Phân lập và tinh chế zeaxanthin từ kỷ tử dùng làm chất chuẩn trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ Hãa häc, T. 45 (6A), Tr. 231 - 236, 2007<br /> <br /> <br /> PH¢N LËP Vµ TINH CHÕ ZEAXANTHIN Tõ Kû Tö DïNG LµM<br /> CHÊT CHUÈN TRONG S¾C Ký LáNG HIÖU N¡NG CAO<br /> §Õn Tßa so¹n 15-11-2007<br /> TrÇn ThÞ Thu Thuû , Ho ng ThÞ HuÖ An2, NguyÔn QuyÕt ChiÕn1<br /> 1<br /> <br /> 1<br /> ViÖn Hãa häc, ViÖn Khoa häc v& C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> 2<br /> Bé m«n Hãa häc, §¹i häc Nha Trang<br /> <br /> SUMMARY<br /> A simple method has been developed to isolate and purify zeaxanthin dipalmitate and all-<br /> trans zeaxanthin from wolfberry with satisfied purity for use as authentic standard in carotenoid<br /> HPLC quantification.<br /> Keywords: Zeaxanthin, zeaxanthin dipalmitate, wolfberry, carotenoid quantification, HPLC.<br /> <br /> <br /> I - §ÆT VÊN §Ò Trung Quèc v nhãm nghiªn cøu cña Khachik<br /> [3] ®+ chØ ra ®©y l mét nguån nguyªn liÖu cã<br /> Zeaxanthin ® îc ph©n lËp lÇn ®Çu tiªn v o h m l îng zeaxanthin ®Æc biÖt cao.<br /> n¨m 1929 tõ h¹t ng« [1] nh ng m+i ®Õn thËp kû ë n íc ta, kû tö (qu¶ cña c©y Lycium<br /> 90 cña thÕ kû tr íc ng êi ta míi ®i s©u v o chinense Mill.) tõ l©u ®+ ® îc sö dông nh l<br /> nghiªn cøu nh÷ng t¸c dông cña hîp chÊt n y ®èi mét vÞ thuèc ®«ng y th«ng dông v kh«ng ®¾t<br /> víi søc khoÎ cña con ng êi. Cïng víi lutein, tiÒn. V× thÕ, chóng t«i ®+ lùa chän nguån<br /> zeaxanthin l mét trong hai carotenoit cã mÆt nguyªn liÖu n y ®Ó ph©n lËp v tinh chÕ<br /> trong vâng m¹c cña m¾t. V o th¸ng 9 n¨m zeaxanthin.<br /> 2007, nhãm nghiªn cøu cña San Giovanni thuéc<br /> ViÖn Nghiªn cøu quèc gia vÒ m¾t, Maryland -<br /> Mü, ®+ chøng minh r»ng lutein v zeaxanthin cã II - THùC NGHIÖM<br /> t¸c dông b¶o vÖ chèng l¹i bÖnh mï ë ng êi lín<br /> tuæi g©y nªn bëi sù tho¸i hãa ®iÓm v ng ë vâng Dung m«i chiÕt v xö lý mÉu ®Òu thuéc lo¹i<br /> m¹c [2]. V× vËy, viÖc ®Þnh l îng zeaxanthin tinh khiÕt ph©n tÝch, hoÆc ® îc ch ng cÊt l¹i<br /> còng nh mét sè carotenoit kh¸c trong c¸c tr íc khi sö dông. Dung m«i dïng cho s¾c ký<br /> nguyªn liÖu, thùc phÈm, d îc phÈm cã mét tÇm láng cao ¸p thuéc lo¹i tinh khiÕt HPLC (Merck).<br /> quan träng lín trong nç lùc n©ng cao tuæi thä v C¸c hãa chÊt kh¸c ®Òu thuéc lo¹i tinh khiÕt ph©n<br /> c¶i thiÖn søc khoÎ cña con ng êi tÝch.<br /> Trong tù nhiªn, zeaxanthin cã mÆt trong mét Phæ UV-VIS ® îc ghi trªn quang phæ kÕ<br /> sè lo¹i thùc phÈm dïng h ng ng y nh rau x GBC Instrument-2855; phæ APCI-MS ® îc ghi<br /> l¸ch, b«ng c¶i xanh, ng«, c¶i Bruxel, ®Ëu, c¶i ë chÕ ®é ®o ®iÖn tÝch d ¬ng (positive mode) trªn<br /> b¾p l¸ xanh, ít, c chua, mét sè lo¹i bÇu bÝ, lßng m¸y LC-MS Agilent 1100 series HPLC-DAD<br /> ®á trøng, mét sè lo i gi¸p x¸c v c¸…N¨m (Agilent Technologies, Wilmington, USA); c¸c<br /> 1995, lÇn ®Çu tiªn zeaxanthin ® îc ph©n lËp tõ phæ NMR ® îc ghi trªn m¸y Bruker Avance<br /> kû tö (qu¶ chÝn ph¬i hay sÊy kh« cña c©y 500 MHz (§øc) víi dung m«i l CDCl3 v chÊt<br /> chuÈn néi l TMS.<br /> Lycium barbarum L. v Lycium chinense Mill.)<br /> 231<br />  S¾c ký b¶n máng (TLC) ® îc tiÕn h nh trªn 16, H-16’); 1,11 (6H, s, H-17, H-17’); 1,26 -<br /> b¶n Kieselgel 60 F254 ®Õ nh«m (Merck KGaA, 1,30 (24H, m, 14 CH2, H-23, H-23’); 1,56 (2H,<br /> Darmstadt, §øc). S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao dd, J = 11; 12 Hz, Hax-2, Hax-2’); 1,60-1,65 (4H,<br /> (HPLC) ® îc ch¹y trªn m¸y LC-MS Agilent m, H-22, H-22’); 1,72 (6H, s, H-18, H-18’);<br /> 1100 series HPLC-DAD, cét Zorbax SB-18 (150 1,78 (2H, ddd, J = 12; 1,5 Hz, Heq-2, Heq-2’);<br /> x 3 mm, 5 µm). 1,968 & 1,975 (12H, 2s, H-19, H-19’, H-20, H-<br /> 20’); 2,11 (2H, dd, J = 17; 9 Hz, Hax-4, Hax-4’);<br /> Nguyªn liÖu<br /> 2,29 (4H, t, J = 7,5 Hz, H-21, H-21’); 2.44 (2H,<br /> Kû tö (Fructus Lycii) kh« cã nguån gèc tõ dd, J = 17; 5,5 Hz, Heq-4, Heq-4’); 5,06 (2H, m,<br /> Trung Quèc ® îc mua t¹i c¸c hiÖu thuèc §«ng H-3, H-3’); 6,11 (4H, overlap, H-7, H-7’, H-8,<br /> y ë H néi. H-8’); 6,16 (2H, d, J = 11,5 Hz, H-10, H-10’);<br /> Xö lý nguyªn liÖu v ph©n lËp zeaxanthin 6,26 (2H, like d, J = 10 Hz, H-14, H-14’); 6,36<br /> este (2H, d, J = 15 Hz, H-12, H-12’); 6,62 - 6,67<br /> (4H, m, H-11, H-11’, H-15, H-15’).<br /> 500 g kû tö kh« ® îc ng©m trong n íc cÊt 13<br /> qua 1 ®ªm, sau ®ã phÇn vá thÞt v h¹t ® îc t¸ch C-NMR (CDCl3, 125 MHz): (ppm)<br /> riªng. PhÇn vá thÞt qu¶ kû tö ® îc xay nhá, 12,75 & 12,82 (CH3, C-19, C-19’, C-20, C-20’);<br /> ng©m v chiÕt b»ng diclometan cho ®Õn khi dÞch 14,12 (CH3, C-24, C-24’); 21,49 (CH3, C-18, C-<br /> chiÕt gÇn nh kh«ng cßn m u v ng (Ýt nhÊt 6 18’); 22,70 & 29,15-29,70 & 31,93 (CH2, C-23,<br /> lÇn). C¸c dÞch chiÕt ® îc gép l¹i, l m khan trªn C-23’); 25,05 (CH2, C-22, C-22’); 28,53 (CH3,<br /> Na2SO4 v cÊt lo¹i dung m«i d íi ¸p suÊt gi¶m ë C-17, C-17’); 30,05 (CH3, C-16, C-16’); 34,73<br /> 30oC, thu ® îc 1,5 g bét m u ®á. Hçn hîp (CH2, C-21, C-21’); 36,72 (C, C-1; C-1’); 38,53<br /> carotenoit n y ® îc t¸ch trªn cét s¾c ký trªn (CH2, C-4, C-4’); 44,13 (CH2, C-2, C-2’); 68,13<br /> silica gel, cho ph©n ®o¹n cã chøa zeaxanthin (CH, C-3, C-3’); 124,91 (CH, C-11, C-11’);<br /> este (0,9 g). Sau khi kÕt tinh l¹i trong n-hexan ë 125,33 (CH, C-7, C-7’); 125,69 (C, C-5, C-5’);<br /> 2 - 4oC thu ® îc 0,6 g zeaxanthin dipalmitat 130,11 (CH, C-15, C-15’); 131,44 (CH, C-10,<br /> s¹ch d íi d¹ng tinh thÓ m u ®á. §nc: 98 oC. C-10’); 132,65 (CH, C-14, C-14’); 135,59 (C, C-<br /> 9; C-9’); 136,48 (C, C-13, C-13’); 137,65 (CH,<br /> §é tinh khiÕt (HPLC): 95%.<br /> C-12, C-12’); 137,89 (C, C-6; C-6’); 138,66<br /> 1<br /> H-NMR (CDCl3, 500 MHz): (ppm) 0,88 (CH, C-8, C-8’); 173,61 (C=O).<br /> (6H, t, J = 7 Hz, H-24, H-24’); 1,08 (6H, s, H-<br /> <br /> <br /> 18' 4'<br /> 16 17<br /> 19 20 5' O (CH2 )12<br /> 3'<br /> 7 9 11 13 15 14' 12' 10' 8'<br /> 2 6 1' 2' O<br /> 22<br /> O 1<br /> 8 10 12 14 15'<br /> 13'<br /> 11'<br /> 9'<br /> 7'<br /> 6'<br /> 24 3<br /> 21 17' 16'<br /> (CH2 )12 O 4<br /> 5<br /> 18<br /> 20' 19'<br /> 23<br /> <br /> <br /> <br /> Thñy ph©n zeaxanthin dipalmitat v tinh chÕ riªng, röa l¹i hai lÇn b»ng n íc cÊt, l m khan<br /> all trans-zeaxanthin trªn Na2SO4 v cÊt lo¹i dung m«i. Zeaxanthin<br /> 200 mg zeaxanthin dipalmitat ® îc ho tan th« ® îc röa 3 lÇn b»ng n-hexan tr íc khi ® îc<br /> trong 5 mL diclometan v 15 mL etanol trong tinh chÕ trªn cét s¾c ký trªn silica gel (n-<br /> mét b×nh cÇu 50 mL. 10 mL dung dÞch KOH hexan/etyl axetat 5/1). Zeaxanthin thu ® îc<br /> 20% trong etanol ® îc thªm v o v hçn hîp ® îc kÕt tinh l¹i tõ hçn hîp dung m«i n-<br /> ph¶n øng ® îc ®un ë 70 oC trong 3h. Dung dÞch hexan/etyl axetat 1/1 hoÆc diclometan/n-hexan<br /> ® îc cÊt lo¹i etanol d íi ¸p suÊt gi¶m v ph©n 1/2 ë 2-4oC, cho tinh thÓ h×nh kim m u ®á da<br /> bè l¹i b»ng etyl axetat/n íc hoÆc cam (40 mg). §nc: 213oC.<br /> diclometan/n íc. Sau ®ã pha h÷u c¬ ® îc t¸ch §é tinh khiÕt (HPLC): > 99%.<br /> 232<br />  UV-Vis(Hx): max(log ) 426 (5,0080); 447 Hz, H-14, H-14’); 6,36 (2H, d, J = 15 Hz, H-12,<br /> (5,1412); 474 (5,0628). H-12’); 6,60 – 6,67 (4H, m, H-11, H-11’, H-15,<br /> APCI-MS: m/z (%) 569,4 [M+H]+ (100). H-15’).<br /> 13<br /> 1 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (ppm)<br /> H-NMR (CDCl3, 500 MHz) : (ppm) 1,08<br /> 12,63 & 12,69 (CH3, C-19, C-19’,C-20, C-20’);<br /> (12H, s, H-16, H-16’, H-17, H-17’); 1,35 (2H,<br /> 21,49 (CH3, C-18, C-18’); 28,57 (CH3, C-17, C-<br /> bd, -OH ë C-3, C-3’); 1,48 (2H, t, J = 12 Hz,<br /> 17’); 30,16 (CH3, C-16, C-16’); 36,98 (C, C-1,<br /> Hax-2, Hax-2’); 1,74 (6H, s, H-18, H-18’); 1,78<br /> C-1’); 42,22 (CH2, C-4, C-4’); 48,11 (CH2, C-2,<br /> (2H, ddd, J =12; 3,5; 2,5 Hz, Heq-2, Heq-2’);<br /> C-2’); 64,66 (CH, C-3, C-3’); 124,86 (CH, C-11,<br /> 1,968 & 1,973 (12H, 2 s (overlap), H-19, H-19’, C-11’); 125,57 (CH, C-7, C-7’); 126,17 (C, C-5,<br /> H-20, H-20’); 2,04 (2H, dd, J = 17 ; 10 Hz, Hax- C-5’); 130,00 (CH, C-15, C-15’); 131,19 (CH,<br /> 4, Hax-4’); 2,39 (2H, dd, J = 17 ; 4,5 Hz, Heq-4, C-10, C-10’); 132,50 (CH, C-14, C-14’); 135,63<br /> Heq-4’); 4,00 (2H, m, Hax-3, Hax-3’); 6,12 (4H, (C, C-9, C-9’); 136,41 (C, C-13, C-13’); 137,46<br /> overlap, H-7, H-7’, H-8, H-8’); 6,16 (2H, d, J = (CH, C-12, C-12’); 137,66 (C, C-6, C-6’);<br /> 11,5 Hz, H-10, H-10’); 6,25 (2H, like d, J = 10 138,38 (CH, C-8, C-8’).<br /> <br /> 18' 4'<br /> 16 17<br /> 19 20 5' OH<br /> 3'<br /> 7 9 11 13 15 14' 12' 10' 8'<br /> 2 6 1' 2'<br /> 1 6'<br /> 13' 9'<br /> 8 10 12 14 15' 11' 7'<br /> 3<br /> 17' 16'<br /> HO 4<br /> 5<br /> 18<br /> 20' 19'<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> III - KÕT QU¶ V TH¶O LUËN da cam víi ®iÓm nãng ch¶y t ¬ng øng l 98oC<br /> v 213 oC, phï hîp víi c¸c sè liÖu ®+ c«ng bè<br /> Theo t liÖu [4], zeaxanthin trong kû tö tån [1, 2]. C¸c d÷ liÖu phæ thu ® îc b»ng c¸c<br /> t¹i chñ yÕu d íi d¹ng dieste cña axit palmitic v ph ¬ng ph¸p vËt lý kh¸c nh UV-VIS, APCI-<br /> chØ cã l îng vÕt este cña axit lauric v myristic. MS, 1D v 2D-NMR cho phÐp kh¼ng ®Þnh cÊu<br /> Ngo i ra, trong kû tö cã chøa mét l îng nhá tróc hãa häc cña c¸c hîp chÊt ph©n lËp ® îc.<br /> mét sè carotenoit kh¸c nh -cryptoxanthin, - ViÖc g¸n c¸c tÝn hiÖu phæ 1H v 13C NMR<br /> cryptoxanthin, lycopen, -carotene, v cã rÊt Ýt (b¶ng 1) ® îc thùc hiÖn trªn c¬ së ph©n tÝch kÕt<br /> lutein - ®ång ph©n rÊt khã t¸ch khi cã mÆt cïng hîp c¸c phæ DEPT-135, DEPT-90 v c¸c phæ<br /> zeaxanthin. §Þnh l îng carotenoit b»ng ph ¬ng hai chiÒu nh COSY, HSQC v HMBC.<br /> ph¸p HPLC-DAD trong mét sè lo i kû tö [5] CÊu h×nh all-trans cña s¶n phÈm zeaxanthin<br /> cho thÊy, tæng l îng carotenoit chiÕm 0,03 - 5% ® îc chøng minh qua kÕt qu¶ phæ hÊp thô UV-<br /> khèi l îng nguyªn liÖu kh«, trong ®ã zeaxanthin VIS ghi trong n-hexan víi c¸c ®Ønh cùc ®¹i ®Æc<br /> dipalmitat ®¹t kho¶ng 31 - 56%. tr ng ë 426 (5,0080), 447 (5,1412), v 474 nm<br /> Quy tr×nh chiÕt v tinh chÕ zeaxanthin (5,0628); qua h»ng sè t ¬ng t¸c trªn phæ 1H<br /> dipalmitat v all-trans zeaxanthin ® îc tãm t¾t NMR J = 15 Hz cña H-12 (víi H-11), J = 11,5<br /> trong s¬ ®å 1. Quy tr×nh thuû ph©n cã thÓ ¸p Hz cña H-10 (víi H-11), J = 10 Hz cña H-14<br /> dông cho c¶ zeaxanthin este th« v este s¹ch sau (víi H-15) (h»ng sè t ¬ng t¸c cña H-7 v H-8<br /> khi tinh chÕ qua cét s¾c ký silica gel. Theo dâi kh«ng ®o ® îc chÝnh x¸c do cã sù chång chÊt<br /> tiÕn tr×nh ph¶n øng b»ng TLC cho thÊy trong lªn nhau). Ngo i ra, viÖc so s¸nh ®iÓm nãng<br /> qu¸ tr×nh thuû ph©n cã sù t¹o th nh monoeste ch¶y cña s¶n phÈm víi ®iÓm nãng ch¶y c«ng bè<br /> tr íc khi bÞ thuû ph©n ho n to n th nh [6] cña c¸c ®ång ph©n kh¸c còng thèng nhÊt víi<br /> zeaxanthin tù do. kÕt luËn trªn.<br /> Chóng t«i ®+ thu ® îc zeaxanthin dipalmitat §é tinh khiÕt cña s¶n phÈm zeaxanthin<br /> v zeaxanthin d íi d¹ng tinh thÓ m u ®á v ®á dieste v zeaxanthin ® îc ®¸nh gi¸ b»ng ph ¬ng<br /> <br /> 233<br /> ph¸p HPLC [7]. MÉu ® îc ch¹y trªn cét ng îc 450 nm. §é tinh khiÕt ® îc tÝnh b»ng diÖn tÝch<br /> pha Zorbax SB-18 (150 x 3 mm, 5 µm) víi pha pic cña s¶n phÈm /tæng diÖn tÝch c¸c pic trªn s¾c<br /> ®éng l MeOH/ MeCN/CH2Cl2 10:85:5 (v/v/v) + ký ®å. KÕt qu¶ cho thÊy ®é tinh khiÕt cña s¶n<br /> 0,05% trietylamin, tèc ®é dßng 0,6 ml/min, phÈm zeaxanthin dipalmitat ®¹t 95% v<br /> nhiÖt ®é 25 oC. S¾c ký ®å ® îc ghi ë b íc sãng zeaxanthin ®¹t trªn 99%.<br /> <br /> <br /> Kû tö<br /> <br /> ChiÕt CH2Cl2<br /> T¸ch cét<br /> silica gel<br /> <br /> Zeaxanthin<br /> dipalmitat Thuû ph©n<br /> <br /> Zeaxanthin th«<br /> KÕt tinh<br /> Röa b»ng<br /> Zeaxanthin n-hexan<br /> dipalmitat s¹ch Zeaxanthin 1<br /> T¸ch cét<br /> silica gel<br /> <br /> Zeaxanthin 2 Zeaxanthin s¹ch<br /> KÕt tinh<br /> <br /> <br /> S¬ ®å 1: Quy tr×nh ph©n lËp v tinh chÕ zeaxanthin dipalmitat v zeaxanthin<br /> <br /> B¶ng 1: Sè liÖu phæ 1H NMR v 13<br /> C NMR cña zeaxanthin dipalmitat v all-trans zeaxanthin<br /> ghi trong CDCl3<br /> C H (J=Hz) C C H (J=Hz) C<br /> <br /> <br /> <br /> zeaxanthin dipalmitat zeaxanthin<br /> 1 2 3 4 5 6 7 8<br /> 1, 1’ C 36,72 1, 1’ C 36,98<br /> 2, 2’ CH2 1,56 ax (dd; 11; 12) 44,13 2, 2’ CH2 1,48 ax (t; 12) 48,11<br /> 1,78 eq (ddd; 12; 1,5) 1,78 eq (ddd; 12; 3,5;<br /> 2,5)<br /> 3, 3’ CH 5,06 (m) 68,13 3, 3’ CH 4,00 (m) 64,66<br /> 4, 4’ CH2 2,11 ax (dd; 17; 9) 38,53 4, 4’ CH2 2,04 ax (dd; 17; 10) 42,22<br /> 2,44 eq (dd; 17; 5,5) 2,39 eq (dd; 17; 4,5)<br /> 5, 5’ C 125,69 5, 5’ C 126,17<br /> <br /> 234<br />  1 2 3 4 5 6 7 8<br /> 6, 6’ C 137,89 6, 6’ C 137,66<br /> 7, 7’ CH 6,11 (overlap) 125,33 7, 7’ CH 6,12 (overlap) 125,57<br /> 8, 8’ CH 6,11 (overlap) 138,66 8, 8’ CH 6,12 (overlap) 138,38<br /> 9, 9’ C 135,59 9, 9’ C 135,63<br /> 10, 10’ CH 6,16 (d; 11,5) 131,44 10, 10’ CH 6,16 (d; 11,5) 131,19<br /> 11, 11’ CH 6,62-6,67 (overlap) 124,91 11, 11’ CH 6,60-6,67 (overlap) 124, 86<br /> 12, 12’ CH 6,36 (d; 15) 137,65 12, 12’ CH 6,36 (d; 15) 137,46<br /> 13, 13’ C 136,48 13, 13’ C 136,41<br /> 14, 14’ CH 6,26 (like d; 10) 132,65 14, 14’ CH 6,25 (like d; 10) 132,50<br /> 15, 15’ CH 6,62-6,67 (overlap) 130,11 15, 15’ CH 6,60-6,67 (overlap) 130,00<br /> 16, 16’ CH3 1,08 (s) 30,05 16, 16’ CH3 1,08 (s, overlap) 30,16<br /> 17, 17’ CH3 1,11 (s) 28,53 17, 17’ CH3 1,08 (s, overlap) 28,57<br /> 18, 18’ CH3 1,72 (s) 21,49 18, 18’ CH3 1,74 (s) 21,49<br /> 19, 19’ CH3 1,968 (s) 12,75 19, 19’ CH3 1,968 (s) 12,63<br /> 20, 20’ 1,975 (s) 12,82 20, 20’ !,973 (s) 12,69<br /> 21 CH2 2,29 (t; 7,5) 34,73<br /> 22 CH2 1,60-1,65 (m) 25,05<br /> 23 12CH 1,26-1,30 (m) 22,70-<br /> 2 31,93<br /> 24 CH3 0,88 (t; 7) 14,12<br /> C=O 173,61<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> S¾c ký ®å HPLC cña s¶n phÈm zeaxanthin<br /> <br /> IV - KÕT LUËN ®¹t yªu cÇu l m mÉu chuÈn trong ph ¬ng ph¸p<br /> ®Þnh l îng carotenoit b»ng HPLC.<br /> B»ng ph ¬ng ph¸p chiÕt xuÊt v tinh chÕ kÕt<br /> hîp gi÷a s¾c ký cét trªn silica gel v kÕt tinh l¹i Lêi c¶m ¬n: C«ng tr×nh n&y ®Fîc thùc hiÖn víi<br /> t ¬ng ®èi ®¬n gi¶n, dÔ thùc hiÖn trong phßng thÝ sù hç trî t&i chÝnh cña Héi ®ång khoa häc tù<br /> nghiÖm, zeaxanthin dipalmitat v all-trans nhiªn.<br /> zeaxanthin ®+ ® îc ph©n lËp víi ®é tinh khiÕt<br /> <br /> 235<br />  T I LIÖU THAM KH¶O purification of lutein, zeaxanthin and rare<br /> carotenoids from marigold flowers and<br /> 1. P. Karrer, H. Salomon, H. Wehrli. Helvetica plants, WO03048284 (2003).<br /> Chimica Acta, 12, 790 - 792 (1929). 5. Y. Peng, C. Ma, Y. Li, K. S.-Y. Leung, Z.-<br /> H. Jiang, Z. Zhao. Plant Food for Human<br /> 2. www.wikipedia.org.<br /> Nutrition, 60, 161 - 164 (2005).<br /> 3. F. Khachik, G. R. Beecher, J. C. Jr. Smith. J. 6. www.lipidbank.jp.<br /> Cellular Biochem., 22, 236 - 246 (1995). 7. M. Kimura, D. B. Rodriguez-Amaya. J.<br /> 4. F. Khachik. Process for extraction and Food Chem., 78, 389 - 398 (2002).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 236<br />