Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 1/2016<br />
<br />
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br />
<br />
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ KHOÁNG<br />
VÀ PROTEIN TRÊN ĐẦU VÀ VỎ TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITOSAN<br />
STUDY ON USING LACTIC ACID BACTERIA FOR DEMINERALIZATION<br />
AND DEPROTEINIZATION OF HEADS AND SHELLS OF SHRIMP<br />
IN CHITOSAN PRODUCTION<br />
Vũ Ngọc Bội1, Nguyễn Thị Mỹ Trang2, Ngô Thị Phương Thảo3<br />
Lê Phương Chung4, Hoàng Thị Bảo Yến5<br />
Ngày nhận bài: 01/9/2015; Ngày phản biện thông qua: 11/11/2015; Ngày duyệt đăng: 15/3/2016<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Sản xuất chitin và chitosan từ đầu vỏ tôm theo phương pháp hóa học để khử tạp chất có nhược điểm là ô<br />
nhiễm môi trường, chi phí sản xuất cao, các sản phẩm phụ lẫn với hoá chất nên việc tận dụng gặp nhiều khó<br />
khăn… Nghiên cứu này đã thử nghiệm sử dụng 2 chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính mạnh là Lactobacillus<br />
plantarum VTCC 431 và Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 từ Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (VTCC) để<br />
khử khoáng và protein trên đầu vỏ tôm. Trong điều kiện lên men kỵ khí, với tỉ lệ vi khuẩn bổ sung 10%, thời gian<br />
lên men 132h, pH của môi trường 7.2, kết quả đã khử được hơn 85% protein và khoáng trong đầu vỏ tôm. Kết<br />
quả nghiên cứu này cho thấy khả năng sử dụng vi sinh vật trong cải tiến quy trình sản xuất chitin và chitosan<br />
từ đầu và vỏ tôm, hạn chế ô nhiễm môi trường, cải thiện chất lượng chitin và chitosan.<br />
Từ khóa: L. plantarum VTCC 431, L. bulgaricus VTCC 703, vỏ đầu tôm, chitosan, chitin<br />
ABSTRACT<br />
Some weakpoints of chemical method to remove impurities from heads and shells of shrimp in chitin<br />
and chitosan production are environmental pollution, high production costs, by products contain extraneous<br />
matters so difficult to retrieve…This study tested the use of two strains of lactic acid bacteria have strong<br />
activity, Lactobacillus plantarum VTCC 431 and Lactobacillus bulgaricus VTCC 703 from Vietnam Type<br />
Culture Collection (VTCC) to demineralize and deproteinize heads and shells of shrimp. In anaerobic<br />
fermentation conditions, additional bacteria ratio of 10%, 132 hours fermentation time, pH of 7.2, the results<br />
showed that more than 85% protein and mineral were removed from heads and shells of shrimp. These results<br />
suggested the possibility of using microorganisms in process improvement chitin and chitosan produced from<br />
heads and shells of shrimp, limit environmental pollution and improve the quality of chitin and chitosan.<br />
Keywords: L. plantarum VTCC 431, L. bulgaricus VTCC 703, heads and shells of shrimp, chitosan, chitin<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Ngành thủy sản nước ta trong những năm<br />
gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể<br />
về nuôi trồng, chế biến cũng như xuất khẩu và<br />
<br />
thực sự đã trở thành ngành kinh tế trọng điểm,<br />
đóng góp một phần không nhỏ vào sự phát<br />
triển kinh tế của đất nước. Trong đó, ngành chế<br />
biến thủy sản luôn giữ vai trò chủ đạo và đóng<br />
<br />
TS. Vũ Ngọc Bội, 2 ThS. Nguyễn Thị Mỹ Trang: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang<br />
KS. Ngô Thị Phương Thảo: Trường Cao đẳng Nghề - Nha Trang<br />
4<br />
ThS. Lê Phương Chung, 5 Hoàng Thị Bảo Yến: Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang<br />
1<br />
<br />
3<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 11<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
góp một tỷ trọng lớn trong kim ngạch xuất khẩu<br />
thủy sản. Theo sự phát triển chế biến thủy sản,<br />
một vấn đề lớn, đang được quan tâm là phế liệu<br />
từ công nghiệp chế biến, trong đó có phế liệu<br />
từ chế biến tôm xuất khẩu. Nguồn phế liệu này<br />
nếu không được xử lý hay tận dụng một cách<br />
hiệu quả sẽ gây ô nhiễm môi trường. Trong<br />
phế liệu tôm có chứa protein, astaxanthin,<br />
chitin,... là những chất rất hữu ích. Do đó,<br />
ngoài việc dùng phế liệu tôm để chế biến thức<br />
ăn chăn nuôi, chúng ta có thể sử dụng chúng<br />
để sản xuất chitin và chitosan mang lại giá trị<br />
kinh tế cao (Trần Thị Luyến, 1995).<br />
Chitin và dẫn xuất của nó là chitosan là<br />
những polysaccharid mạch thẳng. Chitin tồn<br />
tại ở cả động vật và thực vật. Ở động vật thủy<br />
sản, chitin có nhiều ở vỏ tôm, cua ghẹ… (Trần<br />
Thị Luyến và cộng sự, 2005). Vì vậy, vỏ tôm,<br />
cua ghẹ là nguyên phế liệu dồi dào để sản xuất<br />
chitin-chitosan. Hiện nay, công nghệ sản xuất<br />
chitin và chitosan chủ yếu theo phương pháp<br />
hóa học dùng HCl, NaOH để khử protein và<br />
khoáng chất. Nhược điểm của công nghệ này<br />
là gây ô nhiễm môi trường, ăn mòn thiết bị, chi<br />
phí sản xuất cao, chưa tận thu được các thành<br />
phần có giá trị như protein, chất màu từ phế<br />
liệu thủy sản. Nhiều nghiên cứu đã được thực<br />
hiện nhằm cải thiện quy trình, hạn chế nhược<br />
điểm, tăng hiệu suất thu hồi các thành phần có<br />
ích, trong đó sử dụng vi sinh vật hỗ trợ là một<br />
trong những giải pháp được nhiều nhà nghiên<br />
cứu quan tâm (Trang Sĩ Trung, 2008).<br />
Lên men lactic là một trong những kỹ<br />
thuật phát triển từ lâu đời và được con người<br />
ứng dụng sớm nhất trong bảo quản và chế<br />
biến thực phẩm (sữa lên men, thịt lên men,<br />
rau lên men, các sản phẩm đồ uống…) cũng<br />
như trong nhiều lĩnh vực khác như y dược,<br />
hóa chất và chăn nuôi (Nguyễn Trọng Cẩn và<br />
cộng sự, 2006). Trong điều kiện có mặt nguồn<br />
cơ chất carbohydrat (saccharose, glucose,<br />
fructose, tinh bột ngô, tinh bột sắn…), vi khuẩn<br />
lactic sẽ lên men carbohydrat tạo thành acid<br />
lactic và sản sinh enzyme protease. Acid<br />
lactic sẽ tác dụng với phần canxicacbonat<br />
<br />
12 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
Số 1/2016<br />
trong vỏ tôm để tạo thành lactatcanxi ở dạng<br />
không hòa tan (Nguyễn Đức Lượng, 2001).<br />
Phản ứng này gần tương ứng với quá trình<br />
khử khoáng bởi HCl trong phương pháp hóa<br />
học. Đồng thời hệ enzyme protease sẽ thủy<br />
phân một phần protein có trong vỏ tôm làm<br />
tăng quá trình khử protein khỏi vỏ đầu tôm.<br />
Vì vậy việc sử dụng vi khuẩn lactic trong quá<br />
trình lên men khử khoáng và protein trên<br />
vỏ đầu tôm hứa hẹn sẽ nâng cao hiệu quả<br />
sản xuất chitin, chitosan và hạn chế ô nhiễm<br />
môi trường.<br />
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tượng nghiên cứu<br />
Vi khuẩn giống: sử dụng hai chủng vi khuẩn<br />
lactic: L. plantarum VTCC 431 và L. bulgaricus<br />
VTCC 703 do Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam<br />
(VTCC), Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.<br />
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng:<br />
đầu vỏ tôm thẻ chân trắng thu nhận tại bàn<br />
chế biến của Công ty Cổ phần Nha Trang<br />
Seafoods - F17. Vỏ đầu tôm sau khi thu nhận,<br />
rửa sạch, vận chuyển về Phòng thí nghiệm<br />
Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha<br />
Trang, đông lạnh và bảo quản ở -200C để dùng<br />
dần trong quá trình nghiên cứu.<br />
2. Phương pháp nghiên cứu<br />
2.1. Phương pháp xử lý mẫu: Trước khi tiến<br />
hành nghiên cứu, nguyên liệu đầu tôm được<br />
rửa sạch, xay nhỏ bằng máy xay với kích<br />
cỡ nguyên liệu từ 4÷6 mm, trộn đều, cân<br />
cho vào túi polymer (1000g/túi) và bảo quản<br />
đông ở nhiệt độ -200C để dùng cho quá trình<br />
nghiên cứu.<br />
2.2. Phương pháp phân tích:<br />
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương<br />
pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC theo TCVN<br />
3700 - 1990.<br />
- Xác định hàm lượng khoáng bằng phương<br />
pháp nung ở 5500C theo TCVN 4588 - 1988.<br />
- Xác định hàm lượng protein còn lại bằng<br />
phương pháp Microbiuret.<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 1/2016<br />
<br />
- Xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng<br />
phương pháp đo OD ở bước sóng 600 nm kết<br />
hợp phương pháp đếm khuẩn lạc (Trần Linh<br />
Thước, 2007).<br />
- Xác định hiệu suất khử khoáng và khử<br />
protein dựa trên công thức của Rao và cộng<br />
sự (2000)<br />
● Các số liệu được xử lý và vẽ đồ thị bằng<br />
<br />
phần mềm MS EXCEL 2010<br />
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br />
<br />
1. Thành phần hóa học của đầu tôm thẻ<br />
chân trắng<br />
Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ<br />
bản của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng được trình<br />
bày ở bảng 1.<br />
Bảng 1. Thành phần hóa học của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng<br />
<br />
STT<br />
<br />
Chỉ tiêu<br />
<br />
Đơn vị đo<br />
<br />
Hàm lượng (*)<br />
<br />
1<br />
<br />
Hàm lượng protein<br />
<br />
%<br />
<br />
48,6 ± 1,3<br />
<br />
2<br />
<br />
Hàm lượng khoáng<br />
<br />
%<br />
<br />
25,2 ± 0,6<br />
<br />
3<br />
<br />
Hàm lượng lipid<br />
<br />
%<br />
<br />
5,8 ± 0,3<br />
<br />
4<br />
<br />
Chitin<br />
<br />
%<br />
<br />
17,9 ± 0,5<br />
<br />
*Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.<br />
<br />
Kết quả phân tích cho thấy đầu tôm chứa<br />
4 thành phần chính là protein, khoáng, lipid và<br />
chitin. Trong đó protein chiếm hàm lượng lớn<br />
nhất (48,6%) - kết quả nghiên cứu này cao hơn<br />
sơ với thành phần proetin đầu vỏ tôm thẻ chân<br />
trắng mà Trang Sĩ Trung đã phân tích năm<br />
2008. Sự khác biệt này có thể là do mùa vụ<br />
và thời điểm lấy mẫu. Hàm lượng lipid (5,8%)<br />
cũng cao hơn nhiều so với hàm lượng lipid chỉ<br />
có ở phần vỏ tôm (4,7%).<br />
2. Nhân giống vi khuẩn<br />
Chủng giống L. plantarum VTCC 431 và<br />
L. bulgaricus VTCC 703 được hoạt hóa trên<br />
môi trường MRS agar. Khuẩn lạc đặc trưng cho<br />
L. plantarum VTCC 431 có hình tròn, nhẵn, mịn,<br />
<br />
Hình 1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sự sinh<br />
trưởng của vi khuẩn L. plantarum VTCC 431<br />
<br />
màu trắng sữa. Quan sát vi khuẩn L. plantarum<br />
VTCC 431 dưới kính hiểu vi thấy rằng L. plantarum<br />
VTCC 431 là trực khuẩn Gram dương, có<br />
dạng hình que nhỏ, không sinh bào tử, không<br />
di động. Khuẩn lạc đặc trưng cho L. bulgaricus<br />
VTCC 703 phẳng, hơi vàng, đường kính 2 ÷<br />
- 3 mm, khuẩn lạc càng già thì càng trở nên<br />
sậm màu. Vi khuẩn L. bulgaricus VTCC 703 là<br />
trực khuẩn Gram dương, hình que dài, mảnh,<br />
thường xếp thành chuỗi dài, không có khả<br />
năng di động. Tiến hành nhân giống trên môi<br />
trường MRS lỏng và lắc 150 vòng/phút.<br />
Sau các khoảng thời gian 2, 4,…, 30h,<br />
tiến hành xác định mật độ tế bào trong dịch<br />
nuôi cấy, kết quả thể hiện ở hình 1 và hình 2<br />
như sau.<br />
<br />
Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sự sinh<br />
trưởng của vi khuẩn L. bulgaricus VTCC 703<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
Kết quả nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở trên<br />
cho thấy trong 20h đầu của quá trình nuôi, các<br />
chủng vi khuẩn phát triển chậm. Bắt đầu từ giờ<br />
thứ 20 trở đi, vi khuẩn bắt chuyển sang pha<br />
sinh trưởng và phát triển rất nhanh. Từ giờ<br />
nuôi từ 28h đến 30h, mật độ tế bào đạt cao<br />
nhất, vi khuẩn đang ở cuối pha log, đầu pha<br />
ổn định. Đây là thời điểm vi khuẩn sinh tổng<br />
hợp enzyme mạnh cũng như nhiều hợp chất<br />
có hoạt tính mạnh khác. Sau 30h nuôi cấy vi<br />
khuẩn chuyển sang pha ổn định. Vì vậy, dịch<br />
vi khuẩn sử dụng trong quá trình lên men khử<br />
protein và khoáng ở đầu tôm ở các thí nghiệm<br />
tiếp theo sẽ được nhân giống và dừng quá<br />
trình nuôi ở thời gian từ 28 ÷ 30h nuôi cấy.<br />
<br />
Số 1/2016<br />
3. Sử dụng vi khuẩn L. plantarum VTCC 431,<br />
L. bulgaricus VTCC 703 trong xử lý đầu tôm<br />
3.1. Xác định tỉ lệ vi khuẩn bổ sung vào<br />
nguyên liệu:<br />
Vi khuẩn L. plantarum VTCC 431 và<br />
L. bulgaricus VTCC 703 được nhân giống trên<br />
môi trường MRS. Sau đó tiến hành các mẫu<br />
thí nghiệm xác định khả năng lên men khử<br />
khoáng và khử protein của chúng. Quá trình<br />
lên men thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong 6<br />
ngày (144h) ở pH 7,2 trong điều kiện kị khí.<br />
Sau khi lên men ép tách vỏ, rửa sạch, cân,<br />
sấy khô đến độ ẩm 11% và tiến hành phân tích<br />
hàm lượng protein và khoáng còn lại. Kết quả<br />
thể hiện ở hình 3, hình 4, hình 5 và hình 6.<br />
<br />
Hình 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn L.plantarum<br />
bổ sung đến hàm lượng khoáng còn lại ở vỏ đầu tôm<br />
<br />
Hình 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn L.bulgaricus<br />
bổ sung đế hàm lượng khoáng còn lại ở vỏ đầu tôm<br />
<br />
Hình 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn L.plantarum<br />
bổ sung đến hàm lượng protein còn lại ở vỏ đầu tôm<br />
<br />
Hình 6. Ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn L.bulgaricus<br />
bổ sung đến hàm lượng protein còn lại ở vỏ đầu tôm<br />
<br />
Từ kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ dịch vi<br />
khuẩn càng tăng, lượng protein và khoáng còn<br />
lại trong vỏ đầu tôm càng thấp. Sau 6 ngày<br />
bổ sung vi khuẩn L. plantarum VTCC 431và<br />
L. bulgaricus VTCC 703 đã nhân giống trên môi<br />
trường MRS hàm lượng protein và khoáng còn<br />
lại trong mẫu giảm đáng kể. Kết quả này là do vi<br />
<br />
14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
khuẩn L. plantarum VTCC 431 và L. bulgaricus<br />
VTCC 703 trong quá trinh lên men đã sinh<br />
ra enzyme protease và acid lactic. Enzyme<br />
protease sinh ra sẽ thủy phân protein của<br />
vỏ đầu tôm tạo thành các peptid mạch ngắn,<br />
các acid amin hòa tan vào dịch lên men. Còn<br />
acid lactic sẽ phản ứng với CaCO3 tạo thành<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
lactatcanxi ở dạng không hòa tan (Rao và cs,<br />
2001 và 2005). Vì vậy hàm lượng protein và<br />
khoáng còn lại trong đầu vỏ tôm giảm đáng kể.<br />
Từ phân tích ở trên cho thấy tỷ lệ dịch vi khuẩn bổ<br />
sung vào nguyên liệu đầu tôm thích hợp là 10%.<br />
3.2. Xác định thời gian lên men khử protein và<br />
khử khoáng<br />
Sử dụng 2 chủng L. plantarum VTCC 431<br />
<br />
Số 1/2016<br />
và L. bulgaricus VTCC 703 để lên men vỏ đầu<br />
tôm với tỉ lệ vi khuẩn bổ sung 10% (v/w) ở pH<br />
7,2 và lên men ở nhiệt độ phòng với thời gian<br />
lên men khác nhau. Sau khi lên men tiến hành<br />
ép tách dịch lên men, rửa sạch và sấy khô đến<br />
cùng độ ẩm là 11%. Kết quả phân tích hàm<br />
lượng protein và khoáng còn lại ở vỏ đầu tôm<br />
được trình bày ở các hình 7 ÷10.<br />
<br />
Hình 7. Sự thay đổi hàm lượng khoáng còn lại ở vỏ<br />
đầu tôm theo thời gian lên men bằng vi khuẩn L.plantarum<br />
<br />
Hình 8. Sự thay đổi hàm lượng khoáng còn lại ở vỏ<br />
đầu tôm theo thời gian lên men bằng vi khuẩn L.bulgaricus<br />
<br />
Hình 9. Sự thay đổi hàm lượng protein còn lại<br />
ở vỏ đầu tôm theo thời gian lên men bằng<br />
vi khuẩn L.plantarum<br />
<br />
Hình 10. Sự thay đổi hàm lượng protein còn lại<br />
ở vỏ đầu tôm theo thời gian lên men bằng<br />
vi khuẩn L.bulgaricus<br />
<br />
Kết quả phân tích cho thấy thời gian lên men<br />
có quan hệ nghịch biến với hàm lượng protein<br />
và khoáng còn lại ở vỏ đầu tôm sau quá trình lên<br />
men. Trong giới hạn nghiên cứu, càng tăng thời<br />
gian lên men thì hàm lượng protein và khoáng<br />
còn lại ở đầu vỏ tôm càng giảm. Nhưng càng<br />
về cuối quá trình lên men, mức độ giảm hàm<br />
lượng protein và khoáng chất còn lại ở vỏ đầu<br />
<br />
tôm càng chậm. Do vậy để tiết kiệm thời gian mà<br />
hiệu quả khử protein và khoáng vẫn đạt yêu cầu,<br />
nên dừng thời gian lên men ở giai đoạn 132 h.<br />
Từ kết quả phân tích trên cho phép lựa<br />
chọn thông số thích hợp cho quá trình khử<br />
khoáng và protein trên đầu vỏ tôm thể bằng<br />
các chủng vi khuẩn L. plantarum VTCC 431<br />
và L. bulgaricus VTCC 703 ở bảng 2.<br />
<br />
Bảng 2. Thông số thích hợp cho quá trình khử khoáng và protein bằng dịch vi khuẩn<br />
L. plantarum VTCC 431và L. bulgaricus VTCC 703<br />
STT<br />
<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
<br />
Yếu tố<br />
<br />
Nồng độ dịch vi khuẩn/phế liệu<br />
Thời gian<br />
pH<br />
Nhiệt độ phòng<br />
<br />
Thông số tối ưu<br />
<br />
10% (v/w)<br />
132 h<br />
7,2<br />
300C<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15<br />
<br />