Nghiên cứu tuyển chọn và nuôi cấy vi khuẩn tả (vibrio cholerae) sinh độc tố tả in vitro

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

99
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm tái hoạt hóa, tuyển chọn các chủng V. cholerae tăng sinh mạnh trong điều kiện nuôi cấy chọn lọc bằng môi trường đặc hiệu với VKT và kích thích vi khuẩn sinh độc tố trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường kích thích sinh độc tố.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tuyển chọn và nuôi cấy vi khuẩn tả (vibrio cholerae) sinh độc tố tả in vitro

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ NUÔI CẤY VI KHUẨN TẢ (VIBRIO CHOLERAE) SINH ĐỘC TỐ TẢ IN VITRO Đỗ Minh Trung*; Phạm Thế Tài*; Hoàng Đắc Thăng* Lê Thu Hồng**; Lê Thu Hà***; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Tả là bệnh nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn tả (VKT) Vibrio cholerae gây ra. Độc tố tả (ĐTT) (cholera toxin) là yếu tố độc lực chủ yếu của VKT, đồng thời là tác nhân chính gây bệnh tả. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy chỉ những chủng VKT sinh ĐTT mới liên quan tới các vụ dịch tả. Vì vậy, ĐTT là chỉ điểm quan trọng của các chủng vi khuẩn gây dịch tả. Tuy nhiên, VKT thường chỉ sinh ĐTT trong điều kiện in vivo, khi đã nhiễm và tăng sinh trong môi trường đường ruột của đối tượng bị nhiễm. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy thông thường, vi khuẩn này tăng sinh mà không tiết độc tố. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tái phân lập 10 chủng VKT từ các vụ dịch tiêu chảy cấp do tả trước đây; hoạt hóa, tăng sinh và lựa chọn được chủng VKT tăng sinh mạnh nhất. Chủng vi khuẩn này sinh ĐTT trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy có chứa pepton, cao men bia, NaCl và NaHCO3 qua khảo sát bằng kỹ thuật GM1-ELISA đặc hiệu với ĐTT. * Từ khóa: Vi khuẩn tả; Độc tố tả; Kỹ thuật GM1-ELISA. SELECTION AND BACTERIAL CULTURE OF VIBRIO CHOLERAE PRODUCING CHOLERA TOXIN IN VITRO SUMMARY Cholera is an intestinal infection caused by the bacterium Vibrio cholerae (V. cholerae). Cholera toxin (CT) secreted by V. cholerae is the causative agent of cholera and is a major agent involved in severe diarrheal diseases. Previous studies have found that only the strains of V. cholerae which secret CT are related to outbreaks of cholera. Therefore, ability of CT secretion is an important characteristic of V. cholerae strains that cause cholera outbreaks. However, V. cholerae only secrets CT in vivo conditions, when the bacteria have infected and developed inside intestinal tract of exposed persons. If the V. cholerae is in vitro cultured in normal medium, it increases the number without CT secretion. One of preventive methods to cholera is the usage of antibodies anti CT. * Học viện Quân y ** Bệnh viện 103 *** Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 16/9/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 8/11/2013 83 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 With the aim of collecting a large amount of CT used as sources of antigenic material to produce antibodies anti-CT, this study targeted to select suitable V. cholerae strain in Vietnam and specific culture medium enabling CT secretion in vitro. Ten strains of V. cholerae causing previous outbreaks in Vietnam in 2007 were used as candidates for selection. The strain with the strongest reproductive capacity in TCBS agar was chosen. The culture medium which used in this study contained peptone, yeast extract, NaCl, NaHCO3. CT released in culture medium was determined by GM1-ELISA technique. * Key words: Vibrio cholerae; Cholera toxin; GM1-ELISA technique. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tả gây ra bởi VKT (Vibrio cholerae). VKT là một loại vi khuẩn Gram âm sinh ĐTT (cholerae toxin). ĐTT tác động lên tế bào biểu mô niêm mạc của ruột, gây tiêu chảy nặng kèm theo rối loạn nước, điện giải, là dấu hiệu đặc trưng của bệnh tả. Trường hợp bệnh nặng có thể gây tử vong trong thời gian ngắn. Bệnh tả có khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rộng, ảnh hưởng nặng nề đến sức khoẻ, kinh tế xã hội và an ninh của nhiều quốc gia. Tuy nhiên, VKT thường chỉ sinh ĐTT trong điều kiện in vivo, khi đã nhiễm vào tăng sinh trong môi trường đường ruột của đối tượng bị nhiễm. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy thông thường, vi khuẩn này chỉ tăng sinh mà không tiết độc tố. ĐTT từ V. cholerae có ý nghĩa khi được sử dụng làm nguyên liệu chế tạo antidote để phòng chống khủng bố, trong trường hợp này, sử dụng độc tố tả như một loại vũ khí sinh học. Muốn thu được độc tố cần phải phân lập, nuôi cấy và tuyển chọn được các chủng V. cholerae sinh độc tố để sử dụng ĐTT làm nguyên liệu chế tạo antidote. Hơn nữa, tách độc tố từ những chủng lưu hành tại Việt Nam, tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ sẽ tốt hơn và chủ động trong nghiên cứu và sản xuất antidote. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nghiên cứu này được tiến hành nhằm: Tái hoạt hóa, tuyển chọn các chủng V. cholerae tăng sinh mạnh trong điều kiện nuôi cấy chọn lọc bằng môi trường đặc hiệu với VKT và kích thích vi khuẩn sinh độc tố trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường kích thích sinh độc tố. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu. * Đối tượng nghiên cứu: 10 chủng V. cholerae được phân lập trong các vụ dịch tiêu chảy cấp do tả năm 2007 và ký hiệu lần lượt là V1, V2, V3, V4, V5, V10, V25, V35, V47, V50. Đựng các chủng sau phân lập trong ống nghiệm cryovial và lưu giữ ở -80°C tại Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện 103. 84 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 * Hóa chất, thiết bị nghiên cứu: môi trường TCBS agar, thạch kiềm (Merck) để nuôi cấy, phân lập và tuyển chọn V. cholerae; hóa chất OPD, BSA, GM1, kháng thể đơn clôn kháng ĐTT, kháng thể IgG gắn enzym HRP (Sigma); ĐTT chuẩn (Enzo); pepton, cao men bia, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, NaOH, HCl, H2CO3, (NH)2SO4 (Merck); gram kit, PBS, thuốc thử catalase, thuốc thử oxidase, Tween (BioRad). Plate ELISA và các hóa vật tư tiêu hao dùng cho nuôi cấy V. cholerae, phản ứng ELISA, phản ứng sinh hóa khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích và được cung cấp từ Merck, Sigma và các hãng có uy tín khác. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Hoạt hóa, nuôi cấy tăng sinh và tuyển chọn V. cholerae: Sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh -80ºC, các ống nghiệm đựng VKT được giã đông bằng cách đặt ở tủ ấm 370C trong 2 giờ trước khi tiến hành nuôi cấy tăng sinh. Nuôi cấy tăng sinh: nuôi cấy mỗi chủng VKT trên hai đĩa thạch, bao gồm một đĩa thạch kiềm và một đĩa thạch TCBS. Tuyển chọn chủng VKT: chủng VKT được tuyển chọn phải đảm bảo cho kết quả phản ứng sinh hóa phù hợp với đặc điểm của chủng V. cholera. Đồng thời, chủng VKT đó có khả năng tăng sinh tốt trên môi trường thạch TCBS, là môi trường nuôi cấy đặc hiệu của V. cholera. Hình thái của các khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy thạch kiềm và TCBS phải phù hợp với đặc điểm hình thái của chủng V. cholera. Các phản ứng sinh hóa bao gồm: oxidase, gluco, gas, lacto, saccaroza, lysine, ornithine, 1% NaCl và nhuộm gram. Các khuẩn lạc phù hợp về tính chất sinh hóa học được xác định bằng phản ứng ngưng kết với kháng thể tả O1 và Ogawa. * Nuôi cấy kích thích V. cholerae sinh ĐTT in vitro: Sau khi tuyển chọn được chủng V. cholerae tăng sinh mạnh trong môi trường thạch TCBS, chủng VKT đó được cấy chuyển sang môi trường kích thích sinh ĐTT. Thành phần của môi trường bao gồm pepton, cao men bia, NaHCO3 có bổ sung NaCl. Môi trường pepton kiềm có pH từ 8 - 9, là môi trường tăng sinh tốt cho V. cholerae. Nồng độ từng thành phần đã được tối ưu hóa để khả năng sinh ĐTT cao nhất. Đưa chủng VKT tuyển chọn vào bình chứa 500 ml pepton kiềm và để 35ºC trong thời gian 24 giờ (1 giờ lắc bình nuôi cấy 1 lần để kích thích vi khuẩn mọc nhanh). Sản phẩm thu hoạch là dịch lên men của VKT. Dịch được ly tâm 86 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 4.500 vòng/phút x 25 phút loại bỏ cặn (bất hoạt bằng phương pháp cách thủy 80ºC/20 phút), thu dịch nổi, phần dịch nổi là phần có chứa ĐTT. Kiểm tra sự có mặt của ĐTT trong dịch nổi bằng kỹ thuật GM1-ELISA. * Phản ứng GM1-ELISA phát hiện ĐTT: Phản ứng GM1-ELISA được xây dựng theo nguyên lý kỹ thuật ELISA kiểu sandwich, sử dụng ganglioside GM1 là phối tử đặc hiệu với ĐTT gắn lên pha rắn làm phân tử bắt giữ ĐTT. Kháng thể đơn clôn kháng ĐTT được dùng để phát hiện sự có mặt của ĐTT đã bị GM1 bắt giữ. Các bước cụ thể như sau: gắn GM1 vào các giếng của đĩa ELISA, để qua đêm rồi rửa với PBS-T, block các giếng bằng BSA 1%, thời gian 30 phút, sau đó rửa bằng PBS-T. ĐTT chuẩn (chứng dương, độ tinh sạch > 95%); dịch nuôi cấy cần xác định ĐTT và môi trường nuôi cấy không có V. cholera (chứng âm) được cho vào các giếng đã gắn GM1 để cho ĐTT gắn với GM1 trong giếng, rồi rửa bằng PBS-T. Cho kháng thể kháng ĐTT vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa các giếng bằng PBS-T, cho kháng thể thứ hai gắn enzym HRP vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa lại bằng PBS-T. Cho cơ chất vào các giếng phản ứng với nồng độ 0,5 mg/ml, thời gian 10 phút. Xác định kết quả thông qua mật độ quang học của giếng đo bằng máy đọc DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ) ở bước sóng 450 nm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Tái phân lập, hoạt hóa và tuyển chọn V. cholerae. Từ 10 chủng V. cholerae được lưu giữ ở -80°C, chúng tôi tiến hành cấy hoạt hóa lại và kiểm tra tính chất sinh vật hóa học để xác định lại V. cholerae. Kết quả thu được 10 chủng V. cholerae trên môi trường phân lập khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng. Trên môi trường thạch kiềm: khuẩn lạc tròn trong, long lanh như giọt sương, đường kính 1 2 mm; trên môi trường thạch TCBS: khuẩn lạc có màu vàng, lồi bóng, đường kính 2 - 3 mm. Mặc dù V. cholerae có thể phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau. Tuy nhiên, môi trường TCBS được sử dụng rộng rãi vì có tính chọn lọc tốt để phân lập và tuyển chọn V. cholerae. V. cholerae thuộc họ Vibrionaceae cùng với Aeromonas, Phobacterium và Plesiomonas. Các giống này có thể phân biệt được bằng phản ứng sinh hóa. 87 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 1: Kiểm tra V. cholerae bằng các test thử phản ứng sinh hóa. TEST KIA H2S GAS OXIDASE SACAROSE LYSINE ORMITHINE 1% NaCl CHỦNG V01 V02 V03 V04 V05 V10 V25 V35 V47 V50 Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) Glu (+) Lacto (+) - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + - - + + + + + Cũng giống như các phẩy khuẩn khác, V. cholerae là một vi khuẩn Gram âm, hiếu kỵ khí tùy tiện, không sinh nha bào, có khả năng lên men các loại carbonhydrat và chuyển hóa bằng cách oxy hóa. Kết quả các phản ứng sinh hóa bao gồm: oxidase (+), gluco (+), gas (-), lacto (+) chậm, saccaroza (+), lysine (+), ornithine (+), 1% NaCl (+). Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh hóa của V. cholerae. Sau khi lựa chọn 10 chủng VKT, chúng tôi tiến hành pha các chủng VKT trong nước muối sinh lý 0,9% vô trùng để tạo thành hỗn dịch 108 vi khuẩn⁄ml, cấy 0,1 ml hỗn dịch 108 vi khuẩn⁄ml của mỗi chủng được ria cấy đều trên bề mặt đĩa thạch, ủ 35ºC⁄18 giờ. Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch Muller Hinton, từ đó làm cơ sở lựa chọn chủng có khả năng phát triển tốt nhất làm chủng tăng sinh độc tố tả. 88