Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu vi nấm kháng tuyến trùng trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_______________________

Chu Thanh Bình

NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_______________________

Chu Thanh Bình

NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9420101.07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ

2. TS. HỒ TUYÊN

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS Bùi Thị Việt Hà và TS. Hồ Tuyên. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận

án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học, phần còn lại

chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội ngày 31 tháng 8 năm 2020

Tác giả luận án

Chu Thanh Bình

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành

và sâu sắc tới cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi

sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, TS.

Hồ Tuyên, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, là những người

thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ tôi tích cực nghiên cứu và tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng Genomic, đặc biệt là TS.

Trần Văn Tuấn, Trưởng bộ môn Vi sinh vật học, Trưởng phòng Genomic, Phòng

thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời

gian nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy, truyền đạt những kiến

thức mới và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành kết quả nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Phương Nhuệ, TS. Đỗ Thị Tuyên

phòng Công nghệ lên men, Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học,

Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận án.

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình

học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi mong muốn được gửi lời cảm ơn đến Ban Tổng giám đốc, Trung tâm Nhiệt

đới Việt – Nga, Bộ Quốc phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lòng biết ơn sâu sắc đến người thân trong gia đình,

bạn bè đã luôn luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và

nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 31 tháng 8 năm 2020

Tác giả luận án

Chu Thanh Bình

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

5-FOA 5 fluoroorotic acid

ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated tranformation

(chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens)

APS Ammonium Persulphate

AS Acetosyringone

BCAs Các tác nhân kiểm soát sinh học (Biocontrol Agents)

Bp Base pair

CD Czapeck Dox

CMA Corn Meat Agar

CYA Czapeck Yeast Autolysate

DNA Deoxyribonucleic acid

DNS 3, 5-Dinitrosalicylic acid

DsRed Red fluorecent protein

ĐC Đối chứng

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

GFP Green fluorecent protein

HLCP Hiệu lực chế phẩm

HLD Hiệu lực diệt

HQPH Hiệu quả phục hồi

IM Induction medium (môi trường cảm ứng)

ITS Internal Transcribed Spacer

KPH Không phát hiện

LB Luria-Bertani

MH Mô hình

MM Minimal medium (môi trường tối thiểu)

ORF Open Reading Frame (khung đọc mở)

PPN Plant-parasitic nematodes

P. lilaciuns Paecilomyces lilacinus

PCR Polymerase chain reaction

PDB Potato Dextrose Broth

PDA Potato Dextrose Agar

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TCA Tricloacetic acid

UV Ultra violet

TLC Tỷ lệ chết

VOC Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi

WT Wild type (chủng tự nhiên)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hệ thống phân loại nấm diệt tuyến trùng 10

Bảng 1.2. Các chế phẩm sinh học thương mại phòng trừ bệnh do tuyến trùng 31

Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách 43

Bảng 2.2. Thiết kế các biến bằng ma trận Plackett-Burman 52

Bảng 2.3. Đánh giá cấp độ biểu hiện bệnh 57

Bảng 2.4. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mô hình nhà lưới 59

Bảng 2.5. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mô hình đồng ruộng 60

Bảng 3.1. Khảo sát khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. 67

Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng P. lilacinus P1 72

Bảng 3.3. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase 81

Bảng 3.4. Đánh giá tính thực tế của mô hình 83

Bảng 3.5. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino axit 89

Bảng 3.6. Khả năng sống sót của chủng P1 trong dịch bảo quản 101

Bảng 3.7. Khả năng sống sót của chủng P1 trong chế phẩm theo thời gian 103

Bảng 3.8. Mật độ tuyến trùng còn sống (MĐTT) và Hiệu lực diệt (HLD) tuyến 104

trùng sau khi xử lý bằng Chế phẩm sinh học trong chậu trồng ở nhà lưới

Bảng 3.9. Tỷ lệ cây không phục hồi và năng suất của mô hình thử nghiệm 106

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hồ tiêu bị bệnh vàng lá và chết chậm 7

Hình 1.2. Sự tương tác giữa tuyến trùng, nấm và vi khuẩn 8

Hình 1.3. Hình thái của bẫy được tạo ra bởi nấm bẫy tuyến trùng 13

14 Hình 1.4. Vòng đời của nấm sợi Esteya vermicola

Hình 1.5. Sự biến đổi về hình thái của A. oligospora trên CMA và PDA 24

Hình 1.6. Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua A. tumefaciens 26

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 39

Hình 3.1. Hình thái, cấu trúc sinh bào tử của các chủng nấm sợi 61

Hình 3.2. Hoạt độ chitinase và protease của NV01, NV20 và P1 71

Hình 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp chitinase 75

Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn các bon đến khả năng sinh chitinase 77

Hình 3.5. Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ đến khả năng sinh chitinase 78

Hình 3.6. Ảnh hưởng của muối khoáng đến khả năng sinh chitinase 79

Hình 3.7. Bề mặt đáp ứng của từng cặp các yếu tố ảnh hưởng đến sinh chitinase 80

chủng P. lilacinus P1

Hình 3.8. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5-FOA của chủng P1 85

Hình 3.9. Kết quả chọn lọc thể đột biến bằng phương pháp chiếu UV 87

Hình 3.10. Nhân dòng đoạn gen ORFpyrG chủng P1 và thể đột biến 424 89

Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc chủng P1 và 424pyrG(-) ở các nồng độ 90

uracil/uridine khác nhau

Hình 3.12. Điều kiện được lựa chọn tối ưu cho quá trình chuyển gen 92

Hình 3.13. Quy trình chuyển gen bằng phương pháp ATMT của thể đột biến 94

424pyrG(-) sử dụng vectơ nhị thể pEX2A với marker pyrG.

Hình 3.14. Xác nhận thể chuyển gen biểu hiện huỳnh quang đỏ DsRed 95

Hình 3.15. Hoạt tính chitinase và protease của các thể chuyển gen 98

Hình 3.16. Tỷ lệ chết của tuyến trùng Hình 3.17. Các yếu tổ ảnh hưởng thu hồi sinh khối ướt của P. lilacinus P1 100

Hình 3.18. Sơ đồ sản xuất dịch thể chế phẩm sinh học 102

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chương 1 .................................................................................................................... 4

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................................... 4

1.1. BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp. TRÊN CÂY HỒ TIÊU ............................................................................................................................ 4

1.1.1. Bệnh gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne ................................................. 4

1.1.2. Phân bố của tuyến trùng Meloidogyne tại Tây Nguyên ........................ 4

1.1.3. Đặc điểm và cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp. .............. 5

Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne sp. ......................................................... 5

Cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp. ............................................. 6

1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG ................................................ 7

1.2.1. Vai trò của nấm diệt tuyến trùng trong kiểm soát sinh học .................... 8

1.2.2. Phân loại nấm diệt tuyến trùng ................................................................ 10

1.2.2.1. Nấm bẫy tuyến trùng ............................................................................. 12

1.2.2.3. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng .............................................................. 15

Giới thiệu về Paecilomyces sp. ......................................................................... 16

Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng .................................................................. 16

Protease từ nấm diệt tuyến trùng ................................................................... 20

1.2.2.4. Nấm sinh độc tố ..................................................................................... 20

1.2.3. Các giai đoạn diệt tuyến trùng của nấm .................................................. 21

1.3. CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG .............................. 24

1.3.1. Các phương pháp chuyển gen .................................................................. 24

1.3.2. Một số gen chỉ thị dùng cho chuyển gen ở nấm ...................................... 26

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chuyển gen .......................................... 27

1.3.4. Một số nghiên cứu cải biến di truyền đối với nấm diệt tuyến trùng ..... 28

1.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM ................................................................... 31

1.4.1. Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne ........... 31

1.4.2. Tình hình phòng trừ bệnh tuyến trùng cây hồ tiêu tại Việt Nam ......... 34

Chương 2 .................................................................................................................. 37

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 37

2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................... 37

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 37

2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 38

2.1.3. Thiết bị ........................................................................................................ 38

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 39

2.2.1. Phương pháp phân lập và quan sát hình thái ......................................... 39

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu enzym/protein ................................................ 41

2.2.3. Phương pháp điện di trên Gel polyacrylamid (SDS-PAGE) ................. 43

2.2.4. Tách chiết DNA hệ gen và phản ứng PCR .............................................. 44

2.2.5. Phản ứng nối ghép gen .............................................................................. 45

2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α ........................................... 46

2.2.7. Tách DNA plasmid .................................................................................... 46

2.2.8. Đánh giá khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5 – FOA của chủng P. lilacinus P1 ............................................................................................................ 46

2.2.9. Phương pháp thu bào tử và hệ sợi nấm P. lilacinus P1 .......................... 47

2.2.10. Phương pháp tạo chủng đột biến gen pyrG bằng UV sử dụng môi trường chọn lọc 5-fluoroorotic axit (5-FOA) từ chủng P. lilacinus P1 ........... 47

2.2.11. Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium tumefaciens ........................................................................................................... 48

2.2.11.1. Biến nạp vector pEX2A vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 .............. 48

2.2.11.2. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ở thể đột biến 424pyrG(-) .......................................................................................................... 49

2.2.11.3. Xác nhận biểu hiện gen DsRed của các thể chuyển gen ..................... 50

2.2.11.4. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease ngoại bào, khả năng diệt tuyến trùng của các thể chuyển gen. ........................................... 51

2.2.12. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase của P. lilacinus P1 ................................................................................ 51

2.2.12.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................................................. 51

2.2.12.2. Sàng lọc các yếu tố bằng ma trận Plakett – Burman .......................... 52

2.2.12.3. Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) .......................................................................................... 52

2.2.12.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 54

2.2.13. Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học ............................... 54

2.2.13.1. Phương pháp lấy mẫu đất và mẫu rễ .................................................. 54

2.2.13.2. Tách lọc và đếm số lượng tuyến trùng trong mẫu đất và mẫu rễ ....... 54

2.2.13.3. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng ................................................. 55

2.2.13.4. Phương pháp đếm tuyến trùng [3] ...................................................... 56

2.2.13.5. Phương pháp làm nhiễm nấm lên tuyến trùng theo Khan A. và cs., (2006)[94] ........................................................................................................... 56

2.2.13.6. Phương pháp tạo chế phẩm sinh học và đánh giá khả năng sống sót của chủng trong dịch bảo quản .......................................................................... 56

2.2.13.7. Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học phòng bệnh bởi tuyến trùng gây ra .............................................................................................. 56

2.2.13.8. Xác định hiệu lực của chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng trên đất trồng cây hồ tiêu trong nhà lưới......................................................................... 58

2.2.13.9. Xây dựng mô hình, quy trình sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh tuyến trùng quy mô 03 ha tại Đăk Lăk ...................................................... 60

Chương 3 .................................................................................................................. 61

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................. 61

3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp. .......................................................................................... 61

3.1.1. Phân lập, sàng lọc các chủng nấm sợi ...................................................... 61

3.1.2. Định danh các chủng nấm sợi P1, NV01, NV20 dựa trên trình tự ITS1/ITS4 ............................................................................................................. 69

3.1.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại bào của chủng NV01, P1 và NV20 .................................................................................... 71

3.1.4. Tinh sạch chitinase từ chủng P1 ............................................................... 72

3.1.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase từ P1 ....... 74

3.1.5.1 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên men...................................... 74

3.1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn các bon .............................................................. 76

3.1.5.3. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ ................................................................... 77

3.1.5.4. Phân tích ý nghĩa của mô hình với thí nghiệm ...................................... 80

3.1.5.5. Đánh giá tính thực tế của mô hình ........................................................ 83

3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN DI TRUYỀN CHỦNG Paecilomyces lilacinus P1 84

3.2.1. Đánh giá khả năng mẫn cảm với 5-FOA và một số kháng sinh của chủng P. lilacinus P1 ............................................................................................ 84

3.2.2. Tạo chủng nấm P. lilacinus đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uridine/uracil ........................................................................................................ 87

3.2.2.1. Gây đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uridine/uracil bằng phương pháp chiếu UV .................................................................................................... 87

3.2.2.2. Xác nhận thể đột biến 424 bằng giải trình tự vùng ORF gen PyrG ..... 88

3.2.3. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ưu vào 424 pyrG(-) ........................ 91

3.2.4. Xác nhận biểu hiện gen DsRed ở các thể chuyển gen ............................. 94

3.2.5. Sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease và hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao ................................................................. 97

3.3. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG ................................................................................. 100

3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và các loại môi trường quá trình sinh trưởng của chủng P1 ................................................... 100

3.3.2. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh cây hồ tiêu .......................................................................................... 101

3.3.3. Nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới của chế phẩm sinh học ..................................... 103

3.3.4. Đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng chế phẩm ............................................................................................................................. 105

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 107

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 108

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ............................ 109

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 110

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tuyến trùng ký sinh thực vật (Plant-parasitic nematodes - PPN) gây bệnh trên

hàng loạt các loại rau, cây nông nghiệp, cây công nghiệp. PPN gây thiệt hại trị giá

ước tính hơn 157 tỷ USD/năm trên toàn thế giới. Trong nhiều thập kỷ, việc phòng trừ

tuyến trùng phụ thuộc rất nhiều vào hóa chất bảo vệ thực vật như Furadan, Marshal,

Oncol, Nokaph, Vimoca với hiệu quả làm giảm mật độ tuyến trùng nhưng vườn cây

vẫn bị bệnh và phải áp dụng thuốc trong thời gian dài. Hơn nữa, sử dụng thuốc bảo

vệ thực vật thường dẫn tới khả năng kháng thuốc, mất cân bằng giữa hệ vi sinh vật

có lợi và vi sinh vật đất. Hơn nữa, một số thuốc bảo vệ thực vật hiện nay đã bị rút

khỏi danh mục được sử dụng vì độc tính của chúng đối với động vật và ảnh hưởng

đến sức khỏe con người. Hiệu quả của luân canh cây trồng bị hạn chế trong một số

loại cây trồng do phạm vi vật chủ rộng hoặc tỷ lệ sống lâu dài của hầu hết các PPN.

Sự đa dạng di truyền cao trong/giữa các quần thể tuyến trùng làm hạn chế hiệu quả

của các loại cây trồng kháng bệnh do tuyến trùng gây nên. Do đó, các loại cây công

nghiệp và rau màu trên toàn cầu vẫn đang bị đe dọa nặng nề từ PPN. Cùng với việc

phát triển các biện pháp phòng trừ sinh học, các vi sinh vật tiêu diệt tuyến trùng nói

chung và nấm sợi nói riêng được coi như một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để loại trừ

các loài tuyến trùng. Một số chi nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp các enzym và độc

tố nhằm ngăn cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne sp. Những chi nấm này được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học

diệt tuyến trùng, như chế phẩm sinh học Biocon có thành phần chính là nấm

Paecilomyces lilacinus, đây là loài có khả năng ký sinh, tiêu diệt tuyến trùng và trứng

của chúng.

Tại Việt Nam, theo quy hoạch lý thuyết, diện tích trồng cây hồ tiêu của

tỉnh Đăk Lăk đến năm 2020 đạt 15000 ha, tuy nhiên tháng 1 năm 2017 diện tích trồng

hồ tiêu đã tăng lên tới 38616 ha, tỉnh Gia Lai đã có trên 6155 ha hồ tiêu bị nhiễm

bệnh. Việc tăng nhanh diện tích trồng hồ tiêu cũng kèm theo số diện tích bị sâu, dịch

hại tăng nhanh. Theo Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Đăk Lăk, từ đầu năm 2016 đến

đầu năm 2017 có hơn 2776 ha trồng hồ tiêu bị sâu bệnh gây hại, chiếm 10% tổng diện

tích hồ tiêu toàn tỉnh: Trong đó, hơn 579 ha bị bệnh chết nhanh, 1113 ha bệnh chết

chậm, 1083 ha bị các loại sâu bệnh khác gây hại. Diện tích trồng hồ tiêu bị bệnh tập

trung tại các huyện Buôn Đôn (515 ha), Ea H’leo (183 ha), Ea Kar (hơn 156 ha),

Krông Năng (45,5 ha), thị xã Buôn Hồ (216 ha)… Để ngăn chặn dịch bệnh lây lan và

bùng phát, Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh đã hướng dẫn người dân thực hiện nhiều biện

pháp phòng trừ dịch bệnh như thường xuyên thăm vườn để nắm bắt tình hình sinh

trưởng của cây trồng, thực hiện bón phân hợp lý, quản lý sâu bệnh hại tổng hợp

(Integrated Pests Management – IPM).

Nhằm giải quyết nhu cầu cấp thiết tạo chế phẩm sinh học một mặt vừa thân

thiện với môi trường mặt khác lại tăng hiệu quả phòng trừ bệnh gây ra bởi tuyến trùng

từ chủng nấm sợi diệt tuyến trùng hại hồ tiêu, đề tài: “Nghiên cứu vi nấm kháng

tuyến trùng trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học” đã

được thực hiện với thời gian nghiên cứu từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 12 năm 2019.

2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

 Tuyển chọn được một số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến trùng

Meloidogyne sp. cao gây bệnh trên cây hồ tiêu Piper nigrum L. và tạo chế

phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm tăng năng suất cây hồ tiêu tối thiểu là 15%.

 Tạo được chủng đột biến và đánh giá hoạt lực diệt tuyến trùng của chủng đột

biến so với chủng tự nhiên.

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

* Tuyển chọn, thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. của các

chủng nấm phân lập từ đất trồng hồ tiêu tỉnh Đăk Lăk. Xác định hoạt tính chitinase,

protease của chủng nấm diệt tuyến trùng tiềm năng.

* Nghiên cứu tạo chủng vi nấm đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao bằng

phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

* Tạo chế phẩm sinh học và thử nghiệm ở quy mô nhà lưới và quy mô 3 ha tại

Đăk Lăk.

4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Ý nghĩa khoa học

Trong ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng phân lập được trên đất

trồng hồ tiêu, Paecilomyces lilacinus P1 (hay còn gọi là Purpureocillium lilacinum)

là chủng được quan tâm nghiên cứu bởi hoạt lực diệt tuyến trùng cao nhất.

Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với chủng tự

nhiên trong vòng 48 giờ. Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens sẽ mở ra những triển vọng về nghiên cứu vai trò, chức

năng của các gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng của chi Paecilomyces.

- Ý nghĩa thực tiễn

Chế phẩm sinh học được thử nghiệm trên quy mô 3 ha/mô hình tại tỉnh Đăk

Lăk đã có tác dụng điều hòa tăng năng suất lên 20% so với đối chứng là vườn tiêu

cấp độ cây hoàn toàn khỏe mạnh; 48% so với đối chứng là vườn tiêu nhiễm bệnh cấp

độ nặng nhất. Chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng sẽ góp phần bảo vệ môi trường và

phát triển bền vững ngành sản xuất hồ tiêu ở nước ta.

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

+) Tuyển chọn được 1 chủng vi nấm bản địa (P1) từ đất trồng hồ tiêu tỉnh Đăk

Lăk có hoạt lực diệt tuyến trùng cao nhất; Chế phẩm sinh học từ chủng P1 được thử

nghiệm ở quy mô 3 ha/mô hình cho năng suất tăng 20% đối với vườn hồ tiêu hoàn

toàn khỏe mạnh.

+) Đã xây dựng quy trình chuyển gen mới bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn

A. tumefaciens dựa trên cơ chế trợ dưỡng uridine/uracil đạt hiệu suất cao gấp 10 lần

so với nghiên cứu trước đây. Thể chuyển gen PE858 được sàng lọc từ thư viện các

thể chuyển gen có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với chủng tự nhiên.

Ngoài ra, đề tài mở ra những hướng nghiên cứu như điều tra vai trò chức năng của

một số gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng.

Chương 1

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp. TRÊN CÂY HỒ TIÊU

1.1.1. Bệnh gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne

Hầu hết tuyến trùng thuộc chi Meloidogyne là nhóm tuyến trùng ký sinh thực

vật quan trọng nhất đối với nền nông nghiệp trên toàn thế giới [52]. Trên cây hồ tiêu,

tuyến trùng Meloidogyne gây ra bệnh sần rễ, vàng lá, chết chậm. Ở các nước Đông

Nam Á như Malaysia, M. incognita và M. javanica được công bố là nguyên nhân

gây hai loại bệnh chính là bệnh chết chậm và bệnh vàng lá trên cây hồ tiêu. Các loài

này cũng đã được ghi nhận trên hồ tiêu ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia,

Brunei, Philipin, Braxil và Việt Nam [149]. Tuyến trùng Meloidogyne tấn công sẽ

làm cho bề mặt rễ cây hồ tiêu có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục và sau đó là

các vi sinh vật cơ hội gây bệnh xâm nhập. Tuy nhiên, khi nhổ bỏ những cây hồ tiêu

bị nhiễm bệnh thì trứng tuyến trùng Meloidogyne vẫn tồn tại trong đất. Đây là vấn đề

khó khăn vì khi trồng hồ tiêu sẽ lại mắc bệnh. Qua khảo sát các loài tuyến trùng này

có khả năng tồn tại trong đất không có cây chủ sau 1 năm loại bỏ cây hồ tiêu bị bệnh.

Điều đó chứng tỏ rằng ngoài phổ ký chủ rộng rãi Meloidogyne còn có khả năng tồn

tại trong đất rất lâu ngay cả trong điều kiện khắc nghiệt như mùa khô tại Tây Nguyên.

Do vậy, những vùng đất này thường bị bỏ hoang hoặc trồng những loại cây ngắn ngày

hoặc những cây có giá trị kinh tế thấp [170]. Khi trồng lại hồ tiêu, với mật độ lớn

tuyến trùng có thể gây chết cây, đồng thời sự có mặt của tuyến trùng làm giảm khả

năng kháng bệnh của cây do tác nhân khác gây nên [36].

1.1.2. Phân bố của tuyến trùng Meloidogyne tại Tây Nguyên

Tây Nguyên có hơn 2 triệu hecta đất bazan màu mỡ, tức là chiếm đến 60%

tổng diện tích đất bazan trên cả nước, đất bazan giàu chất dinh dưỡng, tầng phong

hoá sâu, phân bố tập trung kết hợp với khí hậu Tây Nguyên được chia làm hai mùa:

mùa mưa từ tháng 5 đến hết tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau.

Đây là yếu tố thuận lợi cho việc hình thành các vùng chuyên canh qui mô lớn. Chính

vì thế Tây Nguyên đứng đầu cả nước về diện tích cây công nghiệp với các cây trồng

xuất khẩu chủ lực là cà phê và hồ tiêu.

Năm 2000, Việt Nam công bố có 5 loài thuộc Meloidogyne và cả 5 loài này

đều phân bố ở Tây Nguyên. Các nghiên cứu sau này cho thấy sự hiện diện và gây hại

của Meloidogyne là rất lớn, chủ yếu tập trung cây hồ tiêu, cà phê [3].

Lê Đức Khánh và cs. (2013) ghi nhận trên hồ tiêu 3 loài tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne, trong đó 2 loài M. incognita, Meloidogyne sp. ghi nhận tại Gia Lai, Đăk

Lăk, Đăk Nông và 1 loài M. javanica tại tỉnh Đăk Lăk với tần suất xuất hiện

Meloidogyne trong đất là 92,5% và 62,5% trong rễ [4].

Trịnh Thu Thủy (2010) phân tích 240 mẫu thu ở 36 vườn hồ tiêu tại 3 tỉnh Đắk

Lắk, Gia Lai, Kon Tum ghi nhận 97,1% mẫu hồ tiêu bị nhiễm M. incognita, trong đó

tỷ lệ bị nhiễm M. incognita cao nhất là ở Gia Lai [166].

Như vậy, tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu khu vực Tây Nguyên chủ yếu thuộc

chi Meloidogyne và dưới đây tập trung tổng quan về đặc điểm, cơ chế gây bệnh đồng

thời cũng như nấm sợi diệt tuyến trùng chi Meloidogyne. Theo thống kê của Cục Bảo

vệ Thực vật/Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tính đến tháng 10 năm 2016,

cây hồ tiêu bị bệnh với diện tích lên đến hàng ngàn ha tập trung ở một số địa phương

như Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk. Theo báo cáo của 3 tỉnh trọng điểm trồng cây hồ

tiêu của Tây Nguyên là Đăk Lăk, Gia Lai và Đăk Nông, hàng năm, mỗi tỉnh đều có

vài ngàn ha hồ tiêu bị nhiễm bệnh vàng lá, tuyến trùng … [1].

1.1.3. Đặc điểm và cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp.

Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne sp.

Tuyến trùng Meloidogyne sp. là tuyến trùng gây bệnh sần rễ và được coi là nhóm

tuyến trùng gây hại nhiều nhất với 3 nghìn loài thực vật trên thế giới bao gồm các cây

trồng quan trọng như đậu đỗ, ngũ cốc, cây ăn quả và nhiều loại cây công nghiệp khác

[153]. Các công bố cho thấy có khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc Meloidogyne; trong

đó có bốn loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M.

javanica và M. hapla. Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các nước nông

nghiệp trên thế giới. Tuyến trùng Meloidogyne sp. thuộc nhóm động vật không xương

sống, có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến

trùng này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các

nhóm sinh thái khác như: phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để tiêm vào mô

thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước của trứng lớn so với kích thước cơ thể,

đời sống của chúng bắt buộc lệ thuộc vào cơ thể thực vật, trong đó phần kim chích là

phần quan trọng nhất của tuyến trùng.

Tuyến trùng tập trung nhiều nhất ở vùng rễ. Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng

sẽ di chuyển và cư trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ,

làm phân hóa tế bào đỉnh sinh trưởng. Các nốt sần rễ thường được tạo thành trong

vòng 1-2 ngày sau khi bị tuyến trùng xâm nhập. Vị trí phân loại của giống

Meloidogyne hiện tại theo hệ thống Karsen và cs., (2013) [89] như sau:

Ngành: Nematoda Potts, 1932

Lớp: Chromadorea Inglis, 1983

Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942

Bộ: Rhabditida Chitwood, 1933

Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949

Họ: Meloidogynidae Skarbilovich, 1959

Phân họ: Meloidogyninae Skarbilovich, 1959

Giống: Meloidogyne Göldi, 1887

Cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp.

Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát triển:

trứng, ấu trùng tuổi 1(J1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm - J2), ấu trùng tuổi 3,

4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực. Trứng sau khi thụ tinh sẽ

hình thành giai đoạn đầu tiên của ấu trùng J1 nằm trong trứng. Khi đạt điều kiện thuận

lợi trứng chứa J1 sẽ nở ra thành ấu trùng tuổi 2 (J2). Sau khi xâm nhập vào trong rễ,

tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ, tách dọc tế bào và định vị tại vùng mô

phân sinh của vỏ rễ bắt đầu quá trình dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, tuyến

trùng cố định phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm thay đổi

quá trình sinh lý sinh hóa của tế bào rễ cây chủ và hình thành các điểm dinh dưỡng

cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào đa nhân) được tạo thành

trong vùng nhu mô hoặc hoặc mô libe. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các

mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng bị phình to ra và tạo thành các nốt

sần rễ (gall hoặc root-knot) [22]. Những cây hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng thường mắc

hai bệnh chính là vàng lá và chết chậm.

Chiều dài vòng đời tuyến trùng phụ thuộc nhiều yếu tố, quan trọng nhất là nhiệt

độ môi trường và loại đất. Ở nhiệt độ 27 ºC, một chu kỳ của tuyến trùng Meloidogyne

từ 21-25 ngày, trong khi tại nhiệt độ 19 ºC cần ít nhất là 29 ngày để hoàn thành chu

kỳ sống [22].

Hình 1.1. Hồ tiêu bị bệnh vàng lá và chết chậm. A. Vàng lá B. Chết chậm

(Nguồn: Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam)

1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG

Nấm diệt tuyến trùng là loại vi sinh vật có thể bắt, tiêu diệt và tiêu hóa tuyến

trùng. Các nhà khoa học đã tìm ra hơn 200 loài nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng

[138]. Những chi nấm này có khả năng diệt tuyến trùng ở tất cả các giai đoạn: trưởng

thành, ấu trùng và trứng, đồng thời sử dụng tuyến trùng là nguồn dinh dưỡng. Một số

loại nấm diệt tuyến trùng có khả năng hình thành bẫy như Arthrobotrys, Dactylaria,

một số vừa có khả năng ký sinh trứng tuyến trùng và có cả khả năng bẫy như

Nematoctonus, một số chi nấm khác ký sinh trứng của tuyến trùng như Drechmeria,

Hirsutella, Haptoglossa, Catenaria, Paecilomyces [138]. Hình 1.2 khái quát sự tương

tác giữa nấm sợi diệt tuyến trùng và tuyến trùng, các phương thức thu hút và diệt

tuyến trùng. Khi cảm nhận được tuyến trùng, nấm diệt tuyến trùng có thể phát triển

các thiết bị bẫy khác nhau để bắt tuyến trùng. Nấm có thể trực tiếp lây nhiễm tuyến

trùng bằng cách sử dụng bào tử dính. Ngoài ra, tuyến trùng cũng có phương thức

chống lại nấm diệt tuyến trùng.

Chú thích: Nấm và vi khuẩn được coi là tác nhân gây bệnh cho tuyến trùng. SMP - sản phẩm

trao đổi chất thứ cấp; UPR, đáp ứng protein; AMP - peptide kháng khuẩn [110].

Hình 1.2. Sự tương tác giữa tuyến trùng, nấm và vi khuẩn

1.2.1. Vai trò của nấm diệt tuyến trùng trong kiểm soát sinh học

Theo Cook và cs., (1993) kiểm soát sinh học là việc con người sử dụng các vi

sinh vật đối kháng không gây bệnh để ức chế mầm gây bệnh theo cách thân thiện với

môi trường [41]. Theo Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Hoa Kỳ, kiểm soát sinh học

được định nghĩa là việc sử dụng các sinh vật biến đổi theo chọn lọc tự nhiên hoặc

biến đổi gen hoặc các sản phẩm biến đổi gen của chúng để làm giảm tác hại của mầm

bệnh [97].

Vai trò quan trọng của nấm diệt tuyến trùng là khả năng sử dụng chúng để loại

trừ tuyến trùng ký sinh gây bệnh thực vật. Việc sử dụng nấm diệt tuyến trùng mang

lại những ưu điểm là thân thiện với môi trường và có ý nghĩa về kinh tế. Hơn nữa,

bên cạnh việc ngăn ngừa bệnh cho cây, một số nấm này còn thúc đẩy sự phát triển

của cây. Chúng cũng tăng cường khả năng chịu stress, hỗ trợ hấp thu chất dinh dưỡng

và tham gia vào cơ chế kháng bệnh cho cây. Tùy thuộc vào cơ chế và tác dụng của

nấm diệt tuyến trùng, các nấm này được ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học,

chế phẩm nhằm kích thích tăng trưởng cho cây hoặc thuốc trừ sâu sinh học. Theo

nghiên cứu của Wu và cs., (2015), thị trường toàn cầu về thuốc trừ sâu sinh học sẽ

tăng lên tới 83,7 tỷ USD vào năm 2019 [188].

Có hai phương pháp có thể sử dụng để kiểm soát sinh học đối với tuyến trùng:

(i) sử dụng chế phẩm sinh học nhằm bổ sung một lượng lớn nấm diệt tuyến trùng vào

đất, (ii) kích thích hoạt động của các loại nấm diệt tuyến trùng hiện có bằng cách sử

dụng các sửa đổi di truyền khác nhau [138]. Các chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng

thường được tạo ra bởi một số chi nấm với các phương thức diệt khác nhau như (1)

nấm bẫy tuyến trùng (Arthrobotrys hoặc Monacrosporium); (2) nấm nội ký sinh, như

Hirsutella rhossiliensis và Dactylaria coniospora; (3) nấm ký sinh trứng tuyến trùng

như Ponchonia chlamydosporia và Paecilomyces lilacinus [138].

Một số nghiên cứu cho thấy triển vọng của các chủng vi sinh vật diệt tuyến

trùng được thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho hiệu suất cao hơn khi ứng dụng

ngoài đồng ruộng. Các yếu tố có khả năng góp phần vào sự thành công cũng như hạn

chế trong lĩnh vực này hầu hết chúng đều liên quan đến sự tương tác phức tạp giữa

các loại cây trồng, tuyến trùng gây bệnh, vi sinh vật diệt tuyến trùng và nhiều yếu tố

môi trường phi sinh học. Hiện tại, các nghiên cứu về sự tương tác giữa quần xã sinh

vật, các nghiên cứu ở mức độ phân tử giữa các loài thực vật, tuyến trùng, vi sinh vật

tiêu diệt tuyến trùng và nhân tố môi trường vẫn đang được các nhà khoa học quan

tâm.

1.2.2. Phân loại nấm diệt tuyến trùng

Các nhà khoa học đã phân loại nhóm nấm diệt tuyến trùng dựa trên kiểu tấn

công con mồi và do đó chia thành các nhóm: (1) nhóm hình thành bẫy tuyến trùng

(hay còn gọi là nấm săn mồi), (2) nội ký sinh, (3) nấm sản xuất độc tố, (4) nhóm sử

dụng các phương thức tiêu diệt khác [45].

Nhiều nghiên cứu đang tiếp tục tiến hành nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế tác

dụng của một số loại nấm và phát hiện ra những loài nấm mới có khả năng diệt tuyến

trùng. Đối với những chi nấm hệ sợi có khả năng biến đổi tạo thành bẫy, quá trình

diệt tuyến trùng sử dụng đồng thời cơ chế cơ học kết hợp với các enzym tiêu hóa

tuyến trùng. Một số nấm có khả năng tạo ra các bẫy khác nhau như sợi nấm hình

thành không gian ba chiều, mạng dính ba chiều nhằm đánh lừa tuyến trùng và tiêu

diệt chúng. Theo các nghiên cứu của Li và cs., (2015), dựa trên phương thức xâm

nhập và tiêu diệt tuyến trùng, nấm được chia ra bốn nhóm chính được trình bày ở

Bảng 1.1 [107].

(dựa trên phương thức xâm nhập và tiêu diệt) [107]

Bảng 1.1. Hệ thống phân loại nấm diệt tuyến trùng

Nấm sợi Chi Loài điển hình Nhóm nấm

Arthrobotrys/ Orbilia Bẫy tuyến trùng PT tiêu diệt Mạng dính

A. oligospora, A. conoides, A. musiformis, A. superba D. haptotyla

Dactylellina/ Orbilia Bẫy tuyến trùng

Nấm sợi/Nấm túi Nội ký sinh

Harposporium/ Podocrella

Harposporium anguillulae, Harposporium cerberi

tử Drechmeria Drechmeria coniospora Nội ký sinh

Mấu dính/vòn g dính Xâm nhập vào bằng bào tử Bào dính

Haptocillium balanoides tử Nội ký sinh

Haptocillium/ Cordyceps Hirsutella tử Nội ký sinh

Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis Pochonia chlamydosporia

Paecilomyces lilacinus

Pochonia/ Metacordyceps Paecilomyces/ Cordyceps Lecanicillium/ Cordyceps Trichoderma Bào dính Bào dính Giác bám Giác bám Giác bám

Ký sinh trứng Ký sinh trứng Ký sinh trứng Sợi nấm ký sinh

Acremonium Lecanicillium psalliotae, Lecanicillium lecanii Trichoderma harzianum Trichoderma pseudokoningii Acremonium spp.

Neotyphodium Neotyphodium spp.

Fusarium Fusarium oxysporum

Penicillium Penicillium oxalicum

tử

Nematoctonus/ Hohenbuehelia Bào dính Nấm nội ký sinh Nấm nội ký sinh Nấm nội ký sinh Nấm nội ký sinh Nấm nội ký sinh

Pleurotus Nematoctonus concurrens, Nematoctonus haptocladus Pleurotus ostreatus

Nấm sợi/Nấm đảm Coprinus Coprinus comatus

Stropharia Nấm sinh độc tố Nấm sinh độc tố

Glomus Stropharia rugosoannulata Giọt độc tố Giọt, cấu trúc gai Cuống gai

Catenaria Nấm Mycorrhizal Nội ký sinh

Haptoglossa Catenaria anguillulae, Catenaria auxiliaris Haptoglossa heterospora Nội ký sinh

Động bào tử Thâm nhập

Nội ký sinh

Động bào tử

Nấm/ Blastocladi omycota

Myzocytiopsis Myzocytiopsis glutinospora, Myzocytiopsis vermicola, Myzocytiopsis enticularis, Myzocytiopsis humicola

Nematophthora Nematophthora gynophila

Stylopage Stylopage hadra sợi Ký sinh trứng

Nấm/ Tiếp hợp

Cystopage Cystopage cladospora sợi

Động bào tử Hệ dính Hệ dính

Nhằm tìm hiểu rõ hơn về cơ chế diệt tuyến trùng của nấm sợi, các nhà khoa

học đã có những nghiên cứu dựa trên một số chi nấm với phương thức điển hình và

được trình bày tóm tắt dưới đây.

1.2.2.1. Nấm bẫy tuyến trùng

Hầu hết nấm bẫy tuyến trùng được công bố đều thuộc ngành Ascomycota

[131]. Những nấm sợi này có thể sống hoại sinh trong đất. Tuy nhiên, với sự có mặt

của tuyến trùng, những loài nấm này trở thành kẻ săn mồi thông qua việc hình thành

các bẫy có thể bao gồm các vòng, núm dính, mạng dính, cột dính (Hình 1.3) [107,

202]. Cấu tạo bẫy tuyến trùng khác nhau tùy thuộc vào loài hoặc thậm chí dưới loài

cũng như chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường bao gồm môi trường sinh học và

phi sinh học. Điều quan trọng là nấm sợi không chỉ tạo thành các cấu trúc bẫy để bắt

tuyến trùng mà tuyến trùng còn là nguồn thức ăn của nấm sau khi chúng bị nấm bắt

giữ.

Như vậy, nấm tiêu diệt tuyến trùng gồm 2 bước chủ yếu như sau (1) nấm sử dụng các

phương thức bắt tuyến trùng khác nhau (bẫy, độc tố …) để tiêu diệt tuyến trùng (2)

tuyến trùng bị bắt và chúng là nguồn dinh dưỡng cho nấm [138]. Đại diện của nhóm

nấm là chi Arthrobotrys (mạng ba chiều dính), Dactylellina (núm dính và, hoặc vòng

dính), Drechslerella (vòng thắt) và Gamsylella (nhánh dính) [131].

dính. (c, d) Núm dính; (e, f) Vòng giới hạn; (g, h) Núm dính và vòng không giới hạn; (i)

Mạng dính; Tất cả các thanh bar là 10 μm [107].

Hình 1.3. Hình thái của bẫy được tạo ra bởi nấm bẫy tuyến trùng. (a, b) Sợi nấm

1.2.2.2. Nấm ký sinh tuyến trùng

Hầu hết các loại nấm này là ký sinh bắt buộc và hoại sinh kém trong đất, nhưng

thường có phạm vi ký sinh tuyến trùng rộng. Những nấm này sống toàn bộ vòng đời

bên trong tuyến trùng. Chính vì khả năng hoại sinh hạn chế của chúng trong đất làm

cho nấm ký sinh được sử dụng tương đối hẹp trong các ứng dụng để sản xuất chế

phẩm sinh học diệt tuyến trùng [117].

(a) sợi nấm và bào tử hình lưỡi liềm; (b) tuyến trùng được thu hút và tiếp nhận bào tử hình

liềm; (c) hấp thụ dinh dưỡng từ xác chết tuyến trùng và tạo ra các bào tử mới; (d) sự xuất

hiện của sợi nấm nảy mầm từ tuyến trùng; (e), nảy mầm và sinh trưởng hàng loạt của sợi

nấm và bào tử trên con tuyến trùng chết; (f), thu hút và lây nhiễm tuyến trùng theo chu trình.

Toàn bộ quá trình nhiễm vào tuyến trùng khoảng 48 h. Thanh bar, 50 µm; phần (a) bar: 5

µm.

Hình 1.4. Vòng đời của nấm sợi Esteya vermicola [184]

Trong số các loại nấm ký sinh, Drechmeria coniospora được nghiên cứu nhiều

nhất. Người ta đã cho rằng D. coniospora có thể tạo ra một số lượng lớn bào tử dính

(có đến 10000 bào tử dính/tuyến trùng) để lây nhiễm. Mỗi bào tử trưởng thành có thể

tạo thành một chồi dính ở một đầu để bám vào lớp biểu bì tuyến trùng hoặc các cấu

trúc cảm giác ở vùng đầu và vùng cuối cùng. Sau khi bào tử được kết dính vào tuyến

trùng, sợi nấm được sinh trưởng bên trong tuyến trùng. Các sợi nấm sẽ tiêu hóa tuyến

trùng, thông thường trong vòng ba ngày, tại đó các sợi nấm mới được hình thành và

nhô ra từ xác chết tuyến trùng [131]. Vòng đời của nấm Esteya vermicola được miêu

tả ở Hình 1.4.

1.2.2.3. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng

Nấm ký sinh trứng tuyến trùng sử dụng động bào tử, giác bám, hoặc bào tử

được đưa vào bằng đường miệng tuyến trùng. Bào tử nảy mầm xâm nhập nhanh chóng

vào tuyến trùng bằng cách hình thành cấu trúc sợi nấm [117]. Khi nấm xâm nhập vào

tuyến trùng, quá trình sinh trưởng của nấm sẽ xảy ra trong tuyến trùng. Nấm nội ký

sinh như Ophiocordy cipitaceae nảy mầm trong đường tiêu hóa của tuyến trùng

Harposporium sp. sinh trưởng và tiêu diệt chúng [55].

Các loại nấm ký sinh trứng tuyến trùng thường bắt gặp trong các giai đoạn

không di động của tuyến trùng. Một số nấm ký sinh trứng chỉ sử dụng giác bám, một

loại giác bám chuyên biệt thâm nhập hoặc sử dụng các nhánh sợi nấm để lây nhiễm

vỏ trứng tuyến trùng [117]. Các loài đại diện của nấm ký sinh trứng tuyến trùng bao

gồm Pochonia chlamydosporia, Paecilomyces lilacinus (Purpureocillium lilacinum),

Clonostachys rosea và Lecanicillium psalliotae. P. lilacinus thường phân bố ở các

khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, trong khi đó, Lecanicillium chủ yếu được tìm thấy

ở các khu vực nhiệt đới [177]. Những chi này đều thuộc nhóm nấm Ascomycota và

có mối quan hệ chặt chẽ với nhiều loại nấm diệt côn trùng như Metarhizium.

Vỏ trứng của tuyến trùng bao gồm ba lớp riêng biệt và chủ yếu bao gồm

protein, chitin và lớp vô định hình [195]. Sự xâm nhập vào vỏ trứng của tuyến trùng

xảy ra từ một điểm chuyên biệt hoặc các nhánh bên của sợi nấm. Chitinase và protease

đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm mỏng vỏ trứng và dẫn đến sự tan rã của

các lớp vỏ trứng [117, 195]. Paecilomyces lilacinus sinh tổng hợp một số chitinase

và protease có liên quan đến tốc độ phá hỏng mạnh mẽ của cấu trúc vỏ trứng [93].

Theo Ocralit và cs., (2009), một trong những công bố đầu tiên về khả năng

diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita và Globodera pallida của nấm sợi P. lilacinus

là của Jatala và cs., (1979) [140]. Kể từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu công bố trên

thế giới về khả năng diệt tuyến trùng sần rễ Meloidogyne của chi nấm này ở cả trong

khu thí nghiệm nhà kính và thực tế ngoài đồng ruộng được tiến hành. Một trong

những ưu điểm để chi nấm ký sinh trứng tuyến trùng được quan tâm nghiên cứu nhiều

và đưa vào sản xuất chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng là do hiệu quả cao, tính an

toàn của chúng đối với con người và môi trường [32, 84, 91, 154].

Giới thiệu về Paecilomyces sp.

Paecilomyces thuộc ngành nấm túi Ascomycota, Lớp Euascomycetes; Bộ

Eurotiales; Họ Trichocomaceae. Chi Paecilomyces gồm nhiều loài như: P. lilacinus

(Purpureocillium lilacinum), P. variotii, P. lavendulum….

Paecilomyces diệt tuyến trùng với cơ chế ký sinh trực tiếp lên trứng và ấu

trùng đồng thời sinh tổng hợp enzym như chitinase, protease có khả năng phân hủy

lớp chitin bên ngoài của ấu trùng và ức chế nở trứng [9, 95, 107, 117, 175]. Thành

phần vỏ trứng tuyến trùng có 40% (w/w) là chitin. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng có

thể sinh tổng hợp chitinase ngoại bào để xâm nhập vào vỏ trứng tuyến trùng trong

quá trình tiêu diệt. Ngoài chitinase, protease cũng góp phần phá vỡ lớp biểu bì tuyến

trùng và vỏ trứng. Các nghiên cứu của Khan và cs., (2004), (2001), Gortari và cs.,

(2008) đã xác định cấu trúc, chức năng và quá trình sinh tổng hợp các enzym, từ đó

đã công bố vai trò của enzym liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng [65, 93, 96]. Quan

sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy sợi nấm P. lilacinus xâm nhập trực

tiếp vào lớp biểu bì của trứng, ấu trùng của Meloidogyne javanica [9, 95]. Kiewnick

và Sikora (2006) đã thử nghiệm khả năng kiểm soát tuyến trùng sần rễ Meloidogyne

incognita ký sinh trên cà chua của P. lilacinus 251, kết quả là làm giảm lượng mật độ

ấu trùng trong rễ đến 71% so với mẫu đối chứng [98]. Paecilomyces lilacinus

(Purpureocillium lilacinum) được coi là yếu tố phòng trừ bệnh thực vật gây ra bởi

tuyến trùng [130].

Sau đây là một số công trình nghiên cứu về chitinase và protease ngoại bào từ

các chủng vi nấm diệt tuyến trùng nhằm làm sáng tỏ hơn vai trò của chitinase và

protease tham gia vào cơ chế diệt tuyến trùng.

Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng

Các chitinase của nấm sợi chủ yếu thuộc nhóm GH18, ngoại lệ là NbChiA từ

Nosema bombycis trong họ GH19 [70]. Tuy nhiên, các phân nhóm chitinase GH18

của nấm sợi không tương ứng với các nhóm cùng tên trong số các enzym GH18 của

vi khuẩn. Giống như vi khuẩn, chitinase của nấm sợi cũng có thể có cấu trúc nhiều

trung tâm hoạt động [78]. Theo Seidl-Seiboth và cs., (2014), ở Trichoderma

harzianum và Trichoderma viride, chitinase bao gồm nhiều loại chitinase thuộc GH18

ngoại bào được sử dụng để sản xuất các loại chitinase có bán trên thị trường [20].

Vào những năm 1980, lần đầu tiên các nghiên cứu nhằm sàng lọc các chủng

nấm diệt tuyến trùng trong đất đã chứng minh mối liên quan giữa hoạt tính chitinase

của nấm diệt tuyến trùng với khả năng diệt tuyến trùng [43]. Theo Yang và cs., (2007),

các chi nấm diệt tuyến trùng như Pochonia, Arthrobotrys, Paecilomyces được coi

như các tác nhân sinh học diệt tuyến trùng [195]. Dackman và cs., (1989) đã công bố

hai loài thuộc chi Verticillium có khả năng diệt Heterodera schachtii nhờ hoạt tính

chitinase và protease của chi nấm này [43].

Những năm đầu thế kỷ 21, Tikhonov và cs., (2002) đã tinh sạch chitinase

Chi43 từ hai loài riêng biệt thuộc chi Verticillium. Khi quan sát bằng kính hiển vi

điện tử quét, trên các bề mặt của trứng Globodera pallida xuất hiện các vết sẹo do

enzym phân hủy. Các vết này thể hiện rõ nét hơn khi xử lý bằng Chi43 kết hợp với

P32 là một protease được nấm tiết ra trong quá trình xâm nhập vào trứng [167]. Sau

đó Mi và cs., (2010) đã công bố gen mã hóa chitinase GH18, PcChi44, từ Pochonia

chlamydosporia đồng thời cũng biểu hiện thành công chitinase này ở E. coli. Enzym

tái tổ hợp PcChi44 được tiến hành ủ với trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica

và nhận thấy enzym này làm suy giảm đáng kể đến bề mặt của vỏ trứng. Ngoài ra,

các nhà khoa học còn chứng minh PcChi44 cũng có tác động đối với trứng B. mori

[125].

Theo nghiên cứu của Li và cs., (2006) cho thấy hầu hết các loại nấm thường

sinh tổng hợp nhiều hơn một loại chitinase và các enzym này tương tác với nhau [54].

Các công bố hiện nay cho thấy, nhiều loài nấm ký sinh (ví dụ Trichoderma

harzianum) được coi là nguồn sản xuất các chitinase công nghiệp [21, 54, 62].

Không giống như vi khuẩn, ở nấm sợi, chitin là thành phần chính của thành tế

bào. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia, sinh trưởng và hình

thành tế bào nấm. Các loại nấm sợi như Trichoderma, Penicillium, Neurospora,

Mucor, Aspergillus, Conidiobolus và Beauveria tiết ra các loại chitinase khác nhau

[73].

Nghiên cứu của Park và cs., (2004) đã sàng lọc các chủng nấm chống tuyến

trùng dựa vào khả năng phân hủy protein, chitin và thử nghiệm khả năng diệt ấu trùng

của loài Meloidogyne javanica. Kết quả nghiên cứu cho thấy P. lilacinus gây chết đối

với Caenorhabditis trưởng thành [144]. Ngoài ra, Khan và cs., (2003) đã sử dụng

điện di trên gel 2D dịch nuôi cấy P. lilacinum 251 và tìm ra 6 protein có hoạt tính

chitinase [92]. Tác dụng của chế phẩm dạng bán tinh khiết có chứa các chitinase này

được thử nghiệm trên trứng của tuyến trùng M. javanica dưới dạng đơn lẻ hoặc kết

hợp với một protease ngoại bào cho hiệu quả ức chế 79% sự nở của ấu trùng làm cho

tuyến trùng bất động, biến dạng và cấu trúc vỏ trứng bị thay đổi mạnh. Kết quả soi

trên kính hiển vi điện tử cho thấy: trứng được xử lý protease, lớp lipid bên trong biến

mất, do đó làm tăng tính thấm của trứng, tác dụng của chitinase là phân hủy đặc thù

cho lớp chitin trung gian. Tuy nhiên, khi sử dụng kết hợp protease và chitinase hiệu

quả tác động mạnh hơn làm co lipid và lớp chitin bị thủy phân [93]. Chan và cs.,

(2010) đã nghiên cứu gen PjChi-1 tổng hợp chitinase được phân lập từ Paecilomyces

javanicus (còn gọi là Isaria javanica) và thử nghiệm hiệu quả diệt tuyến trùng

Meloidogyne incognita bằng cách chuyển gen đó lên cây cà chua. Nghiên cứu đã

chứng minh hoạt động endochitinase ở cây cà chua mang gen PjChi-1 cao so với đối

chứng. Điều này được xác định bằng sự giảm hàm lượng chitin của vỏ trứng tuyến

trùng, do đó kéo theo những ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của ấu trùng [35].

Gần đây, chitinase từ loài nấm sợi Monacrosporium thaumasium và

Duddingtonia flagrans đã được tách chiết, xác định hoạt tính, thử nghiệm khả năng

diệt tuyến trùng. Kết quả cho thấy cả hai loài đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng

khi sử dụng enzyme này [27, 156]. Theo nghiên cứu của Braga và cs., (2015),

chitinase được chứng minh là ngoài tác dụng làm mỏng vỏ trứng tuyến trùng còn có

tác dụng tiêu diệt vi khuẩn [27]. Ở Trichoderma, các chitinase có liên quan đến sự

phân hủy các sợi fibrin ngoại bào và thành tế bào. Gruber và cs., (2012) cho rằng sự

phân biệt giữa các chitinase là do khả năng phản ứng của chitinase với các cơ chất

khác nhau [66].

Một loại endochitinase từ Trichoderma harzianum đã được biểu hiện trong

cây thuốc lá nhằm kiểm tra khả năng đối kháng với tuyến trùng Meloidogyne hapla.

Theo nghiên cứu của Brants & Earle, (2002), hoạt tính chitinase tăng cao khi nuôi

cấy tế bào cây thuốc lá chuyển gen tổng hợp endochitinase [29]. Theo Brants và cs.,

(2000) công bố các tín hiệu peptide có chức năng trong cây thuốc lá và do đó chitinase

được biểu hiện sẽ được tiết ở vùng rễ nơi tiếp xúc với trứng của tuyến trùng M. hapla

[28].

Theo nghiên cứu của Zhang và cs., (2014) cho thấy Trichoderma

longibranchiatus đã ký sinh vào tuyến trùng Heterodera avenae và ức chế sự nở của

nang trứng, với hiệu quả tỷ lệ thuận với hoạt tính của chitinase [199]. Những kết quả

này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về Trichoderma harzianum, trong đó quá

trình lây nhiễm của tuyến trùng có sự tham gia của một hệ thống phức tạp bao gồm

sáu loại chitinase. Trichoderma harzianum đã nhận ra tín hiệu trên bề mặt tuyến trùng

(thông qua yếu tố nhận biết) từ đó chúng đã kích hoạt cả sự hình thành cấu trúc nhiễm

vào tuyến trùng và kích thích sự sản sinh chitinase trong nấm, hai quá trình cơ bản để

xâm nhập vào thành tế bào tuyến trùng. Từ đó các nhà khoa học đã nhận định rằng

lớp vỏ trứng tuyến trùng được cấu tạo bởi lớp chitin và hàng loạt các nghiên cứu về

lớp biểu bì của tuyến trùng. Các công bố trong những năm tiếp theo về chitinase từ

nấm sợi phá hủy lớp biểu bì tuyến trùng như của Braga và cs., (2015), Chen và cs.,

(2015), Park và cs., (2002) [27, 38, 143].

Gan và cs., (2007) công bố đã biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase

lpchi1 từ nấm Lecanicillium psalliotae (hay còn gọi là Verticillium psalliotae) vào

nấm men [63]. Tác dụng của enzym tái tổ hợp này đã được thử nghiệm trên trứng

tuyến trùng M. javanica ở dạng đơn lẻ hoặc kết hợp với protease Ver122. Chitinase

được tinh sạch đã ức chế trứng nở (khoảng 38,2% ở dạng trứng so mẫu đối chứng,

khoảng 19,8% không phát triển từ trứng thành ấu trùng) và khi kết hợp với protease,

hiệu quả của nó được tăng cường thêm, cụ thể tỷ lệ nở giảm 56,5%.

Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới cho thấy chitinase từ nấm sợi đóng vai

trò quan trọng trong quá trình diệt trứng cũng như ấu trùng và tuyến trùng. Từ đó, các

chủng nấm sợi phân lập được trong đề tài được hướng tới nghiên cứu khả năng sinh

chitinase tham gia vào vai trò diệt tuyến trùng.

Protease từ nấm diệt tuyến trùng

Cho đến nay, hơn 20 protease serine đã được tinh sạch hoặc xác định trọng

lượng phân tử từ các loại nấm diệt tuyến trùng khác nhau [171, 192, 194]. Các nghiên

cứu cơ chế tiêu diệt tuyến trùng đã chỉ ra rằng các protease này có thể làm suy giảm

hiệu quả các lớp biểu bì tuyến trùng. Do đó, chúng còn được gọi là protease phân hủy

tuyến trùng. Các cấu trúc tinh thể khác nhau của hai protease phân hủy lớp biểu bì,

Ver112 (tìm thấy từ Lecanicillium psalliotae) và PL646 (tìm thấy từ Paecilomyces

lilacinus) dẫn tới chức năng của chúng khác nhau [111]. Protease từ các chủng nấm

này là các protease ngoại bào được sinh ra chủ yếu từ Verticillium lecanii và

Metarhizium anisopliae [158]. Protease P32 đầu tiên được xác định từ Pochonia

rubescens [116]. Sau đó, các protease tương tự cũng được tìm thấy trong các loại nấm

diệt tuyến trùng khác. Năm 1994, hai protease tham gia vào cơ chế diệt tuyến trùng

(PII và VCP1) đã được xác định lần lượt từ loài nấm Arthrobotrys oligospora và

Pochonia chlamydosporia (hay có thể gọi là Verticillium chlamydosporium) [151,

171]. Gần đây, các protease diệt tuyến trùng từ nấm Paecilomyces lilacinus,

Arthrobotrys oligospora được tìm thấy nhiều hơn bao gồm pSP3, Aoz1, Ver112, Mlx,

PrC và Ds1 có khả năng diệt tuyến trùng [25, 129]. Ngày nay, các nhà khoa học cho

rằng các protease khác nhau thì tác dụng diệt tuyến trùng khác nhau, đồng thời cũng

diệt các vật chủ khác nhau. Do vậy, đối với những tuyến trùng khác nhau cần đối

tượng nấm diệt tuyến trùng đặc thù [195].

1.2.2.4. Nấm sinh độc tố

Nấm sản xuất độc tố là một nhóm nấm trong quá trình trao đổi chất của chúng

hình thành một số độc tố bằng cách cố định tuyến trùng trước khi sợi nấm xâm nhập

qua lớp biểu bì của tuyến trùng [117]. Hơn 200 hợp chất có hoạt tính diệt tuyến trùng

đã được xác định, số lượng khoảng 280 loài nấm trong 150 chi thuộc Ascomycota và

Basidiomycota. Các hợp chất này bao gồm các ancaloit, peptide, terpenoid macrolide,

oxygen heterocycle, các hợp chất benzo, quinone, hợp chất aliphatic, các hợp chất

thơm đơn giản và sterol [75, 106].

Pleurotus là chi nấm có khả năng hình thành các giọt độc tố tiêu diệt tuyến

trùng, các độc tố này chuyển động trong sợi nấm và hướng tới con tuyến trùng [102,

164, 165].

Việc phát hiện ra các sản phẩm trao đổi chất này với các hoạt động diệt tuyến

trùng tạo ra một bước nghiên cứu đầy hứa hẹn để phát triển các hoạt chất này dưới

dạng sản phẩm thương mại diệt tuyến trùng. Như Thermolides A (F (1 (6) 6), một

loại chất chuyển hóa có chứa macrolactone bao gồm 13 dẫn xuất được sinh tổng hợp

bởi Talaromyces thermophilus đồng thời hai trong số chúng (hợp chất 1 và 2) có tác

dụng diệt tuyến trùng tương tự như avermectin thương mại [67].

Một trong những yếu tố quan trọng nữa là ngoài việc sản sinh độc tố, nấm

Coprinus comatus và Stropharia rugosoannulata, có thể diệt tuyến trùng bằng cách

đặc biệt do hình thành các u gai và bướu gai. Các cấu trúc đặc biệt này phá hủy lớp

biểu bì của tuyến trùng và dẫn đến rò rỉ tế bào chất tuyến trùng ra ngoài gây chết

tuyến trùng, đồng thời các lực cơ học cũng có thể hoạt động như một yếu tố độc lực

[120, 121].

Ngoài ra, một số hợp chất diệt tuyến trùng cũng đã thu được từ Trichoderma

như trichodermin-vinyl-cyclopentane-1α, 3α-diol, 6-pentyl-2H-pyran-2-one và 4-(2-

hydroxyeth) phenol. Một số chi nấm nội sinh Acremonium và nấm Arbuscular

mycorrhizal (AM) có khả năng làm giảm sự xâm nhập của tuyến trùng và tăng cường

sự phát triển của cây bị nhiễm tuyến trùng [176, 178]. Fusarium oxysporum đã được

công bố có thể ức chế đáng kể quần thể tuyến trùng Pratylenchus goodeyi và

Helicotylenchus multotypeus và tăng năng suất của cây chuối nuôi cấy mô [186].

1.2.3. Các giai đoạn diệt tuyến trùng của nấm

Nhiều công trình nghiên cứu đã giải thích tại sao các loài nấm diệt tuyến trùng

lại có thể nhận biết được tuyến trùng để tiêu diệt [107, 117]. Quá trình từ thâm nhập

đến tiêu diệt bao gồm 3 - 4 giai đoạn khác nhau: (1) Thu hút/nhận biết, (2) Bám dính,

(3) Thâm nhập, (4) Tiêu hóa [7, 138].

Thu hút và nhận biết là những bước đầu trong quá trình lây nhiễm của nấm

diệt tuyến trùng. Quá trình này xảy ra thông qua sự tiếp xúc tế bào và liên quan đến

một loạt các tương tác sinh hóa, sinh lý hoặc hình thái giữa nấm và tuyến trùng. Khi

tuyến trùng đi qua, nấm diệt tuyến trùng có thể bám vào tuyến trùng thông qua sợi cơ

kết dính trên bề mặt bào tử nấm [107]. Thành phần hóa học của các sợi cơ trên bề

mặt của nấm còn chưa được sáng tỏ. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các protein liên kết

với carbohydrate (profin) thường được tìm thấy trên các sợi cơ bề mặt. Sau khi gắn

vào tuyến trùng, sợi nấm xâm nhập vào tuyến trùng bằng cách phá vỡ lớp biểu bì [89,

107]. Hiện nay một số công bố cho rằng sự xâm nhập của nấm bao gồm sự kết hợp

các lực cơ học và các enzym ngoại bào, enzym thủy phân cũng rất quan trọng trong

giai đoạn diệt tuyến trùng bao gồm các protease serine, chitinase và collagenase

[193].

Việc thu hút và nhận biết của nấm diệt tuyến trùng còn được các nhà nghiên

cứu tìm ra do sự hấp dẫn của các chi nấm này với tuyến trùng: ví dụ như một số hợp

chất hữu cơ dễ bay hơi (Volatile Organic Compounds - VOC) được sản xuất nhiều

và liên tục bởi nấm nội sinh Esteya vermicola có sự hấp dẫn đối với tuyến trùng cây

thông (pinewood nematode - PWN) Bursaphelenchus xylophilus [182]. Các VOC

được xác định bao gồm monoterpen (α-pinene và-pinene) và terpenoid (long não),

tương tự như các hợp chất dễ bay hơi phát ra từ cây thông, cho thấy E. vermicola bắt

chước mùi hương của cây thông [113]. Tuy nhiên, nghiên cứu về các hợp chất được

sinh ra bởi nấm diệt tuyến trùng nhằm thu hút tuyến trùng vẫn còn hạn chế.

Sự điều chỉnh các quá trình trao đổi chất của nấm đóng vai trò quan trọng trong

việc thích nghi với môi trường sinh thái đa dạng. Nấm bẫy tuyến trùng có thể chuyển

đổi lối sống từ hoại sinh sang gây bệnh bằng cách phát triển các kiểu bẫy để dính

tuyến trùng và ăn thịt con mồi như một nguồn chất dinh dưỡng trong tự nhiên. Tuy

nhiên, chất hóa học cụ thể được sinh ra bởi nấm vẫn còn đang được nghiên cứu. Một

số nhà khoa học giả thiết rằng các phân tử tín hiệu quan trọng này có thể dễ bay hơi

trong tự nhiên. Việc sử dụng GC-MS để thực hiện phân tích so sánh các chất chuyển

hóa của nấm ở giai đoạn hoại sinh và giai đoạn gây bệnh của loài Arthrobotrys

oligospora đã và đang được nghiên cứu. Nấm tạo ra một nhóm nhỏ chất chuyển hóa

furanone và pyrone dễ bay hơi có liên quan đến việc chuyển từ giai đoạn hoại sinh

sang giai đoạn gây bệnh. A. oligospora được nuôi cấy trên môi trường CMA (Corn –

Meal- Agar) có xu hướng tạo ra nhiều bẫy hơn và sử dụng các dẫn xuất của furan để

tối ưu việc sử dụng bẫy, trong khi nấm nuôi cấy trên PDA ít bẫy hơn. Một chất chuyển

hóa pyrone dễ bay hơi khác, maltol, được xác định là chất điều chỉnh hình thái để

tăng cường sự hình thành bẫy (Hình 1.5) [181]. Khi tiếp xúc trực tiếp với tuyến trùng,

nấm sinh trưởng trên môi trường CMA phát triển nhiều bẫy hơn so với nấm trên môi

trường PDA, khi tiếp xúc không trực tiếp với tuyến trùng, nấm trên PDA phát triển

hạch nhiều hơn so với trên CMA. Khi sinh trưởng trên CMA tạo ra chất chuyển hóa

2 - (5H) - furonone, trong khi nấm trên PDA tạo ra chất chuyển hóa nicalide, 5-methyl

furan 2-carbaldehyd, cũng như maltol làm tăng số lượng bẫy. Song song với việc nấm

diệt tuyến trùng có sự thu hút tuyến trùng như trên đã trình bày thì ở nhóm nấm này

cũng có thể cảm nhận được một số chất tạo ra bởi tuyến trùng. Tín hiệu nemin ở tuyến

trùng Neoaplectana glaseri được chứng minh là nguyên nhân gây ra sự chuyển đổi

hình thái và hình thành bẫy trong Arthrobotrys conoides, mặc dù thành phần hóa học

của chất nemin vẫn chưa được biết. Một nghiên cứu khác báo cáo rằng ascaroside,

một loại phân tử nhỏ được tạo ra bởi nhiều loài tuyến trùng, có thể kích hoạt sự hình

thành bẫy ở Arthrobotrys oligospora và một số loài liên quan, tạo ra mạng lưới dính

ba chiều [77]. Những kết quả này cho thấy nấm diệt tuyến trùng có thể nhận ra tuyến

trùng thông qua giao tiếp hóa học và sau đó điều chỉnh hình thái. Quá trình trao đổi

chất ở nấm sợi cũng bao gồm những đường dẫn truyền để nhận biết tín hiệu môi

trường và truyền tín hiệu đến các tế bào. Nhóm Protein G là một nhóm cảm biến

chính liên quan đến các quá trình trao đổi chất, bao gồm sự sinh trưởng, sinh bệnh

học và phản ứng với các tín hiệu môi trường [108]. Chen và cs., (2001) đã công bố

vai trò mấu chốt của G-Protein trong đường truyền tín hiệu để hạn chế sự hình thành

vòng của Arthrobotrys dactyloides [39].

Hình 1.5. Sự biến đổi về hình thái của A. oligospora trên CMA và PDA [181]

Sau khi xâm nhập vào tuyến trùng, nấm bắt đầu quá trình tiêu hóa tuyến trùng.

Đối với nấm Arthrobotrys oligospora, các sợi nấm phình to tạo thành các bóng lớn.

Protein có tên gọi là AOL được hình thành và hỗ trợ quá trình tiêu hóa tuyến trùng,

tuy cơ chế này chưa được nghiên cứu nhiều [138].

Tiếp theo đó, nấm sợi có thể đã tham gia quá trình đồng hóa và lưu trữ các

chất dinh dưỡng thu được từ tuyến trùng bị tiêu diệt. Các nhà khoa học đã tìm thấy

các giọt lipid tích tụ trong sợi nấm [138]. Như vậy, chitinase và protease đóng vai trò

đặc biệt là phá vỡ tính toàn vẹn cấu trúc của lớp biểu bì và vỏ trứng của tuyến trùng,

tạo điều kiện cho nấm xâm nhập và tiêu diệt [107, 193].

1.3. CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG

1.3.1. Các phương pháp chuyển gen

Hiện nay, trên thế giới các nhà khoa học đang sử dụng các phương pháp

chuyển gen vào nấm sợi như chuyển gen bằng tế bào trần, chuyển gen bằng xung

điện, chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens… Mỗi phương pháp

chuyển gen đều có những ưu nhược điểm riêng. Tuy nhiên tùy thuộc vào từng loài

mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phương pháp và những phương pháp

chuyển gen thường được sử dụng như sau:

(1) Chuyển gen bằng tế bào trần (protoplast): tế bào nấm sợi trước khi chuyển

gen cần được xử lý enzym nhằm loại bỏ thành tế bào, từ đó tạo protoplast giúp DNA

dễ dàng xâm nhập vào tế bào. Ở phương pháp chuyển gen này, giai đoạn chuẩn bị

protoplast phức tạp, chi phí cao, không ổn định. Protoplast phải sử dụng ngay sau khi

chuẩn bị do vậy khó khăn trong quá trình chuyển [115]. (2) Chuyển gen bằng xung

điện (electroporation): Nguyên tắc của phương pháp là một xung điện cao thế trong

thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các lỗ thủng tạm thời giúp cho các

phân tử DNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Đối với

nấm sợi, trước khi xử lý với xung điện, bào tử nấm nảy chồi sẽ được loại bỏ thành tế

bào bằng một số enzym để tạo tế bào trần (protoplast), sau đó tế bào trần được trộn

với DNA và được đưa vào máy tạo xung điện để chuyển DNA vào trong tế bào nấm.

Phương pháp này cần phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình chuyển gen và

chỉ áp dụng thành công trên một số đối tượng nấm sợi [34]. (3) Chuyển gen bằng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) Vi khuẩn A. tumefaciens là vi khuẩn

Gram âm, sống trong đất, thuộc chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. A. tumefacines

là tác nhân gây khối u trên thực vật [185]. Sự hoạt động của các gen vir được cảm

ứng bởi acetosyringone (AS) [127]. Acetosyringone (3,5 - dimethoxyacetophenone)

là hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật, hoạt động như một chất cảm ứng với

hiệu quả khác nhau tùy thuộc vào vật chủ [142]. Khi qua nhiều giai đoạn như vậy,

chuyển gen vào nấm sợi bằng vi khuẩn A. tumefaciens chịu ảnh hưởng của nhiều yếu

tố: vật liệu chuyển gen (bào tử nấm), vi khuẩn A. tumefaciens, tỷ lệ nồng độ vi khuẩn

A. tumefaciens và bào tử nấm, điều kiện đồng nuôi cấy vi khuẩn – bào tử nấm, nồng

độ chất cảm ứng AS.

Chuyển gen bằng A. tumefaciens là phương pháp cơ bản sử dụng trong tái tổ

hợp di truyền nhằm biểu hiện gen, xóa gen, điều tra gen …

Hình 1.6. Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens [185].

1.3.2. Một số gen chỉ thị dùng cho chuyển gen ở nấm

Gen chỉ thị được sử dụng để đánh giá hiệu quả chuyển gen vào chủng được

chuyển hoặc để sàng lọc các thể chuyển gen. Chuyển các gen chỉ thị vào chủng nấm

cần nghiên cứu nhằm tạo ra các chủng có kiểu hình khác với chủng tự nhiên (wild

type - WT). Các gen chỉ thị giúp các nghiên cứu dễ dàng hơn trong việc nhận biết thể

chuyển gen dưới kính hiển vi điện tử mà không làm thay đổi hoạt tính sinh lý, sinh

hóa của chủng. Đối với những nghiên cứu đòi hỏi tính chính xác cao, các nhà khoa

học có thể thiết kế gen chỉ thị gắn liền với gen đích và được biểu hiện dưới cùng một

promotor hoặc có thể biểu hiện độc lập mà không có gen đích đi kèm. Một số gen chỉ

thị thường dùng là DsRed, GFP, GUS, lacZ… [139].

Protein huỳnh quang đỏ được các nhà khoa học nghiên cứu mang tên DsRed

từ san hô Discosoma sp., gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ được gọi là DsRed đã

được tối ưu hóa codon cho biểu hiện cao trong các tế bào động vật có vú. Ngoài ra,

GFP là gen huỳnh quang xanh lá cây để biểu hiện protein xanh lá cây cũng thường

được sử dụng trong nấm sợi thuộc Ascomycetes [139]. Biểu hiện huỳnh quang đỏ

của gen chứa DsRed đã nhận được ở cả ba loại nấm Penicillium paxilli, Trichoderma

harzianum, Trichoderma virens cho thấy rằng DsRed có thể được sử dụng gen biểu

hiện hiệu quả cao trong nấm sợi thuộc Ascomycetes. Ngoài ra, một số nghiên cứu

cũng được biểu hiện kép cả DsRed và GFP trong cùng một sợi nấm và được sử dụng

để so sánh không định lượng về cường độ huỳnh quang bằng kính hiển vi quét laser

đồng tiêu. Marker chọn lọc thường sử dụng là các gen mang đặc điểm thích hợp để

phục vụ mục đích chọn lọc nhân tạo và được đưa vào trong tế bào. Các gen được sử

dụng chuyển gen thông thường là các gen kháng kháng sinh và gen trợ dưỡng PyrG.

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chuyển gen

Quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua A. tumefaciens là phương

pháp được áp dụng phổ biến bởi tính ổn định và chi phí thấp. Tuy nhiên, hiệu suất

của quá trình chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:

(*) Agrobacterium tumefaciens: vi khuẩn được sử dụng cho chuyển gen thường rất

đa dạng, theo Gelvin và cs., (2010) các protein vir độc lực khác nhau (protein vir:

virA, virC, virG…) được truyền từ A. tumefaciens đến tế bào vật chủ qua thành tế bào

và màng sinh chất [64]. Protein vir ở các A. tumefaciens thường đa dạng và cho hiệu

quả chuyển gen khác nhau ở các loài nấm khác nhau do chúng sở hữu một số cảm

biến thay đổi tùy từng loại nấm và được bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy [8].

(*) Thời gian, cấu trúc màng đồng nuôi cấy quyết định thành công hay thất bại của

quá trình chuyển gen. Quá trình đồng nuôi cấy thường được xác định trước nhằm

tránh rủi ro trong quá trình chuyển gen, thời gian đồng nuôi cấy thông thường từ 48

- 72 giờ tùy thuộc vào từng loại nấm, việc khảo sát thời gian đồng nuôi cấy là yếu tố

quan trọng, là thông số khác nhau trên các loài nấm sợi khác nhau.

(*) Vật liệu chuyển gen

(*) Nồng độ chất cảm ứng

Ngoài ra tỷ lệ phối trộn ban đầu giữa vi khuẩn và bào tử nấm là yếu tố có ảnh

hưởng nhiều nhất đến hiệu quả chuyển gen, tỷ lệ không thích hợp sẽ dẫn tới vi khuẩn

nhiều, ức chế sự trao đổi chéo tương đồng hoặc tỷ lệ bào tử nhiều sẽ dẫn tới hiện

tượng dương tính giả (khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa nhưng không nhận được gen

chuyển). Do vậy cần thiết lập một tỷ lệ hợp lý cũng như quy trình tối ưu riêng thích

hợp nhất cho từng loại nấm [64].

Để thực hiện quá trình chuyển gen, một công cụ quan trọng nhất được các nhà

khoa học không ngừng tìm kiếm và phát triển đó là vector. Có hai hệ thống vector sử

dụng trong chuyển gen bằng A. tumefaciens là hệ thống vector đồng tích hợp (co-

integrated vector) và hệ thống vector nhị thể (binary vector) [172]. Hệ thống vector

đồng tích hợp ít phổ biến hơn do khó khăn trong việc thiết kế và sử dụng chúng [172].

Hệ thống vector nhị thể được sử dụng nhiều nhất để chuyển gen thông qua vi khuẩn

A. tumefaciens. Hệ thống này gồm hai plasmid là Ti plasmid và vector nhị thể.

Như vậy, phương pháp Agrobacterium tumefaciens-Mediated transformation

(ATMT) là phương pháp hiệu quả cho nghiên cứu biểu hiện gen ở nấm sợi bởi kỹ

thuật đơn giản, chi phí thấp, hiệu quả cao, chủng chuyển gen ổn định về mặt di truyền.

Do vậy, trong khuôn khổ của luận án này, gen chỉ thị huỳnh quang đỏ DsRed bước

đầu nghiên cứu chuyển gen và biểu hiện gen ở Paecilomyces lilacinus P1 thông qua

vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng maker trợ dưỡng uridine/uracil và tối ưu quá trình

chuyển gen nhằm lựa chọn được thể chuyển gen có tốc độ diệt tuyến trùng cao.

1.3.4. Một số nghiên cứu cải biến di truyền đối với nấm diệt tuyến trùng

Một cách để cải thiện khả năng diệt tuyến trùng của nấm sợi là sử dụng kỹ

thuật di truyền để tăng khả năng gây bệnh và khả năng sống sót của nấm. Nhờ đột

biến gen xảy ra với nấm diệt tuyến trùng Arthrobotrys oligospora, gen PII - mã hóa

protease serine (phân hủy lớp biểu bì tuyến trùng) đã được biểu hiện quá mức ở A.

oligospora. Ahman và cs., (2002) đã nghiên cứu gen PII của Arthrobotrys oligospora

và nhận thấy nếu xóa gen PII do tái tổ hợp tương đồng có ảnh hưởng đến khả năng

diệt tuyến trùng của nấm này. Đồng thời, nếu biểu hiện quá mức PII thì nhận thấy tốc

độ diệt tuyến trùng tăng hơn so với chủng tự nhiên. Các nghiên cứu này mới chỉ ở

mức độ khởi đầu cho các nghiên cứu kế tiếp nhằm tạo các chế phẩm đạt hiệu quả diệt

tuyến trùng cao hơn [10]. Gần đây, các nhà khoa học đã công bố biểu hiện quá mức

gen Ver112 – mã hóa protease ở Paecilomyces lilacinus (nấm ký sinh trứng tuyến

trùng) làm tăng tốc độ diệt tuyến trùng của loài nấm này.

Những tiến bộ trong sinh học phân tử đã cho phép chuyển những gen cụ thể

vào thực vật. Nhằm tăng cường khả năng kiểm soát sinh học, một loạt các dòng biến

đổi gen đã được tạo ra để cung cấp sức đề kháng chống lại nấm bệnh. Theo Punja

(2001) một trong những cách tiếp cận chính là biểu hiện quá mức các enzym như

chitinase [147]. Tuy nhiên, việc biểu hiện quá mức chitinase chỉ tăng sức đề kháng

của cây với một hoặc vài loài nấm gây bệnh của cây như Rhizoctonia solani và

Botrytis cinerea. Do vậy, nếu hoạt tính chitinase của nấm tăng lên thì chỉ đặc hiệu

với một hoặc vài loài nấm bệnh cho thực vật [118]. Với khả năng tiếp cận như vậy

gần đây các nhà khoa học đã thành công bằng cách tạo ra cây cà chua biểu hiện gen

mã hóa một chitinase được phân lập từ nấm Paecilomyces javanicus. Theo Chan và

cs., (2010), cây chuyển gen được biểu hiện quá mức chitinase và được thử nghiệm

trong phòng thí nghiệm chống lại bệnh bởi tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. [35].

Yang và cs., (2015) đã gây đột biến bằng chiếu UV trên chủng Pacielomyces

lilacinus 36-1 (Pl36-1) tạo hai thể đột biến P100 và PL3 kháng với carbendazim (bình

thường chủng tự nhiên mẫn cảm với carbedazim ở nồng độ 0,3 g/ml). Đồng thời các

nghiên cứu cũng cho thấy mối liên hệ giữa sự đột biến gen ß-tubulin với khả năng

kháng carbendazim của chủng này. Do vậy, định lượng bằng RT-PCR cho thấy việc

biểu hiện quá mức ß-tubulin gấp 4 lần so với chủng dại đồng thời giúp thể đột biến

P3 và P100 tăng cường khả năng sinh bào tử và thử nghiệm trong điều kiện phòng thí

nghiệm cho hiệu quả diệt tuyến trùng tăng 20% [190].

Việc xóa gen AOL_s00079g496 trong A. oligospora đã dẫn đến tăng chất hấp

dẫn furanone lên 2 lần trong các đột biến và tăng cường hoạt động dẫn dụ (1,5 lần)

của nấm, trong khi dẫn đến giảm sự hình thành bẫy. Nghiên cứu này cung cấp những

kết quả mới về khả năng thích ứng của nấm đối với stress môi trường, liên quan đến

cơ chế, thay đổi hình thái và quá trình chuyển hóa [181].

Ahrén và cs., (2005) đã tìm thấy một số gen biểu hiện hình thành các bẫy dính

từ các sợi nấm và có thể đóng vai trò bẫy ký sinh trùng của loài nấm Monacrosporium

haptotylum. Những gen này bao gồm gen biểu hiện hình thái như rho1, rac1 và ras1,

một số gen như rho (rdi1) và các gen liên quan đến khả năng đáp ứng stress môi

trường, tổng hợp protein, phiên mã và chuyển hóa carbon [12].

Các nhà khoa học cũng nghiên cứu quá trình chuyển gen ở loài nấm diệt tuyến

trùng Dactylellina cionopaga (bẫy tuyến trùng bằng cách tạo ra các cột dính và mạng

hai chiều) bằng tế bào trần và bằng Agrobacterium tumefaciens. Kết quả cho thấy, ở

4,175 ± 1,025 × 106 đến 3,08 ± 1,4 × 107 protoplast/ml thu được 4,2 đến 11 khuẩn lạc

bằng phương pháp chuyển bằng tế bào trần, đồng thời 180 – 270 khuẩn lạc bằng

chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với nồng độ bào tử khi

chuyển là 106 bào tử/ml. Khi chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang nhận thấy có xuất

hiện huỳnh quang xanh, như vậy D. cionopaga đã nhận được vector pK2-BarGFP, có

chứa gen kháng ammonium glufosine và gen protein huỳnh quang xanh [72].

Liu và cs., (2019) đã phát triển một hệ thống nhằm xóa bỏ gen ku80 (phức hệ

protein Ku – liên quan đến xác suất tái tổ hợp không tương đồng NHEJ) của

Pupureocillium lilacinum (Paecilomyces lilacinus) đã làm tăng hiệu quả yếu tố phiên

mã trong quá trình điều hòa trung tâm của bào tử góp phần gây nhiễm bệnh tuyến

trùng hay nói cách khác là tăng khả năng diệt tuyến trùng. Nghiên cứu này cũng đồng

thời xác định thêm các gen liên quan đến sự gây bệnh tuyến trùng của nấm này [114].

Yang và cs., (2015) đã công bố vai trò của gen pld ở loài Purpureocillium

lilacinum mã hóa protein phospholipase D (PLD) có khả năng phân cắt phospholipid

dẫn tới mất ổn định màng và dễ dàng thâm nhập vào tế bào chủ. Gen pld gồm có 3303

bp (ORF), mã hóa 1100 axit amin. Vai trò của gen pld này được chứng minh đáng kể

trong quá trình xâm nhiễm vào trứng của Meloidogyne incognita bằng kỹ thuật RT-

PCR, sự biểu hiện của pld cao nhất là 36 giờ và 48 giờ, điều này đưa ra bằng chứng

cho thấy sự hiện diện của M. incognita có thể tạo ra biểu hiện của gen pld trong P.

lilacinum [191].

Trên đây là một số công trình nghiên cứu về cải biến di truyền ở các chi nấm

có khả năng diệt tuyến trùng. Tuy nhiên, quá trình chuyển gen đều sử dụng marker

chọn lọc là gen kháng kháng sinh, điều này ảnh hưởng đến môi trường sống, con

người và động vật. Việc sử dụng các marker trợ dưỡng cho quá trình chuyển gen đang

được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và cũng là nội dung mà luận án hướng

tới.

1.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG

TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM

1.4.1. Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne

Phòng bệnh bởi tuyến trùng gây ra sớm là phương pháp tối ưu nhằm tránh được

những thiệt hại lớn về kinh tế. Hiện nay, nông dân thường xử lý khi cây đã chớm biểu

hiện bệnh khi đó tuyến trùng đã xâm nhập và mức độ bệnh đã nặng nên rất khó chữa

trị hoặc mất nhiều thời gian và cây phục hồi cho năng suất thấp.

Có một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng như: Tuyển chọn ngay từ khâu chọn

giống như chọn cây khỏe, có khả năng kháng bệnh, biện pháp canh tác như vệ sinh

đồng ruộng, tưới ủ, phân bón (i) Vật lý: Đa số tuyến trùng không sống được ở nhiệt

độ 60 oC; vì vậy biện pháp xử lý nhiệt sẽ triệt để nhưng chi phí cao và thời gian dài

(ii) Hóa học: Biện pháp này cho hiệu quả cao nhưng gây ô nhiễm môi trường, độc hại

đối với người và động vật; (iii) Sinh học: mang lại hiệu quả lâu dài hướng tới môi

trường phát triển bền vững. Đối với biện pháp bằng vi sinh vật: sử dụng các chủng vi

nấm, vi khuẩn... sinh trưởng trong đất trồng và có khả năng diệt tuyến trùng [2].

Trên thị trường thế giới hiện nay, các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh tuyến

trùng được sử dụng phổ biến với hiệu quả tương đối ổn định và được trình bày ở Bảng

1.2.

Tên chế phẩm

Nấm

sợi đối

Dạng

Phòng trừ bệnh Phương

Công ty/Quốc gia sản

thương mại

kháng

chế

pháp sử

xuất

phẩm

dụng

Biocon

Paecilomyces

Nhiều

loại

Asiatic

lilacinus

dạng

bệnh

Technologies,

Inc/Philippines

Prophyta/Phillippine,

Bioact/Paecil Paecilomyces

Nước –

Rau, quả

Tưới nhỏ

Bayer,

giọt

lilacinus

Dạng

CropScience/United

hạt

States

Bảng 1.2. Các chế phẩm sinh học thương mại phòng trừ bệnh do tuyến trùng [107]

Thuốc lá, chuối,

PlPlus

Paecilomyces

Dạng

Tưới nhỏ

BCP/ Nam Phi

quả có múi

lilacinus

giọt

bột

PL Gold

Paecilomyces

Dạng

Chuối, Cà chua

BASF Worldwide/

lilacinus

Đức

bột

DiTera

Myrothecium

Dịch,

Rau, hoa quả,

Tưới nhỏ

Valent Biosciences

verrucaria

hạnh nhân

giọt

Corp./Canada

bột

Pochonia

Xianchongbi

Thuốc lá, điều,

Tưới nhỏ

Trường

đại

học

Bột

chlamydosporium

đậu nành, dưa

giọt

Yunnan/Trung Quốc

Nemix

Bacillus sp.

Bột

Rau, Cây ăn

AgriLife/Brazil

quả

Biostart

Hỗn

hợp

Dịch

Cà chua, Hồ

Tưới nhỏ

Bacillus spp.

tiêu, dâu tây

giọt

Các chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng hiện nay trên thế giới chủ yếu trong

thành phần là nấm sợi Paecilomyces lilacinus hoặc Pochonia chlamydosporia, vi

khuẩn Bacillus [110]. Ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ bệnh gây ra bởi

tuyến trùng còn gặp phải một số khó khăn đó là hiệu quả tương đối thấp và sự không

thống nhất trong quy trình chăm sóc [107].

Theo Soares (2006), sử dụng chế phẩm sinh học tiêu diệt tuyến trùng có nhiều

ưu điểm so với phòng trừ bằng thuốc hóa học bởi (i) Không để lại tác hại với môi

trường, (ii) Không để lại dư lượng trong các sản phẩm thu hoạch, (iii) Dễ sử dụng,

(iv) Không gây xuất hiện các dạng kháng tuyến trùng. Từ những ưu điểm trên, một

số nhà khoa học đã cố gắng tạo ra chế phẩm nấm diệt tuyến trùng nhằm sử dụng cho

mục đích thương mại và trong quá trình này đã đạt được một chút thành công [122].

Sự ra đời sản phẩm mang tính thương mại cần những điều kiện cần thiết để

xây dựng chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng. Theo Askary và cs., (2015) chế phẩm

sinh học nấm đối kháng tuyến trùng cần đạt được các yêu cầu sau [18]: (1) Khả năng

sống sót khi không có vật chủ, (2) Không đặc hiệu và có khả năng ký sinh trên nhiều

loài tuyến trùng, (3) Hiệu quả diệt tuyến trùng tốt, (4) Dễ dàng và kinh tế trong sản

xuất hàng loạt, (5) Thời hạn sử dụng dài, (6) Không độc hại đối với thực vật, con

người và các động vật khác, (7) Khả năng xâm nhập đất ngay sau khi ứng dụng, (8)

Tương thích với phân bón và hóa chất nông nghiệp khác.

Việc lựa chọn môi trường lên men, cũng như chủng giống đưa vào sản xuất

chế phẩm diệt tuyến trùng được quan tâm nghiên cứu từ lâu. Nấm Arthrobotrys

conoides, Paecilomyces lilacinus và Pochonia chlamydosporia là những chủng nấm

được cho là thích hợp trong cơ chất cám gạo. Các nghiên cứu đã sử dụng môi trường

nuôi cấy là PDA (Potato dextrose agar), PDA + peptone, CMA (agar bột ngô), bột

ngô + agar và YpSs (cao nấm men), PDA và YpSs và PSA (agar sucrose) để sản xuất

sinh khối nấm [51]. Trong quá trình nhân nuôi, một trong những điểm quan trọng

trong công thức sản xuất chế phẩm nấm diệt tuyến trùng hiệu quả là khả năng sống

và tính ổn định của chủng giống nhân. Soares và cs., (2006) đã nghiên cứu hàng loạt

các loại chất mang để đa dạng các thành phần trong công thức của nấm diệt tuyến

trùng [122]. Kết quả nghiên cứu đã đưa ra sự lựa chọn nguồn cơ chất cho nấm như

gạo tấm, cám gạo, trấu, phụ phẩm lên men bia, bã mía phù hợp cho điều kiện áp dụng

chế phẩm cũng như canh tác [18].

Một số kết quả nghiên cứu của Zhen Yu và cs., (2015) cho thấy tối ưu điều

kiện lên men P. lilacinus bằng phương pháp tối ưu bề mặt theo phương án cấu trúc

có tâm (response surface methodology – RSM), lượng bào tử P. lilacinus trong điều

kiện tối ưu hóa là 1010 CFU/ml. Sau khi lên men, nồng độ nhu cầu oxy của chất thải

thực phẩm đã giảm đáng kể 81,92%. Ngoài ra, việc đánh giá của chất thải thực phẩm

là phân bón sinh học cho thấy chất lượng đạt tiêu chuẩn phát hành bởi Bộ Nông

nghiệp Trung Quốc công bố. Hoạt tính protease và khả năng diệt khuẩn của P.

lilacinus được nuôi cấy bằng chất thải thực phẩm lần lượt cao hơn 10,8% và 27% so

với môi trường PDA [197]. Nghiên cứu Khasa và cs., (2017) đã lựa chọn các công

thức cho chế phẩm sao cho chủng nấm đạt được những yêu cầu ở trên. Quá trình lên

men nhân sinh khối nấm sợi được tối ưu nguồn C, chế phẩm có thể sử dụng các chất

nền là Talc, cám lúa mì vermiculite, chitosan, vỏ trấu [97].

1.4.2. Tình hình phòng trừ bệnh tuyến trùng cây hồ tiêu tại Việt Nam

Một trong những vấn đề lớn thường gặp đối với đa số hộ trồng hồ tiêu ở khu

vực Tây Nguyên là sử dụng nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật và tự ý tăng liều lượng.

Mục đích của người trồng hồ tiêu là mong muốn tăng cao năng suất nhưng họ lại

không quan tâm đến chất lượng sản phẩm. Đây cũng chính là nguyên nhân khiến cho

tình trạng hồ tiêu thành phẩm của nước ta xuất khẩu ra thị trường quốc tế có tồn dư

chất bảo vệ thực vật vượt quá giới hạn cho phép. Đa số các hộ trồng có diện tích nhỏ,

ít khi quan tâm đến chu trình canh tác lẫn phòng chống dịch bệnh và cách bón phân

cho cây hồ tiêu. Người trồng hồ tiêu chủ yếu xử lý theo hướng dẫn của người bán

phân bón, bán thuốc bảo vệ thực vật, không quan tâm đến việc bón phân hữu cơ cho

cây. Một số hộ chăn nuôi thì có sử dụng số lượng ít phân chuồng để bón còn lại chủ

yếu vẫn là sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Việc sử dụng thuốc hóa học đúng liều lượng

quy định chưa được tuyên truyền rộng rãi.

Trước tình hình gây hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu tại một số tỉnh Nam

Trung Bộ, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các tỉnh, Chi cục Bảo vệ thực

vật, trạm Bảo vệ thực vật các huyện thuộc địa bàn tỉnh đã hướng dẫn người trồng Hồ

tiêu ở những vùng bị tuyến trùng gây hại nặng, áp dụng một số biện pháp nhằm giảm

tác hại của tuyến trùng xuống mức thấp nhất. Hầu hết các biện pháp mà các Chi cục

Bảo vệ thực vật các tỉnh chỉ đạo người dân phòng bệnh là chính, điều tra phát hiện và

xử lý kịp thời. Áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp như (1) Không trồng xen với

các loại cây họ cà, ớt, làm sạch cỏ tăng cường bón phân hữu cơ ủ với men vi sinh

chứa nấm đối kháng, (2) Đào rãnh thoát nước xung quanh vườn, đặc biệt là đối với

những vườn hồ tiêu thoát nước kém, tránh ứ đọng nước trong bồn vào mùa mưa, (3)

Những vườn bị tuyến trùng cần hạn chế tưới tràn để tránh lây lan.

Biện pháp hóa học: sử dụng Maplogic 90WP, Palila 500WP, NoKaph 20EC,

Vimoca 10GR vào 3 lần (đầu, giữa và cuối mùa mưa) và một số hỗn hợp như Sincosin

0.56SL + Agrispon 0.56SL. Mặc dù vậy hiệu quả của các loại thuốc hóa học không

cao, những cây bị nhiễm tuyến trùng nặng thường phải nhổ bỏ.

Một số loại chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng đang sử dụng trên thị trường

Việt Nam hiện nay như: Tribac (có thành phần là chi Trichodesma sp.) dạng bột đóng

gói 1 kg; Tribi dạng dịch thể, Oligochitosan dạng dịch thể, GC Mite...

Đối với cây hồ tiêu trồng mới, một số biện pháp được áp dụng như sau:

+ Không trồng ở những loại đất có độ sét cao.

+ Đối với đất khai hoang: cần làm đất kỹ, rà sạch rễ, gốc cây sau đó tiến hành

trồng cây họ đậu để cải tạo đất từ 1-2 năm sau đó mới trồng.

+ Xử lý hố trước khi trồng 10-15 ngày, mỗi hố rải 300 g vôi bột, 30 g một số

thuốc hóa học như Nokaph 10G hoặc Furadan 3G rải đều trên mặt hố, kết hợp bón

phân hữu cơ hoai mục.

+ Chọn giống sạch sâu bệnh, không lấy giống ở vùng bị nhiễm tuyến trùng.

+ Trồng trên ụ cao để hom hồ tiêu không bị úng nước, thối rễ, che nắng hợp

lý trong mùa khô và trồng cây chắn gió xung quanh vườn.

Nhóm nghiên cứu của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã sản xuất, thử

nghiệm chế phẩm SH-BV1 gồm 6 loài vi sinh vật và tiến hành thử nghiệm trên đối

tượng cây hồ tiêu đang trong thời kỳ kinh doanh, 9 năm tuổi và 12 năm tuổi. Quy mô

thử nghiệm 1 ha/ 2 mô hình tại thôn 6, xã IaBlang, huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai. Thời

gian triển khai từ 2012 và thử nghiệm ba năm liên tục cho hiệu lực diệt tuyến trùng

từ 59,6 đến 82,98% [1].

Trong thời gian từ năm 2011 đến năm 2015, Chương trình Tây Nguyên 3, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Phát triển công nghệ cao chủ

trì thực hiện đề tài: "Nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số chế phẩm có nguồn

gốc sinh học trong canh tác chè, cà phê, hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại

Tây Nguyên". Nhóm nghiên cứu đã thu được những kết quả đối với cây Hồ tiêu: Đã

thực hiện mô hình thử nghiệm ứng dụng tổng hợp các sản phẩm sinh học cho cây Hồ

tiêu trên 2 ha thí nghiệm và 0,5 ha đối chứng tại thị trấn Nhơn Hòa huyện Chưpưh,

Gia Lai và 2 ha thí nghiệm và 0,5 ha đối chứng tại Phường Yên Thế, TP Pleiku, Gia

Lai trong 2 vụ từ năm 2013 đến 2015. Mô hình thay thế được phân chuồng bón lót

bằng phân hữu cơ được xử lý phế thải đồng rộng bằng chế phẩm Vixura, giảm 25%

lượng phân bón hóa học bằng việc bổ sung chế phẩm HOTIEU-HTD 03 và phun

thuốc SH-01 phòng chống sâu bệnh làm cho môi trường sinh thái đồng ruộng được

cải thiện. Sinh trưởng và năng suất ở các lô thí nghiệm cao hơn lô đối chứng từ 8,3

đến 10%. Tuy nhiên, chế phẩm SH-01 chưa đề cập đến hiệu lực và thời gian diệt

tuyến trùng.

Năm 2018, Nguyễn Thị Hai và cs., đã thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu quả gây

chết tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces

lilacinus từ chủng Paecilomyces lilacinus HT1 được phân lập từ đất vùng rễ của cây

Jatropha bị bệnh tuyến trùng Meloidogyne sp.” Nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm chế

phẩm sinh học dạng bột (liều lượng 30 kg/ha) từ chủng Paecilomyces lilacinus HT1

với mẫu đối chứng là thuốc vifu super 5GR (carbosulfan) và mẫu không sử dụng

thuốc diệt tuyến trùng với số lượng cây thử nghiệm là 12 cây/lô, tiến hành lặp lại 3

lần. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm không thấy đề cập đến lựa chọn cây hồ tiêu giống

nào, bao nhiêu tháng tuổi, điều kiện thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho hiệu lực

diệt tuyến trùng của chế phẩm sinh học là 73,67%, hiệu lực diệt của vifu super 5GR

là 70,08% sau 15 ngày thử nghiệm [6].

Tháng 8 năm 2019, theo tổng quan của Nguyễn Viết Vinh về nấm

Paecilomyces lilacinus và khả năng phòng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu, Paecilomyces

lilacinus có tác dụng kích thích sự phát triển của hồ tiêu dẫn tới tăng năng suất nhưng

chưa cụ thể là tăng bao nhiêu phần trăm, quy mô thử nghiệm, thời gian, địa điểm tiến

hành thử nghiệm (Nguồn: Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây hồ tiêu).

Mặc dù tiềm năng diệt tuyến trùng của chi Paecilomyces là rất lớn nhưng việc

nghiên cứu sử dụng chi này ở Việt Nam còn nhiều hạn chế. Việc tạo chế phẩm sinh

học từ nấm sợi và thử nghiệm hiệu quả diệt tuyến trùng nhằm làm tăng năng suất trên

cây hồ tiêu vẫn là vấn đề cấp thiết và luôn được các nhà khoa học quan tâm. Các

nghiên cứu gần đây như đã đề cập ở trên cho thấy hiệu quả diệt tuyến trùng cây hồ

tiêu của chế phẩm chưa cao, vì vậy việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm

sinh học nhằm tăng năng suất cây hồ tiêu là rất cần thiết.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu đất trồng hồ tiêu khu vực tỉnh Đăk Lăk: 15 mẫu theo TCVN 9017: 2011

– Phương pháp lấy mẫu trên vườn sản xuất.

Thời gian thu mẫu: tháng 3 năm 2016.

Vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu: E. coli DH5α, Agrobacterium

tumefaciens AGL1, Paecilomyces lilacinus CP1 được cung cấp bởi Phòng Genomic,

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Vector sử dụng cho quá trình chuyển gen: pEX2A được cung cấp bởi Phòng

Genomic, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Tuyến trùng Meloidogyne sp. được cung cấp bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên

Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam: sử dụng cho thử nghiệm

hoạt tính diệt tuyến trùng của ba chủng nấm sợi NV01, P1 và NV20.

Tuyến trùng Meloidogyne sp. được cung cấp bởi Trung tâm đấu tranh sinh học

– Viện Bảo vệ Thực vật: sử dụng cho thử nghiệm hoạt tính diệt tuyến trùng của thể

đột biến PE858 (do nguồn tuyến trùng thời điểm này sẵn có cho thử nghiệm).

Cây hồ tiêu: 3,5 tháng tuổi giống Vĩnh Linh - cung cấp bởi Công ty giống cây

Địa điểm tiến hành thử nghiệm quy mô nhà lưới: Xí nghiệp sản xuất phân bón trồng Đăk Lăk.

– Công ty Cổ phần Nicotex Đăk Lăk, xã EaNuôi, huyện Buôn Đôn, tỉnh Đăk Lăk.

Địa điểm tiến hành thử nghiệm quy mô đồng ruộng: Vườn Hồ tiêu thời kỳ kinh

doanh (từ 5 – 7 năm tuổi): diện tích khảo nghiệm 3 ha chia làm 3 khu, mỗi khu diện

tích 1 ha. Số trụ hồ tiêu trung bình 1800 trụ/ha, thuộc xã Eabar, huyện Buôn Đôn,

tỉnh Đăk Lăk.

2.1.2. Hóa chất

Các loại kháng sinh dùng cho nghiên cứu: Hygromycin B; Phleomycin;

Nourseothricin; Geneticin (G418); Kanamycin; Ampilixilin; Cefotaxime;

Acetosyringone AS (Merck).

Hóa chất sử dụng cho sinh học phân tử: các loại kít tinh sạch DNA (Thermo,

Pro MEGA, Intron); enzym Phusion®; pJET 1.2/blunt – Cat. Nos. K1231 (Thermo).

Casein (Merck); chitin (Biobasic); CMA (Merck); PDA (Merck); 5 – fluoroorotic axit

(5-FOA) (Merck); Uridine (Merck); Uracil (Merck).

Các cặp mồi được thiết kế hoặc tham khảo, sau đó được gửi đi tổng hợp bởi

công ty Sinh hóa Phù sa và công ty IDT (Integrated DNA Technologies), Singapore.

Từ dạng bột đông khô ban đầu, mồi được pha trong nước khử ion vô trùng đến nồng

độ sử dụng là 10 pmol. Các cặp mồi được liệt kê ở phụ lục 1.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị sinh học phân tử thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

Enzyme và Protein - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội:

PCR (Thermo), máy soi gel (Bio – Rad), máy biến nạp bằng xung điện (Bio – Rad),

máy ly tâm các loại (Effendoft), Thiết bị nano-drop ONE (Thermo), máy cố định gel

(Vilber – Pháp), thiết bị quang phổ (Thermo), Kính hiển vi Zeiss (huỳnh quang và soi

nổi).

Các thiết bị thuộc Phòng Công nghệ lên men/Viện Công nghệ sinh học: thiết

bị lên men Bioflo 500.

Kính hiển vi Olympus CX 51 và máy ảnh Canon G10/ Trung tâm đấu tranh

sinh học/ Viện Bảo vệ Thực vật.

Thiết bị thuộc Phòng Công nghệ sinh học enzyme/Viện Công nghệ sinh học:

bể ổn nhiệt, bộ điện di đứng (Bio-Rad), bể ổn nhiệt (Trung Quốc) …

Thiết bị thuộc Phân viện Công nghệ sinh học/Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga:

tủ nuôi cấy ổn nhiệt Biosan (Trung Quốc); tủ khử trùng khô (Sanyo), tủ lạnh 4 oC…

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thứ tự nghiên cứu của luận án được trình bày theo sơ đồ ở Hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập và quan sát hình thái

Pha loãng mẫu đất: để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc

mạnh dịch đã pha loãng. Pha loãng với mỗi nồng độ kế tiếp giảm 10 lần. Sử dụng các

bình tam giác 250 ml chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng. Ghi ký hiệu trên các

bình tam giác theo thứ tự (-1), (-2)… Cân 10 g mẫu đất trồng hồ tiêu đưa vào bình

tam giác có sẵn 90 ml nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều trên máy lắc 250 v/phút

trong thời gian 30 phút. Lấy 10 ml ở bình 1 đưa sang bình thứ 2. Ta có độ pha loãng

100 lần. Chuẩn bị các đĩa Petri chứa môi trường PDA (Potato Dextro Agar): với mỗi

nồng độ chuẩn bị 3 đĩa. Hút dịch pha loãng từ bình tam giác ở trên vào các đĩa Petri

đã chuẩn bị, cấy trải đều mặt thạch. Ủ các đĩa đã cấy ở nhiệt độ 28 oC ± 2 oC, trong

thời gian từ 5-7 ngày. Quan sát khuẩn lạc các tế bào nấm trên đĩa.

Phương pháp bẫy du động bào tử bằng cánh hoa hồng (Erwin và Riberrio,

1996) [58].

Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Các chủng phân lập được cấy chuyền trên ống thạch nghiêng có môi trường

PDA và nuôi ở nhiệt độ 28 oC – 30 oC thời gian 3 - 5 ngày, sau đó bảo quản ở nhiệt

độ 4oC. Thời gian cấy chuyền lại đối với nấm sợi là 3 – 6 tháng [180].

Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi

Quan sát đại thể: cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày đưa 3-5 ml

nước cất vô trùng vào ống. Dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử nấm sợi trong ống

nghiệm rồi nhúng nhẹ vào dịch nấm đưa vào môi trường đĩa thạch PDA. Quan sát

từng ngày khuẩn lạc về các đặc điểm sau: Tốc độ phát triển của khuẩn lạc, màu sắc

và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc, hình dạng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc và sợi

nấm, giọt tiết (nếu có), sắc tố tiết vào môi trường.

Quan sát vi thể: Chuẩn bị sẵn các lam kính, la men. Dùng kim mũi mác vô

trùng cắt lấy một miếng thạch từ đĩa chứa khuẩn lạc (1 x 1 cm) đặt lên lam kính đưa

vào đĩa Petri vô trùng. Dùng que cấy vô trùng lấy nhẹ nhàng bào tử nấm sợi từ ống

nghiệm chấm vào mép của miếng thạch trên lam kính, đậy lamen. Sau ba ngày nuôi

cấy, đưa tiêu bản quan sát trên kính hiển vi về đặc điểm: cấu trúc hệ sợi nấm (có hay

không có vách ngăn), cấu trúc cuống sinh bào tử, thể bình, hình dạng và cách sắp xếp

bào tử.

Đánh giá khả năng phân nhánh của hệ sợi: cấy ria trên đĩa có chứa môi trường

CDA 5 µl dịch bào tử (105 bào tử/ml), nuôi cấy 30 oC. Sau 3 ngày, quan sát sự phân

nhánh hệ sợi dưới kính hiển vi điện tử.

Nghiên cứu khả năng nảy mầm của bào tử: Nhỏ 10 µl dịch bào tử (105 bào

tử/ml) của chủng nấm sợi cần nghiên cứu trải đều lên lam kính có phủ 1 lớp môi

trường CDA. Nuôi bào tử ở các nhiệt độ 25 oC, 30 oC. Sau 12 giờ nuôi cấy xác định

khả năng nảy mầm của bào tử dưới kính hiển vi. Tỷ lệ bào tử nảy mầm của mỗi chủng

nấm được xác định bằng số lượng tối thiểu của 100 bào tử từ mỗi lam kính (tiến hành

lặp lại 3 lần). Bào tử được xác định là nảy mầm khi nó xuất hiện một ống mầm với

chiều dài tối thiểu bằng một nửa bào tử.

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu enzym/protein

Chuẩn bị dịch huyền phù chitin theo Cańtizares (2001) [33] cụ thể như sau: 5

g chitin bổ sung 50 ml axit HCl nguyên chất, lắc trong 30 phút sao cho chitin tan

thành dịch trong. Thêm 250 ml nước cất ở 4oC để chitin tủa, ly tâm tủa và rửa tủa 2

đến 3 lần bằng nước cất. Dịch huyền phù chitin được điều chỉnh pH 7,0 với NaOH

8N. Rửa tủa và bảo quản lạnh.

Phương pháp định tính chitinase: được định tính bằng phương pháp khuyếch

tán trên thạch.

Xác định hoạt tính chitinase: Bằng phương pháp tạo phản ứng màu với DNSA

(3,5-Dinitrosalicylic axit) theo Miller 1959 [128]. Nguyên tắc: dựa trên sự thủy phân

huyền phù bằng chitinase sau đó bất hoạt enzym và tạo phản ứng màu bằng DNSA.

Lượng đường N-acetylglucosamine tạo ra được xác định bằng phương pháp đo hấp

thụ ở bước sóng 540 nm dựa vào cường độ màu tạo ra bởi phức với thuốc thử. Tính

lượng sản phẩm tương ứng do enzym xúc tác dựa trên đồ thị đường chuẩn.

Tiến hành đo: đưa 0,6 ml cơ chất chitin huyền phù 0,5% trong đệm

natriphotphat pH 7,0 vào ống eppendoft 2,0 ml, thêm 0,15 ml dịch enzym. Hỗn hợp

được lắc đều và ủ ở 37 oC trong 30 phút. Dừng phản ứng bằng 1ml DNSA và đun sôi

trong 10 phút. Để lạnh, ly tâm 8 000 vòng trong 5 phút loại bỏ chitin không tan và so

màu ở bước sóng 540 nm.

Ống đối chứng: Hút 0,6 ml cơ chất chitin huyền phù, thêm 0,15 ml nước cất.

Sau 30 phút bổ sung 1 ml DNSA và tiến hành đo như ống thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm

lặp lại 03 lần.

Dựng đường chuẩn: N-acetyl glucosamine được pha trong đệm Natriacetat

100 mM pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10 – 100 μg/ml (mỗi bước nhảy

là 10 μg/ml). Dung dịch được đo ở bước sóng 540 nm. Độ hấp phụ và nồng độ N-

acetyl glucosamine được xử lý bằng phần mềm Excel. Kết quả cho thấy, đường chuẩn

tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 10 – 100 μg/ml. Đường chuẩn có phương trình

y= 0,001x + 0,041. Trong đó: y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 540 nm, x là nồng

độ N-acetyl glucosamine (μg/ml) (Phụ lục 1).

Xác định hoạt tính protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến

[48]: Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình

thủy phân cơ chất casein của protease bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Hỗn

hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzym và dung dịch casein 2,0 %, tỷ lệ 1:2

(v/v) được ủ ở 30 oC trong 10 phút, ngưng phản ứng bằng dung dịch tricloacetic axit

(TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch acid cho 1 thể tích enzym, ly tâm thu dịch

nổi để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ

lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Thực hiện đồng thời mẫu kiểm

tra bằng cách cho dung dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ

ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo trên máy quang

phổ kế ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine y = 0,909 x + 0,0184 để

tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt tính

protease (HP) được định nghĩa là lượng enzym mà trong một phút ở 30 oC có khả

năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong tricloacetic axit, cho

phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine (Phụ lục 1)

Phương pháp tinh sạch chitinase: 100 ml dung dịch enzym sau khi ly tâm ở

10000 vòng/phút trong vòng 10 phút được tủa bằng (NH4)2SO4 bão hòa nồng độ 65%

ở 4 oC trong thời gian 4 giờ. Ly tâm 10000 v/phút để loại muối, tủa được hòa với 10

ml đệm natri photphat 50 mM pH 7,0 và đưa vào túi thẩm tích loại muối trong thời

gian 12 giờ. Dịch tủa sau khi loại muối (9 ml) được đưa qua cột sắc ký trao đổi ion

DEAE-Sephadex A-50 (2,6 x 60 cm) đã được cân bằng với 200 ml đệm Tris-HCl 50

mM, pH 7,0, tốc độ chảy là 30 ml/giờ (10 giọt/phút) [24]. Protein được thu lại với

đệm Tris-HCl 50 mM pH 7,0 có chứa NaCl ở nồng độ 0,5M. Thể tích mỗi phân đoạn

là 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn,

sau đó điện di trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra độ tinh sạch.

2.2.3. Phương pháp điện di trên Gel polyacrylamid (SDS-PAGE)

Nguyên tắc: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein

polyacrylamide với nồng độ 12,5% theo phương pháp điện di biến tính theo Laemmli

U.K., (1970) [104]. Thành phần gel được trình bày ở Bảng 2.1. Bản điện di được lắp

vào hệ thống điện di và chạy với cường độ dòng điện 30 mA cho lớp gel cô và 50 mA

cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel được nhấc khỏi phiến kính và

nhuộm bằng Coomasie R. Công thức pha 100 ml EtOH 95% (V/v), 350 mg Serva

Blue G, 200 ml H3PO4 (88%). Thời gian nhuộm bản gel là 24 giờ trên máy lắc với

tốc độ 50 - 70 v/phút.

Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách

Thành phần Gel tách (μl) Gel cô (μl)

1940 1180 H2O

Dung dịch A 1500 0

Dung dịch B 0 500

Dung dịch C 2500 300

Dung dịch D 60 20

APS (10%) 24 10

TEMED 7 5

Tổng 6031 2015

Sau khi nhuộm xong, gel được tẩy với dung dịch axit axetic (10%) và methanol

(30%). Sau khi tẩy nhuộm, các protein dưới dạng monomer tinh sạch xuất hiện một

băng duy nhất.

Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số theo Bradford [26]: dựa trên

nguyên tắc các protein khi phản ứng với Coomassie Brillant Blue G-250 sẽ hình thành

phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường

độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số

được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Phụ

lục 1).

2.2.4. Tách chiết DNA hệ gen và phản ứng PCR

Tách DNA hệ gen từ sợi nấm của P1, NV01, NV20: Tế bào nấm được nuôi

cấy trong 100 ml môi trường PDA dịch thể ở 28 oC ± 2 oC, trên máy lắc với tốc độ

200 vòng/phút. Thu 0,2 g hệ sợi vào ống eppendorf vô trùng 2 ml và sử dụng hạt thủy

tinh để nghiền sợi. Bổ sung 600 µl đệm chiết GX và 3 µl proteinase K vào ống chứa

mẫu, vortex 10 -15 giây và ủ mẫu ở 60 oC trong thời gian 30 phút. Sau đó, bổ sung

oC, 12000 vòng/phút trong 20 phút. Chuyển toàn bộ phần dịch nổi sang ống eppendorf

thêm 300 µl natri acetate 3M pH 5,2 vào ống chứa mẫu và tiến hành ly tâm lạnh ở 4

1,5 ml mới, bổ sung thêm isopropanol lạnh với thể tích tương đương để kết tủa DNA

và tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC. Giữ lại phần tủa trong ống

eppendoft, thêm 700 µl ethanol 70% vào ống ly tâm lạnh ở 4 oC, 12000 vòng/phút

trong 5 phút để rửa phần tủa. Đổ bỏ dịch nổi, làm khô mẫu bằng máy cô quay

(Eppendoft). Bổ sung 50 µl đệm TE 1x để hòa tan và bảo quản DNA. Loại bỏ RNA

có trong mẫu bằng cách ủ mẫu ở 60 oC trong 30 phút sau khi bổ sung 3 µl RNAse (1

mg/ml) [136].

Nhân bản gen bằng phản ứng PCR

Trình tự đoạn DNA một số được lấy từ cơ sở dữ liệu của ngân hàng GenBank,

sử dụng các cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế trên phần mềm Primer3 và được

tổng hợp bởi công ty IDT (Singapore) (Phụ lục 1), riêng đoạn ITS1– 5,8s – ITS2 sử

dụng mồi Universal. Do trình tự DNA của vùng sao chép nội bộ ITS (Internal

Transcribed Spacer) của rDNA của các loài nấm vừa có trình tự bảo thủ vừa có các

trình tự thay đổi nên các vùng ITS này đã được nghiên cứu để lập cây phân loại của

nhiều loài nấm [42]. Các đoạn DNA được PCR từ DNA hệ gen sử dụng enzym

Phusion® high-fidelity DNA polymerase của hãng Thermo Scientific. Khuôn DNA

(50 – 100 ng/µl). Thành phần phản ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen:

5X HF buffer : 5 µl

dNTPs (16 mM cho 4 loại nu) : 1 µl

Mồi xuôi (10 pmol) : 1 µl

Mồi ngược (10 pmol) : 1 µl

Phusion polymerase : 1 µl

Khuôn DNA : 1 µl

Nước khử ion vô trùng : 15 µl

Tổng thể tích phản ứng : 25 µl

Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 - chu trình gia nhiệt như sau: 94 oC – 6

phút; 94 oC – 30 giây; 55 oC – 30 giây; 72 oC – 40 giây với 35 chu trình. 72 oC - 10

phút.

Phản ứng PCR với cặp mồi Chi-PF1/Chi-PR1(1st Base) – chu trình gia nhiệt

như sau: 95 oC – 3 phút; 95 oC – 30 giây; 55 oC – 30 giây; 72 oC – 1 phút với 35 chu

trình, 72 oC trong 10 phút.

Điện di agarose: Điện di agarose được thực hiện trên gel agarose 1% pha trong

đệm 1 x TAE. Đun nóng agarose cho tan hoàn toàn, để nguội xuống khoảng 50 oC,

đổ vào khay điện di đã cài lược sẵn. Để 30 phút cho gel ổn định, đặt vào buồng điện

di và tra mẫu. Điện di trong 30 phút với hiệu điện thế 90 V. Bản gel được nhuộm

trong ethidium bromide khoảng 5 - 15 phút, soi dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm.

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA của hãng Promega theo

hướng dẫn của nhà sản xuất, trình tự nucleotid được so sánh trên

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ với phần mềm Bioedit và Clustal Omega.

2.2.5. Phản ứng nối ghép gen

Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR (50 - 100 ng/µl) vào vector pJET 1.2

(Thermo) được thực hiện theo protocol của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng:

2x reaction buffer 5 µl :

T4 DNA ligase 0,5 µl :

Sản phẩm PCR 1 µl :

Vector cloneJET1.2 0,5 µl :

3 µl : H2O (đi kèm pJET)

Tổng thể tích phản ứng : 10 µl

Phản ứng được thực hiện ở 22 oC trong thời gian 60 phút.

2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α

Quá trình biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.

Quá trình biến nạp diễn ra như sau: ống chứa tế bào khả biến E. coli DH5α được giữ

trên nước đá 5-10 phút cho tới khi rã đông. Hút hỗn hợp ghép nối gen vào ống tế bào

oC và ủ trên đá 2 phút. Bổ sung 800 µl LB lỏng và ống được lắc 1 giờ ở 37 oC tốc độ

khả biến, làm đều ống bằng pipet và ủ trên đá 20 phút. Sau đó sốc nhiệt 40 giây ở 42

lắc 200 v/phút. Dịch biến nạp được ly tâm 8000 vòng trong thời gian 30 giây. Thu

tủa, cấy trải sinh khối vi khuẩn trên môi trường LB có bổ sung ampilixilin (100 µg/ml)

ở 37 oC trong thời gian 12 giờ hoặc qua đêm.

2.2.7. Tách DNA plasmid

Tế bào vi khuẩn được nuôi trong bình tam giác 100 ml với thể tích lắc 20 ml,

môi trường LB lỏng bổ sung ampilixilin (100 µg/ml) nhiệt độ 37 oC, với tốc độ 200

vòng/phút, thời gian nuôi cấy qua đêm (12 – 15 giờ). Dịch nuôi cấy được ly tâm 8000

vòng/phút trong 5 phút. Plasmid được tách theo kit của hãng Promega. Sản phẩm

được bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh hoặc ở (- 30 oC). Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 0,7%.

2.2.8. Đánh giá khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5 – FOA của chủng

P. lilacinus P1

Tiến hành kiểm tra khả năng mẫn cảm của nấm với kháng sinh hygromycin

(Hyg), nourseothricin (Nat), phleomycin (Phleo) và geneticin (G418): Cả bốn loại

kháng sinh này đều được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen [132, 148].

Nhỏ 10 µl dịch bào tử chủng nấm sợi lên môi trường CDA (pH 7) chứa kháng sinh

oC ± 2 oC trong 96 – 120 giờ, quan sát sự sinh trưởng của nấm. 5-FOA được bổ sung

như ở trên với các nồng độ 600 mg/l, 800 mg/l, 1000 mg/l. Đĩa nuôi cấy được ủ ở 28

vào môi trường CDA với nồng độ từ 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml. Thí nghiệm được

lặp lại 3 lần, đĩa đối chứng được nhỏ dịch bào tử lên môi trường CDA không bổ sung

kháng sinh hoặc 5-FOA.

2.2.9. Phương pháp thu bào tử và hệ sợi nấm P. lilacinus P1

P. lilacinus P1 được nuôi cấy trên môi trường PDA, ở nhiệt độ 28 oC ± 2 oC,

sau 7 ngày nuôi cấy, tiến hành thu hoạch bào tử từ bề mặt của đĩa nấm bằng cách bổ

sung 12 ml dung dịch 0,05% Tween 80 vào đĩa nấm, dùng que chang đánh đều cho

bào tử trên đĩa nấm tách ra khỏi sợi nấm và khuếch tán đều vào trong nước cất. Sử

dụng màng lọc Miracloth (22-25 µm) (Calbiochem, Đức) và thu dịch bào tử nấm vào

ống falcol [135]. Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút, rửa lại bào tử bằng nước cất 3 – 5

lần. Dịch bào tử nấm được xác định bằng buồng đếm Thoma theo công thức:

Số lượng bào tử của nấm được tính theo công thức: X = 5 . a. f . 104

Trong đó: X là số bào tử trong 1 ml dịch bào tử

a: số bào tử trung bình trong 5 ô lớn

5a: số bào tử trung bình trong 25 ô lớn

f: hệ số pha loãng

2.2.10. Phương pháp tạo chủng đột biến gen pyrG bằng UV sử dụng môi

trường chọn lọc 5-fluoroorotic axit (5-FOA) từ chủng P. lilacinus P1

Với nguyên lý là đối với chủng tự nhiên (ký hiệu WT) hoạt động của enzym

OMP mã hóa bởi gen pyrG sẽ chuyển hóa hợp chất 5-FOA không độc thành chất gây

độc tế bào là 5-fluorouracil, vì vậy làm tế bào chết trên môi trường có bổ sung 5-

FOA. Ngược lại, các chủng bị đột biến sai hỏng gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa

hợp chất 5-FOA. Chính vì vậy 5-FOA thường được bổ sung vào môi trường trong

quá trình chọn lọc các chủng vi nấm đột biến hỏng hoặc mất gen pyrG [23].

Đưa 100 µl dịch bào tử P. lilacinus P1 (1 x 106) vào đĩa Petri có chứa 20 ml

môi trường CDA có bổ sung 0,2% uridine, uracil và 0,2% 5-FOA (được hòa tan trong

dimethyl sulfoxide DMSO). Gạt đều trên đĩa sao cho bào tử dàn đều. Xử lý với UV

ở bước sóng 254 nm, khoảng cách chiếu từ đèn chiếu đến bề mặt đĩa là 10 cm trên

máy cố định gen Vilber Lourmat (Pháp), thời gian chiếu (giây) theo thứ tự: 6, 12, 18,

24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, khi chiếu mở nắp đĩa Petri. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

trong mỗi thời gian chiếu.

Các đĩa Petri được nuôi cấy ở nhiệt độ 28 oC, trong điều kiện không có ánh

sáng, thời gian nuôi cấy từ 3 – 5 ngày. Các khuẩn lạc đột biến được xác nhận lại trên

môi trường CDA tối thiểu và CD có bổ sung 0,2% uridine, uracil và 5-FOA. Lựa

chọn những khuẩn lạc sinh trưởng tốt trên môi trường CD có bổ sung uridine, uracil

và 5-FOA nhưng không sinh trưởng trên CD tối thiểu. Cấy chuyển qua 5 thế hệ liên

tiếp đồng thời quan sát hình thái khuẩn lạc. Lựa chọn thể đột biến có hình thái khuẩn

lạc tương tự chủng P1 tự nhiên. Những thể đột biến sai hỏng gen pyrG được gọi là

pyrG(-).

2.2.11. Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium

tumefaciens

2.2.11.1. Biến nạp vector pEX2A vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1

Chủng AGL1 là chủng vi khuẩn đã được cải biến di truyền từ chủng A.

tumefaciens AGL0. Hệ gen của chủng AGL1 đã được loại bỏ đi vùng chứa các gen

gây khối u, nhờ đó tạo điều kiện cho việc phát triển các vector nhị thể chứa vùng gen

thay thế mong muốn. Vector pEX2A được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens

AGL1 bằng phương pháp xung điện [141] bao gồm các bước sau: (1) Chuẩn bị tế bào

A. tumefaciens AGL1 khả biến: chọn 1 khuẩn lạc đơn vi khuẩn AGL1 trong đĩa cấy

sang bình tam giác có chứa 50 ml LB dịch thể (bổ sung kanamycin nồng độ 100 mg/L,

tốc độ lắc 200 v/phút, 28 oC trong 15-18 giờ. (2) Ly tâm dịch nuôi 5000 vòng/phút ở

4 oC thời gian 10 phút. (3) Thu tủa và rửa tủa bằng dung dịch HEPES 100 mM và

một lần bằng dung dịch glycerol 10%. (4) Ly tâm dung dịch ở nhiệt độ 4 oC, 4000

v/phút trong thời gian 10 phút và đổ bỏ dịch sau mỗi lần rửa. (5) Hòa cặn tế bào trong

1 ml glycerol 10% sau đó chia vào các ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 50 µl. (6) Các

ống chứa tế bào AGL1 khả biến được bảo quản trong tủ (-30 oC) hoặc có thể sử dụng

ngay để biến nạp bằng xung điện. Quy trình biến nạp: Vector được biến nạp vào

chủng A. tumefaciens AGL1 bằng phương pháp xung điện. Trộn 0,5 µl vector vào

ống chứa 50 µl tế bào A. tumefaciens AGL1 khả biến. Hút toàn bộ dịch chuyển vào

cuvet 2 mm và đặt trên nước đá. Biến nạp bằng xung điện sử dụng máy chuyển gen

xung điện Bio-Rad với các thông số của chương trình là 2,5 kV; 400 Ω; 25 µF, cuvet

2 mm. Sau khi bắn xung điện, hỗn hợp được chuyển sang ống eppendorf 2 ml và bổ

sung thêm 500 µl môi trường LB lỏng và lắc 1 giờ ở 28 oC, tốc độ lắc 200 v/phút

(tránh lắc với tốc độ 250 – 300 v/phút gây chết tế bào). Thu tế bào vi khuẩn bằng ly

tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây, đổ bỏ dịch, hòa tế bào vào phần dịch còn

lại và cấy trải trên môi trường LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa nuôi

cấy được ủ ở 28 oC trong 72 giờ để thu nhận các khuẩn lạc riêng rẽ. Các khuẩn lạc

sau đó được kiểm tra bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng với các gen

có mặt trong vector (Phụ lục 1).

2.2.11.2. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ở thể đột biến

424pyrG(-)

Vector pEX2A được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng

phương pháp xung điện. Chủng AGL1 mang vector pEX2A sẽ được chuyển vào thể

đột biến 424pyrG(-). Tối ưu quy trình chuyển gen vào các loài nấm sợi đã được các

nhà khoa học công bố trước đây [44, 109, 133, 136].

A. tumerfaciens AGL1 mang gen chỉ thị DsRed sau đó được nuôi cấy trong

môi trường lỏng LB chứa kanamycin 100 µg/ml, nhiệt độ nuôi cấy 28 oC, tốc độ lắc

200 vòng/phút. Hỗn hợp IM lỏng (được bổ sung 200 µM acetosyringone (AS): dịch

vi khuẩn nuôi cấy ở trên theo tỷ lệ: 1: 9 được nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 28oC, tốc độ lắc

200 vòng/phút, thời gian nuôi cấy 6 h, trong điều kiện tránh ánh sáng để OD đo ở

bước sóng 600 nm đạt 0,8 là đạt yêu cầu chuyển gen. Một hỗn hợp bao gồm 100 μl

môi trường nuôi cấy A. tumefaciens trộn với 100 μl huyền phù bào tử nấm (105, 106

hoặc 107 bào tử/ml) đã được lọc trên giấy lọc, mã: FT-3-303-090 (Sartorius,

Göttingen , Đức), đặt trên đĩa thạch IM có bổ sung 0,005% uridine hoặc 0,005% uracil

hoặc 0,001% uridine hoặc 0,001% uracil chứa AS (100, 200, 300 µM).

Các điều kiện tối ưu được lựa chọn như sau: khoảng thời gian đồng nuôi cấy

khác nhau (48, 60, 72 giờ) và nhiệt độ đồng nuôi cấy khác nhau (20, 22, 25 °C) đã

được thử nghiệm. Các màng lọc được chuyển vào các đĩa CDA được bổ sung

cefotaxime (300 g/ml) để lựa chọn các thể chuyển gen đồng thời loại bỏ các tế bào

Agrobacterium. Các màng được ủ ở nhiệt độ 25 oC đến 28 °C trong thời gian từ 4 đến

5 ngày. Sau đó các khuẩn lạc nấm xuất hiện trên đĩa môi trường chọn lọc, quan sát sự

sinh trưởng và đếm các khuẩn lạc.

Quy trình chuyển gen huỳnh quang DsRed vào thể đột biến 424pyrG(-) bằng

A. tumefaciens AGL1 được thực hiện theo các bước sau (1) Nuôi cấy lắc 200 v/phút

A. tumefaciens AGL1 (đã biến nạp vector PEX2A) trên môi trường LB có bổ sung

kanamycin (100 µg/ml) ở 28 oC, (2) Lắc A. tumefaciens AGL1 trên môi trường IM

có bổ sung AS (100 µg/ml) ở 25 oC – 28 oC trong 6 giờ, 200 v/phút. Đo OD ở bước

sóng 600 nm trước và sau khi nuôi cấy, (3) Trộn đều dịch bào tử và dịch nuôi cấy, đo

OD ở 600 nm, (4) Đưa màng lọc vào đĩa Petri chứa IM 0,001% uracil hoặc 0,001%

uridine, 0,005% uracil, 0,005% uridine, có bổ sung AS với nồng độ 100 – 300 µM),

hút 200 µL trải đều lên màng, (5) Quá trình đồng nuôi cấy trong thời gian 48, 60, 72

giờ (tùy thuộc), nhiệt độ đồng nuôi cấy 20 oC hoặc 22 oC hoặc 25 oC, (6) Sau thời

oC ± 2 oC, thời gian từ 3 đến 5 ngày, (7) Những khuẩn lạc mọc được trên CDA tối

gian đồng nuôi cấy, chuyển màng sang môi trường CDA và nuôi cấy ở nhiệt độ 28

thiểu là những thể chuyển gen đã nhận được gen, làm sạch khuẩn lạc, lưu giữ các thể

chuyển gen.

2.2.11.3. Xác nhận biểu hiện gen DsRed của các thể chuyển gen

Các thể chuyển gen mọc trên môi trường CDA tối thiểu bằng cách phân lập từ

bào tử đơn trong năm thế hệ kế tiếp để kiểm tra sự ổn định của quá trình phân bào.

Những chủng này sau đó được nuôi cấy trong môi trường CD dịch thể để thu hệ sợi

và tách DNA hệ gen. Sự tích hợp T-DNA vào hệ gen của các thể chuyển gen đã được

xác định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen DsRed và AnpyrG_ORF,

sử dụng GoTaq Green Master Mix (Promega, USA). Để kiểm tra biểu hiện gen huỳnh

quang, các thể chuyển gen được nuôi trên một phiến kính vô trùng có chứa một giọt

môi trường CDA, sau đó được phủ bằng lamen trên môi trường thạch, mẫu được ép

nhẹ nhàng. Lam kính được đưa vào nuôi cấy trên đĩa Petri vô trùng có chứa một số

mảnh giấy đã được làm ướt trong 48 giờ, ở 30 oC. Lam kính nuôi cấy được quan sát

dưới kính hiển vi huỳnh quang Axioplan (Carl Zeiss, Đức) tín hiệu cho huỳnh quang

đỏ.

2.2.11.4. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease ngoại bào,

khả năng diệt tuyến trùng của các thể chuyển gen.

Năm trăm thể chuyển gen được tiến hành sàng lọc, nghiên cứu khả năng sinh

tổng hợp chitinase và protease ngoại bào và khả năng diệt tuyến trùng.

2.2.12. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp

chitinase của P. lilacinus P1

Nhân giống: Từ ống nghiệm giữ giống, P. lilacinus P1 được cấy chuyển sang

ống nghiệm chứa môi trường CDA thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày. Giống được cấy

vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (200 v/phút), ở nhiệt độ 28 oC ± 2 oC trong 48

giờ (giống cấp 1).

Lên men P. lilacinus P1 được thực hiện trong bình tam giác 500 ml chứa thể

tích 100 ml chất lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút bổ sung 5% giống (v/v). Nghiên

cứu các yếu tố bao gồm tỷ lệ chitin, glucose, pepton, K2HPO4, Ca2+/Mg2+. Sau 96 giờ

lên men, xác định hoạt tính chitinase. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần và

được tính giá trị trung bình.

Khảo sát nguồn nitơ và carbon trong môi trường lên men thu nhận chitinase

bổ sung 0,75% chitin cơ chất. Khi nghiên cứu các nguồn carbon, sử dụng nguồn nitơ

là 0,5% pepton, thay đổi nguồn carbon với nồng độ 0,5% lần lượt: glucose, maltose,

saccarose, lactose, galactose, mannose. Khảo sát nguồn nitơ khi sử dụng nguồn

carbon là 2% glucose, thay đổi nguồn nitơ theo pepton, cao thịt, (NH4)2SO4, KNO3,

NaNO3 với nồng độ 0,5%. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần.

Điều kiện nuôi cấy P. lilacinus P1 sinh tổng hợp chitinase được khảo sát lần

lượt trong các thí nghiệm. Yếu tố khảo sát ở thí nghiệm trước được sử dụng cho thí

nghiệm sau.

2.2.12.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Xác định hàm lượng tối ưu của 5 yếu tố ảnh hưởng là A (huyền phù chitin), B

(glucose) , C (Pepton), D (KH2PO4), E (tỷ lệ Mg2+/Ca2+) bằng cách sử dụng quy hoạch

trực giao đối xứng. Hàm đáp ứng được chọn là hoạt tính chitinase (U/ml dịch lên

men). Các nghiên cứu tối ưu được tiến hành với thể tích dịch môi trường 50 ml trong

bình tam giác dung tích 250 ml ở 28 °C, pH 5,0, trên máy lắc với tốc độ 200

vòng/phút.

2.2.12.2. Sàng lọc các yếu tố bằng ma trận Plakett – Burman

Thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman (1946) [146] để sàng

lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase (U/ml). Kết quả nghiên

cứu giúp chúng ta xác định được các yếu tố quan trọng có ảnh hưởng trực tiếp tới

hàm mục tiêu và loại bỏ những yếu tố ảnh hưởng không đáng kể.

Bảng 2.2. Thiết kế các biến bằng ma trận Plackett-Burman

Yếu tố Thành phần Level

môi trường (+ 1) (0) (-1)

Chitin (%) 1,0 0,75 0,5 A

Glucose (%) 3,0 2,0 1,0 B

Pepton (%) 0,7 0,5 0,3 C

0,1 0,06 0,01 K2HPO4 (%) D

Ca2+/Mg2+ (g/g) 1,25 0,75 0,25 E

Ma trận Plakett – Burman được thiết kế dựa vào tâm thí nghiệm của 5 yếu tố

ở thí nghiệm khảo sát. Ma trận được thiết kế với mức thấp (-1) mức trung bình (điểm

0) và mức cao (+1) với α = 1,25 của từng yếu tố tương ứng với phạm vi khảo sát được

thực hiện trong thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố bao gồm 63 thí nghiệm để sàng lọc ra

các yếu tố ảnh hưởng chính đến hoạt tính chitinase. Các yếu tố có độ tin cậy cao (p<

0,05) sẽ được đưa vào mô hình tối ưu hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặt theo cấu

trúc có tâm (RSM – CCD).

2.2.12.3. Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface

Methodology - RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng là một kỹ thuật mô hình thực nghiệm được sử

dụng để đánh giá mối quan hệ giữa một tập hợp của các yếu tố thử nghiệm kiểm soát.

Dựa trên kết quả kiểm tra biến, mô hình kiểm tra các biến thử nghiệm cần thiết cho

hoạt tính chitinase tối ưu bằng cách sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng. Sử dụng

kỹ thuật mô hình thống kê thực nghiệm để phân tích hồi quy đa điểm. Tập hợp dữ

liệu định lượng nhận được từ thiết kế yếu tố nhằm giải đồng thời các phương trình đa

biến. Các thành phần môi trường đã lựa chọn có ảnh hưởng đến sinh trưởng được tối

ưu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm. Theo thiết kế này, 5 biến được chọn

trong thí nghiệm là x1 (glucose), x2 (peptone) , x3 (KH2PO4), x4 (chitin), x5 (tỷ lệ

Mg2+/Ca2+) được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng tương tác lẫn nhau đến quá trình

sinh trưởng của P. lilacinus P1. Mô hình đã đưa ra 63 thí nghiệm. Các yếu tố kiểm

tra được mã hóa theo phương trình sau đây:

xi =

Trong đó:

Xi là giá trị được mã hóa vô hướng của biến số độc lập thứ i, Xi các giá trị tự nhiên

của các biến độc lập thứ i;

X0 là các giá trị tự nhiên của các biến độc lập thứ i tại điểm trung tâm;

δXi là giá trị bước thay đổi (bước nhảy).

Phương trình tối ưu các thành phần môi trường được đưa ra dựa trên cơ sở của

phương trình bậc hai sau:

2 + ∑βijxj

Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi

Trong đó:

Y là kết quả dự đoán;

β0 là giới hạn bị chặn;

βi là hệ số tuyến tính;

βii là hệ số bình phương;

βij là hệ số tương tác qua lại.

Dữ liệu được phân tích bởi phần mềm thống kê Design Expert (DX7 version 7.1,

Stat-Dee, Minneapolis, Minnesota. USA). Chất lượng phù hợp của mô hình được

đánh giá bằng R2 và Phân tích phương sai (ANOVA). Kiểm tra thống kê của mô hình

được thực hiện bằng cách kiểm tra thống kê Fisher. Từ kết quả phân tích xác định

mức tối ưu của các yếu tố cho sản lượng chitinase cực đại.

2.2.12.4. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng Microsoft Excel để xử lý số liệu thu được trong quá trình thí nghiệm

và tính giá trị của các tham số thống kê.

Sử dụng phần mềm MEGA7 để dựng cây phát sinh chủng loại theo nghiên cứu

của White và cs., (1990), Stecher và cs., (2014) [159, 187].

Sử dụng phần mềm Bioedit, Clustal để so sánh trình tự nucleotid, so sánh trình

tự axit amin và xây dựng cây phát sinh chủng loại đối với các chủng nấm cần nghiên

cứu. Sử dụng phần mềm Primer 3 để thiết kế mồi cho đoạn gen cần khuếch đại.

2.2.13. Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học

2.2.13.1. Phương pháp lấy mẫu đất và mẫu rễ

Mẫu đất và rễ được lấy dưới tán cây, ở 3 điểm của từng trụ cây theo hình tam

giác đều mà gốc cây là tâm của tam giác. Trộn đều mẫu của 3 điểm đó thành 01 mẫu

(01 mẫu/ 1 trụ). Lấy mẫu theo chiều sâu phát triển của rễ, đối với hồ tiêu thường ở độ

sâu 10-20 cm (chú ý sự đồng đều của cách lấy các mẫu). Mẫu đất lấy dưới tán cây,

tại nơi có rễ cây phát triển, gạt 5-10 cm đất bề mặt, có thể lấy đất ở độ sâu 5-20 cm.

Mỗi công thức lấy 5 mẫu theo đường chéo góc. Mỗi mẫu đất lấy 500-1000 g. Thời

gian lấy mẫu vào trước các đợt sử dụng chế phẩm và sau khi sử dụng chế phẩm 1, 2,

4 tháng. Đánh dấu mẫu, ngày tháng, địa điểm, số kí hiệu trên cây. Mẫu bảo quản trong

điều kiện mát, tốt nhất nên phân tích mẫu ngay (không nên để quá 5 ngày).

2.2.13.2. Tách lọc và đếm số lượng tuyến trùng trong mẫu đất và mẫu rễ

Thu thập mẫu theo QCVN 01-38:2010/BNNPTNT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc

gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng và phương pháp nghiên cứu

bảo vệ thực vật: tập 1, phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên

địch của chúng: Phương pháp điều tra thu thập giám định tuyến trùng ký sinh cây

trồng nông nghiệp - Viện Bảo vệ thực vật 1997.

Mẫu đất và rễ được lấy ở diện tích dưới tán cây, độ sâu theo chiều của rễ bị hại (thường độ sâu 15-20 cm), mỗi cây điều tra lấy 3 điểm theo hình tam giác đều, lấy gốc cây làm trung tâm. Nếu số mẫu vượt quá 25 mẫu thì các mẫu của từng cây được trộn đều, đảm bảo mỗi ha có số lượng 20-25 mẫu. Mỗi mẫu rễ lấy 20-30 g. Mỗi mẫu đất lấy 500 gram. Mẫu thu thập được bảo quản trong phòng mát nhiệt độ khoảng

20-22 ºC, nhặt và tách mẫu rễ ra khỏi mẫu đất, cho vào các túi đựng mẫu riêng để trong tủ lạnh (9-10 ºC). Lọc mẫu đất trước, sau đó lọc mẫu rễ. Mẫu được xử lý trong

vòng 5-10 ngày kể từ ngày nhận mẫu.

2.2.13.3. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng

Lọc tuyến trùng từ đất: Hệ thống lọc tuyến trùng được thiết kế trên cơ sở

phương pháp Baermann. Phễu lọc được mô tả như sau: cấu trúc của hệ thống lọc bao

gồm 1 phễu thủy tinh đường kính 13,5 cm, cuống phễu dài 8 cm, phần dưới của cuống

phễu nối với ống silicon đường kính khoảng 1,5 cm, dài 9,5 cm, phía dưới ống silicon

nối với 1 ống tuýp đường kính 1,2 cm, cao 7,5 cm, cốc đựng đất bằng nhựa đường

kính 7,6 cm, cao 5 cm đáy phễu là lưới rất mịn đặt trên phễu. Hệ thống lọc đặt trong

các giá sắt cao 30 cm và đặt trên mặt đá để tránh rung động. Trộn đều đất ở mỗi mẫu.

Mỗi mẫu lấy ra 100 g cho vào các cốc đựng đất như mô tả trên. Làm ẩm đất bằng

cách dùng bình phun tay, phun nhẹ đều lên mặt. Cho nước vào phễu, ước lượng mực

nước sao cho khi cho cốc chứa đất vào thì mực nước sẽ ngập bề mặt của đất. Nhẹ

nhàng đặt cốc đất vào phễu bổ sung thêm nước vào phễu nếu cần. Thời gian lọc là 48

giờ. Khi thu mẫu, nhẹ nhàng tháo ống nghiệm ra khỏi ống silicon, ghi nhãn, đậy nắp

và giữ trong tủ lạnh. Đếm số lượng tuyến trùng trên 100 g đất sau khi lọc bằng kính

lúp soi nổi (Nikon SMZ1500).

Lọc tuyến trùng từ rễ: Theo phương pháp của Nguyễn Ngọc Châu (2003) ,

gồm các bước: Mẫu rửa sạch, lau khô, mỗi mẫu cân lấy 5 g, dùng kéo cắt nhỏ (chiều

dài khoảng 5 mm). Cho mẫu đã cắt vào cối xay sinh tố, cho nước vào vừa đủ ngập

lưỡi dao của cối. Xay 10 giây, nghỉ 10 giây, xay 10 giây, nghỉ 5 giây và xay 5 giây.

Mở nắp, dùng vòi nước xả vào để những phần rễ đã xay bám vào nắp và thành cối

xuống phía đáy cối để thu tuyến trùng. Lọc qua rây thô để loại bỏ những phần gỗ và

cặn bã thô. Xả nước mạnh để phần tuyến trùng trong rây thô này xuống dưới. Sau đó

lọc bằng rây 38 µm. Thu mẫu vào hộp nhựa nhỏ bằng cách dùng bình phun tia gạn

tuyến trùng vào trong lọ. Đếm số lượng tuyến trùng trên 5 g rễ sau khi tách lọc bằng

kính lúp soi nổi.

2.2.13.4. Phương pháp đếm tuyến trùng [3]

Tuyến trùng được đếm và tính số lượng bằng đĩa đếm tuyến trùng (counting

dish) và đồng hồ đếm (counting machine) dưới kính hiển vi soi nổi. Trong trường

hợp mẫu có ít tuyến trùng (< 1000 con) có thể đổ cả tuyến trùng vào đĩa để đếm. Sau

khi lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều, có thể đếm toàn bộ tuyến trùng theo

các dãy ô cho toàn bộ đĩa đếm hoặc có thể đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó

tính trung bình 1 ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Trong trường hợp mẫu có quá

nhiều tuyến trùng thì ta có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 50 ml, sau đó

lấy 10 ml để đếm, lặp lại lần 2 như vậy, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 10

ml và nhân với 5.

2.2.13.5. Phương pháp làm nhiễm nấm lên tuyến trùng theo Khan A. và cs.,

(2006)[94]

Nuôi nấm trên môi trường CD dịch thể (bổ sung 105 bào tử/ml), lắc trong 3

ngày ở 28 oC ± 2 oC, 200 vòng/phút. Thu dịch nuôi cấy, bổ sung 300 tuyến trùng/5

ml dịch trong hộp chuyên dụng, giữ trong 120 giờ ở 28 oC ± 2 oC, kiểm tra số lượng

tuyến trùng sau mỗi 24 giờ, mẫu đối chứng được thay dịch nuôi cấy nấm bằng nước

cất. Làm tiêu bản nhuộm với Phloxin B và soi dưới kính hiển vi để xác định số lượng

tuyến trùng chết bắt màu tím với thuốc nhuộm.

2.2.13.6. Phương pháp tạo chế phẩm sinh học và đánh giá khả năng sống sót

của chủng trong dịch bảo quản

Nghiên cứu các công thức bao gồm tinh bột hồ hóa, EDTA, than bùn kết hợp

với cám gạo và 0,9% NaCl. Theo dõi và đếm mật độ bào tử lưu trữ thời gian trong 10

ngày, 30 ngày, 60 ngày. Lựa chọn công thức dịch thể thích hợp tạo chế phẩm sinh

học.

2.2.13.7. Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học phòng bệnh bởi

tuyến trùng gây ra

Địa điểm thử nghiệm chế phẩm sinh học tại Đăk Lăk ở quy mô 3 ha: Khu vực

vườn trồng hồ tiêu thuộc thôn 8, xã Eabar, huyện Buôn Đôn, tỉnh Đăk Lăk.

Phương pháp đánh giá cấp độ cây bị bệnh trên vườn hồ tiêu biểu hiện qua lá

Những cây bị bệnh chết nhanh thường cây đang xanh có biểu hiện héo lá, sau

khoảng một tuần thì chết, khó cứu chữa. Những cây chết chậm có biểu hiện lá bị vàng

từ từ, nguyên nhân có thể do tuyến trùng trích hút nhựa, làm tổn thương bộ rễ hoặc

do các chủng nấm bệnh trong đất xâm nhập vào nhựa cây. Vì vậy, để xác định cây bị

bệnh do tuyến trùng hay do nấm bệnh cần lấy mẫu đất và rễ cây phân tích, đánh dấu.

Sử dụng khung điều tra hình chữ nhật (40 x 40 cm), đặt khung đối diện tầm mắt người

điều tra (khoảng cách từ dưới đất lên khung là 1,5 m), đếm tất cả số lá trong cây, số

lá bị bệnh, phân chia cấp cây bị bệnh theo tỷ lệ số lá bị vàng (R, %). Cấp độ cây bị

bệnh được tham khảo theo QCVN01-166/2014 và QCVN01-172/2014 của Bộ Nông

nghiệp và Phát triển Nông thôn về phân cấp cây bị bệnh và phương pháp điều tra

phát hiện sinh vật hại hồ tiêu. Tỷ lệ và phân cấp theo thang một cấp 0 và bốn cấp

bệnh được trình bày ở Bảng 2.3.

* Đánh giá cây bị bệnh theo tỷ lệ số lá bị vàng (%) (QCVN 01-172/2014)

R (%)=(F/B) x 100, trong đó:

R: Tỷ lệ (%) số lá bị vàng

B: Tổng số lá trong khung điều tra

F: Tổng số lá bị vàng.

Bảng 2.3. Đánh giá cấp độ cây bị bệnh

Các cấp độ Mức biểu hiện

Cây có lá xanh bình thường, không có lá biểu hiện bị vàng 0

Cây có lá vàng nhẹ, có dưới 25% lá biểu hiện vàng, chậm phát triển 1

Cây có lá vàng trung bình, có 25-50% lá biểu hiện vàng, phát triển 2 chậm, bắt đầu có hiện tượng chùn đọt, rụng lá, tháo đốt.

Cây có biểu hiện vàng nặng, có 50-75% lá bị vàng, không phát triển, 3 rụng lá tháo đốt nhiều.

Cây vàng lá rất nặng, trên 75% lá bị vàng, rụng lá, tháo đốt, cây gần 4 chết.

* Đánh giá hiệu quả phục hồi (HQPH, %) vườn hồ tiêu của chế phẩm sinh học

bằng cách xác định tỷ lệ số lá bị vàng trên cây bệnh, quy ra cấp độ bệnh của cây, tính

tỷ lệ % số cây phục hồi trên tổng số cây điều tra ở vườn thí nghiệm so với số cây phục

hồi trên trổng số cây điều tra ở vườn đối chứng sau thời gian thử nghiệm, theo công

thức:

E (%) = T - C, trong đó:

E: Hiệu quả phục hồi (%)

T: số cây phục hồi trên tổng số cây điều tra ở vườn thí nghiệm (%)

C: số cây phục hồi trên tổng số cây điều tra ở vườn đối chứng (%).

2.2.13.8. Xác định hiệu lực của chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng trên đất

trồng cây hồ tiêu trong nhà lưới

Hỗn hợp đất đỏ bazan: phân hữu cơ sạch theo tỷ lệ 3:1. Hỗn hợp được xử lý

bằng cách trải mỏng, phủ màng, phơi nắng khoảng từ 4-5 ngày, để tiêu diệt bớt vi

sinh vật. Chia đều lượng đất vào các chậu, trung bình 10 kg/chậu đưa vào nhà lưới.

Lựa chọn cây hồ tiêu (giống Vĩnh Linh) khoảng 3,5 tháng tuổi để thử nghiệm. Tất cả

các cây hồ tiêu được trồng ổn định vào chậu và theo dõi trong thời gian từ 7 đến 10

ngày trước khi đưa vào thử nghiệm. Bố trí ngẫu nhiên đầy đủ 3 lần lặp lại gồm 7 công

thức (bảng 2.4), mỗi công thức 30 cây.

Phương pháp lây nhiễm tuyến trùng nhân tạo trong điều kiện nhà lưới: Tuyến

trùng Meloidogyne sp. được thu nhận từ nguồn nhân nuôi trong đất trồng và trên rễ

cây bị sưng để đánh giá chất lượng của chế phẩm sinh học. Mật độ tuyến trùng lây

nhiễm cho 1 chậu đất là 100 con/100 g đất (duy trì độ ẩm cần thiết cho sinh trưởng

của cây và sự sống của tuyến trùng). Sau khi lây nhiễm, để ổn định sự tồn tại của

tuyến trùng khoảng 1 đến 2 ngày, kiểm tra lại mật độ tuyến trùng có trong 100 g đất.

Thời điểm mỗi lần tưới cách nhau 10 ngày, mỗi lần tưới là 200 ml chế phẩm. Quá

trình thử nghiệm được tiến hành 6 tháng trong năm 2017 tại nhà lưới của Xí nghiệp

sản xuất phân bón/Công ty Cổ phần Nicotex Đăk Lăk, xã Ea Nuôi, huyện Buôn Đôn,

mỗi đợt thử nghiệm tiến hành trong 30 ngày, nhiệt độ thử nghiệm trong nhà lưới duy

trì trung bình 26 oC đến 29 oC.

Bảng 2.4. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mô hình nhà lưới

Ký hiệu Diễn giải

ĐC1 (-) Chậu hồ tiêu 3,5 tháng tuổi tưới nước thường, không có tuyến trùng

ĐC2 (+) Canh tác như tập quán thông thường của người trồng

ĐC3 (++) Sử dụng chế phẩm thông thường trên thị trường (Nokaph)

TN1 Sử dụng chế phẩm sinh học pha loãng 50 lần

TN2 Chế phẩm sinh học pha loãng 100 lần

TN3 Chế phẩm sinh học pha loãng 150 lần

TN4 Chế phẩm sinh học pha loãng 200 lần

Lấy mẫu đất sau các thời điểm sử dụng chế phẩm 10 ngày trước khi sử dụng

chế phẩm lần 2 hoặc 3 (nếu có). Dụng cụ dùng lấy mẫu phải vô trùng để tránh nhiễm

chéo. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 oC cho đến khi xử lý và phân tích. Dùng

dao hay xẻng sạch đã lau cồn để lấy mẫu đất. Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 2-5 cm trên

bề mặt, sau đó lấy phần đất tiếp theo cho vào túi đã được khử trùng, gài cẩn thận. Túi

được dán nhãn ghi rõ đặc điểm, công thức thí nghiệm lấy mẫu.

Theo dõi đánh giá mật độ tuyến trùng trong các lần lấy mẫu, sự sinh trưởng

của cây hồ tiêu trồng trong các chậu và cả mẫu đối chứng không bổ sung tuyến trùng,

kiểm tra mật độ tuyến trùng còn sống (con/100 g đất). Áp dụng Tiêu chuẩn ngành 10

TCN 281:1997, quy phạm khảo nghiệm hiệu lực thuốc BVTV trừ côn trùng gây hại

trong bảo quản, từ đó tính ra hiệu lực của các chế phẩm (HLCP, %) theo công thức

Henderson - Tilton (1955) [74] như sau:

Trong đó: + H (%): Hiệu lực của chế phẩm tính theo phần trăm

+ Ca: Số lượng tuyến trùng sống ở lô đối chứng sau xử lý

+ Cb: Số lượng tuyến trùng sống ở lô đối chứng trước xử lý

+ Ta: Số lượng tuyến trùng sống ở công thức thí nghiệm sau xử lý

+ Tb: Số lượng tuyến trùng sống ở công thức thí nghiệm trước xử lý.

2.2.13.9. Xây dựng mô hình, quy trình sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ

bệnh tuyến trùng quy mô 03 ha tại Đăk Lăk

Bảng 2.5. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mô hình đồng ruộng 3 ha

Ký hiệu Bố trí thí nghiệm Phương thức tiến hành

ĐC: Lô Tiến hành tại 3 vườn, mỗi vườn diện Theo tập quán canh tác của

đối chứng tích 1 ha. Số lượng trụ tiêu trung bình người trồng hồ tiêu, được áp

1800 trụ/ha. Đánh giá 10 điểm/vườn. dụng theo “Quy trình kỹ thuật

Mỗi điểm 06 trụ, mỗi trụ điều tra cấp trồng, chăm sóc và thu hoạch hồ

độ bệnh của cây theo khung hình tiêu” (Quyết định số: 730/QĐ-

vuông với 2 hướng đối lập nhau (Bắc – BNN-TT, ngày 05 tháng 03 năm

Nam) và quan trắc theo thang 4 cấp độ. 2015 - Bộ NN và PTNT, đưa ra

Độ cao được tính từ dưới đất lên khung các giải pháp phòng trừ dịch

là 1,5 m. bệnh).

MH: Mô Tiến hành tại 3 vườn. Đánh giá 10 Sử dụng theo quy trình như trên

hình thí điểm/vườn. Mỗi điểm 06 trụ, mỗi trụ nhưng sử dụng chế phẩm sinh

nghiệm điều tra theo khung hình vuông (như học để chăm sóc.

mô hình đối chứng). Mỗi trụ hồ tiêu tưới khoảng 20

– 30 lít chế phẩm sinh học (tùy

thuộc vào độ ẩm của đất tại mỗi

thời điểm tưới).

Bón phân và chăm sóc theo quy

định 730/QĐ-BNN-TT (như

trên)

* Thiết kế mô hình: Chọn vườn hồ tiêu trong thời kỳ kinh doanh (5-7 năm

tuổi), có biểu hiện bị dịch bệnh. Áp dụng cách bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng

ruộng cụ thể như Bảng 2.5.

* Chỉ tiêu đánh giá năng suất thực thu được tính bằng tạ/ha khi hồ tiêu còn lại

12 – 13% độ ẩm.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN

TRÙNG Meloidogyne sp.

3.1.1. Phân lập, sàng lọc các chủng nấm sợi

Từ 15 mẫu đất và rễ quanh cây hồ tiêu được thu thập tại tỉnh Đăk Lăk, 23

chủng nấm sợi đã được phân lập. Các chủng nấm sợi được định danh sơ bộ bằng hình

thái, cấu trúc sinh bào tử. Hình 3.1 cho thấy trong số 23 chủng có 3 chủng nấm sợi

không thuộc các chi Penicillium, Aspergillus và Fusarium đó là NV01, NV20 và P1.

Hình 3.1. Hình thái, cấu trúc sinh bào tử của các chủng nấm sợi

KH

Đặc điểm, Phân loại Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào

Trên môi trường

CDA, sau 5 ngày nuôi

NV01

cấy, bào tử hình thành

đến ngày thứ 14 khuẩn

lạc màu vàng nhạt.

NV02

Khuẩn lạc màu đen, bào tử mịn.

(Aspergillus sp.)

NV03 Khuẩn lạc màu xanh viền trắng bên ngoài, bào tử mịn.

(Penicillium sp.)

NV04

Khuẩn lạc xanh nhạt sau 7 ngày chuyển màu xanh sẫm, bào tử mịn. (Penicillium sp.)

NV05

Khuẩn lạc trắng, sau 7 ngày chuyển màu ghi nhạt, bào tử đính. (Aspergillus sp.)

NV20

Sợi nấm màu trắng phát triển lan trên bề mặt thạch. Sau 5 ngày trên môi nuôi cấy trường PDA. Dưới kính hiển vi điện tử từ ngày thứ 5, sợi nấm xuất hiện những nút vòng thắt.

P1

Trên môi trường CDA, sau 5 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc hình tròn đồng tâm dạng thảm nhung, sợi nấm màu trắng, sau chuyển sang tím nhạt và tím. Cuống bào tử dài, phân nhánh và mọc lên từ sợi nấm. Trên phần cuống có thể bình phồng ở phần gốc, nhọn ở đầu và mọc vươn thẳng, tạo thành cụm. Trên thể bình là những bào tử ovan dài tạo thành dạng chuỗi hoặc bị đứt đoạn.

P6

Khuẩn lạc sau 7 ngày có màu xanh cỏ úa, bào tử đính.

(Aspergillus sp.)

P7

Khuẩn lạc xanh, bào tử mịn. (Penicillium sp.)

EN8

Khuẩn lạc trắng, sau 7 ngày ngả vàng nhạt và xuất hiện giọt tiết, bào tử đính. (Aspergillus sp.)

EN9

Khuẩn lạc xanh, bào tử mịn (Penicillium sp.)

EB10

Khuẩn lạc ở giữa có màu xanh sẫm, viền trắng ở xung quanh,, có giọt tiết. Bào tử mịn.

(Penicillium sp.)

EB11

Khuẩn lạc màu trắng sợi dài.

(Fusarium sp.)

EB12

lạc có màu Khuẩn kem, sau 7 ngày chuyển màu ghi, bào tử đính.

(Aspergillus sp.)

EB13

Khuẩn lạc sau 7 ngày ngả vàng, bào tử mịn ở giữa.

(Aspergillus sp.)

DL14

Khuẩn lạc xanh, viền trắng, bào tử mịn. (Penicillium sp.)

DL15

Khuẩn lạc màu trắng, sau 7 ngày chuyển màu ghi nhạt, bào tử mịn. (Aspergillus sp.)

T16

Khuẩn lạc xanh sau 7 ngày tiết sắc tố đỏ vào môi trường, bào tử mịn.

(Penicillium sp.)

T17

Khuẩn lạc màu trắng, sợi dài. (Fusarium sp.)

K18

Khuẩn lạc màu trắng, sau 7 ngày ngả màu vàng nhạt, bào tử mịn. (Penicillium sp.)

K19

Khuẩn lạc màu trắng ngả vàng, bào tử đính (Aspergillus sp.)

R21

Khuẩn lạc trắng bông, lan hết bề mặt, sợi bông dài, sau 7 ngày ngả màu vàng. (Fusarium sp.)

Khuẩn lạc xanh, bào tử mịn

R22

(Penicillium sp.)

Ghi chú: Hình thái cấu trúc sinh bào tử dưới kính hiển vi ở vật kính 40x

Nhằm hướng tới mục tiêu lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến

trùng, các chủng nấm được nuôi cấy lắc trên môi trường CD dịch thể trong thời gian

96 giờ nhiệt độ nuôi cấy 30 oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, dịch nuôi cấy được lọc và

sử dụng để thử nghiệm với tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp. theo phương pháp

2.2.13.5. Các chủng có khả năng diệt tuyến trùng sẽ được lựa chọn cho các nghiên

cứu tiếp theo. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khảo sát khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.

Stt Ký hiệu Tỉ lệ tuyến trùng chết (%)

chủng 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ

0 Đối chứng 1 - - - - -

(nước cất)

1 Đối chứng 2 - - - ± ±

(CD dịch thể)

2 P1 - 10,81± 0,75 30,7 ± 2,71 58,5 ± 2,39 58,5 ± 2,41

3 NV01 - 2,31 ± 0,24 15,6 ± 1,82 50,4 ± 2,84 50.4 ± 2,97

4 NV20 - 20,80 ± 2,51 40,17 ± 3,28 55,23 ± 4,12 55,23 ± 3,96

Ghi chú: (±): chết ˂ 3,0 %

Bảng 3.1 cho thấy, trong thời gian thử nghiệm đến 96 giờ, tuyến trùng cho tỷ

lệ chết cao nhất đến 58% đối với P1; 55,23% đối với NV20; 50,4% đối với NV01.

Trong khoảng thời gian 72 - 96 giờ lượng trứng nở và ấu trùng sống sót bắt đầu giảm

nhiều, có thể là tại thời điểm này các enzym phân hủy cùng với các độc tố bắt đầu

được sản sinh nhiều hơn nên đã có tác động đến khả năng tồn tại và phát triển quần

thể của tuyến trùng so với mẫu đối chứng. Sau 96 giờ trở đi, lượng trứng và ấu trùng

sống sót thay đổi không đáng kể, có thể do lượng enzym ủ lâu đã mất đi một phần

hoạt tính [80, 81].

Perveen và S. Shahzad (2013) đã sử dụng dịch thể nuôi cấy Paecilomyces

lilacinus, Paecilomyces variotii, Paecilomyces fumosoroseus, ủ với ấu trùng của

tuyến trùng Meloidogyne incognita, kết quả cho thấy từ 72 giờ - 96 giờ khả năng diệt

tuyến trùng đạt hiệu quả 75% [145]. Một nghiên cứu tương tự, Ajrami và cs., (2016)

khi thử nghiệm Paecilomyces lilacinus với tuyến trùng Meloidogne javanica gây

bệnh bướu rễ cây cà chua trong thời gian 72 - 96 giờ thì hiêụ quả diệt đạt 57%. Đồng

thời nhóm nghiên cứu chế tạo viên nang chứa alginate kết hợp với P. lilacinus được

sử dụng để thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng M. incognita trên cây cà chua trong

nhà kính. Các viên P. lilacinus cho tỷ lệ giảm mật độ tuyến trùng ở vùng rễ là 66,7%,

tương tự như vậy, viên P. chlamydosporia cho tỷ lệ giảm đến 90%, các nhà khoa học

kết luận cả hai chủng đều có khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. [16].

Một nghiên cứu mới của Admad và cs., (2019), sử dụng Paecilomyces variotii

cho kết quả thử nghiệm vượt trội, với hiệu quả lên đến 91,5% trong kiểm soát tuyến

trùng bướu rễ, trong khi đó hiệu quả này là 96,4%, 99,7% và 98,9% khi sử dụng

DMAC, diazinon và chiết xuất thực vật. Nghiên cứu được tiến hành trên trứng của

tuyến trùng Meloidogyne sp. với loài chủng phân lập (Paecilomyces variotii, P.

lilacinus, Duddingtonia flagrans, Trichoderma harzianum, Trichoderma asperelum)

nhưng chỉ D. flagrans hoàn toàn không gây hại cho trứng còn bốn loài còn lại thì P.

lilacinus có khả năng giảm khả năng sống sót tới 67,9%, trong khi đó hiệu lực của P.

variotii chỉ là 25,1% [9].

Từ những kết quả thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng của P1, NV01 và

NV20 cho thấy các chủng trên có thể sử dụng tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng

Meloidogynes sp.. Nhằm làm rõ hơn về cơ chế tiêu diệt, ba chủng nấm sợi trên được

định danh bằng giải trình tự dựa trên đoạn ITS1/ITS4.

3.1.2. Định danh các chủng nấm sợi P1, NV01, NV20 dựa trên trình tự

ITS1/ITS4

Các chủng P1, NV01, NV20 được nuôi cấy trên môi trường CD dịch thể trong

thời gian từ 3 ngày; nhiệt độ nuôi cấy 30 oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Hệ sợi nấm

được thu để phục vụ tách chiết DNA hệ gen.

Cặp mồi ITS1/ITS4 được sử dụng để khuếch đại vùng ITS của ADN ribosome

nhằm đánh giá chất lượng ADN hệ gen cũng như được sử dụng để giải trình tự đoạn

ITS. Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm sợi có kích thước 586 bp và được tinh sạch

bằng kit để tiến hành giải trình tự. Kết quả được phân tích mối quan hệ dựa trên phần

mềm MEGA7 [162, 187]. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp

Neigbor-joining với độ tin cậy sử dụng 1000 bootstrap. Cây phả hệ dựa trên trình tự

vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) của NV01, P1, NV20 và các chủng có mối quan hệ

gần gũi được trình bày ở Phụ lục 2.

Sử dụng công cụ BLAST so sánh trình tự thu được với trình tự ITS của các chủng

nấm đã biết trong GenBank của NCBI cho thấy, NV01 có mức độ tương đồng về

trình tự ITS với chủng Paecilomyces variotii IKF305752 là 100%. Như vậy, dựa vào

đặc điểm hình thái, trình tự vùng ITS có thể kết luận chủng NV01 thuộc loài P.

variotii và được gọi là P. variotii NV01.

Chủng P1 có mức độ tương đồng về trình tự ITS với chủng Paecilomyces

lilacinus KY549673.1 là 99%. P1 thuộc loài P. lilacinus và được gọi là P. lilacinum

P1 hoặc theo cách gọi mới của Luangsa-ard và cs., 2011 là Purpureocillium lilacinum

[119].

Từ kết quả giải trình tự, NV01 và P1 đều thuộc chi Paecilomyces. Theo các

nghiên cứu trước đây như Djian C., (1991), Khan A., (2003), Park J., (2004) cho thấy

khả năng diệt tuyến trùng của chi Paecilomyces là do các sợi nấm nảy mầm từ bào tử

ký sinh vào trứng tuyến trùng có thể xâm nhập vào giai đoạn phát triển của tuyến

trùng. Trong giai đoạn sinh trưởng của nấm, sợi nấm sản sinh ra các enzym như

chitinase, protease, axit axetic, một số sản phẩm bậc hai như leucinotoxin… để tiêu

diệt tuyến trùng [60, 92, 144]. Công bố của Kanai Y., (2004), Kwon J., (2007) cho

thấy chitinase và protease trực tiếp tác động đến trứng cụ thể là làm mỏng vỏ trứng

tuyến trùng [87, 103]. Chan và cs., (2010) cho thấy chitinase PjCHI-1 sinh ra bởi nấm

Paecilomyces javanicus có khả năng làm giảm sự nở của trứng và ấu trùng tuyến

trùng sống sót trên cây cà chua. Ngoài ra, một số sản phẩm trao đổi chất khác như

paeciloxazine sinh ra bởi Paecilomyces là chất có hoạt tính diệt tuyến trùng rất mạnh

[35]. Những công bố gần đây như Li và cs., (2015), Liang và cs., (2019), Soarest và

cs., (2018) hai loài P. variotii và P. lilacinus thuộc chi Paecilomyces đều có khả năng

diệt tuyến trùng [45, 107, 110]. Ahman và cs., (2019) cho thấy P. lilacinus và P.

variotii phân lập tại đất vùng Bali (Indonexia) được coi là tác nhân sinh học diệt tuyến

trùng Meloidogyne ký sinh thực vật. Paecilomyces lilacinus là một loài nấm diệt

tuyến trùng và hiệu quả đối với phổ rộng của tuyến trùng gây bệnh thực vật [32, 84,

91, 154]. P. lilacinus là chủng an toàn đối với con người [11, 71, 169], không có độc

tính hoặc khả năng gây bệnh khi thử nghiệm trên động vật gặm nhấm và các động vật

không xương sống khác nhau [18, 110, 122]. P. lilacinus sinh trưởng trong dải pH

rộng, trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau giúp chúng có khả năng cạnh tranh với

nhiều vi sinh vật trên đất trồng do đó được ứng dụng tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến

trùng [9, 25, 92].

Dựa trên kết quả giải trình tự, NV20 có mức độ tương đồng về trình tự ITS

với chủng Pleurotus giganteus (KT956125.1) là 99%, do vậy NV20 được gọi là

Plerotus giganteus NV20. Theo công bố của Koziak và cs., (2007), Thorn và cs.,

(2000) Plerotus thuộc họ Plerotaceae bộ Agaricale [101, 165]. Các nghiên cứu của

Li và cs., (2015), Soares và cs., (2018), Plerotus được xếp vào chi diệt tuyến trùng

bằng phương thức sử dụng độc tố do nấm tiết ra như pleurotin, leucopleurotin,

dihydropleurotinic acid, 1-(4-methoxyphenyl)-1,2-propanediol, 2-hydroxy-(4’-

methoxy) propiophenone…[45, 107]. Cho đến nay, độc tố của những chủng nấm

thuộc chi này vẫn còn đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.

Một trong những cơ chế liên quan đến khả năng diệt tuyến trùng của các chủng

nấm sợi là sự tham gia của chitinase ngoại bào và sự hỗ trợ của protease ngoại bào.

Vì vậy, NV01, P1 và NV20 được khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase và

protease nhằm lựa chọn chủng có hoạt tính cao cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại bào của

chủng NV01, P1 và NV20

Nhằm nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại bào, các

chủng NV01, P1, NV20 và chủng tham chiếu CP1 (Paecilomyces lilacinus CP1) được

nuôi cấy trên môi trường CD có bổ sung cơ chất chitin 0,75%, casein 0,65%, với pH

6,5–7,0, thời gian nuôi cấy 5 ngày, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, dịch nuôi cấy được xác

định hoạt tính chitinase, protease ngoại bào.

Hình 3.2. Hoạt tính chitinase và protease của NV01, P1 và NV20

A - Hoạt tính chitinase; B – Hoạt tính protease

Kết quả được trình bày ở Hình 3.2 cho thấy, hoạt tính chitinase và protease của

P1 đều cao hơn so với NV01, NV20 và chủng CP1 trong cùng điều kiện nuôi cấy. Cụ

thể hoạt tính chitinase lần lượt là 61,7 U/ml, 50,6 U/ml, 37,7 U/ml và 5,29 U/ml (Hình

3.2A). Chủng NV20 cho hoạt tính chitinase và protease thấp nhất. Điều này cũng

được giải thích bởi NV20 là nấm diệt tuyến trùng theo cơ chế sử dụng độc tố [45,

107]. Hoạt tính chitinase của chủng P1 gấp 3 lần so với nghiên cứu của Homthong và

cs., (2016) khi nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trường cơ bản (g/l) gồm KH2PO4,

3,0; K2HPO4, 1,0; MgSO4, 0,7; (NH4)2SO4, 1,4; NaCl, 0,5; CaC12, 0,5; cao nấm men,

0,5; bacto-peptone, 0,5 và chitin cơ chất, 5,0 thu nhận chitinase sau 10 ngày nuôi cấy;

gấp 5 lần nuôi cấy trên môi trường cơ bản và thu nhận chitinase sau 5 ngày [76]. Hoạt

tính protease của P1 cao hơn so với chủng tham chiếu CP1 và NV01 cụ thể 91,2 U/ml

84,7 U/ml và 82,3 U/ml (Hình 3.2B) và gấp 1,7 lần so với chủng P. variotii PR-4 của

Deore và cs., (2013), Nguyen và cs., [49] [137].

Như vậy, sau khi khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease của

chủng NV01 và P1, kết quả cho thấy chủng P1 có hoạt tính cao hơn NV01. Kết hợp

với những nghiên cứu khả quan về hoạt tính diệt tuyến trùng, chủng P1 được sử dụng

để nghiên cứu tinh sạch chitinase cũng như nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi

cấy đến quá trình sinh tổng hợp chitinase.

3.1.4. Tinh sạch chitinase từ chủng P1

Chitinase sinh ra từ Paecilomyces cũng như nấm sợi khác thường có độ tinh khiết

không cao do tạp lẫn nhiều protein khác. Do đó, quá trình tinh sạch để thu được

chitinase tinh khiết là cần thiết. Kết quả này phục vụ cho quá trình đánh giá các yếu

tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzym và sử dụng chúng cho những ứng dụng trong thực

tế. Sau khi khảo sát quá trình tinh sạch chitinase từ P1, chitinase được tiến hành tinh

sạch bằng (NH4)2SO4 bão hòa 65%. Hoạt tính chitinase sau tinh sạch thu được 85,08

U/ml, độ sạch 1,35 lần và hiệu suất thu hồi đạt 11,6%. Chitinase sau thẩm tích loại

muối được đưa qua cột DEAE – Sephadex A-50 và cuối cùng cho độ sạch 2,1 lần và

hiệu suất thu hồi đạt 1,68%. Enzym tinh sạch này có hoạt tính 133,3 U/ml (Bảng 3.2),

sản phẩm sau tinh sạch được xác định khối lượng phân tử bằng SDS-PAGE 12,5%.

Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng P. lilacinus P1

Hàm lượng Hoạt tính Hoạt độ Độ sạch Hiệu suất

Bước tinh sạch protein TS tổng số (U) riêng (lần) (%)

(ml) (U/ml)

Enzym thô 0,76 62,63 1,0 100 47,6

0,065 85,08 1,35 11,6 5,53 (NH4)2SO4

DEAE- 0,006 133,3 2,1 1,68 0,8

Sephadex A-50

Chitinase từ Trichoderma harizanum được tinh sạch bằng tủa muối (NH4)2SO4

bão hòa, DEAE-Sephadex A-50, cho hoạt tính tương đương chitinase của nghiên cứu

này (133,3 U/mg) nhưng lại thấp hơn Lecanicillium lecanii 43H là 0,35 lần [47, 88],

thấp hơn so với Metarhizium anisopliae gần 5 lần. Hiệu suất tinh sạch của nghiên

cứu này thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Hữu Quân và cs., (2014) là 0,3 lần.

Đây cũng là bước đầu thành công bởi quá trình tinh sạch còn chưa được nghiên cứu

tối ưu các điều kiện [5].

Theo nghiên cứu của Homthong và cs., (2016), đoạn gen mã hóa chitinase của

Paecilomyces sp. khi giải trình tự có kích thước khoảng 1500 bp [76]. Bằng phương

pháp khuyếch đại gen mã hóa chitinase của P. lilacinus P1 với cặp mồi được thiết kế,

băng điện di cho thấy sự tồn tại của gen mã hóa chitinase ở chủng P1 và có kích thước

1269 bp (Phụ lục 2).

Chitinase được sinh ra bởi Paecilomyces có các kích thước khác nhau, theo công

bố của Dong và cs., (2007), Paecilomyces lilacinus khi tinh sạch có trọng lượng phân

tử 45,8 KDa [53]. Theo nghiên cứu của Chan và cs., (2010) chitinase PjCHI-1 từ P.

javanicus có trọng lượng phân tử 37 KDa [35], Huang và cs., (2016), chitinase từ

Isaria fumosorosea (Paecilomyces fumosorosea) có trọng lượng phân tử 44 KDa

[79], chitinase từ Beauveria bassiana (loại nấm diệt côn trùng) có trọng lượng phân

tử 33 KDa [59]. Chitinase của P. lilacinus 251 theo các công trình nghiên cứu của

Khan và cs., (2003) (2004) bao gồm 6 loại chitinase khác nhau chưa công bố kích

thước cụ thể, các nghiên cứu đang tiếp tục [92, 93].

Nhằm xác định trọng lượng phân tử chitinase của P1, sản phẩm được tiến hành

điện di trên gel polyacrylamid, sản phẩm điện di cho băng có kích thước khoảng 46

kDa (Phụ lục 2).

Hoạt tính chitinase chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như thời gian nuôi cấy thu

hồi enzym, nồng độ cơ chất bổ sung vào môi trường, pH của môi trường nuôi cấy,

khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym…

3.1.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase từ P1

3.1.5.1 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên men

Dựa trên cơ chế gây bệnh của nấm diệt tuyến trùng, Paecilomyces sử dụng

phương thức là bào tử kết dính vào trứng tuyến trùng nảy mầm phát triển thành hệ

sợi ăn sâu vào ấu trùng, tiết ra enzym như chitinase làm mỏng vỏ trứng tuyến trùng

và tiêu diệt chúng [9, 107, 155]. Khi sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng tuyến trùng hoặc

ấu trùng với hoạt tính càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt tuyến trùng càng

nhanh. Từ đó, các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu tối ưu môi trường nuôi cấy sao

cho hoạt tính enzym cao nhất và kết hợp với chế phẩm sinh học bào tử nấm nhằm

nâng cao hiệu quả diệt tuyến trùng.

Tối ưu hóa môi trường là một trong những vấn đề cần được nghiên cứu kỹ

nhất và thường được tiến hành trước khi đưa vào sản xuất. Thành phần môi trường

và điều kiện lên men luôn luôn là yếu tố quan trọng của quá trình lên men công

nghiệp, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất sản phẩm Zhang và cs., (1999) [198]. Trong

nghiên cứu này, môi trường CMA, Czapeck-Dox, PDB và CHY được dùng cho

nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase của chủng P1.

Các kết quả được trình bày trong Hình 3.3A cho thấy chủng P1 có khả năng

sinh tổng hợp chitinase trên cả bốn môi trường được khảo sát. Đặc biệt, môi trường

CHY cho hoạt tính chitinase cao nhất (với đường kính vòng thủy phân chitin 17,2

mm). Điều này có thể là do môi trường CHY chứa thành phần khoáng chất có thể

tăng cường khả năng sản xuất chitinase; nó kích hoạt một số gen có khả năng kiểm

soát sự tổng hợp chitinase tăng lên [157].

Mỗi loài vi nấm cho hoạt tính chitinase khác nhau và chịu ảnh hưởng của pH

môi trường nuôi cấy khác nhau. Thí nghiệm được thiết kế dựa trên môi trường CHY

và pH môi trường ban đầu thay đổi từ 4,0 đến 8,5. Kết quả được trình bày ở hình 3.3B

cho thấy ở pH môi trường 6,0 đến 7,5 hoạt tính chitinase cao hơn trong khoảng từ 4,0

đến 5,5 và 8,0 đến 8,5. Theo nghiên cứu của Cirano và cs., (1991), môi trường ban

đầu nuôi cấy Trichoderma harzianum cho hoạt tính chitinase cao nhất ở pH 6,0 [173],

Zhu và cs., (2008), Verticillium lecanii là pH 7,0 [203]. Từ kết quả trên, lựa chọn pH

ban đầu cho môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp chitinase cho chủng P1 trong khoảng

6,0 – 7,0.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp chitinase. (A).

Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy, (B). Ảnh hưởng của pH, (C). Thời gian nuôi

cấy, (D). Nồng độ chitin.

Hình 3.3C cho thấy hoạt tính chitinase cũng thay đổi rõ rệt theo thời gian cụ

thể như sau: tăng nhanh sau 72 giờ nuôi cấy và đạt cực đại ở 96 giờ, sau 96 giờ hoạt

tính giảm dần. Điều này chứng tỏ, trong thời gian đầu chủng P1 đã đồng hóa mạnh

các nguồn cacbon và nitơ dễ hấp thu để gia tăng sinh khối. Sau 72 giờ lượng sinh

khối trong môi trường nuôi cấy đã tăng rất nhiều, mà nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu

đã cạn kiệt, vì vậy thúc đẩy chủng P1 tiếp tục tổng hợp chitinase để phân giải nguồn

chitin có trong môi trường và sau 96 giờ nuôi cấy hoạt tính chitinase được ghi nhận

là cao nhất. Sau đó, khi nguồn chitin trong môi trường đã bị phân cắt hết đồng thời

khi các sản phẩm cuối như N-acetyl-D glucosamine có nhiều trong môi trường đã gây

ức chế ngược lại quá trình sinh tổng hợp chitinase vì vậy hoạt tính chitinase có xu

hướng giảm. Do đó lựa chọn 96 giờ nuôi cấy là thời gian cần thiết để thu nhận

chitinase.

Do chitinase vừa là enzym cấu trúc vừa là enzym cảm ứng nên trong môi

trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase cần bổ sung nguồn cơ chất chitin là chất cảm

ứng nhằm làm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase [69].

Theo nghiên cứu của Homthong và cs., (2016), Khan và cs., (2003) đã lựa

chọn nồng độ cơ chất chitin trong khoảng từ 0,7% đến 1,0%; sử dụng cho các nghiên

cứu về quá trình sinh tổng hợp chitinase [76, 92]. Nghiên cứu này tiến hành lựa chọn

sử dụng các thành phần bổ sung bao gồm cơ chất chitin (dao động từ 0,1% đến 1,5%),

glucose, pepton, K2HPO4, Ca2+/Mg2+ nhằm tìm ra nguồn dinh dưỡng phù hợp cho

quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng P1. Kết quả Hình 3.3D cho thấy, ở nồng

độ cơ chất 0,75% hoạt tính chitinase cao hơn cả cụ thể gấp 2,7 lần so với không bổ

sung cơ chất (70,3 U/ml so với 25,8 U/ml); gấp 1,8 lần so với nồng độ chitin là 0,1%.

Điều đó chứng tỏ rằng, khi không có hoặc nồng độ chitin quá thấp thì lượng cơ chất

này không đủ để chủng P1 vừa sinh trưởng vừa tổng hợp chitinase. Kết quả minh hoạ

ở Hình 3.3D cho thấy, hoạt tính chitinase đạt cao nhất tại nồng độ cơ chất 0,75% và

giảm dần khi nồng độ cơ chất tăng lên.

3.1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn các bon

Carbon là thành phần môi trường quan trọng nhất, vì nó là nguồn năng lượng

cho nấm và đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng cũng như sản xuất chất

chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp. Tốc độ mà nguồn carbon được chuyển hóa thường có

thể ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối và sản xuất enzym.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn các bon đến khả năng sinh tổng hợp

chitinase, (A). Các nguồn các bon, (B). Nồng độ glucose.

Hình 3.4A cho thấy, glucose cho hoạt tính chitinase cao nhất trong các nguồn

khảo sát 58,2 đến 62,7 U/ml. Do đó, glucose được chọn nguồn carbon trong quá trình

sinh tổng hợp chitinase. Điều này cũng hoàn toàn hợp lý bởi glucose là nguồn cacbon

duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden

Meyerhof, Pentose và Entner Doudoroff. Các nguồn carbon khác cho các hoạt động

chitinase thấp hơn [14, 152]. Trong thí nghiệm này, sự thay đổi hàm lượng glucose

dao động từ 0,75% đến 3,25% và các thành phần khác cố định. Ở nồng độ glucose từ

2,0% đến 2,5%, hoạt tính chitinase cao nhất là ở nồng độ 2% tương ứng với chitinase

đến 68,3 đến 70,1 U/ml. Vậy, glucose được chọn nguồn carbon với nồng độ 2% (Hình

3.4B).

3.1.5.3. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ

Giống như carbon, việc lựa chọn nguồn nitơ và nồng độ của nó trong môi

trường cũng đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất chất chuyển hóa. Bởi vì,

chủng P1 này có thể sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và / hoặc hữu cơ. Trong nghiên cứu

này, ảnh hưởng của một số nguồn nitơ như pepton, cao thịt, (NH4)2SO4, KNO3,

NaNO3 ở nồng độ 0,5% đã được nghiên cứu.

Hình 3.5. Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ đến khả năng sinh tổng hợp chitinase,

(A). Các nguồn ni tơ, (B). Nồng độ pepton

Kết quả Hình 3.5A nhận thấy pepton cho hoạt tính chitinase cao nhất, nguồn

nitơ vô cơ cho hoạt tính thấp hơn; kết quả này cũng trùng với các công bố của Farag

A., (2014), Dhar P., (2010), Jha S., (2016) [13, 50, 85]. Nồng độ pepton được biến

đổi trong khoảng 0,1% đến 0,7% và các thành phần khác không thay đổi. Hình 3.5B

cho thấy, pepton ở nồng độ 0,5% cho hoạt tính chitinase cao hơn do vậy sử dụng nồng

độ này cho các nghiên cứu sau.

Aliabadi N và cs., (2016), Shivalee và cs., (2018) đã xác nhận: trong một số

trường hợp có một vài nguồn nitơ như NH4Cl, KNO3 … có tác dụng ức chế quá trình

tạo thành chất chuyển hóa, đồng thời một vài nguồn ni tơ khác như pepton, cao thịt

lại có tác dụng tăng cường quá trình trao đổi chất [17, 152]. Theo Kim và cs., (2002),

K2HPO4 và một số nguồn phot pho ảnh hưởng đến hoạt động của enzym nói chung

và chitinase nói riêng [100]. Các kết quả hiển thị trong Hình 3.6A cho thấy ở K2HPO4

0,06% khi bổ sung vào môi trường cho hoạt tính chitinase cao hơn. Ngoài ra,

phosphate là một thành phần cơ bản khác cần thiết cho việc sản xuất phospholipid có

trong màng tế bào vi sinh vật và sản xuất axit nucleic. Do đó, lượng phốt phát thêm

vào trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào thành phần môi trường và nhu cầu của

vi sinh vật, cũng như theo nhu cầu tạo ra sản phẩm mong muốn. Không chỉ yếu tố

muối khoáng mà các ion kim loại như Ca2+, Mg2+ khi bổ sung vào môi trường nuôi

cấy cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của chitinase [152]. Kết quả Hình 3.6B cho thấy

tỷ lệ Ca2+/Mg2+ là 3: 4 cho hoạt tính chitinase cao hơn.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của muối khoáng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase,

(A). Ảnh hưởng của nồng độ K2HPO4, (B). Tỷ lệ Ca2+/Mg2+

Từ những kết quả trên cho thấy, cơ chất chitin, nguồn carbon, nguồn ni tơ,

K2HPO4, tỷ lệ Ca2+/Mg2+ có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Tuy

nhiên những kết quả trên mới chỉ được đánh giá độc lập của từng yếu tố mà chưa

đánh giá được tác động cộng hưởng, tương tác giữa các yếu tố với nhau. Với mục

tiêu chitinase có hoạt tính cao nhất, thí nghiệm được thiết kế nhằm tìm sự tương tác

đồng thời của các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase.

Khảo sát các yếu tố đã được chọn để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp

chitinase với các giá trị sau: nồng độ chitin (A) từ 0,5 đến 1,0%, glucose (B) từ 1%

đến 3%, peptone (C) từ 0,3 đến 0,7%, K2HPO4 (D) từ 0,01 đến 0,1%; và tỷ lệ

Ca2+/Mg2+ (E) từ 0,25 đến 1,25. Y là hoạt tính chitinase (U/ml).

Sử dụng phương án đáp ứng bề mặt – phương pháp cấu trúc có tâm nhằm tìm

kiếm sự kết hợp tối ưu của các thành phần này trong môi trường nuôi cấy. Giới hạn

nồng độ phù hợp của các yếu tố đã được xác định sơ bộ. Như vậy năm yếu tố với tổng

số 63 thí nghiệm được tiến hành. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được thể

hiện ở Phụ lục 2.

3.1.5.4. Phân tích ý nghĩa của mô hình với thí nghiệm

Bảng 3.3 cho thấy giá trị của "Model-F-value" là 28,72 và mô hình hoàn toàn

có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99% (p <0,0001). Giá trị của ‘‘Model Prob>F”

˂ 0,0001 mô hình có ý nghĩa cao. Giá trị “Lack of Fit Prob>F” của mô hình là p=

0,1548 cho thấy sự thiếu phù hợp là không đáng kể, điều đó chứng tỏ mô hình hoàn

toàn tương thích với thực nghiệm.

B A

C D

Hình 3.7. Bề mặt đáp ứng của từng cặp các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp

thay đổi; B – Cơ chất chitin và tỷ lệ Ca2+/Mg2+ thay đổi; C – Cơ chất chitin và nồng độ

K2HPO4 thay đổi; D – Sự tác động đồng thời của năm yếu tố.

chitinase của chủng Paecilomyces lilacinus P1. A – Cơ chất chitin và nồng độ glucose

Năm yếu tố là chitin, glucose, pepton, K2HPO4, tỷ lệ Ca2+/Mg2+ và mỗi cặp

yếu tố này cũng như sự tương tác của từng cặp yếu tố đều có ý nghĩa. Điều này được

thể hiện rõ hơn khi quan sát bề mặt đáp ứng trong Hình 3.7. Sự có ý nghĩa của các hệ

số hồi quy được kiểm định bởi chuẩn F, p < 0,05 cho biết mô hình có ý nghĩa. Trong

trường hợp này, các yếu tố A, B, C, D, E đều có p < 0,05 nên cả năm yếu tố này thể

hiện là các yếu tố có tác động đến hoạt tính chitinase. Nghiên cứu từng yếu tố đối với

hoạt động của chitinase cho thấy nồng độ cơ chất chitin có ảnh hưởng lớn nhất sau

đó là tỷ lệ Ca2+/Mg2+ và nồng độ glucose ít bị ảnh hưởng (Hình 3.7).

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy giá trị R2 là 0,9519 tiệm cận với 1, chứng

tỏ rằng hoạt tính chitinase thu được từ thực nghiệm gần đúng với giá trị dự đoán của

mô hình. Như vậy, hoạt tính chitinase được biểu diễn bằng phương trình bậc 2 như

Hoạt tính chitinase = + 1,12764 + 139,25238 * Cơ chất chitin huyền phù + 7,22665

* Glucose -16,05982 *Pepton+ 135,52633 * K2HPO4 + 21,87475 * Ca2+/Mg2+ -

2,50000 * Cơ chất chitin huyền phù * Glucose + 21,25000* Cơ chất chitin huyền phù

* Pepton+27,77778 * Cơ chất chitin huyền phù * K2HPO4+10,50000 * Cơ chất chitin

huyền phù * Ca2+/Mg2+ + 6,56250 * Glucose * Pepton+12,50000 * Glucose *

K2HPO4+3,62500 * Glucose * Ca2+/Mg2+ -125,00000 * Pepton * K2HPO4+2,50000

* Pepton * Ca2+/Mg2+ -1,98006E-013 * K2HPO4 * Ca2+/Mg2+-100,67076 * Cơ chất 2- chitin huyền phù2-3,41192*Glucose2-5,29806 * Pepton2-578,72706 * K2HPO4 25,16769 * Ca2+/Mg2+2

Bảng 3.3. Kết quả phân tích hồi quy hoạt tính chitinase

Thông số Tổng Bậc tự Trung bình Chuẩn Giá trị P

(Source) phương do (df) phương sai Fisher (Prob > F)

sai (sum khác (Mean (F

of square) value) of

squares)

significant

Mô hình 3326,15 20 166,31 28,72 < 0,0001

A- Chitin 23,53 1 23,53 4,06 0,0532

B-Glucose 90,88 1 90,88 15,69 0,0004

C-Pepton 10,28 1 10,28 1,77 0,1932

216,73 216,73 37,43 < 0,0001 1 D-K2HPO4

E-Ca2+/Mg2+ 1 2,18 2,18 0,38 0,5443

1 12,5 12,5 2,16 0,1525 AB

1 36,13 36,13 6,24 0,0184 AC

1 3,13 3,13 0,54 0,4685 AD

1 55,13 55,13 9,52 0,0044 AE

1 55,13 55,13 9,52 0,0044 BC

1 10,13 10,13 1,75 0,1964 BD

1 105,12 105,12 18,15 0,0002 BE

1 40,5 40,5 6,99 0,0131 CD

1 2 2 0,35 0,5613 CE

1 0 0 0 1 DE

1 234,72 234,72 40,53 < 0,0001 A^2

1 69,02 69,02 11,92 0,0017 B^2

1 0,27 0,27 0,046 0,8317 C^2

1 8,14 8,14 1,41 0,2453 D^2

1 234,72 234,72 40,53 < 0,0001 E^2

167,93 29 5,79 Residual

Lack of Fit

not

(Sự không tương

significant

thích mô hình) 146,06 22 6,64 2,12 0,1548

Pure Error

Sai số thuần 21,87 7 3,12

(Tổng phương

Cor Total

sai)

3494,08 49

Quá trình tối ưu hóa các thành phần môi trường lên men cho hoạt tính chitinase

cao nhất được thực hiện bởi phương pháp RSM - CCD đã xác định được điểm tối ưu.

Cuối cùng, vùng tối ưu của tất cả các yếu tố ảnh hưởng, bao gồm 63 thí nghiệm trong

đó tối ưu nhất là: chitin (0,75%), glucose (1,93%), pepton (0,33%), K2HPO4 (0,1%),

tỷ lệ Ca2+/Mg2+ (0,75); pH 7. Hoạt tính chitinase đạt được theo mô hình là 72,23

(U/ml).

3.1.5.5. Đánh giá tính thực tế của mô hình

Môi trường lên men được sử dụng là CHY1 đến CHY5, số liệu Bảng 3.4 cho

thấy các kết quả thực nghiệm tương đương với mô hình, điều này chứng tỏ rằng mô

hình thiết kế tương tự như thực tế.

Bảng 3.4. Đánh giá tính thực tế của mô hình

Hoạt tính chitinase

Môi Chitin Glucose Pepton (U/ml) Ca2+/ K2HPO4

trường (%) (%) (%) (%) Mg2+ Dự Thực tế

đoán

CHY1 0,75 1,84 0,55 0,09 0,63 71,30 69,7

CHY2 0,75 2,12 0,48 0,08 0,75 71,29 70,2

CHY3 0,75 1,93 0,33 0,1 0,75 72,23 70,8

CHY4 0,75 1,87 0,58 0,08 0,76 71,48 71,2

CHY5 0,75 2,41 0,6 0,09 0,92 70,36 69,4

CHY 0,75 2,0 0,5 0,06 0,75 70,75 68,35

Như vậy, môi trường CHY3 đã được chọn làm môi trường thích hợp cho quá

trình lên men sinh tổng hợp chitinase chủng P1: cụ thể là hoạt tính chitinase tăng lên

17% so với khi chưa tối ưu; đồng thời gấp 3,5 lần so với nghiên cứu của Homthong

và cs., (2016) [76]. Từ những kết quả trên cho thấy, nghiên cứu đánh giá sự tác động

đồng thời của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật nhằm

tìm ra phương án tối ưu nhất là rất quan trọng. Nghiên cứu của tác giả Tasharrofi,

N.và cs., (2011) cho thấy phương pháp tối ưu bề mặt đáp ứng đã giúp làm tăng khả

năng sinh tổng hợp chitinase của Bacillus pumilus từ 79,7 U/ml lên đến 97,67 U/ml

tức là tăng lên 22,5% [163]; theo nghiên cứu của Halifah và cs., (2019), quá trình tối

ưu bằng phương pháp RSM-CCD đã làm tăng 1,2 lần khả năng sinh tổng hợp

chitinase của Trichoderma virens [68]. Akhir S. và cs., (2009) đã làm tăng hoạt tính

chitinase lên gấp 4,5 lần khi lên men Bacillus licheniformis TH-1 sử dụng phương

pháp tối ưu bề mặt đáp ứng [15].

Khả năng diệt tuyến trùng cũng như khả năng sinh tổng hợp enzym chitinase

của P. lilacinus P1 tự nhiên là có hạn. Việc tăng hoạt lực diệt tuyến trùng cũng như

hoạt tính chitinase có thể được thực hiện thông qua cải biến di truyền. Với mục đích

đóng góp những nghiên cứu có ý nghĩa về mặt khoa học, trong đề tài này, hệ thống

chuyển gen mới vào chủng P1 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được thiết lập nhằm

tạo ra thể chuyển gen có hoạt lực diệt tuyến trùng và có hoạt tính chitinase cao hơn

so với chủng tự nhiên P1.

3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN DI TRUYỀN CHỦNG Paecilomyces lilacinus P1

3.2.1. Đánh giá khả năng mẫn cảm với 5-FOA và một số kháng sinh của

chủng P. lilacinus P1

Trước tiên, chủng P1 được đánh giá mẫn cảm với các loại kháng sinh thông

dụng dùng cho chuyển gen ở nấm là phleomycin, nourseothricin; hygromycin;

geneticin (G418) [46, 90, 126, 160]. Kết quả trình bày ở Hình 3.8 cho thấy P1 kháng

với cả 4 loại kháng sinh là phleomycin; nourseothricin; hygromycin; geneticin (G418)

với nồng độ kháng sinh từ 600 – 1000 µg/ml.

Theo nghiên cứu của Zhang và cs., (2014), Paecilomyces lilacinus ACSS mẫn

cảm với hygromycin ở nồng độ 50-500 µg/ml và mẫn cảm với G418 ở nồng độ 200

µg/ml trở lên; do đó Zhang và cs., (2014) đã sử dụng G418 (200 µg/ml) để chuyển

gen bằng phương pháp ATMT, không sử dụng hygromycin chuyển gen do nồng độ

quá cao [200]. Chaves B., (1997) đã sử dụng hygromycin với nồng độ 150 µg/ml để

chuyển gen vào Paecilomyces fumosoroseus [37]. Nhóm nghiên cứu của Lima G. và

cs., (2006) đã sử dụng marker hygromycin để chuyển gen bằng A. tumerfaciens vào

P. fumosoroseus với nồng độ 150 μg/ml [112].

Hình 3.8. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5-FOA của chủng P1

Wang J. và cs., (2010) đã sử dụng kháng sinh G418 với nồng độ 400 µg/ml để

chuyển gen bằng A. tumerfaciens vào P. lilacinus [183]. Yang J và cs., (2011) đã

chuyển gen bằng tế bào trần sử dụng hygromycin với nồng độ 1000 µg/ml ở P.

lilacinus112 [196]. Với các công trình nghiên cứu công bố về chuyển gen trên

Paecilomyces, các tác giả đều sử dụng gen kháng hygromycin và G418 là marker

chọn lọc cho quá trình chuyển gen [183, 196]. Tuy nhiên, chủng P1 lại kháng với cả

hai loại kháng sinh trên ở nồng độ cao (1000 µg/ml) (Hình 3.8).

Đối với 5-FOA chủng P1 không sinh trưởng được trên tất cả các nồng độ thử

nghiệm (Hình 3.8). Điều đó được giải thích rằng gen PyrG mã hóa cho enzym

decarboxylase orotidine-5’-monophotphate (OMP) xúc tác cho quá trình tổng hợp

pyrimidin tác dụng với 5-FOA (khi có mặt 5-FOA) không độc thành chất gây độc tế

bào là 5-fluorouracil dẫn tới tế bào chết [23]. Việc sử dụng marker trợ dưỡng để tiến

hành chuyển gen vào các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus sp., Penicillium sp.

bằng phương pháp ATMT đã được các nhà khoa học công bố trong những năm gần

đây [135, 136, 168] nhưng các nghiên cứu được cập nhật chưa đưa ra kết quả nào về

chuyển gen bằng A. tumerfaciens khi sử dụng marker trợ dưỡng với chất chọn lọc là

5-FOA tiến hành trên P. lilacinus. Như vậy, chủng P1 mẫn cảm với 5-FOA và có thể

sử dụng uridine/uracil là maker trợ dưỡng cho quá trình chuyển gen vào P. lilacinus

P1.

Ngoài việc sử dụng marker kháng kháng sinh, một số nghiên cứu như Yang

và cs., (2015), sử dụng các chất bảo vệ thực vật như glyphosate ammonium (basta),

carbedazim… là marker chọn lọc thể chuyển gen đối với P. lilacinus 36-1 bằng

phương pháp ATMT với nồng độ basta 4,5 mg/ml và carbedazim là 400 µg/ml [189].

Zhang và cs., (2014) đã tiến hành chuyển gen vgb vào chủng P. lilacinus ACSS bằng

phương pháp ATMT nhằm nghiên cứu vai trò của gen vgb [200]. Yang và cs., (2015)

đã chuyển gen ß tubulin vào P. lilacinus 36-1 bằng phương pháp ATMT nhằm xác

định thể chuyển gen kháng carbendazim [190].

Việc sử dụng marker là gen kháng kháng sinh hoặc gen kháng chất bảo vệ thực

vật có nguy cơ phát tán các gen kháng kháng sinh ra ngoài môi trường khi đưa vào

sản xuất lớn đồng thời tạo các thể chuyển gen dương tính giả nhiều (xuất hiện khuẩn

lạc trên đĩa có kháng sinh nhưng không có gen cần chuyển theo ý muốn). Do đó, sử

dụng các gen kháng chất diệt cỏ cũng như kháng chất bảo vệ thực vật mới chỉ dừng

lại ở mức nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà không ứng dụng nhiều trong thực

tiễn.

3.2.2. Tạo chủng nấm P. lilacinus đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng

uridine/uracil

3.2.2.1. Gây đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uridine/uracil bằng phương

pháp chiếu UV Từ kết quả đánh giá khả năng kháng kháng sinh và 5-FOA của chủng P1, môi

trường chứa 5-FOA, uridine, uracil được sử dụng để chọn lọc thu nhận các thể đột

biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uridine và uracil. Phương pháp chiếu UV đã được

áp dụng để tạo ra một số đột biến trong phòng thí nghiệm. Tác nhân gây đột biến là

UV được tiến hành trên máy cố định gen Vilber Lourmat [31, 82, 150]. Kết quả gây

đột biến bằng phương pháp chiếu UV thu được 826 khuẩn lạc trên môi trường chọn

lọc theo các thời gian chiếu khác nhau (6 giây, 12 giây, 18 giây, 24 giây (Hình 3.9B).

Khuẩn lạc sống sót được chọn lọc qua 5 thế hệ cấy chuyền liên tiếp trên môi trường

CDA + 5- FOA + uridine + uracil. Những thể đột biến bền về khả năng kháng 5-FOA,

trợ dưỡng uridine, uracil đồng thời có hình thái khuẩn lạc tương tự với chủng tự nhiên

P1được lựa chọn. Thể đột biến 424 có hình thái khuẩn lạc giống P1 hơn cả và được

sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.9C).

Hình 3.9. Kết quả chọn lọc thể đột biến bằng chiếu UV. A. Tạo thể đột biến

bằng UV trên môi trường chọn lọc 5-FOA; B. Tỷ lệ sống sót theo thời gian chiếu UV;

C. Kiểu hình các thể đột biến trên các môi trường. M8, M26, M52, M104, M424 là các

thể đột biến.

Kết quả được trình bày ở Hình 3.9B cho thấy, khi chiếu UV với thời gian 30

giây nhận thấy không có khuẩn lạc nào sống sót. Như vậy, chứng tỏ rằng P. lilacinus

P1 mẫn cảm với UV. Theo công bố của Yang và cs., (2015) khi đột biến bằng UV

trên chủng P. lilacinus 36-1 trong thời gian từ 30 giây trở lên, số lượng khuẩn lạc đột

biến là 648 khuẩn lạc đến thời gian 120 giây trở đi không xuất hiện khuẩn lạc. Thể

đột biến được chọn lọc trên môi trường bổ sung carbedazim nhằm lựa chọn thể đột

biến sai lệch nucleotid trên gen ß-tubulin [190]. Theo nghiên cứu của

Balasubramanian và cs., (2010), Trichoderma harzianum tự nhiên được tạo đột biến

bằng tia UV với thời gian từ 10, 20, 30 giây, ở giây thứ 30 trở đi khả năng sống sót

còn lại 1%. Thể đột biến T. harzianum H11 cho thấy khả năng sinh tổng hợp chitianse

và protease lần lượt là 1,3 và 1,6 lần so với chủng dại [19]. Ahmed và cs., (2007) tạo

đột biến bằng UV trên chủng Penicillium roquefortii kết quả cho thấy chủng đột biến

sinh tổng hợp alcaloid và lipase nhiều hơn so với chủng tự nhiên [56].

3.2.2.2. Xác nhận thể đột biến 424 bằng giải trình tự vùng ORF gen PyrG

Sử dụng UV gây đột biến hỏng gen trên P. lilacinus là một kỹ thuật được các

nhà khoa học quan tâm nhằm hướng tới những mục đích nghiên cứu về cải biến di

truyền. Yang và cs., (2015) nghiên cứu gen ß-tubulin của P. lilacinus 36-1 để phân

tích sự sai hỏng nucleotid dẫn đến thay đổi amino axitvà làm hỏng chức năng của

gen [190]. Hiện nay chưa có công bố nào trên thế giới về nghiên cứu đột biến hỏng

gen pyrG trên P. lilacinus. Trong nghiên cứu này, đoạn ORF_pyrG chủng P1 được

giải trình tự để so sánh với trình tự đoạn ORF_pyrG thể đột biến 424.

Đoạn ORF_pyrG của chủng P. lilacinus P1 dài 1899 bp được PCR với cặp

mồi PL_ORF_F và PL_ORF_R. Sản phẩm PCR được tinh sạch bởi kít (Intron) và

điện di kiểm tra trên gel agarose 0,7%. Sản phẩm sau tinh sạch được gắn trực tiếp vào

vector pJET 1.2/blunt với sự có mặt của T4 DNA polymerase. Vector trung gian được

biến nạp vào E. coli DH5α. Dòng biến nạp được nuôi cấy để tách plasmid. Plasmid

được điện di trên gel agarose 0,7% (Hình 3.10)

Hình 3.10. Nhân dòng đoạn gen ORFpyrG chủng P1 và thể đột biến 424. A.

Khuẩn lạc E. coli DH5α biến nạp đoạn gen ORFpyrG chủng P1 (1899 bp) và clony

PCR chủng P1; B. Khuẩn lạc E. coli DH5α biến nạp đoạn gen ORFpyrG (pyrG-) và

clony PCR chủng 424 pyrG-; C. Vector tách dòng pJP1 (chủng P1) và pJP- (424

pyrG-).

Bảng 3.5. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid và amino axit

Vị trí Nucleotid Amino axit biến đổi

205 (WT) T C L S (Leucine – Serine)

251 (WT) T G S R (Serine – Arginin)

795 (WT) T A Thêm R (Arginin)

DNA plasmid được giải trình tự bởi Công ty sinh hóa Phù Sa. Kết quả giải

trình tự chủng P1 và thể đột biến 424 được trình bày ở Phụ lục 2. Có ba vị trí đột biến

nucleotid trong vùng ORF: ở vị trí nucleotid thứ 205 chủng P1 tự nhiên đột biến từ

nucleotid T thành nucleotid C thể đột biến 424. Vị trí nucleotid thứ 251 từ T của

chủng P1 tự nhiên đột biến thành nucleotid G của thể đột biến 424. Đồng thời

nucleotid thứ 795 của chủng tự nhiên P1 là T chuyển thành nucleotid A của thể đột

biến 424.

Từ những vị trí đột biến nucleotid, sự sai khác của 3 amino axit trong vùng

ORF gen pyrG được phát hiện, kết quả được trình bày ở Bảng 3.5, chính điều này đã

giải thích rằng sự thay thế axit amin mới trong đoạn ORF làm mất khả năng mã hóa

enzym orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase). Sự thay

thế axit amin gây ra bởi những thay đổi trực tiếp tại vị trí của các codon đích cụ thể

(205, 251, 795) được biểu hiện là nguyên nhân gây ra tình trạng mất khả năng tổng

hợp uridine, uracil. Sự sai khác về trình tự amino axit đã dẫn đến thể đột biến 424 sai

hỏng vùng ORF của gen pyrG (Phụ lục 2). Do vậy thể đột biến 424 còn được gọi là

424pyrG(-).

Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc chủng P1 và 424pyrG(-) trên môi trường CD có

bổ sung uridine và uracil ở nồng độ khác nhau

Hiện nay, trên thế giới vẫn chưa có công bố nào về đột biến UV trên môi

trường bổ sung uridine, uracil và kháng 5-FOA nhằm sai hỏng gen pyrG ở P.

lilacinus. Ngoài ra, các công trình về chuyển gen bằng phương pháp ATMT sử dụng

marker trợ dưỡng là gen pyrG cũng không nhiều, công trình nghiên cứu của Nguyen

và cs., (2017) đã chuyển gen DsRed thành công bằng phương pháp ATMT sử dụng

trợ dưỡng uridine/uracil ở Aspergillus oryzae [135].

Kết quả được trình bày ở Hình 3.11 về hàm lượng uridine, uracil cần thiết để

oC nhận thấy thể đột biến 424 pyrG (-) trên các môi trường có bổ sung uridine/uracil

thể đột biến có thể phục hồi khả năng sinh trưởng. Sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30

không khác so với chủng P1. Đây là những căn cứ quan trọng từ đó lựa chọn môi

trường có bổ sung 0,005% uridine, 0,005% uracil cho quá trình chuyển gen vào thể

đột biến 424pyrG(-).

3.2.3. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ưu vào 424 pyrG(-)

Để tăng cường hiệu quả quá trình chuyển gen bằng phương pháp ATMT, phân

tích các thông số ảnh hưởng đến quá trình này đã được thực hiện như: nồng độ uridine,

uracil, nhiệt độ đồng nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ AS, mật độ bào tử

chuyển gen. Nhằm đánh giá khả năng phục hồi sinh trưởng, môi trường đồng nuôi

cấy có thành phần sau: IM + 0,001% uracil; IM + 0,001% uridine; IM + 0,005%

uidine; IM + 0,005% uracil đã được sử dụng. Nhiệt độ đồng nuôi cấy là nhân tố quan

trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen. Nhiệt độ thích hợp cho quá

oC đến 25 oC [46, 127, 201]. Thời gian đồng nuôi cấy trong điều kiện không chiếu

trình chuyển gen đối với chủng nấm sợi theo các công bố trước đây dao động từ 20

sáng và được thay đổi trong khoảng thời gian từ 48 – 72 giờ. Các công bố trước đây

của Bundock và cs., (1995), Michielse và cs., (2005) khẳng định AS là một yếu tố

quan trọng ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển T-DNA và tích hợp gen vir vào tế

bào nấm cần chuyển [30, 127].

(Nồng độ uridine, nồng độ uracil, thời gian đồng nuôi cấy, nhiệt độ đồng nuôi cấy, nồng độ

AS, nồng độ bào tử thể đột biến 424pyrG(-) của chủng P1)

Hình 3.12. Điều kiện được lựa chọn tối ưu cho quá trình chuyển gen

Nồng độ AS được thay đổi từ 100 µM, 200 µM, 300 µM. Các đĩa có phủ màng

cellulose (mã số FT 3-3-3-085 hoặc FT-3-303-090, Satorius) sau thời gian đồng nuôi

cấy được chuyển sang môi trường CDA có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300

mg/ml). Sau khi ủ đĩa từ 3-5 ngày ở nhiệt độ 25 oC – 28 oC trên đĩa môi trường chọn

lọc xuất hiện các khuẩn lạc nấm chuyển gen.

Kết quả được trình bày ở Hình 3.12 cho thấy, hiệu quả chuyển gen cao nhất

đạt được tới 2873 ± 224 thể chuyển gen/106 bào tử với nồng độ uridine là 0,005%,

thời gian đồng nuôi cấy 60 giờ, nhiệt độ đồng nuôi cấy 22 oC, nồng độ bào tử sử dụng

cho quá trình chuyển gen 106/ml, nồng độ AS là 200 µM. Kết quả này gấp 10 lần so

với nồng độ uridine 0,001%, gấp ba lần so với nồng độ uracil 0,005%. Số lượng thể

chuyển gen sau 60 giờ đồng nuôi cấy gấp hai lần so với nhiệt độ đồng nuôi cấy ở 48

giờ. Nhiệt độ đồng nuôi cấy ở 22 oC cho số lượng thể chuyển gen gấp 5 lần so với

nhiệt độ đồng nuôi cấy ở 20 oC, ở nhiệt độ đồng nuôi cấy 24 oC và 25 oC số lượng vi

khuẩn mọc nhiều lấn át thể chuyển gen vì vậy không có số liệu. Kết quả tối ưu cho

thấy, ở nồng độ AS 200 µM số lượng thể chuyển gen gấp hai lần so với nồng độ AS

100 µM và gấp 4,5 lần số lượng thể chuyển gen ở nồng độ AS là 300 µM. Điều này

chứng tỏ ở nồng độ AS cao, số lượng vi khuẩn A. tumefaciens bị diệt nhiều. Đối với

mật độ bào tử 107/ml cho hiện tượng mọc nền trên màng nuôi cấy, không phân biệt

thể chuyển gen riêng biệt.

Theo các nghiên cứu của Yang và cs., (2015), quá trình chuyển gen ß-tubulin

bằng phương pháp ATMT được tiến hành ở P. lilacinus 36-1 và tối ưu hóa các điều

kiện như thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ AS, nồng độ bào tử… cuối cùng đạt hiệu

quả là 256 thể chuyển gen với nồng độ bào tử khi chuyển gen 106 bào tử /ml; đạt 186

thể chuyển gen khi chuyển gen bar với thời gian đồng nuôi cấy 54 giờ; nhiệt độ đồng

nuôi cấy 25 oC; nồng độ AS là 250 µg/ml; mật độ bào tử là 106 bào tử/ml [203]. Lima

I. và cs., (2006) cho hiệu quả chuyển gen đạt 58,3 ± 18,5, 98,3 ± 24,8 và 169,7 ± 35,5

thể chuyển gen/105; 106 và 107 bào tử khi sử dụng A. tumerfaciens vào Paecilomyces

fumosoroseus [112]. Chaves B. và cs., (1997) đã chuyển gen bằng phương pháp tế

bào trần vào P. fumosoroseus, hiệu suất của quá trình chuyển gen cho 1,9 đến 2,5 thể

chuyển gen/µg DNA [37]. Lima G., và cs., (2006) đã chuyển gen bằng A.

tumerfaciens vào P. fumosoroseus cho hiệu quả chuyển gen 169,7±35,5 thể chuyển

gen/107 bào tử [112]. Trong nghiên cứu này, kết quả của luận án cho số lượng thể

chuyển gen sau khi tối ưu các điều kiện nhiều gấp 10 lần so với kết quả của Yang và

cs., (2015) và cao hơn rất nhiều lần so với công bố của Lima I. và cs., (2006), Chaves

B. và cs., (2007), Lima G., và cs., (2006).

Cải biến di truyền ở chủng P1 bằng phương pháp chuyển gen ATMT sử dụng

marker trợ dưỡng là một bước tiến vượt trội đồng thời thí nghiệm đã chuyển gen

thành công gen DsRed vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 với các thông số tối ưu

là nồng độ uridine bổ sung cho môi trường IM đồng nuôi cấy là 0,005%; nồng độ bào

tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml; nhiệt độ đồng nuôi cấy là 22 oC; nồng độ AS cho

giai đoạn cảm ứng là 200 µM AS; thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ (Hình 3.13).

Hình 3.13. Quy trình chuyển gen bằng phương pháp ATMT của thể đột biến

424pyrG(-) sử dụng vectơ nhị thể pEX2A với marker pyrG.

3.2.4. Xác nhận biểu hiện gen DsRed ở các thể chuyển gen

Vector pEX2A được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng xung điện

[161]. Sau 3-5 ngày chuyển màng, nuôi cấy ở nhiệt độ 28 oC, các khuẩn lạc chuyển

gen xuất hiện. Nuôi cấy quan sát hình thái khuẩn lạc các thể chuyển gen trên môi

trường CDA và CDA có bổ sung 0,005% uridine và 0,005% uracil. Tiến hành xác

nhận các thể chuyển gen bằng cách nuôi cấy thu sợi và tách chiết DNA của các thể

chuyển gen. Phản ứng PCR được thực hiện với những cặp mồi đặc hiệu.

Kết quả so sánh hình thái, màu sắc khuẩn lạc của các thể chuyển gen (ký hiệu

là PE1 – PE5) cho thấy các thể chuyển gen và chủng tự nhiên không có sự khác biệt

(hình 3.14A).

Hình 3.14. Xác nhận thể chuyển gen biểu hiện huỳnh quang đỏ DsRed từ

Ghi chú: A. Kết quả chuyển gen DsRed bằng vector pEX2A vào thể đột biến 424 pyrG (-)

chủng P. lilacinus P1 và sàng lọc ngẫu nhiên 5 chủng chuyển gen (từ PE1 đến PE5) trên môi

trường CD có bổ sung 0,005% uridine, uracil đồng thời trên môi trường CD tối thiểu. B. Xác

nhận các thể chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi AnpyrG_ORF-F/AnpyrG_ORF-

R và cặp mồi DsRed-F/DsRed-R. C. Năm thể chuyển gen DsRed (từ PE1 đến PE5) được

quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

424pyrG(-) chủng P. lilacinus P1.

Gen GFP, DsRed là gen chỉ thị huỳnh quang xanh và huỳnh quang đỏ được sử

dụng phổ biến trong chuyển gen ở nấm và được biểu hiện thành công ở các loài nấm

khác nhau [105, 136]. Khi tế bào nấm nhận được gen DsRed sẽ xuất hiện màu đỏ

dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng phù hợp [57, 83, 134]. Trong nghiên cứu

này, các thí nghiệm được tiến hành chuyển gen DsRed vào thể đột biến 424 pyrG (-)

chủng P1 bằng phương pháp ATMT. Thí nghiệm được tiến hành với vector pEX2A,

thiết kế theo nghiên cứu của Nguyen và cs., (2016), Tao Xuan Vu và cs., (2019) với

marker gpdA và promotor là AnpyrG từ Aspergillus niger [136, 179].

Năm thể chuyển gen DsRed thu được từ 424 pyrG(-) đã được cấy trên môi

trường tối thiểu CDA; nhiệt độ nuôi cấy 30 oC trong thời gian 3 ngày để tiến hành thu

hệ sợi nấm sử dụng cho tách chiết DNA. Khi gen pyrG được đưa trở lại các chủng

đột biến này, các thể chuyển gen sinh trưởng bình thường. Sự tích hợp của gen chỉ

thị DsRed (729 bp) vào bộ gen được xác định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc

hiệu DsRedF/DsRedR (729 bp); AnPyrG_ORFF/AnPyrG_ORFR (1005 bp). Sản

phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,7%. Kết quả PCR cho thấy gen DsRed và

gen marker AnpyrG đều đã được tích hợp vào trong bộ gen của các thể chuyển gen

(từ PE1 đến PE5) (Hình 3.14B).

Kết quả được trình bày ở Hình 3.14C cho thấy băng 729 bp và băng 1005 bp

xuất hiện trên bản điện di điều đó chính tỏ rằng gen DsRed và AnpyrG đã được chuyển

vào thể đột biến 424pyrG(-).

Đồng thời kết quả Hình 3.14C khi làm tiêu bản hệ sợi dưới kính hiển vi huỳnh

quang cho thấy gen DsRed đã được biểu hiện thành công ở P. lilacinus P1 thông qua

tín hiệu huỳnh quang đỏ. Điều đó chứng tỏ rằng, hệ thống chuyển gen mới thiết lập

cho hiệu quả biểu hiện gen tốt, cho tới nay DsRed chưa từng được biểu hiện ở

Paecilomyces, mở ra triển vọng nghiên cứu vai trò của một số gen liên quan đến cơ

chế diệt tuyến trùng trong tương lai. Urquhart và cs., (2018) đã chuyển gen và biểu

hiện thành công gen GFP vào P. variotii CBS 101075 bằng phương pháp ATMT

nhằm mục đích nghiên cứu chức năng một số gen trong đó có gen leuA [174].

Kết quả nghiên cứu cho thấy, gen huỳnh quang đỏ DsRed đã được biểu hiện

thành công ở chủng 424pyrG(-). Các khuẩn lạc chuyển gen được tiến hành cấy

chuyền, thuần khiết, lưu giữ chủng. Việc tạo ra ngân hàng các thể chuyển gen có vai

trò quan trọng trong nghiên cứu sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt lực diệt tuyến

trùng cao, mở ra triển vọng mới cho nghiên cứu biểu hiện protein, enzym tái tổ hợp

cũng như sản xuất các chất có hoạt tính sinh học ở nấm P. lilacinus.

3.2.5. Sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease và

hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao

Quá trình nghiên cứu tối ưu chuyển gen vào chủng 424pyrG(-) đã thu được

thư viện các thể đột biến do quá trình chèn T-DNA trong quá trình chuyển gen và

chúng có thể được sử dụng để sàng lọc các thể đột biến liên quan đến khả năng sinh

chitinase, protease cũng như diệt tuyến trùng.

Năm trăm thể chuyển gen được xác định hoạt tính chitinase và được sàng lọc

(Phụ lục 2). Kết quả trên Hình 3.15A cho thấy thể chuyển gen PE858 cho hoạt tính

chitinase cao gấp 11,7 lần (722,28 U/ml và 61,7 U/ml) so với chủng tự nhiên (WT).

Nhóm A (các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase dao động từ 23,7 U/ml đến 35,4

U/ml) tức là thấp hơn chủng tự nhiên P1 (WT) chiếm tỷ lệ 65,4%, nhóm B (các thể

chuyển gen có hoạt tính dao động từ 68,85 U/ml đến 88,01 U/ml) tức là cao hơn

chủng tự nhiên P1 (WT) khoảng 1,2 lần chiếm tỷ lệ 15,3%. Nhóm C (các thể chuyển

gen có hoạt tính dao động từ 98,3 U/ml đến 133,4 U/ml) tức là cao hơn chủng tự

nhiên P1 (WT) khoảng 2 lần chiếm tỷ lệ 19,2%. Như vậy, thể chuyển gen PE858 và

nhóm C tiếp tục được sàng lọc và xác định hoạt tính protease. Hoạt tính protease gần

100 thể chuyển gen của nhóm C được trình bày ở Hình 3.15B. PE858 có hoạt tính

protease gấp 1,8 lần so với chủng tự nhiên P1 (WT), tiếp theo là nhóm C2 (có hoạt

tính từ 109,9 U/ml đến 158,4 U/ml) chiếm 7,7% cao xấp xỉ so với PE858. Nhóm C3

có hoạt tính tương đương với chủng tự nhiên P1 (WT) chiếm 23,9% và nhóm C1 có

hoạt tính thấp hơn hẳn so với chủng tự nhiên P1 (WT) chiếm 68,4%. Lý do các chủng

đột biến này có sự thay đổi hoạt tính sinh tổng hợp chitinase, protease có thể do quá

trình chuyển gen DsRed vào 424pyrG(-), gen DsRed nằm trong vùng T-DNA đã được

chèn ngẫu nhiên vào một trong các gen hoặc đoạn gen liên quan dẫn đến bất hoạt các

gen này ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Những đoạn gen sai hỏng

này là các đối tượng tiềm năng cho nghiên cứu chức năng gen ở P. lilacinus.

Từ những kết quả chọn lọc ở trên, thể chuyển gen PE858 được thử nghiệm khả

năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. như phương pháp 2.2.13.5.

Hình 3.15. Hoạt tính chitinase và protease của các thể chuyển gen và chủng P1, A. Hoạt tính chitinase, B. Hoạt tính protease.

Kết quả thử nghiệm cho thấy trong vòng 48 giờ, dịch nuôi cấy PE858 cho tỷ

lệ tuyến trùng Meloidogyne sp. bị chết lên đến 72%, trong đó chủng tự nhiên (P1) cho

tỷ lệ chết 11%. Điều đó chứng tỏ hoạt tính chitinase cao ảnh hưởng đáng kể đến tốc

độ diệt tuyến trùng.

Hình 3.15 cho thấy ở mẫu đối chứng (ĐC) là nước cất, tuyến trùng chết tự

nhiên xấp xỉ 1%, thể chuyển gen PE858 cho tốc độ diệt tuyến trùng Meloidogyne sp.

nhanh gấp 7 lần sau 48 giờ so với chủng P1 (WT). Đồng thời quan sát dưới kính hiển

vi điện tử, sự phân nhánh hệ sợi của PE858 nhiều hơn rõ rệt so với WT (Phụ lục 2).

Như vậy, ở PE858 đã có việc chèn T-DNA ngẫu nhiên vào các gen điều hòa hoặc vào

vị trí nhằm kích hoạt biểu hiện một số gen tham gia vào cơ chế diệt tuyến trùng. Việc

cải biến di truyền tạo các thể đột biến cho khả năng diệt tuyến trùng cao ở chủng P1

mở ra hướng nghiên cứu mới nhằm điều tra vai trò, chức năng của các gen liên quan

đến cơ chế diệt tuyến trùng cũng như các gen tham gia vào quá trình trao đổi chất của

chủng nấm sợi tiềm năng này.

Hình 3.16. Tỷ lệ chết của tuyến trùng A. Hình ảnh tuyến trùng sống B. Hình ảnh

KHV Olympus CX 41 độ phóng đại 150x)

tuyến trùng chết C. Đồ thị tỷ lệ chết của tuyến trùng. (Ghi chú: hình A, B được chụp trên

Những kết quả trên có ý nghĩa lớn về mặt khoa học đồng thời có thể sản xuất

chitinase để phối trộn vào chế phẩm nhằm tăng hiệu lực diệt. Việc sử dụng chủng đột

biến để ứng dụng tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng tại Việt Nam còn gặp phải

nhiều vấn đề về mặt pháp lý.

Nhằm giải quyết tính cấp thiết là tạo chế phẩm và áp dụng thử nghiệm thực tế

chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng trên cây hồ tiêu khu vực Tây Nguyên, nhóm

nghiên cứu tiến hành tạo chế phẩm sinh học có sử dụng chủng nấm P1 tự nhiên. Quá

trình tạo chế phẩm, thử nghiệm chế phẩm là một phần nội dung của Hợp đồng

số 07/16-ĐTĐL.CN-CNN ngày 10/6/2016 giữa Bộ Khoa học và Công nghệ với Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với tên đề tài

“Ứng dụng công nghệ nano sản xuất chế phẩm sinh học dạng dịch thể từ vi sinh vật

và thảo mộc phòng trừ tuyến trùng và bệnh rễ cây hồ tiêu ở Tây Nguyên” - Mã số

ĐTĐL.CN-07/16. Công ty Cổ phần Nicotex kết hợp với Viện Công nghệ sinh học

sản xuất chế phẩm. Năm 2018 đã hoàn thiện quy trình tại công ty và nhiệm vụ đặt ra

là triển khai mô hình, xây dựng quy trình sử dụng các chế phẩm để có các biện pháp

quản lý tổng hợp bệnh tuyến trùng, nấm gây hại rễ cây hồ tiêu áp dụng cho tỉnh Đăk

Lăk.

3.3. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC

DIỆT TUYẾN TRÙNG

3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và các loại môi

trường quá trình sinh trưởng của chủng P1

Nhiệt độ nuôi cấy là yếu tố cần thiết, ảnh hưởng trực tiếp quá trình sinh trưởng

của chủng P. lilacinus P1. Các kết quả được thể hiện trong hình 3.17A cho thấy: sau

144 giờ nuôi cấy, sinh khối sợi nấm thu được cao nhất ở nhiệt độ 30 oC, sau đó là ở

25 oC. Kết quả này tương tự như công bố cho thấy ở Phellinus sp. [40], Paecilomyces

japonica nhưng lại khác so với Cordyceps militaris [124] sinh khối nhiều nhất ở 25oC.

Trên cơ sở môi trường đã lựa chọn để nuôi cấy P1 như CMA, Czapeck-Dox,

PDA, CHY dịch thể với pH ban đầu là 7,0, tiến hành nuôi cấy trong thời gian 7 ngày,

nhiệt độ nuôi cấy 30 oC; tốc độ lắc 200 vòng/phút. Lượng bào tử P1 đưa vào nuôi cấy

là 100 µL với nồng độ bào tử 106/ml bào tử. Sau mỗi 24 giờ nuôi cấy, xác định sinh

khối tươi chủng P1 tạo thành. Kết quả được trình bày ở Hình 3.17B cho thấy, trên

môi trường CD và PDA dịch thể cho sinh khối ướt tương đương nhau (15,517 ± 0,439

mg/ml và 15,103 ± 0,245 mg/ml).

Hình 3.17. Các yếu tổ ảnh hưởng thu hồi sinh khối của P. lilacinus P1; (A). Ảnh

hưởng thời gian, (B). Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy.

Từ thời gian 144 giờ đến 168 giờ, lượng sinh khối tăng không đáng kể, kết quả

này cũng tương tự như công bố của Kim và cs., (2002), Mascarin và cs., (2010) khi

thu hồi hệ sợi của Isaria fumosorosea (còn gọi là Paecilomyces fumosorosea),

Paecilomyces japonica [99, 123]. Nhằm tiết kiệm thời gian cũng như tính đến lợi ích

100

về mặt kinh tế, thời gian nuôi cấy sẽ dừng lại ở thời điểm 144 giờ và sử dụng để tạo

chế phẩm sinh học.

3.3.2. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. gây

bệnh cây hồ tiêu

Để tạo chế phẩm sinh học dạng dịch thể, vấn đề cần thiết là nghiên cứu sự tồn

tại của chủng nấm trong chế phẩm. Theo nghiên cứu của Kagimu và cs., (2018) một

số cơ chất có khả năng duy trì sự sống của chủng vi sinh vật như than bùn, tinh bột,

trấu, cám gạo … được sử dụng tạo chế phẩm [86]. Thí nghiệm được bố trí trên ba

công thức nhằm đánh giá khả năng tồn tại của chủng P1 sau thời gian 10 ngày; 30

ngày, 60 ngày. Bào tử bổ sung ban đầu là 1x107/ml. Mẫu đối chứng là môi trường

CD cấy bào tử P1. Quan sát, theo dõi sự tồn tại của chủng P1 trên các công thức thí

nghiệm như Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Khả năng sống sót của chủng P1 trong dịch bảo quản

Công thức Ký hiệu 10 ngày 30 ngày 60 ngày

Bột bắp 5% + Cám gạo 5% + CM1 (0,3 ± 0,05) (2,4 ± (1,45 ± 0,05)

NaCl 0,9% x107 0,35) x 106 x 106

Tinh bột hồ hóa 20% + Cám CM2 (1,2 ± 0,28) x (5,8 ± (2,31 ± 0,27)

gạo 5% + NaCl 0,9% 108 0,36) x 107 x 107

EDTA 1% + Cám gạo 5% + CM3 (1,7 ± 0,24) x (1,57 ± (2,34 ± 0,31)

104 0,18) x 102 x 101 NaCl 0,9%

Than bùn 5% + Cám gạo 5% CM4 (1,52 ± 0,23) (2,87 ± (1 ± 0,25)

x 106 0,38) x 106 x 106 + NaCl 0,9%

(-): Không sinh trưởng

Theo số liệu ở Bảng 3.6, các chất mang khác nhau có số lượng bào tử nấm

khác nhau. Chủng P1 có mật độ bào tử nấm tăng trong giai đoạn 10 ngày đầu và mật

độ ổn định trong giai đoạn từ 30 ngày đến 60 ngày trên CM2 (tinh bột hồ hóa 20% +

Cám gạo 5% + NaCl 0,9%). EDTA có thể được coi là một chất làm tăng sức mạnh

cho thành tế bào của vi sinh vật đồng thời EDTA cũng được coi là chất kháng khuẩn

[61]. Nhưng trong trường hợp này CM3 không phù hợp với chủng P1. CM2 có sự

101

khác biệt về số lượng bào tử nấm so với nghiệm thức của CM1, CM4. Đồng thời trên

CM1 và CM4 số lượng bào tử nấm không có sự khác biệt nhiều.

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT DỊCH THỂ CHẾ PHẨM SINH HỌC 10 LÍT/MẺ

Giống gốc P1

Hoạt hóa giống (20 ml)

30 oC, 48 giờ lắc 200 v/phút

Môi trường CDB, pH7, bình tam giác

30 oC, 24 giờ lắc 200 v/phút

Nhân giống cấp 1 (150 ml)

CDB, pH7, bình tam giác 1 lít

CDB, pH7, 144 giờ, 30 oC, sục khí 0,5 v/v/phút

Nhân sinh khối (2 lít bình lên men 5 lít

Cám gạo 25%; Xơ dừa 15%

Tinh bột hồ hóa 1%

Thu hồi sinh khối, lên men xốp 96 h, 30 oC

Thu hồi bào tử

0,9% NaCl + 5% cám gạo

Xơ dừa

Phối trộn bào tử

Kiểm tra mật độ

Hoàn thành Chế phẩm sinh học

Hình 3.18. Sơ đồ quy trình sản xuất dịch thể chế phẩm sinh học

102

Mô tả kỹ thuật sản xuất dịch thể vi nấm: Hình 3.18 cho thấy, chủng P1 được

hoạt hóa và nuôi cấy trên môi trường CD dịch thể (CDB), pH7, sục khí 0,5 v/v/phút

nhiệt độ nuôi cấy là 30 oC. Sau 144 giờ nuôi cấy, sinh khối được phối trộn với cám

gạo 25% và mụn xơ dừa 15% đã khử trùng ở 121 oC trong 30 phút, chuyển sang lên

men xốp sau 96 giờ, nhiệt độ nuôi cấy 30 oC. Thu nhận bào tử và phối trộn với dung

dịch tinh bột 20% đã qua hồ hóa, 5% cám gạo và 0,9% NaCl sao cho đạt mật độ 107

CFU/ml. Chế phẩm dạng dịch thể của chủng P1 được bảo quản ở nhiệt độ 20 oC –

30oC và được kiểm tra mật độ sau các khoảng thời gian bảo quản: 10 ngày, 1 tháng,

3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng, 15 tháng và 18 tháng. Kết quả kiểm tra mật độ

trình bày ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Khả năng sống sót của chủng P1 trong chế phẩm theo thời gian

Thời gian 10 01 03 06 9 12 15 18

bảo quản ngày tháng tháng tháng tháng tháng tháng tháng

Mật độ (107 2,04 ± 2,12 ± 1,79 ± 1,7 ± 1,2 ± 0,97 ± 0,86 ± 0,84 ±

CFU/ml) 0,37 0,24 0,28 0,41 0,39 0,25 0,29 0,26

Như vậy trong khoảng thời gian 30 ngày, mật độ tế bào có tăng với lượng

không đáng kể. Sau 06 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng, mật độ tế bào còn lại trong

chế phẩm có suy giảm chút ít, có thể do suy giảm nguồn dinh dưỡng, nhưng các tế

bào vẫn còn một lượng nhỏ tinh bột, vi lượng … để tồn tại ở dạng tiềm sinh. Đồng

thời chế phẩm cũng được tiến hành thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ

Meloidogyne sp. trong vòng 96 giờ cho thấy: chế phẩm làm chết trên 50% số lượng

tuyến trùng. Do mật độ nấm suy giảm ít trong quá trình bảo quản, vì vậy chế phẩm

vẫn giữ được hoạt tính diệt tuyến trùng.

3.3.3. Nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại

hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới của chế phẩm sinh học

Quá trình triển khai thử nghiệm trên đất trồng có ý nghĩa thực tế nhiều hơn

trong môi trường lỏng do môi trường đất gần hơn với thực tế thử nghiệm, mô phỏng

chính xác hơn so với thử nghiệm trên môi trường dịch thể. Sử dụng đất đỏ bazan:

phân hữu cơ sạch theo tỷ lệ 3:1, đất trộn được xử lý bằng cách trải mỏng, phơi nắng

103

trong 4-5 ngày để tiêu diệt bớt vi sinh vật. Hỗn hợp đất và phân hữu cơ được chia đều

vào các chậu trung bình 10 kg/chậu và đưa các chậu vào trong nhà lưới. Cây hồ tiêu

(giống Vĩnh Linh) 3,5 tháng tuổi được sử dụng làm thí nghiệm (30 cây/lô). Trong quá

trình thử nghiệm luôn luôn duy trì độ ẩm cần thiết cho sinh trưởng của cây và duy trì

sự sống của tuyến trùng. Sau khi lây nhiễm, để tuyến trùng ổn định trong thời gian 1-

2 ngày, kiểm tra lại mật độ tuyến trùng có trong 100 g đất. Quá trình thử nghiệm diễn

ra trong nhà lưới với nhiệt độ trung bình dao động từ 26 oC đến 29 oC. Kết quả xác

định khả năng sống sót của tuyến trùng trong đất, trong rễ, hiệu lực của chế phẩm

sinh học (H, %) tuyến trùng sau 10 ngày, 20 ngày, đến ngày thứ 30.

Bảng 3.8. Mật độ tuyến trùng còn sống (MĐTT) và Hiệu lực diệt (HLD) tuyến

trùng sau khi xử lý bằng Chế phẩm sinh học trong chậu trồng ở nhà lưới

MĐTT còn sống và Hiệu lực diệt sau khi xử lý (%)*

Công thức Sau 10 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày

MĐTT trước xử lý MĐTT HLD MĐTT HLD MĐTT HLD

100,0 0 0 0 104,7 ± 0,12 106,7 ± 0,21 109,9 ± 0,25

100,5

80,5 ± 0,18 23,11 ± 0,2 73,7 ± 0,19 30,92 ± 0,28 60,5 ± 0,15 44,9 ± 0,21

100,0

82,8 ± 0,24 20.91 ± 0,27 77,3 ± 0,15 27,6 ± 0,31 67,3 ± 0,19 38,8 ± 0,32 ĐC1 (không bổ sung tuyến trùng) ĐC2-(+1) (theo tập quán canh tác) ĐC3-(+2) (Nokaph)

100,7 TN1 (CPSH pha 50x) 71,4 ± 0,16 33,27 ± 0,25 63,9 ± 0,18 42,77 ± 0,18 56,3 ± 0,25 53,57 ± 0,27

100,0

100,3

100,0 41,84 ± 0,14 35,03 ± 0,24 31,81 ± 0,36 31,23 ± 0,29 24,8 ± 0,18 22,2 ± 0,21 52,48 ± 0,18 45,51 ± 0,37 42,31 ± 0,19 73,4 ± 0,13 79,9 ± 0,18 82,5 ± 0,22 64,8 ± 0,16 71,6 ± 0,21 74,9 ± 0,23 57,4 ± 0,38 64,7 ± 0,28 67,5 ± 0,19

TN2 (CPSH pha 100x) TN3 (CPSH pha 150x) TN4 (CPSH pha 200x) Ghi chú: MĐTT- Mật độ tuyến trùng còn sống (con/100 g đất); HLD: Hiệu lực diệt

tuyến trùng của chế phẩm (%).

104

Kết quả Bảng 3.8 cho thấy, tại các thời điểm kiểm tra sau xử lý, mật độ tuyến

trùng trong các chậu đối chứng có tăng thêm từ 4,7% đến 9,9%. Trong các chậu thí

nghiệm mật độ tuyến trùng còn sống giảm xuống còn 56-82% do tác động của chế

phẩm. Hiệu lực diệt tuyến trùng dao động trong khoảng 20-53%. Xét về hiệu lực diệt

tuyến trùng ở các mức pha loãng 50 và 100 lần gần giống nhau, còn ở mức 150 và

200 lần hiệu lực giảm hẳn, nên chọn mức pha loãng chế phẩm 100 lần. So sánh với

hai mẫu ĐC 2 và ĐC 3 hiệu lực diệt của chế phẩm sinh học ở TN 3 và TN 4 gần tương

tự nhau, trong đó mẫu ĐC 3 (chỉ sử dụng 1 loại chế phẩm bán sẵn trên thị trường)

cho hiệu lực diệt ít hơn so với ĐC 2 (theo tập quán canh tác của người trồng hồ tiêu).

Kết luận: Tùy theo mức độ bị dịch bệnh của cây hồ tiêu để lựa chọn độ pha loãng

chế phẩm sinh học cho thích hợp, mức trung bình là pha loãng 100 lần. Từ kết quả

nghiên cứu nhằm lựa chọn độ pha loãng chế phẩm sinh học P1 phù hợp, mô hình thử

nghiệm 3 ha được triển khai tại vườn trồng hồ tiêu thuộc xã Eaba, huyện Buôn Đôn,

tỉnh Đăk Lăk.

3.3.4. Đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng chế phẩm

Các vườn hồ tiêu trong thời kỳ kinh doanh (5-7 năm tuổi) của mô hình thu

hoạch trong khoảng cuối tháng 3 và 4, thời điểm thích hợp để đánh giá số lượng cây

không có khả năng phục hồi về cấp bệnh thấp hơn, tuy những cây đó vẫn cho thu

hoạch (nhưng năng suất thấp). Thời gian triển khai mô hình từ tháng 4 năm 2018 đến

tháng 3 năm 2019. Mô hình đánh giá tổng thể những cây không phục hồi và năng suất

thực tế của mô hình trên đồng ruộng. Năng suất cây trồng được thể hiện qua các cây

còn sống và cho thu hoạch quả. Số liệu bình quân trồng cây hồ tiêu ở Tây nguyên

1800 trụ/1ha. Ở mỗi khu vực, mỗi cấp bệnh, mô hình triển khai đánh giá năng suất

trên 10 trụ hồ tiêu x 6 điểm thu hoạch bằng 60 trụ, từ đó tính bình quân cho một ha

trồng thực tế để tính năng suất bình quân, kết quả thể hiện trong Bảng 3.9.

Qua kết quả Bảng 3.9 cho thấy, khi vườn hồ tiêu không bị bệnh, sử dụng chế

phẩm sinh học chỉ có tác dụng phòng trừ bệnh là chủ yếu, tuy nhiên năng suất của

vườn đối chứng không bị bệnh vẫn cao hơn hẳn các vườn đối chứng chớm bị vàng lá.

105

Bảng 3.9. Tỷ lệ cây không phục hồi và năng suất của mô hình thử nghiệm

Tỷ lệ cây không phục Năng suất của MH Cấp Năng suất, tạ/1 ha Năng suất hồi, % giảm so với Cấp 0 cây bị tăng, % bệnh ĐC Mô hình ĐC Mô hình Tạ/ha %

Cấp 0 - - 32,7 39,3 - - 20,9

Cấp 1 96,1 ± 1,3 20,6 ± 2,4 36,9 6,11 2,4 31,8 28,0

Cấp 2 96,1 ± 2,1 23,8 ± 2,7 26,1 35,9 8,65 3,4 37,5

Cấp 3 98,3 ± 0,8 52,8 ± 3,2 19,9 28,9 26,46 10,4 45,2

Cấp 4 99,7 ± 0,5 88,3 ± 2,75 7,8 11,6 70,48 27,7 48,7

Ghi chú: ĐC: Đối chứng; MH: Mô hình thí nghiệm; KPH: Cây không phục hồi, cây

bị chết hoặc không giảm cấp bệnh, cho năng suất thấp.

Như vậy, chế phẩm sinh học P1 có tác dụng điều hòa tăng năng suất tới trên

20%. Các vườn chớm bị bệnh vàng lá, năng suất cả bên đối chứng và mô hình đều

giảm nhiều so với vườn không bị vàng lá, nhưng do vườn mô hình có sử dụng chế

phẩm nên hạn chế được tuyến trùng do đó năng suất tăng hơn nhiều so với đối chứng,

từ 31,8 % đến 48,7%. Thử nghiệm trên mô hình cho thấy hiệu quả thiết thực nhất khi

cây hồ tiêu chớm bị vàng lá cần dùng ngay các chế phẩm sinh học để phòng trừ, một

khi tuyến trùng và nấm gây hại đã xâm nhập vào phần nhựa cây thì khó hơn nhiều

trong việc chữa trị bệnh. Theo công bố của Nguyễn Thị Chúc Quỳnh và cs., 2015,

thử nghiệm chế phẩm SH-BV1 kết hợp với Nokaph 10GR quy mô 1 ha/2 mô hình tại

tỉnh Gia Lai trên vườn hồ tiêu kinh doanh 9 năm tuổi trong 3 năm liên tục từ 2012,

năng suất tăng ở niên vụ thứ 3 là 22,9% - 38,5% (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt

Nam, Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai) [1].

Khuyến cáo sử dụng chế phẩm sinh học ngay từ khi trồng mới, kiến thiết vườn

hồ tiêu và kiểm tra định kỳ khi có biểu hiện vàng lá phải sử dụng ngay các chế phẩm

sinh học, vì tác dụng của chế phẩm sinh học là từ từ và cần có thời gian. Trong các

cấp bệnh đều tăng năng suất so với đối chứng, nhưng thực tế cho thấy những cây đã

chớm bị bệnh thì năng suất trên 1 ha đều giảm so với cây không bị bệnh.

106

KẾT LUẬN

1. Đã tuyển chọn được ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng

- Từ 15 mẫu đất bản địa khu vực trồng hồ tiêu tỉnh Đăk Lăk đã phân lập được 23

chủng nấm sợi trong đó có 03 chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng và được

định danh là Paecilomyces lilacinus P1; Paecilomyces variotii NV01; Plerotus

giganteus NV20.

- Sử dụng phương án đáp ứng bề mặt – phương pháp cấu trúc có tâm, hoạt tính

chitinase của chủng P1 cao hơn 17% so với hoạt tính chitinase khi chưa tối ưu.

2. Tạo chủng đột biến PE858 có hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao

- Đã thiết lập được hệ thống chuyển gen mới thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumerfaciens dựa trên cơ chế trợ dưỡng uridine/uracil ở nấm Paecilomyces lilacinus

với hiệu quả chuyển gen đạt 2873 ± 224 thể chuyển gen/106 bào tử.

- Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với chủng tự nhiên

P1 trong thời gian 48 giờ.

3. Tạo chế phẩm sinh học từ chủng P1 và thử nghiệm quy mô nhà lưới, quy mô

đồng ruộng 3 ha/mô hình tại tỉnh Đăk Lăk

- Đã xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng dạng dịch thể,

chế phẩm ổn định với mật độ 107 CFU/ml sau 18 tháng.

- Chế phẩm sinh học từ chủng nấm sợi trên được thử nghiệm trên cây hồ tiêu 3,5

tháng tuổi quy mô trong nhà lưới có hiệu lực diệt 52,48% sau 30 ngày.

- Năng suất của mô hình trình diễn 3 ha triển khai tại Đăk Lăk sau khi sử dụng

chế phẩm tăng 20,9% so với đối chứng ở cấp độ cây khỏe mạnh; tăng 48,7% khi sử

dụng chế phẩm ở cấp độ cây bị bệnh nặng nhất.

107

KIẾN NGHỊ

1. Cần tiếp tục nghiên cứu về cải biến di truyền chủng Paecilomyces lilacinus

P1 nhằm điều tra vai trò chức năng của một số gen liên quan đến cơ chế

diệt tuyến trùng.

2. Triển khai thêm mô hình ứng dụng trên một số địa bàn trong tỉnh và vùng

Tây Nguyên, thu thập số liệu bổ sung cho quy trình sử dụng chế phẩm sinh

học dạng dịch thể trong quản lý tổng hợp bệnh tuyến trùng và nấm hại rễ

cây hồ tiêu nhằm phát triển bền vững ở Tây Nguyên.

108

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Chu Thanh Bình, Bùi Thị Việt Hà, Hồ Tuyên, Nguyễn Phương Nhuệ (2017),

“Đặc điểm sinh học của chủng Paecilomyces variotii NV01 phân lập từ đất trồng

hồ tiêu khu vực ĐăkLăk”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và

Công nghệ, 33(1S), 42-48.

2. Chu Thanh Bình, Nguyễn Phương Nhuệ, Hồ Tuyên, Bùi Thị Việt Hà (2019),

“Tinh sạch và xác định hoạt tính chitinase từ nấm diệt tuyến trùng Paecilomyces

sp. P1”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 35(1),

90-96.

3. Chu Thanh Binh, Tran Van Tuan, Bui Thi Viet Ha (2019), “Optimization of

medium composition for enhancing chitinase production of Paecilomyces sp. P1

strain by using response surface methodology”, Tạp chí Công nghệ sinh học,

17(2), 301-308.

4. Chu Thanh Binh, Tran Van Tuan, Tran Bao Tram, Bui Thi Viet Ha (2019),

“Determination of protease and chitinase activities from Paecilomyces variotii

NV01 isolated from Dak Lak pepper soil”, Vietnam Journal of Science,

Technology and Engineering, 61(4), 33-38.

5. Chu Thanh Binh, Bui Thi Viet Ha, Van Tuan Tran (2019), “A new and highly

efficient Agrobacterium-mediated transformation system based on the

uridine/uracil auxotrophic mutant in the nematicidal fungus Paecilomyces

lilacinus”, Journal of Microbiological Methods, Đã nộp bản thảo.

6. Chu Thanh Bình, Trần Văn Tuấn, Bùi Thị Việt Hà (2020), “Nghiên cứu thử

nghiệm chế phẩm sinh học P1 diệt tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu tại tỉnh Đăk

Lăk”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 4(113), 126-131.

109

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Trần Văn Huy, Nguyễn Thu Hà, Lê Văn Trịnh, Vũ

Thị Hiền, Phạm Thị Minh Thắng, Phùng Quang Tùng (2016), "Nghiên cứu

sản xuất ứng dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 phòng trừ bệnh tuyến trùng và

nấm bệnh hại rễ cây hồ tiêu, cà phê ở Gia Lai và Đăk Nông", Hội thảo Quốc

gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai, tr. 960 – 965.

2. Nguyễn Ngọc Châu (2003), Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ, NXB

Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội, Hà Nội.

3. Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000), Tuyến trùng ký sinh thực

vật, Động vật chí Việt Nam 4, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội.

4. Lê Ðức Khánh, Lê Quang Khải, Đào Thị Hằng, Phùng Sinh Hoạt, Trần Thị

Thúy Hằng, Trần Thanh Toàn, Đặng Đình Thắng, Nguyễn Ngọc Châu, Trịnh

Quang Pháp, Nguyễn Văn Vấn, Đào Thị Lan Hoa, Lương Đình Khoa (2013),

"Thành phần Tuyến trùng ký sinh thực vật trên cà phê, hồ tiêu ở một số vùng

trồng tập trung tại Tây Nguyên", Tạp chí bảo vệ thực vật, tr 6-12.

5. Nguyễn Hữu Quân, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi, Phạm Thanh Huyền

(2013), "Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ nấm

Lecanicillium lecanii", Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 1, tr.

426-431.

6. Nguyễn Thị Hai, Chu Thị Bích Phượng, Đinh Thành Hiếu (2018), "Hiệu quả

tuyến trùng sần rễ hồ tiêu (Meloidogyne sp.) của chế phẩm nấm Paecilomyces

lilacinus", Tạp chí Viện Bảo vệ thực vật, tr. 9-14.

Tiếng Anh

7. Abad, P., J. Gouzy, J.-M. Aury, P. Castagnone-Sereno, E.G. Danchin, E.

Deleury, L. Perfus-Barbeoch, V. Anthouard, F. Artiguenave, and V.C. Blok,

(2008), "Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode

Meloidogyne incognita", Nature biotechnology 26 (8), pp. 909 - 917.

110

8. Adachi, Y., S. Mori, M. Nakano (2004), "Agrobacterium-mediated production

of transgenic plants in Tricyrtis hirta (Liliaceae), IX International Symposium

on Flower Bulbs 673.

9. Ahmad, R., B. Sidi, D. Endrawati, F. Ekawasti (2019), "Paecilomyces

lilacinus and P. variotii as a predator of nematode and trematode eggs", in IOP

Conference Series: Earth and Environmental Science, IOP Publishing.

10. Åhman, J., T. Johansson, M. Olsson, P.J. Punt, C.A. van den Hondel, A.

Tunlid (2002), "Improving the pathogenicity of a nematode-trapping fungus

by genetic engineering of a subtilisin with nematotoxic activity", Applied

Environmental Microbiology 68(7), pp. 3408-3415.

11. Ahmed, S., M.S. Monjil (2019), "Effect of Paecilomyces lilacinus on tomato

plants and the management of root knot nematodes", Journal of the

Bangladesh Agricultural University, 17(1), pp. 9-13.

12. Ahren, D., M. Tholander, C. Fekete, B. Rajashekar, E. Friman, T. Johansson,

A. Tunlid (2005), "Comparison of gene expression in trap cells and vegetative

hyphae of the nematophagous fungus Monacrosporium haptotylum",

Microbiology 151(3), pp. 789-803.

13. Aida, F.M., S. Al-Nusarie, S. Taghreed (2014), "Production, optimization,

characterization and antifungal activity of chitinase produced by Aspergillus

terrus", African Journal of Biotechnology 13(14), pp. 378-385.

14. Ajayi, A., E. Onibokun, F. George, O. Atolagbe (2016), "Isolation and

Characterization of Chitinolytic Bacteria for Chitinase Production from the

African Catfish, Clarias gariepinus (Burchell, 1822)", Research Journal of

Microbiology 11(5), pp. 119-125.

15. Akhir, S., S. Abd-Aziz, M. Salleh, R. Rahman, R. Illia, M. Hassan (2009),

"Medium optimization of chitinase enzyme production from shrimp waste

using Bacillus licheniformis TH-1 by response surface methods"

Biotechnology 8(1), pp. 120-125.

111

16. Al Ajrami, H.M. (2016), Evaluation the Effect of Paecilomyces lilacinus as a

Biocontrol Agent of Meloidogyne javanica on Tomato in Gaza Strip, PhD and

MSc These, Faculty of Science, University of Gaza.

17. Aliabadi, N., S. Aminzadeh, A.A. Karkhane, K. Haghbeen (2016),

"Thermostable chitinase from Cohnella sp. A01: isolation and product

optimization", Brazilian journal of microbiology 47(4), pp. 931-940.

18. Askary, T.H (2015), "Nematophagous fungi as biocontrol agents of

phytonematodes", Biocontrol agents of phytonematodes 5 (1), pp. 81-125.

19. Balasubramanian, N., V.T. Priya, S. Gomathinayagam, V. Shanmugaiah, J.

Jashnie, D. Lalithakumari (2010), "Effect of chitin adapted and ultra violet

induced mutant of Trichoderma harzianum enhancing biocontrol and chitinase

activity", Australian Journal of Basic and Applied Sciences 4(10), pp. 4701-

4709.

20. Berini, F., S. Caccia, E. Franzetti, T. Congiu, F. Marinelli, M. Casartelli, G.

Tettamanti (2016), "Effects of Trichoderma viride chitinases on the

peritrophic matrix of Lepidoptera", Pest management science 72(5), pp. 980-

989.

21. Berini, F., C. Katz, N. Gruzdev, M. Casartelli, G. Tettamanti, F. Marinelli

(2018), "Microbial and viral chitinases: attractive biopesticides for integrated

pest management", Biotechnology advances 36(3), pp. 818-838.

22. Bird, D.M., I. Kaloshian (2003), "Are roots special Nematodes have their say",

Physiological and Molecular Plant Pathology 62(2),pp. 115-123.

23. Boeke, J.D., F. La Croute, G.R. Fink (1984), "A positive selection for mutants

lacking orotidine-5′-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic

acid resistance", Molecular and General Genetics 197(2), pp. 345-346.

24. Bollag, D.M., S.J. Edelstein, M.D. Rozycki (1996), Proteins methods.

25. Bonants, P.J., P.F. Fitters, H. Thijs, E. den Belder, C. Waalwijk, J.W.D.

Henfling (1995), "A basic serine protease from Paecilomyces lilacinus with

112

biological activity against Meloidogyne hapla eggs", Microbiology 141(4). pp.

775-784.

26. Bradford, M.M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding",

Analytical biochemistry 72(2), pp. 248-254.

27. Braga, F.R., F.E.F. Soares, T.Z. Giuberti, A.D.C.G. Lopes, T. Lacerda, T. de

Hollanda Ayupe, P.V. Queiroz, A. de Souza Gouveia, L. Pinheiro, A.L. Araújo

(2015), "Nematocidal activity of extracellular enzymes produced by the

nematophagous fungus Duddingtonia flagrans on cyathostomin infective

larvae", Veterinary parasitology 212(4), pp. 214-218.

28. Brants, A., C. Brown, E. Earle (2000), "Trichoderma harzianum endochitinase

does not provide resistance to Meloidogyne hapla in transgenic tobacco"

Journal of nematology 32(3), pp. 289-295.

29. Brants, A., E. Earle (2001), "Transgenic tobacco cell cultures expressing a

Trichoderma harzianum endochitinase gene release the enzyme into the

medium", Plant cell reports 20(1), pp. 73-78.

30. Bundock, P., A. den Dulk‐Ras, A. Beijersbergen, P. Hooykaas (1995), "Trans‐

kingdom T‐DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces

cerevisiae", The EMBO journal 14(13), pp. 3206-3214.

31. Cagáň, Ľ., M. Švercel (2001), "The influence of ultraviolet light on

pathogenicity of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Balsamo)

vuillemin to the European corn borer, Ostrinia nubilalis HBN.(Lepidoptera:

Crambidae)", Journal of Central European Agriculture 2(3-4), pp. 227-234.

32. Cannayane, I., C. Sivakumar (2001), "Nematode egg-parasitic fungus I:

Paecilomyces lilacinus – A review", Agricultural Reviews 22(2), pp. 79-86.

33. Cańtizares‐Macías, P., L. Hernández‐Garciadiego, H. Gómez‐Ruíz (2001),

"An automated flow injection analysis procedure for the determination of

reducing sugars by DNSA method", Journal of food science 66(3), pp. 407-

411.

113

34. Chakraborty, B., M. Kapoor (1990), "Transformation of filamentous fungi by

electroporation", Nucleic acids research 18(22), pp. 6737-6744.

35. Chan, Y.L., D. Cai, P. Taylor, M.T. Chan, K. Yeh (2010), "Adverse effect of

the chitinolytic enzyme PjCHI‐1 in transgenic tomato on egg mass production

and embryonic development of Meloidogyne incognita", Plant pathology

59(5), pp. 922-930.

36. Chau, N., N. Thanh, P. Binh, P. Luc, L. Gia, H. Nhi (1990), "Situation of

nematode diseases on black pepper in Tan Lam state farm and some protection

methods", Publishing House Science and Technology, pp. 80-84.

37. Chaves Barreto, C., L. Cardoso Alves, F.J. Lima Aragão, E. Rech, A. Schrank,

M. Henning Vainstein (1997), "High frequency gene transfer by

microprojectile bombardment of intact conidia from the entomopathogenic

fungus Paecilomyces fumosoroseus", FEMS microbiology letters 156(1), pp.

95-99.

38. Chen, L., H. Jiang, Q. Cheng, J. Chen, G. Wu, A. Kumar, M. Sun, Z. Liu

(2015), "Enhanced nematicidal potential of the chitinase pachi from

Pseudomonas aeruginosa in association with Cry21Aa", Scientific reports 5

(1), pp. 14395-14401.

39. Chen, T.H., C.S. Hsu, P.J. Tsai, Y.F. Ho, N.S. Lin (2001), "Heterotrimeric G-

protein and signal transduction in the nematode-trapping fungus Arthrobotrys

dactyloides", Planta 212(6), pp. 858-863.

40. Choi, D.B., S.H. Kang, Y.H. Song, K.H. Kwun, K.J. Jeong, W.S. Cha, "Exo-

polysaccharide production in liquid culture of Pleurotus ferulae", Journal of

microbiology and biotechnology 15(2), pp. 368-375.

41. Cook, R.J (1993), "Making greater use of introduced microorganisms for

biological control of plant pathogens", Annual review of phytopathology 31(1),

pp. 53-80.

114

42. Curran, J., F. Driver, J. Ballard, R. Milner (1994), "Phylogeny of Metarhizium:

analysis of ribosomal DNA sequence data", Mycological Research 98(5), pp.

547-552.

43. Dackman, C., I. Chet, B. Nordbring-Hertz (1989), "Fungal parasitism of the

cyst nematode Heterodera schachtii: infection and enzymatic activity", FEMS

Microbiology Ecology 5(3), pp. 201-208.

44. de Boer, P., J. Bronkhof, K. Dukiќ, R. Kerkman, H. Touw, M. van den Berg,

R. Offringa (2013), "Efficient gene targeting in Penicillium chrysogenum

using novel Agrobacterium-mediated transformation approaches", Fungal

Genetics and Biology 61(1), pp. 9-14.

45. De Freitas Soares, F.E., B.L. Sufiate, and J.H. de Queiroz (2018),

"Nematophagous fungi: Far beyond the endoparasite, predator and ovicidal

groups", Agriculture and Natural Resources 52(1), pp. 1-8.

46. De Groot, M.J., P. Bundock, P.J. Hooykaas, A.G. Beijersbergen (1998),

"Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi",

Nature biotechnology 16(9), pp. 839-845.

47. De, L.C., Jesús, A. Hidalgo-Gallego, J.M. Lora, T. Benitez, J.A. Pintor- Toro,

A. Llobell (1992), "Isolation and characterization of three chitinases from

Trichoderma harzianum", European Journal of Biochemistry 206(3), pp. 859-

867.

48. Debnath, P., K. Gode, D.G. Das, A. Sanyal (1974), "Effects of propranolol on

gastric secretion in albino rats", British journal of pharmacology 51(2), pp.

213-216.

49. Deore, G., A. Limaye, Y. Dushing, S. Dhobale, S. Kale, S. Laware (2013),

"Screening of Protease Producing Fungi for Microbial Digestion of Seed

Proteins and Synthesis of Amino Acids-metal nutrient Chelates", Pakistan

Journal of Biological Sciences 16(2), pp. 86-91.

115

50. Dhar, P., G. Kaur (2010), "Effects of carbon and nitrogen sources on the

induction and repression of chitinase enzyme from Beauveria bassiana

isolates", African Journal of Biotechnology 9(47), pp. 8092-8099.

51. Dias, W.P., S. Ferraz (1993), "Crescimento e esporulação de Arthrobotrys spp

em diferentes substratos, meios de cultura, pH e níveis de temperatura",

Nemato Bras 17(2), pp. 168-181.

52. Djian-Caporalino, C., A. Fazari, M. Arguel, T. Vernie, C. VandeCasteele, I.

Faure, G. Brunoud, L. Pijarowski, A. Palloix, V. Lefebvre (2007), "Root-knot

nematode (Meloidogyne spp.) Me resistance genes in pepper (Capsicum

annuum L.) are clustered on the P9 chromosome", Theoretical and Applied

Genetics 114(3), pp. 473-486.

53. Dong, L., J. Yang, K. Zhang (2007), "Cloning and phylogenetic analysis of

the chitinase gene from the facultative pathogen Paecilomyces lilacinus",

Journal of applied microbiology 103(6), pp. 2476-2488.

54. Duo-Chuan, L. (2006), "Review of fungal chitinases", Mycopathologia

161(6), pp. 345-360.

55. Eilenberg, J., A. Hajek, C. Lomer (2001), "Suggestions for unifying the

terminology in biological control", BioControl 46(4), pp. 387-400.

56. EL-Bondkly, A.M., A.A. Keera (2007), "UV-and EMS-induced mutations

affecting synthesis of alkaloids and lipase in Penicillium roquefortii", Arab

Journal of Biotechnology 10(2), pp. 241-248.

57. Elleuche, S., S. Pöggeler (2008), "Visualization of peroxisomes via SKL-

tagged DsRed protein in Sordaria macrospora", Fungal Genetics Reports

55(1), pp. 9-12.

58. Erwin, D.C., O.K. Ribeiro (1996), Phytophthora diseases worldwide,

American Phytopathological Society (APS Press), American.

59. Fang, W., J. Feng, Y. Fan, Y. Zhang, M.J. Bidochka, R.J.S. Leger, Y. Pei

(2009), "Expressing a fusion protein with protease and chitinase activities

116

increases the virulence of the insect pathogen Beauveria bassiana", Journal of

invertebrate pathology 102(2), pp. 155-159.

60. Favre-Bonvin, J., M. Ponchet, C. Djian, N. Arpin, L. Pijarowski (1991),

"Acetic acid: a selective nematicidal metabolite from culture filtrates of

Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson and Trichoderma longibrachiatum

Rifai", Nematologica 37(4), pp. 101-112.

61. Finnegan, S., S.L. Percival (2015), "EDTA: an antimicrobial and antibiofilm

agent for use in wound care", Advances in wound care 4(7), pp. 415-421.

62. Francesca, B., K. Chen, G. Nady, M. Casartelli, T. Gianluca, M. Flavia (2018),

"Microbial and viral chitinases: Attractive biopesticides for integrated pest

management"

63. Gan, Z., J. Yang, N. Tao, L. Liang, Q. Mi, J. Li, K. Q. Zhang (2007), "Cloning

of the gene Lecanicillium psalliotae chitinase Lpchi1 and identification of its

potential role in the biocontrol of root-knot nematode Meloidogyne incognita",

Applied Microbiology and Biotechnology 76(6), pp. 1309-1317.

64. Gelvin, S.B. (2010), "Plant proteins involved in Agrobacterium-mediated

genetic transformation", Annual review of phytopathology 48 (3), pp. 45-68.

65. Gortari, M.C., R.A. Hours (2008), "Fungal chitinases and their biological role

in the antagonism onto nematode eggs", Mycological Progress 7(4), pp. 221-

238.

66. Gruber, S., V. Seidl-Seiboth (2012), "Self versus non-self: fungal cell wall

degradation in Trichoderma", Microbiology 158(1), pp. 26-34.

67. Guo, J.P., C.Y. Zhu, C.P. Zhang, Y.S. Chu, Y.L. Wang, J.X. Zhang, D.K. Wu,

K.Q. Zhang, X.M. Niu (2012), "Thermolides, potent nematocidal PKS-NRPS

hybrid metabolites from thermophilic fungus Talaromyces thermophilus"

Journal of the American Chemical Society 134(50), pp. 20306-20309.

68. Halifah, P., Z. Maulana, M.M. Salleh (2019), "Optimization of Chitinase

Production by Trichoderma virens in Solid State Fermentation Using

Response Surface Methodology", Materials Science Forum 967, pp. 132-142.

117

69. Hamid, R., M.A. Khan, M. Ahmad, M.M. Ahmad, M.Z. Abdin, J. Musarrat,

S. Javed (2013), "Chitinases: an update", Journal of pharmacy & bioallied

sciences, 5(1), pp. 21-27.

70. Han, B., K. Zhou, Z. Li, B. Sun, Q. Ni, X. Meng, G. Pan, C. Li, M. Long, T.

Li (2016), "Characterization of the First Fungal glycosyl hydrolase family 19

Chitinase (NbchiA) from Nosema bombycis (Nb)", Journal of Eukaryotic

Microbiology 63(1), pp. 37-45.

71. Hano, P., M.R. Khan (2016), "Evaluation of fungal (Paecilomyces lilacinus)

formulations against root knot nematode infecting tomato", Bangladesh

journal of Botany, 45(5), pp. 1003-1013.

72. Hanying, Y., X. Wei, G. Xingxi (2012), "Development of a transformation

method for the nematophagous fungus Dactylellina cionopaga", African

Journal of Biotechnology 11(14), pp. 3370-3378.

73. Hartl, L., S. Zach, V. Seidl-Seiboth (2012), "Fungal chitinases: diversity,

mechanistic properties and biotechnological potential", Applied microbiology

and biotechnology 93(2), pp. 533-543.

74. Henderson, C.F., E.W. Tinton (1955), "Tests with acaricides against the brown

wheat mite", Journal of Economic Entomology 48(2), pp. 157-161.

75. Herrera-Estrella, A., S. Casas Flores, C.P. Kubicek (2016), "Nematophagous

Fungi", Springer 15(1), pp. 247-267.

76. Homthong, M., A. Kubera, M. Srihuttagum, V. Hongtrakul (2016), "Isolation

and characterization of chitinase from soil fungi Paecilomyces sp."

Agriculture and Natural Resources 50(4), pp. 232-242.

77. Hsueh, Y. P., P. Mahanti, F.C. Schroeder, P.W. Sternberg (2013), "Nematode-

trapping fungi eavesdrop on nematode pheromones", Current Biology 23(1),

pp. 83-86.

78. Huang, Q. S., X. L. Xie, G. Liang, F. Gong, Y. Wang, X. Q. Wei, Q. Wang,

Z.-L. Ji, Q.X. Chen (2011), "The GH18 family of chitinases: their domain

architectures, functions and evolutions", Glycobiology 22(1), pp. 23-34.

118

79. Huang, Z., Y. Hao, T. Gao, Y. Huang, S. Ren, N.O. Keyhani (2016), "The

Ifchit1 chitinase gene acts as a critical virulence factor in the insect pathogenic

fungus Isaria fumosorosea", Applied microbiology and biotechnology

100(12), pp. 5491-5503.

80. Hussain, M., M. Zouhar, P. Ryšánek (2017), "Effects of nematophagous fungi

on viability of eggs and juveniles of Meloidogyne incognita", The Journal of

Animal & Plant Sciences 27(1), pp. 252-258.

81. Hussain, M., M. Zouhar, P. Ryšánek (2018), "Suppression of Meloidogyne

incognita by the Entomopathogenic Fungus Lecanicillium muscarium", Plant

disease 102(5), pp. 977-982.

82. Jafari, N., H. Jafarizadeh Malmiri, M. Hamzeh Mivehroud, M. Adibpour

(2017), "Optimization of UV irradiation mutation conditions for cellulase

production by mutant fungal strains of Aspergillus niger through solid state

fermentation", Green Processing and Synthesis 6(3), pp. 333-340.

83. Janus, D., B. Hoff, E. Hofmann, U. Kück (2007), "An efficient fungal RNA-

silencing system using the DsRed reporter gene", Applied Environmental

Microbiology 73(3), pp. 962-970.

84. Jatala, P. (1986), "Biological control of plant-parasitic nematodes", Annual

review of phytopathology 24(1), pp. 453-489.

85. Jha, S., H.A. Modi, C.K. Jha (2016), "Characterization of extracellular

chitinase produced from Streptomyces rubiginosus isolated from rhizosphere

of Gossypium sp.", Cogent Food & Agriculture 2(1), pp. 119 - 225.

86. Kagimu, N., T. Ferreira, A. Malan (2017), "The attributes of survival in the

formulation of entomopathogenic nematodes utilised as insect biocontrol

agents", African Entomology 25(2), pp. 275-291.

87. Kanai, Y., T. Fujimaki, S.i. Kochi, H. Konno, S. Kanazawa, S. Tokumasu

(2004), "Paeciloxazine, a novel nematicidal antibiotic from Paecilomyces sp.",

The Journal of antibiotics 57(1), pp. 24-28.

119

88. Kang, S.C., S. Park, D.G. Lee (1999), "Purification and characterization of a

novel chitinase from the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae",

Journal of invertebrate pathology 73(3), pp. 276-281.

89. Karssen, G., W. Wesemael, M. Moens (2013), "Root-knot nematodes", Plant

nematology 2, pp. 73-108.

90. Kemppainen, M., A. Circosta, D. Tagu, F. Martin, A.G. Pardo (2005),

"Agrobacterium-mediated transformation of the ectomycorrhizal symbiont

Laccaria bicolor S238N", Mycorrhiza 16(1), pp. 19-22.

91. Kerry, B. K. Evans (1996), "New strategies for the management of plant

parasitic nematodes. R. Hall (Ed.)", Principles and Practice of Managing

Soilborne Plant Pathogens APS Press, pp. 134 - 152.

92. Khan, A., K. Williams, M.P. Molloy, H. Nevalainen (2003), "Purification and

characterization of a serine protease and chitinases from Paecilomyces

lilacinus and detection of chitinase activity on 2D gels", Protein Expression

and Purification 32(2), pp. 210-220.

93. Khan, A., K.L. Williams, H.K. Nevalainen (2004), "Effects of Paecilomyces

lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching of

Meloidogyne javanica juveniles", Biological control 31(3), pp. 346-352.

94. Khan, A., K.L. Williams, H.K. Nevalainen (2006), "Control of plant-parasitic

nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum in pot

trials", Biocontrol 51(5), pp. 643-658.

95. Khan, A., K.L. Williams, H.K. Nevalainen (2006), "Infection of plant-

parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium

lysipagum", BioControl 51(5), pp. 659-678.

96. Khan, H.U., R. Ahmad, W. Ahmed, S. Khan, M.A. Khan (2001), "Evaluation

of the Combined Effects of Paecilomyces lilacinus and Trichoderma

harzianum Against Root-knot Disease of Tomato", Online Journal of

Biological Sciences, 1(3), pp. 139-142.

120

97. Khasa, Y.P. (2017), "Microbes as biocontrol agents", Probiotics and Plant

Health. 2017, Springer. pp. 507-552.

98. Kiewnick, S. R. Sikora (2006), "Biological control of the root-knot nematode

Meloidogyne incognita by Paecilomyces lilacinus strain 251", Biological

control 38(2), pp. 179-187.

99. Kim, S., H. Hwang, J. Park, Y. Cho, C. Song, J. Yun (2002), "Mycelial growth

and exo‐biopolymer production by submerged culture of various edible

mushrooms under different media", Letters in Applied Microbiology 34(1), pp.

56-61.

100. Kim, S., H. Hwang, C. Xu, Y. Na, S. Song, J. Yun (2002), "Influence of

nutritional conditions on the mycelial growth and exopolysaccharide

production in Paecilomyces sinclairii", Letters in Applied Microbiology 34(6)

pp. 389-393.

101. Koziak, A.T., K.C. Cheng, R.G. Thorn (2007), "Phylogenetic analyses of

Nematoctonus and Hohenbuehelia (Pleurotaceae)", Botany 85(8), pp. 762-

773.

102. Kwok, O., R. Plattner, D. Weisleder, D. Wicklow (1992), "A nematicidal toxin

from Pleurotus ostreatus NRRL 3526", Journal of Chemical Ecology 18(2),

pp. 127-136.

103. Kwon, S. J., W. S. Lim, S. H. Park, M. R. Park, K. H. Kim (2007), "Molecular

characterization of a dsRNA mycovirus, Fusarium graminearum virus-DK21,

which is phylogenetically related to hypoviruses but has a genome

organization and gene expression strategy resembling those of plant potex-like

viruses", Molecules and cells 23(3), pp. 304 - 314.

104. Laemmli, U.K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly

of the head of bacteriophage T4", Nature 227(5259), pp. 680 - 688.

105. Leal Jr, S.M., S. Cowden, Y.C. Hsia, M.A. Ghannoum, M. Momany, E.

Pearlman (2010), "Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis

of Aspergillus fumigatus keratitis", PLoS pathogens 6(7), pp. 976 - 1000.

121

106. Li, G. H. K. Q. Zhang (2014), "Nematode-toxic fungi and their nematicidal

metabolites, in Nematode-Trapping Fungi", Springer, pp. 313-375.

107. Li, J., C. Zou, J. Xu, X. Ji, X. Niu, J. Yang, X. Huang, K. Q. Zhang (2015),

"Molecular mechanisms of nematode-nematophagous microbe interactions:

basis for biological control of plant-parasitic nematodes", Annual review of

phytopathology 53, pp. 67-95.

108. Li, L., S.J. Wright, S. Krystofova, G. Park, K.A. Borkovich (2007),

"Heterotrimeric G protein signaling in filamentous fungi", Annual review of

microbiology 61, pp. 423-452.

109. Li, M., L. Zhou, M. Liu, Y. Huang, X. Sun, F. Lu (2013), "Construction of an

Engineering Strain Producing High Yields of α-Transglucosidase via

Agrobacterium tumefaciens"-Mediated Transformation of Asperillus niger",

Bioscience, biotechnology, and biochemistry, pp. 130 - 281.

110. Liang, L. M., C. G. Zou, J. Xu, K. Q. Zhang (2019), "Signal pathways involved

in microbe–nematode interactions provide new insights into the biocontrol of

plant-parasitic nematodes", Philosophical Transactions of the Royal Society B

374(1767), pp. 317 - 325.

111. Liang, L., Z. Meng, F. Ye, J. Yang, S. Liu, Y. Sun, Y. Guo, Q. Mi, X. Huang,

C. Zou (2010), "The crystal structures of two cuticle-degrading proteases from

nematophagous fungi and their contribution to infection against nematodes",

The FASEB Journal 24(5), pp. 1391-1400.

112. Lima, I., R. Duarte, L. Furlaneto, C. Baroni, M. Fungaro, M. Furlaneto (2006),

"Transformation of the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus

with Agrobacterium tumefaciens", Letters in applied microbiology 42(6), pp.

631-636.

113. Lin, F., J. Ye, H. Wang, A. Zhang, B. Zhao (2013), "Host deception:

predaceous fungus, Esteya vermicola, entices pine wood nematode by

mimicking the scent of pine tree for nutrient", PloS one 8(8), pp. 71 - 76.

122

114. Liu, L., Y. R. Cao, C. C. Zhang, H. F. Fan, Z. Y. Guo, H. Y. Yang, M. Chen,

J. J. Han, J. Xu, K. Q. Zhang (2019), "An efficient gene disruption system for

the nematophagous fungus Purpureocillium lavendulum", Fungal Biology

123(4), pp. 274 - 282.

115. Liu, Z., T.L. Friesen (2012), "Polyethylene glycol (PEG)-mediated

transformation in filamentous fungal pathogens", Plant Fungal Pathogens,

Springer, pp. 365-375.

116. Lopez-Llorca, L. (1990), "Purification and properties of extracellular

proteases produced by the nematophagous fungus Verticillium

suchlasporium", Canadian Journal of Microbiology 36(8), pp. 530-537.

117. Lopez-Llorca, L., J. Maciá Vicente, H. B. Jansson (2008), "Mode of action

and interactions of nematophagous fungi, in Integrated management and

biocontrol of vegetable and grain crops nematodes", Springer, pp. 51-76.

118. Lorito, M., S.L. Woo, I.G. Fernandez, G. Colucci, G.E. Harman, J.A. Pintor

Toro, E. Filippone, S. Muccifora, C.B. Lawrence, A. Zoina (1998), "Genes

from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal

pathogens", Proceedings of the National Academy of Sciences 95(14), pp.

7860 - 7865.

119. Luangsa-ard, J., J. Houbraken, T. van Doorn, S.-B. Hong, A.M. Borman, N.L.

Hywel-Jones, R.A. Samson (2011), "Purpureocillium, a new genus for the

medically important Paecilomyces lilacinus" FEMS microbiology letters,

321(2), pp. 141-149.

120. Luo, H., X. Li, G. Li, Y. Pan, K. Zhang (2006), "Acanthocytes of Stropharia

rugosoannulata function as a nematode-attacking device", Applied

environmental microbiology 72(4), pp. 2982-2987.

121. Luo, H., Y. Liu, L. Fang, X. Li, N. Tang, and K. Zhang (2007), "Coprinus

comatus damages nematode cuticles mechanically with spiny balls and

produces potent toxins to immobilize nematodes", Applied environmetal

microbiology 73(12), pp. 3916-3923.

123

122. Martinelli, P.R.P., P.L.M. Soares, J.M. dos Santos, A.J. da Silveira (2015),

"Nematophagous Fungi: Formulation, Mass Production and Application

Technology", Biocontrol Agents of Phytonematodes 25(3), pp. 175-183.

123. Mascarin, G.M., S.B. Alves, R.B. Lopes (2010), "Culture media selection for

mass production of Isaria fumosorosea and Isaria farinosa", Brazilian

Archives of Biology and Technology 53(4), pp. 753-761.

124. Maziero, R. (1996), Produção de exopolissacarídeos por basidiomicetos em

cultura submersa: screening, caracterização química preliminar e estudo de

produção utilizando Irpex lacteus, France.

125. Mi, Q., J. Yang, F. Ye, Z. Gan, C. Wu, X. Niu, C. Zou, K. Q. Zhang (2010),

"Cloning and overexpression of Pochonia chlamydosporia chitinase gene

pcchi44, a potential virulence factor in infection against nematodes", Process

Biochemistry 45(5), pp. 810-814.

126. Michielse, C., M. Arentshorst, A. Ram, C. Van den Hondel (2005),

"Agrobacterium-mediated transformation leads to improved gene replacement

efficiency in Aspergillus awamori", Fungal Genetics and Biology 42(1), pp.

9-19.

127. Michielse, C.B., P.J. Hooykaas, C.A. van den Hondel, A.F. Ram (2005),

"Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in

fungi", Current genetics 48(1), pp. 1-17.

128. Miller, G.L. (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar", Analytical chemistry 31(3), pp. 426-428.

129. Minglian, Z., M. Minghe, Z. Keqin (2004), "Characterization of a neutral

serine protease and its full-length cDNA from the nematode-trapping fungus

Arthrobotrys oligospora", Mycologia 96(1), pp. 16-22.

130. Moosavi, M.R. M. Ghani (2019), "The optimal concentrations of

Purpureocillium lilacinum and jasmonic acid in controlling Meloidogyne

javanica on tomato", Archives of Phytopathology and Plant Protection 52(8),

pp. 582-600.

124

131. Moosavi, M.R., R. Zare (2012), "Fungi as biological control agents of plant-

parasitic nematodes, in Plant defence: biological control", Springer, pp. 67-

107.

132. Mora-Lugo, R., J. Zimmermann, A.M. Rizk, M. Fernandez-Lahore (2014),

"Development of a transformation system for Aspergillus sojae based on the

Agrobacterium tumefaciens-mediated approach", BMC microbiology 14(1),

pp. 247 - 253.

133. Mullins, E.D., X. Chen, P. Romaine, R. Raina, D.M. Geiser, S. Kang (2011),

Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient

tool for insertional mutagenesis and gene transfer", Phytopathology 91(2), pp.

173-180.

134. Nahalkova, J., J. Fatehi (2003), "Red fluorescent protein (DsRed2) as a novel

reporter in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici", FEMS Microbiology

letters 225(2), pp. 305-309.

135. Nguyen, K.T., Q.N. Ho, L.T.B.X. Do, L.T.D. Mai, D. N. Pham, H.T.T. Tran,

D.H. Le, H.Q. Nguyen, V. T. Tran (2017), "A new and efficient approach for

construction of uridine/uracil auxotrophic mutants in the filamentous fungus

Aspergillus oryzae using Agrobacterium tumefaciens-mediated

transformation", World Journal of Microbiology and Biotechnology 33(6), pp.

107 - 115.

136. Nguyen, K.T., Q.N. Ho, T.H. Pham, T. N. Phan, V. T. Tran (2016), "The

construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic

marker and fluorescent reporter genes for Agrobacterium-mediated

transformation of Aspergillus oryzae", World Journal of Microbiology and

Biotechnology 32(12), pp. 204 - 212.

137. Nguyen, V. N., I. J. Oh, Y. J. Kim, K. Y. Kim, Y. C. Kim, R. D. Park (2009),

"Purification and characterization of chitinases from Paecilomycesvariotii

DG-3 parasitizing on Meloidogyne incognita eggs", Journal of industrial

microbiology & biotechnology 36(2), pp. 195 - 204.

125

138. Nordbring‐Hertz, B., H.B. Jansson, A. Tunlid (2001), Nematophagous fungi.

139. Nordgren, I.K., A. Tavassoli (2014), "A bidirectional fluorescent two-hybrid

system for monitoring protein–protein interactions", Molecular BioSystems,

10(3), pp. 485-490.

140. Oclarit, E., C. Cumagun (2009), "Evaluation of efficacy of Paecilomyces

lilacinus as biological control agent of Meloidogyne incognita attacking

tomato", Journal of Plant Protection Research 49(4), pp. 337-340.

141. Özyiğit, İ.İ. (2012), "Agrobacterium tumefaciens and its use in plant

biotechnology", Crop Production for Agricultural Improvement, pp. 317-361.

142. Palmer, A.G., R. Gao, J. Maresh, W.K. Erbil, D.G. Lynn (2004), "Chemical

biology of multi-host/pathogen interactions: chemical perception and

metabolic complementation", Annual review phytopathology 42, pp. 439-464.

143. Park, J.O., K. El‐Tarabily, E. Ghisalberti, K. Sivasithamparam (2002),

"Pathogenesis of Streptoverticillium albireticuli on Caenorhabditis elegans

and its antagonism to soil‐borne fungal pathogens", Letters in Applied

Microbiology 35(5), pp. 361-365.

144. Park, J.O., J. Hargreaves, E. McConville, G. Stirling, E. Ghisalberti, K.

Sivasithamparam (2004), "Production of leucinostatins and nematicidal

activity of Australian isolates of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson",

Letters in Applied Microbiology 38(4), pp. 271-276.

145. Perveen, Z., S. Shahzad (2013), "A comparative study of the efficacy of

Paecilomyces species against root-knot nematode Meloidogyne incognita",

Pakistan Journal of Nematology 31(2), pp. 125-131.

146. Plackett, R.L., J.P. Burman (1946), "The design of optimum multifactorial

experiments", Biometrika 33(4), pp. 305-325.

147. Punja, Z.K. (2001), "Genetic engineering of plants to enhance resistance to

fungal pathogens—a review of progress and future prospects", Canadian

Journal of Plant Pathology 23(3), pp. 216-235.

126

148. Punt, P.J., C.A. van den Hondel (1992), "Transformation of filamentous fungi

based on hygromycin b and phleomycin resistance markers", in Methods in

enzymology, pp. 447-457.

149. Sahoo, N., G. Sudershan, S.J. Eapen (2000), "Description of Meloidogyne

piperi sp. n.(Nematoda: Meloidogynidae) isolated from the roots of Piper

nigrum in South India", Indian Journal of Nematology 30(2), pp. 203-209.

150. Schwartz, L., J. Stauffer (1966), "Three methods of assessing the mutagenic

action of ultraviolet radiation on the fungus Emericellopsis glabra", Applied

Environmetal Microbiology 14(1), pp. 105-109.

151. Segers, R., T.M. Butt, B.R. Kerry, J.F. Peberdy (1994), "The nematophagous

fungus Verticillium chlamydosporium produces a chymoelastase-like protease

which hydrolyses host nematode proteins in situ", Microbiology 140(10), pp.

2715-2723.

152. Shivalee, A., K. Lingappa, D. Mahesh (2018), "Influence of bioprocess

variables on the production of extracellular chitinase under submerged

fermentation by Streptomyces pratensis strain KLSL55", Journal of Genetic

Engineering and Biotechnology 16(2), pp. 421-426.

153. Shurtleff, M.C., C.W. Averre (2000), Diagnosing plant diseases caused by

nematodes, American Phytopathological Society (APS Press).

154. Siddiqui, Z.A., I. Mahmood (1996), "Biological control of plant parasitic

nematodes by fungi: a review", Bioresource Technology 58(3), pp. 229-239.

155. Silva, S.D., R.M. Carneiro, M. Faria, D.A. Souza, R.G. Monnerat, R.B. Lopes

(2017), "Evaluation of Pochonia chlamydosporia and Purpureocillium

lilacinum for Suppression of Meloidogyne enterolobii on Tomato and

Banana", Journal of nematology 49(1), pp. 77-84.

156. Soares, A.M.d.S., S.A.d. Araújo, S.G. Lopes, C. Junior, L. Martins (2015),

"Anthelmintic activity of Leucaena leucocephala protein extracts on

Haemonchus contortus", Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária

24(4), pp. 396-401.

127

157. Soares, F.E.d.F., F.R. Braga, J.V.d. Araújo, W.d.S. Lima, L.R. Mozzer, J.H.d.

Queiroz (2013), "Optimization of protease production by the fungus

Monacrosporium thaumasium and its action against Angiostrongylus vasorum

larvae", Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 22(2), pp. 285-288.

158. St Leger, R.J., D.C. Frank, D.W. Roberts, R.C. Staples (1992), "Molecular

cloning and regulatory analysis of the cuticle‐degrading‐protease structural

gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae", European

Journal of Biochemistry 204(3), pp. 991-1001.

159. Stecher, G., L. Liu, M. Sanderford, D. Peterson, K. Tamura, S. Kumar (2014),

"MEGA-MD: molecular evolutionary genetics analysis software with

mutational diagnosis of amino acid variation", Bioinformatics 30(9), pp. 1305-

1307.

160. Sugui, J.A., Y.C. Chang, K. Kwon-Chung (2005), "Agrobacterium

tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient

tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption", Applied

Environmental Microbiology 71(4), pp. 1798-1802.

161. Talhinhas, P., S. Muthumeenakshi, J. Neves-Martins, H. Oliveira, S.

Sreenivasaprasad (2008), "Agrobacterium-mediated transformation and

insertional mutagenesis in Colletotrichum acutatum for investigating varied

pathogenicity lifestyles", Molecular biotechnology 39(1), pp. 57-67.

162. Tamura, K., G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar (2013), "MEGA6:

molecular evolutionary genetics analysis version 6.0", Molecular biology and

evolution 30(12), pp. 2725-2729.

163. Tasharrofi, N., S. Adrangi, M. Fazeli, H. Rastegar, M.R. Khoshayand, M.A.

Faramarzi (2011), "Optimization of chitinase production by Bacillus pumilus

using Plackett-Burman design and response surface methodology", Iranian

journal of pharmaceutical research: IJPR 10(4), pp. 759 - 766.

164. Thorn, R., G. Barron (1984), "Carnivorous mushrooms", Science 224(4644),

pp. 76-78.

128

165. Thorn, R.G., J.-M. Moncalvo, C. Reddy, R. Vilgalys (2000), "Phylogenetic

analyses and the distribution of nematophagy support a monophyletic

Pleurotaceae within the polyphyletic pleurotoid-lentinoid fungi", Mycologia

92(2), pp. 241-252.

166. Thuy, T.T.T. (2010), Incidence and Effect of Meloidogyne incognita

(Nematoda: Meloidogyninae) on Black Pepper Plants in Vietnam", Thesis.

Katholieke Universiteit Leuven, België. Unpublish.

167. Tikhonov, V.E., L.V. Lopez-Llorca, J. Salinas, H.-B. Jansson (2002),

"Purification and characterization of chitinases from the nematophagous fungi

Verticillium chlamydosporium and V. suchlasporium", Fungal Genetics and

Biology 35(1), pp. 67-78.

168. Tran, V.T., S.A. Braus‐Stromeyer, H. Kusch, M. Reusche, A. Kaever, A.

Kühn, O. Valerius, M. Landesfeind, K. Aßhauer, M. Tech (2014),

"Verticillium transcription activator of adhesion V ta2 suppresses

microsclerotia formation and is required for systemic infection of plant roots",

New Phytologist 202(2), pp. 565-581.

169. Tranier, M.S., J. Pognant-Gros, R.D.l.C. Quiroz, C.N.A. González, T.

Mateille, S. Roussos (2014), "Commercial biological control agents targeted

against plant-parasitic root-knot nematodes", Brazilian Archives of Biology

and Technology 57(6), pp. 831-841.

170. Trinh, P.Q., W.M. Wesemael, H.A. Tran, C.N. Nguyen, M. Moens (2012),

"Resistance screening of Coffea spp. accessions for Pratylenchus coffeae and

Radopholus arabocoffeae in Vietnam", Euphytica 185(2), pp. 233-241.

171. Tunlid, A., S. Rosen, B. Ek, L. Rask (1994), "Purification and characterization

of an extracellular serine protease from the nematode-trapping fungus

Arthrobotrys oligospora", Microbiology 140(7), pp. 1687-1695.

172. Tzfira, T., V. Citovsky (2007), Agrobacterium: from biology to biotechnology,

Springer Science & Business Media.

129

173. Ulhoa, C.J., J.F. Peberdy (1991), "Regulation of chitinase synthesis in

Trichoderma harzianum", Microbiology 137(9), pp. 2163-2169.

174. Urquhart, A., S. Mondo, M. Mäkelä, J. Hane, A. Wiebenga, G. He, S.

Mihaltcheva, J. Pangilinan, A. Lipzen, K. Barry (2018), "Genomic and genetic

insights into a cosmopolitan fungus, Paecilomyces variotii (Eurotiales)",

Frontiers in microbiology 9, pp. 3058 - 3067.

175. Vega, F.E., F. Posada, M.C. Aime, M. Pava-Ripoll, F. Infante, S.A. Rehner

(2008), "Entomopathogenic fungal endophytes", Biological Control 46, pp. 72

- 82.

176. Veresoglou, S.D., M.C. Rillig (2011), "Suppression of fungal and nematode

plant pathogens through Arbuscular mycorrhizal fungi", Biology letters 8(2),

pp. 214-217.

177. Viaene, N., D. Coyne, K. Davies (2013), "Biological and cultural

management", Plant nematology 2, pp. 383-410.

178. Vos, C., S. Claerhout, R. Mkandawire, B. Panis, D. De Waele, A. Elsen

(2012), "Arbuscular mycorrhizal fungi reduce root-knot nematode penetration

through altered root exudation of their host", Plant and Soil 354(2), pp. 335-

345.

179. Vu, T.X., H.H. Vu, G.T. Nguyen, H.T. Vu, L.T.D. Mai, D. N. Pham, D.H. Le,

H.Q. Nguyen, V. T. Tran (2019), "A newly constructed Agrobacterium-

mediated transformation system revealed the influence of nitrogen sources on

the function of the LaeA regulator in Penicillium chrysogenum", Fungal

Biology 123(11), pp. 830-842.

180. Wackett, L.P. (2014), "Microbial strain collections and information: An

annotated selection of World Wide Web sites relevant to the topics in

microbial biotechnology", Microbial biotechnology 7(4), pp. 371 - 379.

181. Wang, B.L., Y.H. Chen, J.N. He, H.X. Xue, N. Yan, Z.J. Zeng, J.W. Bennett,

K.Q. Zhang, X.M. Niu (2018), "Integrated metabolomics and morphogenesis

130

reveal volatile signaling of the nematode-trapping fungus Arthrobotrys

oligospora", Applied Environmental Microbiology 84(9), pp. 2749- 2755.

182. Wang, C.Y., Z. Wang, Z.M. Fang, D.L. Zhang, L.J. Gu, L. Liu, C.K. Sung

(2010), "Attraction of pinewood nematode to endoparasitic nematophagous

fungus Esteya vermicola", Current microbiology 60(5), pp. 387-392.

183. Wang, J., J. Wang, F. Liu, C. Pan (2010), "Enhancing the virulence of

Paecilomyces lilacinus against Meloidogyne incognita eggs by overexpression

of a serine protease", Biotechnology letters 32(8), pp. 1159-1166.

184. Wang, R., L. Dong, R. He, Q. Wang, Y. Chen, L. Qu, Y.A. Zhang (2018),

"Comparative genomic analyses reveal the features for adaptation to

nematodes in fungi", DNA Research 25(3), pp. 245-256.

185. Wang, S., H. Chen, X. Tang, H. Zhang, W. Chen, Y.Q. Chen (2017),

"Molecular tools for gene manipulation in filamentous fungi", Applied

microbiology and biotechnology 101(22), pp. 8063-8075.

186. Waweru, B., L. Turoop, E. Kahangi, D. Coyne, T. Dubois (2014), "Non-

pathogenic Fusarium oxysporum endophytes provide field control of

nematodes, improving yield of banana (Musa sp.)", Biological control 74, pp.

82-88.

187. White, T.J., T. Bruns, S. Lee, J. Taylor (1990), "Amplification and direct

sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics", PCR

protocols: a guide to methods and applications 18(1), pp. 315-322.

188. Wu, L., H. J. Wu, J. Qiao, X. Gao, R. Borriss (2015), "Novel routes for

improving biocontrol activity of Bacillus based bioinoculants", Frontiers in

microbiology 6, pp. 1395 - 1404.

189. Yang, F., H. Abdelnabby, Y.-N. Xiao (2016), "Construction and verification

of a gene knockout system in the nematophagous fungus, Purpreocillium

lilacinum (Hypocreales: Ophiocordycipitaceae)", Applied entomology and

zoology 51(1), pp. 99-110.

131

190. Yang, F., H. Abdelnabby, Y. Xiao (2015), "Novel point mutations in β-tubulin

gene for carbendazim resistance maintaining nematode pathogenicity of

Paecilomyces lilacinus", European journal of plant pathology 143(1), pp. 57-

68.

191. Yang, F., H. Abdelnabby, Y. Xiao (2015), "The role of a phospholipase (PLD)

in virulence of Purpureocillium lilacinum (Paecilomyces lilacinum)",

Microbial pathogenesis 85, pp. 11-20.

192. Yang, J.K., F.P. Ye, Q.L. Mi, S.Q. Tang, J. Li, K. Q. Zhang (2008),

"Purification and cloning of an extracellular serine protease from the

nematode-trapping fungus Monacrosporium cystosporium", J Microbiol

Biotechnol 18(5), pp. 852-858.

193. Yang, J., L. Liang, J. Li, K. Q. Zhang (2013), "Nematicidal enzymes from

microorganisms and their applications", Applied microbiology and

biotechnology 97(16), pp. 7081-7095.

194. Yang, J., L. Liang, Y. Zhang, J. Li, L. Zhang, F. Ye, Z. Gan, K.Q. Zhang

(2007), "Purification and cloning of a novel serine protease from the

nematode-trapping fungus Dactylellina varietas and its potential roles in

infection against nematodes", Applied microbiology and biotechnology 75(3),

pp. 557-565.

195. Yang, J., B. Tian, L. Liang, K.Q. Zhang (2007), "Extracellular enzymes and

the pathogenesis of nematophagous fungi", Applied microbiology and

biotechnology 75(1), pp. 21-31.

196. Yang, J., X. Zhao, L. Liang, Z. Xia, L. Lei, X. Niu, C. Zou, K.Q. Zhang (2011),

"Overexpression of a cuticle-degrading protease Ver112 increases the

nematicidal activity of Paecilomyces lilacinus", Applied microbiology and

biotechnology 89(6), pp. 1895-1903.

197. Yu, Z., Y.c. Zhang, X. Zhang, Y. Wang (2015), "Conversion of food waste

into biofertilizer for the biocontrol of root knot nematode by Paecilomyces

lilacinus", Environmental technology 36(24), pp. 3148-3158.

132

198. Zhang, J., R. Greasham (1999), "Chemically defined media for commercial

fermentations", Applied microbiology and biotechnology 51(4), pp. 407-421.

199. Zhang, S., Y. Gan, B. Xu, Y. Xue (2014), "The parasitic and lethal effects of

Trichoderma longibrachiatum against Heterodera avenae", Biological

Control 72, pp. 1-8.

200. Zhang, S., J. Wang, Y. Wei, Q. Tang, M.K. Ali, J. He (2014), "Heterologous

expression of VHb can improve the yield and quality of biocontrol fungus

Paecilomyces lilacinus, during submerged fermentation", Journal of

biotechnology 187, pp. 147-153.

201. Zhang, T., Z. Qi, Y. Wang, F. Zhang, R. Li, Q. Yu, X. Chen, H. Wang, X.

Xiong, K. Tang (2013), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

of Penicillium expansum PE-12 and its application in molecular breeding",

Microbiological research 168(3), pp. 130-137.

202. Zhang, W., X. Cheng, X. Liu, M. Xiang (2016), "Genome studies on

nematophagous and entomogenous fungi in China", Journal of Fungi 2(1), pp.

9 - 16.

203. Zhu, Y., J. Pan, J. Qiu, X. (2008), "Isolation and characterization of a chitinase

gene from entomopathogenic fungus Verticillium lecanii", Brazilian Journal

of Microbiology 39(2), pp. 314-320.

133

PHỤ LỤC 1. Các cặp primer, đệm, trình tự vector PEX2A, môi trường nuôi

cấy sử dụng cho nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5′-3′) Ghi chú

TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC

Sản phẩm 580 bp 729 bp

1005 bp

TCTTTCCATTCCCGCATTA

1005 bp

ITS1 ITS4 DsRed – F AAC TCG AGC ACG TGC TTA AGG ATA TCA TGG CCT CCT CCG AGG DsRed – R AAG GAT CCC CGC GGG AGC TCG ATA TCC TAC AGG AAC AGG TGG TGGC TCTTTCCATTCCCGCATTA

AAC GCT GTC TAC TTC ACT AAC CCG TTC TTC ATG TTG TCG TAC

AnPyrG – ORF – F AnPyrG – ORF - R Chil-PF1 Chil-PR1 PL_ORF_F CTGCTCCCGCTTGATCTTAC PL_ORF_R TAGCACCGTGAGCAATTCAG 1269 bp 1899 bp 1899 bp

Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Thành phần, nồng độ (w/v)

Dung dịch APS Ammonium per sulfate (10%)

Dung dịch Bradford 100 ml ethanol 100%, 350 mg serva blue G, 200 ml

gốc phosphoric axit 88% (v/v)

Dung dịch Bradford 425 ml H2O, 15 ml ethanol 95% (v/v), 30 ml

working phosphoric axit 88% (v/v), 30 ml dung dịch Bradford

gốc

Dung dịch A Đệm Tris-Base 1,5M, pH 8,8

Dung dịch B Đệm Tris-HCl 0,5M, pH 6,8

Dung dịch C Acrylamide 30 %, bis-acrylamide 0,8%

Dung dịch D SDS 10 %

Dung dịch DNS DNS 0,53%, NaOH 0,99%, KNaC4H4O6 15,3%

Na2S2O5 0,451 %, phenol 0,38 % (v/v)

134

Dung dịch I Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0

Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue 0,1%, methanol 30% (v/v),

PAGE axit axetic 10%

Dung dịch tẩy PAGE Methanol 30% (v/v), axit axetic 10% (v/v)

Đệm điện di protein Tris-HCl 20mM, glycine 192mM, SDS 0,1%, pH 8,8

Đệm 5x tra mẫu protein Brommophenol blue 0,05%, glycerol 50% pha trong

đệm Tris-HCl 1M, pH 6,8.

Đệm TE Tris- HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH 6,8

Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật

MT nuôi cấy Thành phần (w/v)

LB Pepton 1,0 %; Cao nấm men 0,5%; NaCl 0,5%

Czapeck – Dox NaNO3 0,2%; K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,05%; KCl 0,05%;

Sacaroza 2,0%; CuSO4; ZnSO4; pH 6,5.

CYA Czapeck NaNO3 0,2%; K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,05%; KCl 0,05%;

Yeast Autolysate Sacaroza 2,0%; CuSO4: 0,001%; ZnSO4: 0,001%; FeSO4:

0,001%; Cao nấm men: 5%, pH 6,5.

MM KH2PO4 0,3625%, (NH4)2SO4 0,125%, NaCl 0,0375%,

K2HPO4 0,5125%, MgSO4 0,125%, FeSO4 0,00062%.

1M-MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES.H2O):

21,325% pH 5,3

IM (Introduction 1M-MES 4%; MM 40%; Glucoza 0,018%; Glycerol

medium) 0,05%

CHY Glucose (2%), pepton (0.06%), (0.5%), K2HPO4

Ca2+/Mg2+ (3: 4; g/g); pH 7,0.

CHY1 Chitin : 0.75%; glucose (1.84%), pepton (2.12%), K2HPO4

(0.08%), Ca2+/Mg2+ (3:4; g/g).

135

CHY2 Chitin : 0.75%; glucose (2.12%), pepton (0.55%), K2HPO4

(0.09%), Ca2+/Mg2+ (3:4; g/g).

CHY3 Chitin : 0.75%; glucose (1.93%), pepton (0.33%), K2HPO4

(0.1%), Ca2+/Mg2+ (3: 4; g/g).

CHY4 Chitin : 0.75%; glucose (1.87%), pepton (0.58%). K2HPO4

(0.08%), Ca2+/Mg2+ (3: 4; g/g).

CHY5 Chitin : 0.75%; glucose (2.41%), pepton (0.6%), K2HPO4

(0.09%), Ca2+/Mg2+ (4:5; g/g).

Cám gạo Giống lúa IR50404 được sử dụng để xay xát tạo thành cám,

gạo, vỏ trấu.

AGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCT TCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGG CGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTAC GCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGAC TTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACC GGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTG ACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATC CAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGC CGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACC CGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCG GCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCA CTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACC GAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCC GAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCA TTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCT CAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCA GCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCT TGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCAT GAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGC CCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCG CGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGA CCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGA CTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGA CATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCT ACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGC GCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCAC TGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGC GCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGC

Cấu trúc vector PEX2A

136

ACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTG GCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAG ATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCA GAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAA TCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGG CGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGC GTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGA AGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGT GGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGA TTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCA CCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTG GCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGG CCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGAT ACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGT TCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACA CCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGG GTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGA TCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTC ACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCG CAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGT TCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGA AGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAG CATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTC GAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGA ACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAA AAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCC TGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGT CGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGG CTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGC GCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAG CTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCG TCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTAT ACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATAC CGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGC TGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCA CAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGAC GCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCA AGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTC TTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAA GGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTT GATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCAGGATCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT CAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTG

137

Kanamycin

LB

EcoRI

XhoI

An pyrG promoter

BglII

EcoRV

KpnI

AflII

ApaI

BamHI

TAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGAT TCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGA GAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGAC TTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCAT TCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAAT CGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTC TTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGT ACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC ATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTT CCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATA TAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCT CATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATCTGGATCACAG GCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAAC CCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAA CGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGA GCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGC TTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGCTCTAGC CAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTC CCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCC AGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACA CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCACTGCTATGCGACCGTAGAGCAGTGCAAGACCAAC GTAAGCCAACCTCACACAAACAGGATTCCTCGAGCTAACATACATTCCGAACCGTGCAGCCCAAGG CCGAGCAGTTCAACTGCGCTCAGCGCGCTCATGCCAACTTCCTTGAGAACTCCAGCCAAACTATGC TCTTCCTCCTGGTAGCTGGACTGAAGTACCCCCAGTTGGCGACTGGCCTCGGAAGCATCTGGGTCC TCGGTCGCTCACTGTTCCTTTACGGATATGTGTACTCCGGCAAGCCGCGGGGTCGCGGTCGTTTGT ACGGCAGCTTCTACTTGCTTGCACAGGGAGCTCTCTGGGGCTTGACGTCTTTTGGAGTTGCGAGGG AGTTGATTTCCTACTTCTAAGTTTGGACTGAATCCGTGGTGTGATTGAGGTGATTGGCGATGTTTG GCTATACCAGCTATATGTAATAATCTCTACTGTATACTACTATTCAACGCATTTTACTATGCGTGC TGCTAGGGTCGGCAATGACAATGGCAATCTGACTGACGTGGTCTATTTCTCCATGTGCAGCAGGGA ATACGAGCTCCAATGGACCTCGGGAGTGGCACAGTCAATGGCAAGGAAACTCCGCCTTTGCAGGTG TGGCTGAACCCCACGGGTCGGAGGCGGAGCAATCCACCCCCGATGTGGCTGGTGCGTGGAGGGGCT CGCGATGATTTTACTGAGCTTGCTTTTCTTGTCGACATTGAACATTGTCCTTGGTCTTCCTTCAGA TTTAAGGGTCAGTCACTGCTACATTTTTCAGTAGTATCCGCGCACGTCTCTGGATTTACGAATCAG GGTCCACCAGTCGAAACTTCGAACTACTCTCATTATACAATCCTCTTTCCATTCCCGCATTAACCC CTCCATCAACACCATGTCCTCCAAGTCGCGATTGACCTACACTGCCCGTGCCAGCAAGCATCCCAA TGCTCTGGCGAAGAGGCTGTTCGAGATTGCCGAGGCCAAGAAGACCAATGTGACTGTCTCGGCTGA CGTTACCACCACTAAGGAGCTACTAGATCTTGCTGACCGTAGGCCGACCCGCTACTCTGCCTGATT ATGCTGCATGCAAACTTATTAACGGTGATACCGGACTGCAGGTCTCGGTCCCTACATTGCCGTGAT CAAAACCCACATCGATATCCTCTCTGATTTCAGCAACGAGACCATTGAGGGACTTAAGGCTFCTCG CGCAGAAGCACAACTTTCTCATCTTCGAGGACCGCAAGTTCATTGACATCGGCAACACGGTCCAGA AGCAATACCACGGCGGTACCCTCCGTATCTCGGAATGGGCCCACATCATCAACTGCAGCATTCTCC CTGGTGAGGGTATCGTCGAGGCTCTCGCTCAGACGGCGTCTGCACCGGACTTCGCCTACGGCCCCG AACGCGGTCTGTTGATCTTGGCAGAGATGACCTCTAAGGGCTCCTTGGCTACCGGCCAGTACACTA CTTCCTCGGTCGATTATGCCCGGAAATACAAGAACTTCGTTATGGGATTCGTGTCGACGCGCGCGT TGGGTGAGGTGCAGTCGGAAGTCAGCTCTCCTTCGGATGAGGAGGACTTTGTGGTCTTCACGACTG GTGTGAACATTTCTTCCAAGGGAGATAAGCTTGGTCAGCAGTACCAGACGCCCGGATCGGCTATCG GCCGGGGTGCTGACTTCATTATCGCGGGTCGCGGTATCTACGCCGCGCCGGATCCGGTGCAGGCTG CGCAACAGTATCAGAAGGAGGGGTGGGAAGCCTACCTGGCCCGTGTCGGCGGAAAACTAATACTAT

LB

138

NcoI

An pyrG

terminator

gpdA promoter Rr

XhoI PmlI AflII EcoRV

DsRed

PstI StuI StuI

EcoRV SacI SacII BamHI

TrpC terminator

AAAAGGAGGATCGAAGTTCTGATGGTTATGAATGATATAGAAATGCAACTTGCCGCAACGGATACG GAAGCGGAAACGGACCAATGTCGAGCACGGGTAGTCAGACTGCGGCATCGGATGTCCAAACGGTAT TGATCCTGCAGGCTACTATGGTGTGGCACAAGGATCAATGCGGTACGACGATTTGATGCAGATAAG CAGGCTGCGAAGTAGTAACTCTTGCGTAGAGAAAATGGCGACGGGTGGCTGATAAGGGCGGTGATA AGCTTAATTGTCATCGCAGATAAGCACTGCTGTCTTGCATCCAAGTCAGCGTCAGCAGAAATACGG GACTTCCGAAAGTATATGGCAAAATTAAAGAACTTGACTCTCCAGCAATGTTTTGCCCTGACCGTC GCTAAAACGTTACTACCCCTATACCCGTCTGTTTGTCCCAGCCCGAGGCATTAGGTCTGACTGACA GCACGGCGCCATGCGGGCTTGGGACGCCATGTCCGTCGCGTGATAAGGGTTGATCCATGCAGCTAC TATCCTTCCATCGTTCCATTCCCATCCTTGTCCTATCTCCATCCTTGAAACTTTACTAGTTTAGTT GGATGCTCGAGCTTGCTCTCGGCTACTCCGTCCAATGGATAAGACCCCGATGCCGGTCCTCATTGG TCTCCAGCTGGTATCGCCCCAACCTTCGTGTGATCGCCTCTCTGCTTCCCCTCATCATCATTACTA ACTAGTACATCCAAAAGCCATCCCAGTGCTTCCCCTCACCCTTGCCCAAGACATTCCAAGTGGGCC TTCGGCTGGAAAACATGGACCCATTGGTTCCATCGATAAGCTAGCTCCTCGTCCGTTACCCCAGAT TGATACCAGATAACATTGACCAGCGGCTTATCACCGAGGTCTGCGGGTGAGACCCCCCCTGCGACA AGTTAGATAAAAGAAACTCGCCTCATTGTGCTTCCGATGTCTAGTGTGACCGGTGACTCTTTCTGG CATGCGGAGAGACGGACGGACGCAGAGAGAAGGGCTGAGTAATAAGCCACTGGCCAGACAGCTCTG GCGGCTCTGAGGTGCAGTGGATGATTATTAATCCGGGACCGGCCGCCCCTCCGCCCCGAAGTGGAA AGGCTGGTGTGCCCCTCGTTGACCAAGAATCTATTGCATCATCGGAGAATATGGAGCTTCATCGAA TCACCGGCAGTAAGCGAAGGAGAATGTGAAGCCAGGGGTGTATAGCCGTCGGCGAAATAGCATGCC ATTAACCTAGGTACAGAAGTCCAATTGCTTCCGATCTGGTAAAAGATTCACGAGATAGTACCTTCT CCGAAGTAGGTAGAGCGAGTACCCGGCGCGTAAGCTCCCTAATTGGCCCATCCGGCATCTGTAGGG CGTCCAAATATCGTGCCTCTCCTGCTTTGCCCGGTGTATGAAACCGGAAAGGCCGCTCAGGAGCTG GCCAGCGGCGCAGACCGGGAACACAAGCTGGCAGTCGACCCATCCGGTGCTCTGCACTCGACCTGC TGAGGTCCCTCAGTCCCTGGTAGGCAGCTTTGCCCCGTCTGTCCGCCCGGTGTGTCGGCGGGGTTG ACAAGGTCGTTGCGTCAGTCCAACATTTGTTGCCATATTTTCCTGCTCTCCCCACCAGCTGCTCTT TTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCC TAAGTAAGTACTTTGCTACATCCATACTCCATCCTTCCCATCCCTTATTCCTTTGAACCTTTCAGT TCGAGCTTTCCCACTTCATCGCAGCTTGACTAACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCCTCGA GCACGTGCTTAAGGATATCATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGT GCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTA CGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACAT CCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTA CAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGT GGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTCCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGG CGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGA GCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGG CGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTA CTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTA CGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAGGATATCGAGCTCCCGCGGGGATCCACTTA ACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCT CCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGA GTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTTCGGGTTTACCTCTT CCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGACTGCAACCTAGTAACGCCTTNCAGGCTCC GGCGAAGAGAAGAATAGCTTAGCAGAGCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAAC GGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTC TAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAG CNCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCATGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATT CATCGTAGGTATAAACCTCGAAATCANTTCCTACTAAGATGGTATACAATAGTAACCATGCATGGT

139

DsRed

EcoRV

SacI

SacII

BamHI

XbaI SbfI PstI HindIII

RB

TGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAACTTTTTTACAACTCTCCTATGAGT CGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAGAAGTCCTCGTGTA CTGTGTAAGCGCCCACTCCACATCTCCACTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG TTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCC CTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCC TGAATGGCGAATGAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGT GTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTT AAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCT CGGGATCAA

Các đồ thị đường chuẩn

0.2

)

A B

)

0.15

0.4

y = 0.0011x + 0.0419 R² = 0.9923

Đồ thị đường chuẩn tyrosin y = 0.909x + 0.0184 R² = 0.9986

m n 0 5 7 (

0.3

0.1

0.2

m n 0 4 5 ( 0 0

0.05

0.1

g n a u q ộ đ

t ậ

100

0.1

0.3

0.4

M D O

μg/ml

0.2 Nồng độ tyrosin (µM/ml)

0.8

A. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo Miller (1959) B. Đường chuẩn tyrosin theo phương pháp Anson cải tiến

)

0.6

y = 0.9027x + 0.0198 R² = 0.9998

0.4

m n 5 9 5 ( 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

Nong do BSA (μg/ml)

Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford

140

0.05

Penicillium digitatum KJ834506

Paecilomyces variotii FJ549438

100

PHỤ LỤC 2.

Paecilomyces variotii KF305752 NV01

Paecilomyces variotii JQ796880

Paecilomyces variotii KU729023

100

Paecilomyces variotii AF455416

100

Paecilomyces variotii JX231004

100

Paecilomyces variotii GU968667

Byssochlamys spectabi KC009788

Paecilomyces variotii KC237293

Paecilomyces variotii JX231002

Purpureocillium lilac KC157750

Byssochlamys spectabi KC157706

100

Paecilomyces variotii FJ487938

Cây phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) của chủng NV01 và các chủng có mối quan hệ gần gũi

141

Cây phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) của chủng P1 và

các chủng có mối quan hệ gần gũi

142

Cây phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS (ITS1 – 5,8S – ITS2) của chủng NV20

và các chủng có mối quan hệ gần gũi

A B

A - Sản phẩm điện di DNA gen chi (M: marker – 1Kb); B - Sản phẩm điện di

chitinase trên polyacrylamid của chủng P1

143

K2HPO4 Ca2+/Mg2+

Cơ chất chitin huyen phu 0,5 1 1 1 0,5 0,5 1 0,5 1 1 0,5 0,5 1 0,75 1 1 1 0,5 1 0,5 1 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75

Glucose 3 1 1 3 1 1 1 1 3 3 3 3 3 2 3 3 1 3 3 1 1 3 1 1 3 3 1 3 1 1 3 1 1 1,43 1,21 2,23 2,12 2,08 2,4

Hoạt tính (U/ml) 54,87 57,56 53,01 53,22 54,55 60,97 55,34 49,30 41,17 60,47 49,49 54,71 48,75 70,75 47,42 56,00 58,73 53,88 56,39 55,50 55,34 51,49 52,01 49,25 47,16 46,16 53,58 52,71 48,33 59,73 50,14 57,56 54,72 68,80 68,48 70,17 71,29 63,71 66,51

Kết quả của 63 thí nghiệm với 5 yếu tố ảnh hưởng

Pepton 0,3 0,7 0,3 0,7 0,7 0,3 0,7 0,7 0,3 0,7 0,7 0,7 0,7 0,5 0,3 0,7 0,3 0,3 0,3 0,3 0,7 0,7 0,3 0,3 0,3 0,3 0,7 0,7 0,7 0,3 0,3 0,7 0,3 0,34 0,45 0,38 0,48 0,61 0,41

1,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 1,25 0,25 1,25 0,25 1,25 0,25 0,75 1,25 1,25 1,25 0,25 1,25 0,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 0,25 0,25 0,25 1,25 0,25 0,25 1,25 1,25 0,84 0,95 0,69 0,75 0,38 0,86 0,1 0,1 0,01 0,1 0,1 0,1 0,01 0,1 0,01 0,1 0,01 0,1 0,01 0,06 0,01 0,01 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,1 0,01 0,1 0,1 0,1 0,1 0,04 0,06 0,07 0,08 0,01 0,03

144

0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 1,68 2,27 2,48 1,18 1,24 1,37 2,57 2,47 2,27 1,83 1,84 1,33 1,45 2,43 1,77 1,93 2,96 1,23 1,12 2,55 1,89 1,87 1,14 2,41 0,06 0,05 0,1 0,02 0,01 0,03 0,02 0,03 0,01 0,04 0,09 0,05 0,1 0,04 0,02 0,1 0,06 0,02 0,03 0,05 0,06 0,08 0,1 0,09 1,11 0,47 0,82 0,8 1,02 1,12 0,8 0,6 1,01 1,13 0,63 1,08 0,38 1,16 0,64 0,7 1,17 1,15 1,07 0,94 1,24 0,76 0,25 0,92 67,07 67,28 70,52 66,69 64,58 64,57 66,07 67,36 63.79 65,34 71,30 66,41 68,15 64,22 68,39 72,23 64,49 62,71 64,39 67,51 64,96 71,48 65,20 70,36

0,32 0,54 0,46 0,36 0,66 0,53 0,54 0,65 0,42 0,36 0,55 0,47 0,54 0,44 0,61 0,33 0,63 0,6 0,57 0,46 0,53 0,58 0,5 0,6

145

So sánh trình tự nucleotide đoạn gen pyrG ORF giữa P. lilacinus P1

714 714

P1 GGTATCGGGCTGGGACTTTCACCCCCAGACCGGTACGGGCGCCAAGCTCGCCTCTCTCGC 60 424pyrG(-) GGTATCGGGCTGGGACTTTCACCCCCAGACCGGTACGGGCGCCAAGCTCGCCTCTCTCGC 60 ************************************************************ P1 CCGCAAGCATGGCTTCCTCATTTTTGAGGACCGCAAGTTCGGCGACATCGGCAACACGGT 120 424pyrG(-) CCGCAAGCATGGCTTCCTCATTTTCGAGGACCGCAAGTTCGGCGACATCGGCAACACGGT 120 ************************ *********************************** P1 CGAGATGCAGTACATTGGGGGCTCGGCCCGCATCATCGAGTGGGCCCACATTGTCAACGT 180 424pyrG(-) CGAGATGCAGGACATTGGGGGCTCGGCCCGCATCATCGAGTGGGCCCACATTGTCAACGT 180 ********** ************************************************* P1 CAACATGGTCCCGGGCAAGGCGTCCGTCGCCTCGCTCGCCAACGCCGCCACGCGATGGTT 240 424pyrG(-) CAACATGGTCCCGGGCAAGGCGTCCGTCGCCTCGCTCGCCAACGCCGCCACGCGATGGTT 240 ************************************************************ P1 CGAGCGGTATCCGTACGAGGTCAAGACTTCCGTCACCGTCGGCACGCCCACCGCGGAACA 300 424pyrG(-) CGAGCGGTATCCGTACGAGGTCAAGACTTCCGTCACCGTCGGCACGCCCACCGCGGAACA 300 ************************************************************ P1 GTTCGAGGACGTGGACACAGGCTCAAGTCAGGAGGGAAAGGCAGACAAGGAGGAGGGCAA 360 424pyrG(-) GTTCGAGGACGTGGACACAGGCTCAAGTCAGGAGGGAAAGGCAGACAAGGAGGAGGGCAA 360 ************************************************************ P1 GACGCGAGCCGACGACGGGCGCAAGGGCAGCATCGTTTCCGTCACCACCGTCACGCAGCA 420 424pyrG(-) GACGCGAGCCGACGACGGGCGCAAGGGCAGCATCGTTTCCGTCACCACCGTCACGCAGCA 420 ************************************************************ P1 GTATGAGCCTGCCAACTCGCCGCGCCTGACCAAGAGCATGGCCGGCGGCGACGAGGTTTT 480 424pyrG(-) GTATGAGCCTGCCAACTCGCCGCGCCTGACCAAGAGCATGGCCGGCGGCGACGAGGTTTT 480 ************************************************************ P1 GTTCGCCGGCATCGACGAGGCTCCGATGACCAGGGGTCTGCTGATCCTGGCGCAAATGTC 540 424pyrG(-) GTTCGCCGGCATCGACGAGGCTCCGATGACCAGGGGTCTGCTGATCCTGGCGCAAATGTC 540 ************************************************************ P1 GAGCCAGGGCAACTTCATGAACAAGGAGTACACGCAGGCCTGCGTCGAGGCCGCGCGAGA 600 424pyrG(-) GAGCCAGGGCAACTTCATGAACAAGGAGTACACGCAGGCCTGCGTCGAGGCCGCGCGAGA 600 ************************************************************ P1 GCACAAGGACTTTGTCATGGGCTTCGTGTCACAGGAGAGCCTCAACTCGGAGCCGGAGGA 660 424pyrG(-) GCACAAGGACTTTGTCATGGGCTTCGTGTCACAGGAGAGCCTCAACTCGGAGCCGGAGGA 660 ************************************************************ P1 CCAGTTCATCCACATGACGCCCGGCTGCCAACTGCCGCCCGAGGACGAGGACCA 424pyrG(-) CCAGTTCATCCACAAGACGCCCGGCTGCCAACTGCCGCCCGAGGACGAGGACCA ************** ***************************************

và thể đột biến 424pyrG(-)

146

So sánh trình tự amino axit mã hóa vùng ORF_pyrG chủng P. lilacinus P1

292 279

P1 PTRLGRPSWCSRLTTTWYRAGTFTPRPVRAPSSPLS 59 424pyrG(-) PTRLGRPSWCSRLTTTWYRAGTFTPRPVRAPSSPLS 45 ************************************ P1 PASMASSFLRTASSATSATRSRCSTLGARPASSSGPTLSTSTWSRARRPSPRSPTPPRDG 119 424pyrG(-) PASMASSFSRTASSATSATRSRCRTLGARPASSSGPTLSTSTWSRARRPSPRSPTPPRDG 105 ******** ************** ************************************ P1 SSGIRTRSRLPSPSARPPRNSSRTWTQAQVRRERQTRRRARREPTTGARAASFPSPPSRS 179 424pyrG(-) SSGIRTRSRLPSPSARPPRNSSRTWTQAQVRRERQTRRRARREPTTGARAASFPSPPSRS 165 ************************************************************ P1 SMSLPTRRA*PRAWPAATRFCSPASTRLR*PGVC*SWRKCRARATS*TRSTRRPASRPRE 235 424pyrG(-) SMSLPTRRA*PRAWPAATRFCSPASTRLR*PGVC*SWRKCRARATS*TRSTRRPASRPRE 221 ************************************************************ P1 STRTLSWASCHRRASTRSRRTSSST*RPAANCRPRTRT 424pyrG(-) STRTLSWASCHRRASTRSRRTSSSTRRPAANCRPRTRT ************************* ************

và thể đột biến 424pyrG (-)

Ghi chú: WT-chủng P1; PE858: Thể chuyển gen từ P1; PDA, CDA – Môi trường nuôi cấy

Khả năng phân nhánh của hệ sợi và nồng độ bào tử của PE858 và WT

147

Lấy mẫu rễ và đất cây bị bệnh cấp 1 Lấy mẫu rễ và đất cây bị bệnh cấp 2

PHỤ LỤC 3. Lấy mẫu rễ và đất cây bị bệnh các cấp

Lấy mẫu rễ và đất cây bị bệnh cấp 3 Lấy mẫu rễ và đất cây bị bệnh cấp 4

148

149

PHỤ LỤC 4. Hình ảnh triển khai mô hình thử nghiệm tại ĐăK LăK

Mô hình thử nghiệm Chế phẩm sinh học

Phân các lô thí nghiệm

150

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu vi nấm kháng tuyến trùng trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học

NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC

NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC

KH

NV01

NV02

NV03 Khuẩn lạc màu xanh viền trắng bên ngoài, bào tử mịn.

NV04

NV05

NV20

P1

P6

P7

EN8

EN9

EB10

EB11

EB12

EB13

DL14

DL15

T16

T17

K18

K19

R21

R22

Hình 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp chitinase. (A).

Hình 3.7. Bề mặt đáp ứng của từng cặp các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT DỊCH THỂ CHẾ PHẨM SINH HỌC 10 LÍT/MẺ

Giống gốc P1

Môi trường CDB, pH7, bình tam giác

CDB, pH7, bình tam giác 1 lít

Hoàn thành Chế phẩm sinh học

LB

An pyrG promoter

LB

gpdA promoter Rr

DsRed

TrpC terminator

DsRed

RB

Các đồ thị đường chuẩn

)

Đồ thị đường chuẩn tyrosin y = 0.909x + 0.0184 R² = 0.9986

m n 0 4 5 ( 0 0

μg/ml

)

m n 5 9 5 ( 0 0

Nong do BSA (μg/ml)

Paecilomyces variotii KF305752 NV01

Có thể bạn quan tâm

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển nguồn nhân lực du lịch trong các cơ sở lưu trú tại Hà Nội

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển nguồn nhân lực du lịch trong các cơ sở lưu trú tại Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Giáo dục đạo đức sinh thái cho sinh viên các trường đại học tại Thành phố Hồ Chí Minh hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Giáo dục đạo đức sinh thái cho sinh viên các trường đại học tại Thành phố Hồ Chí Minh hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Công tác hoằng pháp và hoạt động của đạo tràng Phật giáo tỉnh Lào Cai hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Hành vi nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe tâm thần của học sinh trung học phổ thông tại Hà Nội hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Hành vi nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe tâm thần của học sinh trung học phổ thông tại Hà Nội hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Đảng bộ tỉnh Đồng Nai lãnh đạo công tác bảo tồn và phát huy giá trị các di tích lịch sử - văn hóa từ năm 1996 đến năm 2015

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Đảng bộ tỉnh Đồng Nai lãnh đạo công tác bảo tồn và phát huy giá trị các di tích lịch sử - văn hóa từ năm 1996 đến năm 2015

Luận án Tiến sĩ: Thực hiện Pháp lệnh thực hiện dân chủ ở xã, phường, thị trấn vùng dân tộc thiểu số tỉnh Quảng Nam hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Thực hiện Pháp lệnh thực hiện dân chủ ở xã, phường, thị trấn vùng dân tộc thiểu số tỉnh Quảng Nam hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Công tác hoằng pháp và hoạt động của đạo tràng Phật giáo tỉnh Lào Cai hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu chất lượng dịch vụ viễn thông di động tại Tổng công ty viễn thông Viettel

Luận án Tiến sĩ: Nâng cao chất lượng cơ sở vật chất các trường đại học tư thục trên địa bàn thành Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Năng lực cạnh tranh của doanh nghiệp nhỏ và vừa trên địa bàn tỉnh Phú Thọ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự thành công trong khởi sự kinh doanh của phụ nữ khu vực miền Bắc

Luận án Tiến sĩ: Kiểm soát nội bộ tại Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Kiểm soát nội bộ tại Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp phát triển trung tâm logistics quốc tế cho khu vực kinh tế trọng điểm phía Bắc

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến mức độ công bố thông tin trên báo cáo thường niên của các ngân hàng thương mại Việt Nam

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa