Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi ngọn dứa (Ananas comosus)

An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI NGỌN DỨA<br /> (ANANAS COMOSUS)<br /> <br /> Nguyễn Phú Thọ1<br /> 1<br /> Trường Đại học An Giang<br /> <br /> Thông tin chung: ABSTRACT<br /> Ngày nhận bài: 31/08/2017<br /> Ngày nhận kết quả bình duyệt: This paper presents the study of the extraction of crude bromelain from the<br /> 07/06/2018 pineapple bud. The project objectives were the establishment of the simple<br /> Ngày chấp nhận đăng: bromelain production procedure which based on studies of (a) Appropriate<br /> 08/2018 extraction conditions of bromelain from pineapple bud; (b) The effects of<br /> Title: precipitants on bromelain activity; (c) Appropriate temperature of drying;<br /> A study of the extraction of (d) Applying extracted bromelain to hydrolysis of Tra fish by-product. The<br /> crude bromelain from the results showed that the appropriate ratio between pineapple bud and<br /> pineapple bud (Ananas distilled water was 1:3. The best precipitant was acetone with the ratio<br /> comosus)<br /> between pineapple bud and acetone = 1:1. The optimum drying temperature<br /> Keywords: was 45 oC within 4 hours. This bromelain product had the hydrolysis<br /> Acetone precipitation, property higher than the commercial one (Sigma - Aldrich).<br /> bromelain, drying<br /> precipitation, pineapple bud<br /> (Ananas comosus)<br /> TÓM TẮT<br /> <br /> Từ khóa: Đề tài nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa được thực<br /> Chồi dứa (Ananas comosus), hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu quy trình sản xuất bột bromelain đơn giản và<br /> bromelain, kết tủa acetone, rẻ tiền dựa trên các nghiên cứu: (a) Điều kiện trích ly bromelain từ chồi<br /> sấy khô kết tủa ngọn dứa; (b) Ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến bromelain; (c) Nhiệt độ<br /> sấy khô kết tủa bromelain; (d) Thử khả năng thủy phân phụ phẩm cá tra giữa<br /> bromelain sản phẩm và bromelain thương mại.<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy, nước là dung môi thích hợp để trích ly<br /> bromelain từ chồi ngọn dứa với tỷ lệ chồi ngọn:nước là 1:3. Acetone cho<br /> hiệu quả tủa bromelain chồi ngọn tốt nhất. Tỷ lệ dịch trích enzyme:acetone<br /> là 1:1. Nhiệt độ sấy khô kết tủa tối ưu là 45 oC, thời gian sấy 4 giờ.<br /> Bromelain sản phẩm thu được có khả năng thủy phân phụ phẩm cá tra. Khả<br /> năng thủy phân của bromelain sản phẩm thí nghiệm cao hơn bromelain<br /> thương mại (Sigma - Aldrich).<br /> <br /> <br /> 1. GIỚI THIỆU ứng dụng rộng rãi trong y học và chế biến thực<br /> Bromelain là một loại enzyme thủy phân đạm phẩm.<br /> (proteinase) được tìm thấy trong toàn bộ cây Trong ngành công nghệ chế biến dứa sẽ có các<br /> dứa cũng như trong các phế phụ phẩm của dứa phế phẩm như lõi, chồi, vỏ và lá. Phần phế<br /> (Ananas comosus), đây là một enzyme được phẩm này chiếm một tỷ lệ lớn của lượng dứa<br /> nguyên liệu đưa vào chế biến, khoảng 70%<br /> <br /> <br /> <br /> 84<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> (Nguyễn Bá Mùi, 2005). Tuy nhiên ở Việt 2.2.2 Ảnh hưởng của tác nhân tủa lên hoạt<br /> Nam, một nước nhiệt đới có sản lượng dứa lớn, tính bromelain<br /> việc tách bromelain từ phế phụ phẩm tạo chế Bromelain được trích ly từ chồi ngọn bằng<br /> phẩm thương mại ứng dụng trong công nghiệp nước cất với tỷ lệ chồi ngọn:nước thích hợp.<br /> chưa nhiều. Ở các nông trường trồng dứa, cây Sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút, trong 10<br /> và lá dứa bị bỏ khô trên đất hoặc được vùi làm phút, 4 oC. Lấy dịch trích enzyme ở phía trên<br /> đem tủa với các tác nhân: acetone (với tỷ lệ<br /> phân bón. Ở các nhà máy chế biến rau quả, dịch trích enzyme:acetone lần lượt là 1/1, 1/2,<br /> phần lớn phụ phẩm dứa được đưa ra bãi rác gây 1/3 và 1/4); ethanol 960 (với tỷ lệ dịch<br /> ô nhiễm môi trường. trong:ethanol lần lượt là 1/4, 1/5, 1/6 và 1/7);<br /> (NH4)2SO4 (30%, 40%, 50% và 60%). Kết thúc<br /> Xuất phát từ tình hình thực tế trên đề tài<br /> quá trình tủa tiến hành ly tâm ở 13.000<br /> “Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ vòng/phút, trong 10 phút, 4 oC. Thực hiện đo<br /> chồi dứa (Ananas comosus)” được thực hiện hoạt tính trước và sau khi tủa.<br /> nhằm bước đầu xây dựng quy trình thu nhận 2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính<br /> bromelain thô từ chồi dứa góp phần đáp ứng bromelain trong quá trình sấy<br /> được nhu cầu sử dụng enzyme; làm tăng giá trị<br /> Bromelain được trích ly từ chồi ngọn bằng<br /> kinh tế của cây dứa. Mặt khác, đề tài còn góp nước cất với tỷ lệ chồi ngọn:nước là 10 g:30<br /> phần giải quyết được một phần nguồn phụ ml. Dịch trích enzyme được tủa bằng acetone<br /> phẩm từ công nghiệp chế biến dứa. với tỷ lệ dịch trích enzyme:acetone là 1:1. Kết<br /> 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU thúc quá trình tủa ly tâm ở 13.000 vòng/phút,<br /> trong 10 phút, 4 oC để thu lấy tủa. Trải kết tủa<br /> 2.1 Mẫu nghiên cứu thật mỏng trên khai nhựa, sấy đối lưu tự nhiên<br /> bằng tủ sấy Memmert UNB500 ở nhiệt độ 45<br /> Nguyên liệu: Phụ phẩm chồi dứa được chọn là oC, 55 oC, 65 oC và để khô tự nhiên ở nhiệt độ<br /> chồi ngọn thu tại các chợ trên địa bàn thành phố phòng 30 oC. Cứ sau 2 giờ lấy mẫu một lần ở<br /> Long Xuyên. mỗi nhiệt độ sấy tương ứng để xác định hoạt<br /> tính.<br /> Hóa chất: Coomasie Brillant Blue G250<br /> (Merck), L-Cystein (Merck), Casein (Trung 2.2.4 So sánh khả năng thủy phân phụ phẩm<br /> Quốc), Tyrosin (Merck), Tricloroacetic acid cá tra giữa sản phẩm bromelain thí<br /> (Trung Quốc), EDTA, NaH2PO4 và Na2HPO4 nghiệm và bromelain thương mại<br /> (Trung Quốc) để pha dung dịch đệm phosphat Phụ phẩm cá tra gồm đầu, xương, bụng được<br /> có pH = 7, H3PO4, … nghiền nhuyễn và tách béo. Bổ sung enzyme<br /> bromelain trong nghiên cứu và bromelain<br /> 2.2 Nội dung nghiên cứu<br /> thương mại với nồng độ 0,1%. Tiến hành thủy<br /> 2.2.1 Trích ly bromelain từ chồi ngọn dứa phân trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 37 oC. Mẫu<br /> đối chứng không bổ sung enzyme. Khối lượng<br /> Chồi ngọn dứa sau khi loại hết lá, rửa sạch, cho mỗi mẫu thủy phân là 1 kg phụ phẩm. Khi<br /> nghiền nhuyễn và được ly trích bằng hai loại thủy phân xong, chiết lấy dịch thủy phân và<br /> dung dịch: nước cất; đệm phostphat 50 mM, nâng nhiệt độ lên 100 °C trong 15 phút để vô<br /> pH=7. Nước cất hoặc đệm được cho lần lượt hoạt enzyme. Sau đó dịch thủy phân được lọc<br /> vào các cốc chứa 10 g chồi ngọn đã nghiền và phân tích hàm lượng đạm amin.<br /> nhuyễn với thể tích khác nhau 20 ml, 30 ml, 40<br /> ml và 50 ml. Khuấy đều trên máy khuấy từ 2.3 Phương pháp phân tích<br /> trong 15 phút. Sau đó ly tâm ở 13.000 2.3.1 Xác định hàm lượng protein<br /> vòng/phút, trong 10 phút, 4 oC. Bỏ cặn, lấy dịch<br /> enzyme trong bên trên để xác định hoạt tính Hàm lượng protein được xác định theo phương<br /> bromelain. pháp Bradfrod (1996). Nồng độ protein được<br /> xác định sau khi cho tác dụng với Coomassie<br /> Brilliant Blue (CBB) G250. Chất này kết hợp<br /> <br /> <br /> 85<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> với protein trong điều kiện axít tạo nên phức 10 phút. Dung dịch được đo độ hấp thụ ánh<br /> màu xanh tím hấp thu ánh sáng ở bước sóng sáng ở 275 nm.<br /> 595 nm. Độ hấp thu tỷ lệ thuận với hàm lượng Một đơn vị hoạt tính của papain (Tyrosin Unit<br /> protein trong dung dịch. Dựng đường chuẩn (TU) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân<br /> hàm lượng protein, dựa vào đường chuẩn suy ra casein cho ra 1 µg tyrosine trong 1 phút ở 37<br /> nồng độ protein trong mẫu. Protein thu hồi bằng oC, pH =7,5.<br /> protein sau khi tủa chia cho protein trước khi<br /> tủa nhân với 100. Hoạt tính đặc hiệu là số đơn vị hoạt tính của<br /> enzyme trên 1 mg protein (U/mg). Hoạt tính thu<br /> 2.3.2 Xác định họat tính papain hồi bằng hoạt tính bromelain sau khi tủa chia<br /> Hoạt tính enzyme papain được xác định dựa cho hoạt tính bromelain trước khi tủa nhân với<br /> theo phương pháp Kunitz (1917) cải tiến, sử 100.<br /> dụng casein làm cơ chất thủy phân và đã được 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> điều chỉnh để có thể thực hiện trong ống<br /> eppendorf. Cho vào các ống eppendorf 600 µl Từ 10 kg chồi ngọn sau khi làm sạch lá gai thu<br /> 1% (w/v) casein + 40 µl Cystein 20 mM + 140 được 2 kg chồi. Rửa sạch, nghiền và trích ly<br /> µl đệm phosphat (pH = 7,5) + 20 µl enzyme. được 4 L dịch chiết enzyme bromelain. Hàm<br /> Ống đối chứng bất hoạt enzyme bằng TCA<br /> lượng protein và hoạt tính của dịch trích thô đã<br /> 15%. Ủ lắc 10 phút, 37 oC. Ly tâm 13.000 rpm,<br /> được xác định ở Bảng 1.<br /> Bảng 1. Thành phần protein và hoạt tính bromelain trong chồi dứa<br /> <br /> Chồi ngọn Chồi ngọn<br /> Thể tích Protein Hoạt tính Hoạt tính đặc hiệu<br /> chưa xử lý sau khi xử lý<br /> (lít) (mg/ml) (U/ml) (U/mg)<br /> (kg) (kg)<br /> 10 2 4 1,06 4,62 4,36<br /> <br /> <br /> Kết quả này giống với Lại Thị Ngọc Hà (2009), Kết quả ảnh hưởng của loại dung dịch trích ly<br /> hoạt lực protease trong chồi ngọn và vỏ quả là và tỷ lệ trích ly bromelain chồi ngọn dứa đến<br /> cao nhất. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim hàm lượng protein tổng và hoạt tính đặc hiệu<br /> Anh, Phạm Thu Thủy và Nguyễn Thị Xuân của bromelain được trình bày ở Bảng 2.<br /> Sâm (2005) khẳng định, bromelain thu nhận Kết quả Bảng 2 cho thấy, hàm lượng protein<br /> chủ yếu từ chồi và vỏ dứa. Đinh Thị Tình khác biệt không có ý nghĩa ở các nghiệm thức<br /> (2007) đã khảo sát hoạt lực protease trong các khác nhau. Hàm lượng protein thu được cao<br /> phần của quả dứa cũng cho kết quả tương tự. nhất là 1,82 mg/ml khi ly trích bằng nước với tỷ<br /> Như vậy, chồi ngọn là phần phụ phẩm có thể lệ 1/5 nhưng hoạt tính đặc hiệu thu được là thấp<br /> dùng để tách protease. nhất (2,04 U/mg). Tương tự, hoạt tính đặc hiệu<br /> 3.1 Ảnh hưởng của dung dịch trích và tỷ lệ cũng khá thấp (2,27 U/mg) khi ly trích bằng<br /> trích ly đến bromelain chồi dứa đệm ở tỷ lệ 1/5. Điều này cho thấy ở hàm lượng<br /> nước cao enzyme dễ dàng bị mất hoạt tính.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 86<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của dung dịch trích ly và tỷ lệ trích ly đến lượng protein và hoạt tính đặc hiệu của<br /> bromelain<br /> <br /> Tỷ lệ Protein tổng Hoạt tính<br /> Dung dịch trích ly<br /> Chồi:dung môi (mg) đặc hiệu (U/mg)<br /> 1/2 1,33ab 3,21a<br /> 1/3 1,25ab 3,43a<br /> Đệm<br /> 1/4 1,61ab 2,84abc<br /> 1/5 1,52ab 2,27bc<br /> 1/2 1,18ab 2,06bc<br /> 1/3 1,15b 3,54a<br /> Nước<br /> 1/4 1,70ab 2,89ab<br /> 1/5 1,82a 2,04c<br /> Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa<br /> thống kê ở mức ý nghĩa 5%.<br /> <br /> Hoạt tính đặc hiệu của bromelain (Bảng 2) khi kết thí nghiệm với kết quả nghiên cứu này ta<br /> ly trích ở tỷ lệ 1/3 bằng đệm là 3,43 U/mg và thấy nước là dung môi rẻ tiền có thể sử dụng để<br /> bằng nước là 3,54 U/mg cao hơn so với các trích ly enzyme nhóm thiol protease.<br /> nghiệm thức còn lại. Như vậy cho thấy, tỷ lệ 3.2 Kết quả ảnh hưởng của tác nhân tủa<br /> 1/3 thích hợp cho việc trích ly bromelain từ đến hoạt tính bromelain<br /> chồi ngọn dứa.<br /> Độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào sự tương<br /> Tóm lại, tỷ lệ ly trích bromelain từ chồi dứa tác của các nhóm tích điện trong phân tử<br /> thích hợp là 1/3. Theo kết quả nghiên cứu của enzyme với các phân tử nước. Sự tương tác đó<br /> Nguyễn Phú Thọ và Dương Thị Hương Giang (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống<br /> (2011) thì tỷ lệ trích ly papain (enzyme cùng khi thêm vào dung dịch protein enzyme các<br /> nhóm với bromelain) từ nhựa đu đủ thích hợp dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính.<br /> nhất là nhựa:nước: 0,1:2 g/ml. Như vậy so sánh<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Dịch trích chồi dứa trước và sau khi tủa<br /> <br /> <br /> <br /> 87<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, 90%, hoạt tính thu hồi là 94%. Ngược lại, khi<br /> isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại tủa với ethanol protein thu hồi giảm còn 75%<br /> rượu. Mỗi loại dung môi khác nhau sẽ có ảnh và hoạt tính thu hồi là 88%. Điều này cho thấy,<br /> hưởng khác nhau đến hoạt tính enzyme trong tác nhân tủa khác nhau sẽ có ảnh hưởng khác<br /> quá trình kết tủa. Tương tự, trong cùng một loại nhau đến hoạt tính của enzyme sau tủa.<br /> dung môi (hay tác nhân tủa) thì nồng độ dung Đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của ba loại tác<br /> môi khác nhau cũng có ảnh hưởng khác nhau nhân tủa là ethanol, acetone và ammonium<br /> đến hoạt lực của enzyme. Theo Mariela, Bruno, sulfate ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thí<br /> Pardo, Caffini và López (2002), khi tủa nghiệm được trình bày ở Bảng 3.<br /> bromelain quả với acetone, protein thu hồi đạt<br /> Bảng 3. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính và protein thu hồi của enzyme bromelain chồi<br /> <br /> Protein Hoạt tính Hoạt tính<br /> Tỷ lệ tủa<br /> thu hồi (%) thu hồi (%) đặc hiệu (U/mg)<br /> Enzyme:ethanol:1:4 32,58b 36,96de 5,61e<br /> Enzyme:ethanol:1:5 38,48a 55,32ab 7,04de<br /> Enzyme:ethanol:1:6 38,98a 66,62a 8,38d<br /> Enzyme:ethanol:1:7 36,52a 43,08cde 5,78e<br /> Enzyme:acetone:1:1 12,40f 50,14bc 19,66a<br /> Enzyme:acetone:1:2 15,85ef 33,19e 11,00c<br /> Enzyme:acetone:1:3 19,29cde 48,73bcd 12,28bc<br /> Enzyme:acetone:1:4 15,85ef 43,55bcde 13,55b<br /> Ammonium sulfate (30%) 17,25de 6,97f 1,97f<br /> Ammonium sulfate (40%) 19,71cd 10,03f 2,49f<br /> Ammonium sulfate (50%) 21,61c 14,36f 3,26f<br /> Ammonium sulfate (60%) 19,78cd 12,48f 3,09f<br /> Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì không khác biệt về mặt thống kê<br /> ở mức ý nghĩa 5%.<br /> <br /> Đối với tác nhân tủa là ethanol, kết quả ở Bảng phần trăm hoạt tính thu hồi có thể đạt xấp xỉ<br /> 3 cho thấy, protein thu hồi thấp nhất ở tỷ lệ 90% (Lopes và cs., 2009). Đối với hoạt tính thu<br /> enzyme:ethanol là 1/4 (32,58%). Phần trăm hồi, ở tỷ lệ enzyme:ethanol là 1/4 thì hoạt tính<br /> protein thu hồi cao nhất là 38,48% và 38,98% thu hồi thấp nhất (36,96%). Phần trăm hoạt tính<br /> tương ứng với tỷ lệ dịch trích enzyme:ethanol là thu hồi tăng lên 55,32% ở tỷ lệ 1/5. Khi tỷ lệ<br /> 1/5 và 1/6. Tuy nhiên, với tỷ lệ enzyme:ethanol enzyme:ethanol là 1/6, hoạt tính thu hồi tăng<br /> là 1/7 thì phần trăm thu hồi protein lại giảm lên 66,62%. Tuy nhiên không có sự khác biệt ý<br /> (36,52%) nhưng khác biệt này không có ý nghĩa nghĩa 5% về hoạt tính thu hồi giữa 2 tỷ lệ 1/5<br /> thống kê so với tỷ lệ 1/5 và 1/6. và 1/6. Hoạt tính thu hồi lại giảm còn 43,08% ở<br /> Trong chiết xuất enzyme, phần trăm hoạt tính tỷ lệ 1/7. Theo Lại Thị Ngọc Hà (2009), hàm<br /> thu hồi thường dùng để đánh giá sự hiệu quả lượng protein và hoạt tính thu hồi cũng tăng lên<br /> của phương pháp. Ở điều kiện tinh sạch tối ưu khi nồng độ ethanol trong thể tích hỗn hợp tăng<br /> <br /> <br /> <br /> 88<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> và sau đó lại giảm khi nồng độ ethanol tăng sulfate tăng từ 30% đến 50% thì phần trăm thu<br /> vượt quá. hồi protein cũng tăng. Ở 30%, lượng protein thu<br /> Hoạt tính đặc hiệu thể hiện độ tinh sạch của hồi đạt 17,25% và ở 50% ammonium sulfate<br /> enzyme, hoạt tính đặc hiệu càng cao enzyme bão hòa tăng đến 21,61%, sau đó giảm ở các<br /> càng tinh sạch. Kết quả Bảng 3 cho thấy, khi nồng độ ammonium sulfate bão hòa cao hơn thể<br /> nồng độ ethanol tăng thì hoạt tính đặc hiệu thu hiện qua lượng protein còn (19,78% thu hồi).<br /> được sau tủa cũng tăng, nhưng khi nồng độ Theo Bảng 3 thì ở nồng độ 50% ammonium<br /> ethanol vượt quá cao thì hoạt tính lại giảm. sulfate bão hòa có phần trăm hoạt tính thu hồi<br /> Hoạt tính đặc hiệu thấp nhất ở tỷ lệ đạt cao nhất 14,36% nhưng khác biệt không có<br /> enzyme:ethanol là 1/4 (5,61 U/mg) và cao nhất ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn<br /> ở tỷ lệ 1/6 (8,38 U/mg). Khi nồng độ ethanol lại. Khi nồng độ ammonium sulfate bão hòa<br /> tăng lên (tỷ lệ 1/7) thì hoạt tính đặc hiệu lại tăng lên 60% thì hoạt tính đặc hiệu và hoạt tính<br /> giảm (5,78 U/mg). Khi nồng độ ethanol quá cao thu hồi có xu hướng giảm. Như vậy có thể thấy<br /> thì lực tương tác tĩnh điện tăng lên, kết quả làm với nồng độ ammonium sulfate 50% bão hòa thì<br /> cho các phân tử enzyme bị vặn uốn gây ảnh các protein trong dung dịch đều được kết tủa<br /> hưởng đến hoạt tính. So sánh giữa các nghiệm với hàm lượng và hoạt tính thu hồi enzyme cao<br /> thức khảo sát có thể thấy tỉ lệ tủa nhất. Kết quả này không khớp với nghiên cứu<br /> enzyme:ethanol 1:6 là tối ưu nhất. Tỷ lệ 1/6 của Nguyễn Văn Thành và cs. (2013) khi nồng<br /> tương đương với nồng độ ethanol khoảng 82%. độ ammonium sulfate 70% thì hoạt tính thu hồi<br /> Kết quả này trùng khớp với Lại Ngọc Hà bromelain trong thân dứa là cao nhất. Ở nồng<br /> (2009) kết tủa bromelain chồi bằng cồn ở nồng độ muối cao hơn 70% bão hòa, lực điện tích<br /> độ 80% là tốt nhất. tăng lên, số lượng ion kết hợp với protein<br /> nhiều, lực tĩnh điện được tạo thành sẽ làm cho<br /> Đối với tác nhân tủa là acetone, kết quả thí<br /> phân tử protein bị xoáy, vặn và dẫn đến sự biến<br /> nghiệm cho thấy, phần trăm protein thu hồi thấp<br /> tính (Nguyễn Đình Huyên, Hà Ái Quốc, Lâm<br /> nhất là 12,40% tương ứng với tỷ lệ<br /> Thị Kim Châu, Lê Thị Thanh Mai, 1994).<br /> enzyme:acetone là 1:1. Ở tỷ lệ enzyme:acetone<br /> là 1/2 phần trăm protein thu hồi là 15,85% và Theo kết quả của Nguyễn Đình Huyên và cs.<br /> tăng lên 19,29% ở tỷ lệ 1/3. Tuy nhiên, phần (1994), khi kết tủa bromelain trái bằng<br /> trăm thu hồi protein lại giảm xuống còn 15,85% ammonium sulfate ở các nồng độ từ 30% đến<br /> với tỷ lệ enzyme:acetone là 1/4. Ở nồng độ 100% cũng đã kết luận nồng độ 70%<br /> acetone quá cao, protein bị biến tính không ammonium sulfate cho hiệu suất thu hồi hoạt<br /> thuận nghịch và không thể hòa tan trở lại trong tính cao nhất. Dương Thị Hương Giang và cs.<br /> nước hay dung dịch đệm sau khi kết tủa. (2002) đã nghiên cứu đánh giá các phương<br /> pháp trích ly bromelain từ nước khóm thô bằng<br /> Ở tỷ lệ enzyme:acetone là 1/1 kết tủa thu được<br /> acetone và ammonium sulfate đã kết luận rằng,<br /> có hoạt tính đặc hiệu cao và khác biệt so với<br /> phương pháp trích ly bromelain bằng<br /> các mẫu còn lại. Tuy hiệu suất thu hồi protein<br /> ammonium sulfate theo tỷ lệ 70% bão hòa thu<br /> thấp nhưng hoạt tính thu hồi và hoạt tính đặc<br /> nhận bromelain thô cho hiệu suất thu hồi khá<br /> hiệu cao chứng tỏ enzyme khá sạch. Theo kết<br /> cao 92% so với hoạt tính ban đầu. Như vậy cho<br /> quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Trúc<br /> thấy có sự khác biệt trong cấu trúc giữa<br /> (2010), tỷ lệ enzyme:acetone là 1/1 cũng cho<br /> bromelain trong thân, nước khóm và chồi ngọn.<br /> hiệu quả tủa tốt nhất ở bromelain thân dứa.<br /> Tóm lại, khi so sánh giữa các tác nhân tủa thì<br /> Đối với tác nhân tủa là ammonium sulfate, kết<br /> hoạt tính đặc hiệu của các mẫu tủa bằng<br /> quả thí nghiệm cho thấy, khi lượng ammonium<br /> <br /> <br /> 89<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> ammonium sulfate là thấp hơn so với các tác tương đối thấp (khoảng 12,4%), nhưng hoạt<br /> nhân tủa khác. Điều này cho thấy, ammonium tính đặc hiệu rất cao cho thấy về mức độ tinh<br /> sulfate không cho hiệu quả tủa bromelain chồi sạch cũng tốt hơn nhiều so với hai tác nhân tủa<br /> tốt vì kết tủa chứa nhiều protein tạp. Đối với còn lại.<br /> phương pháp tủa bằng acetone tỷ lệ 1/1 hoạt 3.3 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến<br /> tính đặc hiệu của bromelain thu được cao nhất hoạt tính bromelain trong quá trình sấy<br /> là 19,66 U/mg gấp 2 lần so với mẫu tủa bằng khô kết tủa<br /> ethanol tỷ lệ 1/6 (8,38 U/mg) và gấp 6 lần so<br /> Nhiệt độ sấy và thời gian sấy là hai yếu tố quan<br /> với mẫu tủa bằng ammonium sulfate 50% (3,26<br /> trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm<br /> U/mg). Với ethanol tỉ lệ 1:6, tăng thu hồi<br /> enzyme. Sấy ở nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt<br /> protein 3 lần, tăng hoạt tính thu hồi phần trăm<br /> tính của enzyme do protein bị biến tính. Tuy<br /> cao hơn so với aceton nhưng hoạt tính đặc hiệu<br /> nhiên, khi sấy ở nhiệt độ thấp thì thời gian sấy<br /> thấp hơn chứng tỏ trong thành phần kết tủa<br /> kéo dài và trong thời gian này với sự hiện diện<br /> ngoài bromelain còn có nhiều protein tạp. Như<br /> của ẩm độ cao thì sự tự phân của các protease<br /> vậy, acetone là dung môi thích hợp để tinh sạch<br /> sẽ diễn ra làm enzyme bị mất hoạt tính.<br /> sơ bộ bromelain chồi, mặc dù protein thu hồi<br /> <br /> Bảng 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính đặc hiệu của enzyme bromelain qua quá trình sấy<br /> <br /> Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)<br /> Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Trung bình<br /> 2 4 6<br /> Phòng (30 oC) 14,48a x 14,15c x 8,08 b y 12,24<br /> 45 15,47a x<br /> 13,71bc x<br /> 10,18b y<br /> 13,12<br /> 55 15,64a x<br /> 11,98b y<br /> 8,36b z<br /> 12,00<br /> 65 14,34a x 3,13a y 0,00a z 5,82<br /> Trung bình 14,99 10,74 6,65<br /> Ghi chú: Các kí tự từ a – b so sánh các trung bình trong cùng một cột, các kí tự từ x – z so sánh các trung bình trong<br /> cùng một hàng. Các kí tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.<br /> <br /> Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian gian đặc biệt là sau 6 giờ sấy, do đó không thể<br /> đến hoạt tính của bromelain trong quá trình sấy làm khô tủa bromelain chồi ở nhiệt độ phòng.<br /> kết tủa được thể hiện trong Bảng 4. Kết quả Ở nhiệt độ 45 °C, hoạt tính bromelain ở 2 giờ<br /> Bảng 4 cho thấy, thời gian sấy càng kéo dài thì sấy là 15,47 U/mg và giảm còn 13,71 U/mg sau<br /> hoạt tính bromelain càng giảm. 4 giờ sấy. Tuy nhiên khác biệt này không có ý<br /> Ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ kết quả thực nghiệm nghĩa thống kê. Sau 6 giờ sấy hoạt tính<br /> cho thấy, độ ẩm của chế phẩm bromelain vẫn bromelain là 10,18 U/mg giảm đáng kể so với<br /> cao hơn 10%. Mức ẩm độ này chưa đủ để bảo thời gian 2 giờ và 4 giờ. Như vậy, thời gian sấy<br /> quản chế phẩm được lâu vì độ ẩm càng cao thì thích hợp cho bromelain chồi ngọn ở 45 oC là 4<br /> enzyme dễ dàng bị mất hoạt tính. Đồng thời giờ.<br /> theo kết quả thí nghiệm (Bảng 4) thì ở nhiệt độ Ở 55 oC và 65 °C, khi kéo dài thời gian sấy thì<br /> này hoạt tính bromelain giảm nhanh theo thời hoạt tính bromelain giảm nhanh theo thời gian<br /> <br /> <br /> <br /> 90<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> và có sự khác biệt ý nghĩa giữa mốc thời gian 2 hoạt tính còn lại sau khi sấy là 73,28%. So với<br /> giờ và 4 giờ sấy. kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Thành và<br /> Không chỉ có nhiệt độ mà thời gian cũng ảnh cs. (2013) thì hoạt tính còn lại của bromelain<br /> hưởng đến hoạt tính của bromelain trong quá thân dứa là 87,55% khi thực hiện sấy đông khô.<br /> trình sấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi thời Lại Thị Ngọc Hà (2009) so sánh hiệu quả của<br /> gian sấy càng kéo dài thì hoạt tính đặc hiệu của phương pháp sấy phun và sấy đông khô<br /> bromelain càng giảm do càng có nhiều phân tử bromelain cho kết quả hoạt tính được giữ lại<br /> enzyme bị biến tính. Ở thời gian 2 giờ, hoạt tính sau hai quá trình này là 96% và 73%, tương<br /> đặc hiệu của bromelain khác biệt không có ý ứng.<br /> nghĩa khi sấy ở các nhiệt độ khác nhau. 3.4 So sánh khả năng thủy phân phụ phẩm<br /> cá tra giữa sản phẩm bromelain thí<br /> Tóm lại, chế phẩm bromelain có thể sấy ở nhiệt<br /> nghiệm với sản phẩm bromelain thương<br /> độ 45 °C trong 4 giờ là thích hợp nhất với hoạt<br /> mại<br /> tính đặc hiệu là 13,71 U/mg. So với hoạt tính<br /> đặc hiệu ban đầu (18,71 U/mg) thì phần trăm<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Bột bromelain chồi dứa sau khi sấy<br /> <br /> Sau khi sấy khô kết tủa thì thu được chế phẩm phẩm thương mại. Số đơn vị hoạt tính trên một<br /> bromelain dạng bột màu trắng ngà. Tiến hành miligam bột sản phẩm bromelain thí nghiệm là<br /> đo hoạt tính để so sánh với sản phẩm bromelain 1,12 U/mg cao hơn so với bromelain thương<br /> thương mại (Sigma-Aldrich). Kết quả Bảng 5 mại 0,91 U/mg. Như vậy, nếu sử dụng cùng<br /> cho thấy, hoạt tính đặc hiệu của bromelain một lượng bột enzyme thì sản phẩm bromelain<br /> trong sản phẩm thí nghiệm cao hơn so với chế<br /> <br /> <br /> <br /> 91<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> thí nghiệm có thể cho hiệu quả thủy phân cao hơn.<br /> Bảng 5. So sánh hoạt tính của sản phẩm bromelain thí nghiệm và bromelain thương mại<br /> <br /> Enzyme bromelain Protein Hoạt tính Hoạt tính đặc hiệu<br /> (mg/mg bột) (U/mg bột) (U/mg)<br /> Bromelain sản phẩm 0,09a 1,12a 13,13a<br /> Bromelain thương mại<br /> 0,10b 0,91b 9,48b<br /> (Sigma - Aldrich)<br /> Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa<br /> thống kê ở mức ý nghĩa 5%.<br /> <br /> Xét về hàm lượng protein thì chế phẩm phẩm thí nghiệm. Như vậy cho thấy, sản phẩm<br /> bromelain thương mại có hàm lượng protein thí nghiệm có độ tinh sạch cao hơn so với sản<br /> cao hơn nhưng hoạt tính đặc hiệu thấp hơn sản phẩm thương mại.<br /> Bảng 6. Hàm lượng đạm amin trong dịch thủy phân phụ phẩm cá tra khi thủy phân bằng hai chế phẩm<br /> bromelain<br /> Loại bột bromelain Đạm amin (g/l)*<br /> Bromelain sản phẩm 2,24a<br /> Bromelain thương mại (Sigma-Aldrich) 2,01b<br /> <br /> Không bổ sung enzyme 0,64c<br /> <br /> Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa<br /> thống kê ở mức ý nghĩa 5%.<br /> <br /> Từ Bảng 6 nhận thấy với cùng loại cơ chất là sấy ở điều kiện không khí đối lưu ở nhiệt độ 45<br /> phụ phẩm cá tra, cùng một nồng độ enzyme thì oC - 55 oC khoảng 4 giờ. Chế phẩm bromelain<br /> <br /> khả năng thủy phân của sản phẩm bromelain thí chồi có khả năng thủy phân protein trong phụ<br /> nghiệm cao hơn so với sản phẩm bromelain phẩm cá tra. Trong tương lai cần nghiên cứu<br /> thương mại. Hàm lượng đạm amin sinh ra khi thêm việc ứng dụng sản phẩm này trong các<br /> thủy phân bằng sản phẩm bromelain thí nghiệm lĩnh vực khác nhau như thực phẩm chức năng<br /> là 2,24 g/l so với bromelain thương mại là 2,01 (trợ tiêu hóa cho người già và trẻ con), mỹ<br /> g/l. So với mẫu không sử dụng enzyme thì hàm phẩm (kem tẩy tế bào chết), lên men bia (chống<br /> lượng đạm amin cao hơn 3,5 lần khi dùng cặn lắng), chế biến thịt và thủy hải sản (làm<br /> bromelain thí nghiệm và cao hơn 3,1 lần khi mềm thịt), hay lên men nước mắm ngắn ngày…<br /> dùng chế phẩm thương mại. TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive<br /> method quantification of protein utilizing<br /> Đề tài bước đầu đã xây dựng được quy trình thu<br /> the principle of protein dye biding. Anal.<br /> nhận bột enzyme bromelain thô từ chồi ngọn<br /> Biochem 72, 248 - 254.<br /> dứa. Enzyme bromelain thô có thể được trích ly<br /> từ chồi ngọn dứa đơn giản chỉ bằng nước cất Dương Thị Hương Giang, Lê Thanh Hùng, Võ<br /> Văn Song Toàn, Sonia Beeckmans, Edilbert<br /> với tỉ lệ 30 ml nước trên 10 g chồi ngọn.<br /> Van Driessche & Trần Phước Đường.<br /> Acetone là dung môi thích hợp cho quá trình<br /> (2002). Đánh giá các phương pháp trích ly<br /> tủa bromelain chồi. Tủa bromelain chồi có thể<br /> <br /> <br /> <br /> 92<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93<br /> <br /> bromelin từ nước khóm thô. Tạp chí Khoa Melissa. (2005). Nghiên cứu quy trình tinh sạch<br /> học Trường Đại học Cần Thơ. enzyme bromelain trích ly từ thân và quả ở<br /> Dương Thị Hương Giang. (2005). Tinh sạch phạm vi pilot.<br /> bromelain quả từ phụ phẩm dứa bằng Mariela A. Bruno, M.F. Pardo, N.O. Caffini &<br /> phương pháp sắc ký gel mở rộng. Viện L.M.I. López. (2002). Purification of a New<br /> Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Endopeptidase Isolated from Fruits of<br /> học. Đại học Cần Thơ. Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae).<br /> Đinh Thị Tình. (2007). Xác định hoạt lực và Acta Farm. Bonaerense, 21, 51 - 56.<br /> tách sơ bộ enzyme bromelain từ phụ phẩm Nguyễn Bá Mùi. (2005). Nghiên cứu phụ phẩm<br /> dứa. Khóa luận tốt nghiệp Đại học. Trường dứa ủ chua làm thức ăn gia súc. (Luận án<br /> Đại học Nông nghiệp, Hà Nội. Tiến sĩ Nông nghiệp không xuất bản).<br /> Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà<br /> Phạm Thu Thủy & Nguyễn Thị Xuân Sâm. Nội, Việt Nam.<br /> (2005). Công nghệ enzyme. NXB Khoa học Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Lê Hà<br /> Kỹ thuật. Ny & Lê Trung Hiếu. (2013). Trích ly<br /> Kunitz M. (1974). Determination of proteolytic enzyme bromelain từ phụ phẩm dứa Cầu<br /> activity by the casein digestion method. Đúc (Hậu Giang). Tạp chí Khoa học Trường<br /> Journal of General Physiology, 30, 291. Đại học Cần Thơ, 28, 21 - 27.<br /> <br /> Lại Thị Ngọc Hà. (2009). Nghiên cứu tách và Nguyễn Phú Thọ & Dương Thị Hương Giang.<br /> tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ phẩm (2011). Nghiên cứu qui trình điều chế bột<br /> dứa. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2, 203 enzyme papain thô từ nhựa đu đủ. Tạp chí<br /> – 211. Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 17b,<br /> 158 - 166.<br /> Lopes, F.L.G., J.B.S. Júnior , R.R. de Souza,<br /> D.D. Ehrhardt, J.C.C Santana & E.B. Nguyễn Thị Thanh Trúc. (2010). Tinh sạch và<br /> Tambourgi. (2009). Concentration by khảo sát các nhân tố ảnh hưởng hoạt tính<br /> membrane separation processes of a enzyme bromelain trích ly từ thân khóm. Đề<br /> medicinal product obtained from pineapple tài Nghiên cứu Khoa học cấp Trường. Viện<br /> pulp. An international journal, 52, 457 - Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh<br /> 464. học. Đại học Cần Thơ.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 93<br />