Phát triển kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh do Echinococcus ở quy mô phòng xét nghiệm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Phát triển kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh do Echinococcus ở quy mô phòng xét nghiệm trình bày việc phát triển bộ kít và đánh giá kỹ thuật LAMP để phát hiện Echinococcus, hướng tới phát triển thành bộ kít dùng cho chẩn đoán nhanh từ các mẫu bệnh phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát triển kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh do Echinococcus ở quy mô phòng xét nghiệm

T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DO ECHINOCOCCUS Ở QUY MÔ PHÒNG XÉT NGHIỆM Nguyn Thu Hương1, Nguyn Th Anh Vân1, Nguyn Phương Thoa1 Phí Th Hương Liên1, Nguyn Minh Toàn1, Nguyn Ngc Hương Ly2 Đng Anh Sơn3, Nguyn Th Hương Bình4 TÓM TẮT Mc tiêu: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật trong phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm Echinococcus trên người Việt Nam (ECHO-LAMP). Đi tưng và phương pháp: Các hoạt động thực nghiệm trong phòng thí nghiệm gồm: 1) Thiết kế bộ sinh phẩm dựa trên nguyên lý phản ứng LAMP để chẩn đoán trường hợp nhiễm Echinococcus, 2) Khảo sát khả năng phát hiện trường hợp nhiễm Echinococcus của bộ sinh phẩm chế tạo. Kt qu: Bộ sinh phẩm LAMP chẩn đoán Echinococcus có khả năng phát hiện trường hợp nhiễm trên lâm sàng. Bộ sản phẩm khuếch đại LAMP chế tạo gồm 6 thành phần, trong đó, cặp mồi thiết kế có kích thước 228bp, chứng dương tạo ra cùng bộ Kít có nồng độ 100 ng/µL. Phản ứng LAMP chế tạo có nồng độ 0 MG 0,004% và MgSO4 8 mM, phản ứng khuếch đại gen mồi tại 63 C trong 60 phút, ngưỡng -8 0 phát hiện bộ Kít là 10 ng/µL tương đương với 2,82 x 10 bản sao gen/µL. Khả năng phát hiện ca nhiễm Echinococcus của bộ sinh phẩm với độ nhạy trên 93% và độ đặc hiệu trên 98%. Kt lun: Bộ kít LAMP chế tạo có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm cơ bản mà không cần các trang thiết bị đặc biệt và rất phù hợp với việc phát hiện tác nhân gây bệnh lây truyền từ động vật sang người. * Từ khóa: Echinococcus; Gen 18SrRNA; LAMP. Development of LAMP Technique in the Detection of Human Echinococcosis at the Laboratory Scale Summary Objectives: To perfect the technical process in developing the Echinococcus diagnostic kit and evaluate the sensitivity and specificity of the biological kit in the laboratory. Subjects and methods: The study was carried out on the experimental activities in the laboratory, including 1) Designing a biological kit based on the LAMP reaction principle to diagnose Echinococcus infections, 2) Surveying the ability of the preparation kit to detect human Echinococcus infections. Results: The performance of the Echinococcus-LAMP test (ECHO-LAMP) was found to be stable includes 6 components. In which the designed primer pair was 228 bp in size, 1 Trường Đại học Y tế Công cộng 2 Trường PTTH Chuyên Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN 3 Bệnh viện Đa khoa Vinmec 4 Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương Ngưi phn hi: Nguyn Thu Hương (nth14@huph.edu.vn) Ngày nhn bài: 19/11/2021 Ngày đưc chp nhn đăng: 16/12/2021 36
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 the positive control was created with the kit with a concentration of 100 ng/µL. The fabricated LAMP reaction has MG concentration of 0.004% and MgSO4 8 mM, primer gene detection 0 -8 reaction at 63 C for 60 minutes, the detection threshold of the kit is 10 ng/µL corresponding to 0 2.82x10 gene copies/µL. The sensitivity and specificity were high above 95% for humane Echinococcus. Conclusion: The developed ECHO-LAMP test does not require a cold chain or a sophisticated laboratory. It holds promise for use as a routine simple molecular tool for point-of-care Echinococcosis diagnosis in zoonotic endemic diseases areas. * Keywords: Human Echinococcus; Gen 18S rRNA; LAMP. ĐẶT VẤN ĐỀ [4, 7, 8, 9, 10]. Tuy nhiên, xét nghiệm Bệnh nang nước (hydatid disease) hay huyết thanh học là các xét nghiệm hữu còn gọi là bệnh hydatidosis hoặc ích trong giai đoạn người mới nhiễm sán Echinococcosis là bệnh nhiễm ký sinh hoặc những trường hợp bệnh mạn tính trùng lây truyền từ chó sang người. nhưng không tìm thấy trứng trong phân. Người nhiễm bệnh do nuốt trứng sán Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch có độ trong thức ăn, nước uống hoặc đất bị ô nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào từng nhiễm, hoặc sau khi tiếp xúc trực tiếp với loại test, có hiện tượng dương tính kéo động vật. Trên thế giới, có hơn 1 triệu dài và phản ứng chéo giữa các loài, khó người bị nhiễm Echinococcus với tỷ lệ tử triển khai tại thực địa. vong sau phẫu thuật là 2,2% và khoảng Xét nghiệm sinh học phân tử như 6,5% tái phát sau khi can thiệp [6]. Việc PCR, Real-time PCR hay giải trình tự là chẩn đoán bệnh hiện nay chủ yếu dựa các phương pháp có độ nhạy và độ đặc vào các triệu chứng lâm sàng và xét hiệu cao, song đòi hỏi phải có trang thiết nghiệm miễn dịch phát hiện kháng bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ nguyên hoặc kháng thể lưu hành trong đào tạo cao. Kỹ thuật khuếch đại đẳng máu. Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng nhiệt LAMP được nghiên cứu và phát thường không đặc hiệu, thời gian ủ bệnh triển bởi Công ty Eiken Chemical (Nhật dài và khi có những biểu hiện của bệnh Bản) là phương pháp nhân bản gen đẳng đã vào giai đoạn muộn và khó điều trị. nhiệt đang được ứng dụng nhiều nhất. Việc phát hiện nhanh do Echinococcus để Kết quả của phản ứng LAMP có thể được có biện pháp điều trị hiệu quả là rất quan quan sát trực tiếp bằng mắt thường, thời trọng. Hiện nay, các kỹ thuật xét nghiệm gian xét nghiệm nhanh (khoảng 45 - 60 Echinococcus chủ yếu dựa vào xét phút), xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu. nghiệm tìm nang ấu trùng sán trong cơ Trên thế giới và Việt Nam chưa có nghiên thể. Xét nghiệm này được xem là phương cứu nào được công bố để ứng dụng kỹ pháp chuẩn vàng trong chẩn đoán xác thuật LAMP vào chẩn đoán nhiễm định ca bệnh. Một số kỹ thuật được sử Echinococcus. Trong nghiên cứu này, dụng phổ biến tại các phòng xét nghiệm chúng tôi phát triển bộ kít và đánh giá kỹ gồm kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp, nhuộm thuật LAMP để phát hiện Echinococcus, soi mô bệnh học, hoặc các kỹ thuật miễn hướng tới phát triển thành bộ kít dùng cho dịch phát hiện kháng nguyên, kháng thể... chẩn đoán nhanh từ các mẫu bệnh phẩm. 37
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP + Mẫu chứng âm: Ấu trùng hoặc con NGHIÊN CỨU trưởng thành: Giun chó mèo, sán lá gan lớn 1. Đối tượng nghiên cứu Fasciola, Giun móc/mỏ, Teania solium, - Mẫu chứng chuẩn: Sán và nang Strongyloides stercoralis và nước cất khử ion. Echinococcus đã định loại bằng hình thái - Mẫu sử dụng cho đánh giá độ nhạy, và khẳng định bằng kỹ thuật PCR. độ đặc hiệu của bộ kít ECHO-LAMP: - Mẫu nghiên cứu: Mẫu được thu thập + Mẫu dùng so sánh độ nhạy, độ đặc từ phòng khám chuyên ngành của Viện hiệu của bộ sinh phẩm: Mẫu lựa chọn có Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung chủ đích và được thực hiện với quy mô ương lưu trữ tại Khoa Sinh học phân tử; nhỏ trong phòng thí nghiệm dựa vào mẫu huyết thanh người không nhiễm lượng mẫu dương tính tập hợp mẫu lâm Echinococcus và một số ký sinh trùng khác sàng thử nghiệm với giả định tỷ lệ nhiễm thu từ xã Mai Trung, huyện Bắc Giang. (P) là 5%. Độ nhạy và đặc hiệu mong đợi - Hóa chất dùng cho LAMP như Bst của kít ECHO-LAMP khoảng 95%, sai số DNA polymerase được mua của Hãng ước tính của hai xác suất là 5% với độ tin New England Biolabs, Mỹ. Kit tách chiết cậy (giá trị α = 0,05) 95%. Số mẫu cần có ADN từ mẫu mô, mẫu phân của Hãng để ước tính độ nhạy và độ đặc hiệu được Qiagen, Đức. Các trình tự mồi thiết kế xác định bằng công thức giữa hai tỷ lệ. được đặt tổng hợp của Hãng IDT, Mỹ. Tính được nse = 3,46 làm tròn 4 mẫu * Thời gian và địa điểm nghiên cứu: dương tính và nsp = 76,83 làm tròn 77 - Thời gian: tháng 01/2021 - 9/2021. mẫu âm tính. Trên thực tế, nghiên cứu 4 - Địa điểm: Phòng Xét nghiệm Sinh mẫu huyết thanh dương tính được lưu trữ học phân tử của Trường Đại học Y tế tại phòng thí nghiệm (1 mẫu thu trên linh Công cộng và Viện Sốt rét - Ký sinh trùng trưởng và 3 mẫu bệnh nhân) và 88 mẫu - Côn trùng Trung ương. âm tính thu từ người khoẻ mạnh, khẳng định âm tính các loại ký sinh trùng bằng 2. Phương pháp nghiên cứu ELISA và PCR. * Cỡ mẫu và chọn mẫu: - Mẫu sử dụng đánh giá phản ứng - Mẫu chuẩn sử dụng cho thiết kế và chéo các loại giun sán là 19 mẫu, đánh giá hoạt động của bộ mồi LAMP: trong đó Toxocara sp. (8 mẫu), ấu trùng + Mẫu chuẩn dương để chuẩn kỹ thuật: sán lợn (2 mẫu); sán lá gan lớn Fasciola 03 mẫu ở các giai đoạn (ấu trùng và sán (5 mẫu), sán lá gan nhỏ (2 mẫu), trưởng thành) thu trên linh trưởng và chó giun Strongyloides stercoralis (2 mẫu). do Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện Nông Các mẫu này cũng được thẩm định nghiệp cung cấp. Các mẫu này được bằng qPCR. thẩm định loài bằng qPCR trước khi đưa vào nghiên cứu, mỗi mẫu tiến hành xét - Mẫu sử dụng cho xác định ngưỡng nghiệm lặp lại 3 lần. phát hiện của bộ kít ECHO-LAMP: 38
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 Trên vùng trình tự bảo tồn trên gen - Thiết kế bộ mồi: 18s rRNA của sán dây Echinococcus sp. Mồi cho phản ứng LAMP sẽ được thiết có kích thước 596 bp được chèn vào kế trên vùng gen đặc hiệu cao Cox1 theo vector pUC19 và nhân dòng. Sản phẩm các nghiên cứu trước đã công bố trên thu được là plasmid tái tổ hợp mang đoạn thế giới (2,3). Phần mềm chuyên dụng gen 18S rRNA đặc trưng cho sán dây thiết kế mồi cho phản ứng LAMP được sử Echinococcus sp. có kích thước 3282 bp. dụng là phần mềm Primer Explorer v.5 Lượng plasmid thu hồi là 5 µg và hòa tan (https://primerexplorer.jp/e/). Các trình tự trong 50 µL nước cất để thu được nồng gen 18s rRNA của các loài sán dây độ 100 ng/µL. Echinococcus sp. trên ngân hàng dữ liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) được tải về - Mẫu DNA phân tích: và sử dụng phần mềm MEGA 7 với tính DNA tổng số được phân tách từ con năng chức năng Clustal W để sắp gióng sán trưởng thành và mẫu bệnh phẩm thu các trình tự bảo tồn gen của Echinococcus từ bệnh nhân bằng bộ tách chiết DNA spp. Kết quả thu được đoạn trình tự bảo micro kit và QIAamp DNA stool mini kit tồn cho Echinococcus spp. có kích thước của Qiagen (Germany). Quy trình tách 596 bp và sản phẩm sau phản ứng LAMP chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà bằng cặp mồi F3-B3 có kích thước theo lý sản xuất. thuyết là 228bp < 280 bp. Bảng 1: Trình tự mồi LAMP thiết kế trên vùng gen 18s rRNA phát hiện Echinococcus sp. Chiều Tm Tỷ lệ Tên mồi Vị trí 5’ Vị trí 3’ o Trình tự mồi dài (nu) ( C) GC F3 283 303 21 56,60 0,38 AGAGGGTTTAAACCAGACATT B3 489 510 22 57,89 0,41 CTTCGAACCTCTAACTTTCGTT GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCA- FIP 45 GGTCTAGCATGGAATAACACT TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGAC- BIP 50 CTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC F2 316 336 21 56,79 0,43 GGTCTAGCATGGAATAACACT F1c 373 396 24 63,00 0,46 GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCA B2 464 488 25 57,47 0,32 CTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC B1c 408 432 25 60,49 0,40 TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGAC LB 437 457 21 64,14 0,57 GCGAGACGTCCTACTGCGAAA - Khảo sát và tối ưu hóa phản ứng nhạy (ngưỡng phát hiện) của hệ mồi thiết ECHO-LAMP: kế trên cơ sở tiếp theo kết quả chế tạo Các thông số cần được khảo sát tối ưu các bộ kít LAMP chẩn đoán một số loài ký hóa trong phản ứng LAMP là nồng độ sinh trùng của đề tài cấp Nhà nước Mg2+, nhiệt độ hoạt động của bộ mồi, thời KC10/10.16-20. MgSO4 được khảo sát ở gian phản ứng, chất chỉ thị màu dùng để các nồng độ 4, 6 và 8 mM. Phản ứng LAMP quan sát phát hiện sản phẩm LAMP và độ được thực hiện ở dải nhiệt độ từ 60 - 65oC, 39
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 sử dụng chất chỉ thỉ màu MG với các trình tự đích, sau đó được biến nạp vào nồng độ 0,012, 0,008, 0,004 và 0,001% E. coli DH5α, theo hướng dẫn sử dụng bộ [5]. Thời gian thực hiện phản ứng LAMP sinh phẩm. được khảo sát ở 40 và 60 phút. Tiêu chí - Kỹ thuật giải trình tự trên máy giải đánh giá lựa chọn các thông số dựa vào trình tự tự động 3500. việc quan sát sản phẩm LAMP trên gel * Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: agarose 2% và sự chuyển màu dung dịch - Phân tích số liệu bằng các phần mềm trong các ống mẫu âm và dương sau đi kèm với các máy và các phần mềm phản ứng. Đọc kết quả quan sát trên tổng tin sinh: AB7500 version 2.06, Primer số 12 lần xét nghiệm thông qua sự lặp lại Explorer v.5, Primer Blast, Mega 7. 3 lần, với 4 mẫu chứng và được đánh giá - Tính độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số bởi 3 kỹ thuật viên quan sát độc lập tại tương đồng Kappa trên phần mềm Medcalc. các thời điểm xét nghiệm. * Đạo đức nghiên cứu: - Độ nhạy (Se) và độ đặc hiệu (Sp) của bộ ECHO-LAMP: Nghiên cứu được thông qua Hội đồng Đạo đức trong NCYSH Trường Đại học Y Bộ mẫu dùng đánh giá Se và Sp của tế Công cộng theo Quyết định số bộ kít LAMP chẩn đoán Echinococcus là 191/2021/YTCC-HD3, ngày 26/4/ 2021. các mẫu dương tính lưu tại phòng thí Những quy định về đạo đức trong nghiên nghiệm và các mẫu thu thực địa. Tất cả cứu đã được thực hiện nghiêm túc trong mẫu này đều đã được xét nghiệm khẳng suốt quá trình nghiên cứu. định bằng qPCR trước khi thử nghiệm. Hiện chưa có bộ kít LAMP chẩn đoán KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Echinococcus được thương mại hóa. Do 1. Chế tạo bộ Kít LAMP chẩn đoán vậy, chúng tôi sử dụng một bộ kít có cùng Echinococcus các điều kiện phản ứng nhưng bộ mồi đã công bố của Salant và CS, 2012 [12] để so * Khảo sát khả năng hoạt động của bộ sánh với bộ kít ECHO-LAMP chế tạo. mồi LAMP: Se = Số mẫu dương thật/(số mẫu dương thật + số mẫu âm giả) x 100% Sp = Số mẫu âm thật/(số mẫu âm thật + số mẫu dương giả) x 100%. * Các kỹ thuật khác được sử dụng trong nghiên cứu: - Thu thập và bảo quản mẫu theo quy trình thu mẫu. - Xử lý mẫu và tách chiết DNA theo phương pháp tủa cồn. - Kỹ thuật qPCR xác định Echinococcus. - Phương pháp tạo dòng: Trình tự DNA đích cần tạo dòng được chuyển vào plasmid Hình 1: Sản phẩm LAMP sử dụng bộ mồi tạo dòng. Plasmid tái tổ hợp mang đoạn tự thiết kế đặc hiệu cho Echinococcus sp. 40
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 Để đánh giá khả năng hoạt động của bộ mồi thiết kế, kết quả điện di trên gel agarose 2% cho thấy, sản phẩm sau phản ứng (cột 1-8) của mẫu dương chuẩn có dạng dải băng dài tương đương thang chuẩn DNA (M), đây là hình ảnh đặc trưng của sản phẩm LAMP. Bảng 2: Kết quả hoạt động các cặp mồi đặc hiệu Echinococcus sp. ADN Mồi F3-B3 Sán dây nhỏ chó Echinococcus sp. + Giun móc/mỏ - Giun đũa chó mèo Toxocara - Sán lá gan lớn Fasciola - Sán dây Teania solium - Giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis - Nước cất khử ion - Bảng 2 cho thấy khả năng hoạt động các cặp mồi thiết kế chỉ phát hiện được mẫu tách ADN của Echinococcus sp, không phản ứng với mẫu ADN tách từ giun chó mèo, sán lá gan lớn Fasciola, giun móc/mỏ, Teania solium, Strongyloides stercoralis và nước cất khử ion. * Kết quả khảo sát chất chỉ thị màu cho phản ứng LAMP: Bảng 3: Kết quả quan sát chất chỉ thị màu MG ở các nồng độ khác nhau. Màu xanh lam Nồng độ MG Mẫu % Dương tính % Âm tính Có Không 0,001% Chứng dương 0 36 0 100 Chứng âm 0 36 0 100 0,004% Chứng dương 36 0 100 0 Chứng âm 0 36 0 100 0,008% Chứng dương 36 0 100 0 Chứng âm 27 9 75 25 0,012% Chứng dương 36 0 100 100 Chứng âm 31 5 86,1 13,8 41
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 A B Hình 2: Phản ứng màu tại các mẫu chứng dương và âm. A. Hình ảnh các ống trước phản ứng; B. Hình ảnh màu của các ống sau phản ứng: Mẫu dương có màu xanh nhạt, mẫu âm không màu. Các nồng độ MG được khảo sát là 0,012%, 0,008%, 0,004% và 0,001%. Kết quả biểu diễn tại bảng 1, hình 2, cho thấy nồng độ MG 0,004% là nồng độ tối ưu có thể phân biệt được các mẫu dương tính và âm tính. * Kết quả khảo sát thời gian thực hiện phản ứng: Hình 3: Sản phẩm LAMP sau thời gian phản ứng 40 phút (Làn 9 - 16) và 60 phút (Làn 1 - 8). Khảo sát thời gian tối thiểu thực hiện phản ứng LAMP ở 40 và 60 phút, các thành phần phản ứng: DNA khuôn, mồi, đệm phản ứng, nồng độ Mg2+ 8 mM và các điều kiện khác giữ nguyên và đồng nhất, chỉ thay đổi thời gian thực hiện phản ứng. Do mong muốn giảm thiểu thời gian phản ứng nên trong nghiên cứu này, chúng tôi không tiến hành thực nghiệm ở các khoảng thời gian dài hơn 60 phút. Kết quả cho thấy thời gian tối thiểu để khuếch đại DNA trong phản ứng LAMP là 60 phút. 42
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 * Khảo sát ngưỡng phát hiện của bộ kít LAMP: Bảng 4: Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện của bộ mồi LAMP. Kết quả Nồng độ (ng/µl) Lần 1 Lần 2 Lần 3 -6 10 (+) (+) (+) -7 10 (+) (+) (+) -8 10 (+) (+) (+) -9 10 (-) (-) (-) -10 10 (-) (-) (-) -11 10 (-) (-) (-) Neg1 (-) (-) (-) Neg2 (-) (-) (-) Kết quả cho thấy, ngưỡng phát hiện sơ cấp của bộ Kít là 10-8 ng/µL tương ứng với 2,82 x 10o. Thử nghiệm LOD95% của bộ mồi là 2,12 x 10o số bản sao gen/µL (95%CI: 1,71 x 10o bản sao gen/µL đến 2,89 x10o bản sao gen/µL). 3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kít ở phòng thí nghiệm Bảng 5: Kết quả so sánh kít ECHO-LAMP so với qPCR. qPCR ECHO-LAMP chế tạo Tổng Dương tính Âm tính Dương tính 29 1 30 Âm tính 2 148 150 Tổng số 31 149 180 Pse = (29/(29+2))*100% = 93,55%, Psp = (148/(148+1)) * 100% = 99,33% Po = 0,983 và Pe = 0,719 Kappa = 0,94 Bảng 6: Kết quả so sánh kít ECHO-LAMP so bộ kít LAMP mồi của Salant và CS. LAMP-Salant và CS, 2012 ECHO-LAMP chế tạo Tổng Dương tính Âm tính Dương tính 29 1 30 Âm tính 2 49 51 Tổng số 31 50 81 Pse = (29/(29+2))*100% = 93,55%, Psp = (49/(49+1)) * 100% = 98,00% Po = 0,963 và Pe = 0,530 Kappa = 0,921 43
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 BÀN LUẬN thêm màu xanh bằng MG vào hỗn hợp khuếch đại để phân biệt phản ứng LAMP Tiêu chuẩn vàng cho việc phát hiện các dương tính với phản ứng âm tính. trường hợp nhiễm Echinococcus sp. ở người là theo truyền thống dựa trên việc * Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng phát hiện hình thể ký sinh trùng đối với ECHO-LAMP: con trưởng thành đường tiêu hóa và/hoặc - Nhiệt độ của phản ứng LAMP: khi có các nang dạng bọc nước tại các Nhiệt độ gắn mồi (Ta) là yếu tố quan mô, tạng đặc trong cơ thể. Các phương trọng hàng đầu, quyết định tính chính xác pháp phát hiện ký sinh trùng này thường cũng như hiệu quả khuếch đại của kỹ không quá tốn công, phát hiện tốt nhưng thuật PCR và các kỹ thuật khác được bản chất là thủ thuật can thiệp xâm lấn có phát triển từ PCR. Một đặc trưng của thể gây tổn thương khó hồi phục trên LAMP là khuếch đại DNA hiệu quả trong người. Hơn nữa, phương pháp kiểm tra điều kiện đẳng nhiệt, trong đó nhiệt độ đơn giản của kính hiển vi quang học dựa phù hợp cho phản ứng có thể dao động vào hình thể của ký sinh trùng không thể từ 50 - 68oC. Trên cơ sở này, chúng tôi phân biệt hình thái giữa tất cả loại trứng, đã tiến hành khảo sát nhiệt độ trong nang ấu trùng các loài thuộc họ Taenida khoảng 60 - 65oC. Kết quả điện di sản [6]. Ngoài ra, các test chẩn đoán phẩm LAMP cho thấy, ở nhiệt độ 63oC Echinococcosis không có sẵn trên thị trường. sản phẩm khuếch đại đạt hiệu suất cao Phương pháp PCR có sẵn nhưng chi phí nhất. Nhiệt độ 63oC được đánh giá là tạo cao về trang thiết bị, hoá chất, con người điều kiện ủ mồi và tăng cường khả năng và ít nhất 3 - 4 giờ để hoàn thành quá chịu đựng các chất ức chế thường được trình khuếch đại DNA và điện di phân tích tìm thấy trong các mẫu chẩn đoán bệnh. trên gel agarose. Do đó, yêu cầu đối các - Nồng độ MgSO4: bộ kít chẩn đoán đơn giản hơn, rẻ hơn Nồng độ MgSO4 ảnh hưởng đến hiệu nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu cao và quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. phương pháp phát hiện sàng lọc hàng Trong dung dịch đệm, quan trọng nhất là loạt rất cần thiết, đặc biệt là ở các khu ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy vực dịch tễ có tần suất đồng nhiễm (Tm-melting temperature) của DNA mạch Echinococcus với các loài sán dây khác đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để (Zoonotic Taeniid). Phương pháp LAMP hình thành cơ chất mà enzyme có thể được thực hiện nhanh trong vòng polymerase có thể nhận ra, điều này rất chưa đến 1 giờ dưới điều kiện đẳng nhiệt cần thiết cho quá trình liên kết của các bằng cách sử dụng thiết bị ổn nhiệt đơn dNTPs. Trong phản ứng LAMP, nồng độ giản, chẳng hạn như nồi cách thủy hoặc MgSO4 thích hợp thường nằm trong máy gia nhiệt khối. Không cần gel khoảng 4 - 10 mM. Sau khảo sát, chúng agarose điện di để đánh giá trực quan kết tôi nhận thấy rằng, MgSO4 ở nồng độ 4 quả thử nghiệm [6, 7, 8]. Các kết quả có mM không có sản phẩm khuếch đại, thể được quan sát ngay sau phản ứng và MgSO4 ở nồng độ 6 mM cho sản phẩm kiểm tra đánh giá trực quan bằng cách không ổn định, hiệu suất không cao, 44
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 MgSO4 ở nồng độ 8 mM cho sản phẩm bệnh lây truyền lưu hành và hiện đang LAMP với hiệu suất khuếch đại cao và ổn còn khan hiếm trang thiết bị, chuyên gia định. Do vậy, chúng tôi chọn MgSO4 ở 8 mM kỹ thuật. Kỹ thuật LAMP đã đang được là nồng độ tối ưu cho phản ứng LAMP. thiết lập thực hiện thí điểm các điểm kính Chất chỉ thị màu sử dụng để đọc kết hiển vi tại thực địa, cộng đồng cho chẩn quả LAMP: Có nhiều nghiên cứu đã đoán sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ chứng minh kỹ thuật LAMP là một kỹ thuộc đề tài cấp Nhà nước KC10/10. thuật có độ đặc hiệu cao, độ nhạy, thời 16-20 [3]. gian phản ứng ngắn và cho phép phát * Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP: hiện sản phẩm khuếch đại trực quan đơn Nhóm nghiên cứu của Viện Sốt rét - giản bằng cách quan sát độ đục, bằng Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương đã thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc thuốc phát triển bộ kít LAMP với bộ mồi tự thiết nhuộm chỉ thị pH. Gần đây, chất chỉ thị kế trên dãy nồng độ pha loãng ADN tổng màu MG đã được sử dụng thành công như số, tách chiết từ mẫu mô sán lá gan lớn một chất chỉ thị nhạy với pH để phát hiện trưởng thành cho thấy ngưỡng phát hiện các sản phẩm LAMP. Sự thay đổi màu đạt 10 - 6 ng [1], hay với Plasmodium sắc của MG (dạng cation) phụ thuộc vào falciparum là 10 - 2 ng và P. vivax 10 - 3 pH của dung dịch (pH10: không màu). ng [5]. Trong nghiên cứu này, ngưỡng Bước sóng hấp thụ cho MG là 621 nm. phát hiện của kỹ thuật LAMP phát hiện ca Trong xét nghiệm LAMP-MG, các mẫu nhiễm Echinococcus sp. là 10 - 8 ng/phản dương tính và âm tính dễ dàng được ứng, tương đương với 0,294 bản sao/ phân biệt bằng mắt thường là màu xanh phản ứng. Ngưỡng phát hiện này tương nhạt và không màu, tương ứng (Hình 3). đương, thậm chí tốt hơn so với các Việc bổ sung MG vào đệm LAMP nghiên cứu khác của các tác giả trên thế trước khi tiến hành phản ứng không ảnh giới với ngưỡng phát hiện từ 10 - 3 [11] hưởng đến hoạt động của Bst DNA đến 10 - 5 ng [10]. Đồng thời, kỹ thuật polymerase, đồng thời loại bỏ nguy cơ LAMP cũng cho kết quả tốt với khả năng tạp nhiễm giữa các mẫu. Ưu điểm của xét phát hiện ở ngưỡng rất thấp khi tiến hành nghiệm LAMP-MG có thể cải thiện và trên các mẫu giả định. khắc phục những hạn chế từ các phát hiện LAMP khác như đã đề cập ở trên. * Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu bộ Các nồng độ MG được khảo sát là 0,012%, kit ECHO-LAMP: 0,008%, 0,004% và 0,001%. Kết quả cho Khi so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu thấy, có sự đồng nhất giữa 3 người quan ECHO-LAMP chế tạo với bộ kít LAMP có sát và họ kết luận rằng nồng độ MG cặp mồi thiết kế bởi Salant và CS, 2012 [9] 0,004% là nồng độ tối ưu có thể phân biệt có độ nhạy 93,55%, độ đặc hiệu 98,00% được các mẫu dương tính và âm tính. với sự phù hợp cao (Kappa = 0,92 > 0,8). Nghiên cứu phát triển bộ kít ECHO- Kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu so với LAMP của chúng tôi có thể có tiềm năng qPCR của bộ kít ECHO-LAMP có độ nhạy lớn ở các nước đang phát triển, nơi các 93,55%, độ đặc hiệu 99,33% và sự phù 45
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 hợp cao (Kappa = 0,94 > 0,8). Như vậy, KẾT LUẬN bộ kit ECHO-LAMP trong nghiên cứu có Bộ mồi thiết kế trong nghiên cứu hoạt sự phù hợp cao với phương pháp PCR động tốt, có tính đặc hiệu cao với đối sánh. Kết quả này góp phần củng cố Echinococcus không có sự bắt cặp chéo thêm dữ liệu về hiệu quả của LAMP trong với các loài sán khác. Phản ứng LAMP chẩn đoán nhiễm Echinococcus là đạt chế tạo có nồng độ MG 0,004% và mức tương đồng cao các phương pháp MgSO4 8 mM, phản ứng khuếch đại gen PCR [3]. Tác giả Xing-Wei Ni và CS mồi tại 63oC trong 60 phút. Kết quả phản (2014), nghiên cứu phát triển LAMP áp ứng sau khi sử dụng bộ sinh phẩm dụng vào chẩn đoán nhiễm Echinococcus ECHO-LAMP chế tạo có thể quan sát trên chó tại Trung Quốc đã dùng phương bằng mắt thường sau khi bổ sung chất pháp Real-time PCR làm phương pháp chỉ thị màu MG. Ngưỡng phát hiện bộ kít tham chiếu thì độ nhạy của LAMP so với là 10-8 ng/µL tương ứng với 2,82 x 100 PCR thông thường, xét nghiệm LAMP cung bản sao gen/ µL. Bộ kít ECHO-LAMP chế cấp độ đặc hiệu 88,8% và độ nhạy 100% tạo có độ nhạy và độ đặc hiệu cao (trên [13]. Agathe Nkouawa và CS năm 2010, 93% và trên 98%). Bộ kít này cho phép đã so sánh khả năng chẩn đoán LAMP ứng dụng kỹ thuật LAMP thuận tiện hơn, với multiplex PCR để phát hiện phân biệt khả năng chính xác tương đương các kỹ loài Taenia trong mẫu phân của bệnh thuật PCR khác và có triển vọng thể triển nhân nhiễm sán dây. Phương pháp khai tại cơ sở y tế địa phương. LAMP không có dương tính giả, cho thấy độ nhạy cao hơn (88,4%) so với multiplex PCR (37,2%) [14]. Do đó, phương pháp TÀI LIỆU THAM KHẢO LAMP có giá trị cao trong chẩn đoán phân 1. Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Nguyễn Thị tử bệnh sán dây trên người. Hương Bình, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Thu Huyền, Trần Văn Hải, Trần Thanh Dương. Nghiên cứu này có một số hạn chế khi Phát triển kỹ thuật LAMP phát hiện sán lá gan chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng lớn Fasciola spp. Tạp chí Khoa học và Công LAMP cho chẩn đoán Echicoccosis trên nghệ Việt Nam 2020; 62(7):23-28. người và mới được thực hiện tại phòng 2. Nguyễn Thị Hương Bình. Báo cáo Tổng thí nghiệm nên chưa đánh giá đầy đủ tính kết nhiệm vụ khoa học thường quy: Ứng dụng ổn định của bộ sinh phẩm. Ở nghiên cứu và phát triển kỹ thuật LAMP để định loại P. này, chúng tôi mạnh dạn so sánh với kỹ falciparum và P.vivax tại phòng thí nghiệm, năm 2015. thuật qPCR, bộ kít ECHO-LAMP và số 3. Trần Thanh Dương và CS. Nghiên cứu liệu bước đầu cho thấy hiệu quả khả chế tạo bộ kít LAMP chẩn đoán ký sinh trùng quan trong chẩn đoán bệnh Echinococcus sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, trên người. Tuy nhiên, để ứng dụng trong giun lươn đường ruột tại thực địa”, mã số lâm sàng, chúng tôi cần thử nghiệm và so KC.10.16/16-20. Bộ Khoa học và Công nghệ sánh với cỡ mẫu lớn hơn, hướng đến https://most.gov.vn/vn/tin-tuc/18760/thong-tin- ứng dụng rộng rãi trên cộng đồng. ve-ket-qua-thuc-hien-nhiem-vu-cap-quoc-gia- 46
T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 - 2022 nghien-cuu-che-tao-bo-kit-lamp-chan-doan- 10. Avcioglu H., Esin G., Ibrahim B., et al. ky-sinh-trung-sot-ret--san-la-gan-.aspx cập nhật First Molecular Characterization of Echinococcus ngày 13/11/2020. multilocularis in Turkey Vector-borne and 4. Anh Đào Nguyễn Thị, Nguyễn Đỗ Phúc, zoonotic diseases 2016; 20(20) Mary Ann Hoàng Hoài Phương, Lê Thị Hiên. Ứng dụng Liebert, Inc. Doi: 10.1089/vbz. 2016. 1983 kỹ thuật LAMP để phát hiện Listeria 11. Cruz M.L., Perez A., Domínguez M., monocytogenes trong thực phẩm. Tạp chí et al. Assessment of the sensitivity and Y học TP. Hồ Chí Minh. 2012; 16(3):27-32. specificity of serological (IFAT) and molecular (direct‐PCR) techniques for diagnosis of 5. Hong Ngoc NT, Huong Binh NT, Hong leishmaniasis in lagomorphs using a Bayesian NV, Thang ND, Huong NT, et al. In-house approach. Veterinary Medicine and Science validation of a lamp Kít for diagnosis of 2016; 2(3):211-220. Plasmodium, Plasmodium falciparum and 12. Harold Salant, Ibrahim Abbasi, and Plasmodium vivax in Vietnam. Glob J Infect Joseph Hamburger. The development of a Dis Clin Res 2020; 6(1):048-053. DOI: loop-mediated isothermal amplification https://doi.org/10.17352/2455-5363.000035. method (LAMP) for Echinococcus granulosis 6. Mcmanus DP, Zhang W, Li J, et al. coprodetection Am. J. Trop. Med. Hyg 2012; Echinococcosis. Lancet. 2003; 362:1295- 87(5):883-887 doi:10.4269/ajtmh 2012.12-0184. 1304. 13. Xing-Wei Ni, Donald P. McManus et. 7. Aboelhadida M., Khaled M. El-D., al. A comparison of loop-mediated isothermal Tokuma Y., et al Molecular characterization amplification (LAMP) with other surveillance of Echinococcus granulosus in Egyptian tools for echinococcus granulosus diagnosis donkeys Veterinary Parasitology 2013; in canine definitive hosts PLUS ONE Published: 193:292-296. July 9, 2014 https://doi.org/10.1371/journal. pone.0100877. 8. Adwan G., Kamel A., Sami B., Sameh A., 14. Agathe Nkouawa, Yasuhito Sako, et al., Molecular characterization of Echinococcus Evaluation of a loop-mediated isothermal granulosus isolated from sheep in Palestine amplification method using fecal specimens Experimental Parasitology 2013; 134:195-199. for differential detection of taenia species from 9. Ali TI. Ibrahim OEm, Al-sultan II. Hydatid humans. Journal of Clinical Microbiology, hepatic-broncho-pleural (hepato-pulmonary) Sept 2010; 3350-3352Vol. 48, No. 90095- fistula caused by Echinococcosis granulosa: A 1137 doi:10.1128/JCM.00697-10 Copyright © zoonotic case report. Malaysian Journal of 2010, American Society for Microbiology. Veterinary Research 2018; 9:91-97. All Rights Reserved. 47