Phát hiện nhanh một số corticoid pha trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng kĩ thuật khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> PHÁT HIỆN NHANH MỘT SỐ CORTICOID PHA TRỘN TRÁI PHÉP<br /> TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG KĨ THUẬT KHỐI PHỔ<br /> VỚI CHẾ ĐỘ TIÊM MẪU TRỰC TIẾP<br /> Nguyễn Quang Nam*, Trần Hùng**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát điều kiện và khả năng phát hiện một số corticoid phổ biến pha trộn trái phép<br /> trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp.<br /> Đối tượng: Chất chuẩn corticoid chuẩn được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM. Các mẫu<br /> thuốc đông dược được thu mua tại các nhà thuốc hay mua bán trôi nổi trên địa bàn TPHCM.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng bài thuốc giả lập từ đó khảo sát, xây dựng qui trình chiết các<br /> corticoid được pha trộn. Tối ưu hóa điều kiện vận hành thiết bị khối phổ Quatromicro API ở cả 2 chế độ ghi nhận<br /> ESI+ và ESI- từ đó xác định điều kiện chung áp dụng cho định tính phát hiện các corticoid sử dụng trong nghiên<br /> cứu. Khảo sát mẫu có pha trộn trái phép corticoid dựa trên sự so sánh với phổ corticoid chuẩn.<br /> Kết quả: Đã tìm được phương pháp xử lý mẫu để chiết các corticoid từ công thức giả lập. Đã chọn được<br /> điều kiện phân tích khối phổ, xác định ion mẹ cũng như các ion phân mảnh để phát hiện các corticoid pha trộn<br /> trong mẫu giả lập cũng như trong mẫu thử. Đã tìm được giới hạn phát hiện của từng corticoid trong mẫu chuẩn<br /> cũng như trong mẫu giả lập thêm chuẩn. Đã ứng dụng quy trình phân tích để phát hiện các corticoid trong các<br /> mẫu thuốc đông dược trên thị trường. Kết quả trong 24 mẫu phân tích, phát hiện có 18 mẫu pha trộn trái phép<br /> corticoid.<br /> Kết luận: từ những kết quả đạt được cho thấy phương pháp phổ khối với chế độ tiêm mẫu trực tiếp là một<br /> phương pháp hữu dụng, đơn giản và đáng tin cậy trong việc xác định các chất pha trộn trái phép trong các chế<br /> phẩm thuốc đông dược.<br /> Từ khóa: tiêm mẫu trực tiếp, corticoid, chế phẩm đông dược, khối phổ.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> RAPID DETERMINATION OF CORTICOID ADULTERANTS IN HERBAL MEDICINES USING<br /> ELECTROSPRAY IONIZATION MASS SPECTROMETRY – DIRECT INJECTION MODE<br /> Nguyen Quang Nam, Tran Hung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 633 - 641<br /> Objective: Investigation of optimum MS conditions and screening ability to detect some common corticoid<br /> adulterants in herbal medicines by using mass spectrometry with direct injection mode.<br /> Subjects: Authenticated standards of dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone,<br /> hydrocortisone acetat, dexamethasone acetate were purchased from Drug Quality Control Institute at HCM city.<br /> Herbal medicines were purchased in oriental drugstores or float market.<br /> Method: Establishing a simulation formulas for development of an extraction method to analyze some<br /> corticoids adulterant and invetigation of optimum MS conditions for detecting corticoids in herbal medicines.<br /> The Quatromicro API instrument operated in 2 modes ESI+ and ESI- was used for MS investigations.<br /> *Labo hóa hợp chất tự nhiên,Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM<br /> **Bộ Môn Dược Liệu, Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096<br /> Email: tranhung@uphcm.edu.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 633<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Results: A method for sample preparation and the optimized MS conditions for detection of corticoids in<br /> herbal medicines were established. Charateristics of mother ions of corticoid standards, which were spiked in blank<br /> herbal matrix at concentration of 1ppm were still detectable in spectra, The results were more clearly in MS/MS<br /> mode in either ESI+ or ESI- with limit of detection (LOD) of corticoids ranged from 0,1 ppm to 0,5 ppm.<br /> Application of analysis methods was performed in real samples of herbal medicines. Among 24 herbal products<br /> investigated, 18 samples were adulterated with corticoids.<br /> Conclusion: MS direct infusion was proven to be a useful and reliabe method to identify corticoids in<br /> counterfeit products.<br /> Key words: corticoid, herbal medicines, electrospray ionization, mass spectrometry, direct injection<br /> cách sử dụng phương pháp khối phổ với chế<br /> MỞ ĐẦU<br /> độ tiêm mẫu trực tiếp.<br /> Trong những thập kỉ trở lại đây, thuốc có<br /> THỰC NGHIỆM<br /> nguồn gốc tự nhiên ngày càng thể hiện vai trò<br /> quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> con người và được xem như tương đối an toàn<br /> Chuẩn<br /> dexamethason,<br /> betamethason,<br /> và ít tác dụng phụ. Tuy nhiên, đa số những<br /> prednison, prednisolon, hydrocortison acetat,<br /> thuốc từ dược liệu cần thời gian điều trị tương<br /> dexamtethason acetat (Hình 1) được mua tại<br /> đối dài thuốc mới phát huy tác dụng. Vì mục<br /> Viện kiểm nghiệm TP.HCM. Các mẫu thuốc<br /> tiêu lợi nhuận hay nhằm gia tăng tác động trị<br /> đông dược thu mua tại các nhà thuốc hay mua<br /> liệu, một số nhà sản xuất đã pha trộn thêm các<br /> trôi nổi trên địa bàn TP.HCM. Hầu hết các<br /> hóa chất tổng hợp vào sản phẩm. Trong đó,<br /> mẫu thuốc mua được có xuất xứ từ Trung<br /> corticoid là một trong những nhóm hoá chất<br /> Quốc, Malaysia và các thuốc sản xuất trong<br /> thường được pha trộn nhất vào các dạng bào<br /> nước. Một số chế phẩm không rõ xuất xứ. Mẫu<br /> chế đông dược nhằm gia tăng tác dụng kháng<br /> được bảo quản ở nhiệt độ phòng 25o C, khi tiến<br /> viêm, giảm đau, chống dị ứng của các chế<br /> hành nghiên cứu mới tiến hành xử lí mẫu.<br /> phẩm. Sử dụng corticoid trong thời gian dài có<br /> O<br /> C H2O R5<br /> thể gây một số tác dụng phụ cho người sử<br /> R2<br /> dụng như hội chứng cushing, loét dạ dày tá<br /> OH<br /> tràng, tình trạng loãng xương, suy giảm chức<br /> R3<br /> 1<br /> R<br /> 4<br /> 2<br /> năng tuyến thượng thận… Việc phát hiện sự<br /> R1<br /> hiện diện các corticoid trong các chế phẩm<br /> O<br /> đông dược gặp không ít khó khăn do sự phức<br /> tạp của mẫu thử, hầu hết việc định tính và<br /> Hình 1. Công thức cấu tạo một số Corticoid sử dụng<br /> định lượng corticoid trong các chế phẩm đông<br /> trong nghiên cứu<br /> dược và thực phẩm chức năng đều dựa trên sự<br /> ∆ R1 R2<br /> R3<br /> R4<br /> R5<br /> giúp đỡ của những hệ thống phân tích kĩ thuật<br /> Dexamethason<br /> 1-2 -F -OH -CH3 -H<br /> -H<br /> Betamethason<br /> 1-2 -F -OH -H<br /> -CH3 -H<br /> cao như LC-UV, LC-MS, GC-MS. Cho tới nay,<br /> Dexamethason<br /> 1-2 -F -OH -CH3 -H<br /> -COCH3<br /> chưa thấy có báo cáo đề cập đến việc sử dụng<br /> acetat<br /> phương pháp MS với chế độ tiêm mẫu trực<br /> Hydrocrotison acetat-H -OH -H<br /> -H<br /> -COCH3<br /> Prednison<br /> 1-2<br /> -H<br /> =O<br /> -H<br /> -H<br /> -H<br /> tiếp trong xác định sự hiện diện corticoid<br /> Prednisolon<br /> 1-2 -H -OH -H<br /> -H<br /> -H<br /> trong chế phẩm đông dược. Mục tiêu của đề<br /> Hóa chất và thiết bị<br /> tài nhằm nghiên cứu điều kiện và khả năng<br /> phát hiện một số corticoid phổ biến pha trộn<br /> Dung môi hóa chất sử dụng trong nghiên<br /> trái phép trong chế phẩm đông dược bằng<br /> cứu đều đạt tiêu chuẩn phân tích hoặc đạt chuẩn<br /> HPLC (Merck).<br /> <br /> 634<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Thiết bị nghiên cứu: máy khối phổ MS<br /> Quatromicro-ESI (MicroMass, Anh quốc) cùng<br /> các thiết bị thí nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên<br /> cứu Đào tạo và Phát triển Thuốc có Nguồn gốc<br /> Tự nhiên - Đại Học Y Dược TP.HCM.<br /> <br /> Phương pháp xử lí mẫu<br /> Mẫu chuẩn: Chất chuẩn dạng bột được pha<br /> loãng dần trong MeOH đến các nồng 0,1-1 ppm<br /> từ dung dịch mẹ 0,1% để khảo sát điều kiện<br /> phân tích MS cũng như giới hạn phát hiện.<br /> Mẫu thử:<br /> <br /> KL<br /> 3g<br /> 3g<br /> 2g<br /> 3g<br /> <br /> được xử lí theo qui trình xử lí áp dụng cho mẫu<br /> rắn của Dược điển Việt nam IV, sau đó phân<br /> thành 0,1 g mỗi phần. Mỗi phần riêng rẽ này<br /> được thêm tiếp 1-10 µl dung dịch corticoid<br /> chuẩn ở nồng độ 1 µg/ml trong MeOH.<br /> Với mẫu nguyên liệu lỏng, mẫu nguyên liệu<br /> <br /> Dạng rắn: Một lượng bột thuốc tương đương<br /> với liều chỉ định ghi trên nhãn của sản phẩm<br /> được loại tạp kém phân cực bằng n-hexan có hỗ<br /> trợ của sóng siêu âm (15 phút x 3 lần, mỗi lần<br /> 15ml/1 g bột thuốc). Cắn sau khi loại n-hexan<br /> được tiếp tục chiết trong siêu âm với dung môi<br /> MeOH-H2O (3:7) (15 phút x 3 lần, mỗi lần 15 ml/1<br /> g cắn). Dịch lọc được chiết phân bố với ethyl<br /> acetat (3 lần, mỗi lần 15ml). Gạn lấy lớp ethyl<br /> acetat, cô đến cắn, hòa lại trong 10 ml MeOH.<br /> Dạng lỏng: Một thể tích chế phẩm lỏng tương<br /> ứng với liều chỉ định ghi trên nhãn của sản<br /> phẩm được chiết phân bố với n-hexan (3 lần,<br /> mỗi lần 15ml/ 20 ml chế phẩm), lấy lớp dưới.<br /> Lớp chế phẩm lỏng được tiếp tục lắc phân bố<br /> với ethyl acetat. Dịch ethyl acetat thu được cô<br /> đến cắn, hòa lại trong 10ml MeOH.<br /> <br /> Xây dựng công thức mẫu thuốc giả lập<br /> Thành phần, hàm lượng các dược liệu trong<br /> mẫu thuốc giả lập (Bảng 1) được xây dựng dựa<br /> trên tần suất của các dược liệu trong các bài<br /> thuốc dân gian và các chế phẩm đông dược. Các<br /> dược liệu được chọn là các dược liệu phổ biến và<br /> đa dạng về các nhóm hoạt chất. Việc khảo sát chi<br /> tiết thành phần của bài thuốc giả lập được trình<br /> bày trong một bài báo khác.<br /> Bảng 1. Công thức bài thuốc giả lập<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Dược Liệu<br /> Thành phần hóa học<br /> Radix Angelica sinensis<br /> Tinh dầu<br /> Radix Achyranthis bidentatae Saponin, sterol<br /> Radix Saposhnikoviae<br /> Glycoside, đường, tinh<br /> divaricatae<br /> dầu<br /> Rhizoma Smilacis glabrae<br /> Saponin, tannin, nhựa<br /> <br /> Bốn gram bột nguyên liệu mẫu thuốc giả lập<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> Dược Liệu<br /> Thành phần hóa học<br /> Radix Glycyrrhizae<br /> Flavonoid, saponin<br /> Radix Angelica pubescentis Fatty Acid, sterol,<br /> angelicol<br /> Cortex Eucommiae<br /> Alkaloid, glycoside<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> rắn ban đầu được chiết với ethanol (1 g/ 15ml),<br /> sau đó thực hiện các bước tiếp theo như qui<br /> trình xử lí áp dụng cho mẫu lỏng.<br /> <br /> Phương pháp định tính phổ khối<br /> Khảo sát các điều kiện ghi nhận tín hiệu tối<br /> ưu trên các mẫu chuẩn corticoid ở cả 2 chế độ<br /> ESI+ và ESI- để áp dụng trong phân tích các mẫu<br /> thử. Trong đó nitrogen được sử dụng như là tác<br /> nhân loại dung môi và argon 99,99% được dùng<br /> làm tác nhân gây phân mảnh ion trong chế độ<br /> MS/MS. Nhiệt độ buồng ion hóa và nhiệt độ hóa<br /> hơi dung môi, điện thế ion hóa cũng như điện<br /> thế phân mảnh chung cho các corticoid khảo sát.<br /> Giá trị giới hạn phát hiện (LOD) được ghi nhận<br /> khi tỉ số tín hiệu trên nhiễu đường nền lớn hơn<br /> hoặc bằng 3.<br /> Mẫu chuẩn giả lập cùng với các mẫu phân<br /> tích được khảo sát và so sánh với các phổ chuẩn<br /> corticoid. Mẫu thử âm tính nếu không ghi nhận<br /> được ion mẹ cũng như các phân mảnh đặc trưng<br /> của từng corticoid trên phổ đồ hoặc nhận diện<br /> được ion ban đầu nhưng các phân mảnh trong<br /> phổ đồ không tương ứng với với phổ chuẩn. Kết<br /> quả dương tính chỉ được xác nhận trong trường<br /> <br /> KL<br /> 1g<br /> 2g<br /> <br /> hợp ion mẹ và các ion phân mảnh đặc trưng ghi<br /> nhận được trên phổ đồ.<br /> <br /> 3g<br /> <br /> 635<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Thông số vận hành máy phân tích phổ<br /> khối<br /> Khảo sát các thông số phân tích MS các mẫu<br /> chuẩn để thu được các điều kiện tối ưu (ion mẹ<br /> trong phân tích MS và ion con trong phân tích<br /> MS/MS có cường độ tối ưu) cho từng chất để từ<br /> đó tìm điều kiện phân tích chung cho các chất<br /> cho kết quả:<br /> Ion source<br /> Source temperature<br /> Desolvation temperature<br /> Capillary voltage<br /> <br /> ESI+, ESIo<br /> 100 C<br /> o<br /> 150 C<br /> 3,2kV<br /> <br /> Cone voltage<br /> Collision voltage<br /> Flow rate of desolvation gas<br /> Rf lens<br /> <br /> 25V<br /> 15 eV<br /> 250 L/h<br /> 0,2 V<br /> <br /> Dữ liệu phổ khối<br /> Trước khi khảo sát sự phân mảnh của các<br /> corticoid chuẩn, chế độ quét full scan được ghi<br /> nhận nhằm xác định các ion mẹ dùng trong<br /> những phân tích tiếp theo.<br /> Ở chế độ ESI+, các mảnh căn bản thu được sẽ<br /> là [M+23]+ và [M+1]+ tương ứng với các ion mẹ là<br /> [M+Na]+ và [M+H]+. Trong chế độ MS/MS các<br /> <br /> ion được chọn khảo sát lần lượt là [M+23]+,<br /> [M+1]+ và được đánh giá bởi những phân mảnh<br /> đặc trưng, phù hợp với những nghiên cứu trước<br /> đây(1,5). Kết quả khảo sát cho thấy ion [M+1]+ là<br /> ion thích hợp cho các phân tích MS/MS tiếp theo.<br /> Ảnh hưởng của acid formic 0,1% (v/v) trên sự<br /> tạo thành các ion(2) cũng được khảo sát. Kết quả<br /> cho thấy khi có acid formic, tín hiệu đỉnh<br /> [M+23]+ giảm đi rõ rệt trong khi cường độ đỉnh<br /> [M+H]+ tăng lên.<br /> Với chế độ ESI-, trong điều kiện không có<br /> acid formic thì mảnh cơ bản là [M-H]- còn khi có<br /> acid formic thì mảnh căn bản là [M -H + 46]([M+HCOO]-). Sự hiện diện của formic cho tín<br /> hiệu phổ tốt hơn trong cả hai chế độ MS và<br /> MS/MS. Một điều thú vị là điều kiện này, phổ<br /> thu được chỉ có 1 đến 2 phân mảnh đặc trưng<br /> với cường độ tín hiệu cao rõ rệt. Trong đa số các<br /> trường hợp, phân mảnh chính là [M-H-30]- hay<br /> [M-H-CH2O]- được thành lập từ sự mất acid<br /> formic sau đó là mất tiếp formaldehyd từ gốc<br /> hydroxymethyl của ion ban đầu [M+HCOO]-.<br /> Riêng dạng muối acetat của dexamethason và<br /> hydrocortison thì ion phân mảnh chiếm ưu thế<br /> là [M-H]-. Vì thế, chế độ phân tích có acid formic<br /> được sử dụng khi ghi nhận phổ ở chế độ ESI-.<br /> <br /> Bảng 2. Ion mẹ và những ion phân mảnh đặc trưng tương ứng của từng corticoid<br /> Chuẩn<br /> <br /> Ion mẹ<br /> <br /> Ion phân mảnh<br /> <br /> Betamethason<br /> <br /> 415 > 393<br /> <br /> 373, 355, 337, 309, 319, 291, 279, 267, 237<br /> <br /> Dexamethason<br /> <br /> 415 > 393<br /> <br /> 373, 355, 337, 309, 319, 291, 279, 267, 237<br /> <br /> +<br /> <br /> ESI<br /> <br /> Prednison<br /> <br /> 381 > 359<br /> <br /> 341, 323, 305, 313, 295, 267, 253, 237, 213<br /> <br /> Prednisolon<br /> <br /> 383 > 361<br /> <br /> 343, 325, 307, 297, 279, 265, 239, 223<br /> <br /> Dexamethason acetat<br /> <br /> 457 > 435<br /> <br /> 415, 397, 379, 355, 337, 327, 319, 309, 291<br /> <br /> Hydrocortison acetat<br /> <br /> 427 > 405<br /> <br /> 387, 373, 345, 327, 309, 267, 241<br /> <br /> 437 > 391<br /> <br /> 361<br /> <br /> ESIBetamethason<br /> Dexamethason<br /> <br /> 437 > 391<br /> <br /> 361<br /> <br /> Prednison<br /> <br /> 403 > 357<br /> <br /> 327<br /> <br /> Prednisolon<br /> <br /> 405 > 359<br /> <br /> 329<br /> <br /> Dexamethason acetat<br /> <br /> 479 > 433<br /> <br /> 433<br /> <br /> Hydrocortison acetat<br /> <br /> 449 > 403<br /> <br /> 403, 373<br /> <br /> 636<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Bảng 2 trình bày giá trị các ion mẹ cũng như<br /> những ion phân mảnh đặc trưng tương ứng của<br /> từng corticoid được khảo sát trong nghiên cứu.<br /> Những ion phân mảnh được gạch dưới được<br /> dùng trong việc đánh giá giới hạn phát hiện và<br /> quyết định kết quả phân tích các mẫu thử. Chưa<br /> ghi nhận được sự khác biệt phổ trong trường<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> hợp của 2 đồng phân dexamethason/<br /> betamethason. Điều này không phải là trở ngại<br /> lớn trong thực tế, vì dù là dexamethason hay<br /> betamethason cũng đều bị cấm pha trộn vào các<br /> chế phẩm đông dược.<br /> Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 2<br /> và Hình 2 – 6.<br /> <br /> Hình 2. Phổ MS của Dexamethason ở mẫu chuẩn (dưới) và mẫu lỏng giả lập thêm chuẩn (trên)<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> Hình 3. Giới hạn phát hiện của Dexamethason trong mẫu giả lập thêm chuẩn<br /> <br /> 1: Mẫu giả lập thêm chuẩn<br /> <br /> dexamethason 1μg/ml 2: Mẫu giả lập thêm chuẩn dexamethason 10μg/ml<br /> 3: Mẫu trắng giả lập<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 637<br /> <br />