Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần lipid và các dạng phân tử của phospholipid từ một số loài san hô mềm ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

ĐẶNG THỊ PHƯƠNG LY

“NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ CỦA PHOSPHOLIPID TỪ MỘT SỐ LOÀI SAN HÔ MỀM Ở VIỆT NAM”

Chuyên ngành: Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

Mã số: 62.44.01.17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2016

Công trình này được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn: 1. GS.TS Phạm Quốc Long – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện HLKH&CN Việt Nam

2. TSKH. Andrey B. Imbs – Viện Sinh vật biển Zhirmunsky – Phân viện Viễn Đông – LB Nga

Phản biện 1: ...............................................................................

Phản biện 2: ...............................................................................

Phản biện 3: ...............................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước tại

.....................................................................................................

Vào hồi ………giờ, ngày ……. tháng ……. năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Tính cấp thiết

Rạn san hô có vai trò lớn trong việc duy trì cân bằng sinh thái biển. Lipid là thành phần hóa học quan trọng, chiếm tới 40% sinh khối khô của san hô, là cơ sở cấu trúc của màng tế bào các polip và có vai trò dự trữ năng lượng. Thành phần lipid, axit béo phản ánh sự đa dạng sinh hóa, các nguồn dinh dưỡng, các mối quan hệ cộng sinh, các con đường sinh tổng hợp và sự vận chuyển theo chuỗi thức ăn các dạng ban đầu của lipid, sức khỏe của san hô. Nghiên cứu hóa học, hoạt tính sinh học của các lipid rất phức tạp, việc phân lập từng hợp chất lipid riêng biệt rất khó khăn,và sự sử dụng chúng làm các sản phẩm dược phẩm gặp nhiều hạn chế bởi mỗi lớp chất lipid là một hỗn hợp của 50 đến 200 hợp chất hóa học riêng biệt (còn được gọi là các “dạng phân tử”), giống nhau đầu phân cực, khác nhau mạch acyl hoặc alkyl trong phân tử. Hiện nay, với các thiết bị nghiên cứu hiện đại, khoa học thế giới đã đạt được những tiến bộ lớn trong việc phân tích các thành phần hóa học của dạng phân tử của một số lớp lipid không phân cực ở thực vật và lipid phân cực ở một số loài ruột khoang. Cho tới nay thông tin về thành phần dạng phân tử của lớp chất phospholipid – lớp chất chứa đựng nhiều thông tin về quá trình sinh tổng hợp lipid của san hô hoàn toàn chưa được công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới.

Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần lipid và các dạng phân tử của phospholipid từ một số loài san hô mềm ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu về lipid, axit béo và và đặc biệt là lớp chất phospholipid của 3 loài san hô mềm Việt Nam (Sinularia macropodia Xenia sp. và Capnella sp.) nhằm bổ sung thêm các số liệu mới vào bộ cơ sở dữ liệu về lipid san hô Việt Nam - Phân tích các số liệu thu được nhằm tìm ra các lipid đánh dấu, mối quan hệ trong hệ cộng sinh giữa san hô vật chủ và vi sinh vật cộng sinh, phân loại … đối với các loài được nghiên cứu

2

(PE), phosphatidylserine (CAEP), phosphatidylinositol (PS), (PI), các

4. Đã chứng minh được cấu trúc của hợp chất CAEP 16:0/18:2base lần

5. Đã đề xuất vai trò biomarker của thành phần lipid và axit béo đối với

- Thu được các số liệu hoàn toàn mới về dạng phân tử phospholipid từ đối tượng san hô Việt Nam, mở ra một hướng nghiên cứu mới chuyên sâu hơn về lĩnh vực này 3. Nội dung nghiên cứu chính của luận án • Phân tích hàm lượng lipid tổng và thành phần, hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng của 3 loài san hô nghiên cứu • Phân tích thành phần hàm lượng các axit béo trong lipid tổng, trong lớp chất lipid phân cực và không phân cực của 3 loài san hô nghiên cứu • Phân tích thành phần, hàm lượng các lớp chất phospholipid của ba loài san hô nghiên cứu • Nghiên cứu dạng phân tử của các lớp chất phospholipid • Khảo sát hoạt tính sinh học của các lớp chất, phân lớp lipid phân lập từ các mẫu san hô nghiên cứu. 4. Những điểm mới của luận án 1. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu chi tiết về thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid, axit béo, phospholipid của 3 loài san hô mềm Sinularia macropodia, Xenia sp. và Capnella sp. thu thập tại vùng biển Việt Nam 2. Lần đầu tiên, các dạng phân tử phosphlipid: phosphatidylcholine (PC), ceramide phosphatidylethanolamine aminoethylphosphonate lyso phospholipids LPC, LPE, LPS trong 3 loài san hô mềm đã được xác định, bao gồm: 15 dạng phân tử của PC và 3 dạng phân tử LPC, 25 dạng phân tử PE và 2 dạng LPE, 7 dạng phân tử PS và LPS, 2 dạng phân tử là CAEP, 32 dạng phân tử của PI 3. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của axit béo mạch siêu dài nằm trong các dạng phân tử PI 18:0/26:5 và PI 18:0/26:6 có mặt trong các mẫu san hô mềm đầu tiên phân lập từ đối tượng san hô mềm san hô:

3

- Dạng phân tử PC 16:0e/18:4 là minh chứng cho sự vận chuyển axit béo

từ vi sinh vật cộng sinh sang sang hô vật chủ - Axit béo mạch dài C24 là đặc trưng sinh tổng hợp của san hô vật chủ trong hệ cộng sinh san hô – zooxanthellae có mặt phần lớn trong phân lớp PS, PI 5. Bố cục của luận án

Luận án gồm 120 trang, trong đó có 41 hình, 28 bảng, 1 sơ đồ. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan (37 trang); Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (6 trang), Chương 3: Thực nghiệm (14 trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (48 trang); Kết luận và kiến nghị (3 trang); Danh mục các công trình công bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (11 trang); Ngoài ra còn có 29 trang phụ lục với các hình phổ, kết quả phân tích TLC, GC-MS, HRMS, NMR.

II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Trong phần tổng quan, luận án đã giới thiệu các khái niệm chung về lipid, phân loại lipid phân cực và tổng hợp một số hoạt tính sinh học của lipid sinh vật biển. Qua tài tìm hiểu tài liệu tổng quan cho thấy, thành phần lipid, axit béo có vai trò đánh dấu sinh học (biomarker) đối với san hô, thể hiện trên nhiều khía cạnh khác nhau: đặc điểm dinh dưỡng, phân loại sinh thái, tính chất của hệ cộng sinh, sức khỏe của san hô và phân loại chemotaxonomy. Luận án cũng nêu lên vai trò của phương pháp phổ khối lượng trong phân tích lipid.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu San hô mềm Sinularia macropodia (Anthozoa, Octocorallia, Alcyonacea, Alcyoniidae);, Xenia sp. (Anthozoa, Octocorallia, Alcyonacea, Xeniidae) và Capnella sp. (Anthozoa, Octocorallia, Alcyonacea, Nephtheidae), thu thập tại vùng biển Nha Trang, Việt Nam năm 2013-2014,

4 được định tên bởi PGS. TS. Đỗ Công Thung và các cs., lưu trữ tiêu bản tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết lipid tổng Chiết lipid tổng theo phương pháp của Folch J.F. (1957), là phương pháp thường quy được sử dụng để chiết lipid với đối tượng san hô tại phòng thí nghiệm Viện Sinh vật biển, phân viện Viễn Đông, LB Nga 2.2.2. Phương pháp phân lập các lớp chất, phân lớp lipid. Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký cột

(CC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 2.2.3. Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid, phospholipid

- Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid: sử dụng TLC kết hợp với chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, LB Nga.

- Thành phần các lớp chất phospholipid: xác định bằng TLC 2 chiều, các thuốc thử molybdate và ninhydrin; và quang phổ kế UV 1800 của hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) tại IBM-FEB-RAS. 2.2.4. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo

Hỗn hợp methyl ester của axit béo được phân tích trên máy sắc ký khí GC và sắc ký khí kết nối khối phổ GC-MS, sử dụng thư viện phổ chuẩn NIST để so sánh. 2.2.5. Phương pháp xác định dạng phân tử và cấu trúc của các hợp chất và các phân lớp phospholipid

a. Dạng phân tử các phospholipid từ các mẫu san hô được phân tích bằng phương pháp phổ khối phân giải cao HRMS, được ghi trên thiết bị Shimadz LCMS-IT-TOF, do hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) cung cấp.

b. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều 1H NMR, 13C NMR và 2 chiều HSQC, HMBC, COSY được ghi trên máy Bruker Avance DPX-700 (Karlsruhe, Germany) ở 700 và 125 MHz, sử dụng TMS là chất chuẩn nội (CDCl3, 30oC), đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ, FEB, RAS).

5

2.2.6. Phương pháp phân tích thành phần chính (PCA) Trong luận án, phân tích PCA sử dụng phần mềm chương trình

”Statisticstica 5.1” (StatSoft, Inc., USA). 2.2.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Thử nghiệm hoạt tính kháng VSV kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào: được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

Sơ đồ nghiên cứu chung

Phần này miêu tả các quá trình chiết lipid tổng, xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid và phospholipid, phân tích thành phần và hàm lượng axit béo trong lipid tổng, lipid trung tính và lipid phân cực, phân lập các phân lớp lipid để phân tích dạng phân tử, xác dịnh dạng phân tử của

6 các chất chuẩn phospholipid và các phân lớp phospholipid phân lập dược, đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào của lipid tổng, lipid phân cực và các phân lớp phospholipid.

Sử dụng phổ khối phân giải cao phân tích các chất chuẩn phospholipid và các mẫu nghiên cứu

- Một số chất chuẩn phospholipid đã được thực hiện phân tích sử dụng phương pháp phổ khối phân giải cao IT-TOF/HRMS trong điều kiện ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI) và ion hóa phun mù điện tử (ESI). Lipid được phát hiện bởi bộ phận phân tích khối kết hợp song song hai kỹ thuật bẫy ion và thời gian bay trong một bộ phận của thiết bị Shimadzu LCMS-IT-TOF (Kyoto, Japan), hoạt động đồng thời ở cả hai chế độ ion âm và ion dương trong mỗi phân tích. Các chất chuẩn phospholipid được phân tích và sử dụng dữ liệu để so sánh: 1-O-hexadecyl-2-oleoyl-sn- glycero-3-phosphocholine (PC),1-O-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine (PE) (Avanti Polar Lipid, Inc. Alabaster, Alabama, USA), và hỗn hợp phospholipid từ đậu tương (L-α-Lecithin Type II-S from Soybean, PC hàm lượng 20 %, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, USA). - Các phân đoạn PE, PC, CAEP, PI, LPC, PS được hòa tan trong MeOH, và tiến hành phân tích dạng phân tử trên thiết bị LCMS-IT-TOF. Các dạng phân tử của từng phân lớp phospholipid được phát hiện bởi HRMS và xác định bằng việc so sánh với bộ phổ chất chuẩn của hãng Shimadzu Solution với phần mềm xử lý v.3.60.361. Quá trình định lượng các loại phân tử của mỗi lớp chất lipit phân cực được tính toán theo diện tích mỗi pic chất thu được trên phổ ion âm và ion dương.

Hợp chất CAEP phân lập từ mẫu san hô mềm Xenia sp. sau khi tinh Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất phân lập được từ loài Xenia sp. chế bằng HPLC, được tiến hành đo phổ NMR để làm rõ cấu trúc.

1H NMR (700 MHz, CDCl3+CD3OD)  ppm: 4.04 (1H, m, H-1a), 3.75 (1H, m, H-1b), 3.78 (1H, m, H-2), 3.96 (1H, t-like, J = 7.0 Hz, H-3), 5.36 (1H, dd, J = 15.4, 7.0 Hz, H-4), 5.61 (1H, dt, J = 15.4, 7.0 Hz, H-5), 1.93 (2H, dt, J = 6.0, 16.8 Hz, H-6), 1.95 (2H, dt, J = 5.6, 16.8 Hz, H-7),

Đặc tính hóa lý và dữ liệu NMR: Dạng vô định hình màu trắng;

7 5.27 (1H, m, H-8), 5.29 (1H, m, H-9), 1.84 (2H, dd, J = 14.3, 7.0 Hz, H-10), 1.10→1.15 (H-11→H-17), 0.76 (3H, t, 7.0 Hz, H-18), 2.05 (2H, t, J = 7.7 Hz, H-2ʹ), 1.47 (2H, m, H-3ʹ), 1.10→1.15 (H-4ʹ→H-15ʹ), 0.76 (3H, t, 7.0 Hz, H-16ʹ), 1.71 (2H, dt, J = 6.3, 16.1 Hz, H-1ʹʹ), 2.96 (2H, dt, 6.3, 16.5 Hz, H-2ʹʹ).

13C NMR (175 MHz, CDCl3+CD3OD)  ppm: 63.5 (C-1), 54.3 (C-2), 71.3 (C-3), 129.3 (C-4), 133.5 (C-5), 32.6 (C-6), 32.58 (C-7), 129.3 (C-8), 131.0 (C-9), 32.3 (C-10), 29.2→29.7 (C-11→C-15), 31.9 (C-16), 22.7 (C- 17), 14.0 (C-18), 174.5 (C-1ʹ), 36.6 (C-2ʹ), 26.0 (C-3ʹ), 29.2→29.7 (C-4ʹ → C-13ʹ), 31.9 (C-14ʹ), 22.7 (C-15ʹ), 14.0 (C-16ʹ), 24.3 (C-1ʹʹ), 35.7 (C-2ʹʹ).

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Hàm lượng lipid tổng Hàm lượng lipid tổng (% trọng lượng tươi) của ba mẫu san hô S. macropodia, Xenia sp., Capnella sp. lần lượt là 1,88± 0,12%, 2,54±0,15%, 1,44±0,10 %, kết quả này khá thống nhất với các kết quả nghiên cứu trước đó về hàm lượng lipid tổng của các loài san hô mềm Việt Nam khác. 4.2. Thành phần các lớp chất lipid Bảng 4.2. Thành phần các lớp chất lipid của các mẫu san hô nghiên cứu (n=3)

Sinularia

Lớp chất

Xenia sp.

Capnella sp.

macropodia

PoL ST FFA TAG

24,91 ± 2,55 11,32 ± 0,10 3,37 ± 0,15 12,31 ± 0,70 26,15 ± 2,71 18,78 ± 0,80 3,16 ± 0,15

36,79 ± 3,92 10,52 ± 1,22 3,18 ± 0,81 14,29 ± 1,94 7,7 ± 4,30 21,48 ± 1,82 5,74 ± 0,78

21,14 ±1,17 10,59 ± 0,75 5,37 ± 0,20 13,79 ± 0,45 25,87 ± 1,14 18,63 ± 1,39 4,61 ± 0,76

Khác

1 2 3 4 5 MADG 6 WE 7 PoL: lipid phân cực; ST: sterol; FFA: axit béo tự do; TAG: triacylaglycerol;

MADAG: monoalkyldiacylglycerol; WE: sáp

Hàm lượng cao nhất trong lipid tổng là 2 lớp chất PoL (cao nhất ở Xenia sp. 36,79% TL) và MADAG (cao nhất ở Capnella sp. 26,15% TL). MADAG được coi là lớp chất đánh dấu cho san hô vật chủ trong hệ cộng sinh san hô – zooxanthellae. Mẫu Xenia sp., hàm lượng lớp chất MADAG thấp hơn so với hai mẫu còn lại, chỉ có 8,0%, thay vào đó là hàm lượng cao vượt trội của lớp chất PoL, chiếm tới 36,79% lipid tổng. Lớp chất WE trong

8 cả 3 mẫu san hô mềm nghiên cứu đều chiếm hàm lượng khá lớn, khoảng 20% lipid tổng. Hai lớp chất ST và TAG có tỉ lệ khá đồng đều trong cả 3 mẫu. Hàm lượng ST trong 3 loài san hô Sinularia macropodia, Xenia sp., Capnella sp. lần lượt là 10,59%, 10,52% và 11,32%. Hàm lượng lớp chất TAG lần lượt là 13,79%, 14,29% và 12,31%. Hàm lượng lớp chất axit béo trong lipid tổng 3 mẫu san hô khoảng 3-5%. Như vậy, so với các tài liệu nghiên cứu trước đây, thành phần và hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng ở 3 loài san hô được nghiên cứu về cơ bản đều bao gồm hầu hết các lớp chất chính đã biết là PoL, ST, FFA, TAG, MADG, WE với hàm lượng PoL chiếm thành phần chủ yếu. Ngoài ra, trong lipid tổng của 3 mẫu san hô còn xuất hiện thêm các lớp chất chưa xác định, chiếm một tỉ lệ không lớn, ở loài san hô Sinularia macropodia là 4,61%, Xenia sp.là 5,74% và Capnella sp.là 3,16%. 4.3. Thành phần axit béo trong các mẫu san hô nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, thành phần và hàm lượng các axit béo trong lipid tổng (TL), lipid trung tính (NL) và lipid phân cực (PoL) của 3 mẫu san hô mềm đã được xác định. Axit béo no phân bố trong phân đoạn NL cao hơn trong PoL, hàm lượng cao nhất là 16:0. Các axit béo không no đa nối đôi PUFA phân bố chủ yếu trong phân đoạn PoL. Trong 3 loài, Xenia sp. có tổng hàm lượng các PUFA trong lipid tổng cao nhất (57,01%) và nằm chủ yếu trong phân đoạn PoL (64,28%). Trong TL của 3 loài san hô nghiên cứu đều có mặt các axit béo đặc trưng cho san hô mềm có chứa vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae. Các axit béo 24:5n-6 và 24:6n-3 là axit béo đánh dấu cho san hô mềm (san hô tám tia), cao nhất ở TL loài Sinularria macropodia – 5,53% tổng axit béo, trong PoL cao nhất ở loài Capnella sp., chiếm 9,38% axit béo của phân đoạn này. Hầu hết ở các loài thuộc bộ Acyonacea hàm lượng 24:5n-6 cao hơn 24:6n-3. Xác định được sự có mặt của axit béo 24:4n ở TL loài Xenia sp., nhưng chưa xác định được vị trí của nối đôi trong cấu trúc của axit béo này do hàm lượng thấp. Các axit béo đánh dấu cho VSV cộng sinh có mặt trong TL 3 mẫu nghiên cứu với hàm lượng đáng kể là 16:2n-7, 18:3n-6, 18:4n-3, 18:5n-3,

9 20:4n-3, 20:5n-3, 22:5n-3, 22:6n-3. Có sự tương quan tỉ lệ nghịch giữa hàm lượng 18:3n-6 và 16:2n-7. Sự khác biệt về tỉ lệ hai axit béo 16:2n-7/18:3n-6 chính là yếu tố tách biệt Xenia sp. khỏi 2 loài còn lại trong phân loại chemotaxonomy. Các axit béo chuỗi n-6 có xu thế phân bố cao hơn trong phân đoạn PoL. Tổng hàm lượng axit béo n-6 trong PoL của 3 mẫu Sinularia macropodia, Xenia sp., Capnella sp. lần lượt là 30,24; 49,06 và 35,68%. Cao nhất là hàm lượng axit béo 20:4n-6 (23,57; 27,48; 24,83% tổng axit béo PoL của 3 loài). Zooxanthellae có khả năng tổng hợp các axit béo 18:2n-6 và 18:3n-6, phân bố trong các lớp chất NL và vận chuyển sang san hô vật chủ trong các “giọt lipid” (lipid droplet), tham gia vào quá trình chuyển hóa và sinh tổng hợp lipid của san hô. Do vậy, axit béo n-6 C20-24 phân bố phần lớn trong PoL nhưng các tiền chất sinh tổng hợp ra chúng 18:2n-6, 18:3n-6 lại có mặt phong phú hơn trong NL. Trong 3 loài, Xenia sp. là mẫu có chứa nhiều axit béo n-3 với hàm lượng cao (18:4n-3 4,65%; 20:5n-3 AA 6,85%; 22:6n-3 DHA 5,25%). Axit béo 18:5n-3 là một trong những axit béo chính nằm trong các lớp chất mono-, digalactosyldiacylglycerol của VSV zooxanthellae. Lớp chất này được xếp vào phân đoạn PoL khi phân lập, do vậy 18:5n-3 phân bố chủ yếu ở phân đoạn PoL, cao nhất ở Xenia sp. (2,18% tổng axit béo PoL). Sự phân bố khá đồng đều 20:5n-3 ở mẫu Xenia sp. và 22:6n-3 Capnella sp. trong cả NL và PoL cho thấy sự vận chuyển axit béo từ VSV cộng sinh zooxanthellae sang san hô vật chủ. Axit tetracosatetraenoic (24:4) có mặt trong mẫu Xenia sp. chưa được tìm thấy trước đó trong san hô mềm. Vì chưa thể khẳng định được axit béo 24: 4 có mặt trong mẫu Xenia sp. là 24: 4n-6, do đó, chúng tôi cho rằng con đường sinh tổng hợp 24: 5n-6 như sau: 20:4n-6  22:4n-6  22:5n-6  24:5n-6, axit béo 22:5n-6 đã được tìm thấy ở nhiều loài san hô mềm. Cấu trúc của axit béo 24: 4 trong mẫu Xenia sp. cần được nghiên cứu thêm. Phân tích PCA: sử dụng số liệu về thành phần các lớp chất lipid và axit béo. Trên giản đồ không gian hai chiều các mẫu san hô S. macropodia, Xenia sp. và Capnella sp. nằm trong vùng phân bố của san hô mềm và có VSV cộng sinh. Trên giản đồ thứ nhất (hình 4.2), Xenia sp. tách biệt hẳn khỏi 2 mẫu còn

10 lại do sự khác biệt rõ ràng về thành phần cao vượt trội của lớp chất PoL và hàm lượng thấp MADAG, còn vị trí của S. macropodia và Capnella sp. khá gần nhau trong vùng phân bố của các mẫu có hàm lượng cao PoL và MADAG. Trên giản đồ thứ 2 (hình 4.5), mẫu Xenia sp. nằm về phía các loài có hàm lượng 18:3n-6 cao, mẫu Sinularia macropodia thuộc vùng các mẫu có hàm lượng cao 16:2n-7, mẫu Capnella sp. nằm ở khoảng trung gian giữa 2 vùng này và thiên về vùng các mẫu có hàm lượng cao axit béo 16:0. Phân tích này nhấn mạnh tầm quan trọng của VSV cộng sinh lên các yếu tố ảnh hưởng tới chemotaxonomy của các mẫu nghiên cứu và các loài san hô mềm khác.

Hình 4.5. Phân tích thành phần chính (PCA) sử dụng thành phần và hàm lượng các axit béo trong các mẫu san hô mềm làm các biến

Hình 4.2. Kết quả phép phân tích thành phần chính (PCA) dựa trên thành phần các lớp chất lipid của các mẫu san hô làm các biến

4.4. Phân tích định tính, định lượng thành phần phospholipid trong các mẫu san hô mềm nghiên cứu So sánh với chất chuẩn trên TLC 1 chiều và 2 chiều với nhiều hệ dung môi khác nhau và kết hợp với các tài liệu tham khảo đã công bố về các lớp chất phospholipid của san hô, chúng tôi xác định, trong lipid phân cực của 3 loài san hô mềm S. macropodia và Xenia sp., Capnella sp. có mặt các phân lớp phospholipid đặc trưng của động vật ngành cnidarian là PE, PC, PS, phosphonolipid là CAEP, PI và có mẫu có mặt lysophospholipid (LPE, LPC) hiện vết trên bản mỏng với hàm lượng

11 nhỏ. Phân tích định lượng theo phương pháp của Kostetsky, kết quả thu được được trình bày trong Bảng 4.4. Bảng 4.4. Thành phần và hàm lượng các phân lớp phospholipid trong của 3 mẫu san hô mềm Sinularia macropodia, Xenia sp., Capnella sp.

Hàm lượng (% tổng phospholipid)

Các phân lớp phospholipid

Xenia sp.

Capnella sp.

Sinularia macropodia 27,75 ± 3,45 18,84 ± 1,60 26,73 ± 1,82

39,51 ± 2,24 20,84 ± 2,56 20,53 ± 1,75

35,53 ±1,46 23,62 ± 2,05 21,13 ± 2,43

14,21 ± 1,25 (CAEP + LPE)

9,76 ± 1,04 (CAEP + LPE)

10,20 ± 1,67 (CAEP)

Phosphatidylchonline (PC) Phosphatidylethanolamine (PE) Phosphatidylserine (PS) Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) + lysophosphatidylethanolamine (LPE) Phosphatidylinositol (PI) Khác**

2,20 ± 1,10 10,27 ± 2,31

4,31 ± 0,78 5,35* ± 2,11

2,08 ± 0,70 7,45 ± 3,40

*: lysophosphatidylcholine **: lysophosphatidylinositol, lysophosphatidylserine, các dạng oxy hóa của phospholipid Ở 3 loài san hô mềm hàm lượng cao nhất là lớp chất PC: 27,75%, 39,51% và 35,53% tổng phospholipid ở ba mẫu Sinularia macropodia, Xenia sp., và Capnella sp. Tiếp theo là PE và PS chiếm xấp xỉ 20% cho mỗi phân lớp. Phân lớp CAEP, PI và các phân lớp lysophospholipid có hàm lượng nhỏ nên đôi khi trong phân tích định tính phải thực hiện cộng gộp các lớp chất gần nhau để tính toán (như CAEP và LPE). Kết quả này tương đồng với các công trình nghiên cứu trước đó về thành phần phospholipid trong lipid các loài san hô mềm có chứa VSV cộng sinh zooxanthellae. Sự có mặt của VSV cộng sinh trong san hô có tác động lên hàm lượng PC nhưng không ảnh hưởng nhiều đến các lớp chất phospholipid khác. 4.5. Xác định các dạng phân tử phospholipid của các mẫu san hô mềm nghiên cứu Để xác định các dạng phân tử của phospholipid từ các mẫu san hô mềm S. macropodia, Xenia sp., Capnella sp., trước hết chúng tôi ghi phổ khối phân giải cao HRMS của các chất chuẩn phospholipid. Trên cơ sở các dữ liệu về sự phân mảnh của các chất chuẩn này và kết quả phân tích định tính định lượng các phân lớp phospholipid, chúng tôi tiến hành xác định các dạng phân tử có mặt trong các phân lớp phospholipid của 3 mẫu san hô mềm

12 được nghiên cứu. Hỗn hợp Et3N:AcOH được sử dụng để giúp làm bền các ion phân tử và tăng độ nhạy của các tín hiệu ion khi cùng lúc ghi nhận các tín hiệu trên phổ ion âm và ion dương. 4.5.1. Phosphatidylcholine (PC)

Hình 4.7. Phosphatidylcholine (PC)

+ Phổ khối phân giải cao của hợp chất 1-O-hexadecyl-2-oleoyl-sn-

glycero-3-phosphocholine (16:0e/18:1 PC) Hợp chất PC 16:0e/18:1 (e : ether) được ion hóa ở dạng dẫn xuất acetyl và trên phổ ion âm ESI-MS1 có tín hiệu [M+CH3COO]- tại m/z 804,6103, trên phổ ion dương có tín hiệu của ion [M+H]+ tại m/z 746,6035. Công thức cấu tạo tương ứng là [C44H87NO9P]- và [C42H85NO7P]+. Trên phổ ion âm MS2, ion có tín hiệu tại m/z 804,6103 bị phân mảnh ra một phân tử trung hòa C3H6O2 (methyl acetate) và tạo thành ion có tín hiệu tại m/z 730,5762, tương ứng với một ion mang điện tích âm khi phân tử lipid kết hợp với một ion COO-. Trên phổ MS3 của ion có tín hiệu tại m/z 730,5762 xuất hiện ion có m/z 281,2463 (ứng với [C18H33O2]−, giá trị tính toán 281,2486) và tương ứng với anion của axit béo 18:1n (Hình 4.8) có mặt trong phân tử PC Hình 4.8. Phổ khối phân giải cao của hợp chất PC 16:0e/18:1 Như vậy với phosphatidylcholine, có thể quan sát đồng thời tín hiệu trên phổ ion dương-MS1 của ion [M+H]+ và tín hiệu của ion [M+CH3COO]-

trong phân

13 trên phổ ion âm tương ứng. Ion [M+CH3COO]- được lựa chọn để thực hiện EIS-HRMS/MS (gọi tắt là MS2). Trên phổ ion âm-MS2 của ion [M+CH3COO]- luôn xuất hiện tín hiệu có cường độ mạnh của ion mảnh [M+CH3COO-X]-, với X = CH3COOCH3 (C3H6O2), được hình thành do [M+CH3COO]- mất đi một mảnh C3H6O2. [M+CH3COO-C3H6O2]- tiếp tục được lựa chọn để thực hiện phân tích MS3, thu được các mảnh ion nhỏ hơn mang lại các thông tin về cấu trúc phân tử của hợp chất PC cần xác định. Trong phân tích ESI-HRMS phân lớp PC mẫu Sinularia macropodia, trên phổ ion âm tín hiệu với cường độ mạnh nhất tại m/z 854,6134, công thức phân tử tương ứng là C46H86NO7P (khối lượng phân tử tính toán được 795,6142, số liên kết đôi là 6). Từ công thức phân tử cho thấy, với 7 nguyên tử hợp chất PC này sẽ ở dạng O-alkyl tử O acylphosphatidylcholine và chỉ chứa trong phân tử 1 axit béo mạch dài. Trên phổ ion âm-MS2 của ion [M+CH3COO]- có xuất hiện tín hiệu tại m/z 780,5691, tương ứng với ion [M+CH3COO-C3H6O2]-. Trên phổ MS3, mảnh ion thu được cho tín hiệu tại m/z 303,2319 tương ứng với anion của axit béo C20H32O2 (C20:4n), cho thấy dạng phân tử của phosphatidylcholine với tín hiệu tại m/z 854,6134 là PC 18:0e/20:4 Đối với lớp chất LPC, trong công thức phân tử tương ứng tính toán được từ số khối thu được trên phổ ESI-MS1 chỉ chứa 6 hoặc 7 nguyên tử O, nếu chỉ chứa 6 O cho thấy mạch cacbon trong phân tử của chúng là O-alkyl hoặc alkenyl, và không chứa axit béo trong phân tử, vì thế không thu được tín hiệu đặc trưng cho anion của axit béo trên phổ MS3. Trên phổ ion âm MS2 đều thu được mảnh ion đặc trưng đối với các hợp chất PC là [M+CH3COO-C3H6O2]-. Kết quả phân tích dạng phân tử của PC và LPC của 3 mẫu san hô được trình bày trong bảng 4.7. Từ 3 loài san hô mềm, 15 dạng phân tử của phosphatidylcholine (PC) và 3 dạng phân tử lysophosphatidylchonline (LPC) đã được xác định. Các dạng phân tử có hàm lượng cao trong phân lớp là PC 18:0e/20:4, LPC 18:0e. Cùng với kết quả phân tích thành phần axit béo trong lipid tổng cho thấy, axit béo chính có mặt trong phân lớp này là axit arachidonic 20:4n-6, ngoài

14 ra còn có các PUFA C16 và C18. Dạng phân tử PC 16:0e/18:4 là minh chứng cho sự vận chuyển axit béo từ VSV cộng sinh sang san hô vật chủ, và san hô vật chủ sử dụng các axit béo đó để sinh tổng hợp lên các lipid của riêng chúng. Bảng 4.7. Tổng hợp thành phần và hàm lượng các dạng phân tử phosphatidylcholine từ 3 loài san hô mềm nghiên cứu

Xenia sp.

Capnella sp.

Sinularia macropodia

TT

Dạng phân tử

- - - 0,51

0,78

- - - - - - - 3,62 8,07 6,82

Hàm lượng trong phân lớp 7.0 77.5 1.3 - - - - 0,78 2,31 0,90

7,78

6,05

15,80 - - - 51,93 - 22,23

0,75 4,81 5,50 4,75 6,76 - 22,03 5,49 1,74 - 36,73 5,70 21,93

LPC 16:0e LPC 18:0e LPC 20:4 Diacyl PC 16:0/20:4 Diacyl PC 18:2/20:4 Diacyl PC 16:0/22:6 Diacyl PC 18:0/20:4 PC 16:0e/16:2 PC 16:0e/18:4 PC 16:0e/18:3 PC 16:0e/18:2 PC 18:0e/16:2 PC 16:0e/20:4 PC 18:0e/18:3 PC 18:0e/18:2 PC 18:0e/18:1 PC 18:0e/20:4 PC 19:1e/20:4 Chưa xác định

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 23,92 14 9,73 15 4,86 16 1,49 17 29,57 18 - 19 4,14 4.5.2. Phosphatidylethanolamine (PE)

Hình 4.10. Phosphatidylethanolamine (PE)

+ Phổ khối phân giải cao của hợp chất 1-O-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine (PE 18:0e/18:1) (chất chuẩn) Phân tử 18:1e/18:1 PE hình thành ion âm [M–H]- tại m/z 728,5587 và ion dương [M+H+(C2H5)3N]+ với m/z 831,6927 tương ứng với các công thức [C41H79NO7P]- và [C47H96N2O7P]+. Trên phổ ion âm MS2 của ion có m/z 728,5587 (hình 4.11) xuất hiện tín hiệu tại m/z 281,2461 ([C18H33O2]-),

Hình 4.11. Phổ khối phân giải cao của hợp chất PE 18:1e/18:1

Đối với PE, các tín hiệu của các ion âm [M-H]- và các ion dương

15 tương ứng với anion của axit béo 18:1n. Tín hiệu tại m/z 464,3140 (mất đi mảnh có khối lượng phân tử 264,2447) cũng xuất hiện trong phổ ion âm MS2. Tín hiệu này tương ứng với ion [M–H]- khi mất đi mảnh là [axit béo 18:1n – H2O] (C18H32O, khối lượng tính toán 264,2453). [M+H+Et3N]+ tương ứng được quan sát đồng thời trên phổ ESI-HRMS. Với PE phân lập từ loài san hô Xenia sp., trên phổ ion âm-MS1 tín hiệu có cường độ mạnh nhất tại m/z 750,5305. Tín hiệu tương ứng trên ion dương-MS1 thu được là tại m/z 853,6804. Công thức cấu tạo tính toán được là C43H78NO7P

Hình 4.13. Phổ ESI-MS1, MS2 và MS3 của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm tại m/z 750,5305 (PE 18:1e/20:4)

Trên phổ ion âm-MS2 của ion [M-H]- của dạng phân tử này có chứa ion mảnh với tín hiệu tại m/z 464,3150 tương ứng với ion phân tử mất đi một mảnh trung hòa C20H30O (C20H31COOH-H2O) (tính toán 465,3219); m/z 303,2338 tương ứng với anion của axit béo C20H31O2 (tính toán 304,2402); m/z 259,2360 tương ứng với mảnh ion có công thức phân tử C19H31 (tính

16 toán 260,2504) (hình 4.10). Theo các thành phần nguyên tố tính toán thu được và giá trị của khối lượng phân tử, dạng phân tử PE được xác định là alkenyl acyl PE 18:1e/20:4 và chiếm hàm lượng cao nhất trong phân lớp. Theo tính toán, hàm lượng của thành phần này chiếm tới 83,5% tổng PE trong mẫu Xenia sp.

S. macropodia

Xenia sp.

Bảng 4.8. Dạng phân tử phân lớp PE trong ba mẫu san hô mềm Capnella sp.

Dạng phân tử PE

[M-H]- m/z 464,3141 714,5450 716,5572

[M-H]- m/z 708,4948

% 0,03

[M-H]- m/z 500,2811 656,4614

0.9

0,22 0,33

722,5108

722,5046

3,93

722,5151

2.4

1,50

724,5256

2,41

724,5177

1,66

724,5281

0.6

726,5404

0,80

728,5545 736,4937

738,4930 748,5166

0,12 2,19

0,38 0,31

750,5444

750,5326

68,10

750,5305

83.5 56,0

752,5554

752,5254

16,68

11,55

764,5243

764,5236

4,83

17,11

782,5460

764,5489 766,5261 804,5796 806,5950

2,54 2,26 1,17 1,34

764,5584

2.5

1,27

LPE 18:1e LPE 20:4 15:1e/16:2* 15:1e/20:4 18:1e/17:1 18:0e/17:1 16:1e/20:4 (31.1)* 18:1e/18:4 (1) 16:0e/20:4 (100) 18:1e/18:3 (10) 18:0e/18:4 (1) 18:1e/18:2 (9) 18:0e/18:3 (1) 18:0e/18:2 16:1/20:4 16:0/20:4 18:1e/20:5 18:1e/20:4 (99.9) 18:0e/20:5 (0.1)** 18:0e/20:4 18:1/20:4 18:0/20:5 19:1e/20:4 18:0/20:4 19:0/20:4 18:1e/24:5 18:0e/24:5

*: tỉ lệ giữa hai dạng phân tử ; **: chỉ xuất hiện với mẫu Sinularia macropodia Tổng cộng 25 dạng phân tử PE và 2 dạng LPE đã được nhận dạng trong 3 mẫu san hô mềm. Như vậy, trong phân lớp PE của 3 mẫu san hô mềm, rất nhiều dạng phân tử là các O-alkenyl PE, khi thực hiện methyl hóa để phân tích thành phần axit béo, trên phổ GC/GC-MS sẽ quan sát thấy tín hiệu của các dimethylacetate (DMA). Dạng phân tử PE 18:1e/20:4 có hàm lượng cao nhất trong cả 3 loài san hô mềm 4.5.3. Phosphatidylserine (PS)

Phosphatidylserine có công thức cấu tạo chung như sau:

17

Hình 4.21. Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) (CAEP)

Hình 4.15. Phổ khối phân giải cao của hợp chất PS 16:0/18:2

+ Phổ khối phân giải cao của hợp chất 1-O-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine Trên phổ ion âm ESI-HRMS1 của phân lớp PS phân tập từ lipid đậu tương cho thấy ion [M–H]- có cường độ mạnh nhất cho tín hiệu tại m/z 758,4924, công thức tính toán thu được là [C40H73NO10P]-. Trên phổ ion dương không xuất hiện tín hiệu của ion tương ứng. Trên phổ ion âm MS2, ion có m/z 758,4924 có sự phân mảnh như sau: ion chính với tín hiệu tại m/z 671,4606 hình thành khi [M–H]- mất đi một nhóm serine với khối lượng monoisotopic 87,0359 (tương ứng với công thức C3H5NO2, khối lượng tính toán 87,0320).

Ngoài ra trong phổ ion âm MS2 còn có 3 ion với cường độ nhỏ có tín hiệu tại m/z lần lượt 391,2232 (mất đi mảnh có khối lượng 367,2692); 409,2330 (mất đi mảnh có khối lượng 349,2594); và 415,2240 (mất đi mảnh có khối lượng 343,2684). Những tín hiệu này là của các ion mảnh hình thành từ ion [M–H]-, ngoài đặc điểm chung là mất đi nhóm serine thì còn mất đi các mảnh acyl. Từ các giá trị m/z của chúng tương ứng với các ion mảnh tạo thành bởi ion [M–H]- loại bỏ ba mảnh trung hòa như sau: C21H37NO4 (C3H5NO2 + C18H32O2, khối lượng tính toán 367,2723), C21H35NO3 (C3H5NO2 + C18H30O, khối lượng tính toán 349,2617), và

18 C19H37O4 (C3H5NO2 + C16H32O2, khối lượng tính toán 343,2723). Từ đó, xác định được dạng phân tử của tử PS được phân tích được là 1-palmitoyl-2- linoleoyl-sn-glycero-3 phosphoserine (PS 16:0/18:2).

Hình 4.16. Sự phân mảnh đặc trưng của PS trong ESI-MS Đối với các hợp chất là PS, sự phân mảnh của ion [M-H]- trên phổ MS2 luôn xuất hiện ion mảnh tạo thành bởi ion mẹ [M-H]- bị mất đi một mảnh tương ứng với nhóm serine C3H5NO2 (khối lượng tính toán là 87,0320) (Hình 4.16)

Hàm lượng trong lớp chất

Capnella sp. 11,1

Bảng 4.12. Tổng hợp kết quả phân tích dạng phân tử lớp chất PS trong 3 mẫu san hô mềm

80,6

1 2 3 4 5 6 7

Sinularia macropodia 0,85 15,27 83,88

Xenia sp. 7,5 67,6 0,6 0,5 1,9

Dạng phân tử PS PS 16:0e/24:5 PS 18:0e/24:6 PS 18:0e/24:5 PS 18 :1e/24:4* PS 19:1e/24:5 LPS 24:5 LPS 18:0e

Tổng cộng ở 3 loài san hô mềm, đã nhận dạng được 7 dạng phân tử PS và LPS (bảng 4.12). Trong đó, chiếm hàm lượng cao nhất trong phân lớp PS ở cả ba loài san hô mềm là PS 18:0e/24:5. Axit béo chính có mặt trong phân lớp này là các axit béo mạch dài C24 – là đặc trưng sinh tổng hợp của san hô vật chủ trong hệ cộng sinh san hô – zooxanthellae. 4.5.4. Phosphatidylinositol (PI)

Hình 4.18. Phosphatidylinositol (PI)

Hình 4.19. Phổ khối phân giải cao của của hợp chất PI 16:0/18:0

19 + Phổ khối phân giải cao của 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3- phosphoinositol (16:0/18:2 PI) (chất chuẩn) Phân lớp phosphotidylinositol được phân lập từ hỗn hợp phospholipid của lipid đậu tương bằng HPLC và đưa vào phân tích phổ khối phân giải cao. Dạng phân tử chính của phân lớp PI hình thành ion [M–H]- có tín hiệu trên phổ ion âm MS1 tại m/z 833,5203, tương ứng với công thức [C43H78O13P]-. Sự phân mảnh khi thực hiện MS2 cho thấy có sự xuất hiện của các tín hiệu tương ứng với các phân mảnh ion đặc trưng được hình thành từ ion [M-H]- này. Các ion cho tín hiệu tại m/z 255,2324 [C16H31O2]- và 279,2331 [C18H31O2]- tương ứng với các anion carboxylate 16:0 và 18:2n. Việc mất đi mảnh 16:0 và 18:2n sẽ hình thành các ion có tín hiệu tại m/z 577,2763 ([M- H-C16H32O2]-, khối lượng tính toán 577,2783) và 553,2773 ([M–H– C18H32O2]-, khối lượng tính toán 553,2783). Khi mất đi mảnh [C18H32O2 – H2O] dẫn đến sự hình thành ion tại m/z 571,2867 ([M–H–C18H30O]-, giá trị tính toán 571,2889). Sự xuất hiện của tín hiệu tại m/z 297,0426 (giá trị tính toán 297,0381) được tạo ra bởi sự mất đi đồng thời 2 axit béo C16H32O2 và C18H32O2. Ion có m/z 315,0464 (giá trị tính toán 315,0487) được tạo bởi sự mất đi đồng thời 2 mảnh [C16H32O2] và [C18H32O2 – H2O]. Khi mất đi nhóm inositol và acyl, ion [M–H–(C6H10O5+C18H32O2)]- (giá trị tính toán 391,2255), và [M–H–(C6H10O5+C16H32O2]- (giá trị tính toán 415,2255) thể hiện tín hiệu tại m/z lần lượt 391,2275 và 415,2275 tương ứng. Với các mảnh ion đặc trưng như vậy, dạng phân tử với ion [M–H]- có tín hiệu tại m/z 833,5203 được xác định là 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3- phosphoinositol (PI 16:0/18:2) (Hình 4.19)

20

Phổ MS2 của ion [M–H]- cho nhiều tín hiệu của các ion mảnh đặc trưng hình thành do sự mất đi từ ion mẹ các mảnh như: phân tử axit béo, phân tử axit béo loại H2O, mất đi đồng thời phân tử axit béo và inositol (C6H10O5), ngoài ra trong phổ MS2 còn xuất hiện tín hiệu của anion các axit béo có mặt trong phân tử PI Bảng 4.14. Kết quả dạng phân tử của phân lớp PI trong 3 mẫu san hô mềm

Hàm lượng trong phân lớp

TT

Dạng phân tử PI

S. macropodia 5,99 20,09 62,96 10,96

Capnella sp. 0,70 1,60 5,39 3,75 1,25 25,23 42,65 8,48 0,05 0,21 0,97 0,10 0,26 0,22 0,15 0,53 0,18 0,64 0,10 3,83 0,06 0,15 1,21 0,23 1,43

Xenia sp. 13,5 1,5 0,8 2,0 33,1 8,0 8,0 6,1 16,1 1,4 5.1 1,7

18:0/20:3 18:0/20:4 16:0/22:6 18:0/22:5 16:0/24:5 16:0/22:6 16:1/22:6 18:0/20:3 18:0/20:4 18:0/22:4 18:0/22:5 + 16:0/24:5 18:0/22:6 18:0/24:5 18:0/24:6 18:0/26:5 18:0/26:6 18:1/22:6 17:1e/16:2 16:1e/18:4 16:0e/18:3 18:0e/16:2 16:0e/18:1 18:0e/18:4 18:0e/18:3 18:0e/18:2 18:0e/20:5 18:0e/20:4 17:0e/22:6 18:1e/22:5 18:0e/22:4 18:0e/24:6 18:0e/24:5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Trong cả ba loài san hô mềm, tổng cộng 32 dạng phân tử của PI đã được xác định. Trong đó, chiếm hàm lượng cao trong phân lớp là PI 18:0/22:4, PI 18:0/24:5, PI 16:0/22:6. Phát hiện sự có mặt của axit béo mạch siêu dài nằm trong các dạng phân tử PI 18:0/26:5 và PI 18:0/26:6, nhưng

21 chưa xác định được vị trí của các nối đôi trong mạch axit béo. Đây cũng là lần đầu tiên các axit béo C26 được xác định có mặt trong lipid các mẫu san hô. 4.5.5. Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) CAEP có công thức cấu tạo chung như sau:

Hình 4.21. Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP)

Phân lớp CAEP ở loài Xenia sp. chỉ có một thành phần chính, tín hiệu của ion phân tử [M-H]- tại m/z 641,5040 (tương ứng với CTPT [C36H70N2O5P]-, giá trị tính toán 641,5028). Đối với 2 loài S. macropodia và Capnella sp., dựa vào phổ ESI-MS1 phân lớp CAEP xác định được 2 thành phần chính với các tín hiệu của ion [M-H]- trên phổ ion âm tại m/z lần lượt là 641,5011/641,5044 (đều tương ứng với CTPT [C36H71N2O5P]-) và 643,5129/643,5155 (tương ứng với CTPT [C36 H73N2O5P]-). Phân tích các dữ liệu phổ MS2 và MS3 thu được, xác định ở loài san hô S. macropodia và Capnella p., phân lớp CAEP có 2 dạng phân tử là CAEP 16:0/18:2base và CAEP 16:0/18:1base, ở loài Xenia sp. thì chỉ có một dạng phân tử là CAEP 16:0/18:2base. 4.6. Xác định cấu trúc CAEP Theo kết quả phân tích dạng phân tử của các lớp chất phospholipid, lớp chất CAEP từ mẫu Xenia sp. chỉ gồm có 1 dạng phân tử là CAEP16:0/18:2. Chúng tôi tiến hành đo phổ NMR nhằm làm rõ cấu trúc của hợp chất này. Phổ 1H-, 13C-, và DEPT-NMR của hợp chất CAEP cho thấy rằng đây là một sphingophospholipipid. Ngoài ra, trên phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất CAEP cho biết trong chuỗi mạch dài (chuỗi sphingoid) có 2 nhóm liên kết đôi, kết hợp với phân tích các phổ cộng hưởng từ 2 chiều COSY và HMBC cho thấy, liên kết đôi thứ nhất thuộc vị trí C4=C5, liên kết đôi thứ hai nằm tại vị trí C8=C9. Các giá trị thu được này xác minh rằng chuỗi sphingoid của ceramide là một acid béo không no có 2 nối đôi trong phân tử (C18:2n-9) (hình 4.25)

22

Hình 4.26. Các tương tác (1H‒1H) COSY và (1H→13C) HMBC của CAEP

4.7. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học Trong số các mẫu TL, PoL và các phân lớp phospholipid phân lập từ san hô mềm được tiến hành thử hoạt tính kháng VSV kiểm định, TL thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus và nấm A. niger, CAEP thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn E. coli và B. Subtillis, LPE thể hiện hoạt tính kháng B. Subtillis (bảng 4.17) Bảng 4.17. Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của lipid tổng, phân đoạn lipid phân cực và các phân lớp phospholipid

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml)

Vi khuẩn Gr(-)

Vi khuẩn Gr(+)

Nấm mốc

Nấm men

Nhận xét

KH mẫu

E. coli

P. aeruginosa

B. subtillis

S. aureus

A. niger

F. oxysporum

S. cerevisiae

C. albicans

TL

100

200 LPE

200 CAEP

200 Kháng 2 VSVKĐ Kháng 1 VSVKĐ Kháng 2 VSVKĐ

Với hoạt tính gây độc tế bào, PoL ức chế cả hai dòng thế bào Hep-G2

và LU-1, thể hiện hoạt tính mạnh đối với dòng Hep-G2, TL thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào LU-1 và PI thể hiện hoạt tính đối với

dòng tế bào Hep-G2 (bảng 4.18)

Bảng 4.18. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào

Nồng độ ức chế 50%

Phần trăm

Nồng độ

tế bào sống sót (CS%)

(IC50, g/ml)

đầu

Kết luận

KH mẫu

(g/ml)

Dòng t. bào Hep-G2

Dòng t. bào LU-1

Dòng Hep-G2

Dòng LU-1

DMSO

Âm tính

100,00,0

Dương tính

2,21,5

3,40,7

50 50 50

- 8,12 32,13

24,8 37,1 -

Chứng (+) TL PoL PI

Dương tính 1 dòng TB Dương tính 2 dòng TB Dương tính 1 dòng TB

19,241,1 34,671,9 97,451,8

97,310,7 0 23,491,8

23 KẾT LUẬN

Lần đầu tiên khảo sát thành phần lipid của của 3 loài san hô mềm Việt Nam Sinularia macropodia, Xenia sp., Capnella sp. Hàm lượng lipid tổng dao động từ 1,44 đến 2,54% trọng lượng khô, 8,15 đến 16,90% trọng lượng tươi. Xác định được thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid của 3 loài san hô mềm nghiên cứu, gồm các lớp chất chính là lipid phân cực, sterol, axit béo tự do, triacylglycerol, monoalkyl diacylglycerol, sáp với hàm lượng lipid phân cực chiếm thành phần lớn (từ 21,14 đến 36,79%).

2. Kết quả ghiên cứu về thành phần và hàm lượng các axit béo của 3 loài san hô cho thấy tất cả đều có mặt các axit béo đánh dấu của san hô mềm (các axit béo 24:5n-6 và 24:6n-3) và các axit béo đặc trưng cho sự có mặt của VSV cộng sinh zooxanthellae (16:2n-7, 18:3n-6, 18:4n-3, 18:5n-3, 20:4n-3, 20:5n-3, 22:5n-3, 22:6n-3).

3. Phép phân tích PCA sử dụng số liệu về lipid ba mẫu san hô nghiên cứu với các số liệu đã được công bố về các loài san hô khác đã nhấn mạnh tầm quan trọng của VSV cộng sinh lên các yếu tố ảnh hưởng tới chemotaxonomy đối với san hô

chủ yếu và là 4. Kết quả phân tích các phân lớp phospholipid trong ba mẫu san hô mềm S. macropodia, Xenia sp., Capnella sp. cho thấy những phospholipid chính là phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamin, phosphatidylserine, phosphatidylinositol ceramide phosphonolipid aminoethylphosphonate. 5. Lần đầu tiên các dạng phân tử của các phân lớp phospholipid trong 3 loài san hô mềm đã được xác định, bao gồm: -

15 dạng phân tử của phosphatidylchonline (PC) và 3 dạng phân tử lyso phosphatidylcholine (LPC) đã được xác định, hàm lượng cao trong phân lớp là LPC 18:0e, PC 16:0e/20:4, PC 18:0e/20:4. Dạng phân tử PC 16:0e/18:4 minh chứng cho sự vận chuyển axit béo từ VSV cộng sinh sang san hô vật chủ. - 25 dạng phân tử phosphatidylethanolamine (PE) và 2 dạng lyso phosphatidyl ethanolamine (LPE), trong đó có mặt rất nhiều dạng phân tử là

24 các O-alkenyl PE. Dạng phân tử PE có hàm lượng cao nhất trong cả 3 loài san hô mềm là PE 18:1e/20:4.

7 dạng phân tử phosphatidylserine (PS) và lyso phosphatidylserine (LPS), chiếm hàm lượng cao nhất trong phân lớp PS ở cả ba loài san hô mềm là PS 18:0e/24:5. Axit béo chính có mặt trong phân lớp này là các axit béo mạch dài C24 – là đặc trưng sinh tổng hợp của san hô vật chủ trong hệ cộng sinh san hô – zooxanthelae -

32 dạng phân tử của phosphatidylinositol, chiếm hàm lượng cao trong phân lớp là PI 18:0/22:4, PI 18:0/24:5, PI 16:0/22:6. Phát hiện sự có mặt của axit béo mạch siêu dài nằm trong các dạng phân tử PI 18:0/26:5 và PI 18:0/26:6, tuy chưa xác định được vị trí của các nối đôi trong mạch axit béo. Đây là lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của các axit béo C26 trong lipid san hô.

- Ở loài san hô Sinualaria macropodia và Capnella p., phân lớp CAEP có 2 dạng phân tử là CAEP 16:0/18:2base và CAEP 16:0/18:1base, ở loài Xenia sp. có một dạng phân tử là CAEP 16:0/18:2base. CAEP được biết là một trong những đặc trưng lipid của ngành động vật ruột khoang

- Đã chứng minh được cấu trúc của hợp chất CAEP 16:0/18:2base 6. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học: - Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: TL thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus và nấm A. niger, CAEP thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn E. coli và B. Subtillis, LPE thể hiện hoạt tính kháng B. Subtillis

- Hoạt tính gây độc tế bào: PoL ức chế cả hai dòng thế bào Hep-G2 và LU-1, thể hiện hoạt tính mạnh đối với dòng Hep-G2, TL thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào LU-1 và PI thể hiện hoạt tính đối với dòng tế bào Hep-G2

KIẾN NGHỊ

- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về dạng phân tử của các lớp chất lphospholipid trên đối tượng san hô mềm Việt Nam. Kết quả thu được mở ra một hướng nghiên cứu mới, chuyên sâu hơn nhưng mới chỉ dừng lại ở bước đầu, cần được tiếp tục thực hiện trên các loài khác khác nhằm thu được một bộ dữ liệu đầy đủ về lĩnh vực lipid san hô.