Phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm của một số chủng vi khuẩn nốt sần ở rễ cây đậu phộng (arachis hypogaea. l)

Chia sẻ: Hân Hân | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

112
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiệm thức sử dụng vi khuẩn nhiễm hạt trước khi gieo đều có số lượng và khối lượng nốt sần, trọng lượng 100 hạt, chiều cao cây và trọng lượng tươi, phần trăm của đạm tổng số của cây được chủng cao hơn một cách rõ rệt so với đối chứng. Kết quả là tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn nốt sần cộng sinh có khả năng cố định đạm cao góp phần nâng cao năng suất cây trồng và giảm chi phí sản xuất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm của một số chủng vi khuẩn nốt sần ở rễ cây đậu phộng (arachis hypogaea. l)

Kỷ yếu kỷ niệm 35 năm thành lập Trường ĐH ng nghiệp Th c ph m T h Minh 98 -2017) PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN NỐT SẦN Ở RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA. L) Trần Ánh Nguyệt1, *, Trần Minh Trí1, Hà Thanh Đạt1, Trần Thu Thảo1, Hồ Viết Thế2 Viện Lúa Đ ng Bằng S ng ửu Long 1 Trường Đại học ng nghiệp Th c ph m Thành phố 2 h Minh * Email: lightmoon98@gmail.com TÓM TẮT Vi khuẩn nốt sần được phân lập từ rễ cây đậu phộng (Arachis hypogaea. L) thông qua việc định danh về đặc điểm, hình thái, sinh lý, sinh hóa thì chỉ có hai chủng đạt yêu cầu. Vi khuẩn phân lập được phát triển tốt trên môi trường YEMA, gram âm, hình que, hiếu khí, có khả năng di động, không bắt màu trên môi trường có bổ sung Congo red, không phát triển trên môi trường Glucose-Peptone-Agar, có khả năng chịu được nồng độ muối 2% và phát triển rất tốt trên môi trường kiềm pH từ 7-10. Về khả năng tạo gum (polysaccharide được chiết xuất từ vỏ màng của tế bào vi khuẩn) cả hai đều tạo gum cao 0,91 mg và 0,89 mg. Hai chủng vi khuẩn cho khả năng cố định đạm cao thông qua phân tích khả năng hình thành nốt sần và đạm tổng số của thí nghiệm trong nhà lưới. Nghiệm thức sử dụng vi khuẩn nhiễm hạt trước khi gieo đều có số lượng và khối lượng nốt sần, trọng lượng 100 hạt, chiều cao cây và trọng lượng tươi, phần trăm của đạm tổng số của cây được chủng cao hơn một cách rõ rệt so với đối chứng. Kết quả là tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn nốt sần cộng sinh có khả năng cố định đạm cao góp phần nâng cao năng suất cây trồng và giảm chi phí sản xuất. Từ khóa: vi khuẩn nốt sần, đậu phộng, YEMA. 1. GIỚI THIỆU Đậu phộng (Arachis hypogaea. L) là cây thực phẩm, cây công nghiệp ngắn ngày dùng để lấy dầu trong nhóm cây trồng cạn. Nó được biết đến mang lại nhiều nguồn lợi về kinh tế, dinh dưỡng, đồng thời cũng là cây cải thiện môi trường nhờ vào khả năng cộng sinh với các vi khuẩn cố định đạm. Mặc dù, diện tích trồng và sản lượng thu được từ cây đậu phộng ít hơn lúa và cây đậu nành nhưng để đưa vào cơ cấu chuyển dịch luân canh nhằm giảm áp lực sản xuất cây lúa liên tục 3 vụ như hiện nay bồi dưỡng đất giúp cải thiện độ phì nhiêu, cắt đứt nguồn lây lan dịch bệnh của cây lúa. Mặt khác, những vùng đất không có khả năng canh tác lúa thì việc nghiên cứu nâng cao diện tích canh tác cây trồng cạn nói chung và cây đậu phộng nói riêng cũng là điều cần thiết trong tình hình sản xuất nông nghiệp như hiện nay. Sử dụng phân bón sinh học là một trong những biện pháp cũng góp phần nâng cao năng suất, phẩm chất cây trồng. Mục đích khảo sát đánh giá, khắc phục những tác hại do lạm dụng quá nhiều phân đạm hóa học thì việc sử dụng phân bón sinh học có chứa các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí, cân bằng hệ sinh thái nhưng vẫn đảm bảo góp phần vào việc gia tăng năng suất, chất lượng nông sản và đồng thời góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và ổn định. Hiện nay vi khuẩn cố định đạm trên rễ cây họ đậu như đậu nành, đậu xanh, bắp đã được phát triển và áp dụng. Bên cạnh đó cũng có những chủng vi khuẩn cố định đạm khác như: vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv, 1990; Somers ctv, 2005; Dậu và ctv, 2007). Một số chế phẩm vi khuẩn nốt sần được sử dụng cho cây họ đậu để 38 hân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm của một số chủng vi khu n nốt sần ở... tăng cường khả năng cố định đạm đã được tập trung nghiên cứu nhiều trên cây đậu nành, bắp (Sơn và ctv, 2006). Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng của vi khuẩn cố định đạm trên cây đậu phộng. Chính vì những lý do trên mục tiêu của nghiên cứu này là bước đầu phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm một số chủng vi khuẩn nốt sần ở rễ cây đậu phộng nhằm tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm làm nguồn nguyên liệu cho việc tạo ra phân đạm sinh học, giúp bảo vệ môi trường và góp phần bảo đảm cho sự phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Vật liệu nghiên cứu sử dụng trong đề tài là các chủng (nòi 1-6) vi khuẩn nốt sần được phân lập từ rễ cây đậu phộng OMĐP13 ở giai đoạn 50 ngày tuổi. Ngoài ra, còn có sử dụng 6 giống đậu phộng (OMĐP1, OMĐP13, OMĐP15, OMĐP16, OMĐP18, OMĐP23). Các thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, sử dụng các trang thiết bị, hóa chất, giống đậu phộng của bộ môn Di Truyền và Chọn Giống-Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm hoàn thiện quy trình phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của rễ cây đậu phộng đã được trồng 50 ngày, tiến hành phân lập trên môi trường YEMA, làm thuần, quan sát hình dạng, thử nghiệm sinh hóa, kiểm tra sự hình thành nốt sần trong nhà lưới, xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn với cây đậu phộng, đánh giá hiệu quả cố định đạm. 2.2.1. Chu n bị m i trường phân lập, quan sát hình dạng, định danh, thử nghiệm sinh hóa Trong các thí nghiệm chúng tôi thử nghiệm các môi trường YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) dùng để phân lập vi khuẩn (Fred và ctv, 1932), YEMA cũng sử dụng môi trường trên thạch đứng để quan sát khả năng tăng trưởng yếm hay kỵ khí, hoặc bổ sung sung từ 0 đến 4% muối NaCl thử nghiệm khả năng tăng trưởng. Môi trường chọn lọc cho vi khuẩn nốt sần như: YEMA có bổ sung Congo red (Hahn và ctv, 1966), và môi trường (GPA) glucose-peptone-agar (Kleczkowska và ctv, 1968). Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng có chứa 0,2% tinh bột (Xu và ctv,1995) và môi trường Hofer đánh giá sự tăng trưởng trên môi trường có pH = 4-12 (Hofer và ctv, 1935). Đối với các thí nghiệm tăng trưởng trên môi trường YEMA có bổ sung 0-4% muối và môi trường kiềm Hofer có pH = 4-12, mỗi nghiệm thức lập lại 3 ống, mỗi thí nghiệm lập lại hai lần độc lập. 2.2.2. Thu mẫu và các bước phân lập vi khu n cố định đạm Đào nhẹ nhàng rễ giống cây đậu phộng OMĐP13 được 50 ngày tuổi và chọn rễ có chứa nốt sần có màu hồng, khỏe mạnh. Dùng kéo cắt nốt sần từ khối u, sau đó đem đi khử trùng bề mặt của nốt sần bằng dung dịch CaOCl2 (4%) trong 3 phút. Tiếp theo các nốt sần được rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng mục đích là để loại bỏ CaOCl2 còn bám trên bề mặt. Sau đó đặt chúng vào dung dịch cồn 70% trong vòng 3 phút, tiếp tục lặp lại các bước rữa với nước cất vô trùng. Lần lượt các nốt sần sạch được nghiền trong eppendort có chứa nước cất vô trùng tạo thành dịch huyền phù. Dung dịch huyền phù trên được pha loãng theo bậc 10 và nồng độ từ 10-2 đến 10-6 được cấy vào 3 đĩa petri môi trường YEMA. Các đĩa sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ phòng từ 2-3 ngày, quan sát thấy khuẩn lạc mọc ghi nhận kết quả và tiếp tục cấy chuyền và làm thuần. 2.2.3. ác phương pháp sử dụng để phân biệt, định danh và quan sát s tăng trưởng Các phương pháp được dùng để phân biệt, quan sát các đặc điểm nuôi cấy và các hình thái của vi khuẩn cố định đạm như nhuộm Gram (Vincent và ctv, 1970) và quan sát gram, hình dạng dưới kính hiển vi, cũng như khả năng tăng trưởng trên môi trường thạch đứng. Khảo sát sự tăng trưởng trên môi trường có bổ sung glucose, manitol và laclose. 2.2.4. S sản xuất gum Chuẩn bị môi trường YEMA lỏng, sau đó cho vào bình arlen mỗi arlen tương ứng 100 mL môi trường. Trước đó đã chuẩn bị môi trường nhân sinh khối của vi khuẩn như sau: Cho 10 mL môi trường 39 Trần Thị nh Ngu ệt, Trần Minh Tr , à Thanh Đạt, Trần Thu Thảo, Viết Thế YEMA lỏng vào 2 ống nghiệm tương ứng hai nòi, cấy vi khuẩn vào để qua đêm lắc trong 24h ở nhiệt độ phòng. Sau đó hút 1mL dung dịch vi khuẩn cho vào arlen tương ứng đã chuẩn bị trước còn lại đối chứng. Ủ liên tục 15 ngày trên máy lắc. Kế tiếp cho 250 µl cồn 95% và 100 mL aceton vào để yên trong 24 h, tránh sự di chuyển. Tiếp tục lọc dung dịch bằng giấy lọc, sau đó sấy khô ở 37 ºC từ 2-3 ngày. Quan sát, cân số lượng gum được tạo ra của chủng vi khuẩn và ghi nhận kết quả. 2.2.5. Thử nghiệm catalase bằng phản ứng với oxi già 3%) Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi của vi khuẩn phân lập được. Chuẩn bị thành phần môi trường YEMA có bổ sung Congo red. Cấy mỗi chủng vi khuẩn đã phân lập vào 3 đĩa môi trường YEMA, ủ từ 2-3 ngày nuôi cấy. Khi khuẩn lạc đã mọc hoàn chỉnh, thử với H2O2 (3%), quan sát và ghi nhận có sự sủi bọt hay không sủi bọt của 3 khuẩn lạc trên 3 đĩa môi trường lập lại của từng dòng vi khuẩn. 2.2.6. S phân hủ m i trường tinh bột theo Xu và ctv 995) Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng có chứa 0,2% tinh bột, thành phần 1l môi trường như sau: Peptone (5 g), Yeast extract (3 g), NaCl (5,0 g), bột gạo (2 g), agar (15 g). Cấy lần lượt mỗi chủng vi khuẩn vào 3 đĩa petri môi trường, ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 ngày. Sau đó nhỏ dung dịch nhuộm gram Iod vào 3 khuẩn lạc/mỗi đĩa petri. Quan sát, đánh giá sự hiện diện quầng sáng xung quanh khuẩn lạc. 2.2.7. Kiểm tra s hình thành nốt sần sau khi chủng vi khu n cố định đạm bằng phương pháp chậu plastic trong nhà lưới Mục đích kiểm tra vi khuẩn phân lập được có khả năng hình thành nốt sần, cố định đạm ở quy mô nhà lưới. Quy trình được tiến hành như sau: Lấy đất ngoài ruộng cộng thêm cát, phơi khô, đập nhỏ đem thanh trùng ở 121 ºC trong 30 phút. Rửa, lau cồn và phơi khô các chậu plastic, cho đất vào và tiến hành gieo đậu phộng. Các giống đậu phộng trước khi gieo khử trùng bề mặt bằng cồn 70%, rửa thật sạch lại với nước cất vô trùng, thấm khô. Tất cả các quá trình đều thực hiện trong điều kiện vô trùng tránh sự xâm nhiễm của các vi sinh vật khác. Sau 5 ngày đậu phộng bắt đầu nảy mầm khỏi mặt đất, tổng số 22 chậu của mỗi giống OMĐP được gieo, 6 chậu đối chứng không chủng (K), 8 chậu chủng 1 (C1), 8 chậu chủng 2 (C2). Một mL dịch vi khuẩn nuôi cấy sau 24 h có nồng độ 2x107 được xác định bằng phương pháp hộp đĩa bơm đều vào các gốc đậu phộng, sau đó dán bề mặt chậu với màng phủ plastic trong khoảng 1-2 ngày. Tiếp theo, chờ đậu phộng lớn lên ta đục lỗ cho cây ra khỏi bên ngoài. Thí nghiệm được tưới nước cất vô trùng và quan sát sự hình thành nốt sần sau 60 ngày gieo. Rễ cây từ mỗi chậu được đào một cách cẩn thận, rửa sạch với nước và đếm số lượng nốt sần được hình thành từ mỗi chậu. Các chỉ tiêu khác như trọng lượng tươi của nốt sần, trọng lượng khô, đường kính của nốt sần, màu sắc nốt sần, số quả trên cây, trọng lượng 100 hạt, sự sinh trưởng và phát triển của cây cũng được ghi nhận. 2.2.8. Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo Bremner, 960) Thân và lá của sáu giống đậu phộng 60 ngày tuổi, trên hai nghiệm thức chủng và không chủng được cắt và chuyển mẫu phân tích đạm tổng số ở bộ môn Khoa Học Đất - Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long theo phương pháp Kjeldahl. 2.3. Xử lý kết quả và tính toán số liệu Số liệu được thu thập xử lý trên máy tính bằng chương trình Excel và Cropstat 7.2 (IRRI, 1996). Mỗi nhóm thí nghiệm khác nhau tính toán hệ số biến thiên (CV%) và LSD (5%). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quá trình phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của rễ cây đậu phộng Sau khi chọn được nốt sần khỏe có màu hồng từ rễ cây họ đậu chúng tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần được 6 chủng vi khuẩn. Qua kết quả sơ tuyển cho thấy 6 chủng đều sinh trưởng nhanh, khuẩn lạc mọc sau 2 ngày nuôi cấy, và kích thước khuẩn lạc đạt được 5,5-6,5 mm sau 7 ngày nuôi cấy. Màu sắc 40 hân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm của một số chủng vi khu n nốt sần ở... của khuẩn lạc từ trắng nhạt đến trắng trong, hình dạng khuẩn lạc từ tròn đến bầu dục, bề mặt có chủng thì lồi, dẹt nhầy nhớt, màu sắc khuẩn lạc trắng trong, có đường viền trong suốt, hoặc trắng sữa quanh khuẩn lạc, kích thước tăng nhanh sau 72 giờ nuôi cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi, vi khuẩn có khả năng di động, hiếu khí, hình que ngắn, là vi khuẩn gram âm bắt màu hồng khi nhuộm. Để loại bỏ những chủng không thuộc nhóm cộng sinh nốt sần, 6 chủng tiếp tục thử nghiệm trên môi trường YEMA có bổ sung Congo red bởi vì đây là chất chị thị đặc biệt hữu hiệu và là môi trường chọn lọc tốt nhất để phân biệt hay kiểm tra độ thuần của vi khuẩn nốt sần (Hình 1). Kết quả ở là khuẩn lạc vi khuẩn có hình dạng trắng tròn, mờ sáng lấp lánh, màu trắng hoặc màu hơi đỏ nguyên nhân là do sự hấp thụ của loài này với thuốc nhuộm rất yếu, tiếp tục loại bỏ những chủng có khả năng hấp thụ mạnh với thuốc nhuộm Congo red (Hình 1). A B ình . Hình dạng của khuẩn lạc trên môi trường YEMA bổ sung Congo red chủng hấp thụ yếu (B), hấp thụ mạnh (A) Dựa trên nguyên tắc vi khuẩn cố định đạm không sử dụng peptone cho quá trình sinh trưởng. Do vậy, môi trường chọn lọc GPA dùng để phân biệt vi khuẩn phân lập từ nốt sần sau khi ủ từ 2-3 ngày. Kết quả cho thấy rằng các chủng phân lập này không phát triển hay phát triển rất yếu trên môi trường này vì đơn giản các nòi vi khuẩn này không thể sử dụng peptone làm nguồn nguyên liệu cho sự nhân đôi tế bào, cũng như phát triển (Hình 2). Qua hai thử nghiệm trên môi trường chọn lọc trên chúng tôi lựa chọn được 2 chủng đáp ứng hai điều kiện không tăng trưởng trên môi trường GPA, và hấp thụ yếu đối với Congo red. Hai chủng C1 và C2 này tiếp tục các thử nghiệm sinh lý sinh hóa và khả năng hình thành nốt sần và cố định đạm. ình . Quan sát sự mọc của khuẩn lạc trên môi trường thử nghiệm GPA (glucose- peptone-agar). 3.2. Quan sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn nốt sần Khi quan sát khả năng tăng trưởng trên môi trường YEMA thạch đứng của hai chủng chúng tôi ghi nhận rằng vết cấy mọc tốt từ đáy ống nghiệm đến bề mặt thạch sâu sau hai ngày cấy đều đó chúng tỏ rằng hai chủng có khả năng di động. Ngoài ra, xác định khả năng hiếu khí bằng các nhỏ dung dịch H2O2 (3%) vào các khuẩn lạc quan sát thấy hầu hết đều có hiện tượng sủi bọt xảy ra chứng tỏ cả hai chủng trên đều hiếu khí. Để quan sát tính tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn cố định đạm chúng tôi cũng quan sát khả năng tăng trưởng trên môi trường YEMA có bổ sung muối NaCl 0,5-4% và môi trường Hofer pH=4-12. Sau hai ngày cấy hai chủng vi khuẩn vào môi trường lỏng nhận thấy rằng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức: ở nồng độ muối đối chứng là không cấy vi khuẩn thì không có sự phát triển môi trường vẫn trong. Ở các nồng độ muối 0,5-2% 2 chủng phát triển rất tốt làm đục cả môi trường, bắt đầu phát triển yếu ở nồng độ 2,5% và nồng độ từ 3-4% không phát triển (Hình 3). Kết quả quan sát trên 2 lần thiết kế thí nghiệm độc lập và cho kết quả tương tự là chủng phân lập được có thể chống chịu mặn được ở 2% và hy vọng rằng chủng này có thể đáp ứng với những loại đất có các nồng độ cation và anion cao. Quan sát sự sinh 41 Trần Thị nh Ngu ệt, Trần Minh Tr , à Thanh Đạt, Trần Thu Thảo, Viết Thế trưởng và độ đục của hai chủng vi khuẩn trên môi trường YEM lỏng có sự khác biệt về pH từ 4-12. Ở các ống nghiệm có pH từ 4-5 không phát triển được, pH = 6 phát triển nhưng rất yếu, còn ở các ống nghiệm có pH từ 7-10 phát triển rất tốt, riêng ở pH bằng 11 có sự phát triển nhưng yếu và pH = 12 là không phát triển (Bảng 1). ình 3 Sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn số 2 ở các nồng độ muối NaCl từ 0,5 - 4%. Bảng 1. Sự tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn nốt sần ở các độ pH 4-12 Độ pH Chủng 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Chủng 1 - - + + + + + + - Chủng 2 - - + + + + + + - Ngoài ra, chúng tôi cũng tập trung quan sát sự sản xuất gum (polysaccharide được chiết xuất từ vỏ màng của tế bào vi khuẩn) và tiêu thụ các nguồn đường carbon. Khi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng, ủ ở nhiệt độ 37 ºC trong 15 ngày, kết tủa rồi sấy khô cho thấy chủng thứ nhất tạo được khối lượng gum nhiều nhất đạt 0,91 mg/100 mL và chủng thứ hai thấp hơn chỉ đạt 0,89 mg/100 mL trong khi đó thì đối chứng chỉ đạt 0,3 mg/100 mL (Bảng 2). Đều đó cho thấy rằng cả hai nòi đều phát triển và cho kết quả cao hơn so với đối chứng không có hiện diện của vi khuẩn. Thí nghiệm sử dụng các nguồn đường carbon cho thấy rằng chỉ có manitol cho sự phát triển mạnh đục hoàn toàn môi trường sau hai ngày nuôi cấy trong khi đó đối với các nguồn glucose và lactose thì phát triển rất yếu đều này được thể hiện bởi mật độ quang của môi trường có chứa manitol cao hơn so với glucose và lactose (Bảng 2). Kết quả này cũng phù hợp bởi vì môi trường dùng để phân lập ban đầu YEMA có chứa nhiều đường manitol. Bảng 2. Sự sản xuất gum và tiêu thụ các nguồn đường carbon Chủng Manitol Glucose Lactose Sản xuất Gum (mg/100 mL) Chủng 1 Rất mạnh Rất yếu Rất yếu 0,91 Chủng 2 Rất mạnh Rất yếu Rất yếu 0,89 Do mỗi loại vi khuẩn có khả năng tăng trưởng và phát triển trên môi trường nhất định bằng cách sử dụng các nguồn đường làm vật liệu. Với mục đích xem hai chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng sử dụng tinh bột như một đường phức được cấu tạo từ glucose như là nguồn năng lượng của carbon và năng lượng cho sự phát triển. Đây là môi trường quyết định vi khuẩn có khả năng tạo ra enzyme amylase, vì chính enzyme này sẽ phân cắt các phân tử glucose có trong tinh bột. 42