Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM<br />
CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA<br />
Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Minh Thái*, Đoàn Duy Thanh*, Trần Cát Đông*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mở đầu: Phân tử oxy hoạt động liên quan đến bệnh hen suyễn, sự nhiễm trùng, viêm khớp, bệnh suy giảm<br />
thần kinh Parkinson, bệnh tim mạch và tiểu đường. Chất chống oxy hóa đóng vai trò như tác nhân đánh bắt gốc<br />
tự do, ức chế sự peroxide hóa lipid, vì vậy chúng có khả năng bảo vệ cơ thể trước nhiều bệnh tật có nguyên nhân<br />
từ gốc tự do. Gần đây, vi nấm được xem là nguồn cung cấp các chất chống oxy hóa mới.<br />
Mục tiêu: Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa (định lượng và định tính) của các chủng vi nấm phân lập được<br />
từ các mẫu đất và nước ở một số địa điểm tại miền Nam.<br />
Phương pháp: Mẫu sau khi thu thập được phân lập trên môi trường Potato Dextrose Agar hoặc Sabouraud<br />
Agar bổ sung Clororamphenicol. Định tính hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp bản mỏng DPPH, các<br />
chủng có hoạt tính chống oxy hóa tiếp tục tiến hành định lượng khả năng đánh bắt DPPH, kết hợp ion sắt II, và<br />
định lượng phenol tổng số.<br />
Kết quả: Từ 200 mẫu nước và đất ban đầu, phân lập được 48 chủng vi nấm, trong đó có 18 chủng có hoạt<br />
tính chống oxy hóa. Khả năng đánh bắt gốc tự do của các chủng trong khoảng 61,31-93,56%, khả năng tạo phức<br />
với ion sắt II, trong khoảng 51,56 % - 98,75%, lượng phenol tổng 16,71-124,18 (mg/ml).<br />
Kết luận: Thông qua việc định tính bằng phương pháp bản mỏng DPPH và một số phương pháp định<br />
lượng, nghiên cứu đã chứng minh vi nấm từ đất và nước có hoạt tính chống oxy hóa khá tốt. Cần có những<br />
hướng nghiên cứu nhằm tối ưu hóa các thông số lên men thu chất chống oxy hóa hoặc chiết chất chống oxy hóa ở<br />
các điều kiện thích hợp.<br />
Từ khóa: chống oxy hóa, vi nấm, bản mỏng DPPH, ion sắt II, phenol tổng.<br />
<br />
ABSTRACT<br />
ISOLATING AND SURVEYING ANTIOXIDANT ACTIVITY IN SOME FUNGAL STRAINS<br />
Vu Thanh Thao, Nguyen Minh Thai, Doan Duy Thanh, Tran Cat Dong<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 256 - 260<br />
Background: Reactive oxygen species are reported to be involved in asthma, inflammation, arthritis,<br />
neurodegeneration Parkinson disease, vascular cardiac diseases, and diabetes. Antioxidants act as radicalscavengers, inhibit lipid peroxidation and other free radical-mediated processes; therefore, they are able to protect<br />
the human from several diseases attributed to the reactions of radicals. Recently, fungi have emerged as the new<br />
sources of antioxidants in the form of their secondary metabolites.<br />
Objectives: Screening antioxidant acitivity (qualitative and quantitative) of fungi isolated from soil and<br />
water samples that collected from different regions in Southern of Vietnam.<br />
Methods: Soil and water samples were taken, and spread on Potato Dextrose Agar or Sabouraud<br />
Clororamphenicol Agar plate. Screening antioxidant with dot blot DPPH assay, potentially antioxidant strains<br />
were done further test for their DPPH, fe rrous ion scavenging activity and total phenolic content.<br />
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br />
Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Minh Thái<br />
ĐT: 0986200594<br />
<br />
256<br />
<br />
Email: minhthai2511@gmail.com<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Results: From initial 200 samples, 48 strains had been were isolated, among them 18 strains have<br />
antioxidant potential. These organisms show a good scavenging effecting on DPPH radicals (61,31-93,56 %),<br />
chelating activity with ferrous ion is 51,56 % - 98,75%, total phenolic concentration is 16,71-124,18 (mg/ml).<br />
Conclusions: By using DPPH dot blot and some method for screening and assaying antioxidant activity,<br />
this study demonstrated that fungi isolated from soil and water possess good antioxidant activity. We intend to<br />
optimize physio-chemical parameters in ferment process and extract antioxidant substances with suitable solvent<br />
to apply for medicine and industry.<br />
Keywords: antioxidant, fungi, DPPH dot blot, ferrous ion, total phenolic.<br />
thu thập từ các tỉnh phía nam. Chủng đối chứng:<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 4F có khả<br />
Các gốc tự do liên quan nhiều bệnh khác<br />
năng sinh acid kojic-một chất chống oxy hóa do<br />
nhau ở người như xơ cứng động mạch, ung thư,<br />
phòng thí nghiệm vi sinh công nghệ Dược cung<br />
đái tháo đường, tổn thương gan, viêm da, bệnh<br />
cấp. Hóa chất và môi trường: Môi trường<br />
mạch vành, viêm khớp(9). Chất chống oxy hóa là<br />
Sabouraud chứa Chloramphenicol (SDA), Môi<br />
yếu tố phòng thủ chống lại các gốc tự do trong<br />
trường PDA (Potato Dextrose Agar). Hóa chất:<br />
cơ thể. Các chất chống oxy hóa tổng hợp như<br />
NaCl 0,85 %, chloramphenicol, DPPH<br />
butylated hydroxyanisole (BHA), butylated<br />
(di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium),<br />
hydroxytoluene<br />
(BHT)<br />
và<br />
tert<br />
ferrozin, FeCl2, thuốc thử Folin-Ciocalteau,<br />
butylhydroquinone-(TBHQ) thường được sử<br />
Na2CO3 của Merk, chất chuẩn: BHT (butylated<br />
dụng làm phụ gia thực phẩm của ngành công<br />
hydroxytoluene), Vitamin C, acid gallic của<br />
nghiệp thực phẩm để ngăn chặn sự peroxy lipid.<br />
Sigma.<br />
Tuy nhiên, ứng dụng này bị hạn chế do thành<br />
Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần, các<br />
phần có thể độc hại và chất gây ung thư được<br />
phương pháp định lượng đều được xây dựng<br />
hình thành trong quá trình biến đổi, vì vậy cần<br />
đường chuẩn.<br />
tìm kiếm nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, an<br />
Lấy mẫu và phân lập<br />
toàn, hiệu quả kinh tế(7). Một số thực vật và nấm<br />
bậc cao thường được biết đến như nguồn sản<br />
Tiến hành lấy mẫu đất, nước, cát, bùn ở các<br />
xuất chất chống oxy hóa, trong khi đó các nghiên<br />
khu vực giàu ánh sáng, nhiệt độ cao. Mẫu ban<br />
cứu trên đối tượng nấm bậc thấp còn rất ít(5). Các<br />
đầu được đựng trong ống Falcon 50 ml, các mẫu<br />
loại nấm mốc Penicillium roquefortii, Aspergillus<br />
đất, cát, bùn chiếm khoảng ¼ thể tích ống, mẫu<br />
candidus, Mortierella, Acremonium, Colletotrichum<br />
nước chiếm đến vạch 30-40 ml. Mẫu được bảo<br />
gloeosporioides(4),<br />
Antrodia<br />
quản ở nhiệt độ phòng trong suốt quá trình thử<br />
(11)<br />
camphorata Chaetomium sp., Cladosporium sp.,<br />
nghiệm. Pha loãng mẫu với dung dịch NaCl<br />
(5)<br />
Torula sp., Phoma sp. đã được chứng minh có<br />
0,85%, độ pha loãng từ cấp số 1 đến 5, trải 100 µl<br />
hoạt tính chống oxy hóa. Trong đề tài này, chúng<br />
mẫu ở 3 độ pha loãng cuối lên môi trường SDA<br />
tôi tiến hành phân lập và sàng lọc các chủng vi<br />
và PDA. Ủ ở 30oC từ 2 đến 3 ngày đối với SDA<br />
và 5 đến 10 ngày đối với PDA. Sau thời gian ủ,<br />
nấm trong môi trường đất và nước có khả năng<br />
tiến hành quan sát các khóm vi nấm về hình<br />
sinh chất chống oxy hóa, lựa chọn ra các chủng<br />
có hoạt tính cao nhằm mở ra những nghiên cứu<br />
dạng, màu sắc ở mặt trên và mặt dưới. Tách lấy<br />
sâu hơn.<br />
các khóm vi nấm này tiếp tục làm thuần trên môi<br />
trường SDA (đối với nấm men) và PDA (đối với<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
nấm mốc).<br />
<br />
Vật liệu<br />
<br />
Đối tượng nghiên cứu: 200 mẫu đất và nước<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Chuẩn bị dịch lọc vi nấm<br />
Cấy huyền dịch (106 bàotử/ml) với tỉ lệ 5%<br />
<br />
257<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
(tt/tt) vào 30 ml môi trường PDA, ủ ở 30oC trong<br />
7 ngày. Ly tâm dịch nuôi cấy ở 10000 g ở 4oC<br />
trong10 phút, thu dịch nổi, lọc dịch nổi với giấy<br />
lọc Whatman để loại bỏ hoàn toàn sợi nấm và<br />
bào tử. Dịch lọc thu được là mẫu thử cho thử<br />
nghiệm định tính và định lượng tiếp theo.<br />
<br />
Định tính hoạt tính chống oxy hóa bằng<br />
phương pháp bản mỏng DPPH<br />
Theo đó, mẫu thử (khoảng 10 µL) được<br />
chấm lên bản mỏng silicagel 60 F254, để khô tự<br />
nhiên, nhuộm bản mỏng với dung dịch DPPH<br />
0,4 M bằng cách lật ngược bản mỏng và giữ<br />
trong 10 giây, đọc kết quả nhuộm sau 1 phút(4, 6).<br />
Chứng âm: nước cất hoặc môi trường PDA<br />
không có vi nấm, chứng dương: dung dịch<br />
vitamin C 0,1% và dịch nuôi cấy chủng<br />
Aspergillus oryzae 4F có chứa acid kojic. Mẫu có<br />
hoạt tính chống oxy hóa (dương tính) khi xuất<br />
hiện vòng trắng trên nền tím, ngược lại mẫu<br />
không có hoạt tính chống oxy hóa (âm tính) khi<br />
không xuất hiện vòng trắng, giống với mẫu nước<br />
cất và môi trường không có vi nấm.<br />
<br />
Định lượng hoạt tính chống oxy hóa<br />
Trong báo cáo này chúng tôi sử dụng 3<br />
phương pháp khác nhau để định lượng hoạt tính<br />
chống oxy hóa.<br />
Phương pháp xác định khả năng đánh bắt<br />
gốc tự do DPPH của Zhao và cộng sự(12). Theo<br />
đó, hỗn hợp phản ứng bao gồm 1 ml dung dịch<br />
DPPH 0,1 mM/ethanol 96% và 0,5 ml mẫu thử, ủ<br />
ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đo độ hấp thu ở<br />
bước sóng 517 nm. Dung dịch BHT 0,5 M làm<br />
chất đối chiếu, phải đánh bắt được 100% gốc tự<br />
do. Khả năng đáng bắt gốc tự do (%) được tính<br />
theo công thức:<br />
<br />
A − A2 <br />
S % = 1 − 1<br />
× 100<br />
A0 <br />
<br />
<br />
Với A1 : giá trị OD của dịch nuôi cấy sau khi<br />
phản ứng với DPPH<br />
<br />
258<br />
<br />
A2 giá trị OD của phản ứng khi không có<br />
DPPH<br />
A0 giá trị OD của phản ứng khi không có<br />
dịch nuôi cấy<br />
Phương pháp xác định khả năng kết hợp ion<br />
Fe2+ dựa trên sự giảm màu của phức Fe2ferrozin ở bước sóng 562 nm của Zhao và cộng<br />
sự (12). Hỗn hợp phản ứng bao gồm mẫu thử,<br />
dung dịch FeCl2 và thuốc thử ferrozin, phản ứng<br />
được thực hiện trong 40 phút ở nhiệt độ phòng.<br />
Mẫu đối chiếu BHT 0,5M thực hiện trong cùng<br />
điều kiện phải đạt khả năng kết hợp 100%. Tính<br />
toán khả năng kếp hợp dựa theo công thức:<br />
<br />
A − A2<br />
S % = 1 − 1<br />
A0<br />
<br />
<br />
<br />
× 100<br />
<br />
<br />
A0 là chứng dương với môi trường chưa nuôi cấy<br />
A1 là mẫu thử nghiệm với dịch nuôi cấy<br />
A2 là mẫu thử nghiệm nhưng không mặt của FeCl2<br />
Phương pháp xác định phenol tổng số:<br />
Mẫu thử kết hợp với thuốc thử FolinCiocalteau, kiềm hóa hỗn hợp này bằng dung<br />
dịch Na2CO3 20%, phản ứng thực hiện ở 40oC<br />
trong 30 phút. Hỗn hợp sau phản ứng được đo<br />
độ hấp thu ở bước sóng 562 nm. Xây dựng<br />
đường chuẩn với acid gallic ở các nồng đồ 0,<br />
10, 20, 30, 40,50,60, 70, 80 (µg/ml). Kết quả tính<br />
toán dựa theo đường chuẩn (10).<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br />
Phân lập<br />
Từ các mẫu đất nước đất thu được ở các<br />
vùng, chúng tôi thu được 48 chủng nấm mốc,<br />
không thu được chủng nấm men nào trong quá<br />
trình phân lập.<br />
<br />
Định tính hoạt tính chống oxy hóa<br />
Sử dụng phương pháp bản mỏng DPPH, đã<br />
sàng lọc được 18 trong 48 chủng có hoạt tính<br />
chống oxy hóa, kết quả được trình bày ở hình 1<br />
và bảng 1:<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
7<br />
<br />
25<br />
<br />
26<br />
<br />
27<br />
<br />
28<br />
<br />
29<br />
<br />
30<br />
<br />
31<br />
<br />
8<br />
<br />
9<br />
<br />
10<br />
<br />
11<br />
<br />
12<br />
<br />
13<br />
<br />
14<br />
<br />
32<br />
<br />
33<br />
<br />
34<br />
<br />
35<br />
<br />
36<br />
<br />
37<br />
<br />
38<br />
<br />
15<br />
<br />
16<br />
<br />
17<br />
<br />
18<br />
<br />
21<br />
<br />
39<br />
<br />
40<br />
<br />
42<br />
<br />
43<br />
<br />
44<br />
<br />
45<br />
<br />
22<br />
<br />
23<br />
<br />
24<br />
<br />
H2O Mt-<br />
<br />
Mt+ vitC<br />
<br />
46<br />
<br />
19<br />
<br />
20<br />
<br />
47<br />
<br />
41<br />
48<br />
<br />
H2O Mt-<br />
<br />
Mt+<br />
<br />
VitC<br />
<br />
Hình 1: Kết quả định tính hoạt tính chống oxy hóa trên bản mỏng DPPH<br />
Mẫu thử: 1 – 48. Chứng âm H2O, Mt- (môi<br />
trường chưa nuôi cấy). Chứng dương Mt+ (dịch<br />
nuôi cấy có aicd kojic), Vit C (dung dịch vitamin<br />
C 0,1%).<br />
Bảng 1: Tổng hợp kết quả định tính hoạt tính chống<br />
oxy hóa<br />
STT Kí hiệu Hoạt tính chống STT Kí hiệu Hoạt tính<br />
oxy hóa<br />
chống oxy<br />
hóa<br />
1<br />
NT5<br />
25 DQ31.2<br />
+<br />
2 DQ23.2<br />
26 DT17<br />
++<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
<br />
DQ28.1<br />
BH9.2<br />
BD6<br />
DT27.1<br />
DT26.2<br />
<br />
++<br />
+++<br />
++<br />
+<br />
<br />
27<br />
28<br />
29<br />
30<br />
31<br />
<br />
DT18<br />
DQ25.2<br />
DQ31.3<br />
DQ31.4<br />
DQ26.6<br />
<br />
8<br />
<br />
DQ38<br />
<br />
-<br />
<br />
32 DQ11<br />
<br />
+<br />
<br />
9<br />
<br />
DQ39.1<br />
<br />
-<br />
<br />
33 DQ24.1<br />
<br />
-<br />
<br />
10 DT26.1<br />
<br />
+<br />
<br />
34 DQ26.3<br />
<br />
-<br />
<br />
11<br />
<br />
NT1<br />
<br />
-<br />
<br />
35<br />
<br />
-<br />
<br />
12<br />
<br />
BH9.5<br />
<br />
+<br />
<br />
36 DQ39.1<br />
<br />
-<br />
<br />
13<br />
<br />
NHS<br />
<br />
+<br />
<br />
37 DQ22.1<br />
<br />
+<br />
<br />
14 DT26.1<br />
<br />
-<br />
<br />
38 DQ19.2<br />
<br />
-<br />
<br />
15<br />
<br />
GL6.1<br />
<br />
-<br />
<br />
39 DQ21.1<br />
<br />
-<br />
<br />
16<br />
<br />
NT10<br />
<br />
-<br />
<br />
40 DQ39.2<br />
<br />
-<br />
<br />
17<br />
<br />
BH9.4<br />
<br />
-<br />
<br />
41 DQ26.5<br />
<br />
-<br />
<br />
18 DT27.2<br />
<br />
+<br />
<br />
42 DQ22.2<br />
<br />
-<br />
<br />
19 DT27.3<br />
20 GL6.3<br />
<br />
+<br />
-<br />
<br />
43 DQ25.1<br />
44 TD6<br />
<br />
-<br />
<br />
21 BH14.1<br />
22<br />
NT2<br />
23 BH12<br />
24 GL6.2<br />
<br />
++<br />
-<br />
<br />
45<br />
46<br />
47<br />
48<br />
<br />
+<br />
<br />
PrBD<br />
<br />
DQ22.3<br />
DQ21.2<br />
DQ26.2<br />
DQ22.4<br />
<br />
+<br />
+++<br />
+<br />
<br />
(+): có hoạt tính chống oxi hoá; (-): không có<br />
hoạt tính chống oxi hoá; (++), (+++):<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
hoạt tính chống oxi hoá mạnh và rất mạnh so<br />
với độ sáng của vết vitamin C<br />
<br />
Kết quả định lượng hoạt tính chống oxy<br />
hóa<br />
Kết quả đánh bắt gốc tự do DPPH của các<br />
chủng vi nấm thu được trong khoảng 61,31-93,56<br />
%, khả năng kết hợp với ion Fe2+ trong khoảng<br />
51,56 % - 98,75%, các kết quả này phù hợp với<br />
nghiên cứu của Arora và cộng sự. Kết quả<br />
phenol tổng số của các chủng vi nấm trong<br />
khoảng 16,71-124,18 (mg/ml) tính theo acid<br />
gallic, đa số các chủng có lượng phenol tổng số<br />
thấp hơn nghiên cứu của Arora và cộng sự (3).<br />
Bảng 2: Kết quả định lượng hoạt tính chống oxy hóa<br />
theo các phương pháp<br />
Ký<br />
hiệu<br />
BH9.2<br />
BD6<br />
DT27.1<br />
DT26.2<br />
DT26.1<br />
BH9.5<br />
NHS<br />
DT27.2<br />
DT27.3<br />
BH14.1<br />
DQ31.2<br />
DT17<br />
DQ25.2<br />
DQ31.4<br />
DQ26.6<br />
DQ11<br />
DQ22.1<br />
DQ22.4<br />
<br />
Khả năng đánh Khả năng kết Lượng phenol<br />
2+<br />
bắt DPPH (%) hợp ion Fe<br />
tổng số (mg/ml)<br />
(%)<br />
80,91<br />
96,65<br />
108,14<br />
91,75<br />
97,20<br />
113,59<br />
79,80<br />
96,30<br />
103,41<br />
76,5<br />
93,75<br />
92,16<br />
70,57<br />
86,61<br />
44,89<br />
76,68<br />
93,80<br />
95,00<br />
73,75<br />
91,90<br />
77,27<br />
74,94<br />
92,29<br />
82,26<br />
61,31<br />
51,56<br />
10,73<br />
67,19<br />
76,66<br />
34,97<br />
75,88<br />
92,85<br />
88,89<br />
92,50<br />
97,76<br />
118,58<br />
65,56<br />
68,75<br />
13,95<br />
93,56<br />
98,66<br />
124,18<br />
70,94<br />
90,00<br />
55,66<br />
71,69<br />
91,19<br />
58,35<br />
69,94<br />
82,28<br />
37,33<br />
66,12<br />
75,71<br />
16,71<br />
<br />
259<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
BÀNLUẬN<br />
Hiện nay, để đánh giá hoạt tính chống oxy<br />
hóa của các hợp chất tự nhiên, các tác giả sử<br />
dụng nhiều thử nghiệm khác nhau dựa trên cơ<br />
chế nội sinh của các chất này trong cơ thể, vẫn<br />
chưa có một thử nghiệm tiện lợi, nhanh chóng,<br />
chính xác để đánh giá hoạt tính này. Nhiều tác<br />
giả cho rằng các hợp chất polyphenol ở thực vật<br />
và vi nấm trong đất và nước chịu trách nhiệm<br />
chính cho hoạt tính chống oxy hóa(8). Hệ thống<br />
liên hợp trong nhân phenol có tác dụng vận<br />
chuyển điện tử hoặc nguyên tử hydro làm trung<br />
hòa các gốc tự do. Nguyên tử hydro linh động<br />
trong nhóm OH đóng vai trò là tác nhân khử<br />
làm ngăn cản quá trình oxy hóa các hợp chất<br />
lipid, ngăn cản sự sản sinh các gốc tự do từ quá<br />
trình này(1). Hơn nữa, các polyphenol có khả ăng<br />
tạo phức với ion Fe 2+, đây là ion kích thích quá<br />
trình oxy hóa các hợp chất lipid và tăng cường<br />
tích lũy các gốc tự do từ quá tình này(3). Trong đề<br />
tài này, chúng tôi sử dụng 2 phương pháp phổ<br />
biến đánh giá dựa trên 2 cơ chế: đánh bắt gốc tự<br />
do và khả năng tạo phức với ion kim loại khử.<br />
Nhằm khảo sát mối liên hệ và mối liên hệ giữa<br />
các cơ chế với lượng phenol tổng cộng, chúng tôi<br />
sử dụng dữ liệu định lượng của 18 chủng vi nấm<br />
để tính toán hệ số tương quan R2 với phần mềm<br />
Excel 2003. Khả năng đánh bắt gốc tự và tạo<br />
phức với ion Fe2+ có hệ số tương quan 0,592<br />
(