Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 QUÁCH THỊ THANH TÂM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN TRONG CHĂN NUÔI

Cần Thơ- 2017

CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn khoa học:

TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PGS.TS. NGUYỄN NHỰT XUÂN DUNG

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm …..

Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam.

DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

Các bài báo đăng trên tạp chí:

1. Quách Th Thanh Tâm, B i Th Minh Diệu . 2015 . Ph n lập và tuyển chọn vi huẩn có hả năng ph n h y l ng gi s c – l ng gi cầm t các l m gi s c b huyện T m Bình, Long H và V ng Liêm t nh V nh Long . Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ ISSN: 1859 - 2333 số 41b 2015 . Trang 1- 11

2. Tam Quach Thi Thanh, Tham Nguyên Thi Hong, Dieu Bui Thi Minh. 2014 . Isolation and Selection of Feather-Degrading Aerobic Bacteria from Poultry Processing Plants in Mekong Delta of Vietnam”, Nova Explore Publications, Nova Journal of Medical and Biological Sciences, PII: S2292793X1400028-2, Vol 2(6), 2014: 1-8 Online ISSN: 2292-793X.

3. Quách Th Thanh Tâm, B i Th Minh Diệu, Nguyễn Th Cẩm Nhung và Nguyễn Nhựt Xuân Dung. (2017) Ảnh hƣ ng c việc b sung bột l ng v sinh học trong hẩu phần lên sinh trƣ ng và quày thịt c gà thả vƣờn , Tạp ch Khoa học Kỹ thuật chăn nuôi ISSN: 1859-476X số 219 tháng 5/2017 . Trang 30 - 37

2

3 Chƣơng I. GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết c luận án Lông gia súc-gia cầm là phế phẩm được tạo ra với khối lượng lớn t chăn nuôi và giết m gia súc-gia cầm. Với thành phần ch nh là keratin (90%), lông rất khó phân hủy và gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. S dụng vi khuẩn đ phân hủy nguồn chất thải này đang là hướng đi mới, v a có th giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường lại v a tận dụng phế phẩm đ b sung vào thức ăn chăn nuôi ho c làm phân bón sinh học. Ở Việt Nam, những năm gần đây mới có một vài nghiên cứu về một số loài vi sinh vật có khả năng phân hủy lông t một số v ng đất khác nhau ở ph a Bắc Việt Nam-v ng kh hậu khá khác biệt với miền Nam. Những nghiên cứu này vẫn còn đang trong giai đoạn khảo sát đ c tính các chủng vi sinh vật phân lập được, chưa thấy có công bố ứng dụng các vi sinh vật này. Hơn nữa, miền Nam Việt Nam chiếm ưu thế trên cả nước về sự phát tri n của chăn nuôi. Điều này kéo theo số lượng lông gia súc-gia cầm thải ra lớn, đồng thời nhu cầu thực phẩm b sung đạm cho vật nuôi cũng cao. Xuất phát t thực tế trên, đề tài Ph n lập, tuyển chọn và ứng dụng vi huẩn ph n giải er tin trong chăn nuôi” được tiến hành.

1.2 Mục tiêu c luận án Luận án được tiến hành nhằm đạt mục tiêu: Tuy n chọn và đ nh danh một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy hiệu quả lông gia súc, gia cầm t các cơ sở giết m gia súc, gia cầm của v ng ĐBSCL Thiết kế được quy trình nuôi cấy th ch hợp cho một số chủng vi khuẩn được tuy n chọn có khả năng phân giải keratin mạnh.

Ứng dụng chủng vi khuẩn được tuy n chọn đ x lý nguồn chất thải lông gia cầm nhằm tạo thành thức ăn b sung protein cho ngành chăn nuôi.

1.3 Những đóng góp mới c luận án Là nghiên cứu đầu tiên ở ĐBSCL có t nh hệ thống về vi khuẩn phân giải keratin chất thải lông gia súc gia cầm, bao gồm các khâu phân lập, tuy n chọn, đ nh danh, đánh giá khả năng phân

giải keratin, khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu và ứng dụng vào chăn nuôi gà th t thả vườn.

Quá trình phân lập dựa vào cơ chế trao đ i chất đ c biệt trong quá trình tăng trưởng và phát tri n của vi khuẩn phân giải keratin chất thải lông, cấy chuyền đ sàng lọc và tuy n chọn ban đầu nguồn vi khuẩn mong muốn, đây là phương pháp mới đ phân lập vi khuẩn phân giải keratin. Sự kết hợp các phương pháp xác đ nh hoạt t nh keratinase, xác đ nh khả năng phân giải keratin là phương pháp tin cậy đ tuy n chọn nguồn vi khuẩn bản đ a phân giải tốt keratin chất thải lông. Thông qua phương pháp này kết hợp phương pháp đ nh danh truyền thống Bergey và phương pháp sinh học phân t , đã tuy n chọn và đ nh danh được 26/429 chủng vi khuẩn bản đ a có khả năng phân giải keratin mạnh làm cơ sở cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn phân hủy mạnh chất thải lông gia súc gia cầm đ ứng dụng x lý chất thải lông t các cơ sở giết m gia súc gia cầm.

Góp phần làm phong phú và b sung mới bộ sưu tập vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh vào bộ giống Vi sinh vật hữu ch của Viện Nghiên cứu và Phát tri n CNSH đ phục vụ sản xuất.

Xác đ nh các môi

trường nuôi cấy

th ch hợp cho các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 bản đ a có khả năng phân hủy chất thải lông mạnh ở v ng ĐBSCL.

Bước đầu xây dựng các thông số ph hợp cho quy trình ứng dụng đối với chủng Bacillus megaterium K79 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh giúp x lý và tận dụng phế phẩm lông gia cầm thành thức ăn b sung protein cho vật nuôi ở dạng bột lông sinh học an toàn vi sinh với giá tr dinh dưỡng và khả năng tiêu hóa cao và đáp ứng được yêu cầu thân thiện với môi trường tốt hơn so với bột lông Meko sản phẩm thương mại).

1.4 Ý ngh thực tiễn và hả năng ứng dụng c luận án Luận án cung cấp thông tin hữu ch liên quan đến việc quản lý môi trường chất thải lông gia súc gia cầm hiệu quả.

2

Luận án còn cung cấp những thông tin khoa học về: (1) các chủng vi khuẩn bản đ a có khả năng phân hủy tốt chất thải lông; (2) các điều kiện nuôi cấy th ch hợp của một số chủng vi khuẩn bản đ a; (3) quy trình tạo bột lông sinh học t lông gia cầm ủ với chủng Bacillus megaterium K79; (4) thành phần dinh dưỡng của bột lông sinh học; (5) chỉ tiêu sinh trưởng cũng như chỉ tiêu thân th t trong chăn nuôi gà thả vườn với bột lông sinh học này.

Đ c biệt, những kết quả nghiên cứu góp phần làm nền tảng khoa học trong việc áp dụng công nghệ cao đ sản xuất bột lông sinh học được s dụng làm thức ăn b sung đạm cho vật nuôi và cá ho c làm phân bón sinh học cho cây trồng trong tương lai. Nghiên cứu này ít nhiều đã đóng góp vào việc x lý hữu ch nguồn chất thải lông gây ô nhiễm trong chăn nuôi, các cơ sở giết m và tạo được môi trường thân thiện. Ứng dụng kết quả nghiên cứu sẽ góp phần đưa ngành chăn nuôi vào một quy trình sản xuất bền vững theo chu trình k n. Chƣơng III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trên 4 nội dung:

3.1. Nội dung 1: Khảo sát tình hình chất thải l ng các cơ s giết m gi s c gi cầm tại thành phố Cần Thơ, V nh Long và Đ ng Tháp. - Thông tin ban đầu được khảo sát về các cơ sở giết m gia súc gia cầm tại 3 đ a bàn qua các trạm thú y. - Mẫu phiếu điều tra được tạo và được ghi nhận tại các cơ sở giết m : gồm các câu h i được thiết kế nhằm phục vụ khảo sát hiện trạng và phương pháp x lý chất thải lông tại các cơ sở giết m gia súc gia cầm về: số lượng, cách x lý chất thải lông của các cơ sở giết m gia súc gia cầm,... T đó, số liệu điều tra được x lý và đánh giá. Đánh giá ết quả: Các phiếu điều tra được nhập liệu, phân nhóm, thống kê theo phần mềm Microsoft Excel và lập các bi u bảng hay bi u đồ so sánh đ đánh giá về hiện trạng chất thải lông t các cơ sở giết m gia súc gia cầm ở 3 đ a bàn.

3 3.2 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi huẩn hiếu hí ph n giải er tin mạnh t chất thải chăn nu i và chế biến gia s c, gi cầm. 3.2.1 Mẫu vật

Chất thải lông heo, lông gia cầm, mẫu nước, mẫu đất thu t các cơ sở giết m gia súc gia cầm ở 3 tỉnh ĐBSCL thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp 3.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nội dung 1 gồm 3 th nghiệm:

3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số ch ng vi huẩn có hả năng ph n giải er tin t chất thải chăn nu i và chế biến gi cầm. Cách lấy mẫu:

Việc thu mẫu được tiến hành tại 14 cơ sở giết m gia cầm ở 3 tỉnh ĐBSCL thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp . M i cơ sở tiến hành thu 3 mẫu: mẫu nước, mẫu lông đang phân hủy và mẫu đất, t ng cộng 42 mẫu.

Mẫu lông: lấy khoảng 10 g mẫu lông đang phân hủy trong đất ở ngay cơ sở giết m . Mẫu đất: đào sâu khoảng 20 cm ở ngay cơ sở giết m và chuồng nuôi gia cầm, lấy khoảng 10 g mẫu. Mẫu nước: lấy 10 mL nước nơi nước tĩnh, đọng lại ho c hố chứa nước thải. Cách ph n lập ch ng vi huẩn có hả năng ph n giải er tin

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin cần phân lập được tăng sinh khối và phân lập trong môi trường phân lập t các mẫu đất, nước, lông thu ờ các cơ sở giết m theo phương pháp của Nguyễn Huy Hoàng và ctv.( 2010).. Tuyển chọn ch ng vi huẩn ph n h y mạnh l ng gi cầm

Bố trí thí nghiệm: Th nghiệm được bố tr hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố th nghiệm là các chủng vi khuẩn phân lập được. Th nghiệm được thực hiện với 3 lần l p lại. Cách thực hiện theo phương pháp Nguyễn Huy Hoàng và ctv.(2010).

Chỉ tiêu theo dõi: - Đánh giá hoạt t nh enzyme keratinase.

4

- Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các chủng vi khuẩn.

3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số ch ng vi huẩn có hả năng ph n giải er tin c l ng gi s c t chất thải chăn nu i và chế biến gi s c.

Vật liệu, phương pháp thực hiện và các chỉ tiêu theo dõi tương tự th nghiệm 1 với lông gia cầm được thay bằng lông heo. Việc thu mẫu 42 mẫu nước, 42 mẫu đất, 42 mẫu lông được tiến hành tại 42 đi m lò giết m gia súc ở 3 tỉnh ĐBSCL Thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp). T ng số 126 mẫu. 3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Ph n lập và nhận diện một số ch ng vi huẩn chịu nhiệt có hả năng ph n giải er tin l ng gi cầm

Đánh giá khả năng ch u nhiệt của các chủng vi khuẩn được thực Vật liệu, phương pháp thực hiện và các chỉ tiêu theo dõi tương tự phương pháp phân lập ở th nghiệm 1 với nhiệt độ 45oC. Thu 30 mẫu 23 mẫu đất và 7 mẫu nước tại lò giết m , trại chăn nuôi gia cầm ở Vĩnh Long và Đồng Tháp. 3.2.2.3.1. Đánh giá hả năng chịu nhiệt c các ch ng vi huẩn hiện theo phương pháp Niamsup et al. (2003).

Các chủng vi khuẩn thuần phân lập được Cấy ria trên môi trường bột lông vũ và ủ ở 50oC trong 48 giờ Chọn chủng có khả năng sống ở 50oC đ tiến hành cấy ria trên môi trường bột lông vũ và ủ ở 55oC trong 48 giờ Thực hiện thao tác tương tự với nhiệt độ tăng dần 60oC, 65oC,...) cho đến nhiệt độ không còn chủng vi khuẩn nào có khả năng sinh trưởng và phát tri n. Ghi nhận kết quả Hình 3.1 Sơ đồ ki m tra khả năng ch u nhiệt của các chủng vi khuẩn được phân lập 3.2.2.3.2 Đánh giá hả năng ph n h y l ng gi cầm c các ch ng vi huẩn chịu nhiệt t nhiệt độ 45oC tr lên

Mật số tế bào vi khuẩn được đếm và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các chủng vi khuẩn được khảo sát t 45oC trở lên: m i bình chứa 100 mL môi trường phân lập, đem kh tr ng ở 121oC trong 20 phút. Lần lượt chủng vào m i bình tam giác 5 mL d ch nuôi vi khuẩn, ủ ở nhiệt độ 45oC trên máy lắc 120 rpm. Một bình tam giác không chủng

5 vi khuẩn được s dụng làm mẫu đối chứng. Sau một tuần nuôi lắc, tiến hành lọc môi trường qua vải lọc đã được cân khối lượng trước đó, cân lượng bột lông còn lại sau khi đã sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đ i đ t nh khối lượng bột lông đã b phân hủy trong quá trình nuôi cấy. Tương tự cho khảo sát khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các chủng vi khuẩn sống và phát tri n ở 50oC, 55oC, 60oC và các mức nhiệt độ cao hơn đến nhiệt độ vi khuẩn chết. 3.2.3 Ph n tích thống ê nội dung nghiên cứu 2

Số liệu th nghiệm được x lý bằng phần mềm thống kê Minitab 16.0, so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%, s dụng Microsoft Excel đ vẽ đồ th , d ng phần mềm bioEdit và phần mềm Mega 5.2 đ xây dựng mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn phân giải keratin dựa trên trình tự 16S rRNA. 3.2.4 Định d nh ch ng vi huẩn có hả năng ph n h y l ng gi cầm Đ nh danh vi khuẩn dựa trên phương pháp phân loại Bergey kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. ADN vi khuẩn được tr ch theo phương pháp của Neumamn et al. (1992 với c p mồi của Khardenavis et al.( 2009)

27F: 5’- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3’ 1492R: 5’- CGGYTACCTTGTTACGACTT – 3’

3.3 Nội dung 3: Ảnh hƣ ng c các điều iện m i trƣờng nu i cấy đến sự phát triển, hả năng ph n h y l ng và hàm lƣợng protein c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2 gồm 10 th nghiệm . 3.3.1 Mẫu vật Chủng sàng được tuy n t th nghiệm 1và th nghiệm 2 3.3.2 Phƣơng pháp Ch tiêu theo dõi ở cả 10 th nghiệm : Mật số vi khuẩn, t lệ bột lông b phân hủy, hàm lượng protein hòa tan. 3.3.2.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hƣ ng c pH và nhiệt độ đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng gi cầm c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1

Th nghiệm được khảo sát mức th ch hợp về nhiệt độ 4 mức độ 30oC, 35oC, 40oC, 45oC và pH 5 mức độ 4, 5, 6, 7, 8). T ng số nghiệm

6 thức là 20 = 5 mức độ pH x 4 mức độ nhiệt độ x 3 lần l p lại = 60 ĐVTN.

Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sự phát tri n và khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 1 theo phương pháp của Daniel et al. (2009) 3.3.2.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hƣ ng c pH và nhiệt độ đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng gia súc (lông heo) c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 2 Cách thực hiện tương tự th nghiệm 4a với lông gia cầm được

thay bằng lông heo với chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 2 3.3.2.3. Thí nghiệm 5 : Khảo sát ảnh hƣ ng c n ng độ dịch vi huẩn đƣ vào đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng gi cầm c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1

Th nghiệm bố tr hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức là 3 mức độ của dung d ch chủng gốc: 3%, 5%, 10% chứa 107 tế bào/mL, lập lại 3 lần, t ng cộng 9 đơn v th nghiệm. Th nghiệm được thực hiện tương tự th nghiệm 4a với c ng công

thức môi trường nuôi cấy; pH, nhiệt độ ủ theo kết quả th nghiệm 4a. 3.3.2.4. Thí nghiệm 5b: Khảo sát ảnh hƣ ng c n ng độ vi huẩn đƣ vào đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng heo c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 2 Cách thực hiện, phương pháp và các chỉ tiêu theo dõi tương tự th nghiệm 4a với lông gia cầm được thay bằng lông heo và chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 2. 3.3.2.5. Thí nghiệm 6 : Khảo sát ảnh hƣ ng c ngu n dinh dƣỡng chứ c rbon đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng gi cầm c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1

Bố tr hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức: glucose 1%, 2%, 3% ; sucrose 1%, 2%, 3% , tinh bột 1%,2%,3% và 1 nghiệm thức đối chứng ĐC: không b sung nguồn dinh dưỡng chứa carbon , m i nghiệm thức lập lại 3 lần, có t ng số là 30 đơn v th nghiệm. Th nghiệm được thực hiện tương tự th nghiệm 5a với pH, nhiệt độ ủ, nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào theo kết quả các th nghiệm trên.

7 3.3.2.6. Thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hƣ ng c ngu n dinh dƣỡng chứ c rbon đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng gi s c (l ng heo) c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 2

Th nghiệm được thực hiện tương tự th nghiệm 6a với lông gia cầm được thay bằng lông heo với chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 2. 3.3.2.7. Thí nghiệm 7a: Khảo sát ảnh hƣ ng c ngu n dinh dƣỡng chứ nitơ đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng gi cầm c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1

Th nghiệm được bố tr hoàn toàn ngẫu nhiên với 10 nghiệm thức lần lượt là ĐC không có chủng nguồn dinh dưỡng chứa nitơ ; yeast extract (0,1%; 0,5%; 1%); bột đậu nành đậu nành nghiền m n (0,1%; 0,5%; 1%); NH4Cl 0,1%; 0,5%; 1% . M i NT có 3 lần lập lại, có t ng số là 30 đơn v th nghiệm.

Th nghiệm được thực hiện tương tự th nghiệm 6a với các nồng độ 0,1%; 0,5%; 1% của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ b sung vào môi trường môi trường C : yeast extract, bột đậu nành đậu nành nghiền m n , NH4Cl được thực hiện c ng lúc với nghiệm thức đối chứng không b sung nguồn nitơ đ so sánh. 3.3.2.8. Thí nghiệm 7b: Khảo sát ảnh hƣ ng c ngu n dinh dƣỡng chứ nitơ đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng heo c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 2 Phương pháp tương tự th nghiệm 7a với lông gia cầm được thay

bằng lông heo với chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 2. 3.3.2.9. Thí nghiệm 8a: Khảo sát sự ph n h y l ng gi cầm nguyên theo thời gi n c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1

Th nghiệm được thực hiện tương tự th nghiệm 7a với nhiệt độ ủ 35oC, pH8, nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào 10% theo các kết quả trên. Theo dõi trong 10 tuần. T ng số nghiệm thức là 1 = 1 chủng VK [x 3 lần l p lại = 3 ĐVTN]. 3.3.2.10. Thí nghiệm 8b: Khảo sát sự ph n h y sợi l ng gi s c theo thời gi n c ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 2 Cách thực hiện tương tự th nghiệm 8a với lông heo và chủng

sàng được tuy n t Th nghiệm 2

8 3.3.3. Ph n tích thống ê nội dung nghiên cứu 3

Số liệu th nghiệm được x lý bằng phần mềm thống kê Minitab 16, so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%, s dụng Microsoft Excel đ vẽ đồ th . 3.4. L ng gi cầm với ch ng sàng đƣợc tuyển t Thí nghiệm 1 Quy trình xử lý chất thải lông chứ er tin làm thức ăn chăn nu i: 1 kg lông gia cầm  Kh tr ng 121oC, 5 phút) Cho vào bình 25 l t , thêm vào 1 L d ch chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 1 đã tăng sinh đạt mật số 107 tế bào/mL  Ủ ở nhiệt độ phòng ~37 oC - 40 oC , 10 tuần  Sấy 45oC  bột lông sinh học - thực liệu b sung đạm. Ph n tích hàm lƣợng vi huẩn có hại trong bột l ng sinh học Coliforms và E.coli trong bột lông sinh học được ki m tra bằng phương pháp MPN (Theo TCVN 7136: 2002) 3.5. Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng ch ng vi huẩn ph n h y mạnh l ng gi cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến l ng gà thành thức ăn b sung protein cho gà thả vƣờn.

Th nghiệm được thực hiện trên 250 Gà Ta Gò Công 5 tuần tu i. Tất cả đều được phân loại trống mái, tiêm phòng bệnh Marek và một số bệnh truyền nhiễm khác. 3.5.1. Thức ăn thí nghiệm Bột lông sinh học thu được do ủ lông gia cầm với chủng sàng được tuy n t Th nghiệm 1 Bột lông Meko được mua t công ty c phần thức ăn gia súc

Meko Gà th nghiệm được nuôi theo quy trình gồm có 3 giai đoạn: Giai đoạn 1 úm t 1 đến 28 ngày tu i, tất cả gà đều được cho ăn c ng một loại thức ăn khởi động của Proconco, có hàm lượng protein 20% CP và ME là 2850 kcal/kg Thức ăn th nghiệm được áp dụng cho gà giai đoạn tăng trưởng 5 – 10 tuần tu i và giai đoạn v béo 11- 14 tuần tu i . Công thức các nghiệm thức NT th nghiệm bảng 3.1 và Bảng 3.2 được trình bày như sau: NT 1: đối chứng - không s dụng bột lông sinh học ĐC NT 2: b sung 2% bột lông sinh học BL2 NT 3: b sung 5% bột lông sinh học BL5

9 NT 4: b sung 8% bột lông sinh học BL8 NT 5: b sung 5% bột lông Meko (BLMK5) M i nghiệm thức lập lại 5 lần. Có t ng cộng 25 đơn v th nghiệm, m i đơn v th nghiệm là một ô chuồng nuôi 10 gà 5 trống 5 mái , có t ng cộng 250 gà.

ĐC 55 15 4 BL5 55 15 4 BL2 55 15 4 BLMK5 55 15 4

15 16 8,9 11,9 11,9

7,1 0 5 0,6 0,41 0,2 0,2 0,59 7,1 5 0 0,6 0,41 0,2 0,2 0,59 7,1 8 0 0,6 0,5 0,2 0,2 0,51 8,1 0 0 0,5 0,25 0,3 0,2 0,65 7,1 2 0 0,5 0,31 0,2 0,2 0,69

Bảng 3.1. Công thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dưỡng của các khẩu phần th nghiệm ở gà giai đoạn 5-10 tuần tu i BL8 Thành phần % 55 Bắp vàng 15 Tấm Cám 4 Bánh dầu đậu nành Bột cá Bột lông sinh học Bột lông Meko Dicalci phosphate L-Lysine HCl DL-Methionine Muối ăn Premix vitamin Thành phần hóa học % và giá tr dinh dưỡng Vật chất khô Protein thô Béo thô Xơ thô Tro Canxi Photpho Lysine Methionine ME(Kcal/kg) 87,76 19,44 2,39 1,11 3,81 0,90 0,55 1,05 0,72 3085 87,36 20,63 2,29 1,02 4,60 0,88 0,52 1,06 0,78 3152 87,58 18,57 2,46 1,20 4,02 0,88 0,53 1,05 0,60 3088 87,47 19,58 2,37 1,11 4,31 0,89 0,53 1,06 0,69 3119 87,67 17,97 2,47 1,26 3,94 0,94 0,55 1,05 0,64 3074

hi ch : : p otein th : o th ; : th L : L ine et: ethionine : n n ượn t o đ i được t nh theo Jansen (1989) t ch dẫn từ NR (1994)

10

ĐC 66,5 11,5 0,3 BL8 66,5 11,5 0,3 BL2 66,5 11,5 0,3 BL5 66,5 11,5 0,3 BLMK5 66,5 11,5 0,3

8,8 6 5 0 0,5 0,45 0,3 0,2 0,45 100,0 11,8 6 2 0 0,5 0,36 0,3 0,2 0,54 100,0 12,8 7 0 0 0,5 0,3 0,35 0,2 0,55 100,0 5,8 6 8 0 0,5 0,54 0,2 0,2 0,46 100,0 8,8 6 0 5 0,5 0,46 0,3 0,2 0,44 100,0

87,47 17,61 2,29 1,03 3,33 0,80 0,47 0,97 0,68 3105 87,17 18,80 2,20 0,94 4,13 0,79 0,44 0,97 0,74 3171 87,49 16,10 2,38 1,17 3,46 0,87 0,48 0,97 0,65 3092 87,40 16,70 2,36 1,12 3,54 0,81 0,46 0,97 0,66 3106 87,28 17,75 2,28 1,03 3,84 0,80 0,45 0,97 0,75 3139

Bảng 3.2. Công thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dưỡng của các nghiệm thức th nghiệm ở gà giai đoạn 11-14 tuần tu i Thành phần % Bắp Tấm Cám Bánh dầu đậu nành Bột cá Bột lông sinh học Bột lông Meko Dicalci phosphate L-Lysine HCl DL-Methionine Muối ăn Premix vitamin T ng cộng Thành phần hóa học % và giá tr dinh dưỡng Vật chất khô Protein thô Béo thô Xơ thô Tro Canxi Photpho Lysine Methionine ME(Kcal/kg) hi ch : : p otein th : o th ; : th L : L ine et: ethionine : n n ượn t o đ i được t nh theo n en (19 9) t ch dẫn từ NR (1994) 3.5.2 Các ch tiêu theo dõi h tiêu inh t ư n Khối lượng, tăng trọng, tiêu tốn thức ăn bình quân, t số hiệu năng protein PER và hệ số chuy n hóa thức ăn FCR m i giai đoạn thí nghiệm.

11

Ch tiêu quày thịt Cuối giai đoạn th nghiệm, m i nghiệm thức chọn 4 gà 2 trống và 2 mái đ m khảo sát. Như vậy, số gà được m khảo sát là 20 con 5 nghiệm thức x 4 con . Xác đ nh các chỉ tiêu như khối lượng sống, sau khi cắt tiết, sau khi nh lông, thân th t, lòng, gan, mề, tim, ức, th t ức, đ i, th t đ i, dài ruột, dài manh tràng, góc ngực. Sau đó tiến hành cân và tính các t lệ như: t lệ nuôi sống ,….. 3.5.3 Ph n tích thống ê

Số liệu thô được x lý sơ bộ bằng chương trình Excel, sau đó tiến hành phân t ch phương sai bằng mô hình tuyến t nh t ng quát General Linear Model của chương trình Minitab 16.0, khi F t nh chỉ ra sự khác biệt thì tiến hành so sánh c p bằng phép th Tukey ở mức ý nghĩa 5%. Đối với các chỉ tiêu t nh t lệ quày th t, số liệu được chuy n sang

[1]

dạng Arcsin, trước khi tiến hành phân t ch thống kê. Mô hình phân t ch thống kê như sau: Yij = µ + Ti + eij Yij: Giá tr biến phụ thuộc thứ i của gà nuôi trong nghiệm thức T. µ: Trung bình quần th . Ti: Ảnh hưởng của nghiệm thức, i = 1-5; i=1= KPCS; i=2=TL2; i=3=TL3; i=4=TL8 và i=5= TLMeko5 TL: t lệ bột lông trong khẩu phần eij: Ảnh hưởng của yếu tố ngẫu nhiên Chƣơng IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng chất thải l ng gi s c, gi cầm tại Thành phố Cần Thơ, V nh Long và Đ ng Tháp

Cả ba đ a bàn có 148 cơ sở giết m gia súc gia cầm, trong đó 29 cơ sở giết m gia súc gia cầm ở thành phố Cần Thơ, 39 cơ sở giết m ở Vĩnh Long và 80 cơ sở giết m ở Đồng Tháp.

Hệ thống x lý chất thải của các cơ sở giết m được khảo sát tại thành phố Cần Thơ: có 14 cơ sở s dụng hầm và túi ủ biogas (48%); 10 cơ sở đưa nước có chứa cả lông thải ra ao lắng 35%); các cơ sở còn lại thải trực tiếp ra sông rạch 17%). Tương tự, Đồng Tháp có 3 cơ sở d ng hầm biogas 4% , 70 cơ sở có hầm x lý 88% và 7 cơ sở thải trực tiếp ra sông 8% . Hầu hết cơ sở giết m ở Vĩnh Long có hệ thống x lý nước

12

thải chưa hoàn chỉnh và chưa có hệ thống trữ lạnh, chỉ có một cơ sở giết m gia cầm lớn có x lý với hầm biogas.

Cách x lý chất thải lông gia súc, gia cầm tại các cơ sở giết m ở thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp rất khác nhau và chưa được đưa vào một hệ thống nhất đ nh. Trong đó, số cơ sở có lượng lông bán (23/148 chiếm 16%, số cơ sở có lượng lông d ng cho trồng cây (20/148 chiếm 14%, các cơ sở giết m còn lại có cách x lý lông thải bằng cách đốt, đ sông, rác chiếm 70%. Với công suất giết m 3289 gia súc và 18.590 gia cầm m i ngày ở 148 cơ sở giết m ở thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp sẽ tương ứng có hơn 1,6 tấn chất thải lông hàng ngày.

Tóm lại, chất thải lông được x lý tại các cơ sở giết m ở thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp chủ yếu bằng hình thức bán ho c đưa vào các bãi rác, đốt, tuôn xuống mương ho c sông ho c đưa vào vườn cây ăn trái. Qua điều tra cho thấy các cơ sở chưa có biện pháp x lý triệt đ nguồn chất thải lông gia súc, gia cầm bán ho c thải ra môi trường . Do đó, cần có các biện pháp x lý hiệu quả, giảm ô nhiễm môi trường. Tình hình trên cho thấy việc nghiên cứu phương pháp vi sinh vật đ x lý và tận dụng chất thải lông gia súc, lông gia cầm là cần thiết. 4.2 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi huẩn hiếu hí ph n giải er tin mạnh t chất thải chăn nu i và chế biến gi s c, gi cầm. 4.2.1 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số ch ng vi huẩn có hả năng ph n giải er tin c l ng gi cầm t chất thải chăn nu i và chế biến gi cầm. 4.2.1.1 Kết quả ph n lập

Kết quả phân lập được 115 chủng vi khuẩn t 14 mẫu đất, 14 mẫu nước, 14 mẫu lông thu thập ở các cơ sở giết m gia cầm ở Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Trong đó, 54 chủng vi khuẩn được phân lập t các mẫu đất chiếm 47%), 33 chủng vi khuẩn được phân lập t các mẫu lông chiếm 28,70% và 28 chủng vi khuẩn còn lại chiếm 24,30%) được phân lập t các mẫu nước. Các chủng vi khuẩn này được tạm đ t tên là Kx với K và x lần lượt là ký hiệu chủng vi khuẩn và số thứ tự chủng vi khuẩn được phân lập.

13

Khuẩn lạc của 115 chủng vi khuẩn phân giải keratin của lông gia cầm phân lập được có đường k nh thay đ i t 0,5 mm đến 6,0 mm và khá đa dạng về hình dạng, màu sắc, độ n i, dạng bìa, bề m t. Tuy nhiên, phần lớn khuẩn lạc có màu trắng đục, chiếm 43,48%. Đa số khuẩn lạc có dạng tròn, chiếm 77,39%. Về độ n i, khuẩn lạc xuất hiện 3 dạng độ n i và dạng mô là nhiều nhất với 63,48%. Các khuẩn lạc có 3 dạng bìa với dạng bìa nguyên chiếm phần lớn, 69,57%. Bề m t các khuẩn lạc có hai loại ướt và khô, đa số khuẩn lạc có bề m t ướt, chiếm 55,65%. Các khuẩn lạc được tách ròng bằng phương pháp cấy ria và trữ trong ống môi trường thạch nghiêng ở 4oC. 4.2.1.2 Hoạt tính enzyme er tin se c 115 ch ng VK ph n giải er tin l ng gi cầm

Chủng K73 cho hoạt t nh cao nhất là 139,45 U/mL và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với tất cả các chủng vi khuẩn khác. Chủng K60 có hoạt t nh thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và thấp hơn khoảng 93 lần so với chủng vi khuẩn cho hoạt t nh cao nhất là chủng K73 4.2.1.3. Tuyển chọn vi huẩn có hả năng ph n giải er tin c l ng gia cầm t chất thải chăn nu i và chế biến gi cầm

Khả năng phân hủy bột lông gia cầm th hiện ở khối lượng giảm đi của bột lông ở các nghiệm thức trước và sau khi nuôi cấy giảm t 20,87% đến 84,31%. Điều này chứng t một t lệ lớn bột lông gia cầm đã b phân hủy bởi các chủng vi khuẩn phân lập được và đã hòa tan vào dung d ch. Chủng K79 cho kết quả phân hủy tốt nhất trong số các chủng phân lập được với 84,31% lượng bột lông gia cầm b phân hủy sau một tuần nuôi lắc và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các chủng còn lại. T lệ phân hủy bột lông gia cầm thấp nhất là 20,87% ở chủng K56, nhưng vẫn cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê P<0,01 so với mẫu đối chứng.

Dựa vào kết quả phân hủy lông gia cầm, mười chủng vi khuẩn K14, K15, K26, K35, K67, K73, K79, K97, K100 và K108 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất trong số 115 chủng vi khuẩn được tuy n chọn đ đ nh danh dựa vào sự kết hợp giữa hai phương pháp truyền thống và hiện đại.

14 4.2.2. Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi huẩn có hả năng ph n giải er tin c l ng gi s c (l ng heo) t chất thải chăn nu i và chế biến gi s c 4.2.2.1. Kết quả ph n lập

Kết quả đã phân lập được 225 chủng vi khuẩn phân giải keratin của lông gia súc t 126 mẫu 42 mẫu đất, 42 mẫu nước, 42 mẫu lông gia súc được thu thập ở 42 cơ sở giết m gia súc, trang trại nuôi gia súc ở Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Trong đó, 108 chủng được phân lập t các mẫu đất chiếm 48% , 67 chủng được phân lập t các mẫu lông chiếm 29,78% và các chủng còn lại chiếm 22,22% được phân lập t các mẫu nước. Các chủng vi khuẩn phân lập được tạm đ t tên là Krx với Kr và x lần lượt là ký hiệu chủng vi khuẩn và số thứ tự chủng vi khuẩn được phân lập.

Đường k nh khuẩn lạc thay đ i t 0,5 mm đến 6,0 mm. Về màu sắc, các khuẩn lạc ở 225 chủng phân hủy lông gia súc đa dạng hơn khuẩn lạc của 115 chủng phân hủy lông gia cầm. Phần lớn các khuẩn lạc có dạng hình tròn (72,44%), bìa nguyên (63,56%), dạng mô 64,89% , màu trắng đục 43,11% và bề m t ướt 57,33%). 4.2.2.2. Kết quả iểm tr hoạt tính enzyme er tin se b ng cơ chất zo er tin c 225 ch ng VK ph n giải er tin c l ng heo

Tất cả d ch enzyme keratinase thô được tr ch t dung d ch nuôi các chủng vi khuẩn phân giải keratin lông heo phân lập được đều th hiện hoạt t nh keratinase với mức khác biệt khá lớn, t 1,00U/mL đến 121,74U/mL. Trong đó, các chủng vi khuẩn Kr209, Kr198, Kr165, Kr162, Kr120, Kr110, Kr105, Kr103, Kr42 có hoạt t nh keratinase cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các chủng vi khuẩn còn lại. Hoạt

t nh enzyme keratinase cao nhất ở chủng Kr110 (121,74U/mL). Một số nghiên cứu đã chứng minh vai trò của tế bào vi khuẩn trong việc phân giải cơ chất chứa keratin không kém phần quan trọng so với vai trò của enzyme keratinase. 4.2.2.3. Tuyển chọn vi huẩn có hả năng ph n giải er tin c l ng gia súc

Khả năng phân hủy bột lông gia súc của các chủng vi khuẩn th hiện ở khối lượng giảm đi của bột lông ở các nghiệm thức trước và sau

15 khi nuôi cấy giảm t 6,27% đến 63,38%. Chủng Kr110 cho kết quả phân hủy lông gia súc tốt nhất (63,38%) sau một tuần nuôi lắc và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. T lệ phân hủy lông gia súc thấp nhất là 6,27% ở chủng Kr137, nhưng vẫn cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với mẫu đối chứng 0,46%. Điều này chứng t một phần lớn lông gia súc đã b phân hủy bởi các chủng vi khuẩn bản đ a và đã hòa tan vào dung d ch.

Do sự phân giải cơ chất keratin được chia thành hai giai đoạn bao gồm giai đoạn: phá hủy cầu nối disulfite và phân giải chu i polypeptide, tế bào vi khuẩn phá hủy các cầu nối disulfite trong keratin lông gia cầm tốt hơn phá hủy các liên kết hydro trong keratin lông heo dẫn đến sự phân giải keratin ở lông heo không tốt bằng sự phân giải keratin ở lông gia cầm.

Dựa vào kết quả phân hủy lông gia súc của 225 chủng vi khuẩn bảng 4.12), ch n chủng vi khuẩn Kr198, Kr125, Kr116, Kr113, Kr110, Kr105, Kr98, Kr45 và Kr11 có khả năng phân hủy lông heo mạnh nhất được tuy n chọn đ đ nh danh dựa vào hai phương pháp truyền thống và hiện đại. 4.2.3. Kết quả ph n lập một số ch ng vi huẩn chịu nhiệt có hả năng ph n giải er tin

T 30 mẫu 23 mẫu đất và 7 mẫu nước được thu tại cơ sở giết m và trại chăn nuôi gia cầm ở Vĩnh Long, Đồng Tháp đã phân lập được 89 chủng vi khuẩn phát tri n được ở nhiệt độ 45oC (được đ t tên t V1 đến V18 và Vc1 đến Vc71). 4.2.3.1. Kết quả iểm tr hoạt tính enzyme er tin se c 89 ch ng VK chịu nhiệt ph n giải er tin Tất cả 89 chủng vi khuẩn ch u nhiệt phân giải keratin phân lập được đều cho phản ứng với cơ chất azokeratin. Tất cả d ch enzyme keratinase thô được tr ch t dung d ch nuôi 89 chủng vi khuẩn ch u nhiệt đều th hiện hoạt t nh keratinase với mức khác biệt khá lớn t 2,60U/mL đến 140,55U/mL. Trong đó, các chủng vi khuẩn Vc71, Vc55, Vc51, Vc49, Vc39, Vc7, V1, V2, V9 có hoạt t nh keratinase cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các chủng vi khuẩn còn lại.

Trong t ng số 89 chủng vi khuẩn ch u nhiệt phân lập được có 18 chủng chiếm 20,22% sinh trưởng được ở 50oC; 7 chủng chiếm 0,08%) sinh trưởng được ở 55oC là V1, V2, V9, V17, V18, Vc39, Vc71.

16 Khi nhiệt độ ủ tăng lên 60oC thì không có chủng vi khuẩn nào trong số các chủng phân lập được phát tri n trên môi trường nuôi cấy. 4.2.3.2.Kết quả ph n h y l ng gi cầm c 89 ch ng vi huẩn chịu nhiệt s u một tuần nu i lắc 45oC

Tiến hành khảo sát khả năng phân hủy lông gia cầm của 18 chủng

Chủng Vc39 và Vc71 cho khả năng phân hủy tốt nhất trong 89 chủng với 66,66% và 53,63% lượng bột lông b phân hủy sau một tuần nuôi lắc ở 45oC khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với các chủng còn lại. 4.2.3.3 Khảo sát hả năng ph n h y l ng gi cầm c 18 ch ng vi huẩn chịu nhiệt 50oC vi khuẩn ch u nhiệt có khả năng sinh trưởng ở 50oC. Chủng vi khuẩn Vc39 cho khả năng phân hủy tốt nhất trong 18 chủng VK ch u nhiệt với 63,66% lượng bột lông b phân hủy sau một tuần nuôi lắc ở 50oC. Kế đến là chủng vi khuẩn Vc71 có t lệ phân hủy lông gia cầm cũng tương đối cao là 50,63%. Chủng Vc15 có t lệ phân hủy lông gia cầm thấp nhất nhưng vẫn cao hơn nhiều lần so với mẫu đối chứng có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. 4.2.3.4 Khảo sát hả năng ph n h y l ng gi cầm c các ch ng vi huẩn chịu nhiệt 55oC Sau 7 ngày chủng và lắc ủ ở 55oC, chỉ còn 7 chủng vi khuẩn ch u nhiệt còn khả năng phát tri n và phân hủy lông gia cầm khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng. Bột lông gia cầm giảm t 26,75% đến 55,55 %. Hai chủng VK ch u nhiệt Vc39 và Vc71 vẫn chiếm ưu thế về khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh hơn so với các chủng còn lại, t lệ phân hủy lần lượt là 55,55% và 45,17%. Chủng VK Vc18 có kết quả phân hủy thấp nhất (26,75%) nhưng vẫn cao hơn rất nhiều lần so với mẫu đối chứng.

Dựa vào kết quả phân hủy lông gia cầm của các chủng vi khuẩn ch u nhiệt, cả 7 chủng vi khuẩn bản đ a V1, V2, V9, V17, V18, Vc39, Vc71 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất được đ nh danh dựa vào hai phương pháp truyền thống và hiện đại.

17 4.2.4. Kết quả định d nh 26 ch ng vi huẩn bản đị ph n giải er tin mạnh

Mười chủng vi khuẩn phân hủy lông gia cầm mạnh: K14, K15, K26, K35, K67, K73, K79, K97, K100 và K108, c ng với ch n chủng vi khuẩn phân hủy lông heo mạnh: Kr198, Kr125, Kr116, Kr113, Kr110, Kr105, Kr98, Kr45, Kr11 và bảy chủng vi khuẩn ch u nhiệt phân giải keratin mạnh: V1, V2, V9, V17, V18, Vc39, Vc71 được đ nh danh bằng cách kết hợp phương pháp truyền thống theo hệ thống phân loại Bergey và phương pháp hiện đại dựa vào trình tự đoạn gen 16S rRNA.

Dựa vào đ c đi m 26 chủng VK được tuy n chọn và 35 nhóm vi khuẩn trong hệ thống phân loại Bergey, nhóm 18 ph hợp cho 19 chủng VK: K15, K26, K35, K73, K79, K100, Kr11, Kr45, Kr110, Kr113, Kr116, Kr125, V1, V2, V9, V17, V18, Vc39, Vc71 là nhóm vi khuẩn gram dương có bào t . Năm chủng VK K14, K97, Kr98, Kr105, K108 có đ c đi m chung thuộc nhóm 4 Nhóm vi khuẩn hình que ho c hình cầu vi hiếu khí ho c hiếu kh gram âm . Trong khi 2 chủng K67 và Kr198 có đ c đi m chung của vi khuẩn nhóm 5 Nhóm vi khuẩn hình que gram âm k kh không bắt buộc là hình que, gram âm, không hình thành bào t .

Khuẩn lạc chủng Kr198 có màu đ rất giống màu đ của một số khuẩn lạc chi Serratia, chủng K67 âm t nh với phản ứng oxydase và dương t nh với phản ứng catalase ph hợp với họ Enterobacteriacea.

Bên cạnh đó, tất cả 26 chủng vi khuẩn tuy n chọn đều cho kết quả PCR dương t nh với c p mồi 8F và 1391R, điều này càng làm rõ đ c đi m những chủng vi khuẩn phân giải keratin. Hơn nữa, kết quả giải trình tự v ng gen 16S rRNA của 26 chủng vi khuẩn đều cho t n hiệu tốt với số nucleotide lớn hơn 700bp. Tất cả các trình tự 16S rRNA của 26 chủng vi khuẩn đã được phân t ch và so sánh với các trình tự đã công bố trên genBank NCBI bằng công cụ BLAST. Kết quả phân t ch được so sánh với nhau và xây dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền của 26 chủng vi khuẩn được phân lập.

Dựa vào kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của 26 chủng vi khuẩn được tuy n chọn với trình tự của các chủng vi khuẩn khác ở genBANK NCBI cho thấy cả 26 chủng VK thuộc các chi: chi chi Bacillus, Stenotrophomonas, Pseudomonas, chi chi

18 Ch ng đại diện loài có qu n hệ gần

Nhóm VK

Mã số

Bacillus subtilis strain BE-91 Brevibacillus parabrevis strain DMB24 Brevibacillus borstelensis strain UTM105 Bacillus tequilensis strain Cs.10-4.1.9 Bacillus megaterium strain BD18C2 Brevibacillus brevis strain DMB23 Bacillus flexus strain PJS5 Bacillus megaterium strain AIMST 3.Ei.1 Brevibacillus parabrevis strain AB1 Bacillus pumilus strain P130 Bacillus subtilis strain SH23 Bacillus acidicola strain GE17-6 Bacillus megaterium Bacillus sp. P014 Bacillus sporothermodurans strain TCA20028 Brevibacillus brevis strain DZBY14 Bacillus cereus strain KR9 Bacillus megaterium strain I24 Bacillus subtilis strain JN005

GO845009 KT274769.1 KF952566.1 AB986572.1 HE610816.1 KT274768.1 KT226113.1 HQ670528.1 KF155293.1 HM152736 KP735610.1 KF030790.1 GU257960 KC357566.1 KC462525.1 KM191290.1 KX082775.1 KR150755.1 KU302780.1

Chryseobacterium, chi Enterobacteriaceae, chi Achromobacter và chi Serratia Bảng 4.1 . Kết quả này cũng ph hợp với kết quả đ nh danh theo phương pháp Bergey. Bảng 4.1 Kết quả mối tương quan di truyền 26 chủng vi khuẩn phân giải keratin đạt hiệu quả cao với các chủng vi khuẩn có trong genBank (NCBI) Tỷ lệ tƣơng đ ng (%) 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

Bacilli K15 K26 K35 K73 K79 K100 Kr11 Kr45 Kr110 Kr113 Kr116 Kr125 V1 V2 V9 V17 V18 Vc39 Vc71 Flavobacteria

JF894157.1

Chryseobacterium indologenes strain McR-1 Chryseobacterium aquifrigidense strain R-21

KP893287.1

98 99

K14 Kr98 Betaproteobacteria

KT716268.1

K97

Achromobacter mucicolens strain OZK37

Gammaproteobacteria K67 K108 Kr105 Kr198

Enterobacteriaceae bacterium strain MB6-2 EF581856.2 FJ788425.1 Pseudomonas putida Rs-198 KU510059.1 Stenotrophomonas maltophilia strain ST2 KC335216.1 Serratia marcescens strain PPM4

99 99 99 99

Kết quả cho thấy 26 chủng vi khuẩn phân giải keratin tốt trong nghiên cứu này có sự đa dạng về loài, các chủng vi khuẩn thuộc 4 nhóm

19 khác nhau, phần lớn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương chiếm ưu thế với 73,08% nhóm Bacilli, trong khi vi khuẩn Gram âm chiếm 26,92% bao gồm 3 nhóm Betaproteobacteria (3,85%) Gammaproteobacteria (15,38%) và Flavobacteria (7,69%)

Trong 26 chủng VK được tuy n chọn và đ nh danh, chủng Bacillus megaterium K79 phân hủy lông gia cầm mạnh nhất và chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 phân hủy lông gia súc tốt nhất được chọn đ khảo sát ảnh hưởng các điều kiện môi trường nuôi cấy. 4.3. Nội dung 3: Kết quả ảnh hƣ ng c các điều iện m i trƣờng nu i cấy đến sự phát triển và hả năng ph n h y er tin c một số ch ng vi huẩn 4.3.1. Kết quả hảo sát ảnh hƣ ng c nhiệt độ và pH đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng c 2 ch ng vi huẩn ph n giải er tin mạnh nhất Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110

Kết quả th nghiệm cho thấy cả 2 chủng vi khuẩn K79 và Kr110 đều có sự tương tác giữa hai nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng như hàm lượng protein hòa tan. pH8 và nhiệt độ 35oC là điều kiện th ch hợp cho hoạt động phân hủy keratin và được s dụng cho các th nghiệm tiếp theo của chủng Bacillus megaterium K79 và chủng Brevibacillus parabrevis Kr110. Cả hai chủng vi khuẩn này đều có khả năng phân giải keratin ở nhiệt độ cao 45°C , đ c t nh ch u nhiệt độ cao của hai chủng vi khuẩn này rất có ý nghĩa trong x lý chất thải lông thực tiễn. 4.3.2. Kết quả hảo sát ảnh hƣ ng c n ng độ dịch vi huẩn đƣ vào đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng c ch ng vi huẩn Bacillus megaterium K79 và ch ng vi huẩn Brevibacillus parabrevis Kr110

, )

à v ) l

7 0 1 x , l

)

7 0 1 x , l

)

(

m / g  ( n

m U F C

( n ẩ u h

y h n h p ệ l

i v

i e t o r p g n ợ ƣ

i v

i e t o r p g n ợ ƣ

ỷ T

l

ỷ T

l

m à H

ố s t ậ M

N ng độ dịch vi huẩn đƣa vào

N ng độ dịch vi huẩn đƣ vào

Hình 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn Kr110 đưa vào đến hiệu suất phân hủy bột lông heo và hàm lượng protein

Hình 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn K79 đưa vào đến hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm và hàm lượng protein

20 , )

à v ) l

7 0 1 x , l

)

7 0 1 x , l

)

(

m / g  ( n

m U F C

m / g  ( n

m U F C

( n ẩ u h

y h n h p ệ l

( n ẩ u h

i v

y h n h p ệ l

i e t o r p g n ợ ƣ

ỷ T

i v

l

i e t o r p g n ợ ƣ

ỷ T

l

m à H

ố s t ậ M

m à H

ố s t ậ M

Qua kết quả th nghiệm ở hình 4.1 và hình 4.2, nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào 10% được chọn s dụng cho các th nghiệm kế tiếp cho cả 2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 4.3.3. Kết quả hảo sát ảnh hƣ ng c ngu n dinh dƣỡng chứ c rbon đến sự phát triển và hả năng ph n h y l ng c ch ng vi huẩn Bacillus megaterium K79 và ch ng vi huẩn Brevibacillus parabrevis Kr110

Ngu n dinh dƣỡng chứ c rbon

Hình 4.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon khả năng phân hủy bột lông gia cầm và hàm lượng protein chủng K79

Hình 4.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến khả năng phân hủy bột lông heo và hàm lượng protein chủng Kr110

Kết quả th nghiệm(Hình 4.3 và Hình 4.4): chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 có sự phát tri n, khả năng phân hủy lông và tạo protein hòa tan cao nhất khi chỉ có bột lông là nguồn carbon duy nhất. 4.3.4. Ảnh hƣ ng c ngu n dinh dƣỡng chứ nitơ đến sự phát triển, khả năng ph n h y l ng và hàm lƣợng protein h t n c ch ng vi huẩn Bacillus megaterium K79 và ch ng vi huẩn Brevibacillus parabrevis Kr110

, )

à v ) l

7 0 1 x , l

)

7 0 1 x , l

)

(

m / g  ( n

m U F C

( n ẩ u h

y h n h p ệ l

i v

i e t o r p g n ợ ƣ

ỷ T

l

m à H

ố s t ậ M

Ngu n dinh dƣỡng chứ nitơ

Hình 4.5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ khả năng phân hủy bột lông gia cầm và hàm lượng protein hòa tan chủng K79

Ngu n dinh dƣỡng chứ nitơ Hình 4.6. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến khả năng phân hủy bột lông heo và hàm lượng protein hòa tan chủng Kr110

21

Kết quả th nghiệm (Hình 4.5 và Hình 4.6): chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 đều cho khả năng phân hủy bột lông cao nhất khi môi trường chỉ có bột lông là nguồn dinh dưỡng duy nhất. 4.3.5. Sự ph n h y sợi l ng nguyên c 2 ch ng vi huẩn Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 theo thời gi n 4.3.5.1 Sự ph n h y sợi l ng gi cầm nguyên c ch ng vi huẩn Bacillus megaterium K79 theo thời gi n

Sau 10 tuần lắc ủ vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy với các điều kiện thích hợp nhất đã được chọn thì sợi lông gà nguyên đã b phân hủy hoàn toàn (100%) với mật số vi khuẩn 271,5x107 CFU/mL và hàm lượng protein hòa tan 28,15g/mL (Hình 4.7)

A

B

Hình 4.7. Sợi lông gà nguyên sau 10 tuần ở 2 nghiệm thức

A: chủng K79 được đưa vào B: đối chứng : không chủng vi khuẩn (N à chụp 01/09/2015) 4.3.5.2. Sự ph n h y sợi l ng gi s c nguyên c vi huẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 theo thời gi n

Ở tuần thứ 10, sợi lông heo phân hủy 38,5% và hàm lượng protein hòa tan là 8,15g/mL. Mật số vi khuẩn ở thời đi m này là 16,7×107 CFU/mL.

22 4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng ch ng vi huẩn ph n h y mạnh l ng gi cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến l ng gi cầm thành thức ăn b sung protein cho gà thả vƣờn. 4.4.1. Sử dụng ch ng Bacillus megaterium K79 để l ng gi cầm thành thức ăn b sung protein cho gà t thả vƣờn

Sau 10 tuần ủ 21 kg lông gia cầm với chủng Bacillus megaterium

ủ với Bacillus megaterium K79

K79 đã thu được 21 kg bột lông sinh học đ tiến hành nuôi gà th nghiệm. Kết quả ki m tra là không có Salmonella, Coliforms và E.coli trong bột lông sinh học .

Hình 4.9 . Bột lông sinh học

Hình 4.8. Lông gia cầm Bột lông sinh học BLSH có hàm lượng vật chất khô tương đối thấp 85,27% so với bột lông vũ Meko 91% , Hàm lượng protein của BLSH là 79,71%, cao hơn so với bột lông Meko là 77,01%. So với bột lông Meko, hầu hết các acid amin thiết yếu có trong BLSH đều cao hơn bột lông Meko như là: lysine, threonine, phenylalanine, valine, histidine, agrinine và glycine. Kết quả th nghiệm cũng cho thấy BLSH có t lệ tiêu hoá protein in vitro là 93,01% cao hơn so với t lệ tiêu hóa protein in vitro 68,75% của bột lông gia cầm Meko.

Như vậy, t lệ tiêu hóa in vitro protein của BLSH rất cao 93,01% cho thấy hiệu quả t ch cực của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 trong việc x lý và tận dụng chất thải lông. 4.4.2. Kết quả thí nghiệm nu i gà 4.4.2.1 Khối lƣợng và tăng trọng gà l c 10 và 14 tuần tu i.

Thức ăn th nghiệm có ảnh hưởng lên khối lượng gà lúc 10 và 14 tuần tu i giữa các nghiệm thức th nghiệm P<0,05 . Gà nuôi khẩu phần không b sung bột lông (ĐC có khối lượng cao nhất lúc 10 và 14 tuần tu i lần lượt là 807,2 g và 1299,4g và thấp nhất là ở khẩu phần b sung

23 bột lông Meko và BL8, trong khi nhóm b sung mức độ 2 và 5% BLSH thì khác biệt không có ý nghĩa so với NT đối chứng theo phép th Tukey.

Do có khác biệt về khối lượng nên tăng trọng của gà qua các giai đoạn 5 – 10, 10 – 14 và toàn kỳ th nghiệm 5 - 14 tuần tu i, cũng khác biệt có ý nghĩa P<0,05 , cao nhất là gà nuôi khẩu phần đối chứng và thấp nhất ở khẩu phần b sung 5% BL Meko. Trong khi NT BL2 và NT BL5 thì khác biệt không có ý nghĩa so với NT đối chứng. 4.4.2.2. Ảnh hƣ ng thức ăn thí nghiệm lên tiêu tốn thức ăn và hệ số chuyển hó thức ăn c Gà T G C ng

Tuy mức tiêu thụ thức ăn của gà ở các nghiệm thức không khác biệt về m t thống kê ở các giai đoạn 5-10, 11-14 tuần tu i và toàn kỳ nhưng ở các giai đoạn này bột lông th nghiệm có ảnh hưởng đến hệ số chuy n hóa thức ăn. Do có sự khác biệt có ý nghĩa về tăng trọng nên gà nuôi khẩu phần ĐC vẫn có FCR thấp nhất qua các giai đoạn 5 – 10 (4,11) và 11-14 tuần tu i 3,51 và toàn kỳ 3,73 , trong khi ở NT BLMK5 luôn cao hơn lần lượt là 4,9; 4,37 và 4,5. Tuy nhiên, theo phép so sánh c p của Tukey, gà nuôi các khẩu phần có b sung BLSH 2% NT BL2 và 5% NT BL5 trong khẩu phần có HSCHTĂ không khác biệt so với NTĐC.

Như vậy, với mức b sung 5% bột lông sinh học vào khẩu phần đã đáp ứng tốt được về tiêu tốn thức ăn và hệ số chuy n hóa thức ăn của gà thả vườn. 4.4.2.3. Lƣợng dƣỡng chất tiêu thụ c gà t G C ng

Kết quả th nghiệm cho thấy t số hiệu năng protein PER của gà ở 2 giai đoạn 5 – 10 và 11-14 tuần tu i giữa các NT khác biệt có ý nghĩa P<0,01 , PER của gà cao nhất ở ĐC 1,36 và 1,77 , thấp nhất ở BL8 1,03 và 1,30 và BLMK5 1,06; 1,34 , riêng PER của gà ở NT BL2 1,27 và 1,59 , BL5 1,22 và 1,53 sai khác không ý nghĩa thống kê so với ĐC trong phép th Tukey.

PER là một chỉ số d ng đ đánh giá chất lượng của một loại protein thức ăn, là hệ số giữa tăng trọng và protein ăn vào, hệ số này cao chứng t vật nuôi tăng trưởng tốt.

Ở giai đoạn 5 – 10 tuần tu i, các t lệ b sung bột lông trong khẩu phần không ảnh hưởng lên lượng vật chất khô và năng lượng ăn vào

24 P>0,05 . Tuy nhiên, do t lệ bột lông thay đ i theo khẩu phần nên mức tiêu thụ protein của gà có khác nhau giữa các NT th nghiệm, số lượng protein ăn vào tăng theo t lệ tăng bột lông trong khẩu phần P<0,05 . NT BL8 có mức tiêu thụ protein cao nhất 10,53 g/con/ngày .

Ở giai đoạn 11-14 tuần tu i, m c d cả 5 nghiệm thức đều có mức tiêu thụ vật chất khô tương đương nhau P>0,05 , nhưng mức năng lượng trao đ i ăn vào và protein thô ăn vào khác biệt có ý nghĩa thống kê P<0,05 là do gà nuôi khẩu phần có bột lông tiêu thụ nhiều thức ăn hơn NTĐC.

Tuy mức protein tiêu thụ như nhau nhưng gà ở nuôi NT BL5 có mức tăng trọng tốt hơn mức tăng trọng của gà ở nghiệm thức BLMK5. Điều này có th giải th ch là bột lông sinh học có t lệ tiêu hóa protein in vitro cao hơn và đã được Bacillus megaterium K79 phân giải các cầu nối disulfit biến lông gia cầm thành bột lông sinh học chứa có giá tr dinh dưỡng cao hơn.

Như vậy, khi b sung bột lông sinh học ở mức 5% đã làm gà sinh trưởng tốt nhờ gà tiêu thụ hiệu quả các dưỡng chất trong bột lông sinh học. 4.4.2.4. T lệ nu i sống

Tỉ lệ nuôi sống là chỉ tiêu đánh giá sức đề kháng của gà và còn ảnh hưởng nhiều đến kết quả chăn nuôi. Gà ta Gò Công là giống gà đ a phương nên dễ th ch nghi với điều kiện kh hậu nước ta, dễ nuôi và có sức sống cao. Th nghiệm được tiến hành theo quy trình chăn nuôi an toàn sinh học, gà được tiêm phòng vaccine phòng bệnh nên t lệ nuôi sống đạt rất cao. T lệ nuôi sống cả 5 nghiệm thức đều đạt 100%. Trong quá trình th nghiệm gà có mắc bệnh cầu tr ng, nhưng được phát hiện và điều tr k p thời nên không ảnh hưởng đến tỉ lệ nuôi sống. Kết quả về t lệ nuôi sống Gà Ta Gò Công đạt 100%, như vậy bột lông sinh học đã không ảnh hưởng âm t nh, đàn gà th nghiệm phát tri n tốt cho năng suất thân th t tốt. 4.4.2.5. Ảnh hƣ ng c thức ăn thí nghiệm lên các ch tiêu th n thịt các nghiệm thức

Gà nuôi khẩu phần có b sung bột lông cho t lệ lông cao hơn NT ĐC P= 0,01 , nhìn chung gà phát tri n lông nhiều hơn so với NT ĐC, t lệ lông cao nhất ở gà nghiệm thức BL5 và BL8, đây cũng là một yếu tố

25 hấp dẫn người mua với những con gà có bộ lông đẹp. Như vậy, khi b sung 5% bột lông sinh học vào khẩu phần đã giúp gà đảm bảo tốt tăng trưởng giúp gà mọc lông nhanh và tốt.

B sung BLSH vào khẩu phần đã ảnh hưởng đến t lệ móc lòng, t lệ th t đ i và th t ức P<0,05 . Gà nuôi khẩu phần BL5 có t lệ ức và th t ức, đ i và th t đ i cao nhất, kế đến là BL2 và NTĐC, các t lệ này thấp nhất ở NTBL8 và BLMK. Thành phần của nội quan như khối lượng tim, gan, mề và lòng không ch u tác động của thức ăn b sung. Dài ruột và manh tràng của gà tương đương nhau giữa các nghiệm thức vì bột lông là loại thức ăn b sung protein nên không ảnh hưởng lên sự phát tri n của manh tràng. Gà nuôi khẩu phần BL5 có sâu ức rộng hơn, đây là kết quả của việc tăng khối lượng ức so các NT khác. Dài ức, t lệ ức và th t ức của gà nuôi NTĐC, BL2 và BL5 tương đương nhau và dài hơn gà NTBL8 và BLMK.

Như vậy, trong th nghiệm này nghiệm thức BLSH 5% t ra ưu thế khi d ng b sung 5% bột lông sinh học trong khẩu phần kết quả tăng trưởng và các chỉ tiêu thân th t đạt chất lượng tốt.

Hình 4.10. Gà th nghiệm nghiệm thức BL5 lúc 14 tuần tu i (N à chụp 06/03/2016)

26

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

Đề tài đã phân lập được 429 vi khuẩn hiếu kh bản đ a. Trong đó 115 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia cầm, 225 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc và 89 chủng vi khuẩn ch u nhiệt. Hai mươi sáu chủng vi khuẩn được tuy n chọn và đ nh danh (73,08% thuộc lớp Bacilli, 3,85% thuộc lớp Betaproteobacteria, 7,69% thuộc lớp Flavobacteria, 15,38% thuộc lớp Gammaproteobacteria .

Chủng Bacillus megaterium K79 có khả năng phân hủy lông gia cầm tốt nhất và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 phân hủy lông gia súc tốt nhất, cả 2 chủng đều phát tri n thuận lợi và phân hủy lông mạnh nhất ở 35oC và pH=8 với nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào 10% trong môi trường chứa bột lông như nguồn carbon và nitơ tốt nhất. Bacillus megaterium K79 phân hủy 100% sợi lông gia cầm nguyên trong 10 tuần. Brevibacillus parabrevis Kr110 phân hủy 38,5% sợi lông heo nguyên trong 10 tuần.

Bột lông sinh học tạo t lông gia cầm ủ với Bacillus megaterium K79) đạt mức an toàn vi sinh, có th b sung vào khẩu phần nuôi gà ta Gò Công thả vườn ở mức 5% đã giúp gà có sức sinh trưởng tốt, t số hiệu năng protein cao, t lệ nuôi sống cao, đạt các chỉ tiêu thân th t tốt (tương đương với nghiệm thức đối chứng , có th s dụng cung cấp đạm cho vật nuôi.

T đó cho thấy Bacillus megaterium K79 là chủng vi khuẩn có ch v a an toàn cho vật nuôi v a giúp x lý được chất thải lông gia cầm thành bột lông sinh học thân thiện cung cấp đạm cho vật nuôi. 5.2. ĐỀ NGHỊ

- Tiếp tục nghiên cứu, th nghiệm thêm về cách chế biến đ sản xuất bột lông sinh học đáp ứng được yêu cầu th trường cho ứng dụng làm phân bón và thức ăn chăn nuôi t nguồn lông gia súc, gia cầm phế thải. - Tiếp tục nghiên cứu th nghiệm bột lông sinh học nuôi heo, trâu bò, cá. - Tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học vi sinh t chủng Bacillus megaterium K79 và chủng Brevibacillus parabrevis K110 đ x lý và tận dụng chất thải lông t ngành chăn nuôi.