Phát hiện hMAM mRNA từ các tế bào ung thư vú bằng kỹ thuật RT-PCR và RT-Realtime PCR

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ung thư vú là loại ung thư rất thường gặp ở phụ nữ, việc chẩn đoán và điều trị sớm ung thư vú sẽ góp phần giảm tỷ lệ tái phát và tỷ lệ tử vong cho người bệnh. Bài viết trình bày việc phát hiện hMAM mRNA ở máu và mô bệnh nhân ung thư vú; Tìm mối liên quan giữa sự biểu hiện của hMAM mRNA và một số yếu tố khác trong bệnh ung thư vú.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện hMAM mRNA từ các tế bào ung thư vú bằng kỹ thuật RT-PCR và RT-Realtime PCR

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020 (20,01%) và huyện Càng Long (19,99%). Bởi vì khuẩn ruột khác (58,62%); Ỉa chảy, viêm dạ BVSNTV đóng trên địa bàn thành phố Trà Vinh dày, ruột non có nguồn gốc nhiễm khuẩn và gần huyện Càng Long nên số lượng bệnh (34,94%) là hai bệnh chủ yếu. nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện nhiều. - Tỷ lệ trẻ nam nhập viện điều trị là 58,99%, Điều này cho thấy người dân ở hai khu vực này tỷ lệ trẻ nữ nhập viện điều trị là 41,01%. ý thức được vai trò quan trọng của việc phòng - Tỷ lệ trẻ mắc bệnh theo nhóm tuổi chiếm bệnh cho trẻ, công tác truyền thông giáo dục đa số từ 1 đến 5 tuổi là 41,79%. sức khỏe cho trẻ được các bậc phụ huynh quan - Tỷ lệ trẻ nhập viện điều trị chủ yếu tập tâm sâu sắc. trung chủ yếu ở hai khu vực là: TP. Trà Vinh (20,01%) và huyện Càng Long (19,99%). V. KẾT LUẬN - Ba nhóm bệnh chủ yếu thường gặp ở trẻ TÀI LIỆU THAM KHẢO dưới 5 tuổi tại BVSNTV là: bệnh hệ hô hấp 1. Bộ Y tế. Bảng phân loại Quốc tế bệnh tật Việt Anh (56,61%), bệnh hệ tiêu hóa (9,97%), bệnh lần thứ 10 (ICD10), nhà xuất bản Y học, 2001. 2. Huỳnh Thuận và cộng sự (2014). Mô hình nhiễm khuẩn và ký sinh vật (9,95%). bệnh tật tại Bệnh viện Nhi Qủang Nam trong 5 - Nhóm bệnh hô hấp chủ yếu là: Viêm cấp năm (2009 – 2013). đường hô hấp trên khác (46,82%), viêm họng và 3. Trương Thị Mai Hồng, Lê Thanh Hải, Phạm viêm amidan cấp 39,37%), viêm phế quản và viêm Ngọc Toàn, Đỗ Quang Vỹ, Lê Thị Dung. (2012). Mô hình bệnh tật tại Khoa cấp cứu, bệnh tiểu phế quản cấp (9,40%) là ba bệnh chủ yếu. viện Nhi Trung ương 2011. - Nhóm bệnh đường tiêu hóa chủ yếu là: Viêm 4. Nguyễn Đình Thoại, Lê Văn Dũng (2005). dạ dày và tá tràng (5,62%), Bệnh khác của ruột Tình hình bệnh tật và tử vong tại Bệnh viện Nhi non và màng bụng (3,76%) là hai bệnh chủ yếu. Quảng Nam trong 9 tháng (1/2004 – 10/2004). 5. Nguyễn Thị Xuân Hương, Hoàng Thị Huế - Nhóm bệnh đường tiết niệu sinh dục chủ (2011). Tình hình bệnh tật và tử vong so sinh tại yếu là: Tổn thương viêm khác của các cơ quan bệnh viện tại khoa Nhi bệnh viện đa khoa trung khung chậu nữ (33,55%), rối loạn kinh nguyệt ương Thái Nguyên trong 3 năm (2008-2010). (17,08%), tổn thương không viêm của buồng 6. Võ Phương Khanh, Trịnh Hữu Tùng, Thái Thanh Tùng. Mô hình bệnh tật tại Bệnh viện Nhi trứng, vòi fallope và dây chằng rộng (13,20%) là Đồng 2 (2005 – 2007). 3 bệnh chủ yếu. 7. Lawn JE (2004) "Why are 4 million dying each - Nhóm bệnh nhiễm khuẩn: Các bệnh nhiễm year", The lancet, vol 364. PHÁT HIỆN hMAM mRNA TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR VÀ RT-REALTIME PCR Nguyễn Minh Hiền* TÓM TẮT UTV. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu trên mẫu máu của 33 bệnh nhân được chẩn đoán xác định 43 Ung thư vú (UTV) là loại ung thư rất thường gặp ở là ung thư vú, 10 người khỏe mạnh tự nguyên tham phụ nữ, việc chẩn đoán và điều trị sớm UTV sẽ góp gia vào nhóm nghiên cứu. Sử dụng kỹ thuật Real time phần giảm tỷ lệ tái phát và tỷ lệ tử vong cho người RT-PCR, giải trình tự gen, để phát hiện hMAM mRNA bệnh. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã từ dòng tế bào ung thư vú, mô ung thư vú và các tế chứng minh được các tế bào ung thư có nguồn gốc từ bào ung thư vú trong máu. Kết quả: Tỷ lệ phát hiện khối u xâm nhập và di chuyển rất sớm vào máu ngoại hMAM trong máu là 19/33 (57,57%), ngưỡng phát vi gọi là tế bào ung thư di chuyển (CTC). Phát hiện hiện được hMAM là 40 đến 2.105 bản copies/ml máu. các gen đăc hiệu từ CTCs có thể hữu ích trong sàng Không thấy biểu hiện của hMAM trong máu người lọc, tiên lượng, theo dõi sau điều trị. Mục tiêu của khỏe mạnh (0/10). Tỷ lệ biểu hiện của gene này có nghiên cứu này là: Phát hiện hMAM mRNA trong máu liên quan đến kích thước u, di căn cũng như giai đoạn bệnh nhân UTV, tìm mối liên quan giữa sự biểu hiện bệnh với (p
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020 the diagnosis and the therapy of early stage tumors cứu với mục tiêu: have the potential to decrease morbidity and mortality 1.Phát hiện hMAM mRNA ở máu và mô bệnh rate of patients with breast cancer. In recent years, scientist have demonstrated that the cancer cells nhân UTV. derived from tumor infiltrating and moving in peripheral 2.Tìm mối liên quan giữa sự biểu hiện của blood from a very early stage known as Circulating hMAM mRNA và một số yếu tố khác trong bệnh Tumor Cell (CTC). The detection sensitive genes from UTV. CTCs may prove useful for screening, prognostication, monitoring of response to therapy. The goal of this II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU study: Detection hMAM mRNA in peripheral blood of 1. Đối tượng nghiên cứu: breast cancer patients, correlation between the + Mẫu bệnh: 33 Mẫu máu và 30 mẫu mô của expression of hMAM mRN and some other factors in that. Patients and methods: Blood sample obtained bệnh nhân UTV ở giai đoạn I, II, III, IV đã được from 33 breast cancer patients, 10 healthy volunteers. chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học. Giai đoạn Using Real-time RT-PCR, gene sequencing techniques I: 05 bệnh nhân. Giai đoạn II: 16 bệnh nhân. to discover hMAM gene in breast cancer cell lines, Giai đoạn III và IV: 12 bệnh nhân. Các bệnh cancer tissues and in CTCs. Results: Detection rates nhân được làm các xét nghiệm hoá sinh, huyết hMAM mRNA are 19/33 (57,57%) in blood, the investigated range from 40 to 2.105 copies/ml blood, học, X- quang, giải phẫu bệnh… tại Bệnh viện K non expression of hMAM in healthy human blood trung ương. Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một (0/10). The expression rate of two genes related to khối u hay ung thư một cơ quan nào khác ngoài tumor size, metastasis and stage of disease (p
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020 Tên primer Trình tự Tm KT (bp) GAPDH F 5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’ 65.3 307 GAPDH R 5’- AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’ 67 hMAM F1 5’- GAA GTT GCT GAT GGT CCT CAT GCT GGC-3’ 71.3 326 hMAM R1 5’- CTC ACC ATA CCC TGC AGT TCT GTG AGC-3’ 71.3 hMAM F 2 5’- CTC CCA GCA CTG CTA CGC AGG CTC-3’ 72.1 203 hMAM R2 5’- CAC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC ATC CG-3’ 70.4 - Diện di sản phẩm PCR thu được trên agarose không đạt. Sau khi kiểm tra chất lượng các mẫu 0,8%. nghiên cứu bằng mồi GAPDH, chúng tôi tiến - Giải trình tự một số mẫu dương tính so sánh hành PCR các mẫu với mồi hMAM. với trình tự hMAM ở ngân hàng gene. - Kết quả hMAM trong nhóm nghiên cứu - Real-time- PCR. Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR bằng dòng tế bào UTV BT474 Phản ứng real-time PCR với primer hMAM xác định số bản sao các mẫu UTV (quy 203 trình kit real-time PCR sử dụng SYBR Green trên bp máy Light Cycler® của hãng Roche). 250 bp *Quy trình được áp dụng cho dòng tế bào UTV, sau khi xác định được độ nhậy sẽ áp dụng trong đối tượng nghiên cứu. Hình2: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR - Dòng tế bào: Sử dụng 3 dòng tế bào: MCF- với mồi hMAM 7, BT474, KPL4, MDA-MB23-1. Từ 1-6 mô UTV (BN mã số 2,3,4,5,7,8), từ 7- 2.2 Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang. 12 máu UTV (BN mã 2,3,4,5,7,8); 13: dòng TB Kết quả thu được được xử lý trên hệ thống máy MCF7; 14: dòng TB KPL4; 15: dòng TB BT474, tính bằng các thuật toán y sinh học: Sử dụng Chi- 16 dòng TB MDA-MB 23-1, Marker 1000bp Square, Fishers exact test để so sánh các tỷ lệ. Nhận xét: Trên kết quả điện di những giếng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU có băng rõ nét kích thước tương đương với kích 1. Phát hiện hMAM trong nhóm nghiên cứu: thước 203bp là những sản phẩm dương tính. Các Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA trong giếng vị trí từ 1đến 6 là sản phẩm RT-PCR của nhóm nghiên cứu mẫu mô ung thư có kết quả dương tính với gene hMAM. Vị trí số 7 là hình ảnh RT-PCR mẫu máu của bệnh nhân ung thư vú âm tính, không có băng kích thước tương đương 203bp. Các giếng từ số 8 đến số 12 là kết quả điện di sẩn phẩm 250 bp RT-PCR mẫu máu bệnh nhân UTV, thể hiện các 307 băng rõ nét kích thước giống các băng ở mẫu bp mô UTV dương tính. Các giếng 13,14,15,16 là vị P trí của dòng tế bào UTV, chúng tôi nhận thấy dòng tế bào MCF7, KPL4, BT474 có biểu hiện Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR hMAM mRNA dương tính các băng rõ nét kích với mồi GAPDH thước đồng nhất 203bp. Dòng TB MDA-MB có 1,2,3: mẫu máu BN UTV; 4,5,6 mẫu mô BN biểu hiện âm tính. UTV; 7,8,9 mẫu máu khỏe mạnh; 10: nước cất, p - Kết quả Real-time PCR khuyếch đại hMAM 11: dòng tế bào MCF7; M: Marker 1000bp Nhận xét: Sau khi tách RNA, sử dụng kỹ thuật RT-PCR tạo cDNA chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhân bản mồi GAPDH là gene nội chuẩn. Các mẫu dương tính có các băng rõ nét kích thước là 307bp. Tất cả các mẫu NC đều dương tính khi kiểm tra bằng GAPDH điều này chứng tỏ chất lượng mRNA và quá trình tạo cDNA đáp ứng các điều kiện cần thiết cho thí nghiệm xác định gene nghiên cứu, loại trừ các trường hợp âm tính giả do chất lượng cDNA Hình 3: Kết quả Real-time PCR nhân bản 167
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020 mồi hMAm trong máu BN UTV bạch cầu, tách RNA, RT-PCR được thực hiện như + Xây dựng đường chuẩn dựa vào trộn vào mục 2.1 5ml máu bình thường tế bào BT474 ở các tỷ lệ + Ngưỡng phát hiện hMAM từ 40 bản 2x101; 2x102; 2x103; 2x104; 2x105 Quy trình tách copies/ml máu. - Tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA Mẫu bệnh phẩm n hMAMmRNA Tỷ lệ (%) Số bản sao (  ±SD) Máu UTV 33 19 57,57 50,7log4 ±11,6log5 Mô UTV 30 28 93,33 92,6log5±25,3log5 Máu khỏe mạnh 10 0 0 P=0,2 Tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA ở mô UTV cao hMAM mRNA liên quan đến giai đoạn bệnh hơn trong máu. Điều này phù hợp vì tế bào ung (p
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 2 - 2020 tốt, thông thường phải tách RNA trong vòng 4 kết quả nghiên cứu hMAM trên mô UTV khác. Tỷ giờ sau khi lấy máu. Mô UTV sau khi lấy được lệ biểu hiện gene UT trên mô cao là phù hợp vì bảo quản ở - 80oC cho đến khi tiến hành tách mô chứa rất nhiều tế bào UT. Nếu kỹ thuật tốt chiết. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân lấy đúng được tổ chức UT thì việc phát hiện hủy bởi các enzyme là các ribonuclease (RNase). gene UT ở mô UT là điều kiện lý tưởng. Việc Tách chiết RNA tổng số theo Rneasy Mini Kit của phát hiện hMAM trên mô UTV là một chứng hãng QIAGEN là phương pháp có hiệu quả, tách dương quan trọng để chúng tôi tìm sự biểu hiện được phân tử RNA có chất lượng cao. Sau khi hMAM trong các CTC. Việc phát hiện gene trên tách RNA tổng số thu được 30 µl, độ tinh sạch mô có nhiều hạn chế vì là thủ thuật không phải của phân tử RNA được xác định bằng các chỉ số lúc nào cũng thực hiện được nhất là trường hợp hấp thụ quang phổ, dựa trên tỷ lệ OD260/ OD280. khối u quá nhỏ hoặc không có biểu hiện bên Tỷ lệ OD260/ OD280 biểu thị mức độ protein còn ngoài, những trường hợp sau phẫu thuật, tổ sót lại trong dịch chiết. RNA được coi là tinh sạch chức u không còn giữ nguyên mốc giải phẫu khi giá trị OD260/ OD280 từ 1,8 đến 2,0. Tất cả các nữa, việc phát hiện gene trên mô UT rất khó mẫu tách RNA của chúng tôi phải đảm bảo sự thực hiện được. VÌ vậy việc phát hiện gene UT tinh sạch mới tiến hành bước kỹ thuật tổng hợp trong máu là hướng mới cho phát hiện UTV. cDNA tiếp theo. Quá trình tổng hợp cDNA dựa Trong số 33 mẫu máu của bệnh nhân UTV có 19 trên mẫu khuôn là RNA được thực hiện bởi mẫu phát hiện có sự sao chép hMAM mRNA enzym sao mã ngược thu được 20 µl cDNA. Sau chiếm 57,57%. Tỷ lệ này cao hơn nghiên cứu mỗi lần tổng hợp cDNA, chất lượng sản phẩm của Chen và Roceella. Chúng tôi cho rằng có thể cDNA được kiểm tra bằng phản ứng khuếch đại do cỡ mẫu chưa đủ lớn, mặt khác số lượng bệnh gene GAPDH với cặp mồi đặc hiệu. Gene GAPDH nhân UTV của Chen và Rocella rất nhiều ở giai hiện diện ở mọi tế bào của cơ thể và được xem đoạn 0 và1 trong khi các bệnh nhân trong là gene nội chuẩn và được sử dụng để kiểm tra nghiên cứu này chủ yếu ở giai đoạn 2,3 và 4 vì chất lượng của DNA hay cDNA. Sau phản ứng thế mà tỷ lệ biểu hiện hMam trong máu bệnh khuếch đại, nếu chất lượng cDNA không tốt, bị nhân UTV ở nghiên cứu này cao hơn. Trong hình đứt gãy hay tạp nhiễm thì băng điện di trên 2 giếng 1 là kết quả điện di sản phẩm mô UTV agarose sẽ mờ, bờ không đều, xuất hiện các của BN mã số 2, BN này ở giai đoạn I kích thước băng phụ. Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy băng mờ, giếng 7 là kết quả máu tương ứng, sản phẩm RT-PCR với mồi GADPH F/R thu được biểu hiện âm tính. Ở giếng 2 là kết quả mô UTV 1 băng sáng đậm có kích khoảng 307 bp phù của BN có kích thước u nhỏ hơn 2cm kết quả hợp kích thước theo tính toán thiết kế. Điều này băng điện di mờ, nhưng đây là bệnh nhân có di chứng tỏ chất lượng RNA và quá trình tạo cDNA căn hạch nên kết quả máu tương ứng lại là băng của chúng tôi đã thành công, cDNA được tạo ra điện di đậm. RT-PCR thường chỉ đánh giá sơ bộ đáp ứng các điều kiện cần thiết cho phản ứng BN có biểu hiện dương tính với hMAM nhưng PCR tiếp theo. chưa đánh giá mức độ biểu hiện của nó, vì vậy Trong nghiên cứu này mẫu đối chứng dương phải làm kỹ thuật Real-time PCR để đánh giá số là dòng tế bào UTV. Trong hình 2: Có ba trong bản sao hMAM trong máu. Ngưỡng phát hiện bốn dòng tế bào UTV biểu hiện hMAM dương hMAM mRNA trong máu là 40 bản copies/ ml tính. Điều này chứng tỏ hMAM là gene có tỷ lệ máu. Không có sự khác biệt về số bản sao hMAM biểu hiện cao trong dòng UTV. Tế bào MDA-MB ở máu và mô bệnh nhân UTV (p=0,02). Đây là 231 không biểu hiện hMAM. Trong nghiên cứu sự khẳng định chúng tôi đã nhân bản thành của S. Rocella thì hMAM biểu hiện ở ba trong số công hMAM mRNA từ các tế bào UTV lưu hành năm dòng UTV [5]. Điều này chứng tỏ gene trong máu. Điều này mở ra triển vọng có thể hMAM có thể biểu hiện ở các dòng TB ung thư ứng dụng phát hiện hMAM là một marker mới khác nhau. Mẫu đối chứng âm là 10 mẫu máu trong chẩn đoán UTV. Để tìm hiểu mối quan hệ của người tình nguyện khỏe mạnh, kết quả là của hMAM trong UTV chúng tôi tìm sự biểu hiện không có mẫu nào có biểu hiện của hMAM. Điều của hMAM gene với các yếu tố sinh học khác liên này phù hợp với nghiên cứu của Chen, Shen, quan đến UTV. Rocella, không thấy biểu hiện của hMAM trong Trong bệnh UTV kích thước u có ý nghĩa rất máu người khỏe mạnh. Từ năm 1996, Watson và quan trọng dó là cơ sở để chẩn đoán, tiên lượng Fleming đã coi hMAM là chỉ giới để phân biệt bệnh. Ở bệnh nhân có khối u dưới 2cm tỷ lệ người lành và UTV. Trong số 30 mẫu mô UTV thì 33,3%, khi kích thước u lớn hơn thì tỷ lệ biểu có 28 mẫu có biểu hiện của hMAM chiếm tỷ lệ hiện hMAM cũng cao hơn 100% ở trường hợp có 93,33%. Kết quả này cũng gần tương đương với khối u lớn hơn 5cm. Khi khối u càng lớn dinh 169
vietnam medical journal n02 - MARCH - 2020 dưỡng tại khối u giảm các tế bào UT có xu nhà lâm sàng một chỉ điểm u góp phần trong hướng tách ra khỏi tổ chức nguyên phát vào chương trình phòng chống ung thư vú. trong máu, vì vậy có thể khối u càng lớn lượng tế bào UT vào máu càng nhiều khả năng phát V. KẾT LUẬN hiện gene UT càng cao. Tỷ lệ biểu hiện của 1. Bước đầu đã xác định được hMAM mRNA ở hMAM không những liên quan đến kích thước u dòng tế bào UTV, mô UTV và tế bào ung thư vú mà còn liên quan đến di căn hạch và di căn xa trong máu. Tỷ lệ biểu hiện của hMAM mRNA ở (p