộ thấp là 0,001 mg/l cũng làm c ch tạo ph i. Tất cả

nh ng qu n sát này cho thấy một m c ộ c o củ uxin nội sinh ch u trách nhi m cho

sự suy giảm trong tiềm năng phát sinh ph i củ m sẹo Citrus. Kéo dài th i gi n cấy

chuyền (từ 6 n 14 tuần) và thi u ư ng trong gi i oạn này cũng thúc y áng k

sự hình thành ph i từ m sẹo Citrus. Nh ng nghi n c u củ Fujimur và Kom mine

(1979) cho thấy một m c ộ tối thi u củ uxin nội sinh hoặc ngoại sinh là cần thi t

cho sự phát sinh ph i som in vitro [65].

Một trong nh ng nguy n nhân làm cho uxin có tác d ng áng k trong sự phát

sinh ph i là vì ngư i t cho rằng nó có ảnh hưởng l n sự bi u hi n củ gen, từ ó nó

làm xuất hi n nhiều th y ổi khi n t bào có th ược tái lập s ng trạng thái có th

sinh ph i. Có nhiều cách làm ngừng lại các ki u bi u hi n gen tại th i i m ó củ

m cấy th y th sự bi u hi n ó bằng một chương trình sinh ph i. Một trong nh ng

cơ ch có th cho phép làm ngưng các bi u hi n củ gen là methyl hó DNA, trong ó,

LoSchi vo và cộng sự (1989) phát hi n r rằng sự methyl hó DNA thực sự xảy

r khi có sự tồn tại một lượng uxin ngoại bào [114]. Ngoài r , uxin còn có v i trò

26

trong sự thành lập các t bào có khả năng sinh ph i là do chúng ảnh hưởng n tính

h u cực củ t bào và kích thích các phân chi kh ng cân x ng s u ó.

Smith và Krikori n (1989) nhận thấy rằng có một sự ki n xuất hi n trong suốt

quá trình cảm ng hình thành ph i som bằng uxin ó là tính nguy n vẹn củ m b

phá vỡ [173]. Điều này làm cho các t bào hoặc nhóm t bào b tách r i nh u r và phá

vỡ cầu li n bào. Sự tách r i củ các t bào có th là k t quả củ sự hoại tử củ các m

xung qu nh, sự tách r i t bào do uxin làm cho m sẹo trở n n xốp, dễ tách r i, thành

lập c llus h y lớp cutin. Nh ng t bào hoặc nhóm t bào tách r i nh u r s kh ng

ch u ảnh hưởng bởi các m xung qu nh. Tất cả nh ng iều này ều có th thúc y sự

phát sinh phôi soma.

1.3.2.2. Sự ảnh hưởng của polyamine và acid amine trong nuôi cấy mô thực vật

a. Polyamine

Poly mine là nh ng polyc tion phân tử nhỏ ược tìm thấy trong tất cả các cơ

qu n sống. thực vật, chúng ược m tả trong một chu i các quá trình sinh học b o

gồm sự sinh trưởng, phát tri n và nh ng phản ng ở trạng thái stress kh ng có sự sống

(Flores và cộng sự, 1989) [63]. Nh ng dạng chính củ poly mine là putrescine,

spermidine và spermine. H n hợp củ chúng cũng cần thi t trong thực vật, phản ng

với nh ng vi sinh vật cộng sinh qu n trọng trong dinh dưỡng củ thực vật. Các

polyc tion tự nhi n củ poly mine tại pH sinh lý là một trong nh ng bản chất chính

làm trung gi n cho hoạt ộng sinh học củ chúng. Thật r , chúng cũng có th gắn k t

một vài phân tử m ng i n tích âm như DNA, protein, màng phospholipide và protein,

polys cch ride peptide. Chúng cũng li n qu n n sự phosphoryl hó protein, sự cải

thi n s u quá trình phi n m và sự vận chuy n thích hợp củ DNA. Có dấu hi u trực

ti p cho thấy chúng cũng cần thi t cho sự sinh trưởng, phát tri n ở prok ryote và

euk ryote (Slocum, 1991) [172] và có v i trò trong quá trình iều hò sự sinh trưởng,

phát tri n thực vật ược thu hút trong nh ng thập kỷ vừ qu (Ev ns và Malmberg,

1989) [59]. PAs rất cần thi t cho sự phân bào và tăng sinh t bào trong các sinh vật và

li n qu n n quá trình tăng trưởng và phát tri n dạng b o gồm cả ch c năng củ

chất nhiễm sắc, tổng hợp protein, k t cấu nguy n vẹn củ nucleic cid và màng t bào

ộng lực học (H nd và M ttoo, 2010; Kus no và cộng sự, 2008; M tthews, 1993;

Theiss và cộng sự, 2002; Thom s và Thom s, 2001; W ll ce, 2009) [79], [104], [118],

27

[191], [193], [212]. Bằng ch ng dược lý th ng qu ng d ng ngoại sinh củ PAs và

phân tử xâm nhập vào th ng qu các nhiễu loạn củ các cấp PA nội sinh bằng phương

pháp chuy n gen gần ây ch ng minh v i trò qu n trọng củ PAs ối với sự nảy

mầm củ hạt, m hoá g , phát sinh cơ qu n, r ho , th phấn, tạo thành ph i, phát tri n

cây ăn quả, chín, r ng, l o hó và phản ng củ stress (Alc z r và cộng sự, 2005;

Gomez-Jimenez và cộng sự, 2010; Im i và cộng sự, 2004; Kus no và cộng sự, 2008;

M ttoo và cộng sự, 2007; Minoch và cộng sự, 2014; N mbees n và cộng sự, 2008;

Takahashi và Kakehi, 2010; Tisi và cộng sự, 2011; Ur no và cộng sự, 2005) [18], [71],

[87], [104], [119], [123], [134], [187], [194], [204]. Tuy nhi n, mặc dù có v số các

hi u ng củ PAs xác nhận trong nhiều sinh vật b o gồm các loại thực vật, các cơ ch

phân tử li n qu n vẫn chư ược hi u rõ (Torrigi ni và cộng sự, 2008) [196].

Bổ sung poly mine vào m i trư ng nu i cấy có hi u quả kích thích sự hình

thành phôi vô tính (Minocha, 1990) [124]. Một số nghi n c u cho thấy polyamine cần

thi t cho sự phát tri n củ phôi in vivo và in vitro (Altman và cộng sự, 1990; Mengoli

và Bagni, 1992) [19], [121]. N gl (1990) qu n sát thấy sự chuy n hó nh nh chóng

củ putrescine qu cuống no n củ Phaseolus [133]. Ph i tâm củ các giống xoài

ph i có ch poly mine, putrescine, spermidine và spermine c o hơn áng k so với

các giống ơn ph i (Litz và Schaffer, 1987) [113]. Tăng m c ộ poly mine nội sinh

(Montague và cộng sự, 1978) [127] và các enzyme sinh tổng hợp (Fienberg và cộng

sự, 1984) [61] ồng th i với sự cảm ng củ ph i soma trong cà rốt và ngăn cản sự

phát sinh ph i bằng vi c c ch sinh tổng hợp poly mine (Minocha và cộng sự, 1990;

Altm n và cộng sự, 1990) [19], [124].

Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng

Trong nh ng năm ầu ti n s u khi thăm dò PA trong t bào thực vật, một iều

áng chú ý về khả năng thúc y sự sinh trưởng ở thực vật củ các PAs trong các gi i

oạn phát tri n. Nh ng tác ộng củ PA ngoại sinh và nội sinh ược nhận thấy rõ ở

cấp ộ thực vật là tương ồng và kh ng ch u ảnh hưởng bởi tác ộng củ

phytohormone. Điều áng chú ý là sự tương tác gián ti p h y trực ti p gi PA và các

phytohormone cảm ng sự phát tri n. Vì vậy, trong một vài loài thực vật, uxin,

gibberellin và cytokinin kích thích sự sinh tổng hợp và gi tăng hàm lượng PA, trong

khi ó PA ngoại sinh tác ộng n các phytohormone nội sinh. Một d li u ầu ti n

28

li n qu n n tác ộng củ uxin n hàm lượng Spd và Spm trong thực vật ược qu n

sát ở loài Helianthus tuberorus s u khi cảm ng IAA giải phóng nh ng chồi ngủ củ

chúng. Đối với Arabidopsis, nó cho thấy IAA cảm ng gen ACL5 m hoá tổng hợp

Spm nhưng ABA h y cid gibberelic có th kh ng cảm ng gen này. Sự kh ng hoạt

ộng củ gen này làm chậm sự kéo dài thân và c ch quá trình phân chi t bào.

Theo như hoạt ộng sinh hó củ chúng, PA có th phân chi thành 2 nhóm: Put

và C t kích thích sự phân chi t bào và hình thành rễ như nh ng uxin và gibberellin,

trong khi ó Spd và Spm iều hò sự phân chi t bào, hình thành các cơ qu n và

nhiễm sắc th như nh ng cytokinin.

Đó là sự thành lập chính xác, ở nh ng nồng ộ PA c o thư ng có mặt trong hoạt

ộng củ các m sinh trưởng thực vật và trong gi i oạn sớm củ sự phát sinh ph i

sinh dưỡng. Trong nu i cấy t bào cà rốt, nó ược bi n nạp với gen ODC cDNA và

nồng ộ Put ược gi tăng trong kh ng bào. Điều này cho phép ược ư vào sử d ng

như hoạt ộng củ uxin ở gi i oạn sớm củ sự phát sinh ph i trong t bào sinh

dưỡng cà rốt.

Sự th y ổi trong tr o ổi PA ở gi i oạn phát sinh ph i sinh dưỡng ược nghi n

c u trong nhiều h thống khác nh u ở thực vật. Vì vậy, nh ng nghi n c u gần ây cho

thấy sự phân tích toàn di n hàm lượng PA, hoạt ộng củ nh ng enzyme tổng hợp n n

chúng, sự bi u hi n củ gen iều hò phi n m ược bi u diễn ở nh ng gi i oạn khác

nh u củ sự phát sinh ph i sinh dưỡng ở Vitis vinifera: hình tim, hình cá uối, ph i

trưởng thành và tái sinh cây. Hoạt ộng củ ODC vượt quá ADC. Sự bi u hi n củ gen

ODC và SAMDC có li n qu n n hoạt ộng củ nh ng enzyme tương ng với nh ng

nồng ộ củ Put và Spd ở gi i oạn sớm củ sự phát sinh ph i. Mối qu n h kh ng có

mặt gi hàm lượng PA tự do, hoạt ộng củ enzyme sinh tổng hợp và cấp ộ bi u

hi n gen ở gi i oạn s u củ sự phát sinh ph i và tái sinh cây có th m ng lại k t quả

từ vi c cắt từ h thống iều hò t bào.

Spermidine

Spermidine là một polyc tion phổ bi n ược tổng hợp từ putrescine và ược xem

như là một tiền chất củ spermine. Putrescine, spermidine và spermine ều là

poly mine th m gi trong nhiều các phản ng sinh học. Sự tổng hợp spermidine làm

29

chất c ch methylglyox l bis˗gu nylhydr zone (MGBG) và dicyclohexylammordum

sulf te (DCHA) là 2 chất làm giảm quá trình tăng trưởng và hình thành ph i trong quá

trình nu i cấy cây cà rốt ho ng dại. Hàm lượng poly mine trong t bào cũng b ảnh

hưởng bởi các chất c ch này, khi bổ sung vào m i trư ng DCHA làm giảm hàm

lượng spermidine. Tương tự, MGBG c ch sự phát sinh cơ qu n củ chồi ược nu i

cấy từ tr dưới lá mầm củ cây dương. Nh ng k t quả này cho thấy rằng các

poly mine, ặc bi t là spermidine óng một v i trò qu n trọng trong sự tăng trưởng và

phát tri n củ thực vật.

Khi bổ sung putrescine vào m i trư ng nu i cấy, hàm lượng spermidine nội bào

tăng c o hơn cả lượng putrescine, iều này cho thấy spermidine có th là nhân tố ch u

trách nhi m ph c hồi quá trình hình thành ph i. M i trư ng nu i cấy có bổ sung

spermidine vào th i i m 0 dẫn n vi c hàm lượng spermidine tăng trong t bào

[164], [187].

Quá trình làm giảm nồng ộ spermidine khi xử lý với MGBG ược ch ng

minh trong hạt lú mạch nảy mầm. Quá trình tăng trưởng và phát tri n củ cây r u

Di p xoăn cũng b giảm khi bổ sung MGBG (Ser fini-Fr c ssini,1984) [160]. Nồng ộ

spermidine trong t bào Cà rốt ho ng d cũng ược b ảnh hưởng bởi các chất c

ch , khi bổ sung spermidine vào m i trư ng làm tăng hàm lượng poly mine trong t

bào. Cũng có iều áng chú ý là hàm lượng putrescine trong t bào c o khi ược xử lý

bởi DCHA, nhưng dư ng như nó chỉ óng v i trò như một “chất nền” cho sự sinh tổng

hợp spermidine. Chất c ch này cũng làm giảm áng k sự phát tri n và tạo ph i nu i

cấy cây Cà rốt ho ng dại, iều này cho thấy spermidine óng một v i trò qu n trọng

trong quá trình này. Một nghi n c u khác gần ây cũng chỉ r rằng DCHA làm giảm

nồng ộ củ poly mine và quá trình tạo ph i trong nu i cấy cà rốt (Sung và cộng sự,

2002) [184]. Quá trình tạo ph i ược ph c hồi trong m i trư ng có DCHA khi bổ

sung spermidine vào m i trư ng nu i cấy.

Tầm qu n trọng về mặt sinh lý học củ spermidine trong thực vật ược ghi

nhận trong nghi n c u về quá trình l o hó củ cây y n mạch (K ur˗S whney và cộng

sự, 1982) [95]. V i trò củ spermidine trong sự phát tri n củ thực vật cũng ược

ch ng minh trong các dòng t bào thuốc lá kháng MGBG, trong ó có nồng ộ củ

spermidine (M lmberg và McIndoo, 1983) [116]. Sự phát tri n bất thư ng củ ho

30

trong mẫu cấy này cũng ược tìm thấy. Các nghi n c u trước ó cho thấy

spermidine ri ng l có th kh i ph c lại quá trình tạo ph i trong m i trư ng có bổ sung

DFMA và s u khi bổ sung putrescine vào m i trư ng (ở nồng ộ có th ph c hồi quá

trình tạo ph i) nồng ộ spermidine s ti n gần n nồng ộ thích hợp tạo ph i hơn

nồng ộ putrescine (Feirer và cộng sự, 1985) [60].

b. Acid amine

Các nitơ h u cơ b o gồm các cid mine và các mit ược dùng nhiều trong nu i

cấy ph i. Glut mine và sp r gine có tác d ng kích thích phát tri n ph i Datura và

nhiều loài thực vật khác, nhưng glut mine có hi u quả rõ r t hơn. Nh ng h n hợp h u

cơ kh ng xác nh như c sein (CH), nước dừ cũng có ảnh hưởng tốt ối với sự hình

thành ph i, do chúng ch nhiều thành phần khoáng, các cid mine. Sự phát sinh

ph i xảy r trong nu i cấy t bào trần tr dưới lá mầm cây Brassica naplus và

Brassica nigra. Các m sẹo hình thành từ tr dưới lá mầm s u h i tuần nu i tr n m i

trư ng MS có bổ sung 2,4˗D và 10% CW ược chuy n s ng m i trư ng kh ng ch

chất kích thích sinh trưởng hình thành ph i. Theo Ch tteerjee và cộng sự (1985),

Kr nz (1988), phát sinh ph i v tính trực ti p và tái sinh cây con có th xảy r trong

nu i cấy t bào trần Brassica juncea và B. naplus [35], [100].

Proline ri ng l h y k t hợp với các cid mine khác ược bi t là có tác d ng

kích thích sự phát sinh ph i v tính ở thực vật. Proline k t hợp với serine kích thích sự

phát sinh ph i v tính ở nh ng cây cỏ non (Trigi nno và Conger, 1987) [203]. Proline

ri ng l kích thích sự phát sinh phôi vô tính in vitro ở cây cà rốt (NutiRonchi và cộng

sự, 1984) [141]. Proline và glut mine kích thích sự cảm ng tạo m sẹo ở các loại thân

thảo Agrostis alba (Shetty và As no, 1991) [164]. Ngoài r nh ng chất tương tự

proline, thioproline ược sử d ng bảo v các dòng t bào phát sinh ph i từ nh ng

hạt ri ng l kh ng ồng nhất về mặt di truyền củ Agrostis Alba (Shetty và Asano,

1991) [164]. Proline cũng ược sử d ng kích thích cytokinin  cảm ng sự phát

sinh chồi in vitro ở dư g ng và dư leo, uxin  cảm ng phát sinh ph i v tính ở cỏ

linh lăng (Shetty và McKersie, 1993) [165]. Proline, nh ng chất tương tự proline và

nh ng tiền chất củ proline, ornithine ược sử d ng có hi u quả trong vi c kích thích

cytokinine  cảm ng sự phát sinh chồi ở dư g ng. Quá trình phát sinh chồi in vitro

cũng ược kích thích khi sử d ng d ch thuỷ phân protein củ cá giàu cid glut mic và

31

proline k t hợp với các hợp chất tương tự proline. Điều này ch ng minh rằng trong các

nghi n c u về sự nhân chồi ở dư g ng có li n qu n n vi c tăng hàm lượng proline

trong các m bi t hoá.

Sinh tổng hợp proline là một áp ng stress phổ bi n ở thực vật, ặc bi t là

nh ng stress nước ngọt và nước mặn (T ylor, 1996) [189]. Acid mine này tích luỹ

trong nh ng thực vật ư mặn, dưới nh ng stress nước, phấn ho kh , nu i cấy t bào

thực vật dưới dạng stress nước, stress muối, khi thực vật già, trong nh ng áp ng với

cid bscisic, với nh ng chất tương tự proline, sự khử nước. Proline ược ề ngh có

tác d ng bảo v màng t bào và các protein khi gặp các stress khác nh u ược ề cập ở

tr n. Proline cũng có th hoạt ộng như một chất chống oxy hoá th ng qu hoạt ộng

thấm lọc ở rễ.

Ngoài khả năng chống ch u với stress thì proline cũng có v i trò khác trong cơ

th thực vật. Sinh tổng hợp proline ược thúc y khi thực vật trở n n già. Ngoài r ,

nó cũng ược cho là có li n qu n n vi c chuy n ổi năng lượng và iều khi n sinh

tổng hợp purine trong nốt rễ cố nh ạm ở cây ậu tương. Nó gắn liền với sự phát

tri n  gắn liền với sự hình thành rễ trong iều ki n kh hạn và nh ng áp ng sinh

nhi t trong phát ho ở Voodoo Lily (Skub tz và c ng sự, 1989) [170]. Nó cũng gắn

liền với các iều ki n phát tri n bình thư ng. Tỷ l về hàm lượng proline tự do và li n

k t c o trong quá trình phát tri n sớm ở cây ậu, s u ó giảm xuống ở gi i oạn s u

thành th c (Venek mp và Koot, 1984) [208]. Hàm lượng proline c o kh ng phải do

k t quả củ stress nước. Điều này có th do proline tự do có một ch c năng ặc trưng

trong quá trình phát tri n sớm (Venek mp và Koot, 1984) [208]. Nh ng nghi n c u

trước ây ở cây ậu tương (Singh và Gupt , 1983) [169] chỉ r rằng sự tích luỹ

proline kh ng gắn liền với stress nước. Một ch c năng củ proline trong sự r ho

cũng ược ề ngh .

Một v i trò khác củ proline trong nh ng áp ng stress ˗ cảm ng sự tổng hợp

phenol cũng ược ề ngh (Shetty, 1997) [163]. Nh ng khái ni m này dự vào v i trò

củ proline và pyproline ˗ 5 ˗ c rboxyl se (P5C) trong vi c iều khi n quá trình oxy

hoá khử và ion hydro ˗ gián ti p kích thích con ư ng pentose phosph te, mà nó lần

lượt iều khi n quá trình ồng hoá proline trong t bào ộng vật. Trong m hình này, sự kích thích sinh tổng hợp proline iều khi n tỷ l NADP+/NADPH2 và ư ng

32

phosph te (mà nó cần thi t cho quá trình ồng hoá purine) th ng qu sự kích thích

NADPH2 ˗ ược tạo r từng bước trong con ư ng pentose phosph te. Ngoài r , nó ề

ngh rằng quá trình d hoá củ proline xảy r nh nh khi nh ng áp ng stress ược

ph c hồi, có th tạo r các ương lượng oxy hoá khử trong phosphoryl hoá oxy hoá ở

ty th , cho n n nó là một quá trình khác tổng hợp n n ATP (Shetty, 1997) [163].

1.4. Biến dị tế bào soma trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.4.1. Khái niệm

B n ầu nu i cấy m ược sử d ng làm kỹ thuật mới tạo sinh khối và phương

pháp nhân giống lý tưởng sản xuất hàng loạt cây ồng nhất và giống với bố mẹ b n

ầu củ các giống ưu tú. Tuy nhi n, với th i gi n các c ng trình nghi n c u ở nhiều loài

cây trồng có giá tr kinh t ngư i t thấy rằng t bào và m ược nu i cấy trong m i

trư ng nhân tạo thư ng xuất hi n các bi n ổi di truyền b o gồm số lượng và cấu trúc

nhiễm sắc th , sự sắp x p lại trong nhiễm sắc th , ột bi n gen. Các bi n d này ược

truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các bi n d di truyền hình thành do quá trình nu i

cấy ược gọi là bi n d dòng som (somaclonal variation) (Bornmann CH, 1993) [28].

Bi n d dòng som ch u ảnh hưởng bởi loài cây, ki u gen trong loài và m cấy,

ch ộ nu i cấy, th i gi n nu i cấy in vitro và tính ổn nh củ genome. Như vậy, bản

thân nu i cấy m và t bào là một nguồn bi n d di truyền qu n trọng, mới m và

phong phú trong các iều ki n thích ng và rất có ích cho sự cải thi n giống cây

trồng. Một số th bi n d dòng som có ích ược phân lập, ó là khả năng ề kháng

virus Fiji, b nh ốm vàng viền nâu và b nh sương m i ở mí (Hil e và Te-chato,

2005) [84]; khả năng kháng b nh ốm lá nhỏ ở ng (Bretell và Ingr m, 1979) [30];

kháng sương m i ở kho i tây (Shep rd và cộng sự, 1980) [162]; ch u hạn và ch u lạnh

ở lú (L Trần Bình và cộng sự, 1996) [2].

Nguyên nhân gây bi n d dòng som ược chi thành b nhóm: sinh lý, di

truyền, hó sinh. H i nguyên nhân chính gây bi n d dòng som là do tính kh ng ồng

nhất di truyền củ các t bào som củ mẫu cấy b n ầu và tác ộng củ các y u tố

trong quá trình nu i cấy in vitro.

1.4.1.1. Biến dị kiểu hình

Các bi n d ki u hình thư ng li n qu n n sự th y ổi trong quá trình th hi n

củ một gen nhất nh. Các bi n d ki u hình thư ng xuy n xuất hi n ở các cây tái sinh

33

s u nu i cấy như là k t quả củ các phản hồi về mặt sinh lý. Các th y ổi về ki u hình

có th tạm th i, kh ng có tính di truyền và có th ph c hồi trạng thái b n ầu. Tuy

nhi n, chúng có th duy trì bi n d ó trong suốt chu kỳ sống củ các cây tái sinh.

Nguy n nhân li n qu n n một vài th y ổi trong quá trình bi u hi n gen [31].

1.4.1.2. Biến dị kiểu gen

Bi n d ki u gen là các bi n d có khả năng di truyền, xảy r với tỷ l rất thấp và

kh ng có tính thuận ngh ch. B o gồm b loại:

Đột biến hệ gen: là các bi n ổi về số lượng nhiễm sắc th . Loại phổ bi n là sự

s i khác về số lượng nhiễm sắc th như bội, d bội, h y th khảm. Các loài có ộ

bội th c o và nhiều về số lượng nhiễm sắc th c o dễ b bi n ổi hơn các loài có m c

ộ bội th thấp và ít nhiễm sắc th (Creissen and Karp,1985) [42]. Bi n ổi này xảy r

thư ng xuy n trong nu i cấy t bào, ặc bi t trong nu i cấy t bào trần. Nh ng bi n

ổi này có th xảy r ng y từ gi i oạn ầu củ quá trình nu i cấy, do sự phân tách

nhiễm sắc th kh ng bình thư ng ở nh ng chu kỳ t bào ầu ti n.

Đột biến nhiễm sắc thể: là các bi n ổi về cấu trúc NST, các th y ổi này có th

b o gồm các hi n tượng như: mất oạn, ảo oạn, th m oạn h y nhân oạn (tạo r

các NST lớn hơn), chuy n oạn và các bi n ổi trong quá trình giảm phân. Nh ng bi n

ổi này có th ảnh hưởng tới ki u hình ở Ro và các th h ti p theo [42].

Đột biến gen: là các bi n ổi ở m c ộ phân tử: sự th y ổi củ một cặp b se,

th y ổi về số lượng bản s o củ một trình tự ặc thù, sự th y ổi trong th hi n củ

các nhóm gen h y sự th hi n củ các gen nhảy (Tr nspos ble elements). Sự xuất

hi n các ột bi n này về cơ bản m ng tính ngẫu nhi n. Nh ng tính trạng ột bi n thu

ược ở nh ng cây tái sinh Ro cũng ược di truyền cho các i s u [42].

1.4.2. Đặc tính của tế bào thực vật được nuôi cấy

Sự ổn nh củ các dòng t bào ược nu i cấy là sự th hi n tốc ộ sinh trưởng

và sinh tổng hợp các hợp chất th cấp có giá tr kinh t , ặc bi t nhất là ng d ng kỹ

thuật nu i cấy t bào trên quy m c ng nghi p. Bi n d di truyền củ t bào nu i cấy là

cơ sở thu nhận nh ng th bi n d som có nh ng ặc tính quí. Sự ổn nh là y u cầu

cần thi t cho vi c vi nhân giống các dòng t bào và chọn lọc ổn nh trong tạo giống.

Một vấn ề khác ược ề cập tới trong nghi n c u về nu i cấy t bào Catharanthus là

34

tính kh ng ổn nh củ các dòng t bào ối với vi c tạo sản ph m th cấp. Một vài

dòng mất khả năng tạo lk loid ng y trong th i gi n bảo quản chúng [43]

Vì th , hi n tượng giảm năng suất kh ng th hoàn toàn loại trừ. Khó khăn ngày

càng trở n n lớn hơn khi ư quy m sản xuất l n dạng c ng nghi p. Như vậy trước

h t là phải ti n hành chọn lọc nh ng dòng t bào tỏ r tương ối ổn nh và ti n hành

nghi n c u cơ ch và nguy n nhân dẫn n tính bất ổn nh. Hi n n y, ngư i t cần

tuân theo quy trình ược ng d ng trong ngành vi sinh vật học nhằm thu ược nh ng

dòng t bào có năng suất ổn nh trong tất cả các gi i oạn nu i cấy ồng th i tránh

mất hoàn toàn nh ng dòng sản xuất này. Một số nghi n c u cho thấy có nh ng dòng t

bào chuy n tạo r sắc tố có tính ổn nh. Đây là một trong các y u tố qu n trọng ảnh

hưởng n năng suất. Th nhưng, xét về nghi n c u di truyền cho n n y thì chỉ mới

có một c ng trình duy nhất phân tích số lượng nhiễm sắc th củ dòng t bào tạo nhiều

c roten và dòng kh ng tạo c roten củ cây Daucus carota và tác giả kh ng tìm thấy sự

s i khác gi h i dòng này. Sự ổn nh năng suất ở ây có th do quá trình cấy chuy n,

ngư i t chỉ cấy chuy n nh ng khối m sẹo có màu sắc ậm nhất, mặc dù vi c làm ó

hoàn toàn v ý th c. Ngoài r , ngư i t s còn phát tri n kỹ thuật bảo quản ng lạnh

ạt tới trình ộ cho phép tránh hoàn toàn sự xuất hi n nh ng th y ổi do chính kỹ

thuật ng lạnh gây r . Phương pháp bảo quản bằng cách giảm phân chi t bào trong nu i cấy ở nhi t ộ 0°C là phương pháp có hi u quả.

Vi c tái thi t ược năng suất củ dòng t bào Catharanthus n u ở tr n có th

ược giải thích bằng hi n tượng tái bi n. Song toàn bộ vấn ề mất i và tái thi t năng

suất s ược giải thích n u nh ng dòng t bào ược nghi n c u là dòng epigenetic ch

kh ng phải là nh ng dòng genetic. Sự thật rằng t bào thực vật nu i cấy m ng nhiều

ặc i m kh ng di truyền ược bi t khá kỹ. Một số ít trư ng hợp ngư i t ch ng

minh ược rằng nh ng th y ổi củ dòng t bào là do nh ng ột bi n c th trong

genome và pl stome, hoặc ngư i t ch ng minh ược có nh ng sản ph m gen th y

ổi, ví d như enzyme th y ổi ược tạo r . Như vậy, vi c sử d ng nh ng dòng t bào

epigenetic hoặc kh ng di truyền làm ph c tạp hó m c ti u sản xuất các hợp chất th

cấp bằng nu i cấy t bào. Vi c chọn ược dòng t bào kh ng m ng nh ng th y ổi

kh ng di truyền rất khó vì muốn ch ng minh iều ó phải tái sinh cây hoàn chỉnh từ

35

nh ng dòng t bào này và s u ó ti n hành ki m tr nu i cấy m từ hạt hoặc cây thu

ược từ nh ng cây hoàn chỉnh ó.

Loại t bào chính dùng trong nu i cấy là nh ng t bào m sẹo, là k t quả củ

nh ng t bào som phản bi t hó và nh ng t bào l i h u tính. Tính dạng củ

nh ng dòng t bào là sự thuận lợi cho các nghi n c u sinh học. Nh ng m sẹo ầu

ti n, hình thành qu sự phân chi nh ng t bào ở m thư ng kh ng ồng nhất. Nh ng

t bào m nu i cấy khác nh u là nguy n nhân dẫn n sự kh ng ồng nhất củ t bào

m sẹo tiền khởi.

Sự phân bào nguy n nhiễm bất thư ng trong suốt quá trình phát sinh và duy trì

phát sinh dẫn n sự hình thành nh ng t bào bội, l ch bội và tái sắp x p lại nhiễm

sắc th . Tốc ộ sinh trưởng trong iều ki n nu i cấy thích hợp ược dùng cho vi c

chọn lọc nh nh chóng nh ng t bào kh ng i vào gi i oạn bi t hó ; m sẹo kh ng

ồng nhất tiền khởi chuy n hó thành t bào m sẹo chặc và s u ó chuy n hó thành

t bào m sẹo xốp, cả h i loại t bào này kh ng có cấu trúc m học.

Thành phần dinh dưỡng củ m i trư ng nu i cấy và hormone xác nh ặc tính

sinh lí và phát sinh t bào bi u sinh (epigenetic) củ nh ng t bào ph thuộc vào

nh ng phần khác nh u củ m sẹo. Ki u di truyền củ một loại thực vật ch u ảnh

hưởng bởi các quá trình bi n ổi xác nh cấu trúc và tốc ộ sinh trưởng củ m sẹo.

Đ có sự phân bào ở t bào ơn, cần phải sử d ng m i trư ng giàu dinh dưỡng

h y m i trư ng iều ki n bằng cách nu i cấy chung với m dinh dưỡng h y một lớp

m cung cấp dinh dưỡng.

Mật ộ t bào ơn c o và sự giảm th tích m i trư ng thúc y t bào chuy n qu

phân chi , ây là nh ng iều ki n nh trước phát sinh phân bào ở nh ng t bào

kh ng có khả năng phân chi .

Nu i cấy t bào thực vật bậc c o có tính h i mặt trong di truyền:

 Nó m ng tính sở h u th ng tin di truyền cần thi t th hi n ở m c ộ t bào.

Th ng tin di truyền này ược thực hi n tr n ch c năng củ t bào.

 T bào nu i cấy vẫn duy trì th ng tin bổ sung, xác nh khả năng sản xuất các

cơ chất.

Nguy n nhân gây ch t trong quần th t bào in vitro có th ược phân chi theo

các ki u s u ây:

36

 Có sự ch t củ t bào ở tất cả các gi i oạn trong chu kì t bào.

 Sự ch t xuất hi n ở một gi i oạn giảm dần trong nu i cấy do giới hạn dưỡng

chất h y sự c ch củ các sản ph m ộc tố trong quá trình tr o ổi chất.

 Sự ch t th hi n trước khi t bào phân chi .

1.4.3. Nguồn gốc của các biến dị tế bào soma

1.4.3.1. Những thay đổi di truyền xảy ra trước khi nuôi cấy in vitro

Trong quá trình phát tri n cá th , phân hoá và già hoá củ m và t bào, một số các

th y ổi di truyền xảy r và ược tích luỹ trong các t bào som (D' m to, 1985)

[46]. Nh kỹ thuật nu i cấy m , cây ược tái sinh từ t bào som s có các ột bi n. Các

nhà kho học ư r khái ni m utomut genesis ˗ tự ột bi n ( ột bi n xảy r kh ng do

các tác nhân từ b n ngoài gây n n mà là ột bi n tự nó ˗ utomut genesis). Vries (1901)

˗ ngư i khởi xướng học thuy t về ột bi n cho rằng cây b ột bi n do ược tái sinh từ

hạt già (có nhiều ột bi n tiềm n từ trước trong hạt già) [211]. B mươi năm s u,

N w cin ch ng minh ột bi n ở hạt già là do các chất th m gi quá trình tr o ổi chất và

các sản ph m cặn b có trong hạt gây n n. Các chất này có th là: hợp chất ch lưu

huỳnh, mino cid, ldehyde, lk loide, phenol, quinone, cid nucleic và các sản ph m

khác. Nguyên nhân gây ột bi n có th do cấu trúc bình thư ng củ hạt và t bào b phá

vỡ ˗ các enzyme ti p xúc với các chất và tạo r sản ph m ột bi n.

Tuỳ theo phương th c nu i cấy t bào som , ngư i t phân bi t các loại bi n d

dưới ây:

- Bi n d dòng t bào m sẹo (c llusoclon l v ri tion): khi cây bi n d tái sinh từ

m sẹo (c llus).

- Bi n d dòng t bào trần (protoclon l v ri tion): khi cây bi n d tái sinh từ t

bào trần.

Ngoài r , Ev ns và cộng sự (1984) còn ư r khái ni m "bi n d gi o tử"

(gameto-clon l V ri tion) khi cây ược tái sinh từ các t bào sinh d c (g mete) [57].

Nh ng bi n d di truyền xảy r và ược phát hi n trong quá trình nu i cấy in vitro gọi

chung là ột bi n t bào dòng.

1.4.3.2. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro

Nguồn bi n d t bào som qu n trọng là sự th y ổi trong bộ máy di truyền xảy

r khi nu i cấy tạo m sẹo và phân hoá cơ qu n in vitro. Chroqui và Bercetch (1985)

37

cho bi t uxin gây r bội hoá b n trong t bào nu i cấy (endopolyploidiz tion).

Oono (1982) nu i cấy m sẹo từ hạt lú và tái sinh cây từ m sẹo cho bi t BAP có

nồng ộ 30 mg/l tạo r tần số ột bi n lớn gấp 50 lần so với BAP ở nồng ộ 2 mg/l

[145]. M c ộ ột bi n t bào som lớn n m c tần số ột bi n do các chất ột bi n

gây r cũng kh ng c o hơn (L rkin và Scowcroff, 1981) [107].

Orton (1984) cho bi t trong th i gi n nu i cấy tr n m i trư ng dinh dưỡng, h gen

củ các t bào thực vật trải qu quá trình cải tổ nh nh chóng và phát hi n nh ng

-2

-1

th y ổi số lượng, cấu trúc nhiễm sắc th , ột bi n gen [146]. Tần số ột bi n gen nhiều

khi rất c o (10 ˗10 ) tính theo locus tr n cây. Th y ổi di truyền phổ bi n nhất xảy r

trong t bào nu i cấy là bội th . S u khi m ược nu i cấy, nhân t bào có th trải

qu quá trình nội phân (endoreduplic tion) làm số lượng nhiễm sắc th trong t bào tăng

l n gấp i hoặc hơn n nhưng kh ng xảy r phân chi t bào. K t quả số lượng nhiễm

sắc th củ t bào tăng l n. Quá trình nội phân củ nhiễm sắc th trước khi phân bào

cho phép ngư i t nhận ược cây lưỡng bội ồng hợp tử (dih ploid) từ hạt phấn ơn bội

trong nu i cấy b o phấn. Phổ rộng các bi n ổi nhiễm sắc th ược qu n sát thấy ở

nhiều loài cây trồng khác nh u (Mur shige và N k no, 1967; S crist n và Melchers,

1960; Sunderland 1973; Nishi và Mitsuoka, 1969) [130], [138], [154], [183]. Nghiên

c u t bào học cho thấy 10% số loài phân hoá cơ qu n kh ng kèm theo hi n tượng nội

phân nhiễm sắc th , 90% số loài phân hoá cơ qu n có kèm theo nội phân nhiễm sắc th .

Đột bi n t bào som xảy r ở các gen trong t bào chất ược ch ng minh

bằng phương pháp tách ADN ty th và l c lạp nh enzyme cắt (Kemble và cộng sự,

1984) [96]. Đột bi n t bào som ng d ng vào chọn giống hi u quả ở nhiều cây

trồng như mí , kho i tây, cà chu , thuốc lá, lú và lú mì. Petuni nhận ược

giống mới gọi là Velevetrose, giống mí Q47 (L rkin nd Scrowroft, 1981) [107].

1.5. Sử dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá biến dị tế bào soma thực vật

1.5.1. Khái niệm chung

Chỉ th di truyền là “bi n chỉ dẫn” h y “ i m mốc” tr n DNA củ nhiễm sắc th .

Chỉ th di truyền có th ược sử d ng như c ng c nhận bi t giúp cho các nhà chọn

giống và di truyền học ánh giá di truyền giống cây hoặc xác nh ki u hình trong chọn

tạo giống. Chỉ th di truyền hoạt ộng như một ơn gen và di truyền thành 3 nhóm: (1)

Chỉ th hình thái, (2) Chỉ th sinh hó , và (3) Chỉ th DNA hoặc chỉ th phân tử.

38

Trong ó chỉ th DNA (chỉ th phân tử) là chỉ th ại di n cho các v trí c th tr n

nhiễm sắc th . Chỉ th phân tử có th bi u hi n cho gen hoặc locus gen. Ưu i m lớn

nhất củ chỉ th phân tử so với các loại chỉ th khác là số lượng chỉ th rất lớn. Do ó

chỉ th phân tử là loại chỉ th phổ bi n nhất. Hơn n , chỉ th phân tử kh ng ph thuộc

vào các gi i oạn phát tri n, kh ng ảnh hưởng bởi y u tố m i trư ng (Bùi Chí Bửu và

cộng sự, 1999) [4].

Chỉ th phân tử ược xem như các i m mốc trong h gen. Chúng t có th nhận bi t

th ng qu trình tự DNA di truyền từ th h này s ng th h khác. Chỉ th phân tử là cơ sở

nhận bi t các locus gen hay gen quy nh các tính trạng. Nh ó mà có th xác nh

ược toàn bộ h genome củ một cá th h y một giống. Th ng qu vi c xác nh h gen

giúp nhà tạo giống quy t h y chuy n locus gen/gen vào giống mới nh chỉ th phân tử. Đ n n y, số chỉ th phân tử rất lớn. Cây trồng có khoảng 108 ˗ 1010 nucleotide trong DNA

tổng số. Thậm chí, n u chỉ tính một s i khác rất nhỏ gi h i cá th dẫn n một số

lượng khổng lồ các chỉ th phân tử gi h i cá th ó. Các loại chỉ th phân tử phổ bi n

ược sử d ng gồm: hình ộ dài oạn cắt giới hạn (Restriction Fr gment Length

Polymorphism˗RFLP), hình trình tự ơn giản (Simple Sequence Repe tes˗SSR) và

hình ộ dài các nhân oạn (Amplified Fr gment Length Polymorphisms˗AFLP), hình

ơn nucleotide (Single nucleotide Polymorphisms˗SNP).

1.5.2. Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền học của cây cọc rào

1.5.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Theo Ambrosi và cộng sự, (2009) [20], cấu trúc bộ gen củ các giống phương

thu thập ược vẫn chư ược bi t nhiều và chương trình nhân giống chọn r nh ng

giống tri n vọng vẫn còn ít. Bộ gen cây cọc rào có kích thước tương ối nhỏ (2C =

0,85, tương ương khoảng 430Mbp) nằm tr n 11 chromosome với bộ nhiễm sắc th

lưỡng bội ( 2n = 2x = 22). Các nghi n c u về số lượng chromosome củ th t m và t

bội vẫn chư ược báo cáo. Độ bội th và cấu trúc củ quần th cây cọc rào

phương củ các nước như Ấn Độ, Srilanka, Brazil, Peru, Mexico, Nicaragua, Somalia,

Togo,… ược xác nh bằng FCSS (Flow Cytometric Seed Screen). Theo Lin và

cộng sự, (2010) [112], bộ gen củ cây cọc rào (210Mb) ược xem như nhỏ nhất trong

giới thực vật. Các nhà nghi n c u thi t lập bản ồ li n k t di truyền củ th h cọc

rào ầu ti n ch 2 quần th l i ngược với 93 dòng con l i. Tổng số 605 m rker ược

39

sử d ng và xây dựng n n bản ồ di truyền thành 11 nhóm li n k t gen ộc lập với

nh u (tương ương 11 cặp chromosome tương ồng củ cây trồng). Chiều dài tổng

cộng là 1880,3 cM, các m rker trung bình chi m 3,11 cM. Khoảng cách vật lí trung

bình tr n m i centimorg n qu n sát ược là 111,7 kb. Điều này cho thấy m c ộ tái tổ

hợp củ bộ gen cây cọc rào khá c o. Bản ồ này là bản ồ QTL vừ bi u hi n các tính

trạng n ng học qu n trọng trong ó có tính trạng về s c ch u hạn, vừ có th cung cấp

th ng tin về ti n hó trong bộ gen cây cọc rào.

H i mươi năm s u khi ược phát minh (1990 – 2010), kỹ thuật RAPD ược sử

d ng trong hàng ngàn nghi n c u về dạng di truyền củ rất nhiều loài tr n th giới.

Ri ng cây cọc rào có rất nhiều nghi n c u về ặc tính di truyền củ các loài thuộc

chi Jatropha và gi các giống cọc rào ở các phương khác nh u.

Năm 2008, G nesh cùng cộng sự sử d ng kỹ thuật RAPD nghi n c u mối

tương qu n di truyền gi 7 loài trong chi Jatropha và năm mẫu cọc rào trồng ở các

phương khác nh u [69].

Năm 2008, Ikb l cùng cộng sự sử d ng kỹ thuật RAPD phân tích tính dạng

di truyền củ 40 mẫu cọc rào thu thập từ nhiều phương khác nh u [86]. Gupt

phân tích sự dạng di truyền các ki u di truyền khác nh u củ cọc rào bằng kỹ thuật

ISSR và RAPD [76]. Subr m ny m cùng cộng sự sử d ng kỹ thuật RAPD ánh

giá sự dạng di truyền củ 10 mẫu cọc rào thu thập từ các vùng khí hậu, sinh thái

khác nh u củ Ấn Độ [181].

Năm 2009, Moh m d cùng cộng sự nghi n c u tính dạng di truyền củ

giống cọc rào tuy n chọn bằng kỹ thuật RAPD [126].

Dự vào k t quả nghi n c u, Kum r cùng cộng sự (2009) cho thấy có th sử

d ng RAPD-PCR như một c ng c ánh giá dạng di truyền và qu n h di truyền

gi các cây cọc rào nu i cấy m [101].

Vào năm 2011, Leel và cộng sự khi nghi n c u về hình thái, ặc i m lý hoá, vi

nhân giống cây cọc rào và phân tích RAPD. K t quả cho thấy kh ng có bi n d som

trong tất cả các dòng, phân tích RAPD xác nhận lại sự tương ồng di truyền và sự

tương ồng củ các bản s o tương ng với cây mẹ [109].

40

1.5.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam

Vi t N m, trong nh ng năm gần ây, các ng d ng trong lĩnh vực c ng ngh

sinh học thực vật khá phát tri n và cũng có nh ng nghi n c u về tính dạng di

truyền tr n một số ối tượng thực vật. Năm 2004, Nguyễn Th Th nh Bình cùng cộng

sự nghi n c u hình một số giống dâu tằm bằng kỹ thuật RAPD [2]. Năm 2007,

Văn Hồng Thi n khảo sát ặc i m di truyền và tinh dầu các quần th Tràm

(Melaleuca cajuputi) ở một số khu vực thuộc các tỉnh miền N m Vi t N m [13]. Năm

2009, Nguyễn Th Ngọc Tuy t nghi n c u tính dạng di truyền củ quần th th ng

ỏ (Taxus wallichiana zucc.) tại Lâm Đồng [16].

Đối với cây cọc rào, nh ng nghi n c u trước ây chủ y u tập trung vào các

iều ki n sinh thái, thổ nhưỡng, hình thái, năng suất, hàm lượng dầu củ các giống

thử nghi m… vẫn chư có nghi n c u nào về dạng di truyền. Chính vì vậy, trong

nh ng năm gần ây có một số khảo sát mối qu n h di truyền củ các cá th cọc rào

thu thập từ một số phương củ nước t và các cá th cọc rào nhập từ nước ngoài.

Đặc bi t th ng qu k t quả củ kỹ thuật RAPD có th tìm r m rker nhận di n một

số giống cọc rào củ một số phương.

Năm 2010, trong luận văn c o học củ Nguyễn Th Lài nghi n c u tính

dạng di truyền củ một số giống cây cọc rào ở Vi t N m bằng kỹ thuật RAPD k t

luận 9 cặp mồi: OPAB5, OPAB6, OPAK14, OPAL11, OPAL12, OPAW7, OPD14,

OPT17 và OPT18 cho k t quả các băng phân bi t rõ, sáng, ri ng bi t và ược chọn lọc

thực hi n RAPD - PCR [10].

Năm 2011, trong luận văn c o học củ Võ Th Hoài Cảm nghi n c u tính

dạng di truyền củ chín giống cây cọc rào nhập nội ở Vi t N m bằng kỹ thuật RAPD

k t luận có 10 cặp mồi cho sản ph m khu ch ại tr n tất cả các giống cọc rào nhập

nội: OPA05, OPA09, OPB 07, OPC18, OPD14, OPE20, OPF11, OPG02, OPN07,

OPR14 [5].

41

Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng ược sử d ng là giống cọc rào (Jatropha curcas L.) ược nhập từ Ấn

Độ trồng tại vư n ươm củ Vi n Sinh học Nhi t ới.

Giống Ấn Độ nhập nội ược khảo nghi m từ ề tài “Nghi n c u tuy n chọn

giống và c ng ngh trồng cây dầu mè Jatropha curcas L. sản xuất diesel sinh học

góp phần giảm thi u nhiễm m i trư ng thành phố” ược thực hi n do B n quản lý

Khu N ng nghi p c ng ngh c o thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007-2010.

Vật li u nghi n c u là lá non ex vitro, lớp mỏng lá, m sẹo, ph i, cây con phát

tri n từ ph i củ cây cọc rào tùy vào m i thí nghi m.

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất

2.1.2.1. Dụng cụ và thiết bị cơ bản trong nghiên cứu

 Thiết bị:

Tủ cấy v trùng S nyo, nồi hấp Hir y m dung tích 8 lít, máy o pH Presi

pH90, cân phân tích S rtorius ( ộ chính xác d=0,0001 g), kính hi n vi qu ng học, kính

hi n vi Nikon eclipse 80i, kính phóng ại s i nổi Nikon SMS 800, …

 Dụng cụ: kéo, kẹp, dao cấy, ĩ petri, èn cồn, ống ng, l men,…

 Hóa chất:

Một số hó chất sử d ng trong thí nghi m: Cồn 96º, 70º, j vel, g r, xà phòng,

các hó chất ph m i trư ng, các chất iều hò sinh trưởng thực vật, thuốc nhuộm t

bào,…

M i trư ng cơ bản ược sử d ng trong các thí nghi m là m i trư ng MS

(Murashige và Skoog, 1962), B5 (Gamborg và cộng sự, 1968), White (White, 1963),

WPM (Lloyd và McCown, 1981).

M i trư ng nu i cấy ược bổ sung 20-30 g/l sucrose; 8,5 g/l g r ( ối với m i

trư ng tái sinh cây có bổ sung th m 1,0 g/l th n hoạt tính). Tùy thuộc từng thí nghi m

s bổ sung các chất iều hò sinh trưởng và các thành phần m i trư ng khác nh u.

42

M i trư ng s ược iều chỉnh về pH = 5,7 - 5,8. S u ó, m i trư ng ược hấp khử

trùng ở 121C, áp suất 1 atm trong 20 phút.

2.1.2.2. Dụng cụ và hóa chất trong chạy kỹ thuật dòng chảy tế bào

˗ Máy phân tích bội th CyFlow Ploidy Analyzer của hãng Partec˗Đ c

- Thuốc nhuộm và các vật tư ti u h o sử d ng phân tích bội th cung cấp

kèm theo máy: dung d ch tạo dòng chảy, 5 lít; dung d ch rử máy, 250 ml; dung

d ch khử b n máy, 250 ml; CellTrics 50 µm, màu vàng, lọc tách nhân t bào

(250 chi c.); DNA control UV, 25ml; Cyst in UV ploidy, 25O tests; ống o mẫu

3,5 ml (500 chi c)

2.1.2.3. Dụng cụ và hóa chất trong chạy kỹ thuật RAPD

 Dụng cụ

Bộ cối chày s , micropipette và các loại ầu tip tương ng từ h ng BIOHIT: 0,5 ˗

10 l; 2 ˗ 20 l; 10 ˗ 100 l; 100 ˗ 1000 l, eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml và 1,5 ml, các

d ng c thủy tinh và vật d ng cơ bản trong phòng thí nghi m.

 Thiết bị

B ổn nhi t (Fisher scientific), tủ âm (-) 86°C Nuaire ILS-DF8517E, tủ âm (-)

20°C Sanaky VH-130, tủ mát (Vesfrost reetech), nồi hấp ti t trùng, máy ổn nhi t

Wealtec HB-2, máy khuấy từ, máy o pH Digimed DM-21, bộ thi t b i n di ng ng

Advance, máy PCR Biorad MyCycle, máy ly tâm Mikro 22R (HettechZentrifugen ˗

Germ ny), máy o qu ng phổ hấp th Genequ nt pro, hộp èn UV (Velber lourm t),

máy o OD (Merck), máy vortex, bình ch nitơ lỏng.

 Hóa chất

‒ Hóa chất tách chiết DNA trong quy trình sử dụng nitơ lỏng

2X CTAB: 2% hexadecyltrimethylammonium bromide CTAB (w/v); 100 mM

Tris (pH 8,0); 20 mM EDTA (pH 8,0); 1,4 M NaCl; 1% PVP (polyvinylpyrrolidone).

‒ Hóa chất điện di

Ag rose, dung d ch Ethium bromide 10 mg/ml, dung d ch nạp mẫu i n di

(loading dye): bromophenol blue; 30 % glycerol trong nước cất; 0,25% xylen cy nol,

TAE 1X: Tris-HCl 4,48g; Na2EDTA 0,5 M (pH 8,0) 2 ml; glacial acetic acid 1,14 ml;

th m nước cất cho ủ 1000 ml.

43

‒ Hóa chất phản ứng PCR

T g DNA polymer se nồng ộ 1,5 U/l (Ferment s), dung d ch m PCR 10X ( i

kèm với) có thành phần 500 mM KCl; 15 mM MgCl2; 100 mM Tris-HCl (pH 8,0),

dNTP có 4 loại: dATP; dCTP; dGTP; dTTP, mồi ngẫu nhi n sử d ng 19 mồi củ h ng

Invitrogen, USA (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các thông số của các mồi (primer)

STT Primer Thứ tự các nucleotic Chiều dài

OPAK 14 CTGTCATGCC 10 1

OPB 07 GGTGACGCAG 10 2

OPD 14 CTTCCCCAAG 10 3

OPC 18 TGAGTGGGTG 10 4

OPT 18 GATGCCAGAC 10 5

OPN 07 CAGCCCAGAG 10 6

OPG 02 GGCACTGAGG 10 7

OPE 20 AACGGTGACC 10 8

OPAL 12 CCCAGGCTAC 10 9

OPAW 07 AGCCCCCAAG 10 10

OPM11 GTCCACTGTG 10 11

OPA05 AGGGGTCTTG 10 12

OPA08 GTGACGTAGG 10 13

OPB01 GTTTCGCTCC 10 14

OPB05 TGCGCCCTTC 10 15

OPB08 TTCCCCCGCT 10 16

OPB13 TTCCCCCGCT 10 17

OPO08 CCTCCAGTGT 10 18

OPB14 TCCGCTCTGG 10 19

44

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát tạo nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi từ nuôi cấy lớp mỏng tế

bào lá

M c ích: Xác nh m i trư ng thích hợp cảm ng tạo m sẹo có khả năng phát

sinh ph i từ nu i cấy lớp mỏng t bào lá.

2.2.2. Khảo sát khả năng tăng sinh, sự biệt hóa và trưởng thành của nguồn mô sẹo

có khả năng sinh phôi: ảnh hưởng của một số nồng độ acid amine và spermidine

M c ích: Xác nh ảnh hưởng củ nồng ộ proline, glut mine, denine sulph te

và spermidine ri ng l n sự tăng sinh, bi t hoá và trưởng thành củ phôi soma phát

sinh từ m sẹo nu i cấy từ lớp mỏng t bào lá.

2.2.3. Khảo sát khả năng tái sinh, phát triển thành cây con hoàn chỉnh của phôi

soma

M c ích: Xác nh thành phần m i trư ng thích hợp cảm ng sự tái sinh cây hoàn

chỉnh từ ph i và khả năng sống củ cây con tr n các loại giá th nu i trồng ngoài vư n

ươm.

2.2.4. Khảo sát mức độ biến dị kiểu hình của cây phát triển từ phôi soma

M c ích: Đánh giá có hay không bi n d ki u hình, tỷ l và loại bi n d ki u hình

xuất hi n ở các cây con phát tri n từ ph i som .

2.2.5. Khảo sát mức độ bội thể của cây giống từ phôi soma

M c ích: Sử d ng phương pháp dòng chảy t bào ánh giá m c ộ bội th củ cây

cọc rào nhân giống in vitro từ các phương pháp nu i cấy khác nh u: nu i cấy ỉnh sinh

trưởng, nu i cấy từ lớp mỏng t bào lá và nu i cấy từ ph i som .

2.2.6. Khảo sát mức độ biến dị di truyền của cây giống từ phôi soma

M c ích: Sử d ng kỹ thuật RAPD so sánh về mặt di truyền củ cây con tái sinh

từ ph i som ở các lần cấy chuyền khác nh u với cây ầu dòng ánh giá có h y

kh ng bi n d di truyền.

2.2.7. Xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma

M c ích: Thi t lập quy trình vi nhân giống hoàn chỉnh cây cọc rào từ các k t quả

thí nghi m ược thực hi n, xác nh iều ki n m i trư ng và iều ki n nu i cấy

thích hợp cho sự phát sinh m sẹo, phát sinh ph i, nhân nh nh phôi và cảm ng tạo

45

cây con, chọn lọc và ươm tạo cây giống hoàn chỉnh ngoài vư n ươm. Từ ó xác nh

th i gi n, h số nhân tương ng với quy trình xây dựng.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ auxin ngoại sinh lên

sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá

 Vật liệu thí nghiệm

Các cặp lá th h i từ ỉnh củ các cây giống cọc rào kho mạnh, kh ng sâu b nh

s u khi thu nhận ược khử trùng sơ bộ bề mặt lá bằng xà phòng lo ng rồi rử lại với

nước sạch và ặt dưới vòi nước chảy (30 phút). S u ó, các mẫu ược chuy n vào tủ cấy khử trùng với cồn 700 trong 30 giây, rử lại bằng nước cất v trùng (3 ˗ 4 lần).

Mẫu ti p t c ược lắc khử trùng với dung d ch j vel nồng ộ 12,5% có bổ sung 2 ˗ 3

giọt Tween˗20 trong 10 phút, s u ó rử sạch lại bằng nước cất v trùng (4 ˗ 5 lần).

Mẫu lá s u khử trùng ược sử d ng làm nguy n li u cho nu i cấy lớp mỏng t bào lá.

 Bố trí thí nghiệm

Các mẫu lá s u khi ược khử trùng ược cắt bỏ phần viền lá, rồi cắt thành các

mảnh nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng t bào theo chiều ng ng (tTCL). M i mảnh nhỏ lá

có kích thước 0,5 mm x 10 mm ược cấy vào m i trư ng cơ bản MS (Murashige và

Skoog, 1962) bổ sung loại và nồng ộ các CĐHSTTV ri ng l b o gồm: 2,4˗D: 0; 0,1;

0,5; 1,0; 1,5 mg/l; IBA: 0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l; NAA: 0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l. Thí

nghi m ược bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhi n. M i nghi m th c ược

nu i cấy tr n 10 ĩ petri, m i ĩ 7 mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3 lần.

 Chỉ tiêu theo dõi:

Các mẫu cấy ược theo dõi và ghi nhận k t quả sau 4 tuần nuôi cấy. B o gồm:

quan sát phản ng của mẫu cấy; tỷ l mẫu sống (%); tỷ l mẫu cấy tạo mô sẹo (%),

khối lượng tươi (mg/mẫu); khối lượng kh (mg/mẫu); hình thái m sẹo

2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và kinetin lên khả

năng sinh phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm

Các cặp lá th h i từ ỉnh củ các cây giống cọc rào kho mạnh, kh ng sâu b nh

ược thu nhận và khử trùng với ch ộ khử trùng như ở thí nghi m 1. Các lá s u khử

46

trùng s ược cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng t bào (TCL) theo chiều ng ng. M i

mảnh nhỏ lá có kích thước 0,5 mm x 10 mm ược cấy vào m i trư ng cơ bản MS bổ

sung 0,5 mg/l 2,4˗D (k thừ k t quả thí nghi m 1). S u 3 tuần nu i cấy các khối m

sẹo ược sử d ng làm vật li u thí nghi m.

 Bố trí thí nghiệm

Vật li u thí nghi m là các khối m sẹo có kích thước 0,5 x 0,5 x 0,5 cm ược cấy

l n m i trư ng MS có bổ sung KIN (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) ri ng l hoặc k t hợp với

2,4˗D (0,5 mg/l).

Thí nghi m ược bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhi n. M i nghi m th c

ược nu i cấy tr n 10 ĩ petri, m i ĩ 7 mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3 lần.

 Chỉ tiêu theo dõi:

Các mẫu cấy ược theo dõi và ghi nhận k t quả sau 8 tuần nuôi cấy. B o gồm:

quan sát phản ng của mẫu cấy; tỷ l mẫu cấy hình thành phôi (%); khối lượng tươi

(g/mẫu).

2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành

phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm

Mẫu m sẹo ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l

KIN (k thừ k t quả thí nghi m 1, 2) nu i cấy 3 tuần ược sử d ng làm vật li u thí

nghi m.

 Bố trí thí nghiệm

Khối m sẹo có khả năng sinh ph i ược ược cắt thành các khối có kích thước

0,5 x 0,5 x 0,5 cm cấy l n m i trư ng cơ bản MS (kh ng bổ sung chất iều hò sinh

trưởng) bổ sung proline ở các nồng ộ khác nh u (250; 500; 750; 1000 mg/l). Thí

nghi m ược bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhi n. M i nghi m th c ược

nu i cấy tr n 10 ĩ petri, m i ĩ 7 mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3 lần.

 Chỉ tiêu theo dõi:

Các mẫu cấy ược theo dõi và ghi nhận k t quả sau 4 tuần nuôi cấy. B o gồm: tỷ l

mẫu hình thành phôi (%); số lượng phôi hình thành/mẫu cấy; khối lượng tươi

(mg/mẫu).

47

2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình

thành phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm: tương tự thí nghiệm 3

 Bố trí thí nghiệm

Khối m sẹo có khả năng sinh ph i ược ược cắt thành các khối có kích thước

0,5 x 0,5 x 0,5 cm cấy l n m i trư ng cơ bản MS có bổ sung glut mine ở các nồng ộ

khác nhau (50; 100; 150; 200 mg/l). Thí nghi m ược bố trí theo phương pháp hoàn

toàn ngẫu nhi n. M i nghi m th c ược nu i cấy tr n 10 ĩ petri, m i ĩ 7 mẫu, m i

nghi m th c lặp lại 3 lần. Các mẫu cấy ược nu i cấy và thu nhận số li u s u 4 tuần.

 Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 3

2.3.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate lên sự

hình thành phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm: tương tự thí nghiệm 3

 Bố trí thí nghiệm

Khối m sẹo có khả năng sinh ph i ược ược cắt thành các khối có kích thước

0,5 x 0,5 x 0,5 cm cấy l n m i trư ng cơ bản MS có bổ sung denine sulph te ở các

nồng ộ khác nh u (50; 100; 150; 200 mg/l). Thí nghi m ược bố trí theo phương

pháp hoàn toàn ngẫu nhi n. M i nghi m th c ược nu i cấy tr n 10 ĩ petri, m i ĩ

7 mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3 lần. Các mẫu cấy ược nu i cấy và thu nhận số li u

s u 4 tuần.

 Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 3

2.3.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên sự hình

thành phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm: tương tự thí nghiệm 3

 Bố trí thí nghiệm

Khối m sẹo có khả năng sinh ph i ược ược cắt thành các khối có kích thước

0,5 x 0,5 x 0,5 cm cấy l n m i trư ng cơ bản MS có bổ sung spermidine ở các nồng ộ

khác nhau (0; 0,01; 0,03; 0,05; 0,07 mg/l). Thí nghi m ược bố trí theo phương pháp

hoàn toàn ngẫu nhi n. M i nghi m th c ược nu i cấy tr n 10 ĩ petri, m i ĩ 7

mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3 lần. Các mẫu cấy ược nu i cấy và thu nhận số li u

s u 4 tuần.

48

 Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 3

2.3.1.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình

thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm: Các phôi hình thành lá mầm

 Bố trí thí nghiệm

Các ph i hình thành lá mầm ược cấy chuyền vào các m i trư ng khoáng khác

nh u b o gồm (MS, ½ MS, SH, B5, WPM), kh ng có bổ sung các chất iều hò sinh

trưởng thực vật. Thí nghi m ược bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhi n. M i

nghi m th c ược nu i cấy tr n 10 ch i, m i ch i 1 mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3

lần.

 Chỉ tiêu theo dõi:

Các mẫu cấy ược theo dõi và ghi nhận k t quả sau 5 tuần nuôi cấy. B o gồm: tỷ

l mẫu hình thành rễ (%); số lượng rễ hình thành/mẫu cấy; chiều dài rễ (cm); khối

lượng tươi của rễ (mg/mẫu cấy); chiều cao của cây con tái sinh từ phôi (cm).

2.3.1.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA, NAA lên sự phát triển

rễ của cây con tái sinh từ phôi soma

 Vật liệu thí nghiệm: Các phôi hình thành lá mầm.

 Bố trí thí nghiệm

Các ph i hình thành lá mầm s ược cấy chuyền vào các m i trư ng khoáng

thích hợp (k thừ thí nghi m 7) có bổ sung IBA hoặc NAA ri ng l với các nồng ộ

khác nhau: IBA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l); NAA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l).

Thí nghi m ược bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhi n. M i nghi m

th c ược nu i cấy tr n 10 ch i, m i ch i 1 mẫu, m i nghi m th c lặp lại 3 lần. K t

quả ghi nhận s u 5 tuần nu i cấy

 Chỉ tiêu theo dõi: tương tự thí nghiệm 7.

2.3.1.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát khả năng sống sót của cây con có nguồn gốc từ

phôi soma trên một số loại giá thể

 Vật liệu thí nghiệm

Các ph i hình thành lá mầm s ược cấy chuyền vào các m i trư ng khoáng bổ

sung chất iều hoà sinh trưởng thích hợp cho tạo cây (k thừ thí nghi m 7, 8). S u 4

tuần nu i cấy, nh ng cây giống phát tri n bình thư ng từ ph i som kh ng có bi n d

49

ki u hình ược sử d ng làm mẫu thí nghi m trong nghi n c u khả năng phát tri n

ngoài vư n ươm.

 Bố trí thí nghiệm

Các cây có chiều c o thân 3 ˗ 4 cm ược rử sạch, ngâm thuốc trừ nấm và ươm

tr n các giá th s u: tro trấu, m n dừ thành ph m, ất trộn m n dừ , ất trộn tro trấu

ánh giá s c sống củ cây con ở ch ộ ngoài vư n ươm (Bảng 2.2).

Bảng 2.2. Các loại giá thể sử dụng trong thí nghiệm

STT Loại giá thể

Đất sạch 1

Đất 2

3 M n dừ

4 M n dừ + ất sạch (1:1)

5 M n dừ + ất (1:1)

6 M n dừ + ất + cát (1:1:1)

 Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ l sống (%); số rễ trung bình/cây.

2.3.1.10. Thí nghiệm 10: Khảo sát các biến dị kiểu hình của cây phát triển từ phôi

soma

 Vật liệu thí nghiệm

Các cây con tái sinh từ ph i som ược cảm ng và nu i cấy tr n m i trư ng

thích hợp k thừ từ k t quả củ các thí nghi m từ 1 n 9.

 Bố trí thí nghiệm

Các cây con tái sinh từ 100 ph i som (3 lần lặp lại) s ược m tả, phân loại

thống k các bi n d ki u hình dự tr n các ặc i m hình thái củ lá, thân và rễ.

 Chỉ tiêu phân loại: ặc i m hình thái lá; ặc i m hình thái thân; ặc i m hình

thái rễ.

2.3.1.11. Thí nghiệm 11: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào đánh giá mức độ

bội thể của cây cọc rào nhân giống in vitro

 Vật liệu thí nghiệm

5 mẫu cây cọc rào b o gồm: mẫu cây bố mẹ ối ch ng (2n); mẫu cây giống nhân

bằng phương pháp nu i cấy ỉnh sinh trưởng (Đ Đăng Giáp và cộng sự, 2012); mẫu

50

cây giống nhân bằng phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào lá (Thái Xuân Du và

cộng sự, 2010); mẫu cây giống nhân bằng phương pháp nu i cấy ph i som (Đ Đăng

Giáp và cộng sự, 2012). Cây con hoàn chỉnh ược thu nhận ở nh ng dòng khác nh u,

trồng ngoài vư n ươm 3 tháng tuổi s ược sử d ng làm vật li u trong ánh giá khả

năng m c ộ bội th củ cây cọc rào nhân giống in vitro [7], [8].

 Bố trí thí nghiệm

Thu mẫu

Đối với mẫu lá ex vitro (cây ầu dòng ối ch ng 2n): các lá dùng cho thí nghi m

là các lá non, còn nguy n vẹn và tươi mới. Các lá này ược chọn và rử sạch trước khi

làm thí nghi m. Các mẫu lá cũng có th ược chọn lự trước và gói bằng giấy m, ặt trong ĩ petri hoặc b o nilon và gi lạnh ở 4°C cho n khi ược sử d ng.

Đối với các mẫu cây in vitro (chư bi t m c ộ bội th ) s lấy phần lá ti n hành

thí nghi m.

Trích và nhuộm mẫu: rử lá bằng nước cất 2 lần; l u bề mặt lá bằng cồn 70; cân

10 ˗ 20 mg lá tươi cho vào ĩ petri; cho th m vào 0,5 ml dung d ch nhuộm Cyst in

UV ploidy ˗ Partec (ch chất trích ly DNA và chất nhuộm DAPI có khả năng phát

qu ng dưới èn UV); dùng d o l m mới cắt nhỏ mẫu lá thành mảnh v n nhỏ giải

phóng nhân t bào; th m vào 1,5 ml dung d ch nhuộm Cyst in UV ploidy ˗ P rtec và ủ

mẫu ở nhi t ộ phòng trong 3 phút; lọc dung d ch mẫu qu màng lọc celltrics 30 µm

và ti n hành o m c bội th tr n máy phân tích bội th CyFlow Ploidy An lyzer củ

hãng Partec˗Đ c; m i nghi m th c ược lặp lại 5 lần.

Chạy mẫu trên máy CyFlow Ploidy Analyzer và phân tích bằng phần mềm

CyView

Ti n hành o và hi u chỉnh các th ng số củ máy cho n khi bi u ồ thu ược

có dạng một ỉnh c o và nhọn, ồng th i cho giá tr trung bình hàm lượng DNA (me n

DNA nucleic content) ổn nh s u nhiều lần o (khoảng 10 lần), m i mẫu khảo sát

ược phân tích lặp lại 3 lần. Giá tr các th ng số củ máy ược thi t lập như s u:

 Chạy mẫu chu n 2n trước, iều chỉnh giá tr G in về chỉ số 511 (Speed: 0,4

µl/s; Lower ˗ Level: 0,72) cho ỉnh Pe k chính củ mẫu chu n 2n nằm vào

v trí chính gi th ng o 0 và 50. Có th chạy lặp lại mẫu chu n 2n một vài lần

so sánh.

51

 Chạy các mẫu chư bi t m c ộ bội th s ược ư vào máy chạy s u khi

chạy mẫu chu n và cố nh giá tr G in theo mẫu chu n (giá tr G in củ mẫu

chu n có th th y ổi tùy theo ngư i phân tích).

2.3.1.12. Thí nghiệm 12: Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh về mặt di truyền của

cây giống từ phôi soma với cây đầu dòng

 Vật liệu thí nghiệm

Các ph i som hình thành lần ầu từ các lá cây ầu dòng trưởng thành qu

phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào ược coi là ph i som ở dòng sơ cấp (L1).

Nh ng ph i som này khi nu i cấy tr n m i trư ng khoáng có bổ sung nồng ộ chất

iều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp (k thừ thí nghi m 7, 8) s tái sinh các cây

con hoàn chỉnh.

Nh ng ph i sơ cấp cấy chuy n nhiều lần, m i lần cấy chuy n cách nh u 21 ngày

tr n m i trư ng hình thành ph i som (k thừ thí nghi m 3-6). Tùy theo số lần cấy

chuy n s hình thành nh ng dòng ph i som khác nh u. Nh ng ph i som ở nh ng

dòng lự chòn s u ó ti p t c nu i cấy tr n m i trư ng khoáng có bổ sung nồng ộ

chất iều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp (k thừ thí nghi m 7, 8) tái sinh các

cây con hoàn chỉnh. Cây con từ ph i som hoàn chỉnh ược thu nhận ở nh ng dòng

khác nh u s ược trồng ngoài vư n ươm 3 tháng. Cây con 3 tháng tuổi này s ược

sử d ng làm vật li u trong ánh giá khả năng bi n d củ cây con. Trong bài báo này

lự chọn nh ng dòng ược chọn ở lần cấy chuy n th 1 (L1); th 3 (L3); th 6 (L6);

th 9 (L9).

S u khi hình thành cây con từ ph i hoàn chỉnh, nh ng cây con từ phôi hoàn

chỉnh trồng ngoài vư n ươm 3 tháng tuổi ở nh ng dòng L1, L3, L6, L9 s ược ánh

giá tính ổn nh di truyền so với cây ầu dòng b n ầu bằng kỹ thuật RAPD ở 19 mồi

khác nhau (Bảng 2.3).

 Bố trí thí nghiệm

 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA mẫu cọc rào thí nghiệm

DNA củ các mẫu cọc rào ược chi t xuất và tinh sạch từ nguồn lá tươi, áp d ng

phương pháp CTAB củ Stew rd 1993 [181].

Chu n b mẫu: Thu thập lá non của các mẫu cây, s u ó các mẫu lá non ược

tách ri ng chu n b cho quá trình tách chi t.

52

Bảng 2.3. Vật liệu thí nghiệm đánh giá tính ổn định di truyền

STT Kí hiệu Diễn giải về mẫu

1 BM1 Cây ầu dòng

2 BM2 Cây ầu dòng

3 L1.1 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 1

4 L1.2 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 1

5 L3.1 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 3

6 L3.2 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 3

7 L6.1 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 6

8 L6.2 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 6

9 L9.1 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 9

10 L9.2 Cây từ dòng ở lần cấy chuy n th 9

- Quy trình tách chiết mẫu: sử dụng bộ kít của hãng QIAGEN. 100 mg lá tươi ược

rử bằng nước cất, s u ó ược làm kh bằng cồn tuy t ối; Cắt nhỏ mẫu cho vào

eppendorf 1,5 ml, cho vào nitơ lỏng → nghiền mẫu; Thêm 400 µl buffer AP1 và 4 µl RNAse → ủ ở 65°C trong 10 phút; Ti p t c cho th m 10 µl buffer AP2 và ặt vào á lạnh trong 5 phút; Ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút ở 25°C; Hút 450 µl d ch cho vào ống QIA; Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút ở 25°C; Bỏ cột lọc, s u ó th m

675 µl buffer AP3 vào phần d ch; Trộn ều mẫu, hút 650 µl d ch cho vào ống DNe sey; Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C; Bỏ d ch lọc, ti p t c ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C; Lấy cột lọc cho vào collection tube mới, th m 500 µl buffer AW; Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C; Bỏ d ch lọc, th m 500 µl buffer AW vào cột; Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút ở 25°C; Bỏ d ch lọc, ặt

cột vào ống ly tâm mới, th m 50 µl buffer AE ủ ở nhi t ộ phòng trong 5 phút; Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C; Bảo quản d ch ở ˗20°C.

- Đánh giá chất lượng DNA tổng số: tỷ l OD260/OD280 ược sử d ng ước lượng

ộ tinh sạch của dung d ch nucleic acid. N u tỷ l này trong khoảng 1,8 ˗ 2,0 thì dung

d ch nucleic cid ược xem là sạch. Khi mẫu có lẫn protein hay phenol thì tỷ l này s

thấp hơn và mẫu DNA kh ng ạt yêu cầu thực hi n phản ng RAPD.

- Hàm lượng DNA ược tính theo công th c:

53

Hàm lượng DNA (ng/µl) = [(62,9 x OD260) – (36 x OD280)] x ộ pha loãng

- Phương pháp tính gần úng hàm lượng DNA bằng OD:

 Xây dựng ư ng chu n: dùng dung d ch TE 1X tạo ư ng chu n.

 Ph lo ng dung d ch DNA n nồng ộ thích hợp o.

 Ti n hành o OD ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm (OD260 và OD280).

S u khi o OD các mẫu DNA ược pha loãng về nồng ộ 50 ng/µl thực hi n

phản ng RAPD.

 Phản ứng RAPD

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng RAPD

Thành phần Nồng độ

Buffer PCR 1X

25 mM MgCl2

DNTP 2.5 mM

Taq polimerase 5 u/l

Mẫu 100 ng/l

Primer 100 ng/l

Đủ 25 µl Nước nuclease depe free

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng

Giai đoạn 1 Số chu kỳ 1

2 2

3 40

4 Nhiệt độ (0C) 95 94 32 72 94 32 72 72 Thời gian (phút) 3 2 2 5 1 1.5 3 10 1

 Đánh giá độ đa dạng di truyền

K t quả RAPD thu ược tr n gel i n di ược m hó thành dạng nh phân (sản

ph m có b nd hi n di n thì t s nhập là 1 và 0 n u kh ng hi n b nd) và ư vào phân

tích bằng phần mềm SAS 9.1. Chỉ các băng rõ, ổn nh và lặp lại có kích thước khoảng

200-2000 bp ược dùng trong phân tích d li u. Các vạch kh ng rõ ược loại bỏ.

54

Đ hi n th mối qu n h di truyền gi các mẫu khảo sát, một sơ ồ hình cây

ược xây dựng dự tr n chỉ số tương qu n ơn giản SM (Simple m tching coefficient)

và x p nhóm các mẫu theo phương pháp UPGMA (Unweighted P ir-Groug Method

with Arithmetic me n) sử d ng phần mềm NTSYS-pc 2.1.

 Sàng lọc mồi (primer):

Sau khi ti n hành tối ưu hó phản ng RAPD, ti p t c ti n hành phản ng RAPD

trên mẫu DNA ly trích từ lá non cây ầu dòng sàng lọc các mồi h u hi u dùng

trong nghiên c u. Quá trình chạy RAPD tr n cây ầu dòng ược lặp lại ít nhất 10 lần

sàng lọc ược nh ng mồi có tính ồng hình cao, các band phân bi t rõ, riêng bi t.

Các mồi (Bảng 2.5) ược sàng lọc ược lấy từ k t quả nghiên c u sử d ng kỹ

thuật RAPD ánh giá tính dạng di truyền của cây cọc rào ở Vi t Nam của 02

luận văn thạc sỹ (Võ Th Hoài Cảm, 2011; Nguyễn Th Lài; 2010) [5], [10]. Ngoài ra

19 mồi ược sử d ng nghiên c u trong ề tài này cũng ược nhiều công trình

nghiên c u trước ây sử d ng ánh giá dạng di truyền trên các giống cọc rào Ấn

Độ như: primer OPAK 14, OPD 14, OPC 18, OPT 18, OPAL 12, OPAW 07.

Sau khi sàng lọc ược nh ng mồi ặc hi u, các mẫu nghiên c u ược chạy

RAPD so sánh tính ổn nh di truyền của cây từ phôi soma so với cây ầu dòng.

Quá trình chạy RAPD tr n cây ầu dòng ược lặp lại ít nhất 10 lần trên m i cặp mồi

và số lượng mẫu thí nghi m khảo sát.

K t quả m i phản ng ược ti n hành phân tích bằng i n di trên gel agarose 2%

có bổ sung ethidium bromide 10 mg/ml trong dung d ch TAE 1X, hi u i n th 80V

trong 60 phút. S u khi i n di, các băng sáng ược phát hi n dưới èn UV. Kích thước

các vạch sáng ược so sánh với thang chu n. Sử d ng phần mềm Im ge˗J ọc k t

quả các băng, các băng hình và ơn hình tr n bảng i n di.

2.3.2. Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu

2.3.2.1. Phương pháp giải phẫu quan sát hình thái

Hình thái củ ph i, m sẹo ược theo dõi bằng phương pháp giải phẫu, nhuộm

hai màu theo quy trình sau (Nguyễn Ti n Bân và cộng sự, 1979) [1]: Cắt mẫu ph i, m

sẹo cần qu n sát; Ngâm mẫu ph i, m sẹo trong j vel khoảng 10 phút; Loại bỏ j vel

tr n mẫu bằng nước cất; Ngâm mẫu ph i, m sẹo trong cid cetic 10% khoảng 10

phút; Rử sạch cid tr n mẫu bằng nước cất;Thấm kh mẫu, nhỏ l n mẫu một giọt

55

thuốc nhuộm Carmin-Iod, nhuộm trong 15 phút; Rử sạch thuốc nhuộm tr n mẫu bằng

nước cất; Đặt mẫu nhuộm l n l me, nhỏ l n mẫu 1 giọt glycerin, ậy l melle và

qu n sát mẫu dưới kính hi n vi. Qu n sát mẫu vật với kính hi n vi ở vật kính X4, X10.

2.3.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thực vật

H thống TCL b o gồm các mẫu m có kích thước nhỏ ược thu nhận từ các cơ

qu n khác nh u củ thực vật (thân, rễ, lá, c m ho , chồi ho , các cơ qu n củ ho , lá,

mầm, m phân sinh, ỉnh sinh trưởng hoặc ph i). Khi thu nhận theo chiều dọc củ

mẫu là lTCL (longitudi l TCL), khi thu nhận theo chiều ng ng mẫu gọi là tTCL

(tr nsverse TCL). Các mẫu lTCL (1 mm × 0,5 mm h y 1,0 mm) b o gồm chỉ một dạng

m như một lớp ơn các t bào bi u bì (có th ược bóc khỏi cơ qu n) hoặc là vài lớp

(3 ˗ 6) t bào bi u bì, trong khi các mẫu tTCL (0,2 ˗ 0,5 mm h y dày vài mm) b o gồm

một số lượng nhỏ các t bào thuộc các dạng m khác nh u như: bi u bì, vùng thượng

tầng, bó g , bó mộc và các t bào nhu m (Tr n Th nh V n và Gendy, 1996) [204].

H thống TCL là một h thống ơn giản, một m hình tốt nghi n c u lĩnh vực

cơ bản h y nghi n c u vào chuy n gen và tái sinh. TCL ược sử d ng n nghi n c u

quá trình cảm ng tạo ph i, tạo cơ qu n ở một số lượng lớn các loài thực vật. TCL còn

là một phương pháp hi u quả nhân giống một số lượng lớn thực vật hoặc cơ qu n

với nh ng tính trạng mong muốn, quy m rộng, hi u quả kinh t c o. Đây còn là h

thống có th làm th y ổi ặc tính khó tái sinh in vitro ối với cây rừng, cây thân g ,

cây một lá mầm.

Trong nghi n c u, các lá s ược cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng t bào theo

chiều ng ng, m i mảnh nhỏ lá có kích thước 0,5 mm x 10 mm và ược nu i cấy tr n

m i trư ng theo nh ng thí nghi m c th (hình 3.1).

56

a. Lá cây Cọc rào b. Cắt lá thành kích thƣớc (0,5 x 1) cm c. Mẫu cắt (0,5 x 10) mm

Hình 2.1. Quy trình cắt mẫu TCL lá cọc rào

∑

2.3.2.3. Phương pháp lấy số liệu

∑

∑

Tỷ l hình thành m sẹo (%) =

∑

∑

Tỷ l mẫu hình thành ph i (%) =

∑

∑

Tỷ l mẫu tạo rễ (%) =

∑

Tỷ l mẫu sống (%) =

Chiều dài thân cây non (cm/cây): ược xác nh bằng cách dùng thước o

khoảng cách từ v trí bắt ầu hình thành rễ lên v trí cặp lá th 2 từ ngọn m xuống.

Khối lượng tươi (mg/mẫu cấy): ược xác nh bằng cách cân khối lượng tươi củ

mẫu.

Khối lượng kh (mg/mẫu cấy): ược xác nh bằng cách sấy kh mẫu cấy ở 40oC

trong 48 gi , cân xác nh khối lượng M1. Ti p t c sấy mẫu ở cùng iều ki n, cân xác

nh khối lượng M2. S i số củ 02 lần cân li n ti p 0,05% xem như khối lượng kh

kh ng ổi. Giá tr cân ược cuối cùng là khối lượng kh củ mẫu

Khối lượng rễ (mg/mẫu cấy): ược xác nh bằng cách cân khối lượng rễ tươi

Chiều dài rễ (cm/rễ): ược xác nh bằng cách dùng thước o từ gốc thân (v trí

rễ bắt ầu xuất hi n) n chóp rễ

57

2.3.2.4. Phân tích và xử lý số liệu

Các thí nghi m ều ược bố trí theo ki u thí nghi m hoàn toàn ngẫu nhi n

(Complettely R ndomized Design, CRD) theo phương pháp củ Compton và Mize,

1999, sử d ng nghi n c u thực vật trong phòng thí nghi m và nhà kính [39].

Số li u ược ghi nhận và xử lý bằng phần mềm St tgr phics Centurion XV.I theo

phương pháp LSD - Least Signifi-c nt Difference (H yter, 1986) ở m c ý nghĩ 5%

[86].

Phương pháp phân tích các y u tố chính dự tr n bảng số li u trung bình về tỷ l

hình thành ph i, số lượng ph i và khối lượng ph i củ các thí nghi m sử d ng các cid

amine (proline, glutamine, adenine sulphate) và spermidine. Phương pháp này ược thực hi n bằng phần mềm Minitab® 16.2.2 (State College, Pennsylvania, USA).

2.4. Điều kiện nuôi cấy

Điều ki n nu i cấy trong phòng thí nghi m: Th i gi n chi u sáng là 10h/ngày,

cư ng ộ chi u sáng là 2500  100 lux, nhi t ộ: 25  2C, ộ m trung bình: 60 

5%.

Điều ki n nu i trồng ngoài vư n ươm: Th i gi n chi u sáng theo ngày, cư ng ộ

chi u sáng 5000  500 lux, nhi t ộ 25  5C, ộ m trung bình 75  5%.

2.5. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Địa điểm thí nghiệm: Phòng Thí nghi m Trọng i m Quốc Gi về C ng ngh

T bào Thực vật, Vi n Sinh học Nhi t ới.

Thời gian thực hiện: Th i gian thực hi n từ tháng 01/2011 n tháng 03/2015.

58

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát tạo nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào

lá

3.1.1. Ảnh hưởng của các auxin ngoại sinh lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng

tế bào lá

Auxin là y u tố cần thi t cho sự phát sinh ph i với ảnh hưởng khác nh u trong

từng gi i oạn củ quá trình sinh ph i. Nhu cầu về loại cũng như nồng ộ uxin trong

quá trình cảm ng ph i th y ổi tùy thuộc vào ki u gen củ thực vật cũng như loại m

sử d ng trong nu i cấy. Trong ó, 2,4˗D và NAA là h i loại uxin ược sử d ng nhiều

nhất, 2,4˗D chi m 50% và NAA chi m 25% trong các trư ng hợp phát sinh ph i

[168].

Ảnh hưởng của auxin NAA, IBA lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế

bào lá cây cọc rào

Sau 28 ngày nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung IBA và NAA ri ng l ở các

nồng ộ khác nh u, k t quả cho thấy các mẫu cấy lớp mỏng lá củ cây cọc rào kh ng

có sự hình thành m sẹo mà còn có dấu hi u hó nâu và ch t. Từ k t quả thu ược,

chúng t i có th k t luận rằng IBA và NAA là nh ng loại uxin ngoại sinh kh ng thích

hợp cảm ng sự hình thành m sẹo củ lớp mỏng t bào lá cây cọc rào (Hình 3.1).

Hình 3.1. Hình thái TCL lá s u 28 ngày nu i cấy tr n m i trư ng bổ sung IBA và NAA; a. IBA: 0,1 mg/l b. IBA: 0,5 mg/l c. IBA: 1,0 mg/l d. IBA: 1,5 mg/l e. NAA: 0,1 mg/l f. NAA: 0,5 mg/l g. NAA: 1,0 mg/l h. NAA: 1,5 mg/l

59

Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá cây

cọc rào

Đối với thí nghi m bổ sung 2,4˗D, s u 28 ngày nu i cấy tỷ l mẫu cấy sống ở

nghi m th c kh ng bổ sung 2,4˗D là 20,36%. Tỷ l này là rất thấp so với các nghi m

th c có bổ sung 2,4˗D. Tỷ l mẫu sống ở các nghi m th c bổ sung 0,5 – 1,5 mg/l 2,4-

D ạt tr n 90%, trong ó nghi m th c bổ sung 1,0 mg/l và 1,5 mg/l 2,4-D cho k t quả

lần lượt là 93,58% và 92,22%. K t quả cũng cho thấy tỷ l tạo m sẹo c o khi bổ sung

2,4-D ở nồng ộ 0,5 – 1,5 mg/l (tỷ l ạt ược lần lượt là 98,40%, 97,95% và 98,79%).

Trong khi ó, nghi m th c ối ch ng thì không có sự hình thành m sẹo. Đối với chỉ

ti u về khối lượng, ở nghi m th c kh ng bổ sung 2,4-D và nghi m th c bổ sung 0,1

mg/l 2,4-D thì khối lượng ạt ược ều rất thấp (lần lượt là 0,80 mg và 8,01 mg ối

với chỉ ti u khối lượng tươi; 0,16 mg và 1,13 mg ối với chỉ ti u khối lượng kh ) so

với các nghi m th c còn lại. Khi tăng nồng ộ 2,4-D bổ sung từ 0,5 – 1,5 mg/l, khối

lượng tươi m sẹo tăng xấp xỉ 10 lần và khối lượng kh tăng khoảng 4 – 5 lần so với

nghi m th c bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D. Khối lượng tươi và khối lượng kh củ nghi m

th c bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D lần lượt ạt 77,75 mg và 4,11 mg. Các nghi m th c bổ

sung 2,4-D nồng ộ c o hơn có sự gi tăng kh ng nhiều nhưng khác bi t về mặt thống

k ở các chỉ ti u này so với nghi m th c 0,5 mg/l 2,4-D. K t quả ở nghi m th c bổ

sung 1,0 mg/l và 1,5 mg/l 2,4-D kh ng có khác bi t, với khối lượng tươi ạt lần lượt là

80,44 mg và 81,62 mg, khối lượng kh ạt lần lượt là 5,20 mg và 4,71 mg. (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D lên sự phát sinh hình thái sau 28 ngày nuôi cấy

Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D (mg/l) Khối lƣợng khô (mg) Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ sống (%)

0,0 0,1 0,5 1,0 1,5

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

Khối lƣợng tƣơi (mg) 0,80dx 8,01c 77,75b 80,44a 81,62a * 77,24 0,16e 1,13d 4,11c 5,20a 4,71b * 68,58 0,00c 10,52b 98,40a 97,95a 98,79a * 77,47 20,36d 60,18c 90,30b 93,58a 92,22ab * 41,16 D0 D1 D2 D3 D4 ANOVAy CV%

60

Qu n sát hình thái giải phẫu bằng phương pháp nhuộm kép cetoc rmine và

Ev n’s blue ược sử d ng nhuộm t bào. Các t bào có khả năng phát sinh ph i có

nhân lớn và t bào chất ậm ặc nhuộm màu ỏ sáng mạnh với cetoc rmine. K t quả

cho thấy tr n m i trư ng có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có hi u quả cảm ng sự hình

thành m sẹo có khả năng sinh ph i som cây cọc rào.

Hình 3.2. Hình thái TCL lá s u 28 ngày nu i cấy tr n m i trư ng bổ sung 2,4-D D0. Đối chứng; D1. 0,1mg/l; D2. 0,5 mg/l; D3. 1,0 mg/l; D4. 1,5 mg/l D5. Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (0,5 mg/l) sau 28 ngày được nhuộm bằng acetocarmine và Evan’s Blue để phân biệt tế bào có khả năng sinh phôi.

61

3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và kinetin lên khả năng phát sinh phôi soma

Phương pháp phát sinh ph i từ t bào som ược áp d ng thành c ng tr n cây

cọc rào. Auxin tổng hợp như 2,4˗D ặc bi t hi u quả trong vi c thúc y sự thi t lập

và tăng sinh ph i hơn các loại uxin khác. Trong gi i oạn cảm ng phát sinh ph i từ

m sẹo, các t bào sinh ph i ược cảm ng tạo thành s phân chi và tạo n n các c m

t bào ph i hình cầu. Tuy nhi n, sự phát tri n củ các c m t bào ph i kh ng ược ghi

nhận, số các c m t bào ph i này có hình cầu và kh ng có sự phát tri n ở các gi i

oạn s u (gi i oạn kéo dài, hình thủy l i h y gi i oạn lá mầm). Điều này có th ược

giải thích rằng 2,4-D có tác ộng ối ngh ch nh u trong sự phát sinh ph i som . Khi

bổ sung 2,4-D ở nồng ộ thích hợp vào m i trư ng nu i cấy, các t bào m sẹo tăng

sinh và hình thành các t bào có khả năng sinh ph i, tuy nhi n, 2,4-D lại ngăn cản các

c m t bào ph i hình cầu phát tri n s ng các gi i oạn s u.Vì vậy, trong nghi n c u về

phát sinh hình thái, 2,4-D thư ng ược sử d ng ở các nồng ộ thấp vào gi i oạn khởi

ầu củ quá trình phát sinh m sẹo củ lớp mỏng t bào. Đ kích thích tăng trưởng củ

phôi soma, các c m t bào này cần ược chuy n s ng m i trư ng kh ng có uxin. Khi

m i trư ng nu i cấy thi u uxin, các gen ngăn cản ph i chuy n s ng gi i oạn hình

tim s kh ng bi u hi n ược (Zimmerm n, 1993) [222]. Jh và cộng sự (2007) [89]

ghi nhận m sẹo có khả năng phát sinh ph i ược thu nhận bằng cách nu i cấy mẫu lá

tr n m i trư ng MS có bổ sung 2,0 mg/l KIN. K thừ k t quả thí nghi m 1 và các

nghi n c u về sự phát sinh ph i ở cây cọc rào, thí nghi m này ti p t c nghi n c u ảnh

hưởng củ KIN có hoặc kh ng k t hợp với 2,4-D (0,5 mg/l) l n khả năng sinh ph i

soma từ m sẹo ược cảm ng bởi nu i cấy lớp mỏng t bào lá cây cọc rào trưởng

thành.

S u 8 tuần nu i cấy, k t quả thí nghi m cho thấy 2,4-D và KIN bổ sung vào m i

trư ng nu i cấy với các nồng ộ khác nh u có ảnh hưởng khác nh u l n sự hình thành

ph i từ m sẹo cây cọc rào. Khi bổ sung ri ng l KIN vào m i trư ng nu i cấy, tỷ l

hình thành ph i từ m sẹo ạt tốt nhất ở nồng ộ KIN bổ sung là 1,0 mg/l (79,29%)

với khối lượng tươi thu ược là 60,33 mg. Vi c tăng nồng ộ KIN tr n 1,0 mg/l bổ

sung vào m i trư ng cho thấy tỷ l phát sinh ph i từ m sẹo giảm rõ r t (dưới 50%),

kéo theo ó là khối lượng tươi thu ược chỉ ạt xấp xỉ 1/2 lần so với nghi m th c bổ

sung 1,0 mg/l KIN (27,14 mg và 28,38 mg lần lượt ở nghi m th c bổ sung 1,5 mg/l và

62

2,0 mg/l KIN). K t quả ở bảng 3.2 cũng cho thấy, m i trư ng bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D

k t hợp với 0,5 mg/l KIN cho tỷ l phát sinh ph i từ m sẹo cây cọc rào thấp nhất

(30,43%). nghi m th c k t hợp 0,5 mg/l 2,4˗D và 1,0 mg/l KIN bổ sung vào môi

trư ng, tỷ l phát sinh ph i tăng l n 77,33%. Tỷ l này cũng xấp xỉ so với nghi m th c

bổ sung 1,0 mg/l KIN (79,29%). Khi tăng nồng ộ KIN bổ sung k t hợp với 0,5 mg/l

2,4-D vào m i trư ng nu i cấy, tỷ l hình thành ph i cũng giảm xuống (56,72% và

49,52% lần lượt ở nghi m th c k t hợp bổ sung 1,5 mg/l và 2,0 mg/l KIN). Điều này

cũng xảy r tương tự ở các nghi m th c bổ sung KIN ri ng l có nồng ộ tr n 1,0

mg/l. Qu thí nghi m này, xác nh ược sự k t hợp gi 2,4˗D và KIN có hi u quả

trong vi c cảm ng hình thành ph i từ m sẹo có khả năng phát sinh ph i som cây

cọc rào. Như vậy, m i trư ng khoáng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D và 1,0

mg/l KIN là tốt nhất trong vi c cảm ng hình thành ph i từ m sẹo có khả năng sinh

ph i som cây cọc rào ( ạt 62,95 mg khối lượng tươi với tỷ l hình thành ph i là

77,33%) (Hình 3.3a và Hình 3.3b).

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo

Khối lƣợng tƣơi (g) Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) Kinetin (mg/l) Tỷ lệ hình thành phôi (%)

0,5 0,5 0,5 0,5 - - - - 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 12,86dx 62,95a 50,52b 33,19c 14,52d 60,33a 27,14c 28,38c

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 ANOVAy CV% * 52,08 30,43f 77,33a 56,72b 49,52c 41,33e 79,29a 46,76d 44,67d * 30,89

M sẹo hình thành tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D và 1,0 mg/l

KIN ược giải phẫu và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép cetoc rmine và Ev n’s

blue (Gupta và Holmstrom, 2005) [74]. Các t bào có khả năng phát sinh ph i có nhân

lớn và t bào chất ậm ặc khi nhuộm bắt màu ỏ sáng mạnh với cetoc rmine (Hình

3.3c). Các t bào nằm trong khối m sẹo kh ng phát sinh ph i có hạch nhân rất nhỏ

63

n n nh ng vật li u b n trong t bào ược nhuộm ỏ bởi cetoc rmine rất khó ược

phát hi n trong khi toàn bộ t bào bắt màu x nh củ ph m nhuộm Ev n’s blue (Hình

3.3d).

Hình 3.3. Hình thái khối m sẹo và ph i a. Hình thái khối mô sẹo và phôi soma cây cọc rào trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (0,5 mg/l) và KIN (1,0 mg/l); b. Hình thái khối mô sẹo và phôi soma cây cọc rào trên môi trường MS có bổ sung KIN (1,0 mg/l); c, d. Mô sẹo được nhuộm bằng acetocarmine và Evan’s Blue để phân biệt tế bào có khả năng sinh phôi

K t quả cho thấy, khi bổ sung k t hợp hoặc ri ng l 2,4˗D và KIN ở các nồng ộ

khác nhau, ph i phát sinh tr n tất cả các nghi m th c với tỷ l mẫu phát sinh ph i và

khối lượng tươi củ ph i hình thành tr n mẫu là khác nh u (Bảng 3.2). Tỷ l m sẹo

phát sinh ph i c o nhất ược ghi nhận tr n m i trư ng bổ sung ri ng l 1,0 mg/l KIN

(79,29%) và m i trư ng bổ sung k t hợp 0,5 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l KIN (77,33%).

K t quả ghi nhận về hình thái ch ng minh sự hi n di n củ uxin ri ng l h y uxin

k t hợp với một cytokinin là cần thi t cho sự thành lập các t bào h y nhóm các t bào

có khả năng sinh ph i. Tuy nhi n, uxin lại cản trở sự sinh ph i ở các gi i oạn ti p

theo củ quá trình phát sinh ph i (gi i oạn ph i hình tim, hình thuỷ l i, lá mầm).

64

Trong thí nghi m này k t quả ghi nhận ược ở nh ng m i trư ng có bổ sung 2,4˗D,

m sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng lá chỉ hình thành nh ng ph i hình cầu, kh ng ti n n

gi i oạn hình thành và phát tri n ở nh ng gi i oạn ti p theo củ ph i. Mẫu cấy tr n

m i trư ng bổ sung 1,0 mg/l KIN ạt tỷ l c o về số m sẹo phát sinh phôi (79,29%)

và phôi soma phát tri n qu nhiều gi i oạn: dạng cầu, dạng tim, dạng thủy l i và dạng

lá mầm.

Vi c sử d ng cytokinin ri ng l tạo ph i v tính từ ph i hợp tử non cũng ạt

ược nh ng thành c ng tr n các loài, b o gồm cả thực vật hạt kín và hạt trần. Kum ri

và J iw l (1998) nhận thấy rằng vi c sử d ng cytokinin ri ng l có tác d ng kích thích

phát sinh phôi soma cây Terminalia arjuna [103]. Cytokinin kích thích quá trình phân

chi t bào mà kh ng b kìm h m bởi các t bào xung qu nh. Bản chất củ quá trình

phân chi t bào có ý nghĩ quy t nh, chỉ có sự phân chi song song hoặc xi n là dẫn

n sự hình thành ph i v tính. Mặt khác, vi c bổ sung cytokinin trong suốt gi i oạn

bi t hó có th bù ắp cho nh ng bất lợi mà uxin gây r l n sự phát tri n củ m phân

sinh (Dương Tấn Nhựt, 2007) [12]. Ph i cây ậu nành khi ch u tác ộng củ cytokinin

thì phát tri n mạnh hơn, trong khi ó, m phân sinh ỉnh ti p t c kéo dài tạo n n v số

chồi. K limuthu và cộng sự (2007) k t luận rằng, ph i som cũng ược cảm ng tr n

m i trư ng chỉ ch cytokinin ri ng l chẳng hạn như BAP [93].

3.2. Khảo sát khả năng tăng sinh, sự biệt hóa và trƣởng thành của nguồn mô sẹo

có khả năng sinh phôi: ảnh hƣởng của một số nồng độ acid amine và spermidine

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma

Hầu h t các quá trình phát tri n ở thực vật ược iều khi n bởi các hormon thực

vật. Sự cảm ng tạo ph i v tính cũng ược ki m soát bằng cách iều khi n các thành

phần củ chất iều hò sinh trưởng trong m i trư ng nu i cấy. Ngoài r vi c bổ sung

các amino cid ngoại sinh vào m i trư ng nu i cấy ược báo cáo là có tác d ng

thúc y sự phát sinh ph i v tính ở một số loài thực vật (W ng và cộng sự, 2002)

[214]. Amino cid là một nguồn nitơ h u cơ (dạng khử) ược chuy n hó rất nh nh

trong t bào thực vật, kích thích t bào sinh trưởng và phát tri n nh nh hơn (Grimes và

Hodges, 1990) [72]. Song nhu cầu ở các loài thực vật khác nh u về các chất bổ sung

và thành phần củ các chất iều hò sinh trưởng cũng khác nh u.

65

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma

Số phôi/mẫu Khối lƣợng tƣơi (mg) Proline (mg/l)

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

11,66cx 45,07b 47,87b 72,33a 50,70b * 45,42 13,00c 50,07b 52,83b 81,37a 56,80b * 45,42 Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%) 23,33d 50,00c 60,00bc 86,67a 66,67b * 38,71 0 250 500 750 1000 ANOVAy CV%

Trong thí nghi m này, các m sẹo có khả năng phát sinh ph i ược cấy chuyền

vào m i trư ng có bổ sung proline ở các nồng ộ khác nh u. S u 4 tuần nu i cấy, k t

quả thí nghi m cho thấy có sự khác bi t áng k về mặt thống k gi các nghi m th c

sử d ng proline và nghi m th c ối ch ng. nghi m th c ối ch ng khi kh ng bổ

sung proline, số lượng ph i hình thành trung bình ạt 11,66 ph i và tỷ l tạo ph i ạt

23,33%. Các nghi m th c còn lại có bổ sung proline vào m i trư ng nu i cấy, qu các

chỉ ti u khảo sát cho thấy sự hi n di n củ proline giúp gi tăng hi u quả tạo ph i ở tất

cả các chỉ ti u theo dõi và cả khối lượng tươi củ mẫu. nghi m th c có nồng ộ 250

mg/l proline, tỷ l hình thành ph i ạt 50,00%, tăng hơn gấp i so với nghi m th c

ối ch ng. Số lượng ph i hình thành tăng l n hơn 4 lần (45,07 ph i/mẫu) so với ối

ch ng. Khối lượng tươi củ mẫu cấy cũng tăng l n ạt 50,07 mg/mẫu. Khi ti p t c gi

tăng hàm lượng proline l n, các chỉ ti u theo dõi cũng có sự gi tăng và ạt c o nhất ở

nghi m th c có thành phần proline bổ sung là 750 mg/l với tỷ l hình thành phôi là

86,67%, số lượng ph i hình thành là 72,33 ph i/mẫu và khối lượng tươi là 81,37 mg

(Bảng 3.3; Hình 3.4). Các chỉ ti u ghi nhận ược ở nghi m th c này ều có sự khác

bi t về mặt thống k so với các nghi m th c còn lại. nghi m th c bổ sung 1000 mg/l

proline, số li u ghi nhận cho thấy có sự giảm i ở tất cả các chỉ ti u theo dõi so với

nghi m th c bổ sung 750 mg/l proline. Nồng ộ proline c o c ch sự hình thành ph i

th hi n khi tỷ l ph i hình thành giảm còn 66,67%, giảm 20% so với nghi m th c

trước ó. Số lượng ph i hình thành (50,70 ph i) và khối lượng tươi củ mẫu (56,80

mg) cũng chỉ ạt khoảng 2/3 so với nghi m th c bổ sung 750 mg/l proline.

66

Nhìn chung, k t quả thí nghi m cho thấy proline có tác ộng hi u quả ối với sự

hình thành phôi som từ mẫu cấy m sẹo có khả năng phát sinh ph i củ cây cọc rào.

Kh ng chỉ giúp gi tăng sự tạo ph i, sự gi tăng khối lượng tươi củ mẫu ở tất cả các

nghi m th c có bổ sung proline cũng cho thấy proline có hi u quả kích thích sự tăng

trưởng ở ây là sự gi tăng sinh sinh khối mẫu cấy.

Proline là một trong nh ng cid mine ược bi t n là có ảnh hưởng n sự kích

thích phát sinh ph i (Shimizu và cộng sự, 1997) [167]. Proline ri ng l h y k t hợp với

các cid mine khác có tác d ng kích thích phát sinh ph i ở các loại thực vật khác

nh u như trong trư ng hợp cây Đậu x nh và Đậu nành, ph i som chỉ hình thành tr n

m i trư ng có bổ sung proline (Shetty và cộng sự, 1993) [165]. Proline ược xem như

là nguồn nitơ khử qu n trọng ược chuy n hó và hấp th rất nh nh trong t bào thực

vật, ngoài r proline còn ược xem như là một nguồn năng lượng sẵn có cho t bào.

B n cạnh ó, proline còn có ch c năng qu n trọng khác như là bảo v các enzyme

chống lại sự suy thoái, iều khi n nồng ộ cid trong cytosol. Nồng ộ củ proline có

tác d ng như là một chất m b n trong t bào chất, chống lại sự gi tăng nồng ộ các

ion trong kh ng bào, có ch c năng như một chất iều khi n cấu trúc củ nước, làm

tăng tính t n củ protein và các phân tử sinh học khác dưới iều ki n th nước giảm

(Schobert, 1977) [159]. S ntos và cộng sự (1996) phát hi n rằng vi c bổ sung

proline m ng lại hi u quả rõ ràng tr n tổng số lượng protein củ m sẹo phát sinh ph i

[156]. Báo cáo nhận nh sự có mặt củ proline trong m i trư ng nu i cấy có v như

áp ng ược các iều ki n stress, giảm i n th nước trong m i trư ng nu i cấy t

bào thực vật, tăng sự tích t các chất dinh dưỡng trong t bào và cuối cùng tăng khả

năng phát sinh ph i som .

Trong nh ng báo cáo trước ó, proline ược phát hi n ư r nh ng phản hồi tối

ưu nhất trong sự phát sinh ph i som cả sơ cấp và th cấp tr n cây Ho hồng

(M rch nt và cộng sự, 1996) [120]. Báo cáo khác cũng ề cập n nh ng v i trò rõ

ràng củ proline l n sự phát sinh ph i ở cây Ng (Supr s nn và cộng sự, 1994) [185]

và cây K (Vikr nt và R shis, 2002) [210]. Khi nu i cấy tạo ph i Sâm Ngọc Linh,

Nhut và cộng sự (2012) nhận thấy nồng ộ proline tối ưu là 300 mg/l [137]. Trong khi

ó tr n ối tượng cây Dâu tây thì nồng ộ proline là 0,5 g/l cho hi u quả tạo ph i tốt

nhất (Bisw s và cộng sự, 2007) [26]. Murch và cộng sự (1999) nghi n c u tr n ối

67

tượng cây Đậu phộng thì thấy rằng 100 mg/l proline là nồng ộ thích hợp tạo ph i

[132]. Tr n ối tượng cây Cà rốt cũng ược cảm ng tạo ph i hi u quả ở nồng ộ này

(Victori và cộng sự, 1984) [209]. Điều này ch ng minh proline có tác ộng tích cực

ối với sự tạo ph i nhưng ở m i loài thực vật khác nh u thì proline có tác d ng ối với

sự cảm ng tạo ph i với các nồng ộ khác nh u. Theo báo cáo này thì ối với mẫu cấy

là mô sẹo có khả năng phát sinh ph i cây cọc rào, nồng ộ proline thích hợp cảm ng

tạo ph i là 750 mg/l.

3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma

Số phôi/mẫu Khối lƣợng tƣơi (mg) Glutamine (mg/l)

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

0 50 100 150 200 ANOVAy CV% 11,66cx 33,13c 46,40b 67,60a 48,23b * 46,72 Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%) 23,33d 53,33c 70,00b 83,33a 63,33bc * 36,93 13,10c 38,10b 52,87b 104,30a 54,00b * 68,39

Trong thí nghi m này, m sẹo có khả năng phát sinh ph i ược cấy vào m i

trư ng MS cảm ng phát sinh ph i, có bổ sung glut mine ở các nồng ộ từ 50 n 200

mg/l. S u 4 tuần nu i cấy, ở tất cả các nghi m th c qu n sát thấy có sự xuất hi n củ

ph i som cây cọc rào dạng hình cầu. S u ó, có sự xuất hi n củ các dạng ph i hình

tim, hình thủy l i và h i lá mầm. Tuy nhi n, có sự khác bi t áng k về mặt thống k

gi các nghi m th c. nghi m th c ối ch ng, mẫu cấy có tỷ l hình thành ph i

thấp hơn so với các nghi m th c có bổ sung glut mine. Các mẫu ược cấy tr n m i

trư ng có bổ sung glut mine ở các nồng ộ khác nh u (từ 50 ˗ 150 mg/l) ạt tỷ l hình

thành ph i c o tr n 50%. Trong ó nghi m th c có bổ sung 150 mg/l glutamine cho

hi u quả tạo ph i c o nhất với tỷ l hình thành ph i là 83,33%, số lượng ph i hình

thành là 67,60 ph i và khối lượng tươi củ ph i là 104,30 mg (Bảng 3.4; Hình 3.5).

Nhưng ở nồng ộ glut mine tăng quá c o (200 mg/l) thì các chỉ ti u giảm xuống, lúc

này sự tăng nồng ộ glut mine trong m i trư ng nu i cấy làm c ch sự phát sinh ph i

68

soma. K t quả cho thấy tỷ l ph i hình thành giảm 20% so với nghi m th c trước ó

và ạt 63,33%. Khối lượng tươi giảm gần ½ so với nghi m th c bổ sung 150 mg/l

lgut mine còn 54,00 mg và số ph i hình thành trung bình là 48,23 ph i/mẫu.

Trong nghi n c u củ El-Shiaty và cộng sự (2004) [56] tr n cây cọ dầu, k t quả

cũng cho thấy có sự khác bi t áng k gi nghi m th c ối ch ng và các nghi m th c

sử d ng glut mine. Các nghi m th c sử d ng glut mine có số ph i hình thành c o hơn

(từ 1,00 n 3,33 ph i) so với nghi m th c ối chúng (0,33 ph i). Nồng ộ glut mine

tối ưu cho sự phát sinh ph i som ở loài cây này là 100 mg/l, số ph i ạt 3,33

ph i/mẫu. Tương tự, theo nghi n c u củ V ris i và cộng sự (2004) [207] tr n ối

tượng cây Đậu (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc.) thì nồng ộ glut mine tối ưu

bổ sung vào m i trư ng nu i cấy cảm ng tạo ph i som là 100 mg/l, ở nồng ộ

này tỷ l ph i hình cầu ạt 32,6%, ph i hình tim ạt 21,2%, ph i hình thủy l i 18,2,

ph i dạng lá mầm ạt 12,8%. B n cạnh ó, Finer và N g s w (1988) [62]; Tetu và

cộng sự (1990) [190] cũng cho thấy ảnh hưởng áng k củ glut mine l n nu i cấy

huyền phù củ cây ậu nành.

Vi c bổ sung glut mine vào m i trư ng nu i cấy cảm ng sinh ph i ược

nghi n c u ở nhiều loại thực vật (Kopertekh và Stribnaya, 2003) [99]. Glut mine h

trợ sự sinh trưởng củ nh ng t bào có nhu cầu năng lượng c o và cần tổng hợp một

lượng lớn protein và cid nucleic. Glut mine là một trong nh ng cid mine sẵn có

nhất làm nguồn tạo năng lượng cho t bào và nó cũng là nguồn năng lượng chính

cho nhiều loại t bào phân chi với tốc ộ c o trong nu i cấy in vitro (Sara và Khaled,

2011) [157]. Glut mine ược sử d ng trong nhiều con ư ng sinh tổng hợp khác nh u

tr n nhiều cơ qu n khác nh u củ thực vật trong nh ng th i kỳ sinh trưởng khác nh u.

Glut mine óng một v i trò qu n trọng trong sự tăng nh nh và phát tri n m sẹo phát

sinh ph i tr n ối tượng cây Cryptomeria japonica (Ogita, 2001) [143].

Trong nghi n c u này, glut mine ở nồng ộ 150 mg/l là thích hợp cho sự phát

sinh ph i cây cọc rào. Điều này cũng cho thấy, tùy từng loại cây khác nh u mà nồng

ộ glut mine sử d ng thì khác nh u, cây cọc rào cần nồng ộ c o cảm ng tạo ph i.

3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành phôi soma

S u 4 tuần nu i cấy, m sẹo tr n m i trư ng có bổ sung denine sulph te ở các

nồng ộ từ 50 ˗ 200 mg/l nhận thấy có sự xuất hi n các ph i som , các chỉ ti u ghi

69

nhận ều có sự gi tăng giá tr so với nghi m th c ối ch ng kh ng có bổ sung

denine sulph te. Khi tăng dần nồng ộ denine sulph te từ 50 l n 150 mg/l thì tỷ l

mẫu tạo ph i, số lượng ph i hình thành và khối lượng tươi củ ph i ều tăng dần và

ạt c o nhất ở nồng ộ 150 mg/l (Bảng 3.5; Hình 3.6). Nghi m th c bổ sung 50 mg/l

denine sulph te có tỷ l tạo ph i là 46,67% khác bi t với nghi m th c kh ng bổ sung

denine sulph te, nhưng ở chỉ ti u còn lại là số lượng ph i (29,07 ph i) và khối lượng

tươi (33,50 mg) lại kh ng có khác bi t so với nghi m th c ối ch ng. Khi ti p t c tăng

nồng ộ denine sulph te l n 100 mg/l thì ồng th i cũng có sự gi tăng có ý nghĩ ở

tất cả các chỉ ti u. Nghi m th c bổ sung 150 mg/l denine sulph te cho k t quả tốt

nhất ở các nghi m th c khảo sát trong thí nghi m với số li u c th là 76,67% mẫu cấy

hình thành ph i với số ph i trung bình 52,43 ph i/mẫu và khối lượng tươi củ mẫu là

59,00 mg, khác bi t có ý nghĩ so với các nghi m th c còn lại. Khi nồng ộ denine

sulph te bổ sung tăng l n 200 mg/l thì các chỉ ti u giảm xuống với tỷ l hình thành

ph i là 53,33%, số lượng ph i hình thành trung bình là 39,27 ph i/mẫu và khối lượng

tươi là 44,37 mg, các k t quả này kh ng có khác bi t về thống k so với nghi m th c

bổ sung 100 mg/l denine sulphate.

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

Khối lƣợng tƣơi (mg) 13,10c 33,50c 47,23b 59,23a 44,37b * 41,82 Số phôi/mẫu 11,66cx 29,07c 41,40b 52,43a 39,27b * 42,15 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành phôi soma Tỷ lệ hình Adenine sulphate thành phôi/mẫu (%) (mg/l) 23,33d 0 46,67c 50 63,33b 100 76,67a 150 53,33bc 200 ANOVAy * 36,22 CV%

Adenine sulph te ược ch ng minh có tác d ng hoạt hó cytokinin và ược

th m vào m i trư ng nu i cấy gi tăng sự sinh trưởng hoặc gi tăng hoạt ộng củ

cytokinin trong m i trư ng nu i cấy. Adenine kích thích sự phát sinh ph i som , phát

sinh cơ qu n, gi tăng sự sinh trưởng củ các ỉnh m phân sinh bi t lập, b o gồm sự

tăng nh nh củ chồi nách trong nu i cấy chồi và kích thích phát sinh chồi bất nh

gián ti p từ m sẹo h y trực ti p từ mẫu cấy (V n St den và cộng sự, 2008) [205].

Adenine sulph te thư ng ược chú ý khi ược k t hợp với mmonium nitr te hoặc với

70

cytokinin như BAP hoặc KIN (V n St den và cộng sự, 2008) [205]. Một ặc tính n

về hoạt ộng củ denine sulph te như là một chất h trợ các cytokinin như KIN và

zeatin (V n St den và cộng sự, 2008) [210]. Adenine sulph te ược sử d ng trong

nu i cấy in vitro giúp tăng nh nh số lượng chồi ở cây u ủ (S h và cộng sự, 2004)

[155] và cây Uraria picta (An nd và cộng sự, 1998) [23]. Tr n ối tượng cây Ti u en

(Piper nigrum), Philip và cộng sự (1992) chỉ ra rằng denine sulph te làm tăng số

lượng chồi trên một mẫu [148]. Delg do˗S nchez và cộng sự (2006) báo cáo rằng vi c

sử d ng adenine sulphate ở nh ng nồng ộ khác nh u cũng tạo ra sự tăng nh nh trong

nuôi cấy c m chồi tr n h i loài Đậu [49].

Như vậy, denine sulph te khi bổ sung vào m i trư ng nu i cấy có tác ộng kích

thích sự tạo ph i từ m sẹo cây cọc rào. K t quả thí nghi m cho thấy, nồng ộ 150

mg/l denine sulph te thích hợp nhất cho cảm ng phát sinh ph i som và nâng c o

tần suất phát sinh phôi soma th ng qu nu i cấy m sẹo cây cọc rào.

3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi soma

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi soma

Số phôi/mẫu Khối lƣợng tƣơi (mg) Spermidine (mg/l)

11,67d 63,37c 102,70a 81,27b 61,13c Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%) 23,33e 76,67c 100,00a 90,00b 70,00d 13,40d 71,73c 113,90a 91,20b 67,47c

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

* 48,83 * 39,00 * 50,55 0,00 0,01 0,03 0,05 0,07 ANOVAy CV%

K t quả ở bảng 3.6 cho thấy có sự khác bi t áng k về mặt thống k gi các thí

nghi m. Tr n m i trư ng có bổ sung spermidine, tỷ l hình thành ph i củ các mẫu

cấy c o hơn so với m i trư ng kh ng bổ sung spermidine, spermidine ở nồng ộ 0,03

mg/l cho hi u quả c o nhất với tỷ l phát sinh ph i ạt 100%, số lượng ph i hình thành

là 102,70 ph i và khối lượng tươi trung bình là 113,90 mg. Tuy nhi n, khi tăng nồng

ộ spermidine l n c o từ 0,05 mg/l n 0,07 mg/l thì tỷ l hình thành ph i, số lượng

ph i cũng như khối lượng tươi trung bình củ ph i giảm xuống (Bảng 3.6; Hình 3.7).

71

Một số nghi n c u chỉ r sự cần thi t củ PA ở nh ng dạng tự do ặc hi u

trong sự phát sinh ph i v tính. Kevers và cộng sự (2000) khẳng nh vi c sử d ng

poly mine trong m i trư ng nu i cấy m ng lại hi u quả và có ý nghĩ qu n trọng

trong gi i oạn phát sinh ph i ở thực vật [97]. Spermidine (Spd) là PA m ng tính ặc

hi u hơn ược dùng cho sự phát sinh ph i v tính từ m t bào Cà rốt (Feirer và cộng

sự, 1985) [60], Vigna (Kaur-S whney và cộng sự, 1988) [95], Hevea (Hadrami và

D’Auz c, 1992) [77], trong suốt các gi i oạn cảm ng củ mảnh cấy cỏ Đinh lăng

(Cvikrová và cộng sự, 1999) [43]. Các tác giả cũng khẳng nh ược v i trò củ

PA, ặc bi t là Spd trong sự phát sinh ph i v tính cây Panax ginseng (Monteiro và

cộng sự, 2002) [128]. Trong nghi n c u này, v i trò củ PA trong phát sinh phôi vô

tính từ m sẹo và nâng c o tần suất phát sinh ph i ở cây cọc rào cũng ược th hi n.

Poly mine có khối lượng phân tử nhỏ, ược tìm thấy ở tất cả các cơ qu n củ

thực vật. Poly mine có nhiều hoạt tính sinh học và có v i trò qu n trọng trong quá

trình sinh trưởng, phát tri n củ thực vật. thực vật, polyamine ược xem là nguồn

nitơ và ược tìm thấy ở tất cả các cơ qu n củ thực vật. Poly mine có cấu trúc là một

mạch thẳng có C3˗C15. Một số poly mine ược bi t như: putrescine, spermine và

spermidine.

PA óng v i trò qu n trọng trong sự bi t hó t bào hình thành ph i (R j m,

1997) [153]. Tuy nhi n, cơ ch chính xác củ nó thì chư ược bi t và hi u một cách

rõ ràng và n bây gi vẫn còn ược ti p t c nghi n c u. Khi PA ở nồng ộ c o s

giúp cho t bào lớn l n và phân chi . Hơn th n , PA ở nồng ộ c o giúp cho t bào

m phân sinh phân chi nh nh. Trong gi i oạn cảm ng ph i, PA s giúp cho t bào

vùng m phân sinh phân chi nh nh chóng và giúp cho ph i ược hình thành (Kevers

và cộng sự, 2000) [97]. Điều này cũng ược ch ng minh trong nghi n c u cây cọc

rào, khi nu i cấy m sẹo có khả năng phát sinh ph i tr n m i trư ng có bổ sung

spermidine với nồng ộ khác nh u. K t quả s u 4 tuần nu i cấy, các m sẹo ược cảm

ng hình thành ph i rất nh nh. Tr n bề mặt m sẹo xuất hi n nh ng ph i hình cầu nhỏ

và số lượng ph i tăng dần l n.

72

Hình 3.4. Ảnh hưởng củ proline l n sự hình thành ph i som a. Mẫu ban đầu; b. Mẫu đối chứng; c. Nồng độ 250 mg/l; d. Nồng độ 500 mg/l; e. Nồng độ 750 mg/l; f. Nồng độ 1000 mg/l

73

a. Mẫu ban đầu; b. Mẫu đối chứng; c. Nồng độ 50 mg/l; d. Nồng độ 100 mg/l;

e. Nồng độ 150 mg/l; f. Nồng độ 200 mg/l

Hình 3.5. Ảnh hưởng củ glut mine l n sự hình thành ph i som

74

Hình 3.6. Ảnh hưởng củ denine sulph te l n sự hình thành ph i som a. Mẫu ban đầu; b. Mẫu đối chứng; c. Nồng độ 50 mg/l; d. Nồng độ 100 mg/l; e. Nồng độ 150 mg/l; f. Nồng độ 200 mg/l

75

Hình 3.7. Ảnh hưởng củ spermidine l n sự hình thành ph i som a. Mẫu ban đầu; b.Mẫu đối chứng; c. Nồng độ 0,01 mg/l; d. Nồng độ 0,03 mg/l; e. Nồng độ 0,05 mg/l; f. Nồng độ 0,07 mg/l

76

3.2.5. Đánh giá tổng hợp ảnh hưởng của các acid amine và spermidine lên sự hình

thành phôi vô tính cây cọc rào

Hình 3.8. Sơ ồ tương tác củ denine, glutamine, proline và spermidine

K t quả ánh giá thành phần chính (Princip l component n lysis - PCA) dự

tr n số li u trung bình cho thấy tỷ l nảy mầm, số lượng ph i củ mẫu cấy tr n các

m i trư ng có bổ sung proline, glut mine, denine, spermidine với các nồng ộ khác

nhau thì khác nhau. Trong k t quả phân tích ở hình 3.8 có sự hình thành b nhóm

chính: Nhóm 1: Các mẫu ược nu i cấy tr n m i trư ng kh ng có bổ sung cid mine

và spermidine có tỷ l hình thành ph i và số ph i trung bình tr n mẫu thấp hơn so với

các nghi m th c còn lại; Nhóm 2: Các mẫu cấy ược nu i cấy tr n m i trư ng bổ sung

denine, proline, spemidine (loại trừ nồng ộ 0,03 mg/l) và glut mine (loại trừ nồng ộ

150 mg/l) có tác ộng l n sự hình thành ph i là như nh u; Nhóm 3: Các mẫu cấy tr n

m i trư ng có bổ sung spermidine ở nồng ộ 0,03 mg/l và glut mine ở nồng ộ 150

mg/l có tác ộng tối ưu l n sự hình thành ph i

Amino cid thư ng ược sử d ng trong các h thống phát sinh ph i v tính

cải thi n cả về số lượng và chất lượng củ ph i v tính (Stu rt và Strickl nd, 1984)

[180]. Một số cid mine thư ng ược sử d ng trong nu i cấy m như là denine

sulph te, proline, glut mine. Trong ó, glut mine dư ng như các tác ộng áng k n

77

sự hình thành ph i. Nghi n c u này cho thấy các mẫu cây cọc rào khi nu i cấy tr n

môi trư ng có glut mine thì tỷ l hình thành ph i tăng c o và ạt c o nhất tr n m i

trư ng có bổ sung 150 mg/l glut mine. cỏ linh lăng thì vi c bổ sung glut mine với

hàm lượng là 50 mM làm tăng kích thước củ ph i, tăng vi c tích luỹ protein và s c

sống củ cây con có nguồn gốc từ ph i v tính (L i và McKersie, 1993) [105]. Nh ng

tác giả này cũng ề ngh rằng glut mine kh ng nh ng có v i trò như là chất dinh

dưỡng cần thi t cho ph i v tính bằng cách cung cấp một nhóm các mino cid khử

cho quá trình sinh tổng hợp các mino cid khác mà còn có v i trò li n qu n n sự

iều khi n quá trình phi n m và d ch m củ các gene tổng hợp protein dự tr . Amino

cid làm tăng ph m chất (hàm lượng protein và trọng lượng kh ) củ cây con có

nguồn gốc từ ph i v tính chỉ r rằng vi c thúc y sự trưởng thành v mặt hình thái

và sinh lý củ ph i v tính dẫn n làm tăng s c sống củ cây con có nguồn gốc từ

ph i v tính. Các mino cid b o gồm: glut mine, l nine, proline hoặc rginine tại

nồng ộ là 30 mM trong m i trư ng tái sinh củ cỏ linh lăng làm tăng năng suất, trọng

lượng kh và tần số bi n ổi củ ph i v tính thành cây con (Stu rt và cộng sự, 1984)

[178]. Glut mine bắt nguồn từ sự ồng hoá nitơ ược bi t như là một chì khoá chính

iều khi n quá trình ồng hoá ở thực vật bậc c o (W llsgrove, 1995) [213]. Glut mine

ược sử d ng trong các con ư ng chuy n hoá khác nh u trong các bộ phận khác nh u

củ thực vật tại các gi i oạn phát tri n khác nh u. Trong nu i cấy m thực vật,

glut mine cũng ược thừ nhận là một hợp chất có hi u quả mà nó hi n di n trong quá

trình sinh trưởng củ m thực vật in vitro. Ví d , glut mine ngoại sinh và/hoặc nội

sinh óng v i trò qu n trọng trong quá trình tăng sinh và phát tri n củ m phát sinh

ph i ở Cryptomeria japonica (Ogit và cộng sự, 2001) [143]. Glut mine trong m sẹo

củ P. nigra óng v i trò qu n trọng trong quá trình phát sinh cơ qu n.

Trong nghi n c u này, b n cạnh glut mine thì spermidine là một nhân tố tối ưu

ảnh hưởng n sự hình thành ph i ở cây cọc rào. Spermidine là một loại poly mine,

thực chất là một dạng chu i củ cid mine và nó ược xem như là một chất iều hò

sinh trưởng. Do ó, v i trò củ spermidine trong quá trình phát sinh ph i cũng ược

khảo sát trong nghi n c u này. hình 3.8, b n cạnh m i trư ng có bổ sung 150 mg/l

glut mine, các mẫu ược nu i cấy tr n m i trư ng có bổ sung 0,03 mg/l spermidine

cũng tác ộng tối ưu l n sự hình thành ph i. Poly mine óng v i trò qu n trọng trong

78

sự bi t hó t bào hình thành ph i (R j m, 1997) [150]. Tuy nhi n n n y, cơ ch

chính xác củ nó thì chư ược bi t và hi u một cách rõ ràng và vẫn còn ược ti p t c

nghi n c u. Khi poly mine ở nồng ộ c o s giúp cho t bào lớn l n và phân chi .

Spermidine ở nồng ộ c o giúp cho t bào m phân sinh phân chi nh nh. Trong gi i

oạn cảm ng ph i, spermidine s giúp cho t bào vùng m phân sinh phân chi nh nh

chóng và giúp cho ph i ược hình thành. Tuy nhi n, n u nồng ộ spermidine quá c o

h y giảm i có th s làm giảm sự hình thành ph i.

Nh ng cid mine ược sử d ng trong nh ng thí nghi m này (proline, glut mine,

denin sulph te) và spermidine ều có cảm ng mạnh tăng cư ng khả năng hình thành

ph i v tính từ m sẹo có khả năng sinh ph i so với nh ng ghi nhận chỉ bổ sung KIN

trong m i trư ng nu i cấy. Khi so sánh nh ng khả năng cảm ng hình thành ph i v

tính từ m sẹo tốt nhất củ từng cid min sử d ng (proline, glut mine, denin

sulphate) và spermidine, chúng t i cũng ghi nhận ược glut mine và spemindine có

tính ặc hi u và hi u quả hơn. Tuy nhi n, spermidine là hó chất rất ắt tiền, vì vậy,

tùy vào iều ki n nghi n c u và ng d ng có th sử d ng nh ng cid mine th ng

d ng tr n (proline, glut mine, denin sulph te) cho phù hợp.

Như vậy, k t luận chung cho các thí nghi m khảo sát ảnh hưởng củ các cid

amine và spermidine cho thấy k t quả m i trư ng có bổ sung spermidine ở nồng ộ

0,03 mg/l hoặc glut mine ở nồng ộ 150 mg/l có tác ộng tối ưu l n sự hình thành

ph i som cây cọc rào.

3.3. Khảo sát khả năng tái sinh, phát triển thành cây con hoàn chỉnh của phôi

soma

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh

từ phôi soma

Trong thí nghi m này, các cây con hình thành từ ph i som nu i cấy in vitro

ược cấy chuyền vào các m i trư ng khoáng khác nh u. Tr n tất cả các m i trư ng

nu i cấy, tỷ l hình thành rễ củ cây con từ ph i soma ạt từ 79,95% n 100%. Tr n

m i trư ng B5, tỷ l hình thành rễ cũng như các chỉ ti u khác ều ạt c o hơn và khác

bi t có ý nghĩ thống k so với các nghi m th c còn lại. Cây con có sự hình thành rễ

ạt 100% và phát tri n tốt hơn so với các m i trư ng khoáng khác với số lượng rễ

(4,07 rễ/mẫu), chiều dài rễ (2,02 cm/mẫu), khối lượng rễ (17,53 mg/mẫu) và chiều c o

79

cây con (2,38 cm/mẫu) ạt c o nhất (Bảng 3.7; Hình 3.9 và Hình 3.10). M i trư ng

MS và WPM cũng cho thấy có hi u quả trong vi c thúc y sự hình thành rễ và phát

tri n củ cây con.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh

từ phôi soma

Tỷ lệ hình thành rễ (%)

Khối lƣợng rễ (mg) 2,83e 13,29b 17,53a 10,37d 11,70c 79,95d 93,33b 100,00a 86,67c 93,33b

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤0,05.

Số lƣợng rễ 1,00dx 3,33b 4,07a 2,87c 3,07c * 36,93 Chiều dài rễ (cm) 0,54e 1,57b 2,02a 1,28d 1,44c * 36,52 * 44,73 Chiều cao cây (cm) 1,29d 2,13a 2,38a 2,11b 1,93c * 19,34 * 8,12 MT khoáng 1/2MS MS B5 WHITE WPM ANOVAy CV%

Một số nghi n c u cho thấy hi u quả củ thành phần m i trư ng khoáng l n sự

tái sinh cây tr n nh ng loài thực vật khác nh u (K i và cộng sự, 2008) [92]. Môi

trư ng MS, B5 và WPM là 3 loại m i trư ng khoáng th ng d ng nhất ược sử d ng

rộng r i trong nu i cấy tái sinh cây tr n nhiều loài thực vật, ặc bi t tr n các loài cây

thân g . Trong thí nghi m này, m i trư ng B5, MS và WPM ều cho tỷ l hình thành

rễ c o và sự phát tri n củ cây con hoàn chỉnh kho mạnh. K t quả này cũng tương tự

như c ng bố củ Mor dkh ni (2012) [129] tr n loài cây Melissa officinalis L., Zhang

và cộng sự, (2004) tr n h i ối tượng cây Isatis indigotica. K t quả cho thấy ở các

nghi n c u này khi nu i cấy tr n 3 m i trư ng MS, B5 và WPM ều cho tỷ l tái sinh

cây cao [221].

Cây hình thành từ ph i som sử d ng nguồn năng lượng ược cung cấp từ m i

trư ng nu i cấy, khác với cây nảy mầm từ hạt sử d ng nguồn năng lượng b n ầu cho

hoạt ộng nảy mầm từ nội nhũ. Vì vậy dinh dưỡng m i trư ng óng v i trò qu n trọng

ối với sự hình thành cây từ ph i som . Chính vì vậy, m i trư ng 1/2MS có sự giảm

áng k thành phần các chất khoáng thi t y u cho cây th hi n kh ng phải là m i

trư ng thích hợp tái sinh cây th ng qu các chỉ ti u theo dõi ều thấp hơn các

nghi m th c khác cùng khảo sát. Photpho là y u tố dinh dưỡng qu n trọng ở gi i doạn

cây con, ở các m i trư ng khảo sát MS, B5, WPM có sự tương ồng về hàm lượng

80

tổng photpho, c o nhất là ối với m i trư ng White có hàm lượng gần gấp i so với

các m i trư ng còn lại. Nghi m th c m i trư ng White cũng là nghi m th c kh ng

cho thấy là m i trư ng thích hợp tái sinh cây từ ph i cọc rào bởi nghi m th c này

có các chỉ ti u chiều dài rễ, khối lượng rễ thấp hơn các nghi m th c cùng khảo sát, chỉ

c o hơn nghi m th c sử d ng m i trư ng 1/2MS. Như vậy, tuy photpho là y u tố qu n

trọng ối với sự phát tri n củ cây con nhưng hàm lượng photpho c o có th là không

thích hợp ối với sự phát tri n cây con từ ph i som ối với cây cọc rào.

Knittel và cộng sự (1991) chỉ r rằng hàm lượng nitơ bổ sung cũng óng một v i

trò nhất nh trong tái sinh chồi từ nu i cấy lá mầm cây ho hướng dương [98]. Khi so

sánh các m i trư ng khoáng là MS, B5 và WPM, về hàm lượng nitơ tổng cho thấy

hàm lượng nitơ tổng củ WPM (14,7 μM) thấp hơn B5 (27,03 μM) và MS (60,03 μM)

(Shi và cộng sự, 2000) [166]. Hàm lượng nitơ tổng ở m i trư ng White, 1/2MS tương

ương với m i trư ng B5. Sự khác bi t về hàm lượng nitơ tổng này có sự tương ồng

với chiều c o cây hình thành tr n các m i trư ng khoáng khác nh u.

So sánh thành phần c nxi củ các m i trư ng th hi n có hi u quả hơn trong tái

sinh cây từ ph i cây cọc rào: MS, B5 và WPM thấy rằng m i trư ng B5 có thành phần

c nxi nhỏ hơn khoảng 4 lần so với m i trư ng MS và khoảng 5 lần so với m i trư ng

WPM. Sự khác bi t áng k về thành phần khoáng này có th là nguy n nhân củ các

k t quả ghi nhận tr n các m i trư ng này. M i trư ng B5 là m i trư ng có k t quả tốt

nhất ở tất cả các chỉ ti u khảo sát với số li u c th là 100% mẫu cấy tạo rễ, chiều c o

cấy ạt 2,38 cm; số lượng rễ hình thành trung bình là 4,07 rễ; chiều dài rễ trung bình

2,02 cm và khối lượng rễ là 17,53 mg. Nghi m th c sử d ng m i trư ng MS có chiều

c o cây kh ng khác bi t so với m i trư ng B5 và k t quả ở các chỉ ti u khác thì thấp

hơn và có khác bi t so với nghi m th c này. K t quả ở m i trư ng MS cũng ghi nhận

ược c o hơn và có khác bi t so với m i trư ng WPM. Như vậy, hàm lượng canxi

cũng có tác ộng c th làm hàm lượng c o làm hạn ch ối với sự hình thành cây

hoàn chỉnh từ ph i som cây cọc rào.

Như vậy, trong thí nghi m này, m i trư ng thích hợp cho sự hình thành rễ và

phát tri n củ cây con từ ph i som là m i trư ng khoáng B5. K t quả này phù hợp

với nghi n c u củ Warakagoda và Subasinghe (2009) khi nghi n c u tái sinh chồi từ

hạt cây cọc rào [215]. K t quả thí nghi m cho thấy ph i som cây cọc rào khi ược

81

nu i cấy trong m i trư ng B5 cho thấy tỷ l nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất so

với các m i trư ng 1/2MS, MS, WHITE và WPM.

3.3.2. Ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự phát triển rễ của cây con tái sinh từ phôi

soma

Các cây con hình thành từ ph i som cây cọc rào ược cấy chuyền vào các m i

trư ng có bổ sung NAA h y IBA theo các nồng ộ khác nh u. S u 5 tuần nu i cấy,

các ph i som bắt ầu có sự hình thành rễ và ti p t c phát tri n thành cây con hoàn

chỉnh.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi

soma

CĐHSTTV (mg/l)

Khối lƣợng rễ (mg) Tỷ lệ tạo rễ (%)

IBA 0 - - - - 0,5 1,0 1,5 2,0

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

Số lƣợng rễ 3,47dx 3,73cd 3,93bc 4,17b 4,10b 3,67cd 4,00bc 4,53a 4,00bc * 8,51 Chiều dài rễ (cm) 1,62h 1,83g 2,13e 2,58b 2,37d 1,99f 2,32d 3,02a 2,45c * 18,02 Chiều cao cây (cm) 2,31f 2,36f 2,57d 3,03b 2,77c 2,45e 2,62d 3,23a 2,97b * 11,52 86,67c 93,33b 100a 100a 100a 93,33b 100a 100a 100a * 5,58 14,07g 15,97f 19,13d 22,97b 21,03c 17,03e 21,37c 27,07a 23,77b * 19,72 NAA 0 0,5 1,0 1,5 2,0 - - - - ANOVAy CV%

K t quả thu ược ở bảng 3.8 cho thấy, tỷ l hình thành rễ khi bổ sung IBA h y

NAA ở các nồng ộ khác nh u kh ng có sự khác bi t áng k về mặt thống k (tỷ l rễ

hình thành ở các nghi m th c phần lớn ều ạt 100%). K t quả tốt nhất củ thí nghi m

ược ghi nhận ở nghi m th c bổ sung 1,5 mg/l IBA. Cả IBA và NAA ều cho thấy

hi u quả kích thích hình thành rễ củ cây tái sinh từ ph i som . Khi so sánh hi u quả

củ IBA và NAA, chúng t i nhận thấy, ở cùng một nồng ộ, các nghi m th c bổ sung

IBA ảnh hưởng tốt hơn các nghi m th c bổ sung NAA l n sự hình thành rễ cây cọc

rào trong thí nghi m này, các rễ hình thành tr n m i trư ng bổ sung IBA to khỏe,

82

nhiều và dài hơn các rễ hình thành tr n m i trư ng ch NAA (Bảng 3.8; Hình 3.9 và

Hình 3.10).

Auxin là một nhóm chất iều hò sinh trưởng thực vật thi t y u trong quá trình

cảm ng hình thành rễ bất nh. Trong quá trình phát sinh rễ ở thực vật, uxin ngoại

sinh ảnh hưởng l n sự th y ổi nồng ộ uxin nội sinh (Heloir và cộng sự, 1996) [83].

Nồng ộ uxin nội sinh c o cũng có li n qu n n tỷ l hình thành rễ c o khi bắt ầu

quá trình hình thành rễ. Auxin và ethylene thư ng ược bi t n như là một chất hoạt

hó sự hình thành rễ, trong khi ó cytokinin và gibberellin thì lại kìm h m quá trình

này. Điều này cũng ược th hi n trong nghi n c u Jh và cộng sự (2007) [89] trên

cây cọc rào, khi nu i cấy các mẫu tr n m i trư ng bổ sung denine sulph te và

cytokinin (KIN và IBA) thành th c hó ph i som , tuy nhi n tỷ l ph i thành th c

chỉ ạt 50% và tái sinh cây con từ ph i som chỉ ạt 20% s u 6 tuần nu i cấy. Cũng

tr n ối tượng cây cọc rào, R jore và cộng sự (2007) cũng báo cáo rằng m i trư ng bổ

sung IBA là m i trư ng tối ưu cho sự kích thích hình thành rễ [151]. Sự hình thành rễ

là một bước cần thi t trong phương pháp nhân nh nh tr n nhiều loại thực vật thân g ,

iều này li n qu n n sự có mặt củ uxin trong m i trư ng nu i cấy (McClell và

cộng sự, 1990) [120].

Trong thí nghi m này, bổ sung IBA vào m i trư ng nu i cấy ở nồng ộ 1,5 mg/l

cho k t quả tái sinh cây c o hơn các báo cáo trước ây là 100% và th i gi n nu i cấy

là 5 tuần. K t quả này cũng tương tự với k t quả củ P ndey và cộng sự (2011) tr n tối

tượng cây Ginkgo biloba L. khi bổ sung IBA vào m i trư ng nu i cấy cho tỷ l hình

thành rễ ạt 100% [147].

83

Hình 3.9. Hình thái ph i som phát tri n thành cây con hoàn chỉnh tr n các m i trư ng khoáng a1, a2, a3, a4, a5: Các môi trường khoáng:½MS, MS, B5, White, WPM; b1, b2, b3, b4, b5: Môi trường khoáng B5 có bổ sung NAA ở các nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l; c1, c2, c3, c4, c5: Môi trường khoáng B5 bổ sung IBA ở các nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l

84

Hình 3.10. Sự phát tri n thành cây con hoàn chỉnh từ ph i a1, a2, a3, a4, a5: Các môi trường khoáng:½MS, MS, B5, White, WPM; b1, b2, b3, b4, b5: Môi trường khoáng B5 bổ sung NAA ở các nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l c1, c2, c3, c4, c5: Môi trường khoáng B5 bổ sung IBA ở các nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l

85

3.3.3. Khảo sát khả năng ươm cây từ phôi soma ở vườn ươm, thử nghiệm một số

loại giá thể

Nh ng cây con từ ph i hoàn chỉnh ược em trồng ngoài vư n ươm. S u 3

tháng, các chỉ ti u như tỷ l sống củ cây và số rễ trung bình tr n một cây ược thu

thập và trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển cây từ phôi soma khi ra vườn ươm

Số rễ trung bình Nghiệm thức Tỷ lệ sống (cái)

19,60b 14,07c 33,57a 15,43c 15,30c 7,23d * 47,65 97,78ax 96,67a 97,78a 93,33ab 88,89b 86,67b * 5,92

1. Đất sạch 2. Đất 3. M n dừ 4. M n dừ + ất sạch (1:1) 5. M n dừ + ất (1:1) 6. M n dừ + ất + cát (1:1:1) ANOVAy CV% x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05.

Tỷ l sống củ cây và khả năng ph c hồi (phát tri n rễ, r lá mới và tăng trưởng

về chiều c o) là mối qu n tâm ầu ti n khi ư cây con in vitro r ngoài vư n ươm.

Tr n các giá th trồng khác nh u khả năng sinh trưởng củ bộ rễ cũng s khác nh u,

iều này ảnh hưởng n tỷ l sống và khả năng ph c hồi sinh trưởng củ cây trồng s u

khi chuy n từ m i trư ng in vitro r m i trư ng ex vitro. Y u cầu củ giá th là vừ

ảm bảo ộ tơi xốp, có khả năng thoát nước tốt, có tính gi m c o ồng th i phải

hoàn toàn sạch các mầm b nh.

Tr n giá th m n dừ tỷ l cây sống và số rễ trung bình tr n một cây củ cây con

ngoài vư n ươm ạt c o nhất, tương ng là 97,78% và 35,57 rễ/cây. Tỷ l sống và số

rễ củ cây con tr n giá th m n dừ - ất - cát cho k t quả thấp nhất với tỷ l cây sống

và số rễ trung bình ạt lần lượt là 86,67% và 7,23 rễ/cây. Điều này có th ược giải

thích vì xơ dừ ảm bảo ược tính chất vật lý củ một loại giá th ối với cây trồng

theo Ji ng Qing H i (2004) [9], là giá th có ộ tơi xốp, th ng thoáng khí giúp cho sự

tr o ổi kh ng khí gi rễ và m i trư ng dễ dàng. Có khả năng hấp thu, khả năng hút

nước cũng như dinh dưỡng cho cây.

86

M i trư ng thích hợp nhất cho cây con in vitro là m n dừ . Đây là loại giá th

ược sử d ng phổ bi n hi n n y vì khả năng gi m tốt, giá thành thấp, dễ tìm và thích

hợp ược với nhiều loại cây.

Hình 4.11. Hình thái cây cọc rào tái sinh từ ph i som khi r vư n ươm

3.4. Thảo luận chung đánh giá sự phát sinh phôi soma

Nhu cầu auxin hoặc các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác cho sự khởi động

sự phát sinh phôi soma cây cọc rào

Các t bào sinh dưỡng thực vật có ch ầy ủ th ng tin di truyền cần thi t

tạo n n một cơ th thực vật có ch c năng hoàn chỉnh. Vi c cảm ng quá trình phát

sinh ph i som trước h t phải tác ộng k t thúc sự bi u hi n gen bi t hó hi n tại và

ồng th i khởi ộng lại chương trình bi u hi n gen phát sinh ph i. Ngư i t cho rằng

chất iều hò sinh trưởng thực vật và iều ki n stress óng v i trò trung tâm trong iều

hò truyền tín hi u, dẫn n vi c tái thi t lập chương trình bi u hi n gen. Điều này dẫn

n k t quả là cảm ng một loạt các phân chi t bào dẫn n tăng trưởng khối m sẹo

kh ng tổ ch c hoặc tăng trưởng có cực từ ó ư n phát sinh ph i (Dudits và cộng

sự, 1995) [53].

Nh ng k t quả nghi n c u sự phát sinh ph i som ở cây cọc rào có nhiều ghi

nhận tr n th giới cũng như ở Vi t N m. Jh và cộng sự (2007) [89] ti n hành

nghi n c u phát sinh ph i v tính tr n cây cọc ràovà ghi nhận ược k t quả chỉ cần sử

87

d ng KIN ở nồng ộ 2,0 mg/l là cảm ng ược các m sẹo có khả năng phát sinh

ph i có nhiều nốt nhỏ màu kem trong khoảng 4 tuần nu i cấy. Nh ng k t quả nghi n

c u củ chúng t i cho thấy tr n m i trư ng có bổ sung 1,0 mg/l KIN k t hợp với 0,5

mg/l 2,4˗D, m sẹo tạo thành có dạng mềm, xốp và rất dễ vỡ v n (Hình 3.12a, b).

Theo nhiều tác giả thì ây là dạng m sẹo có khả năng phát sinh ph i. Smith và

Krikori n (1989) nhận thấy rằng có một sự ki n xuất hi n trong suốt quá trình cảm

ng hình thành ph i som bằng uxin ó là tính nguy n vẹn củ m b phá vỡ [173].

Sự tách r i củ các t bào có th là k t quả củ sự hoại tử các m xung qu nh (Hình

3.12c), sự tách r i t bào do uxin làm cho m sẹo trở n n xốp, dễ tách r i h y lớp

cutin (Hình 3.1d) (Merkle và cộng sự, 1995) [122]. Nh ng t bào hoặc nhóm t bào

tách r i nh u r s kh ng ch u ảnh hưởng bởi các m xung qu nh. Tất cả nh ng iều

này ều có th thúc y sự sinh ph i soma.

Auxin tổng hợp như 2,4˗D, ặc bi t hi u quả trong vi c thúc y sự thi t lập và

tăng sinh nu i cấy ph i hơn so với các loại uxin khác (Hình 3.13 ). Do ó kích

thích tăng trưởng củ ph i v tính cần phải chuy n chúng s ng m i trư ng kh ng có

auxin. Khi m i trư ng nu i cấy thi u uxin, các gen ngăn chặn ph i chuy n s ng gi i

oạn hình tim s kh ng bi u hi n ược (Zimmerm n, 1993) [222]. Nh ng nghi n c u

củ chúng t i cũng cho thấy k t quả phù hợp với nh ng ghi nhận tr n. Khi cấy chuy n,

nh ng khối mô sẹo có khả năng sinh ph i tr n m i trư ng có bổ sung 1 mg/l KIN k t

hợp với 0,5 mg/l 2,4˗D ược cắt thành nh ng c m nhỏ và cấy s ng m i trư ng có bổ

sung KIN (0 ˗ 2,5 mg/l) ri ng l . K t quả cho thấy KIN có ảnh hưởng rõ nét tới khả

năng phát sinh ph i v tính từ nh ng m sẹo có khả năng sinh ph i (Đ Đăng Giáp và

cộng sự, 2013b) [8]. Tr n m i trư ng kh ng bổ sung KIN kh ng có sự hình thành ph i

v tính từ m sẹo có khả năng sinh ph i. Khi bổ sung KIN ở các nồng ộ khác nh u

thì ph i phát sinh tr n tất cả các nghi m th c với tỷ l mẫu phát sinh ph i và số lượng

ph i hình thành tr n mẫu khác nh u. Khi chuy n m sẹo có khả năng sinh ph i s ng

m i trư ng cảm ng phát sinh ph i, nhóm thực hi n ề tài nhận thấy có nh ng bi u

hi n phát tri n bi t hó rất nh nh chóng củ ph i tr n m i trư ng nu i cấy. Ph i v

tính phát tri n qu nhiều gi i oạn: dạng cầu, dạng tim, dạng thủy l i và dạng lá mầm

(Hình 3.3a).

88

Trong số các cytokinin hi n ược sử d ng cho nu i cấy m thực vật, KIN ược

ch ng minh là có tác d ng tốt ối với các nu i cấy b n ầu hình thành ph i som ở

một số loài thân g (Dunst n và cộng sự, 1995) [54]. S u khi cấy chuyền m sẹo có

khả năng sinh ph i s ng m i trư ng chỉ bổ sung 1,0 mg/l KIN, chúng t i nhận thấy có

nh ng th y ổi áng k củ vật li u về màu sắc và k t cấu, ặc bi t là nh ng bi u hi n

phát tri n bi t hó rất nh nh củ ph i tr n m i trư ng này. Ph i hình cầu chi m số

trong quá trình nu i cấy có dạng tròn, màu kem, một số màu vàng c và tăng sinh dày

ặc tr n khối m sẹo có khả năng sinh ph i s u 4 tuần nu i cấy. B n cạnh ó, các dạng

ph i hình tim, hình thủy l i và hình lá mầm cũng xuất hi n nhưng số lượng kh ng

nhiều (Hình 3.3b). Khi ti n hành giải phẫu các cấu trúc và ti n hành nhuộm bằng thuốc

nhuộm c rmin-iod thì nhận thấy các cấu trúc này gồm nh ng t bào nhỏ có t bào chất

ậm ặc, bắt màu ậm. Sự bi t hó như chồi, cực rễ và tiền tầng sinh g xảy r ở dạng

thủy l i. ph i lá mầm, cấu trúc chóp rễ, ỉnh chồi, lá primod , các mạch sợi và lớp

tiền bì ược qu n sát và ghi nhận (Hình 3.13 , b, c, d). K t quả này tương tự k t quả

củ Jh và cộng sự (2007) khi nu i cấy phát sinh ph i cây cọc ràotr n m i trư ng có

bổ sung 0,5 mg/l KIN và 0,25 mg/l IBA [89]. Tuy nhi n, nồng ộ củ KIN sử d ng

phát sinh ph i là khác nh u tùy theo loài thực vật. KIN ở nồng ộ 0,1 mg/l có tác d ng

kích thích sự phát sinh ph i v tính tốt nhất th ng qu nu i cấy m sẹo Pinus taeda và

Citrus clementina (V nildo và cộng sự, 2004) [206]. K t quả này thấp hơn nhiều so

với k t quả mà nhóm thực hi n ề tài ghi nhận ược trong thí nghi m tr n, KIN ở

nồng ộ 1,0 mg/l cho sự hình thành ph i tốt nhất ối với cây cọc rào. Điều này cũng

có th ược giải thích rằng ở m i loài thực vật s có ki u gen khác nh u, do ó nó có

nhu cầu về nồng ộ các chất iều hò sinh trưởng khác nhau.

So sánh hình thái, cấu trúc rễ của cây cọc rào từ phôi soma, từ hạt, từ giâm cành

S u khi qu n sát hình thái b n ngoài củ 3 bộ rễ chúng t i nhận thấy bộ rễ củ

cây nảy mầm từ hạt và cây tái sinh từ ph i som có hình thái khá tương ồng, bộ rễ

củ các cây này b o gồm rễ cọc và các rễ con. Rễ ở cây giâm cành lại có hình thái

khác với rễ cây nảy mầm từ hạt và từ ph i tái sinh, nó có dạng rễ chùm, gồm nhiều rễ

con và kh ng có rễ cọc.

Cấu trúc cắt ng ng củ rễ ở cây từ hạt, từ ph i và từ giâm cành có sự khác bi t

(Hình 3.14). Rễ cây từ ph i có cấu trúc giống rễ cây từ hạt khi mẫu giải phẫu ược

89

qu n sát dưới kính hi n vi. Khi quan sát cấu trúc củ h i bộ rễ này, nhận thấy cấu trúc

ặc trưng củ rễ tr với vùng vỏ dày chi m khoảng 2/3 so với trung tr . Qu n sát nhận

thấy cấu tạo ược qu n sát thấy gồm có vùng t m suberin bắt màu x nh với iod củ

thuốc nhuộm (Hình 3.14), vùng m mềm vỏ gồm nh ng t bào có vách mỏng bằng

cellulose bắt màu với c rmin củ thuốc nhuộm cho màu hồng, nội bì là nh ng lớp t

bào trong cùng củ vỏ, tr bì là nh ng lớp ngoài cùng nhất củ trung tr , các bó libe

g xen k và phân hó hướng tâm, ti ruột và tủy (Hình 3.14). Khác với cấu trúc củ

h i bộ rễ ở tr n, cấu trúc qu n sát thấy ở rễ cây giâm cành giống với cấu trúc ặc trưng

củ loại rễ chùm. Cấu trúc củ rễ này vẫn giống với 2 bộ rễ tr n ở nh ng nét lớn, tuy

nhi n, có nh ng i m khác bi t như s u: thi u tr bì n n bó mạch ti p xúc với nội bì,

kh ng th phân bi t rõ phần trung tr và phần vỏ, xuất hi n nh ng mạch hậu mộc lớn

quanh tủy mà cấu trúc củ rễ cây từ hạt và từ ph i kh ng có, nh ng mạch hậu mộc này

làm cho tủy b thu hẹp lại (Hình 3.14).

Trước ây, cây cọc rào thư ng ược sử d ng làm rào giậu hoặc trồng cây

chống xói mòn và bảo v ất, vì vậy, ngư i dân thư ng trồng cây bằng phương pháp

giâm cành bởi ưu i m là nh nh chóng tạo ược cây trưởng thành. Tuy nhi n, hi n

n y, cây cọc rào ược qu n tâm nhiều hơn ở khí cạnh sản xuất nhi n li u sinh học

từ dầu thu ược từ hạt. Do ó, ối với m c ích trồng cây kh i thác dầu lâu năm thì

phương pháp nhân giống bằng gieo hạt ược sử d ng nhiều hơn do nh ng cây nhân

giống bằng giâm cành ược nhận thấy có i sống ngắn hơn, khả năng chống hạn,

b nh tật kém hơn, rễ củ cây giâm cành phát tri n y u và dễ b g y ổ hơn cây nhân

giống bằng hạt (Heller, 1996) [82].

K t quả từ nghi n c u cho thấy, cây con tái sinh từ ph i som cây cọc rào có bộ

rễ tương tự như các cây con ược trồng từ hạt, 2 bộ rễ này có sự tương ồng về cả hình

thái và cấu trúc. Tuy cây con ược hình thành từ ph i kh ng th có bộ rễ khỏe mạnh

và c ng cáp như cây con ược trồng bằng hạt nhưng iều này có th ược khắc ph c

bằng các nghi n c u kích thích rễ với các tác nhân khác nh u như m i trư ng khoáng

h y các chất iều hò sinh trưởng thực vật và khi ư cây con từ in vitro ra ex vitro

phải có th m gi i oạn thích nghi trong nhà kính. Như vậy có th k t luận, cây ược

tạo thành từ ph i som cây cọc rào hoàn toàn có th th y th cho nh ng cây ược

trồng bằng cách gieo hạt. Từ ó, có th hình thành n n một phương pháp mới, hi u

90

quả tạo r một số lượng lớn cây cọc rào ồng nhất về mặt di truyền, có hàm lượng

dầu c o trong hạt ph c v cho m c ích sản xuất nhi n li u sinh học h y nh ng

nghi n c u x hơn về chuy n gen thực vật h y tạo hạt nhân tạo.

Hình 3.12. Hình thái và cấu trúc giải phẫu m sẹo có khả năng sinh ph i a, b: hình thái và cấu trúc giải phẫu mô sẹo có khả năng sinh phôi trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l KIN.c, d: hình thái và cấu trúc mô sẹo có khả năng sinh phôi hình thành lớp cutin

Hình 3.13. Hình thái ph i và cấu trúc giải phẫu ở nh ng dạng hình thái khác nh u a, b, c, d. Hình thái giải phẫu của phôi soma dạng cầu, tim, thủy lôi và lá mầm

91

Các bó libe gỗ

Tầng tẩm suberin

Nội bì

Mô mềm vỏ

Tia tủy

Trụ bì

a. Cây cọc rào giâm cành với bộ rễ chùm, b. Cấu trúc của rễ cây cọc rào giâm cành; c. Cây

cọc rào trồng bằng hạt 1 tháng tuổi với bộ rễ gồm rễ cọc và 4 rễ con; d. Cấu trúc rễ cây cọc

rào trồng bằng hạt; e. Cây cọc rào tái sinh từ phôi soma với bộ rễ gồm rễ cọc và nhiều rễ

con; f. Cấu trúc rễ cây cọc rào tái sinh từ phôi soma

Hình 3.14. Hình thái và cấu trúc củ 3 bộ rễ từ cây giâm cành, từ hạt, từ ph i som

92

Quy trình vi nhân giống cây cọc rào bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi soma

Phương pháp phát sinh ph i som (som tic embryogenesis) – một c ng c mạnh

củ ngành c ng ngh sinh học tạo giống cây trồng – ược áp d ng thành công

lần ầu ti n tr n cây cọc rào tại Vi t N m ở luận án này. M sẹo có khả năng phát sinh

ph i ược thu nhận bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng MS có bổ sung 2,4˗D

(0,5 mg/l) và KIN (1,0 mg/l). Các khối m sẹo này ược chuy n s ng m i trư ng có

bổ sung KIN (1,0 mg/l) cho thấy tần suất m sẹo phát sinh ph i hình cầu c o nhất.

Ph i ược kích thích phát tri n bởi các cid mine [proline (750 mg/l); glut mine (150

mg/l); denine sulph te (150 mg/l)] và spermidine (0,03 mg/l) giúp gi tăng sự hình

thành ph i som từ m sẹo củ cây cọc rào. Các ph i som trưởng thành s tạo các cây

con tr n m i trư ng B5. Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần. Quá trình

phát sinh ph i som ở cây cọc rào có th trở thành một h thống lý tưởng cho quá trình

vi nhân giống nh ng dòng chọn lọc trong th i gi n tới.

H thống vi nhân giống cây cọc rào th ng qu kỹ thuật nu i cấy ph i som có th

giải quy t ược 3 nhược i m củ nh ng phương pháp nhân giống cổ i n tr n cây

này mắc phải gồm:

- Khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh kém của cây giâm cành: cây cọc rào

là loại cây có khả năng ch u hạn c o, ược trồng ở nh ng vùng kh hạn. Do vậy,

phương pháp nhân giống bằng giâm cành ối với loài cây này có i sống ngắn hơn và

khả năng chống hạn và b nh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt. Bởi vì, cây con từ

cành giâm kh ng tạo ược rễ cọc thật sự n n khả năng kháng hạn kém, th y vào ó

chúng tạo r các rễ cọc giả chỉ có th cắm xuống ất khoảng 1/2 - 2/3 so với rễ cọc

ược tạo r từ cây con gieo hạt. Rễ củ cây giâm cành phát tri n y u, dễ b g y ổ.

Phôi soma ở cây cọc rào ều có cấu trúc lưỡng cực bất nh bao gồm cực chồi và cực

rễ, mà dưới nh ng iều ki n thích hợp thì có th phát tri n thành một cơ th có ch c

năng hoàn chỉnh gần giống như hạt h u tính (Dương Tấn Nhựt, 2007) [12]. Do ó

nh ng cây giống từ phôi soma s cũng có rễ cọc như cây từ hạt h u tính và khả năng

chống ch u khô hạn và b nh tật cũng như cây h u tính (Hình 3.12).

- Khả năng biến dị di truyền do thụ phấn chéo của cây gieo hạt: trồng cây cọc

rào kh i thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt ược sử d ng

nhiều hơn. Hạt trước khi em gieo ược lự chọn là nh ng hạt to, chắc, m y. Hạt ược

93

ngâm nước qu m làm tăng tỷ l nảy mầm. H m s u, hạt ược gieo vào trong các

bầu ất. Hạt s nảy mầm s u khoảng 1 tuần và cây con có th em i trồng s u 45

ngày. Rễ củ cây con mọc từ hạt phát tri n, thư ng có 1 rễ cái và 4 rễ b n. Cây trồng

ngoài thực s r ho s u khoảng 3 - 4 năm. Tuy nhi n nhược i m củ phương

pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con kh ng ồng nhất bởi cây cọc rào là

cây th phấn chéo n n gi các hạt có sự khác nh u về mặt di truyền. Như xét tính

trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo r bằng gieo hạt có hàm lượng dầu trong

hạt kh ng ổn nh, gi o ộng từ 4 n 40%. Vì vậy ở nh ng cây cọc rào nhân giống

bằng phương pháp nu i cấy ph i som về nguyên tắc thì nh ng cây con ược tái sinh

bằng con ư ng này thì ều có vật chất di truyền giống h t t bào sinh dưỡng của cha

mẹ, n u t bào này ược chuy n gen thì cây tái sinh là cây chuy n gen. Do ó nh ng

cây giống ph i som ều ồng nhất về mặt di truyền so với nh ng cây ầu dòng

qua chọn lọc.

Hạn chế của hệ số nhân giống không cao, không chủ động trong nhân giống, cây con

không ổn định di truyền so với cây bố mẹ đối với nhân giống bằng hạt: ph i som rất

giống ph i h u tính ở hình thái và sinh lý nhưng kh ng có quá trình tái tổ hợp di

truyền do ph i som kh ng phải là sản ph m củ sự th tinh gi gi o tử ực và gi o

tử cái. Về nguy n tắc, tất cả nh ng cây con ược tái sinh bằng con ư ng này ều có

vật chất di truyền giống h t các t bào sinh dưỡng ch mẹ, n u t bào này ược chuy n

gen thì các cây tái sinh là cây chuy n gen. Nhân giống v tính thực vật qu con ư ng

phát sinh ph i som cho h số nhân rất c o, ổn nh về mặt di truyền so với cây bố mẹ

ược chọn lọc.

3.5. Khảo sát mức độ biến dị kiểu hình của cây phát triển từ phôi soma

Bảng 3.10. Kết quả phân loại kiểu hình

STT Kí hiệu Loại biến dị Số lƣợng (cây) Tỷ lệ (%)

1 BT Cây kh ng bi n d 217 72,33

2 BD1 Cây bi n d ở lá 24 8,00

3 BD2 Cây bi n d ở thân 6 2,00

4 BD3 Cây bi n d cả thân và lá 53 17,67

94

Theo qu n sát và phân loại các ki u hình từ 300 cây cọc rào in vitro thông qua tái

sinh phôi soma thu ược k t quả theo bảng 3.10. K t quả cho thấy số cây kh ng

nhận thấy bi n d ki u hình là 217 cây với tỷ l chi m 72,33%. Đặc i m dễ nhận thấy

ở nh ng cây này có thân vươn thẳng c o từ 0,5 ˗ 1,0 cm, thân tròn, khỏe. Có lá hình

ov n hoặc hình trái tim, mép lá thẳng kh ng b xoắn lại; lá chi thùy và mọc theo ki u

xen k , sắp x p luân phi n nh u dọc theo thân và tập trung ở phần ngọn (Hình 3.15).

Hình 3.15. Cây cọc rào kh ng có bi n d ki u hình

Các cây có bi u hi n bi n d ở lá chi m tỷ l 8,00%. Cây bi n d ở lá có thân

giống như cây kh ng có bi n d : thân tròn, vươn thẳng c o từ 0,5 - 1,0 cm. Lá b bi n

d có nhiều ki u hình khác nh u, kh ng nhận thấy ược sự sắp x p luân phi n nh u

củ lá tr n thân. Lá kh ng có hình ov n h y hình tim mà có hình phễu, có lá dài nhọn

như hình mũi giáo,... Có một số cây mép lá xoăn, lá co dúm lại kh ng có hình thù nhất

nh (Hình 3.16). Cây khó phát tri n và thư ng ch t s u một th i gi n nu i cấy.

95

Hình 3.16. Cây có bi u hi n bi n d ở lá. a. Cây có lá hình phễu; b. Cây có lá hình mũi giáo; c, d. Cây có lá xoắn, hình dạng không xác định

Trong tổng số cây khảo sát có 6 cây có bi u hi n bi n d từ thân, chi m tỷ l

2,00%, tỷ l thấp nhất trong các bi u hi n bi n d ki u hình khảo sát ược. nh ng

cây này bi u hi n ki u hình cho thấy ở lá thư ng có hình tim rất rõ ràng, lá thẳng mép,

kh ng xoăn, tuy nhi n lá thư ng nhỏ. Qu qu n sát nhận thấy ở nh ng cây có bi u

hi n bi n d ở thân thì thân kh ng mọc theo chiều thẳng mà uốn cong, có thân ch i

(Hình 3.17).

96

Hình 3.17. Cây có bi u hi n bi n d ở thân. a, b. Thân uốn cong; c. Thân vừa uốn cong, vừa tách đôi; d. Ảnh phóng to của cây có biến dị thân tách đôi

Trong số b loại bi n d thì loại bi n d vừ có bi u hi n bi n d ki u hình ở lá

và ở thân chi m tỷ l nhiều nhất với 17,67% trong tổng số cây ược khảo sát bi n d .

Các ặc i m củ lá và thân củ các loại bi n d ở lá và bi n d ở thân ều ược tìm

thấy trong loại bi n d này (Hình 3.18).

97

Hình 3.18. Cây xuất hi n bi n d ở lá và thân Như vậy, tổng số cây có bi u hi n bi n d ki u hình chi m tỷ l 27,67%. K t quả

tr n cho thấy tỷ l các cây có bi u hi n bi n d ki u hình là khá c o. Các bi n d ki u

hình này xuất hi n có th do tác ộng củ quá trình nu i cấy m , vì trong m i trư ng

nu i cấy m sử d ng các chất iều hò sinh trưởng với nồng ộ c o tác ộng vào

quá trình bi u hi n gen. Nồng ộ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong m i trư ng

có th làm giảm các bi n d t bào som (Grosser và Gmitter, 1990) [73]. Cây in vitro

bi n d ki u hình thư ng kém phát tri n so với cây bình thư ng. Cây con nu i cấy m

có th s i khác với cây mẹ b n ầu do hi n tượng bi n d t bào som . K t quả là cây

con kh ng gi ược các ặc tính quý củ cây mẹ. Tỷ l bi n d thư ng thấp ở gi i

oạn ầu nhân giống, nhưng s u ó có chiều hướng tăng l n khi nu i cấy kéo dài và

tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhi n, các th y ổi ki u hình có

th là tạm th i và s kh ng di truyền cho th h s u. Do vậy, tỷ l này kh ng th hi n

ược khả năng bi n d di truyền củ ki u gen. Đ có th nghi n c u sâu hơn về các

98

bi n d ki u hình có khả năng di truyền (có bi n d ki u gen) h y kh ng, cần phải thực

hi n các phương pháp chỉ th sinh học phân tử [73].

3.6. Khảo sát mức độ bội thể của cây giống từ phôi soma

Vi nhân giống cây cọc rào ược nghi n c u thành c ng ở Phòng Thí nghi m

Trọng i m Quốc Gi về C ng ngh T bào Thực vật − Vi n Sinh học Nhi t ới th ng

qu các phương pháp khác nh u như: nuôi cấy ỉnh sinh trưởng (Đ Đăng Giáp và

cộng sự, 2012) [8]; nuôi cấy lớp mỏng t bào lá (Thái Xuân Du và cộng sự, 2010) [7];

nuôi cấy ph i som (Đ Đăng Giáp và cộng sự, 2012) [8]. Các cây con ược tái sinh

bằng các phương pháp tr n có hình thái như nh u, sinh trưởng và phát tri n tốt trong

cả iều ki n in vitro và ex vitro. Tuy nhiên, các cây con này cần phải ược ánh giá

m c ộ ồng nhất so với cây bố mẹ trước khi ược nhân giống với số lượng lớn nhằm

ảm bảo tính ổn nh về mặt di truyền.

K t quả phân tích mẫu lá của các nhóm cây bằng phương pháp dòng chảy t bào

cho thấy các mẫu có ỉnh pe k chính trùng với ỉnh pe k củ mẫu chu n 2n, iều này

có nghĩ là các cây con ều có m c ộ bội th 2n (Hình 3.19; 3.20; 3.21; 3.22). H số

bi n ộng củ các cây con tái sinh th ng qu các phương pháp khác nh u d o ộng

trong khoảng từ 6,34% n 6,59%. Giá tr CV là th ng số chất lượng ( ặc trưng) qu n

trọng trong phân tích dòng chảy t bào. Le l và cộng sự (2006) [108] ư r các

thông tin này trên cây nho và họ thấy rằng h số CV d o ộng từ 2,89% n 4,60% ở 9

cây trồng ngoài ồng ruộng. Le l và cộng sự (2006) tìm thấy sự bi n ộng củ giá

tr CV trong khoảng từ 1,86% n 3,88% ối với các cây con ược tái sinh qu

phương pháp phát sinh ph i som . Mặc dù giá tr CV trong nghi n c u củ chúng t i

c o hơn so với nghi n c u củ Le l và cộng sự (2006) [108], nhưng giá tr này ở cây

con tái sinh th ng qu các phương pháp: nu i cấy ỉnh sinh trưởng, nu i cấy lớp mỏng

t bào và nu i cấy phát sinh ph i som kh ng khác bi t nhiều với cây bố mẹ.

Dòng chảy t bào là một kỹ thuật nh nh chóng, ít chi phí và chính xác ước

tính số lượng DNA nhân (Sliwinsk và Thiem, 2007) [171]. Phương pháp này thư ng

ược sử d ng trong t bào thực vật xác nh m c ộ bội th củ m và cây con

bằng các th o tác in vitro hoặc các xử lý với chất phân bào. Dòng chảy t bào cho bi t

số lượng DNA ánh giá nh nh tất cả các phần m t bào thậm chí là m sẹo. M lá

là nguồn vật li u có nhiều thuận lợi nghi n c u m c ộ bội th trong các cây trưởng

99

thành từ cành giâm vì ây là nguồn vật li u có ch nhiều nhiễm sắc th ược thu

nhận một cách dễ dàng. K ewpoo và Te˗ch to (2010) phân tích hàm lượng DNA

trong cây J.curcas từ lá, thân và m sẹo cho thấy kh ng có sự th y ổi về m c ộ bội

th gi 3 nguồn mẫu [91]. cây Astragalus chrysochlorus, m c ộ bội th củ ph i

v tính (nu i cấy huyền phù t bào 25 ngày tuổi) ược xác nh có 85% giống nh u

bằng dòng chảy t bào (K ra và Ari, 2008) [94]. Riv l và cộng sự (1997) cũng sử d ng

dòng chảy t bào như một c ng c xác nh m c ộ dạng trong nu i cấy m cây

cọ dầu [153]. Bằng cách sử d ng dòng chảy t bào, số lượng DNA nhân củ Hydrastis

canadensis ược ước tính và sự ổn nh kích thước bộ gen củ cây con tái sinh in vitro

ược ánh giá (Ob e và West, 2010) [142]. So sánh kích thước bộ gen củ cây H.

canadensis tái sinh in vitro với cây ho ng d thấy rằng kh ng có bất kỳ sự khác bi t

áng k trong hàm lượng DNA nhân. An và cộng sự (2009) ti n hành lai khác loài

gi Citrus unshiu với Citrus sinensis bằng kỹ thuật dung hợp t bào trần [22]. Phương

pháp FCM tỏ r khá hi u quả khi ược dùng phân tích m c ộ bội th củ sản

ph m con l i, khi k t quả thu ược là 15 trong tổng số 102 cây con l i là t bội th . Và

nguồn giống t bội (4n) này ược sử d ng cho vi c l i tạo r cây t m bội (3n) kh ng

hạt.

Như vậy k t quả nh ng nghi n c u khác sử d ng phương pháp dòng chảy t bào

(flow cytometry-CMF) khảo sát m c ộ bội th của cây cọc rào ược nhân giống in

vitro bằng các phương pháp khác nh u: nu i cấy ỉnh sinh trưởng; nuôi cấy lớp mỏng

t bào lá; nuôi cấy phôi soma. K t quả cho thấy 100% các cây cọc rào vi nhân giống

bằng nh ng phương pháp n u tr n ều mang bộ nhiễm sắc th lưỡng bội (2n), không

có dạng d bội nào.

100

Hình 3.19. Bi u ồ phân tích m c ộ lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy t bào mẫu lá cọc rào ngoài vư n ươm

Hình 3.20. Bi u ồ phân tích m c ộ lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy t bào mẫu lá cọc rào lấy tr n cây phát tri n từ ỉnh sinh trưởng

101

Hình 3.21. Bi u ồ phân tích m c ộ lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy t bào mẫu lá cọc rào lấy tr n cây phát tri n từ lớp mỏng t bào

Hình 3.22. Bi u ồ phân tích m c ộ lưỡng bội bằng phương pháp dòng chảy t bào mẫu lá cọc rào lấy tr n cây phát tri n từ ph i sơ cấp

102

3.7. Khảo sát mức độ biến dị di truyền của cây giống từ phôi soma

a. Ly trích DNA tổng số từ lá cây cọc rào

Lá cây cọc rào ex vitro (cây ầu dòng) và mẫu con s u các lần cấy chuyền L1,

L3, L6, L9 ược sử d ng tách chi t DNA tổng số. S u ó, DNA ược ki m tr chất

lượng và xác nh nồng ộ bằng phương pháp qu ng phổ hấp ph OD và i n di tr n

gel g rose. K t quả o qu ng phổ hấp th th hi n ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Đánh giá độ tinh sạch của các mẫu DNA ly trích

Mẫu BM1 BM2 L1.1 A280nm 0,18408 0,11525 0,68543 Nồng ộ (ng/µl) 3,3 2,3 2,7 A260/A280 1,79 2,02 1,93

A260nm 0,33011 0,23235 1,32480 1,30610 L1.2 0,67064 3,8 1,95

L3.1 L3.2 L6.1 L6.2 L9.1 L9.2 0,13520 0,91127 0,71451 0,15043 0,43516 0,58118 0,07047 0,44210 0,39616 0,07211 0,23888 0,28101 5,4 4,6 3,6 1,5 5,8 6,6 1,92 2,06 1,80 2,09 1,82 2,07

Giá tr ở bảng 3.11 cho thấy mẫu DNA thu ược sạch, tỷ số A260/A280 d o

ộng trong khoảng 1,8 ˗ 2,0, nồng ộ DNA d o ộng từ 1,5 ˗ 6,6 ng/µl. Qu k t quả

i n di và o qu ng phổ hấp th cho thấy các mẫu DNA ly trích ều có chất lượng ủ

ti u chu n ti n hành phản ng RAPD và có th ược sử d ng cho các nghi n c u

ti p theo. Các mẫu DNA tổng số s u ó ược ph lo ng tới nồng ộ 1ng/µl và bảo quản ở ˗20oC thực hi n phản ng RAPD.

b. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD

Sàng lọc mồi

Sử d ng 2 mẫu cây ầu dòng (BM1 và BM2) thực hi n phản ng RAPD với 19

mồi sàng lọc các mồi h u hi u dùng cho khảo sát các bi n d ki u gen của 8 mẫu

nghiên c u. K t quả thu ược trên bảng i n di (Gel agarose 2%, nhuộm ethidium

bromide) hi n th dưới èn UV theo hình 3.23.

103

Hình 3.23. K t quả i n di sản ph m RAPD củ 19 mồi củ mẫu cây ầu dòng. Từ 1 ˗19 lần lượt là sản ph m RAPD với các primer OPAK14, OPAW07, OPC18, OPM11, OPT18, OPA05, OPA08, OPB01, OPAL12, OPB05, OPB08, OPD14, OPB07, OPB13, OPB14, OPE20, OPG02, OPO08, OPN07

S u khi sàng lọc mồi với mẫu BM chọn ược 8 mồiOPAL12, OPG02, OPAK14,

OPC18, OPB01, OPAW07, OPM11, OPB07 cho k t quả với tổng số băng ủ lớn, các

băng phân bi t rõ, riêng bi t thực hi n ánh giá tính ổn nh củ các mẫu cọc rào

s u khi nhân giống ph i som bằng phản ng RAPD (Hình 3.24).

Kết quả chạy RAPD trên các mẫu nghiên cứu ở từng mồi đã qua sàng lọc qua

mẫu cây đầu dòng.

Phản ng RAPD sử d ng 8 mồi thu ược 47 băng, tổng số băng củ m i mồi

khoảng 4 ˗ 8 và kích thước sản ph m khu ch ại 370 ˗ 3000 bp. Bảng 3.12 cho thấy

số các mồi cho k t quả ồng hình tuy nhi n có xuất hi n các băng hình ở 2 mồi

(OPM11, OPG02).

Khoảng cách di truyền gi 8 mẫu con với bố mẹ ược th hi n trong hình 3.24.

Các mẫu ược chi thành 3 nhóm lớn ki u di truyền. Nhóm 1 b o gồm BM1, BM2,

L1.1 và L1.2 (97,44% tương ồng). Nhóm 2 gồm L3.1, L3.2 và L6.1 (98,37% tương

ồng). Nhóm 3 là mẫu L6.2, L9.1, L9.2 (100% tương ồng). Khoảng cách di truyền x

nhất với BM1, BM2 là L6.2, L9.1 và L9.2 (95,83% tương ồng), trong khi ó mẫu

tương ồng gần nhất với BM là L1.1 và L1.2 (tương ồng 100%). Điều này cho thấy các

mẫu có ộ tương ồng c o (0,985) ảm bảo cây con từ ph i som có tính ổn nh di

104

truyền c o so với cây bố mẹ. Tuy nhi n khoảng cách di truyền tăng s u các lần cấy

truyền do nhiều y u tố tác ộng trong quá trình nhân giống như m i trư ng nu i cấy,

nồng ộ chất iều hò sinh trưởng.

Bảng 3.12. Kết quả phản ứng RAPD của mẫu cọc rào sử dụng 8 mồi đã qua sàng lọc

STT Primer

1 OPAL12 2 OPG02 3 OPAK14 4 OPC18 5 OPB01 6 OPAW07 7 OPM11 8 OPB07 Tổng số band 4 5 5 8 8 7 6 4 Số band đa hình 0 1 0 0 0 0 1 0 Số band đơn hình 4 4 5 8 8 7 5 4 Phần trăm đồng hình 100 80 100 100 100 100 83,3 100 Kích thƣớc sản phẩm (bp) 370˗1500 400˗1400 600˗2500 680˗1600 580˗ 2700 900˗3000 420˗2500 1100˗3000

Hình 3.24. K t quả phân tích bằng phần mềm NTSYS-pc

105

Hình 3.25. K t quả i n di sản ph m RAPD: lần lượt là k t quả i n di sản ph m RAPD củ các primerOPAL12, OPG02, OPAK14, OPC18, OPB01, OPAW07, OPM11, OPB07 với các mẫu BM1, BM2, L0.1, L0.2, L3.1, L3.2, L6.1, L6.2, L9.1, L9.2 lần lượt từ 1 ˗ 10.M: marker 100bp plus; Mũi tên: xuất hi n các băng hình ở 02 primer (OPM11, OPG02). (Xem thêm hình chưa điều chỉnh sáng ở phần phụ lục)

106

Vi c phát hi n sự th y ổi di truyền bằng RAPD ược sử d ng trong nghi n

c u phân tích dạng di truyền tr n cây cọc rào (Z inudin và cộng sự, 2014) [220],

nghi n c u ột bi n bởi chi u xạ g m tr n giống cọc rào (Dh ksh n moorthy và cộng

sự, 2010) [50]. Mặc dù có sự th y ổi về mặt di truyền nhưng h số tương ồng di

truyền trung bình c o (0,978) n n các mẫu có qu n h di truyền gần gũi. Nh ng bi n

d dòng som xuất hi n ở nu i cấy ph i som cây cọc rào do nu i cấy tr n m i trư ng

có chất iều hò sinh trưởng trong th i gi n dài cũng có ý nghĩ trong nghi n c u theo

hướng chọn lọc giống mới. Như vậy bản thân nu i cấy ph i som cây cọc rào ngoài

khả năng ng d ng trong vi nhân giống còn là một nguồn bi n d di truyền qu n trọng,

mới m và phong phú trong các iều ki n thích ng và rất có ích cho sự cải thi n

giống cây trồng. Một số th bi n d dòng som có ích ược phân lập, ó là khả năng

ề kháng virus Fiji, b nh ốm vàng viền nâu và b nh sương m i ở mí (Heinz và cộng

sự, 1977) [81]; khả năng kháng b nh ốm lá nhỏ ở ng (Brettell và Ingr m, 1979)

[31]; kháng sương m i ở kho i tây (Shep rd và cộng sự, 1980) [162]; ch u hạn và ch u

lạnh ở lú (L Trần Bình và cộng sự, 1996) [2].

Các bi n d di truyền là có lợi hoặc có hại tùy theo m c ích nu i cấy của nhà

chọn giống. N u các bi n d di truyền không xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô s

giúp bảo toàn các ặc tính tốt ở cây ầu dòng, ngược lại n u các bi n d di truyền xuất

hi n thì có ý nghĩ về mặt chọn giống vì tạo ra nh ng giống mới có các ặc i m khác

với cây ầu dòng.

3.8. Thảo luận chung đánh giá mức độ ổn định di truyền của cây giống từ phôi

soma

Mặc dù kỹ thuật nhân giống v tính nói chung và kỹ thuật nhân giống th ng qu

nu i cấy ph i som nói ri ng ược sử d ng nhằm m c ích tạo r quần th cây trồng

ồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo r nh ng quần th bi n d t

bào som . Nh ng bi n d này ược nghi n c u vận d ng vào cải thi n giống cây trồng

nhưng rất ít nh ng bi n d có lợi ược báo cáo.

Tần số bi n b hoàn toàn khác nh u và kh ng lặp lại. Nu i cấy m sẹo và t bào

ơn có sự bi n d nhiều hơn nu i cấy chồi ỉnh. Cây trồng bi n d t bào som qu

nu i cấy thư ng là bi n d về chất lượng, số lượng và năng suất và bi n d này kh ng

di truyền. Nguy n nhân gây r bi n d chư ược làm sáng tỏ chủ y u là do nh ng bi n

107

ổi trong vật chất di truyền như t g y, chuy n oạn ADN hoặc ảo oạn. Nh ng

nguy n nhân gây bi n d t bào som là: ki u di truyền; th bội (cây bội th tần số

bi n d c o hơn cây nh bội); số lần cấy chuyền (số lần cấy chuyền càng c o thì tần số

bi n d càng lớn); loại m .

- Đối với mức độ biến dị kiểu hình ở cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: cho thấy

có nhiều ki u bi n d khác nh u. Tổng số cây có bi u hi n bi n d ki u hình chi m tỷ

l 27,70%. K t quả tr n cho thấy tỷ l các cây có bi u hi n bi n d ki u hình là khá

c o. Các bi n d ki u hình này xuất hi n có th là do tác ộng củ quá trình nu i cấy

m , vì trong m i trư ng nu i cấy m sử d ng các chất iều hò sinh trưởng với nồng

ộ c o tác ộng vào quá trình bi u hi n gen. Một số ghi nhận ở nh ng ối tượng

cây như cây b ng vải, lú nước (Oryza), lú mì (Triticum)... cây hoàn chỉnh phát sinh

th ng qu gi i oạn c llus thì tần số cây b bạch tạng hoặc cây kh ng phát tri n bình

thư ng chi m khá c o (20–30% hoặc c o hơn n ). Tuy nhi n các th y ổi ki u hình

có th là tạm th i và s kh ng di truyền cho th h s u. Cây cọc rào in vitro từ nuôi

cấy ph i som bi n d ki u hình thư ng kém phát tri n so với cây bình thư ng, kh ng

sống khi ư r ngoài vư n ươm. Do ó trong luận án này ối với cây cọc rào từ ph i

som có bi n d ki u hình s ược loại bỏ ng y và kh ng ư ngoài vư n ươm. Quá

trình này nhằm cũng phần nào ó làm giảm khả năng cây cọc rào nhân giống th ng

qu nu i cấy ph i som tri n kh i ngoài vư n ươm có bi n d ki u gen. Như vậy quy

trình vi nhân giống cây cọc rào từ nu i cấy ph i som chỉ nhận ược k t quả với tỷ l

khoảng 70% cây hình thành có khả năng r ngoài vư n ươm. Tỷ l này là chấp nhận

ược với h i m c ti u h số nhân rất lớn từ nu i cấy ph i som và giảm khả năng bi n

d khi cây tri n kh i trồng ngoài ồng ruộng.

- Đối với mức độ biến dị thể bội của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: k t quả

phân tích mẫu lá của các nhóm cây so sánh bằng phương pháp dòng chảy t bào cho

thấycác cây con cọc rào từ ph i som ều có m c ộ bội th 2n. K t quả này có ược

có th là do chúng t loại bỏ nh ng cây có bi n d ki u hình trước khi r ngoài vư n

ươm. Nh ng hi n tượng tự bội hó củ t bào trong quá trình nu i cấy in vitro cũng

ược ghi nhận. Lần ầu ti n Nitsch và cộng sự (1969) ng d ng nhân ược cây

thuốc lá nh bội từ m sẹo ơn bội [139]. Woo và Chen (1982) qu n sát thấy m

sẹo và cây lú tái sinh từ hạt phấn in vitro tồn tại ở các m c bội th rất khác nh u

108

[219]. K t quả nghi n c u tr n cây lú qu nhiều lần qu n sát cho thấy m c bội th ở

m sẹo mới xuất hi n dưới 5 ngày như s u: ơn bội 78,38%; nh bội 11,74%, số còn

lại là m sẹo ở các m c bội khác từ 3n n 5n. Cây lú xuất hi n từ m sẹo cũng có

m c bội th khác nh u, trong số 168 cây nhận ược từ hạt phấn có 62% là cây nh

bội, 35% cây ơn bội, số còn lại là t m bội.

- Đối với mức độ biến dị di truyền của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: ở

nghi n c u này tìm hi u số lần cấy chuyền (số lần cấy chuyền càng c o thì tần số

bi n d càng lớn) trong quá trình nhân ph i som có ảnh hưởng tới khả năng bi n d di

truyền củ cây cọc rào. K t quả cho thấy chỉ có bi n d ở m c nhỏ từ lần cấy chuyền

th 6 trở l n. Khoảng cách di truyền x nhất với ở lần cấy chuyền th 9 so với cây bố

mẹ là 95,83% tương ồng, trong khi ó mẫu tương ồng gần nhất với cây bố mẹ là lần

cấy chuyền th 1 tới th 3 (tương ồng 100%). Điều này cho thấy các mẫu có ộ tương

ồng c o ảm bảo cây con từ ph i som có tính ổn nh di truyền c o so với cây ầu

dòng.

Như vậy, nh ng cây giống từ vi nhân giống cây cọc rào th ng qu kỹ thuật nu i

cấy ph i som n u như loại bỏ nh ng cây b bi n d ki u hình thì hầu như kh ng có

bi n d ki u gen ở m c bội th , và ở m c ki u di truyền. Trong quy trình vi nhân

giống cây cọc rào chúng t phải loại bỏ ở tỷ l bi n di ki u hình c o gần 30%, nhưng

h số nhân giống củ quy trình lại rất lớn s bù ắp lại. Mặt khác sự loại bỏ nh ng

ph i som b bi n d ở gi i oạn tăng sinh mạnh trong quy trình vi nhân giống n n chi

phí kh ng áng k . Vì vậy qu quá trình sàng lọc trong quy trình vi nhân giống cây

cọc rào từ ph i som vẫn ảm bảo hi u quả: h số nhân giống c o, ổn nh về mặt di

truyền so với cây ầu dòng, chất lượng cây giống ổn nh và ồng ều.

3.9. Xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma

3.9.1. Quy trình nhân giống in vitro cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma

B1. Tạo vật liệu nuôi cấy (3 tuần)

– Sử d ng mẫu lá cây cọc rào làm vật li u nu i cấy tạo ph i sơ cấp. Các cặp lá

th h i từ ỉnh củ cây ầu dòng hoặc chồi ngọn củ cây cọc rào (Jatropha curcas L.)

giống Ấn Độ trưởng thành ngoài ồng ruộng ược chọn lọc khử trùng v mẫu.

– Điều ki n khử trùng: Mẫu vật li u s u khi thu nhận ược khử trùng sơ bộ bằng

cách ặt dưới vòi nước chảy (30 phút), dùng xà phòng lo ng rử sơ bề mặt lá, s u ó

109

ngâm lá trong cồn 70° (30 giây) rồi rử lại bằng nước cất v trùng (3 ˗ 4 lần). Mẫu lá

ược chuy n vào tủ cấy và lắc khử trùng với dung d ch J vel có bổ sung 2 ˗ 3 giọt

Tween˗20 (10 phút), s u ó rử lại bằng nước cất v trùng (4 ˗ 5 lần).

– Các lá s u khi ược khử trùng s ược cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng t bào

(TCL). M i mảnh nhỏ lá có kích thước 0,5 × 1,0 mm ược cấy vào m i trư ng M1 là

môi trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D tạo m sẹo có khả năng phát sinh ph i.

B2. Tạo mô sẹo sinh phôi (3 tuần)

– M sẹo hình thành ược nu i cấy tr n m i trư ng M2 cảm ng tạo ph i

som là m i trư ng khoáng cơ bản MS có bổ sung 2,4˗D (0,5 mg/l) và KIN (1,0 mg/l).

– Nh ng mẫu cấy m sẹo sinh ph i hình thành s u 21 ngày nu i cấy là nguồn vật

li u tạo ph i som .

B3. Tăng sinh phôi soma (4 tuần)

– Các khối m sẹo và ph i từ B2 ược cấy chuyền tăng sinh phối tr n m i

trư ng M3 (m i trư ng tăng sinh ph i): m i trư ng MS cơ bản, bổ sung 20-30 g/l

ư ng sucrose; và spermidine (0,03 mg/l). Số lần cấy chuyền từ 1 tới 6 lần vẫn ảm

bảo h số nhân c o và kh ng bi n d di truyền.

– M i lần cấy chuyền cắt nhỏ khối m sẹo r thành 5 lần.

– Các ph i som phát tri n hình thành lá mầm s ược thu nhận chuy n s ng

gi i oạn tạo cây con hoàn chỉnh.

B4. Phát triển phôi soma (3 tuần)

– Nh ng khối phôi (thu nhận từ bước 3) ược nu i cấy tr n m i trư ng M4 (m i

trư ng phát tri n ph i) là m i trư ng MS cơ bản, bổ sung 20 g/l ư ng sucrose; KIN

(1 mg/l) giúp ph i phát tri n qu các gi i oạn. Các ph i som phát tri n hình thành lá

mầm s ược thu nhận chuy n s ng gi i oạn tạo cây con hoàn chỉnh.

B5. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi soma (4 tuần)

– Các ph i som phát tri n hình thành lá mầm (thu nhận từ B4) s ược thu nhận

chuy n s ng gi i oạn tạo cây con hoàn chỉnh. Theo ghi nhận chỉ có khoảng 50%

số ph i có th chuy n s ng gi i oạn phát tri n hình thành lá mầm.

– Các cây con hình thành từ ph i v tính cây cọc rào ược cấy chuyền vào các

m i trư ng B5 có hoặc kh ng bổ sung chất iều hò sinh trưởng kích thích sự phát

110

tri n rễ, các ph i v tính bắt ầu hình thành rễ, ti p t c phát tri n thành cây con hoàn

chỉnh. Cây con hình thành tốt tr n m i trư ng ược bổ sung 1,5 mg/l IBA.

B6. Chọn lọc cây giống từ phôi soma

– Loại bỏ nh ng cây từ ph i som có bi n d ki u hình. Số cây có bi u hi n bi n

d ki u hình chi m tỷ l 27,70%

– Nh ng cây giống phát tri n bình thư ng từ ph i som kh ng có bi n d ki u

hình ược sử d ng làm cây giống trong tri n kh i ngoài ồng ruộng.

– Qu nh ng ki m tr tính ổn nh di truyền củ cây từ ph i som qu sàng lọc

bi n d ki u hình cho thấy tính ổn nh củ cây giống rất c o.

B7. Ươm cây giống từ phôi soma ra ngoài vườn ươm (12 tuần)

- Nh ng cây giống phát tri n bình thư ng từ ph i som kh ng có bi n d ki u

hình ược sử d ng ươm tr n bột xơ dừ . Cây con từ ph i som 3 tháng tuổi có th

trồng ngoài ồng ruộng.

3.9.2. Hệ số nhân giống

- Theo quy trình vi nhân giống cây cọc rào bằng nu i cấy ph i som hình 4.26,

tổng th i gi n hoàn thi n quy trình vi nhân giống từ một mẫu lá non củ cây ầu

dòng là 49 tuần (khoảng 1 năm). Th ng qu chọn lọc từ quy trình, chúng ta có th tạo

r ược tr n 5 tri u cây giống từ ph i som áp ng y u cầu có th trồng ngoài ồng

ruộng. Cây giống này ảm bảo các tính năng: ổn nh di truyền so với cây bố mẹ, sạch

b nh, có rễ cộc giống cây từ hạt. Đồng th i với h số nhân giống lớn như vậy quy trình

này có th áp ng ược nhu cầu cây giống rất lớn ở quy m c nh tác cây cọc rào s u

này.

111

Khử trùng

Mẫu lá cây ầu dòng

- MT M1: MS + 0,5 mg/l 2,4-D - Th i gi n: 3 tuần

10 mẫu

Tạo m sẹo sinh phôi

- MT M2: MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l KIN - Th i gi n: 3 tuần

10 mẫu

Tạo vật li u nu i cấy

- MT M3: MS + 0,03 mg/l spermidine - Th i gi n: 4 tuần/ 1 lần cấy chuyền - Số lần cấy chuyền: 6 lần

10 x 56 x 102,7 phôi

Tăng sinh ph i som

- MT M4: MS + 1,0 mg/l KIN - Th i gian: 3 tuần

10 x 56 x 102,7 phôi

Phát tri n ph i som

- M i trư ng: B5 / B5 + 1,5 mg/l IBA - Th i gi n: 5 tuần

10 x 56 x 102,7 x 50% cây

- Loại bỏ các cây từ ph i som có

bi n d ki u hình

Tạo cây hoàn chỉnh từ ph i som

- Tỷ l bi n d là 27,70%

10 x 56 x 102,7 x 50% x 72,3% cây

Chọn lọc cây giống từ ph i som

- Cây ược trồng tr n giá th m n xơ dừ - Cây giống 3 tháng tuổi có th trồng ngoài ồng ruộng - Phần trăm h o h t là 10 %

10 x 56 x 102,7 x 50% x 72,3% x 90%

= 5.220.850,78 cây

Ươm cây giống

Cây giống vi nhân giống từ ph i som

Hình 3.26. Sơ ồ quy trình nhân giống cây cọc rào in vitro

112

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

 Kết luận

Đã nghiên cứu thành công sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá

cây cọc rào:

- Đ xác nh ược 2,4˗D có hi u quả cảm ng sự hình thành m sẹo có khả

năng sinh ph i som cây cọc rào. M i trư ng khoáng cơ bản MS có bổ sung 2,4˗D

(0,5 mg/l) ược ghi nhận có hi u quả cảm ng sự hình thành m sẹo trong nghi n

c u sự phát sinh ph i som cây cọc rào.

- Đ xác nh ược sự k t hợp gi 2,4˗D và KIN có hi u quả cảm ng sự

hình thành m sẹo có khả năng sinh ph i som cây cọc rào. M i trư ng khoáng cơ bản

MS có bổ sung 2,4˗D (0,5 mg/l) và KIN (1,0 mg/l) ược ghi nhận có hi u quả cảm

ng sự hình thành m sẹo có khả năng sinh ph i som cây cọc rào.

- M i trư ng khoáng MS cơ bản, bổ sung KIN 1,0 mg/l thích hợp cho sự hình

thành và phát tri n củ ph i som từ mẫu cấy m sẹo có khả năng sinh ph i som .

- M i trư ng khoáng MS cơ bản có bổ sung spermidine ở nồng ộ 0,03 mg/l và

glut mine ở nồng ộ 150 mg/l có tác ộng tối ưu l n sự hình thành ph i som cây cọc

rào.

- M i trư ng khoáng B5 có bổ sung 1,5 mg/l IBA là thích hợp nhất cho sự hình

thành rễ và phát tri n củ cây con tái sinh từ ph i som cây cọc rào nu i cấy in vitro.

Nghiên cứu sự ổn định di truyền của cây nhân giống từ nuôi cấy phôi soma:

- Qua quan sát ki u hình của cây cọc rào in vitro chi thành 4 nhóm ki u hình:

không xảy ra bi n d , bi n d ở lá, bi n d ở thân và bi n d ở cả lá và thân. Số cây

kh ng nhận thấy bi n d ki u hình tỷ l chi m 72,3%, số cây có bi u hi n bi n d ki u

hình chi m tỷ l 27,7%. Cây bi n d ki u hình thư ng kém phát tri n so với cây bình

thư ng, kh ng th sống khi ư r ngoài vư n ươm.

- Khảo sát 4 nhóm cây cọc rào in vitro ược nhân giống bằng các phương pháp

khác nhau: nuôi cấy ỉnh sinh trưởng; nuôi cấy lớp mỏng t bào lá; nuôi cấy phôi

soma (sau khi loại bỏ nh ng ph i b bi n d ki u hình) cho thấy ều mang bộ nhiễm

sắc th lưỡng bội (2n).

- Sử d ng kỹ thuật RAPD so sánh về mặt di truyền củ cây giống từ ph i

som s u khi loại bỏ nh ng ph i b bi n d ki u hình: Xét về m c ộ ổn nh di

113

truyền củ cây ph i som khi ánh giá nh ng mẫu con ở nh ng lần lặp lại cấy chuy n

khác nhau so với cây ầu dòng cho thấy các mẫu có ộ tương ồng c o (0,985) ảm

bảo cây con từ ph i som có tính ổn nh di truyền c o so với cây ầu dòng.

Xây dựng đƣợc quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma

Đ xây dựng ược quy trình nhân giống in vitro hi u quả ở cây cọc rào từ nu i

cấy ph i som . Theo quy trình vi nhân giống cây cọc rào bằng nu i cấy ph i som , s u

49 tuần th i gi n (khoảng 1 năm) từ một mẫu lá non từ cây bố mẹ th ng qu chọn lọc

chúng t có th tạo r ược tr n 5 tri u cây giống từ ph i som . Cây giống này ảm

bảo các tính năng: ổn nh di truyền so với cây ầu dòng, sạch b nh, có rễ cộc giống

cây từ hạt. Đồng th i với h số nhân giống lớn như vậy quy trình này có th áp ng

ược nhu cầu cây giống rất lớn ở quy m c nh tác cây cọc rào s u này.

 Kiến nghị

Trong quy trình vi nhân giống trong gi i oạn các ph i som phát tri n hình

thành lá mầm s ược thu nhận chuy n s ng gi i oạn tạo cây con hoàn chỉnh.

Theo ghi nhận chỉ có khoảng 50% số ph i có th chuy n s ng gi i oạn phát tri n hình

thành lá mầm. Do ó cần ti p t c nghi n c u có nh ng cải ti n trong gi i oạn này

giảm thi u tỷ l ph i som kh ng hình thành cây con hoàn chỉnh.

Từ quy trình nhân giống này, ti p t c nghi n c u khảo nghi m cây giống cọc rào

từ ph i som ngoài ồng ruộng ánh giá về khả năng tăng trưởng và năng suất

trước khi ph c v cho tri n kh i sản xuất hoặc tuy n chọn giống s u này.

K t hợp phân nhóm di truyền dự vào thực hi n phản ng RAPD với vi c phân

nhóm di truyền dự vào các phương pháp khác như: ISSR, AFLP, SCAR có th có

nh ng nhận nh chính xác và ộ tin cậy c o hơn trong tuy n chọn và l i tạo giống

mới cây cọc rào từ nu i cấy ph i som .

Từ quy trình nhân giống này, ti p t c nghi n c u chuy n gen và cải tạo giống

cây cọc rào cho năng suất c o, ph m chất tốt ph c v cho sản xuất.

114

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Đánh giá mức độ biến dị của cây cọc rào (Jatropha curcas L.) được nhân giống in

vitro thông qua tái sinh phôi. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Th Kim Lo n, Trần Trọng

Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí Công nghệ Sinh

học, 2015, 13(2A): 477-483.

2. Ảnh hưởng của một số acid amine và spemindin lên sự hình thành phôi vô tính cây

Cọc rào (Jatropha curcas L.). Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Th Kim Lo n, Trần Trọng

Tuấn, L Th nh Tuấn, Huỳnh L Thi n T , Thái Xuân Du, Nguyễn Đình Lâm,

Dương Tấn Nhựt. Tạp chí Sinh học, 2013, 35:136-144

3. Sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào đánh giá mức độ bội thể của cây cọc rào

(Jatopha curcas L.) nhân giống in vitro. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Th Kim Lo n,

Huỳnh L Thi n T , Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân Du, Dương

Tấn Nhựt. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2014, 52(4D): 42-50.

115

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Nguyễn Ti n Bân, Nguyễn Như Khánh (1979), Phương pháp nghiên cứu thực vật, tập 1. D ch từ nguy n bản củ Klein R.M., Klein D.T., NXB KH&KT Hà Nội. L Trần Bình, L Th Muội (1996), Phân lập gene và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gi , Hà Nội. Nguyễn Th Th nh Bình, Hoàng Th Hằng, N ng Văn Hải (2004), “Nghi n c u hình một số giống tằm bằng kỹ thuật RAPD”, Tạp chí di truyền học và ứng dụng. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Th L ng (1999), Ứng dụng DNA marker trong đánh giá quỹ gen cây lúa, Báo cáo kho học, Hội ngh C ng ngh sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 1216 – 1273. Võ Th Hoài Cảm (2010), Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và tính đa dạng di truyền của chin giống Jatropha (Jatropha curcas L.) ngoại nhập tại vùng đất xám Thủ Đức, Luận văn thạc sĩ kho học n ng nghi p, Trư ng Đại học N ng lâm Tp. HCM. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 363. Thái Xuân Du, Đ Đăng Giáp, Nguyễn Th Ngọc Hân, Bùi Văn Th Vinh, Nguyễn Du S nh, Dương Tấn Nhựt (2010), “Vi nhân giống cây cọc rào (Jatropha curcas L.) bằng kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng lá”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, tr.1287-1291. Đ Đăng Giáp, Nguyễn Th Kim Loan, Trần Trọng Tuấn, Trương Th Trúc Hà, Thái Xuân Du, Bùi Văn Th Vinh, Nguyễn Đình Lâm, Dương Tấn Nhựt (2012),“Ảnh hưởng của chất iều hò sinh trưởng thực vật lên nuôi cấy ỉnh sinh trưởng và thi t lập cây hoàn chỉnh ở cây Cọc rào (Jatropha curcas L.)”, Tạp chí Sinh học, 34, tr. 188 – 195. Hai J.Q. (2004), Hỏi đáp về kỹ thuật trồng hoa cây cảnh tập 1, Nhà xuất bản N ng nghi p, Hà Nội. (Trần Văn M o d ch).

10. Nguyễn Th Lài (2010), Khảo sát một số đặc điểm sinh học và tính đa dạng di truyền của một số giống cây Cọc rào (Jatropha curcas L.), luận văn thạc sĩ sinh học, chuy n ngành di truyền học, trư ng Đại học Kho học Tự nhi n Tp. HCM.

11. Đ Tất Lợi (1977), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học. 12. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật, tập 1, NXB N ng

Nghi p.

116

13. Nguyễn C ng Tạn (2008), “Tri n vọng và lộ trình phát cây Cọc rào sản xuất diesel sinh học ở Vi t N m”, Báo n ng nghi p Vi t N m, ngày 28/2 và 3/3/2008.

14. Văn Hồng Thi n (2007), Khảo sát đặc điểm di truyền và tinh dầu các quần thể Tràm (Melaleuca cajuputi) ở một số khu vực thuộc các tỉnh Miền Nam Việt Nam, Luận văn thạc sĩ kho học, Đại học Kho học Tự nhi n Tp. HCM. 15. Đ Vũ Tuy t Trinh (2009), Nghiên cứu một số biến đổi hình thái trong phát sinh cơ quan từ mẫu cấy lát mỏng tế bào lá Dầu mè (Jatropha curcas L.), Luận văn thạc sĩ Sinh học, chuy n ngành Sinh lý thực vật, trư ng Đại học Kho học Tự nhiên Tp. HCM.

16. Nguyễn Th Ngọc Tuy t (2009), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) tại Lâm Đồng, Luận văn thạc sĩ kho học, Đại học Kho học Tự nhi n Tp. HCM.

17. Bùi Văn Th Vinh, Chu Th Bích Phượng, Đ Đăng Giáp, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt (2011), “Tái sinh chồi trực ti p từ mẫu cấy lá cây Dầu mè (Jatropha curcas L.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9, tr. 79 – 85.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

18. Alcazar R., Garcia-Martinez J.L., Cuevas J.C., Tiburcio A.F. and Altabella T. (2005), “Overexpression of ADC2 in Arabidopsis induces dwarfism and late- flowering through GA deficiency”, Plant Journal, 43, pp. 425 – 436.

19. Altman A., Nadel B.L., Faiash Z. and Levin N. (1990), Somatic embryogenesis in celery: induction, control and changes in polyamines and proteins. In: Nijkamp H.J.J. (Ed), Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, Kluwer Academic Publishers, Amsterdam, pp. 454 – 459.

20. Ambrosi D.G., Galla G., Purelli M., Barbi T., Fabbri A. and Barcaccia G. (2010), “DNA m rkers nd FCSS n lyses shed light on the geneticdiversity and reproductive biology of Jatropha curcas L.”, Diversity, 2, pp. 810 – 836.

21. Ammirrato P.V. (1983), Embryogenesis. In: Evans D.A., Sharp W.A., Ammirrato P.V. and Yamada Y. (Eds.), Handbook for Plant Cell Culture, Macmillan Publication Co. New York, pp. 82 – 123.

22. An H.J., Jin S.B., K ng B.C. nd P rk H.G. (2008), “Production of som tic hybrids between Satsuma mandarin (Citrus unshiu) and navel orange (Citrus sinensis) by protopl st fusion”, Journal of Plant Biology, 51, pp. 186 – 191.

23. Anand A., Rao S.C., Latha R., Josekutty P.C. and Balakrishna P. (1998), “Microprop g tion of Uraria picta, a medicinal plant, through axillary bud culture nd c llus regener tion”, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 34, pp. 136 – 140.

24. Annggi N., B mb ng S.P., D rd E. nd Isw ri S.D. (2014), “Som tic embryogenesis media optimization study of physic nut (Jatropha curcas) as biodiesel feedstock”, Energy Procedia, 47, pp. 21 – 28.

117

25. Attfield E.M. nd Ev ns P.K. (1991), “St ges in the initi tion of root nd shoot organogenesis in cultured leaf explants of Nicotiana tobacum cv. X nthi nc”, Journal Experimental Botany, 42, pp. 59 – 63.

26. Biswas A.K. (2007), Induced mutation in grass pea. In: Ochatt S., Jain S.M. (Eds.), Breeding of neglected and underutilized crops, spices and herbs, Science Publishers, Jersey, Plymouth, USA, pp. 29 – 39.

28.

27. Biswas M.K, Islam R. nd Hoss in M. (2007), “Som tic embryogenesis in strawberry (Fragaria sp.) through c llus culture”, Plant Cell Tiss Organ Cult, 90, pp. 49 – 54. Bornmann C.H. (1993), Maturation of somatic embryos. In: Redenbaugh K. (Ed), Synseed: application of synthetic seeds to crop improvement, pp. 105 – 113. 29. Bornmann C.H. (1993), Micropropagation and somatic embryogenesis. In: Hayward M.D., Bosemark N.O. and Romagosa I. (Eds.), Plant breeding principles and prospects, Chapman and Hall. London, pp. 246 – 260.

30. Brettell R.I.S. nd Ingr m D.S. (1979), “Tissue culture in the production of novel disease-resist nt crop pl nts”, Biological Review, 54, pp. 329 – 345. 31. Brettell R.I.S., Godd rd B.V.D. nd Ingr in D.S. (1979), “Selection of Tins- cytoplasm maize tissue cultures resistant to Drechslera maydis T-toxin”, Maydica, 24, pp. 203 – 213.

32. Brettell R.I.S., Thom s E. nd Ingr m D.S. (1980), “Reversion of Tex s m le- sterile cytoplasm maize in culture to give fertile, T-toxin resist nt pl nts”, Theoretical and Applied Genetics, 58, pp. 55 – 58.

33. Broertjes C. and Van Harten A.M. (1978), Application of Mutation breeding in the improvement of vegetatively propagated crops, Oxford, New York. 34. Broertjes C., Roest S. nd Bokelm nn G.S. (1976), “Mut tion breeding of Chrysanthemum morifolium using in vitro and in vivo adventitious bud techniques”, Euphytica, 25, pp. 11 – 19.

35. Ch tteerjee R.N. (1985), “DNA dependent RNA polymerase

from Drosophila elanogaster embryonic cells from cell line”, Indian Journal of Experimental Biology, 23, pp. 1 – 7.

36. Ch tterjee G., Sikd r S.R., D s S. nd Sen S.K. (1985), “Regener tion of plantlets from mesophyll protoplasts of Brassica juncea L. Czern”, Plant Cell Reports, 4, pp. 245 – 247.

37. Christi nson M.L. nd W rnick D.A. (1984), “Phenocritic l times in the process of in vitro shoot org nogenesis”, Developmental Biology, 95, pp. 288 – 293.

38. Chu Q., Zh ng Z. nd G o Y. (1985), “Cytogenetic l n lysis on neuploids obtained from pollenclones of rice (Oryza sativa L.)”, Theoretical and Applied Genetics, 71, pp. 506 – 512.

118

39. Compton M.E. nd Mize C.W. (1999), “St tistic l consider tions for in vitro research: I-Birth of n ide to collecting d t ”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 35, pp. 115 – 121.

40. Cornu A., Vuillaume E. and Bodergat R. (1981), Interet des variants cytoplasmiques en amelioration des plantes, In: Proc int symp induced mutation as a tool for crop improvement, International atomic energy agency, Vienna.

41. Correll D.S. and Correll H.B. (1982), Flora of the Bahama Archipelago,Food

and Agriculture Organization.

42. Creissen G.P. nd K rp A. (1985), “K ryotypic ch nges in pot to pl nts regener ted from protopl sts”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 4, pp. 171 – 182.

44.

43. Cvikrová M., Binarova´ P., Edera J., Va´gnera M., Hrubcova´ M., Zon´ J. and M ch ´ckov ´ I. (1999), “Effect of inhibition of phenyl l nine mmoni -lyase activity on growth of Alfalfa cell suspension culture: Alterations in mitotic index, ethylene production, and contents of phenolics, cytokinins, and poly mines”, Physiologia Plantarum, 107, pp. 329 – 337. da Silva J.A.T and Nhut D.T. (2003), Control of plant organogenesis: genetic and biochemical signals in plant organ form and development. In: Nhut D.T., Le B.V., Tran Thanh Van K. And Thorpe T. (Eds.), Thin cell layer culture system: regeneration and transformation applications. Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, pp. 65 – 133.

45. Daigny G., Paul H., Sangwan R.S. and Sangwan-Norreel B.S. (1996), “F ctors influencing second ry som tic embryogenesis in M lus domestic Borkh”, Plant Cell Reports, 16, pp. 153 – 157.

46. D' m to F. nd B yliss M.W. (1985), “Cytogenetics of pl nt cell nd tissue cultures nd their Regener tes”, Critical Reviews in Plant Sciences, 3, pp. 73 – 112.

47. D tt M.M., Mukherjee P., Ghosh B. nd Jh T.B. (2007), “In vitro clonal propagation of biodiesel plant (Jatropha curcas L.)”, Current Science, 93, pp. 1438 – 1442.

48. Dehgan B. and Webster G.L. (1979), Morphology and

infrageneric relationships of the genus Jatropha (Euphorbiaceae),Univ.Cal. Publ. Bot.,74, pp. 1 – 73.

49. Delgado-Sanchez P., Saucedo-Ruiz M., Guzmán-Maldonado S.H., Villordo- Pineda E., González-Chavira M., Fraire-Velázquez S., Acosta-Gallegos J.A. and Mora-Avilés A. (2006), “An organogenic plant regeneration system for common bean (Phaseolus vulgaris L.)”, Plant Science, 170, pp. 822 – 827. 50. Dh ksh n moorthy D., Selv r j R., nd Chid mb r m A.L.A. (2011), “Induced mutagenesis in Jatropha curcas L. using gamma rays and detection of DNA

119

polymorphism through RAPD m rker”, Comptes Rendus Biologies, 334, pp. 24 – 30.

51. Do Dang Giap, Bui Van The Vinh, Nguyen Thi Kim Loan, Thai Xuan Du, Chu Thi Bich Phuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Phuc Huy, Tran Trong Tuan, Nguyen Dinh Lamand Duong Tan Nhut. (2012), “Org nogenesis nd som tic embryogenesis from leaf transverse thin cell layers of Jatropha curcas L.”, Journal Biotechology, 10, pp. 281 – 288.

52. Ducos J.P., Zamarripa A., Eskes A. and Pétiard V. (1993), Production of somatic embryos of coffee in a bioreactor, In: (Ed) Proceedings of the 15th Colloquium of International Coffee Science Association, ASIC, pp. 89 – 96.

53. Dudits D., Gyugyey J., Bugre L. and Bakó L., (1995), Molecular biology of somatic embryogenesis. In: Thorpe T.A. (Ed), In vitroEmbryogenesis in Plants. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, pp. 267 – 308.

55.

corn tissue culture. In: Henke R.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

62.

54. Dunstan D.I., Tautorus T.E. and Thrope T.A., (1995), Somatic embryogenesis in woody plants. In: Thorpe T.A. (Ed), In vitro Embryogenesis in Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordercht. pp. 471 – 538. Earle E.B. and Gracen V.E. (1985), Somaclonal variation in progeny of plants from (Eds.) Progagation of Higher Plants through Tissue Culture. Plenum, New York, pp. 139 – 152. El‐Shiaty O.H., El‐Sharabasy S.F., and El‐K reim A.H.A. (2004), “Effect of some amino acids and biotin on callus and proliferation of date palm (Phoenix dactylifera L.) Sewy cultiv r”, Arab Journal Biotechnology, 7, pp. 265 – 272. Evans D.A., Sharp W.R. and Medina-Filho. (1984), “Somaclonal and g metoclon l v ri tion”, American Journal of Botany, 71, pp. 759 – 774. Ev ns P.D. (1981), “Multiple receptor types for octop mine in the locust”, Journal Physiology, 318, pp. 99 – 122. Ev ns P.T. nd M lmberg R.L. (1989), “Do poly mines h ve roles in plant development?”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Mo1ecular Biology,40, pp. 235 – 269. Feirer R. P., Wann S. R. and Einspahr D.W. (1985), The effect of spermidine synthesis inhibitors on in vitro plant development, Plant Growth Regulation,3, pp. 319 – 327. Fienberg A.A., Choi J.H., Lubich W.P. nd Sung Z.R. (1984), “Development l regulation of polyainine inetabolisin in growth and differentiation of carrot culture”, Planta, 162, pp. 532 – 539. Finer J.J. and Nagasawa A. (1988), “Development of n embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max (L.) Merr.)”, Plant Cell Tissue Org. Cult, 15, pp. 125 – 136.

120

63.

64.

65.

66.

Flores H.E., Prot cio C.M. nd Signs M.W. (1989), “Prim ry nd second ry met bolism of poly mines in pl nts”, Recent Advances in Phytochemistry, 23, pp. 329 – 393. Fujimur T. nd Kom mine A. (1975), “Effects of v rious growth regul tors on the embryogenesis in c rrot cell suspension culture”, Plant Science Letter, 5, pp. 359 – 364. Fujimur T. nd Kom mine A. (1979), “Synchroniz tion of som tic embryogenesis in C rrot cell suspension culture”, Plant Physiology, 64, pp. 162 – 164. Fukui K. (1983), “Sequenti l occurrence of mut tions in growing rice c llus”, Theoretical and Applied Genetics, 65, pp. 225 – 230.

67. G h n P.B. nd Bell ni L.M. (1984), “Identificc tion of shoot pic l meristem cells committed to form vascular elements in Pisum sativumi L. and Vicia faba L.”, Annals of Botany, 54, pp. 837 – 841.

68. Gamborg O.L., Miller R.A. nd Ojim L. (1968), “Nutrient requirements of suspension cultures of soybe n root cells”, Experimental Cell Research, 50, pp. 151 – 158.

69. Ganesh S.R., Parthiban K.T., Kumar R.S., Thiruvengadam V. and Paramathma M., (2008), “Genetic diversity among Jatropha species as revealed by RAPD m rkers”, Genetic Resources and Crop Evolution, 55, pp. 803 – 809.

70. George E.F. (1993), Plant propagation by tissue culture - Part 1, The

technology, 2nd edn. Exegetics, Eddington.

71. Gomez-Jimenez M.C, Paredes M.A., Gallardo M., Nieves F.G. Enrique O. and Sanchez-C lle I.M. (2010), “Tissue-specific expression of oliveS-adenosyl methionine decarboxylase and spermidine synthase genes and polyamine met bolism during flower opening nd e rly fruit development”, Planta, 232, pp. 629 – 647.

72. Grimes H.D. nd Hodges T.K. (1990), “The inorg nic NO3: NH4 ratio influences plant regeneration and auxin sensitivity in primary callus derived from immature embryos of indica rice (Oryza sativa L.)”, Journal Plant Physiology, 136, pp. 362 – 367.

73. Grosser J.W., Gmitter F.G., Tus N. nd Ch ndler J.L. (1990), “Som tic hybrid plants from sexually incompatible woody species: Citrus reticulate and Citropsis gilleti n ”, Plant Cell Reports, 8, pp. 656 – 659.

74. Gupta P.K. and Holmstrom D. (2005), “Double St ining Technology For Distinguishing Embryogenic Cultures. Protocol for Somatic Embryogenesis in Woody Plants”, Forestry Sciences, pp. 573 – 575.

75. Gupt R.C. (1985), “Ph rm cognostic studies on “Dr v nti”. P rt 1 Jatropha

curcas L.”, Plant Science, 94, pp. 65 – 82.

121

76. Gupta S., Srivastava M., Mishra G.P., Naik P.K., Chauhan R.S., Tiwari S.K., Kum r M. nd Singh R. (2008), “An logy of ISSR nd RAPD m rkers for comparative analysis of genetic diversity among different Jatropha curcas genotypes”, African Journal of Biotechnology, 7, pp. 4230 – 4243.

77. H dr mi I.E. nd D'Auz c J. (1992), “Effects of growth regul tors on polyamine content and peroxidase activity in Hevea brasiliensis c llus”, Annals of Botany, 69, pp. 323 – 325.

78. Halperin W. (1970), Embryos from somatic plant cells, In: Helen P. (Ed), Control Mechanisms in the Expression of Cellular Phenotypes, Symp. Int. Soc. Cell boil., 9, pp. 69 – 90.

79. H nd A.K. nd M ttoo A.K. (2010), “Differenti l nd function l inter ctions emph size the multiple roles of poly mines in pl nts”, Plant Physiology and Biochemistry, 48, pp. 540 – 546.

80. H yter A.J. (1986), “The m ximum f milywise error r te of Fisher’s le st signifi-c nt difference test”, Journal of the American Statistical Association, 81, pp. 1001 – 1004.

81. Heinz D.M., Krisshnamurti L., Nickel and Maretzki A., (1977), Cell, tissue and organ culture in sugarcane improvement. In: Reinert J. and Bajaj Y.P.S. (Eds.), Applied and Fundamental Aspect of Plant Tissue and Organ Culture, Springer- Verlag, New York, pp. 13 – 17.

82. Heller J. (1996), Physic nut. Jatropha curcas L. In: International Plant Genetic Resources Institute, Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops, Prom Underused Crops, 1, pp. 1 – 66.

83. Heloir M.C., Fournioux J.C., Oziol L. nd Bessis R. (1997), “An improved procedure for the propagation in vitro of grapevine (Vitis vinifera cv. Pinot noir) using xill ry bud cuttings”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 49, pp. 223 – 225.

84. Hilae A. and Te-ch to S. (2005), “Effects of c rbon sources nd strengths of MS medium on germination of somatic embryos of oil palm (Elaeis quineensis J cq.)”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 3, pp. 629 – 635.

86.

87.

85. Huy P.N. nd Nhut D.T. (2012), “In vitro morphogenic response of leaf explants of Kiwifruit (Actinidia deliciosa)”, Journal of Biotechnology, 10, pp. 995 – 1003. Ikbal K., Boora S. nd Dhillon R.S. (2010), “Ev lu tion of Jatropha curacs L. using RAPD m rkers”, Indian Journal of Biotechnology, 9, pp. 50 – 57. Imai A., Matsuyama T., Hanzawa Y., Takashi A., Masanori T., Hikaru S., Yumiko S., Tomohiko K., Hiroaki H., Daisuke S., Satoshi T., Yoshibumi K. nd T k h shi T. (2004), “Spermidine synth se genes re essenti l for surviv l of Arabidopsis”, Plant Physiology, 135, pp. 1565 – 1573.

122

88.

89.

90.

Ismidi nty D. nd Esy nti R.R. (2010), “F tty cid composition induced in somatic embryo of Jatropha curcas in biore ctor”, International Conference on Mathematics and Natural Sciences, pp. 158 – 172. Jh T.B., Mukherjee P. nd D tt M.M. (2007), “Som tic embryogenesis in Jatropha curcas L., n import nt biofel pl nt”, Plant Biotechnology Reports, 1, pp.135 – 140. Joubert P.H., Brown J.M.M., H y I.T. nd Seb t P.D.B. (1984), “Acute poisoning with Jatropha curcas purging nut tree in children”, South AfricanMedicalJournal, 65, pp. 729 – 730.

91. Kaewpoo M. and Te-ch to S. (2009), “Influence of expl nts types nd plant growth regulators on multiple shoot formation from J. curcas”, Science Asia, 35, pp. 353 – 357.

92. Kai G.Y., Dai L.M., Mei X.Y.and Zheng J.G.

(2008), “In vitro plantregeneration from leaf explants of Ophiorrhiza japonica”, Plant Biology, 52, pp. 557 – 560.

93. Kalimuthu K., Paulsamy S., Senthilkumar R. and Sathya M. (2007), “In vitro propagation of the biodiesel plant Jatropha curcas L.”, Plant Tissue Culture and Biotechnology, 17, pp. 137 – 147.

94. K r N.T. nd Ari S. (2008), “In vitro plant regeneration from embryogenic cell suspension culture of Astragalus chrysochlorus (Leguminose e)”, African Journal of Biotechnology, 7, pp. 1250 – 1255.

95. Kaur-S whney R., Shih L.M, Flores H.E. nd G lston A.W. (1982), “Rel tion of polyamine synthesis and titer to ging nd senescence in O t le ves”, Plant Physiology, 69, pp. 405 – 410.

96. Kemble R.J. nd Shep rd J.F. (1984), “Cytopl smic DNA v ri tion in pot to

protoclon l popul tion”, Theoretical and Applied Genetics, 69, pp. 211 – 216.

97. Kevers C., G l N.L., Monteiro M., Dommes J. nd G sp r T. (2000), “Som tic embryogenesis of Panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and their met bolic p thw ys”, Plant Growth Regulation, 31, pp. 209 – 214. 98. Knittel N., Escandon A.S. and Hahne G. (1991), “Pl nt regener tion t high frequency from m ture Sunflower cotyledons”, Plant Sciences, 73, pp. 219 – 226.

99. Kopertekh L.G. nd Stribn y L.A. (2003), “Pl nt regener tion from whe t le f

expl nts”, Russian Journal of Plant Physiology, 50, pp. 365 – 368.

100. Kr nz E. (1988), “Som tic embryogenesis in st tion ry ph se suspension cultures derived from hypocotyl protoplasts of Brassica napus L.”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 12, pp. 141 – 146.

101. Kumar R.V., Yogendra K., Tripathi, Shukla P., Ahlawat S.P. and Gupta V.K. (2009) “Genetic diversity nd rel tionships mong germpl sm of Jatropha curcas L. reve led by RAPDs”, Trees, 23 pp. 1075 – 1079.

123

102. Kum r V., M kk r H.P.S. nd Becker K. (2010), “Detoxified Jatropha curcas kernel meal as a dietary protein source: Growth performance, nutrient utilization and digestive enzymes in common carp (Cyprinus carpio L.) fingerlings”, Aquaculture Niutrition, pp. 1 – 14.

103. Kumari N., Jaiswal U.and J isw l V.S. (1998), “Induction of som tic embryogenesis and plant regeneration from leaf callus of Terminalia arjuna Bedd”, Current Science, 75, pp. 1052 – 1055.

104. Kus no T., Berberich T., T ted C. nd T k h shi Y. (2008), “Poly mines:

essential factors for growth nd surviv l”, Planta, 228, pp. 367 – 381.

105. L i F.M. nd McKersie B.D. (1993), “Effect of nutrition on m tur tion of

alfalfa (Medicago sativa L.) som tic embryos”, Plant Science, 91, pp. 87 – 95.

106. Lansac A.R., Sullivan C.Y. and Johnson B.E. (1996), “Accumul tion of free proline in sorghum (Sorghum bicolor) pollen”, Canadian Journal of Botany, 74, pp. 40 – 45.

107. L rkin P.J. nd Scowcroft W.R. (1981), “Som clon l v ri tion - a novel Source of v ri bility from cell cultures for pl nt improvement”, Theoretical and Applied Genetics, 60, pp. 197 – 214.

108. Leal F., Loureiro J., Rodriguez E., Pais M. S., Santos C. and Pinto-Carnide O. (2006), “Nucle r DNA content of Vitis vinifera cultivars andploidy level analyses of somatic embryo-derived plants obtainedfrom anther culture”, Plant Cell Reports, 25, pp. 978 – 985.

109. Leela T., Naresh B., Srikanth R.M., Madhusudhan N.C. and Cherku P.D. (2011), “Morphologic l, physico-chemical and micropropagation studies in Jatropha curcas L. nd RAPD n lysis of the regener nts”, Applied Energy, 88, pp. 2071 – 2079.

110. Lee-St dlem nn O.Y., Lee S., H cket W.P. nd Re d P.E. (1989), “The formation of adventitious buds in vitro on micro – section of hybrid populus le f midveins”, Plant Science, 61, pp. 263 – 267.

111. Lele S. (2006), Biodiesel and Jatropha Cultivation, Agrobios (India). 112. Lin J., Jin Y., Zhou X. nd W ng J. (2010), “Molecul r cloning nd function l analysis of the gene encoding geranylgeranyl diphosphate synthase from Jatropha curc s”, African Journal of Biotechnology, 9, pp. 3342 – 3351.

113. Litz R.E. nd Sch ffer B. (1987), “Poly mines in dventitious nd som tic embryogenesis in mango (Marzgifera irzdica L.)”, Journal of Plant Physiology, 128, pp. 251 – 258.

114. LoSchiavo F., Pitto L., Giuliano G., Torti G., Nuti-Ronchi V., Marazziti D., Verg r R., Orselli S. nd Terzi M. (1989), “DNA methyl tion of embryogenic carrot cell cultures and its variations as caused by mutation, differentiation, hormones nd hypomethyl ting drugs”, Theoretical and Applied Genetics, 77, pp. 325 – 331

124

115. Mahalakshmi R., Eg n th n P. nd P rid A. (2014), “In vitro regeneration from different ages of petioles of physic nut (Jatropha curcas L.)”, African Journal of Biotechnology, 13, pp. 265 – 273.

116. M lmberg R.L. nd McIndoo J. (1983), “Abnorm l for l development of

tob cco mut nt with elev ted poly mine levels”, Nature, 305, pp. 623 – 625.

117. M rch nt R., D vey M.R., Luc s J.A. nd Power J.B. (1996), “Som tic embryogenesis and plant regeneration in Floribunda rose (Rosa hybrida L.) cvs. Trumpeter nd Gl d Tidings”, Plant Science, 120, pp. 95 – 105.

118. M tthews H.R. (1993), “Poly mines, chrom tin structure nd tr nscription”,

Essays In Biochemistry, 15 (8), pp. 561 – 566.

119. Mattoo A.K., Chung S.H., Goyal R.K., Fatima T., Srivastava A., Solomos T. nd H nd A.K. (2007), “Over-accumulation of higher polyamines in ripening transgenic tomato fruit revives metabolic memory, upregulates anabolism- related genes, and positively impacts nutritional quality”, Journal of AOAC International, 90 (5), pp. 1456 – 1464.

120. McClell M.T., Smith M.A.L. nd C rothers Z.B. (1990), “The effects of in vitro and ex vitro root initiation on subsequent microcutting root quality in three woody pl nts”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 23, pp. 115 – 123.

121. Mengoli M. nd B gni N. (1992), “Poly mines nd som tic embryogenesis in

higher pl nts”, Plant Tissue Culture Letter, 68, pp. 2 – 8.

122. Merkle S.A. (1995b), “Str tegies for de ling with limit tion of som tic embryogenesis in h rdwood trees”, Plant Tissue Culture and Biotechnology, 1, pp. 112 – 121.

123. Minoch R., M jumd r R., nd Minoch S.C. (2014), “Poly mines nd biotic stress in pl nts: complex rel tionship”, Frontiers in Plant Science, 5, pp. 1 – 17.

124. Minocha S. C., Robic C. A., Khan A. J., Papa N., Samuelsen A. I. and Minocha R. (1990), Polyainine and ethylene biochemistry in relation to somatic embryogenesis in carrot (Daucus carota L.) cell cultures. In: Flores H.E., Arteca R.N. and Shannon J.C. (Eds.), Polyamines and ehtylen: biochemistry, physiology, and interaction,Plant Physiology, pp. 339 – 342.

125. Minoch S.C. nd Minoch R. (1995), “Role of poly mines in som tic embryogenesis. In: Bajaj Y.P.S. (Ed), Biotechnology in agriculture and forestry, Vol 30: Somatic embryogenesis and synthetic seed I, Heidelberg, Germany, pp. 53 – 70.

126. Mohamad A.J., Janagoudar B.S., Biradar D.P., Ravikumar R.L., Koti R.V. and P til S.J. (2009), “Genetic diversity n lysis of elite Jatropha curcas L. genotypes using r ndomly mplified polymorphic DNA m rkers”, Karnataka Journal of Agricultural Sciences, 22, pp. 293 – 295.

125

127. Mont gue M.J., Koppenbrink J.W. nd J wor ski E.G. (1978), “Poly mine metabolism in embryogenic cells of Daucus carota I. Changes in arginine dec rboxyl se ctivity”, Plant Physiology, 62, pp. 430 - 433.

128. Monteiro M., Kevers C., Dommes J. nd G sp r T. (2002), “A specific role for spermidine in the initiation phase of somatic embryogenesis in Panax ginseng CA Meyer”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 68, pp. 225 – 232.

129. Mor dkh ni H. (2012), “Investig tion of dventitious shoot regener tion from in vitro stem explants of Melissa officinalis L.”, Journal of Medicinal Plants Research, 6, pp. 3217 – 3221.

130. Mur shige T. nd N k no R. (1967), “Chromosome complement s determin nt of the morphogenic potenti l of tob cco cells”, American Journal of Botany, 54, pp. 963 – 970.

131. Mur shige T. nd Skoog F. (1962), “A revised medium for r pid growth nd bio ss ys with tob cco tissue cultures”, Physiologia Plantarum, 15, pp. 473 – 497.

132. MurchS.J., Victor J.M.R., Krishn r j S. nd S xen P.K. (1999), “The role of proline in thidiazuron-induced som tic embryogenesis of pe nut”, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 35, pp. 102 – 105.

ripening and Senescence.

133. Nagl W. (1990), “Translocation of putrescine in the ovule, suspensor and embryo of Phaseolus coccineus. J.”, Plant Physiology, 136, pp. 587 – 591. 134. Nambeesan S., Handa A.K. and Mattoo A.K. (2008), Polyamines and regulation of In: PaliyathG., MurrD.P., HandaA.K.and Lurie S. (Eds.), Postharvest biology and technology of fruits, vegetables and flowers. Blackwell Publishers, pp. 319 – 340.

135. Nhut D.T., da Silva J.A.T., Aswath C.R., Le B.V. and Tran Thanh Van K. (2003a), Biochemical and molecular markers in programmed plant differentiation and munipulation of the morphogenetic pathways in tobacco and lily by using TCL technique. In: Nhut D.T., Le B.V., Tran Thanh Van K. and Thorpe T. (Eds.), Thin cell layer culture system: regeneration and transformation applications. Kluwer Academic Publishers, the Netherlands. pp. 217 – 245.

136. Nhut D.T., da Silva J.A.T., Le B.V and Tran Thanh Van K. (2003b), Thin cell layer morphogenesis as a power tool in ornamental plant micropropagation and biotecnolgy. In: Nhut D.T., Le B.V., Tran Thanh Van K. and Thorpe T. (Eds.), Thin cell layer culture system: regeneration and transformation applications. Kluwer Academic Publishers, the Netherlands. pp. 247 – 284.

137. Nhut D.T., Vinh B.V.T., Hien T.T., Huy N.P., Nam N.B. and Chien H.X., (2012), “Effect of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese

126

(Panax vietnamensis H et. Grushv.)”, African Journal of

ginseng Biotechnology, 11, pp. 1084 – 1091.

138. Nishi T. and Mitsuoka S. (1969), “Occurrence of v rious ploidy pl nts from nther nd ov ry culture of rice pl nt”, Japanese Journal of Genetics, 44, pp. 341 – 346.

139. Nitsch J.P. nd Nitsch C. (1969), “H ploid Pl nts from Pollen Gr ins”, Science,

163, pp. 85 – 87.

140. Norris R.E. and Smith R.H. (1981), “Regener tion of v rieg ted African violet (Saintpailia ionantha Wendl.) le f chimer s in culture”, Plant Physiology, 67, pp. 117.

141. Nuti-Ronchi V., Adelaide C.M., Nozzolini M. and Luccarini G. (1984), “Stimul tion of c rrot som tic embryogenesis by proline nd serine”, Plant Cell Reports, 3, pp. 210 – 214.

142. Obae G.S. and West T.P. (2010), “Nucle r DNA content of Hydrastis canadensis L. and genome size stability of in vitro regener ted pl ntlets”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 102, pp. 259 – 263.

143. Ogit S., S s moto H., Yeung E.C. nd Thorpe T.A. (2001), “The effects of glutamine on the maintenance of embryogenic cultures of Cryptomeria japonica”,In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 37, pp. 268 – 273.

144. Ogunsola K.E. and Ilori C.O. (2008), “In vitro propagation of miracle berry (Synsepalum dulcificum Daniel) through embryo nd nod l cultures”, African Journal of Biotechnology, 7, pp. 244 – 248.

145. Oono K. (1982), Characteristics of mutation in cultured rice tissues, Food and

Agricuture Organization.

146. Orton T.J. (1984), “Studies on the inherit nce of resist nce to Fusarium

oxysporum f. sp. apii in celery”, Plant Disease, 68, pp. 574 – 578.

147. P ndey A., T mt S. nd Giri D. (2011), “Role of uxin on dventitious root formation and subsequent growth of cutting raised plantlets ofGinkgo biloba L.”, International Journal of Biodiversity and Conservation, 3, pp. 142 – 146. 148. Philip V.J.,

Joseph D., Triggs G.S. and Dickinson N.M. (1992), “Micropropagation of black pepper (Piper nigrum Linn.) through shoot tip cultures”, Plant Cell Reports, 12, pp. 41 – 44.

149. Qiren C., Zhenhu Z. nd Yu nhu G. (1985), “Cytogenetic l n lysis on aneuploids obtained from pollenclones of rice (Oryza sativa L.)”, Theoretical and Applied Genetics, 71, pp. 506 – 512. (1997), Polyamines. In: Prasad M.N.V. 150. Rajam M.V. (ed), Plant

Ecophysiology. New York: John Wiley & Sons, pp. 343 – 374.

127

151. R jore S. nd B tr A. (2007), “An ltern tive source for regener ble organogenic callus induction in Jatropha curcas L.”, Indian Journal of Biotechnology, 6, pp. 545 – 548.

152. Ram S.G., Parthiban K.T., Senthil Kumar R., Thiruvengadam V. and P r m thm M. (2007), “Genetic diversity mongJ troph species s reve led by RAPD m rkers”, Genetic Resources and Crop Evolution, 55, pp. 803 – 809. 153. Rival A., Beule T., Barre P., Hamon S., Duval Y. and Noirot M. (1997), “Comp r tive flow cytometric estim tion of nucle r DNA content in oil p lm (Elaeis guineesis Jacq.) tissue cultures and seed-derived pl nts”, Plant Cell Reports, 16, pp. 884 – 887.

154. Sacrist n M.D. nd Melchers G. (1960), “The c ryologic l n lysis of pl nts regener ted from tumorous nd other c llus culture of tob cco”, Molecular Genetics and Genomics, 105, pp. 317 – 333.

155. Saha M., Phatak A. and Chandra N. (2004), “In vitro culture studies in four dioecious varieties of Carica papaya L. using axillary buds from field-grown pl nts”, Journal of Tissue Research, 4, pp. 211 – 214.

156. Santos M.A., Camara T., Rodriguez P., Claparols I. and Torné J.M. (1996), “Influence of exogenous proline on embryogenic and organogenic maize callus subjected to s lt stress”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 47, pp. 59 – 65.

157. Sara A. nd Kh led. (2011), “Effects of c sein hydrolys tes nd glut mine on callus and somatic embryogenesis of Date Palm (Phoenix dactylifera L.)”, New York Science Journal, 4, pp. 121  125.

158. Sch effer G.W. (1982), “Recovery of herit ble v ri bility in nther-derived

doubled-h ploid rice”, Crop Science, 22, pp. 1160 – 1164.

159. Schobert B. (1977), “Is there n osmotic regul tory mech nism in algae and

higher pl nts?”, Journal of Theoretical Biology, 68, pp. 17 – 26.

160. Serafini-Fracassini D. and Mosseti U. (1984), Free and bound polyamines in different stages of Helianthus tuberosus tuber. In: Selmeci L., Brosnan M.E. and Seiler N. (Eds.), Recent Progress in Polyamine Research, Akademiai Kiad, Budapest, and VNU, The Nederlands, pp. 551 – 560.

161. Sharp W.R., Sondahl M.R., Caldas L.S. and Maraffa S.B. (1980), “The physiology of in vitro sexu l embryogenesis”, Horticultural Reviews, 2, pp. 268 – 310.

162. Shep rd J.F., Bidney D. nd Sh hin E., (1980), “Pot to protopl sts in crop

improvement”, Science, 208, pp. 17 – 24.

163. Shetty K. (1997), “Biotechnology to h rness the benefits of diet ry phenolics; focus on L mi ce e”, Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 6, pp. 162 – 171.

128

164. Shetty K. nd As no Y. (1991), “The influence of org nic nitrogen sources on the induction of embryogenic callus in Agrostis alba L.”, Plant Physiology, 139, pp. 82 – 85.

165. Shetty K. nd McKersie B.D. (1993), “Proline, thioproline nd pot ssium in Alfalfa (Medicago

mediated stimulation of somatic embryogenesis sativa L.)”, Plant Science, 88, pp. 185 – 193.

166. Shi D.H., Kim J.S., Kim I.J., Y ng J., Chung G.C. nd H n K.H. (2000), “A short regeneration protocol effective on diverse genotypes of sunflower (Hellanthus Annuusl)”, In Vitro Cell, Dev. Biol. Plant, 36, pp. 273 – 278. 167. Shimizu K., N g ike H., Y buy T. nd Ad chi T. (1997), “Pl nt regener tion from suspension culture of Iris germanica”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 50, pp. 27 – 31.

168. Shriv st v S. nd B nerjee M. (2008), “In vitro clonal propagation of physic nut (Jatropha curcas L): influence of dditives”, International Journal of Integrative Biology, 3, pp. 73 – 77.

169. Singh B.B. nd Gupt D.P. (1983), “Proline ccumul tion nd rel tive w ter content in soybe n v rieties under stress”, Annals of Botany, 52, pp. 109 – 110. 170. Skub tz H., B sti n J. D., Meeuse nd Arnold J.B. (1989), “Oxid tion of proline and glutamate by mitochondria of the inflorescence of Voodoo lily (Sauromatum guttatum)”, Plant Physiology, 91, pp. 530 – 535.

171. Sliwinska E. and Thiem B. 2007. “Genome size st bility in six medicin l pl nt

species propagated in vitro”, Plant Biology, 51, pp. 556 – 558.

172. Slocum R.D. (1991), Tissue and subcellular localization of polyamines and enzymes of polyamine metabolism. In: Slocum R.D. and Flores H.E. (Eds.), Biochemistry and physiology of polyamines in plants, Boca Raton, pp. 23 – 40.

173. Smith D.L. nd Krikori n A.D. (1989), “Rele se of som tic embryogenic potential from excised zygotic embryos of carrot and maintenance of proembryonic cultures in hormone-free medium”, American Journal of Botany, 76, pp. 1832 – 1843.

174. Son l S., Sh rm A., S rd n J., Sh rm M.M. nd B tr A. (2012), “Som tic embryogenesis Jatropha curcus L. using cotyledon ry le ves”, Indian Journal of Biotechnology, 11, pp. 348 – 351.

175. Soomro R. nd Memoom R.A. (2007), “Est blishment of c llus nd suspension

culture in Jatropha curcas”, Pakistan Journal of Botany, 39, pp. 2431 – 2441.

176. Stew rd C.N.J. nd Vi L.E. (1993), “A r pid CTAB DNA isol tion technique pplic tions”, fingerprinting other PCR nd

useful for RAPD BioTechniques,14, pp. 748 – 750.

177. Stirpe F., Pession-Brizzi A., Lorenzoni E., Strocchi P., Montanaro L. and Sperti S. (1976), “Studies on the proteins from the seeds of Croton tiglium and of

129

Jatropha curcas. Toxin properties and inhibition of protein synthesis in vitro”, Biochemical Journal, 156, pp. 1 – 6.

178. Stu rt D.A. nd Strickl nd S.G. (1984), “Som tic embryogenesis from cell cultures of Medicago sativa L. The role of amino acid additions to the regener tion medium”, Plant Science Letters, 34, pp. 165 – 174.

179. Subr m ny m K., Mur lidh r r o D. nd Dev nn N. (2009), “Genetic diversity assessment of wild and cultivated varieties of Jatropha curcas L. in Indi by RAPD n lysis”, African Journal Biotechnology,8, pp. 1900 – 1910. 180. Sugiyama M. (1999), “Org nogenesis in vitro”, Plant Biology, 2, pp. 61 – 64. 181. Suj th M. nd Mukt N. (1996), “Morphogenesis nd pl nt regener tion from tissue cultures of Jatropha curcas”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 44, pp. 135 – 141

182. Suj th M., M kk r H.P.S nd Becker. (2005), “Shoot bud prolifer tion from axillary nodes and leaf sections of non-toxic J. curcas L.”, Plant Growth Regulation, 47, pp. 83 – 90.

183. Sunderland N. (1973), Pollen and another culture, pp. 205 – 239, In: Street H.E., (Ed.),Plant Tissue and cell Culture. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

184. Sung Z.R. and Okimoto R. (2002), Embryonic proteins in somatic embryos of

carrot, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, pp. 3683 – 3687.

185. Suprasanna P., Rao K.V. and Reddy G.M. (1994), “Embryogenic c llus in m ize: genotypic nd mino cid effects”, Cereal Research Communication, 22, pp. 79 – 82.

186. Swedlund B. nd Locy R.D. (1993), “Sorbitol as the primary carbon source for the growth of embryogenic c llus of m ize”, Plant Physiology, 103, pp. 1339 – 1346.

187. T k h shi T. nd K kehi J.I. (2010), “Poly mines: ubiquitous polyc tions with

unique roles in growth nd stress responses”, Annals of Botany, 105, pp. 1 – 6.

188. T k y m S. nd Akit M. (1994), “The types of biore ctors used for shoots nd embryos”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 39, pp. 147 – 156. 189. T ylor C.B. (1996), “Proline nd w ter deficit: ups nd downs”, Plant Cell, 8,

pp. 1221 –1224.

190. Tetu T., Sangwan R.S. and Sangwan–Noreel B.S. (1990), “Direct som tic embryogenesis and organogenesis in cultured immature zygotic embryos of Pisum sativum L.” J. Plant Physiol, 137, pp. 102 – 109.

191. Theiss C., Peter B. nd Jürgen V. (2002), “Regul tion by poly mines of ornithine decarboxylase activity and cell division in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii”, Plant Physiology, 128, pp. 1470 – 1479.

130

192. Theps mr n N., Thepsith r C. nd Thongpukdee A. (2006), “In vitro induction of shoots and roots from Jatropha curcas L. expl nts”, Journal Horticultural Science and Biotechnology, 83, pp. 106 – 112.

193. Thom s T. nd Thom s T.J. (2001), “Poly mines in cell growth nd cell de th: molecul r mech nisms nd ther peutic pplic tions”, Cellular and Molecular Life Sciences, 58, pp. 244 – 258.

194. Tisi A., Federico R., Moreno S., Lucretti S., Moschou P.N., Roubelakis- Angelakis K.A., Angelini R. and Cona A. (2011), “Perturb tion of poly mine c t bolism c n strongly ffect root development nd xylem differenti tion”, Plant Physiology, 157, pp. 2258 – 2258.

195. Torrey J.G. (1966), The initiation of organized development in plant, Advances

in Morphogenesis.

196. Torrigiani P., Bregoli A.M., Vanina Z.V. and Guglielmo C.G. (2008), “Molecul r nd biochemic l spects underlying poly mine modul tion of fruit development nd ripening”, Stewart Postharvest Reviwe, 2(10), pp. 1 – 12. 197. Tr n Th nh V n K. (1980), “Control of morphogenesis by inherent nd exogenously pplied f ctors in thin cell l yer”, International Review Cytology, 32, pp. 291 – 311.

198. Tran Thanh Van K. (2003), Thin cell layer concept. In: NhutD.T., Van L.B., Tran Thanh Van K.and Thorpe T.A.(Eds.), Thin cell layer culture system: Regeneration and Transformation Application, Kluwer Academic Publishers, Netherlands,pp. 1 – 12.

199. Tr n Th nh V n K. nd Gendy C. (1996), “Thin cell l yer (TCL) method to progr mme morphogenetic p tterns”, Plant Tissue Culture Manual, 144, pp. 1 – 25.

200. Tran Thanh Van K. and Mutaffschiew V.S. (1990), Signal influencing cell elongation, cell enlargement, cell division and morphogenesis. In: Nijkam H.J.T.and Van Der Plas L.H.W. (Eds.), Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, Kluwer Academic Publishers, pp.514 – 519.

201. Tr n Th nh V n M. (1973), “In itro control of de novo flower, bud, root and differenti tion from excised epiderm l tissues”, Nature, 246, pp. 44 – 45. 202. Tr ore A. nd Guiltin n M.J. (2006), “Efects of c rbon sources nd exp lnt type on som tic embryogenesis of four C c o genotypes”, HortScience, 41, pp. 753 – 758.

203. Trigianno R.N. and Conger B.V. (1987), “Regul tion of growth nd som tic embryogenesis by proline and seriile in suspension cultures of Dactylis glomerata”, Journal Plant Physiology, 130, pp. 49 – 55.

204. Ur no K., Hobo T. nd Shinoz ki K. (2005), “Ar bidopsis ADC genes involved in poly mine biosynthesis re essenti l for seed development”, FEBS Letters, 579, pp. 1557 – 1564.

131

205. Van Staden J., Zazimalova E. and George E.F. (2008),Plant growth regulators II: Cytokinins, their analogues and antagonist. In: George E.F., Hall M. and De Kleck G.J. (Eds.), Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd edn. The Netherlands, pp. 205 – 226.

206. Vanildo S., Balbuena T.S., Santa-Catarina, Floh E.I.S., Guerra M.P. and H ndro W. (2004), “Biochemic l ch nges during seed development in Pinus taeda L.”, Plant Growth Regulation, 44, pp. 147 – 156.

207. V ris i S.M., Sung J.M. , Jeng T.L. nd W ng C.S. (2004), “Optimiz tion of somatic embryogenesis in suspension cultures of horsegram Macrotyloma uniflorum (L m.) Verdc. h rdy gr in legume”, Scientia Horticulturae, 106, pp. 427 – 439.

208. Venek mp J.H. nd Koot J.T.M. (1984), “The distribution of free mino cids, especially of proline, in the organs of field bean plants, Vicia faba L., during development in the field”, Journal Plant Physiology, 116, pp. 343 – 349. 209. Victoria N.R., Maria A.C., Mauro N. and Gualtiero L. (1984), “Stimulation of c rrot som tic embryogenesis by proline nd serine”, Plant Cell Reports, 3, pp. 210 – 214.

210. Vikrant A. and R shid A. (2002), “Som tic embryogenesis from imm ture nd mature embryos of a minor millet Paspalum scrobiculatum L.”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 69, pp. 71 – 77.

211. Vries H.D. and Boedijn K. (1901), Die Mutationstheorie, Veit, Leipzig. 648 212. Wallace H.M. (2009), “The poly mines: p st, present nd future”, Essays In

Biochemistry, 46, pp. 1 – 9.

213. Wallsgrove R.M. (1995), Amino acids and their derivatives in higher plants,

Cambridge University Press, Cambridge.

214. Wang Y., Ruemmele B., Chandlee J., Sullivan M., Knapp J. and Kausch A. (2002), “Embryogenic c llus induction nd pl nt regener tion medi for Bentgr sses nd nnu l Bluegr ss”, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 38, pp. 460 – 467.

215. W r k god P.S nd Sub singhe S. (2009), “Shoot proliferation of Jatropha curcas L.”, Tropical Agricultural Research and Extension, 12, pp. 77 – 80. 216. Wei Q., Lu W.D., Liao Y., Pan S.L., Xu Y., Tang L. and Chen F. (2004), “Plant regeneration from epicotyl explant of Jatropha curcas”, Physiology and Molecular Biology of Plant, 30, pp. 475 – 478.

217. Willi ms E.G. nd M hesw r n C. (1986), “Som tic embryogenesis: f ctors influencing co-ordin ted beh viour of cells s n embryogenic group”, Annals of Botany, 57, pp. 443 – 462.

218. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A. and Tingey S.V. (1990), “DNA polymorphisms mplified by rbitr ry primers re useful s genetic m rkers”, Nucleic Acids Research, 18, pp. 6531 – 6535.

132

219. Woo S.C. and Chen C.C. (1982), Rice another culture in Taiwan. In: Rice tissue

cult planning conf. IRRI Los Banos, pp. 83 – 90.

220. Zainudina A., Maftuchahaand Fitri nib H. (2014), “An lysis of genetic diversity on mutants Jatropha curcas using RAPD”, Energy Procedia, 47, pp. 1 – 6.

221. Zh ng L., K i G.,Xu T., Pi Y., Zh ng H., Sun X. nd T ng K. (2004), “Efficient regeneration of tetraploid Isatis indigotica plants via adventitious organogenesis from hypocotyl expl nts”, Biologia Plantarum, 48, pp. 121 – 124.

222. Zimmerm n J.L. (1993), “Som tic embryogenesis: model for e rly

development in higher pl nts”, Plant Cell, 5, pp. 1411 – 1423.

TÀI LIỆU INTERNET

223. Biofuelsdigest.com