PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:55

Thêm vào BST

Báo xấu

139
lượt xem 34
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việt Nam là một trong những nước Đông Nam Á có lịch sử lâu đời về sản xuất lúa. Cây lúa không những đã gắn bó với con người, đất nước ta từ hàng ngàn năm mà cây lúa còn tạo nên lịch sử, văn hóa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hòa bình. Điều đó thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đó đã trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007
LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua. TS. Lê Đình Đôn không những đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ con trong trong nghiên cứu khoa học mà thầy còn dạy con nhiều bài học quí giá trong cuộc sống. Những lời thầy nói, thầy dạy là những bài học mà con sẽ nhớ mãi. Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, động viên, chia sẽ những vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chị Vy, chị Kiều và chị Vân ở phòng Bảo Vệ Thực Vật (Phòng 118, 105) khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi vượt qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài. Chị Ly, anh Điền, anh Khang, anh Hưởng phụ trách phòng Hóa Lý và các anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. Toàn thể lớp CNSH 29 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh ngày 01 tháng 09 năm 2007 Diệp Tuyết Châu i
TÓM TẮT LUẬN VĂN DIỆP TUYẾT CHÂU, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 08/2007. “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, tại Phòng bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM và Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Cây lúa là cây gắn liền với lịch sử hình thành và phát triển nước ta. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng hình thành và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Đặc biệt bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong hai năm gần đây trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long làm giảm năng suất đáng kể. Để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa phát triển cao lên là do giberelin nên chúng tôi tiến hành các nghiên cứu sau: Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC. Các kết quả đạt được: Phân lập được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von. Khuếch đại thành công vùng tef của 14 dòng nấm bằng cặp mồi ef1-ef2 bằng kỹ thuật PCR. Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA3 trong môi trường 20% ICI bằng TLC. ii
SUMMARY The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to 08/2007 at Nong Lam university. In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields. In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of morphological species recognition. Thus, we used molecular technique as PCR to make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all previous morphological treatments. We sucessfully amplified tef gene region of 14 isolates with ef1 and ef2 primers. Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI). Then we used TLC method to identify GA3 but our experiment did not go as well as planned. iii
MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................. i Tóm tắt luận văn ....................................................................................................... ii Summary ................................................................................................................. iii Mục lục .................................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii Danh sách các bảng, hình, sơ đồ ........................................................................... viii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ....................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von ................................................................................. 3 2.1.1 Phân bố và thiệt hại ......................................................................................... 3 2.1.2 Triệu chứng ..................................................................................................... 3 2.1.3 Tác nhân .......................................................................................................... 5 2.1.4 Hình dạng và kích thước ................................................................................. 6 2.1.5 Đặc tính sinh lý ............................................................................................... 6 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển .................................................................... 7 2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi ............................................................. 8 2.2.1 Phân loại học ................................................................................................... 8 2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi ...................................................................... 8 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi .............................................. 9 2.3 Giới thiệu về gen tef ......................................................................................... 10 2.4 Tổng quát về giberelins .................................................................................... 11 2.4.1 Đại cương về các chất giberelins .................................................................. 11 2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa ....................................................................... 13 iv
2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị ............ 13 2.4.2.2 GAs điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đọan trưởng thành .......... 14 2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính ............ 14 2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” ........................................................................... 14 2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt ............................................................. 14 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại ................................................................. 15 2.4.3.1 Trong trồng trọt .......................................................................................... 15 2.4.3.2 Sản xuất bia ................................................................................................ 15 2.4.3.3 Tăng sản lượng mía .................................................................................... 15 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật ............................................................ 16 2.5 Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 16 2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 16 2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................................................................... 20 2.5.3 Một số ứng dụng thông thường của TLC ...................................................... 20 2.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR............................................................................. 20 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................... 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện....................................................................... 22 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 22 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 23 3.3 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm ................................................................ 23 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm ........................................... 23 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm................................................................. 24 3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm ....................................................................... 25 3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử ...................................................................... 25 3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối ..................................................................... 25 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA của nấm ............................................................ 26 3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm................................................................ 26 3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA ....................................................................... 26 v
3.3.2.3 Định tính DNA ........................................................................................... 27 3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích ...................................................................... 28 3.3.3 Khuếch đại vùng tef ...................................................................................... 28 3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm................................................................. 28 3.3.3.2 Thực hiện phản ứng................................................................................... 29 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR ............................................................................ 29 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 ........................................................... 29 3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm.................................................................... 29 3.4.2 Phương pháp sản xuất GA3 .......................................................................... 30 3.4.3 Phương pháp trích GA3 ................................................................................. 30 3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC ............................................................................. 31 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL ....................................................... 32 4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử ................................................................ 33 4.3 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................... 35 4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm ................................................... 36 4.5 Kết quả PCR .................................................................................................... 38 4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC .................................................................... 39 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 41 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 41 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42 PHỤ LỤC vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcOH: acid acetic. AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. BVTV: bảo vệ thực vật. bp: base pair. CHCl3 : chloroform. dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate. ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long. EtOAc: ethyl acetate. HPLC: high performance liquid chromatography. ITS: Internal Transcribed Spacer. GAs: giberelins. GA3: acid giberelic. Gf: Gibberella fujikuroi MP: mating population. PCR: polymerase chain reaction. PDA: potato dextrose agar. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid. Rf: ratio of fronts. STT: số thứ tự. TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate. tef : translation elongation factor. TLC: thin-layer chromatography. Tm: melting temperature. UV: ultra violet. WA: water agar. vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von .............................................. 4 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh ..................................................................... 5 Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme ...................................... 5 Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic ................................................................................ 11 Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene ................................................................................... 11 Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane............................................................................ 12 Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao ................................. 13 Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA3 đến giống nho không hạt của Thompson ................. 15 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC .................................................................. 19 Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ..................... 33 Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trường WA ............................................ 33 Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy ............................. 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy ................................ 34 Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme ............................................................. 35 Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme ........................................................... 35 Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 ....................................................... 36 Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm theo qui trình 2 ........................... 37 Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef ............................................................................. 39 Hình 4.10 Kết quả sắc ký .......................................................................................... 40 Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi .............................. 9 Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium ................................................................. 10 Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3 ................................................................................... 30 Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA3 ................................................................... 31 Bảng 3.1 Các dòng nấm được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL ........ 23 Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR................................................................. 29 viii
1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những nước Đông Nam Á có lịch sử lâu đời về sản xuất lúa. Cây lúa không những đã gắn bó với con người, đất nước ta từ hàng ngàn năm mà cây lúa còn tạo nên lịch sử, văn hóa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hòa bình. Điều đó thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đó đã trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên thế giới. Nó được xem là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu của người Châu Á nói chung cũng như là người Việt Nam nói riêng. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng đã xuất hiện và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Các loại dịch bệnh này có thể do nhiều tác nhân như nấm, sâu bệnh, vi khuẩn, vi rút hay kí sinh trùng gây ra. Các loại dịch bệnh phổ biến do nấm gây ra trên lúa có thể kể như lúa von, đạo ôn, khô vằn. Những năm gần đây bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong vụ Đông Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 toàn tỉnh có hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm đòng (http://www.laodong.com.vn) và đã làm giảm năng suất đáng kể. Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mô tả cách đây hơn 100 năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các loài Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi này bao gồm nhiều loài khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ loài
2 Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các loài sinh học trong nhóm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đó, để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dòng nấm gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa cao đột biến là giberelin từ đó là cơ sở để chọn ra các dòng nấm tạo nhiều giberelin nhất để tiến hành nuôi cấy, lên men sản xuất giberelin. 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC.
3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von 2.1.1 Phân bố và thiệt hại Bệnh đã được biết đến ở Nhật từ năm 1828, nhưng mãi đến năm 1898 mới được Hori mô tả lần đầu tiên. Bệnh khá phổ biến trên thế giới. Ở Trung Quốc bệnh được gọi là „white stalk‟; còn ở Philippines và Guyana bệnh được gọi là „lúa đực‟ (palay lalake hay man rice). Thất thu do bệnh có thể rất đáng kể ở nhiều nơi, 20% ở Hokkaido, 40 – 50% ở Kinki Chugoku, Nhật (Ito, Kimura, 1931; Kinki – Chugoku Regional Agriculture Committee, 1975), 15% ở Đông Uttar Pradesh, Ấn Độ (Pavgi, Singh, 1964), 3,7 – 14,7% ở Trung và Bắc Thái Lan (Kanjanasoon, 1965). Bệnh cũng phổ biến ở nhiều nước Đông Nam Á nhưng thiệt hại không lớn. Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long bệnh cũng có mặt ở nhiều nơi, nhất là vụ Đông Xuân, mức độ thiệt hại tùy giống và tùy năm. Trên giống IR-42 ở Huyện Mỹ Xuyên, Sóc Trăng, tỉ lệ chồi nhiễm có thể đến 10 – 20%. Bệnh có khi thành dịch trên diện rộng, như vào năm 1980 ở Đồng Tháp. 2.1.2 Triệu chứng Bệnh có thể xuất hiện ngay từ giai đoạn mạ. Triệu chứng dễ thấy và thông thường nhất là cây mạ bị bệnh có chiều cao hơn cây bình thường, mảnh và có màu xanh vàng nhạt. Cây mạ bị bệnh có thể chết trước khi nhổ cấy hay sau khi cấy. Những cây này nổi bật lên rất dễ thấy, nó phân bố khắp cánh đồng. Tuy vậy cũng có một số cây mạ bị bệnh không có triệu chứng von mà lại thấp lùn còi cọc, phụ thuộc vào dòng nấm gây bệnh và các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ và ẩm độ.
4 Hình 2.1 Ruộng lúa ở Càng Long -Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von tại thời điểm 01/05/2007. Ghi chú: Các mũi tên chỉ cây lúa bị nhiễm bệnh. Yamanaka và Honkura (1978) đã phân ra có 5 loại triệu chứng. Vươn dài. Vươn dài sau đó phát triển bình thường. Vươn dài sau đó bị còi cọc. Cây bị còi cọc. Cây không phát triển. Trên lúa bệnh phát sinh từ khi bắt đầu đẻ nhánh đến có đòng. Những cây bị bệnh nặng sinh ra các rễ phụ ở đốt thân, đôi khi xuất hiện lớp sợi nấm màu trắng hay màu hồng ở các đốt phía dưới, đó là khuẩn ty và bào tử của nấm, lớp mốc này lan dần lên trên khi cây chết. Nấm có thể thành lập quả nang bầu trên cây bệnh nếu điều kiện thuận lợi.
5 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh. (Nguồn http://www.planthealthaustralia.com.au http://www.plantsciences.ucdavis.edu ) 2.1.3 Tác nhân Bệnh do nấm Fusarium moniliforme, có giai đoạn hữu tính sinh sản bằng nang nên còn được gọi là Gibberella fujikuroi. Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme. (Nguồn http://www.knowledgebank.irri.org )
6 2.1.4 Hình dạng và kích thƣớc Giai đoạn quả tử nang của Gibberella fujikuroi có hình khối cầu hay bầu dục, mặt ngoài xù xì, có màu xanh đậm trong chứa các bào tử nang có một vách ngăn, 250 – 330 x 220 – 280 (190 – 390 x 160 – 420) m; nang có dạng hình trụ, phần trên hơi rộng hơn, 90 – 102 x 7 – 9 (66 – 129 x 7 – 14) m, chứa 4,6 và có khi đến 8 bào tử, một dãy hay hai hàng không rõ; nang bào tử có 1 vách ngăn, khoảng 15 x 5,2 m (đa số là 14 – 18 x 4,4 – 7 m) có khi lớn 27 – 45 x 6 – 7 m (nếu nang chỉ chứa một bào tử) (S.H.Ou, 1985). Giai đoạn phân sinh bào tử của Gibberella fujikuroi có hai dạng bào tử là tiểu bào tử và đại bào tử. Tiểu bào tử có hình trứng dẹt, không có hay có một vách ngăn, thường xếp thành chuỗi, sau đó rời nhau và phân tán thành lớp bột trắng trên nền khuẩn ty trắng vàng hay trắng hồng. Còn đại bào tử thanh mảnh, hai đầu nhọn, hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có một cái móc ở đỉnh, màu xanh vàng nhạt có 3 – 5 vách ngăn (S.H.Ou, 1985). Nấm không có bào tử chống chịu, có hay không có hạch nấm hình cầu, màu xanh đậm, kích thước 80 – 100 m. Số vách ngăn của bào tử, việc thành lập tiểu bào tử, đại bào tử và hạch nấm của nấm gây bệnh cũng rất thay đổi. 2.1.5 Đặc tính sinh lý Theo S.H.Ou (1985) nấm dễ nuôi cấy trên nhiều loại môi trường, thường dùng dung dịch của Richard và Knop. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của sợi nấm được nhiều người nghiên cứu, nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là 27 – 30 C, tối đa 36 – 40 C và tối thiểu 7 – 8 C. Những nguyên tố vi lượng như borax, kẽm, mangan làm gia tăng sự phát triển của nấm. Quá trình phân lập nấm được thực hiện dễ dàng trên những môi trường chọn lọc như môi trường có chứa quintozene (PCNB). Việc sinh tiểu bào tử hay đại bào tử cũng tùy thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong môi trường, bào tử được sinh nhiều nếu có ánh sáng liên tục. Rice straw-soybean meal agar và Sach‟s agar plus
7 rice straw giúp cho tạo tiểu bào tử trong khi glucose casamino acid agar và rice straw casamino acid agar giúp cho việc hình thành đại bào tử. Xylose là nguồn cacbon hydrat thích hợp nhất để tạo đại bào tử. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm sản sinh ra 2 chất là axít fusaric và giberelin. Axít fusaric hạn chế sinh trưởng làm cây còi cọc, còn giberelin có tác dụng kích thích làm cây phát triển theo chiều cao, cao vống lên. Sự sản sinh ra hai chất này phụ thuộc vào dòng nấm và môi trường sinh sống của nấm. Trên môi trường có KH2PO4 hay MgSO4 hay có nhiều kali, nấm sẽ tạo ra nhiều giberelin trong khi glucose lại rất tốt để nấm tạo ra axít fusaric. Axít fusaric sản sinh nhiều ở nhiệt độ cao (33 C) và môi trường kiềm (pH~9), còn giberelin sản sinh ở nhiệt độ thấp hơn (từ 27 – 30 C) và môi trường chua. Mật độ nấm bệnh càng cao, nấm có khuynh hướng tạo axít fusaric. Muốn sinh sản hữu tính, nấm phải cần có khuẩn ty khác nhóm để phối hợp. Ngoài ra, nang bào tử nấm cũng có tính đực, tính cái và lưỡng tính. 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển Bệnh lúa von chủ yếu truyền qua hạt giống. Hạt lúa bị nhiễm bệnh ở thời kì trổ hoa và kéo dài trong ba tuần sau đó, nhưng tỉ lệ hạt bị nhiễm cũng giảm dần đi. Nếu nhiễm nặng hạt sẽ có màu đỏ và mạ mọc lên sẽ bị lùn. Các hạt nảy mầm sẽ sinh ra cây mạ bị von. Từ những cây mạ bị bệnh, bào tử nhờ gió và nước lan truyền xâm nhiễm cho cây khác. Nấm phát triển trong cây phá hủy tế bào cây, đồng thời những chất do chúng tiết ra tạo nên triệu chứng điển hình của cây lúa bị bệnh. Một số hạt giống không bị biến màu vỏ cũng có thể mang nguồn nấm. Trên hạt giống bảo quản khô ráo nấm tồn tại tới 3 năm. Ngoài ra nấm còn tồn tại trong đất, tuy thời gian không lâu. Một thí nghiệm ở Thái Lan (Kanjanosoon, 1965) cho thấy đất sau khi lây nhiễm nấm cho số cây bệnh là 93%, sau đó tỉ lệ bệnh giảm dần, tới 90 ngày chỉ còn 0,7% và sẽ không có cây bệnh nếu để sau 6 tháng. Đại bào tử hay khuẩn ty vách dày của nấm cũng sống được 4 tháng trong đất (S.H.Ou, 1985). Trên hạt và thân lúa nhiễm, nấm có thể sống 4 – 10 tháng ở nhiệt độ phòng, nếu trữ lạnh ở 7 C nấm có thể sống hơn 3 năm.
8 2.2 Đại cƣơng về nấm Gibberella fujikuroi (giai đoạn vô tính là Fusarium moniliforme) 2.2.1 Phân loại học Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Lớp phụ: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales Họ: Nectriaceae Giống: Gibberella Loài: Gibberella fujikuroi complex 2.2.2 Sơ lƣợc về Gibberella fujikuroi Năm 1931, Wollenweber đặt tên cho giai đoạn vô tính của nấm gây bệnh lúa von là Fusarium moniliforme (Sheldon) và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (Saw.) Wr. (B. Tudzynski, 1999) Theo Stefan Malonek và ctv (2005), phức hệ loài Gibberella fujikuroi bao gồm nhiều loài nấm gây bệnh quan trọng trên nhiều cây trồng khác nhau như ngô, lúa, lúa mạch, mía, thông, xoài, dứa, lúa miến… Giai đoạn vô tính trong phức hệ này thuộc giống Fusarium nhóm Liseola. Phức hệ loài này được chia thành ít nhất 9 loài hữu tính (sexually fertile biological species) (được biết như những quần thể giao phối, MP-A đến MP-I) và có 32 loài vô tính. Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu nhằm xác định loài trong phức hệ này như dựa vào hình thái, khả năng giao phối (mating experiment), phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự DNA từ những loci không liên kết như tiểu đơn vị nhỏ của ti thể (mtSSU) rDNA, nuclear 28S rDNA, -tubulin, calmodulin, EF-1 , và histon H3 gen. Những kĩ thuật phân tử khác như RAPDs, mitochondrial RFLPs và CHEF-gel karyotypes cũng được dùng để phân biệt những thành viên trong phức hệ loài Gibberella fujikuroi. Ngoài ra những thành viên trong quần thể giao phối có nhiều kí chủ khác nhau và khác nhau về khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp như fumonisins, axít
9 fusaric, fusaproliferin, moniliformin, fusarins và giberelin. Những dòng của những quần thể giao phối khác nhau sẽ tạo ra những chất thứ cấp khác nhau. Vì vậy những loài của MP-A, -C, -D và -G tạo ra fumonisins, MP-A, -C và F tạo ra moniliformin, beauvericin và fusaprolifern được MP-D và E tạo ra. Ngược lại, chỉ có loài F.fujikuroi (MP-C) có khả năng sản xuất giberelins (Stefan Malonek và ctv., 2005). 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi Theo Hiroshi Kawaide (2006), quá trình nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp giberelin có thể chia thành 3 bước như sau: Bước 1: ent-kaurene được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate thông qua geranylgeranyl diphosphate (GGDP). Bước 2: chuyển ent-kaurene thành GA12-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các enzyme cytochrome P450 monoxygenases. Bước 3: qua nhiều bước GA12-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA3. Sơ đồ 2.1 Con đƣờng sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi. (Nguồn www.aseanbiodiversity.info)
10 2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- ) Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hóa cho protein EF-1 . EF-1 là một chuỗi polypeptide có vai trò quan trọng trong sự kéo dài chuỗi polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhóm aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này đòi hỏi GTP. EF-1 có trọng lượng phân tử là 45.000 – 55.000. Nó cũng có chức năng tương đồng với EF-Tu (prokaryotic elongation factor), cả hai yếu tố này đều hình thành phức hợp aminoacyl tRNAs và GTP. Gen mã hóa EF-1 của nhiều loài đã được tạo dòng và được đọc trình tự. Đó là của các loài nấm men, tôm Artemia sanila, nấm Mucor racemosus và người. Tất cả những gen này mã hóa các protein có độ tương đồng cao so với những protein khác. Điều hòa sự biểu hiện EF-1 là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu do nó là một protein đa dạng và có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sinh tổng hợp protein. Khi hoạt tính EF-1 tăng thì mô phát triển do có nhiều protein được tổng hợp. Tuy nhiên hoạt tính EF-1 được điều khiển ở mức mRNA hay protein vẫn chưa được biết rõ (A.R.Pokalsky và ctv., 1989). Dựa vào vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn vì chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Lại Hà Tố Hoa, 2006). Sơ đồ 2.2 Bảng đồ vùng gen tef ở Fusarium trong FUSARIUM-ID. (David M.Geiser và ctv., 2004)