Phân tích karyotype của loài vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 sử dụng kỹ thuật nhuộm DAPI và điện di xung điện trường

TAP CHI<br /> HOC 2015,<br /> 37(1):<br /> 60-68<br /> PhânSINH<br /> tích karyotype<br /> của<br /> loài vi<br /> tảo<br /> DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1.6140<br /> <br /> PHÂN TÍCH KARYOTYPE CỦA LOÀI VI TẢO Schizochytrium mangrovei<br /> PQ6 SỬ DỤNG KỸ THUẬT NHUỘM DAPI (4’, 6-DIAMIDINO-2-PHENYLIDOLE)<br /> VÀ ĐIỆN DI XUNG ĐIỆN TRƯỜNG (PFGE)<br /> Hoàng Thị Lan Anh1, Ngô Thị Hoài Thu1, Trần Huy Hoàng2, ZhiGang Zhou3,<br /> Trần Quế4, Chu Hoàng Hà1, Trương Nam Hải1, Đặng Diễm Hồng1*<br /> 1<br /> <br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *ddhong60vn@yahoo.com<br /> 2<br /> Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương<br /> 3<br /> Trường Cao đẳng Khoa học và Công nghệ Thủy sản, Đại học Hải dương Thượng Hải, Trung Quốc<br /> 4<br /> Viện nghiên cứu Hạt nhân, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam<br /> TÓM TẮT: Schizochytrium mangrovei PQ6 là loài vi tảo biển dị dưỡng của Việt Nam, có nhiều<br /> đặc điểm quý, bao gồm khả năng đáp ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường nuôi, năng suất<br /> sinh khối cao (30-40 g sinh khối khô/L), hàm lượng lipid lớn (đến 70% sinh khối khô), và giàu các<br /> acid béo không bão hòa đa nối đôi (như acid docosahexaenoic - DHA, C22:6 n-3; eicosapentaenoic<br /> - EPA, C20:5 n-3; docosapentaenoic - DPA, C22:5 n-6). Sinh khối của loài tảo này đã được nghiên<br /> cứu để sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, thực phẩm chức năng, sản xuất biodiesel và một số các<br /> hợp chất có hoạt tính sinh học (acid béo không bão hòa đa nối đôi, squalene...). Tuy nhiên, cho đến<br /> nay, chưa có bất cứ một công bố nào đề cập tới việc phân tích karyotype của loài vi tảo này cũng<br /> như các loài khác thuộc chi Schizochytrium. Trong bài báo này, chúng tôi đã sử dụng colchicine để<br /> ngừng chu kì tế bào tảo ở metaphase. Sau đó, tế bào tảo được xử lý bằng các enzyme làm mềm<br /> thành tế bào, nhiễm sắc thể được nhuộm với DAPI (4’, 6-diamidino-2-phenylindole) và quan sát<br /> dưới kính hiển vi huỳnh quang. Các kết quả thu được cho thấy, chủng PQ6 có 3 nhiễm sắc thể. Mặt<br /> khác, 4 băng tương ứng với 4 nhiễm sắc thể đã được phân tách bởi điện di xung điện trường. Sự<br /> khác biệt về số lượng nhiễm sắc thể này được chúng tôi giả thiết rằng có thể loài vi tảo này có tồn<br /> tại plasmid. Vì vậy, trong thời gian tới, các nghiên cứu khác cần được tiến hành nhằm khẳng định<br /> các kết quả đã thu được. Mặc dù vậy, nghiên cứu này đã cung cấp những bằng chứng đầu tiên về<br /> karyotype và cung cấp cơ sở đầu tiên cho việc sắp xếp, chú giải hệ gen của loài vi tảo này.<br /> Từ khóa: Schizochytrium mangrovei PQ6, DAPI, karyotype, metaphase, PFGE<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Phân tích nhiễm sắc thể là một trong những<br /> yêu cầu tiên quyết của các nghiên cứu về di<br /> truyền và chọn giống. Trong một thời gian dài,<br /> việc phân tích tế bào học của tảo bị giới hạn<br /> một phần do nhiễm sắc thể tảo có kích thước<br /> nhỏ, đồng dạng và số lượng nhiều. Trong các<br /> nghiên cứu trước đây, aceto-iron-haematoxylin,<br /> aceto-iron- carbol fuchsin, haematoxylin-chloral<br /> hydrate, iron alum aceto-carmine và<br /> haemotoxylin là các loại thuốc nhuộm và xử lý<br /> thành tế bào tảo bằng acid thường được sử dụng<br /> trong quy trình xử lý tiêu bản để phân tích<br /> nhiễm sắc thể ở chi tảo lớn như Porphyra,<br /> Laminaria, Undaria [3, 7, 13, 21, 23, 24]. Tuy<br /> nhiên, nhược điểm khi sử dụng các phương<br /> pháp này là sự bắt màu với thuốc nhuộm yếu,<br /> mức độ tương phản giữa nhân và tế bào chất<br /> thấp, quy trình phức tạp.<br /> 60<br /> <br /> Khác với các loại thuốc nhuộm nói trên, sự<br /> tương tác của 4’, 6-diamidino-2-phenylindole<br /> (DAPI) với DNA và polydeoxynucleotide đã<br /> được nghiên cứu ngay khi chất này được Dann<br /> et al. (1971) [5] tổng hợp nhân tạo. Hiện nay,<br /> DAPI được coi là chất gắn đặc hiệu DNA ở<br /> vùng giàu A-T, tạo thành phức hợp huỳnh<br /> quang. Khi phức hợp này được kích thích bằng<br /> ánh sáng UV có bước sóng 365 nm, phức hợp<br /> DNA-DAPI phát huỳnh quang ánh sáng xanh ở<br /> bước sóng 390 nm hoặc lớn hơn. Còn các phần<br /> không liên kết với DAPI hoặc liên kết yếu có<br /> thể phát ánh sáng màu vàng yếu. Vì vậy, DAPI<br /> được sử dụng như một đầu dò hóa học để xác<br /> định hàm lượng DNA ở tảo [2, 14]. Bên cạnh<br /> đó, cũng có một số công bố đã sử dụng chất này<br /> để quan sát nhiễm sắc thể của tảo [15, 18, 22].<br /> Điện di xung điện trường (Pulsed- field gel<br /> electrophoresis-PFGE) được xem là phương<br /> <br /> Hoang Thi Lan Anh et al.<br /> <br /> pháp hiệu quả trong việc phân tách nhiễm sắc<br /> thể và xác định kích thước hệ gen. Nó cũng<br /> được coi là công cụ quan trọng trong các nghiên<br /> cứu về di truyền và phân tử, đặc biệt ở những<br /> sinh vật nhân chuẩn bậc thấp [4]. Trên tảo, kĩ<br /> thuật PFGE đã được áp dụng thành công để<br /> phân tách nhiễm sắc thể ở các chi<br /> Thraustochytrium [1], Pavlova, Diacronema<br /> (Haptophyta) [17]. Các gen mã hóa cho các<br /> enzyme chính của quá trình tổng hợp axít béo<br /> có thể được nhận dạng từ các nhiễm sắc thể<br /> được phân tách bằng phương pháp PFGE.<br /> Các chi vi tảo được phân tích karyotype cho<br /> đến nay hầu hết thuộc về nhóm tảo lớn<br /> (macroalgae/seaweed). Mặc dù các nghiên cứu<br /> trên nhóm vi tảo lại rất hạn chế, phải kể đến<br /> công bố của Dzhambazov et al. (2003) [6] và<br /> Muravenko et al. (2001) [16] ở một số loài<br /> thuộc chi Scenedesmus, Cyanidium và<br /> Galdieria.<br /> Chi Schizochytrium được xếp vào giới<br /> Chromista,<br /> ngành<br /> Labyrinthulomycota<br /> (Heterokontophyta), lớp Labyrinthulea, bộ<br /> Labyrinthulida, họ Thraustochytridae. Các loài<br /> thuộc chi này là những sinh vật có kiểu sống dị<br /> dưỡng và được phân lập từ nhiều vùng sinh thái<br /> khác nhau: vùng cửa sông, đáy biển sâu hoặc<br /> những nơi nước đọng [20]. Hàm lượng lipid (có<br /> thể chiếm trên 77% sinh khối khô- SKK) và<br /> hàm lượng acid béo không bão hòa đa nối đôi<br /> (polyunsaturated fatty acids-PUFA) đặc biệt là<br /> DHA (acid docosahexaenoic; C22:6 ω-3) cao<br /> (chiếm trên 50% so với acid béo tổng số) nên<br /> đây là một trong những nguồn sản xuất DHA<br /> đầy triển vọng. Cho đến nay, sinh khối vi tảo<br /> này đã được sử dụng làm thức ăn cho động vật,<br /> thực phẩm chức năng cho người và làm nguyên<br /> liệu sản xuất nhiều chất có hoạt tính sinh học có<br /> giá trị (-3 PUFA, squalene, polysaccharide và<br /> các enzyme ngoại bào) [8, 19].<br /> Schizochytrium mangrovei PQ6 được phân<br /> lập ở huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ 20062008. Chủng tảo này có khả năng sinh trưởng<br /> và phát triển trong một biên độ rộng về nhiệt độ,<br /> độ mặn và pH. Dưới điều kiện nuôi cấy tối ưu,<br /> chủng này có khả năng sản xuất 40 g sinh khối<br /> khô/L, hàm lượng lipid tổng số chiếm trên 70%<br /> khối lượng khô và DHA chiếm đến 40% so với<br /> <br /> tổng số acid béo. Ở Việt Nam, sinh khối tảo này<br /> đã được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, sản<br /> xuất thực phẩm chức năng và biodiesel [10, 11,<br /> 12]. Hiện nay, chủng PQ6 đang được giải mã<br /> toàn bộ hệ gen. Mặc dù vậy, cũng như nhiều<br /> loài vi tảo biển khác thuộc chi Schizochytrium,<br /> cho đến nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam<br /> vẫn chưa có bất kỳ một công bố nào đề cập đến<br /> việc phân tích karyotype của loài S. mangrovei.<br /> Trong bài báo này chúng tôi đưa ra những kết<br /> quả ban đầu về việc xác định karyotype của<br /> chủng PQ6 dựa trên việc quan sát tiêu bản<br /> nhiễm sắc thể ở metaphase và kỹ thuật PFGE<br /> được sử dụng để xác định số lượng nhiễm sắc<br /> thể. Các kết quả thu được có thể sẽ giúp ích cho<br /> việc sắp xếp và chú giải hệ gen của loài vi tảo<br /> này trong thời gian tới.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy<br /> Chủng S. mangrovei PQ6 được phân lập<br /> thành công từ huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên<br /> Giang từ 2006-2008 do phòng Công nghệ Tảo<br /> (Viện Công nghệ sinh học) cung cấp. Tảo được<br /> giữ trên đĩa môi trường GPY theo công bố của<br /> Hong et al. (2011) [11]. Một khuẩn lạc sạch trên<br /> đĩa môi trường GPY được lấy ra và cấy vào<br /> bình tam giác 250 mL chứa 150 mL môi trường<br /> M1 gồm 3% glucose, 1% cao nấm men và 17,5<br /> g/L muối biển nhân tạo (có hàm lượng NaCl là<br /> 1,5%). Bình nuôi tảo được lắc ở nhiệt độ 28C,<br /> tốc độ 200 vòng/phút (v/p).<br /> Chuẩn bị tiêu bản nhiễm sắc thể<br /> Quy trình chuẩn bị nhiễm sắc thể của chủng<br /> PQ6 được tiến hành theo mô tả của Liu et al.<br /> (2012) [15] có một số cải tiến cho phù hợp với<br /> điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam. Hút 0,5<br /> mL dịch nuôi tảo cho vào ống eppendoft 1,5<br /> mL. Ly tâm thu sinh khối ở 12.000 v/p trong 30<br /> giây và rửa nước cất 2 lần. Hòa tan tế bào trong<br /> 400 mL dung dịch colchicine 0,1%, để yên ở<br /> 16oC trong 1 giờ. Sau đó, ly tâm ở 12.000 v/p<br /> trong 2 phút và loại dịch trên, thu cặn tế bào và<br /> rửa lại bằng nước cất. Bổ sung 1 mL dung dịch<br /> Cannoy (100% ethanol: acid acetic, 3:1, v/v),<br /> mix đều mẫu và giữ ở 4oC trong 48 h. Ly tâm<br /> thu cặn ở 12.000 v/p trong 1 phút, cặn được rửa<br /> lại bằng nước cất 2 lần. Cặn tế bào được bổ<br /> 61<br /> <br /> Phân tích karyotype của loài vi tảo<br /> <br /> sung hỗn hợp enzyme gồm cellulase:<br /> macerozyme R-10 và pectinase (2:1:2, v/v/v) và<br /> ủ mẫu ở 37oC trong 24 giờ. Bổ sung thêm 70%<br /> ethanol lên 1,5 mL, mix đều và ly tâm ở 12.000<br /> v/p trong 2 phút. Lặp lại bước rửa bằng 70%<br /> ethanol thêm 2 lần. Loại bỏ hết ethanol, bổ sung<br /> 50 µL acid acetic 100% và mix đều mẫu. Dùng<br /> pipet hút khoảng 20 µL mẫu nhỏ lên lam kính<br /> sạch từ độ cao khoảng 30 cm nhằm cho mẫu<br /> dàn chải đều thành một lớp mỏng trên lam kính,<br /> đợi cho đến khi tiêu bản khô. Nhỏ 1 giọt thuốc<br /> nhuộm DAPI lên bề mặt mẫu, ủ tối khoảng 2-5<br /> phút, đặt lamen lên trên và quan sát dưới kính<br /> hiển vi huỳnh quang Leica DM4000 B Led<br /> (Đức) với bước sóng kích thích 360 nm sử dụng<br /> vật kính 100 X. Chiều dài của nhiễm sắc thể<br /> được tính toán dựa vào phần mềm Adole<br /> Photoshop CS6 Extended.<br /> Tách chiết DNA nhiễm sắc thể toàn vẹn<br /> DNA nhiễm sắc thể toàn vẹn được thực hiện<br /> theo mô tả của Anbu et al. (2007) [1] với một số<br /> thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí<br /> nghiệm Việt Nam. Sau khi nuôi cấy, các tế bào<br /> được ly tâm thu sinh khối ở 12.000 v/p trong 2<br /> phút. Sinh khối tảo sau đó được rửa 2 lần với<br /> 500 L EDTA 0,05M và ly tâm ở 12.000 v/p<br /> trong 2 phút để thu tế bào. Lượng sinh khối tảo<br /> được sử dụng với khối lượng khác nhau từ 0,5;<br /> 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 và 7,0 mg. Đối với<br /> mỗi ống eppendorf chứa lượng sinh khối tảo<br /> khác nhau được bổ sung thêm 100 L dung dịch<br /> SLB (3 mg/L lyticase; 5% β-mercaptoethanol;<br /> 1M sorbitol; 0,1 M sodium citrate; 0,05 M<br /> EDTA-pH 8,0) và 200 L EDTA 0,05M. Hỗn<br /> hợp này sau đó được trộn đều với một lượng thể<br /> tích tương đương 1% SeaKem Gold Agarose<br /> (dùng cho PFGE, Mỹ) pha trong đệm TE ở<br /> 55oC và nhỏ vào các plug. Các plug được để<br /> yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau khi<br /> đông hoàn toàn, các plug được chuyển vào các<br /> ống eppendorf 2,0 mL. Các ống này được bổ<br /> sung thêm 1 mL dung dịch phủ trên (0,45 M<br /> Tris buffer pH 8,0; 0,05M EDTA; 5% βmercaptoethanol) và ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sau<br /> khi ủ, nhẹ nhàng đổ lớp dịch phía trên và rửa<br /> plug bằng 1 mL đệm TE 1X ở nhiệt độ phòng.<br /> Tiếp tục bổ sung 1 mL dung dịch PR (0,4M<br /> EDTA; 1% sarkosyl; 1 mg/mL proteinase K;<br /> 62<br /> <br /> 1 mg/mL RNase A), ủ ở 37oC trong 15 phút.<br /> Sau đó loại bỏ dung dịch PR. Lặp lại bước rửa ở<br /> trên thêm 2 lần nữa. Cuối cùng, bổ sung 1 mL<br /> đệm TE vào ống chứa plug và bảo quản ở 4oC.<br /> Điều kiện chạy điện di PFGE<br /> Khuôn điện di được chuẩn bị với 1%<br /> SeaKem Gold Agarose pha trong đệm TBE<br /> 0,25X. Sau khi bản gel đông hoàn toàn, các<br /> plug được cắt với chiều rộng khoảng 2 mm, đặt<br /> vào các giếng của bản gel. Quá trình điện di<br /> được thực hiện trên hệ thống máy của Biorad<br /> (Hoa Kỳ) với điều kiện chạy như sau: thời gian<br /> ban đầu (initial time)- 2,2s; thời gian cuối cùng<br /> (final time)-54,2 giây; 6 V; góc 120o sử dụng<br /> đệm TBE 0,25 X trong 22, 27 và 31 giờ. Sau<br /> quá trình điện di, bản gel được nhuộm với<br /> ethidium bromide trong 30 phút và rửa bằng<br /> nước cất sau khi nhuộm trong 20 phút.<br /> Bản gel sau đó được chụp ảnh bằng máy<br /> chụp ảnh gel U: Genius (Anh). Kích thước của<br /> một số nhiễm sắc thể nhỏ được tính toán dựa<br /> trên kích thước nhiễm sắc thể của chủng nấm<br /> men Saccharomyces cerevisiae (chủng YPH80,<br /> Yeast chromosome PFG Marker, Biorad,<br /> Hoa Kỳ).<br /> Hình ảnh điện di chạy PFGE thu được sẽ<br /> được phân tích mật độ quang (densitometry) sử<br /> dụng phần mềm GelAnalyzer 2010a nhằm khẳng<br /> định số băng điện di thu được dựa trên các đỉnh<br /> pick xuất hiện; kiểm tra khả năng chồng pick<br /> theo phân bố của mật độ hay tương ứng với các<br /> băng điện di có sự chồng lên nhau của các nhiễm<br /> sắc thể tương đồng hay không. Kết quả thu được<br /> sẽ cho biết có hay không sự trùng lặp (hay tương<br /> đồng) các băng nhiễm sắc thể.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Phân tích karyotype của chủng PQ6 dựa trên<br /> tiêu bản nhiễm sắc thể<br /> Kết quả quan sát và phân tích tiêu bản<br /> nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi huỳnh quang đã<br /> cho thấy, số lượng nhiễm sắc thể của S.<br /> mangrovei PQ6 là n=3 với tần xuất bắt gặp trên<br /> 85% so với tổng số các tiêu bản nhiễm sắc thể<br /> đã chuẩn bị. Các nhiễm sắc thể của chủng PQ6<br /> dạng chấm (dot-like) có kích thước dao động từ<br /> 1,05 đến 1,50 m, do đó có thể coi là các nhiễm<br /> sắc thể có kích thước nhỏ (hình 1).<br /> <br /> Hoang Thi Lan Anh et al.<br /> <br /> Hình 1. Nhiễm sắc thể của S. mangrovei PQ6 ở metaphase khi được nhuộm với DAPI<br /> Bảng 1. Kích thước các nhiễm sắc thể ở loài vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6<br /> Nhiễm sắc thể<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> <br /> Tuyệt đối (m)<br /> (Absolute length)<br /> 1,50±0,06<br /> 1,18±0,14<br /> 1,05±0,18<br /> <br /> Chiều dài nhiễm sắc thể<br /> Tương đối (% chiều dài tổng số nhiễm sắc<br /> thể (Relative length)<br /> 40,21<br /> 31,64<br /> 28,15<br /> <br /> Sự khác biệt về chiều dài tuyệt đối (absolute<br /> length) giữa các nhiễm sắc thể không đáng kể,<br /> trong khi đó, chiều dài tương đối lại rất khác<br /> biệt nên có thể xếp chúng trong cùng một nhóm<br /> (bảng 1). Ở đây, chúng tôi không quan sát thấy<br /> vị trí tâm động của nhiễm sắc thể. Điều này<br /> cũng xảy ra tương tự khi Muravenko et al.<br /> (2010) [16] quan sát nhiễm sắc thể của một số<br /> loài vi tảo thuộc chi Galdieria.<br /> Hình ảnh nhiễm sắc thể của chủng PQ6 thu<br /> được rõ ràng, không bị nhiễu đã khẳng định quy<br /> trình chuẩn bị tiêu bản nhiễm sắc thể và quá<br /> trình nhuộm với DAPI hoàn toàn phù hợp cho<br /> việc phân tích karyotype của loài vi tảo này.<br /> Việc sử dụng hỗn hợp enzyme cellulase:<br /> macerozyme R-10 và pectinase (2:1:2, v/v/v) có<br /> tác dụng phá thành tế bào, giúp thuốc nhuộm<br /> thấm tốt, vì vậy, việc quan sát và thu nhận hình<br /> ảnh sẽ được cải thiện.<br /> Phân tách nhiễm sắc thể của chủng PQ6<br /> bằng PFGE<br /> <br /> DNA nhiễm sắc thể toàn vẹn được tách<br /> chiết từ lượng sinh khối chủng PQ6 khác nhau<br /> và được phân tách bằng PFGE. Để tìm được<br /> điều kiện phân tách băng tốt nhất, chúng tôi đã<br /> thay đổi thời gian chạy điện di và lượng sinh<br /> khối tảo dùng để tách chiết DNA nhiễm sắc thể.<br /> Sự phân tách nhiễm sắc thể tốt đã thu được khi<br /> sinh khối tế bào tảo tăng ở loài S. mamgrovei<br /> PQ6. Kết quả được chỉ ra trên hình 2A cũng cho<br /> thấy, phân tách tốt nhất khi lượng sinh khối tảo<br /> sử dụng để tách DNA nhiễm sắc thể trong<br /> khoảng từ 4,0-7,0 mg. Khi lượng sinh khối tảo<br /> sử dụng dưới 4 mg, băng nhiễm sắc thể nhỏ<br /> nhất (có kích thước khoảng 345 kb) không xuất<br /> hiện hoặc xuất hiện rất mờ.<br /> Khi tối ưu về thời gian điện di, chúng tôi<br /> nhận thấy với 31 giờ (hình 2D) chạy điện di đã<br /> cho việc phân tách băng tốt nhất. Với thời gian<br /> điện di dưới 22 giờ (hình 2B) và 27 giờ (hình<br /> 2C) chỉ tách được 3/4 băng.<br /> Kết quả nghiên cứu về điều kiện thích hợp<br /> 63<br /> <br /> Phân tích karyotype của loài vi tảo<br /> <br /> nhất cho chạy PFGE ở chủng PQ6 đã cho thấy<br /> các nhiễm sắc thể được phân tách tốt nhất ở<br /> điều kiện chạy điện di với thời gian ban đầu<br /> (initial time): 2,2s; thời gian cuối cùng 54,2<br /> giây; 6 V; góc 120o, sử dụng 1% SeaKem Gold<br /> <br /> Agarose với đệm TBE 0,25 X trong 31 giờ.<br /> Tổng số 4 băng gồm các băng nhiễm sắc thể lớn<br /> và nhỏ đều được tách dưới điều kiện này<br /> (hình 2D).<br /> <br /> Hình 2. Ảnh điện di đồ phân tách nhiễm<br /> sắc thể của S. mangrovei PQ6<br /> <br /> A<br /> 1600 kb<br /> <br /> A: Sau 22 giờ chạy điện di PFGE: Giếng M:<br /> Yeast chromosome PFG Marker; Giếng 1-8:<br /> lượng sinh khối tảo sử dụng để tách DNA<br /> nhiễm sắc thể tương ứng là 0,5; 1,0; 2,0; 3,0;<br /> 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 mg.<br /> <br /> 345 kb<br /> <br /> M 1 2 3 4 M<br /> <br /> B, C, D: Sau 22 giờ, 27 giờ và 31 giờ chạy<br /> điện di PFGE, tương ứng: Giếng M: Yeast<br /> chromosome PFG Marker; Giếng 1-3: lượng<br /> sinh khối tảo sử dụng để tách DNA nhiễm sắc<br /> thể tương ứng là 5,0; 6,0; 7,0 mg.<br /> <br /> 5 6 7 8<br /> <br /> Ch p l n 2<br /> <br /> C<br /> <br /> B<br /> <br /> D<br /> <br /> 1600 kb<br /> <br /> 1600 kb<br /> <br /> 345 kb<br /> <br /> 345 kb<br /> <br /> M<br /> <br /> 1 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3 M<br /> <br /> Bảng 2. Kích thước phân tử DNA nhiễm sắc thể của chủng PQ6<br /> Nhiễm sắc thể<br /> Kích thước<br /> Số I<br /> Số II<br /> (kb)<br /> -<br /> <br /> 1600 kb<br /> <br /> 345 kb<br /> <br /> 1<br /> <br /> Số III<br /> 1600<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> M<br /> <br /> Số IV<br /> 345<br /> <br /> (-). chưa xác định.<br /> <br /> Về nguyên tắc, kích thước của nhiễm sắc<br /> thể được ước tính trên bản điện di PFGE với<br /> khoảng cách các băng nhiễm sắc thể chạy tỷ lệ<br /> thuận với logarit của khối lượng phân tử của các<br /> kích thước chuẩn. Trong điều kiện thí nghiệm<br /> của chúng tôi, kích thước các nhiễm sắc thể<br /> được xác định dựa trên thang kích thước nhiễm<br /> sắc thể chuẩn của Saccharomyces cerevisiae<br /> (bảng 2, hình 2A, B, C và D). Trong số 4 băng<br /> 64<br /> <br /> phân tách được, chúng tôi mới chỉ xác định<br /> được kích thước của 2 băng khoảng 345 và<br /> 1600 kb. Hai băng còn lại nằm ngoài kích thước<br /> băng cao nhất của marker.<br /> Ngoài ra, theo kết quả giải trình tự hệ gen<br /> và tính toán kích thước hệ gen của chủng PQ6<br /> bằng phương pháp flow cytometry (kết quả chi<br /> tiết không chỉ ra ở đây) cũng đã khẳng định<br /> <br />