Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

---------  ---------

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 62.62.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Tp. Hồ Chí Minh, 2016

Công trình được hoàn thành tại:

VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. THÁI XUÂN DU

2. TS. NGUYỄN ĐÌNH LÂM

Phản biện 1: ..................................................................................

Phản biện 2: ..................................................................................

Phản biện 3: ..................................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

V o hồi giờ ngày ..... tháng ..... năm ......

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1. Thư viện Quốc gia

2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

3. Thư viện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

1

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài

Đối với nước ta, việc sản xuất ethanol có thể có những hạn chế nhất định, đó l diện6 tích đất nông nghiệp hạn hẹp nên khả năng mở rộng diện tích trồng cây nguyên liệu có nhiều khó khăn, các cây nguyên liệu cho sản xuất ethanol sinh học đều là những cây lương thực chủ yếu, cây làm thức ăn chăn nuôi có liên quan đến an ninh lương thực cần phải xem xét cẩn trọng Hơn nữa phát triển mạnh việc trồng cây sắn trên đất dốc sẽ gây ra xói mòn đất (bồi lấp cửa sông, lòng hồ đập...).Cho nên việc định hướng phát triển diesel sinh học sẽ có nhiều thuận lợi hơn Trong số những loài cây có khả năng sản xuất diesel sinh học thì cây cọc r o được chú ý hơn cả do dễ trồng, biên độ sinh thái rộng, khả năng chống chịu tốt và hàm lượng dầu trong hạt khá cao.

Chương trình phát triển nhiên liệu sinh học nói chung, nói riêng nhất là từ cây cọc r o đã nhận được sự ủng hộ mạnh mẽ của Nh nước. Ngày 20 tháng 11 năm 2007, Thủ Tướng Chính Phủ đã ra quyết định số 177/2007/QĐ ˗ TTg về việc phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Ng y 19 tháng 6 năm 2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số 1842/QĐ˗BNN˗LN về việc phê duyệt Đề án “Nghiên cứu, phát triển và sử dụng sản phẩm cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Việt Nam giai đoạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn đến 2025”

Hiện nay, cây giống cọc r o được dùng để phát triển vùng nguyên liệu chủ yếu được gieo từ hạt và cành giâm.Mỗi phương thức sản xuất giống đều có ưu v nhược điểm nhất định. Cây giống được gieo từ hạt thì giá thành cây giống thấp nhưng bị phân ly do cọc rào là cây thụ phấn chéo nên khó kiểm soát được năng suất. Cây giống được sản xuất từ cành giâm của những cây gieo từ hạt thì cũng không đảm bảo tính đồng nhất về mặt di truyền. Chính vì vậy, xu hướng gần đây các nh khoa học nghiên cứu nhân giống theoquy trình kỹ thuật cơ bản như sau: (1) Nhân giống in vitro một số cây đầu dòng tốt đã tuyển chọn được. Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu có thể l đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2)

2

Trồng những cây cấy mô ra đồng ruộng; (3) Chọn lọc lại và nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi soma từ những cây nuôi cấy mô nói trên để tăng hệ số nhân giống và làm hạ giá thành cây giống.

Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một phương pháp mới, nghiên cứu về khả năng biệt hóa của tế bào. Hệ thống tế bào lớp mỏng với đặc tính mỏng có nhiều ưu điểm quan trọng để tái thiết lập chương trình cho việc tạo phôi soma. Sự thuận lợi của phương pháp nghiên cứu lớp mỏng tế bào là: tần số phát sinh cơ quan cao, đồng thời chỉ trong thời gian ngắn đã cho kết quả. Nếu chọn được môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp thì hầu như 100% mẫu cấy có phản ứng Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế b o cũng l một phương pháp mới, nghiên cứu về khả năng biệt hóa của tế bào.

Chỉ thị phân tử được phát triển và ứng dụng từ đầu thập niên 90 của thế kỷ XX.Sự phát triển và ứng dụng của chỉ thị phân tử để xác định và sử dụng những biến đổi của DNA là một bước phát triển quan trọng nhất trong lĩnh vực di truyền chọn giống ở thực vật Cho đến n y đã có rất nhiều loại chỉ thị phân tử được phát triển v đưa v o sử dụng. Mỗi loại chỉ thị đều có nguyên lý, kỹ thuật, phạm vi ứng dụng khác nhau và phù hợp cho từng mục đích nghiên cứu khác nhau. Không có một kỹ thuật chỉ thị phân tử n o đáp ứng đầy đủ yêu cầu các nhà nghiên cứu.Trong số các chỉ thị phân tử thì RAPD được xem l tương đối đơn giản và rẻ tiền nhất để nghiên cứu về tính ổn định di truyền của cây giống nuôi cấy mô.Trên thế giới, kỹ thuật RAPD được sử dụng rất nhiều trong nghiên cứu tính ổn định di truyền và lai tạo giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trong phạm vi nghiên cứu của luận án này, vì tính chất lịch sử trong đề cương nghiên cứu và giới hạn kinh phí nghiên cứu, thì kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để đánh giá kiểm tra tính ổn định di truyền của cây con cọc rào từ quy trình vi nhân giống.

Từ những vấn đề đã nêu trên, việc thực hiện luận án: “Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống” nhằm đưa ra

3

một phương pháp mới để vi nhân giống hiệu quả số lượng lớn cây cọc rào chất lượng cao, ổn định về mặt di truyền so với cây đầu dòng. 2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào; Xây dựng được quy trình vi nhân giống hiệu quả từ nuôi cấy phôi soma; Đánh giá mức độ ổn định di truyền ở cây cọc rào vi nhân giống tạo thành bởi phôi soma được cảm ứng từ mô sẹo nuôi cấy bằng kỹ thuật lớp mỏng tế bào lá, từ đó l m cơ sở cho việc sản xuất cây giống in vitro. 3. Tính mới của đề tài

Luận án đã xây dựng được quy trìnhvi nhân giống từ phôi soma cây cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá. Quy trình đảm bảo các mục tiêu có hiệu suất nhân giống cao, ổn định di truyền, chất lượng tốt Đây l quy trình được xây dựng đầu tiên ở Việt Nam và có một v i điểm cải tiến so với những kết quả nghiên cứu trên thế giới.

Trong đề t i n y đã nghiên cứu thay thế các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh bằng một số acid amine và polyamine trong một số giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma trên cây cọc r o Đây có thể là tính mới của luận án so với những kết quả nghiên cứu phát sinh phôi soma trên cây cọc rào ở trong nước cũng như trên thế giới.

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Đây l một hướng nghiên cứu mới trong nuôi cấy in vitro tại Việt Nam trên đối tượng cây cọc rào; Đề t i đóng góp một số kết quả nghiên cứu về phát sinh hình thái, di truyền chọn giống cũng như vi nhân giống cây thân gỗ.

Ý nghĩa thực tiễn:Từ quy trình vi nhân giống của luận án có thể sản xuất cây giống cọc rào ổn định về mặt di truyền, có năng suất và hàm lượng dầu cao đáp ứng cho nhu cầu cao của xã hội; Các cá nhân, cơ quan có nhu cầu nghiên cứu có thể sử dụng tham khảo quy trình công nghệ vi nhân giống cây cọc rào từ kết quả của đề tài này; Một số cơ quan

4

nghiên cứu, doanh nghiệp cần được chuyển giao quy trình công nghệ vi nhân giống cây cọc rào từ kết quả của đề tài này. 5. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu trên đối tượng cây cọc rào giống Ấn Độ. Giống n y đã được nhập nội đã được khảo nghiệm từ đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn giống và công nghệ trồng cây dầu mè Jatropha curcasL. để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường thành phố” đã được thực hiện do Ban quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010. Lá của những cây cọc r o trưởng th nh được thu nhận và sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng những phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật trong xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ phôi soma; Sử dụng những công cụ hiện đại trong đánh giá mức độ ổn định di truyền ở cây giống từ phôi soma; Sử dụng phương pháp giải phẫu mô tế bào thực vật và quan sát hình thái trong nghiên cứu phát sinh hình thái. 6. Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 132 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (04 trang); Chương 1 Tổng quan tài liệu (36 trang); Chương 2 Nội dung và phương pháp (17 trang); Chương 3 Kết quả - thảo luận (54 trang); Kết luận và kiến nghị (02 trang). Các công trình công bố liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang) với 223 tài liệu tham khảo trong đó có 17 tài liệu tiếng Việt và 206 tài liệu tiếng Anh. Luận án có 12 bảng số liệu, 26 hình.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cây cọc rào (Jatropha curcas L.) thuộc họ cây Thầu dầu (Euphorbiaceae) có nguồn gốc từ châu Mỹ được biết đến với nhiều giá trị trong sản xuất phân hữu cơ, thuốc trừ sâu, dược liệu, đặc biệt là ứng dụng trong sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel) thân thiện với môi trường với h m lượng dầu trong hạt cao 35 - 40%, 50 - 60% ở nhân hạt (Sunder và cộng sự, 2006) Để sản xuất biodiesel hiệu quả từ cây cọc rào

5

điều quan trọng là cần có giống tốt và nhân những cây đầu dòng để phát triển vùng nguyên liệu (Isabel và cộng sự, 1993; Leroy và cộng sự, 2000). Vi nhân giống cây J. curcas đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, cây con được tái sinh từ nuôi cấy các bộ phận khác nhau như: chồi nách, chồi đỉnh, đốt thân, lá,…(Isabel và cộng sự, 1993; Leela và cộng sự, 2011; Leroy và cộng sự 2000). Quá trình phát sinh phôi soma ở cây cọc rào trở thành một phương pháp lý tưởng để nhân giống tạo số lượng lớn cây giống v phương pháp n y đã được áp dụng thành công trên cây cọc rào (Bennici và cộng sự, 2004; Fourré và cộng sự, 1997; Ishii và cộng sự, 1999; Nhut và cộng sự, 2013).

Tuy nhiên, tính không đồng nhất di truyền của tế bào soma và tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy in vitro có thể góp phần làm xuất hiện các biến dị soma, điều này dẫn đến sự chọn lọc mất ổn định v l m tăng sự biến dị di truyền trong suốt giai đoạn đầu nuôi cấy. Việc đánh giá tính ổn định di truyền của cây giống cấy mô cần được quan tâm để định hướng trong quá trình sản xuất cây giống hàng loạt.

Trong luận án này, sử dụng phương pháp RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền ở cây cọc r o được tái sinh thông qua phôi soma dưới tác động của các yếu tố theo thời gian nuôi cấy trong quá trình nuôi cấy in vitro có thể góp phần làm xuất hiện các biến dị soma. Để bổ sung cho tính chính xác cao của phương pháp RAPD, trong luận án có nghiên cứu khả năng biến di kiểu hình và sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào trong đánh giá biến dị ở mức đa bội thể của cây nhân giống từ phôi soma. Kết quả nghiên cứu này sẽ giúp định hướng thiết lập quy trình nhân giống, giúp sản xuất cây cọc rào với số lượng lớn trong thời gian ngắn bằng kỹ thuật vi nhân giống.

Chƣơng 2

NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

Địa điểm thí nghiệm: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc Gia về

Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới.

6

Thời gian thực hiện: Thời gian thực hiện từ tháng 01/2011 đến tháng 03/2015.

Đối tƣợng nghiên cứu: Đối tượng được sử dụng là giống cọc rào (Jatropha curcas L ) được nhập từ Ấn Độ trồng tại vườn ươm của Viện Sinh học nhiệt đới.

Giống Ấn Độ nhập nội đã được khảo nghiệm từ đề t i “Nghiên cứu tuyển chọn giống và công nghệ trồng cây dầu mè Jatropha curcas L để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường thành phố” đã được thực hiện do Ban quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007– 2010. 2.1. Nội dung nghiên cứu 2.1.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan phôi soma  Nội dung 1.1. Khảo sát tạo nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá  Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ auxin ngoại

sinh lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và kinetin lên khả năng sinh phôi soma

 Nội dung 1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh, sự biệt hóa và trưởng thành của nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi: ảnh hưởng của một số nồng độ acid amine và spermidine  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma

 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành phôi soma  Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi soma  Nội dung 1.3. Khảo sát khả năng tái sinh, phát triển thành cây

con hoàn chỉnh của phôi soma

7

 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma  Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA, NAA lên sự phát triển rễ của cây con tái sinh từ phôi soma  Thí nghiệm 9: Khảo sát khả năng ươm cây từ phôi soma ở vườn ươm, thử nghiệm một số loại giá thể

2.1.2. Nội dung 2: Đánh giá mức độ ổn định di truyền của cây giống từ phôi soma  Nội dung 2.1. Khảo sát mức độ biến dị kiểu hình ở cây phát triển từ phôi soma Thí nghiệm 10: Khảo sát các biến dị kiểu hình ở cây phát triển từ  phôi soma  Nội dung 2.2. Khảo sát mức độ bội thể của cây giống từ phôi soma

+ Thí nghiệm 11: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế b o đánh

giá mức độ bội thể của cây cọc rào nhân giống in vitro  Nội dung 2.3. Khảo sát mức độ biến dị di truyền của cây giống từ phôi soma

+ Thí nghiệm 12: Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh về mặt di truyền của cây giống từ phôi soma với cây đầu dòng

2.1.3. Nội dụng 3: Xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp giải phẫu quan sát hình thái của phôi soma, mô sẹo có khả năng sinh phôi và mô sẹo không có khả năng sinh phôi Hình thái của phôi, mô sẹo được theo dõi bằng phương pháp giải

phẫu, nhuộm hai màu (Nguyễn Tiến Bân và cộng sự, 1979). 2.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thực vật

Các lá sẽ được cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng tế bào (Tran Thanh Van, 1973) theo chiều ngang, mỗi mảnh nhỏ lá có kích thước 0,5 mm x 10 mm v được dùng làm vật liệu nuôi cấy cho từng thí nghiệm cụ thể.

8

2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu

Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD) theo phương pháp của Compton và Mize, 1999, sử dụng để nghiên cứu thực vật trong phòng thí nghiệm và nhà kính [37]; Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV I theo phương pháp LSD - Least Significant Difference (Hayter, 1986) ở mức ý nghĩa 5% [82] 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện nuôi cấy mô: Thời gian chiếu sáng l 10h/ng y, cường độ chiếu sáng là 2500 lux. Nhiệt độ: 25  2C Độ ẩm trung bình: 60  5%. - Điều kiện ngo i vườn ươm: Vườn ươm theo chuẩn được che sáng.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

3.1. Kết quả 3.1.1. Ảnh hƣởng của các auxin ngoại sinh lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá Ảnh hưởng của auxin NAA, IBA lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào

Sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung IBA và NAA riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau cho thấy các mẫu cấy lớp mỏng lá của cây cọc rào không có sự hình thành mô sẹo mà còn có dấu hiệu hóa nâu và chết. Từ kết quả thu được chúng tôi có thể kết luận rằng IBA và NAA là những loại auxin ngoại sinh không thích hợp để cảm ứng sự hình thành mô sẹo của TCL lá cây cọc rào.

Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào

Kết quả cho thấy 2,4-D cảm ứng hiệu quả sự tạo mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng lá cây cọc rào. Nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D đạt kết quả ở các chỉ tiêu khối lượng tươi 77,75 mg, khối lượng khô 4,11 mg, tỷ lệ tạo mô sẹo 98,40%, tỷ lệ sống 90,30%.

9

Nồng độ 2,4-D (mg/l) 0,0 0,1 0,5 1,0 1,5

Khối lƣợng tƣơi (mg) 0,80dx 8,01c 77,75b 80,44a 81,62a

Quan sát hình thái giải phẫu bằng phương pháp nhuộm kép acetocarmine v Evan’s blue được sử dụng để nhuộm tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi có nhân lớn và tế bào chất đậm đặc nhuộm m u đỏ sáng mạnh với acetocarmine. Kết quả cho thấy trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có hiệu quả để cảm ứng sự hình thành mô sẹo có khả năng sinh phôi soma cây cọc rào. Bảng 3.1.Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D lên sự phát sinh hình thái sau 28 ngày nuôi cấy Tỷ lệ sống Nghiệm (%) thức 20,36d D0 60,18c D1 90,30b D2 93,58a D3 92,22ab D4 * 41,16

Khối lƣợng khô (mg) 0,16e 1,13d 4,11c 5,20a 4,71b * 68,58

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 0,00c 10,52b 98,40a 97,95a 98,79a * 77,47

* 77,24

ANOVAy CV%

2,4-D (mg/l) 0,5 0,5 0,5 0,5 - - - -

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05. 3.1.2. Ảnh hƣởng của sự kết hợp 2,4-D và kinetin lên khả năng phát sinh phôi soma Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo Kinetin Nghiệm (mg/l) thức 0,5 A1 1,0 A2 1,5 A3 2,0 A4 0,5 A5 1,0 A6 1,5 A7 2,0 A8

Tỷ lệ hình thành phôi (%) 30,43f 77,33a 56,72b 49,52c 41,33e 79,29a 46,76d 44,67d * 30,89

Khối lƣợng tƣơi (mg) 12,86dx 62,95a 50,52b 33,19c 14,52d 60,33a 27,14c 28,38c * 52,08

ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy có sự hình thành phôi từ mô sẹo cây cọc r o trên môi trường có bổ sung 2,4˗D v kinetin ở các nồng độ khác nhau (Bảng 3.2) Môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D v 1,0 mg/l KINđược ghi nhận có hiệu quả tốt nhất để cảm ứng sự hình thành phôi từ mô sẹo có khả năng sinh phôi soma cây cọc rào với khối lượng tươi (62,95 g) v tỷ lệ hình thành phôi l (77,33%) đạt cao nhất so với các nghiệm thức cùng khảo sát. Mẫu cấy

10

trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l KIN đạt tỷ lệ cao về số mô sẹo phát sinh phôi (79,29%) và phôi soma phát triển qua nhiều giai đoạn: dạng cầu, dạng tim, dạng thủy lôi và dạng lá mầm. 3.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma

Số phôi/mẫu

11,66cx 45,07b 47,87b 72,33a 50,70b * 45,42

Khối lƣợng tƣơi (mg) 13,00c 50,07b 52,83b 81,37a 56,80b * 45,42

Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%) 23,33d 50,00c 60,00bc 86,67a 66,67b * 38,71

Proline (mg/l) 0 250 500 750 1000 ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các nghiệm thức bổ sung proline và nghiệm thức đối chứng. Khi tiếp tục gia tăng h m lượng proline lên, các chỉ tiêu theo dõi cũng có sự gia tăng v đạt cao nhất ở nghiệm thức có thành phần proline bổ sung là 750 mg/l với tỷ lệ hình thành phôi là 86,66%, số lượng phôi hình thành là 72,33 phôi/mẫu và khối lượng tươi là 81,37 mg. Nhìn chung, kết quả thí nghiệm cho thấy proline có tác động hiệu quả đối với sự hình thành phôi soma từ mẫu cấy mô sẹo có khả năng phát sinh phôi của cây cọc rào. Không chỉ giúp gia tăng sự tạo phôi, sự gia tăng khối lượng tươi của mẫu ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung proline cũng cho thấy proline có hiệu quả kích sinh sự tăng trưởng ở đây l sự gia tăng sinh sinh khối mẫu cấy. 3.1.4. Ảnh hƣởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma

Trong thí nghiệm này, mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được cấy v o môi trường MS cảm ứng phát sinh phôi, có bổ sung glutamine ở các nồng độ từ 50 đến 200 mg/l. Các mẫu được cấy trên môi trường có bổ sung glutamine ở các nồng độ khác nhau (từ 50 ˗ 150 mg/l) đạt tỷ lệ hình thanh phôi cao từ 53,33% đến 83,33%. Ở nghiệm thức có bổ sung 150 mg/l glutamine cho hiệu quả tạo phôi cao nhất với tỷ lệ hình thành

11

Số phôi/mẫu

Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%) 23,33d 53,33c 70,00b 83,33a 63,33bc * 36,93

Khối lƣợng tƣơi (mg) 13,10c 38,10b 52,87b 104,30a 54,00b * 68,39

11,66cx 33,13c 46,40b 67,60a 48,23b * 46,72

phôi là 83,33%, số lượng phôi hình thành là 67,6 phôi và khối lượng tươi của mẫu cấy là 104 mg. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma Glutamine (mg/l) 0 50 100 150 200 ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05. 3.1.5. Ảnh hƣởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành phôi soma

Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các nghiệm thức bổ sung adenine sulphate và nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức bổ sung 150 mg/l adenine sulphate cho kết quả tốt nhất ở các nghiệm thức khảo sát trong thí nghiệm với số liệu cụ thể là 76,67% ở tỷ lệ hình thành phôi với số phôi trung bình 52,43 phôi/mẫu và khối lượng tươi của mẫu là 59 mg, khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành phôi soma

Số phôi/mẫu

Khối lƣợng tƣơi (mg)

Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%)

11,66cx 29,07c 41,40b 52,43a 39,27b * 42,15

13,10c 33,50c 47,23b 59,23a 44,37b * 41,82

23,33d 46,67c 63,33b 76,67a 53,33bc * 36,22

Adenine sulphate (mg/l) 0 50 100 150 200 ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05. 3.1.6. Ảnh hƣởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi soma

Kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các nghiệm thức Trên môi trường có bổ sung spermidine, tỷ lệ hình thành phôi của các mẫu cấy cao hơn so với môi trường không bổ sung spermidine Trong đó, nghiệm thức bổ sung permidine ở nồng độ 0,03

12

Số phôi/mẫu

Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu (%) 23,33e 76,67c 100,00a 90,00b 70,00d * 39,00

Khối lƣợng tƣơi (mg) 13,40d 71,73c 113,90a 91,20b 67,47c * 50,55

11,67d 63,37c 102,70a 81,27b 61,13c * 48,83

mg/l cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ phát sinh phôi đạt 100%, số lượng phôi hình thành là 102,70 phôi và khối lượng tươi trung bình l 1139 mg Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi soma Spermidine (mg/l) 0,00 0,01 0,03 0,05 0,07 ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05. 3.1.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma

MT khoáng

Số lƣợng rễ

Chiều dài rễ (cm)

Khối lƣợng rễ (mg)

Chiều cao cây (cm)

Tỷ lệ hình thành rễ (%) 79,95d 93,33b 100,00a 86,67c 93,33b * 8,12

1,00dx 3,33b 4,07a 2,87c 3,07c * 36,93

0,54e 1,57b 2,02a 1,28d 1,44c * 36,52

1,29d 2,13a 2,38a 2,11b 1,93c * 19,34

1/2MS MS B5 WHITE WPM ANOVAy CV%

2,83e 13,29b 17,53a 10,37d 11,70c * 44,73 x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

Trong thí nghiệm này, các phôi hình thành lá mầm được nuôi cấy trên các môi trường khoáng khác nhau. Tỷ lệ hình thành rễ của cây con từ phôi soma đạt tương đối cao từ 80% đến 100% trên tất cả các môi trường khảo sát. Trên môi trường B5, tỷ lệ hình th nh rễ cũng như các chỉ tiêu khác đều cao hơn v khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại Cây con có sự hình thành rễ đạt 100% và phát triển tốt hơn so với các môi trường khoáng khác với số lượng rễ trung bình (4,07 rễ), chiều dài rễ (2,02 cm), khối lượng rễ (17,53 mg) và chiều cao cây con (2,38 cm) đạt được cao nhất Môi trường MS v WPM cũng cho thấy có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự hình thành rễ và phát triển của cây con, tuy nhiên rễ hình th nh trên các môi trường này ngắn và bị yếu hơn so với rễ hình th nh trên môi trường B5.

13

3.1.8. Ảnh hƣởng của IBA, NAA lên sự phát triển rễ của cây con tái sinh từ phôi soma

Kết quả tốt nhất của thí nghiệm được ghi nhận ở nghiệm thức bổ sung 1,5 mg/l IBA với số lượng rễ (4,53 rễ), chiều dài rễ (3,02 cm), khối lượng rễ (27,07 mg), chiều cao cây (3,23 cm) đạt cao nhất. Cả IBA và NAA đều cho thấy hiệu quả kích thích hình thành rễ của cây tái sinh từ phôi soma. Khi so sánh hiệu quả của IBA và NAA, ở cùng một nồng độ, các nghiệm thức bổ sung IBA đều có ảnh hưởng tốt hơn các nghiệm thức bổ sung NAA lên sự hình thành rễ cây cọc rào trong thí nghiệm này, các rễ hình thành trên môi trường bổ sung IBA to khỏe, nhiều v d i hơn các rễ hình th nh trên môi trường chứa NAA. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma

CĐHSTTV (mg/l)

Chiều dài rễ (cm)

Khối lƣợng rễ (mg)

Tỷ lệ tạo rễ (%)

Số lƣợng rễ

Chiều cao cây (cm)

NAA

IBA

0 0,5 1,0 1,5 2,0 - - -

0 - - - - 0,5 1,0 1,5

3,47dx 3,73cd 3,93bc 4,17b 4,10b 3,67cd 4,00bc 4,53a * 8,51

2,31f 2,36f 2,57d 3,03b 2,77c 2,45e 2,62d 3,23a * 11,52

86,67c 93,33b 100a 100a 100a 93,33b 100a 100a * 5,58

1,62h 1,83g 2,13e 2,58b 2,37d 1,99f 2,32d 3,02a * 18,02

14,07g 15,97f 19,13d 22,97b 21,03c 17,03e 21,37c 27,07a * 19,72

ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05. 3.1.9. Khảo sát khả năng ƣơm cây từ phôi soma ở vƣờn ƣơm, thử nghiệm một số loại giá thể

Tỷ lệ sống của cây và khả năng phục hồi (phát triển rễ, ra lá mới và tăng trưởng về chiều cao) là mối quan tâm đầu tiên khi đưa cây con in vitro ra ngo i vườn ươm Trên các giá thể trồng khác nhau khả năng sinh trưởng của bộ rễ cũng sẽ khác nhau, điều này ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và khả năng phục hồi sinh trưởng của cây trồng sau khi chuyển từ môi trường in vitro ra môi trường ex vitro. Yêu cầu của giá thể là vừa đảm bảo độ tơi xốp, có khả năng thoát nước tốt, có tính giữ ẩm cao đồng thời phải hoàn toàn sạch các mầm bệnh. Trên giá thể mụn dừa tỷ lệ cây sống

14

và số rễ trung bình trên một cây của cây con ngo i vườn ươm đạt cao nhất, tương ứng là 97,78% và 33,57 rễ. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển cây từ phôi soma khi ra vườn ươm

Nghiệm thức

Tỷ lệ sống (%)

Số rễ trung bình (cái)

1 Đất sạch 2 Đất 3. Mụn dừa 4. Mụn dừa + đất sạch (1:1) 5. Mụn dừa + đất (1:1) 6. Mụn dừa + đất + cát (1:1:1)

97,78ax 96,67a 97,78a 93,33ab 88,89b 86,67b * 5,92

19,60b 14,07c 33,57a 15,43c 15,30c 7,23d * 47,65

ANOVAy CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD. y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05. 3.1.10. Khảo sát các biến dị kiểu hình ở cây phát triển từ phôi soma

Theo quan sát và phân loại các kiểu hình từ 300 cây cọc rào in vitro thông qua tái sinh phôi soma đã thu được kết quả. Kết quả cho thấy số cây không nhận thấy biến dị kiểu hình là 217 cây với tỷ lệ chiếm 72,30%. Đặc điểm dễ nhận thấy ở những cây n y có thân vươn thẳng cao từ 0,5 ˗ 1,0 cm, thân tròn, khỏe. Có lá hình ovan hoặc hình trái tim, mép lá thẳng không bị xoắn lại; lá chia thùy và mọc theo kiểu xen kẻ, sắp xếp luân phiên nhau dọc theo thân và tập trung ở phần ngọn. Bảng 3.10.Kết quả phân loại kiểu hình

STT

Kí hiệu

Loại biến dị

Số lƣợng (cây)

Tỷ lệ (%)

72,30 8,00 2,00 17,70

1 2 3 4

BT BD1 BD2 BD3

Cây không biến dị Cây biến dị ở lá Cây biến dị ở thân Cây biến dị cả thân và lá

217 24 6 53

3.1.11. Sử dụng phƣơng pháp dòng chảy tế bào đánh giá mức độ bội thể của cây cọc rào nhân giống in vitro

Các nghiên cứu trước đây đã sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry-CMF) để khảo sát mức độ bội thể của cây cọc rào được nhân giống in vitro bằng các phương pháp khác nhau: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng; nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá; nuôi cấy phôi soma. Kết quả cho thấy 100% các cây cọc rào vi nhân giống bằng những phương

15

pháp nêu trên đều mang bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n), không có dạng dị bội nào. 3.1.12. Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh về mặt di truyền của cây giống từ phôi soma với cây đầu dòng

Sử dụng 2 mẫu cây đầu dòng (BM1 và BM2) thực hiện phản ứng RAPD với 19 mồi để sàng lọc các mồi hữu hiệu dùng cho khảo sát các biến dị kiểu gen của 8 mẫu nghiên cứu. Sau khi sàng lọc mồi với mẫu BM chọn được 8 mồi OPAL12, OPG02, OPAK14, OPC18, OPB01, OPAW07, OPM11, OPB07 cho kết quả với tổng số băng đủ lớn, các băng phân biệt rõ, riêng biệt để thực hiện đánh giá tính ổn định của các mẫu cọc rào sau khi nhân giống phôi soma bằng phản ứng RAPD.

Phản ứng RAPD sử dụng 8 mồi thu được 47 băng, tổng số băng của mỗi mồi khoảng 4 ˗ 8 v kích thước sản phẩm khuếch đại 370 ˗ 3000 bp Bảng 4.12 cho thấy đa số các mồi cho kết quả đồng hình tuy nhiên có xuất hiện các băng đa hình ở 2 mồi (OPM11, OPG02).

Khoảng cách di truyền giữa 8 mẫu con với cây dầu dòng được thể hiện. Các mẫu được chia thành 3 nhóm lớn kiểu di truyền. Nhóm 1 bao gồm BM1, BM2, L1 1 v L1 2 (97,44% tương đồng). Nhóm 2 gồm L3.1, L3.2 v L6 1 (98,37% tương đồng). Nhóm 3 là mẫu L6.2, L9.1, L9.2 (100% tương đồng). Khoảng cách di truyền xa nhất với BM1, BM2 là L6.2, L9.1 v L9 2 (95,83% tương đồng), trong khi đó mẫu tương đồng gần nhất với BM l L1 1 v L1 2 (tương đồng 100%) Điều này cho thấy các mẫu có độ tương đồng cao (0,985) đảm bảo cây con từ phôi soma có tính ổn định di truyền cao so với cây bố mẹ. Tuy nhiên khoảng cách di truyền tăng sau các lần cấy truyền do nhiều yếu tố tác động trong quá trình nhân giống như môi trường nuôi cấy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng. 3.1.13. Quy trình nhân giống in vitro cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma

Theo quy trình vi nhân giống cây cọc rào bằng nuôi cấy phôi soma, sau 49 tuần thời gian (khoảng 1 năm) từ một mẫu lá non từ cây bố mẹ thông qua chọn lọc chúng ta có thể tạo ra được trên 5 triệu cây giống phôi soma. Cây giống n y đảm bảo các tính năng: ổn định di truyền so

16

với cây bố mẹ, sạch bệnh, có rễ cọc giống cây từ hạt Đồng thời với hệ số nhân giống lớn như vậy quy trình này có thể đáp ứng được nhu cầu cây giống rất lớn ở quy mô canh tác cây cọc rào sau này. 3.2. Thảo luận 3.2.1. Thảo luận nội dung 1

Hệ thống vi nhân giống cây cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi soma có thể giải quyết được 3 nhược điểm của những phương pháp nhân giống cổ điển mắc phải trên đối cây này gồm:

- Khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh kém của cây giâm cành: cây cọc rào là loại cây có khả năng chịu hạn cao, được trồng ở những vùng khô hạn. Do vậy, phương pháp nhân giống bằng giâm cành đối với lo i cây n y có đời sống ngắn hơn v khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt. Bởi vì, cây con từ cành giâm không tạo được rễ cọc thật sự nên khả năng kháng hạn kém, thay v o đó chúng tạo ra các rễ cọc giả chỉ có thể cắm xuống đất khoảng 1/2 - 2/3 so với rễ cọc được tạo ra từ cây con gieo hạt. Rễ của cây giâm cành phát triển yếu, dễ bị gãy đổ. Phôi soma ở cây cọc r o đều có cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, m dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng ho n chỉnh gần giống như hạt hữu tính (Dương Tấn Nhựt, 2007) Do đó những cây giống từ phôi soma sẽ cũng có rễ cọc như cây từ hạt hữu tính và khả năng chống chịu khô hạn và bệnh tật cũng như cây hữu tính.

- Khả năng biến dị di truyền do thụ phấn chéo của cây gieo hạt: trồng cây cọc r o để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt được sử dụng nhiều hơn Hạt trước khi đem gieo được lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy. Hạt được ngâm nước qua đêm để làm tăng tỷ lệ nảy mầm. Hôm sau, hạt được gieo vào trong các bầu đất. Hạt sẽ nảy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày. Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thường có 1 rễ cái và 4 rễ bên. Cây trồng ngoài thực địa sẽ ra hoa sau khoảng 3 - 4 năm Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con không đồng nhất bởi cây cọc rào là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt

17

có sự khác nhau về mặt di truyền Như xét tính trạng h m lượng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có h m lượng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 %. Vì vậy ở những cây cọc rào nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy phôi soma về nguyên tắc thì những cây con được tái sinh bằng con đường n y thì đều có vật chất di truyền giống hệt tế b o sinh dưỡng của cha mẹ, nếu tế b o n y được chuyển gen thì cây tái sinh là cây chuyển gen Do đó những cây giống phôi soma đều đồng nhất về mặt di truyền so với những cây đầu dòng đã qua chọn lọc.

- Hạn chế của hệ số nhân giống không cao, không chủ động trong nhân giống, cây con không ổn định di truyền so với cây bố mẹ đối với nhân giống bằng hạt: phôi soma rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi soma không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Về nguyên tắc, tất cả những cây con được tái sinh bằng con đường này đều có vật chất di truyền giống hệt các tế b o sinh dưỡng cha mẹ, nếu tế b o n y được chuyển gen thì các cây tái sinh là cây chuyển gen. Nhân giống vô tính thực vật qua con đường phát sinh phôi soma cho hệ số nhân rất cao, ổn định về mặt di truyền so với cây bố mẹ được chọn lọc. 3.2.2. Thảo luận chung nội dung 2

Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính nói chung và kỹ thuật nhân giống thông qua nuôi cấy phôi soma nói riêng được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma. Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng rất ít những biến dị có lợi được báo cáo.

Đối với mức độ biến dị kiểu hình ở cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: cho thấy có nhiều kiểu biến dị khác nhau. Tổng số cây có biểu hiện biến dị kiểu hình chiếm tỷ lệ 27,7%. Kết quả trên cho thấy tỷ lệ các cây có biểu hiện biến dị kiểu hình là khá cao. Các biến dị kiểu hình này xuất hiện có thể là do tác động của quá trình nuôi cấy mô, vì trong môi trường nuôi cấy mô sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ

18

cao đã tác động vào quá trình biểu hiện gen. Một số ghi nhận ở những đối tượng cây như cây bông vải, lúa nước (Oryza), lúa mì (Triticum) cây ho n chỉnh phát sinh thông qua giai đoạn callus thì tần số cây bị bạch tạng hoặc cây không phát triển bình thường chiếm khá cao (20 – 30 % hoặc cao hơn nữa). Tuy nhiên, các thay đổi kiểu hình có thể là tạm thời và sẽ không di truyền cho thế hệ sau. Cây cọc rào in vitro từ nuôi cấy phôi soma biến dị kiểu hình thường kém phát triển so với cây bình thường, không sống được khi đưa ra ngo i vườn ươm Do đó, trong luận án này, đối với cây cọc rào từ phôi soma có biến dị kiểu hình sẽ được loại bỏ ngay v không đưa ra ngo i vườn ươm Quá trình n y nhằm cũng phần n o đó đã l m giảm khả năng cây cọc rào nhân giống thông qua nuôi cấy phôi soma triển khai ngo i vườn ươm có biến dị kiểu gen Như vậy quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma chỉ nhận được kết quả với tỷ lệ khoảng 70% cây hình thành có khả năng ra ngo i vườn ươm Tỷ lệ này là chấp nhận được với hai mục tiêu hệ số nhân rất lớn từ nuôi cấy phôi soma và giảm khả năng biến dị khi cây triển khai trồng ngo i đồng ruộng.

Đối với mức độ biến dị thể bội của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: kết quả phân tích mẫu lá của các nhóm cây so sánh bằng phương pháp dòng chảy tế bào cho thấycác cây con cọc rào từ phôi soma đều có mức độ bội thể 2n. Kết quả n y có được có thể l do chúng ta đã loại bỏ những cây có biến dị kiểu hình trước khi ra ngo i vườn ươm Những hiện tượng tự đa bội hóa của tế bào trong quá trình nuôi cấy in vitro cũng đã được ghi nhận. Lần đầu tiên Nitsch và cộng sự (1969) ứng dụng để nhân được cây thuốc lá nhị bội từ mô sẹo đơn bội [131]. Woo và Chen (1982) đã quan sát thấy mô sẹo và cây lúa tái sinh từ hạt phấn in vitro tồn tại ở các mức bội thể rất khác nhau [201]. Kết quả nghiên cứu trên cây lúa qua nhiều lần quan sát cho thấy mức bội thể ở mô sẹo mới xuất hiện dưới 5 ng y như sau: đơn bội 78,38%; nhị bội 11,74%, số còn lại là mô sẹo ở các mức đa bội khác từ 3n đến 5n. Cây lúa xuất hiện từ mô sẹo cũng có mức đa bội thể khác nhau, trong số 168 cây nhận được

19

từ hạt phấn có 62% là cây nhị bội, 35% cây đơn bội, số còn lại là tam bội.

Đối với mức độ biến dị di truyền của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: ở đâychúng tôi muốn tìm hiểu số lần cấy chuyền (số lần cấy chuyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn) trong quá trình nhân phôi soma có ảnh hưởng tới khả năng biến dị di truyền của cây cọc rào. Kết quả cho thấy chỉ có biến dị ở mức nhỏ từ lần cấy chuyền thứ 6 trở lên.Khoảng cách di truyền xa nhất với ở lần cấy truyền thứ 9 so với cây bố mẹ l 95,83% tương đồng, trong khi đó mẫu tương đồng gần nhất với cây bố mẹ là lần cấy chuyền thứ 1 tới thứ 3 (tương đồng 100%) Điều này cho thấy các mẫu có độ tương đồng cao đảm bảo cây con từ phôi soma có tính ổn định di truyền cao so với cây bố mẹ.

Như vậy, những cây giống từ vi nhân giống cây cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi soma nếu như đã loại bỏ những cây bị biến dị kiểu hình thì hầu như không có biến dị kiểu gen ở mức đa bội thể, và ở mức kiểu di truyền. Trong quy trình vi nhân giống cây cọc rào,cần phải loại bỏ ở tỷ lệ biến dị kiểu hình cao gần 30%, nhưng hệ số nhân giống của quy trình lại rất lớn sẽ bù đắp lại. Mặt khác sự loại bỏ những phôi soma bị biến dị ở giai đoạn tăng sinh mạnh trong quy trình vi nhân giống nên chi phí không đáng kể. Vì vậy qua quá trình sàng lọc trong quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ phôi soma vẫn đảm bảo hiệu quả: hệ số nhân giống cao, ổn định về mặt di truyền so với cây đầu dòng, chất lượng cây giống ổn định v đồng đều.

20

Chƣơng 4

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

- Nghiên cứu sự phát sinh phôi: + Đã chứng minh được sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào. - Nghiên cứu sự ổn định di truyền của cây nhân giống từ nuôi cấy

phôi soma:

+ Đối với mức độ biến dị kiểu hình ở cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: cho thấy có nhiều kiểu biến dị khác nhau. Tổng số cây có biểu hiện biến dị kiểu hình chiếm tỷ lệ 27,7%. Trong quá trình nuôi cấy sẽ loại bỏ những biến dị này.

+ Đối với mức độ biến dị thể bội của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: kết quả phân tích mẫu lá của các nhóm cây so sánh bằng phương pháp dòng chảy tế bào cho thấycác cây con cọc rào từ phôi soma đều có mức độ bội thể 2n.

+ Đối với mức độ biến dị di truyền của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma: Kết quả cho thấy chỉ có biến dị ở mức nhỏ từ lần cấy truyền thứ 6 trở lên. Khoảng cách di truyền xa nhất với ở lần cấy truyền thứ 9 so với cây bố mẹ l 95,83% tương đồng, trong khi đó mẫu tương đồng gần nhất với cây bố mẹ là lần cấy truyền thứ 1 tới thứ 3 (tương đồng 100%) Điều này cho thấy các mẫu có độ tương đồng cao đảm bảo cây con từ phôi soma có tính ổn định di truyền cao so với cây đầu dòng.

- Quy trình nhân giống in vitro cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro hiệu quả ở cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma. Theo quy trình vi nhân giống cây cọc rào bằng nuôi cấy phôi soma, sau 49 tuần thời gian (khoảng 1 năm) từ một mẫu lá non từ cây bố mẹ thông qua chọn lọc chúng ta có thể tạo ra được trên 5 triệu cây giống phôi soma. Cây giống n y đảm bảo các tính năng: ổn định di truyền so với cây bố mẹ, sạch bệnh, có rễ cọc giống cây từ hạt. Đồng thời với hệ số nhân giống lớn như vậy quy trình này có thể đáp

21

ứng được nhu cầu cây giống rất lớn ở quy mô canh tác cây cọc rào sau này.

Hình1. Sơ đồ quy trình nhân giống cây cọc rào in vitro

4.2. Đề nghị

- Từ quy trình nhân giống này, tiếp tục nghiên cứu khảo nghiệm cây giống cọc rào từ phôi soma ngo i đồng ruộng để đánh giá về khả năng

22

tăng trưởng v năng suất trước khi phục vụ cho triển khai sản xuất hoặc tuyển chọn giống sau này.

- Kết hợp phân nhóm di truyền dựa vào thực hiện phản ứng RAPD với việc phân nhóm di truyền dựa v o các phương pháp khác như: ISSR, AFLP, SCAR để có thể có những nhận định chính xác v độ tin cậy cao hơn trong tuyển chọn và lai tạo giống mới cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma.

Hình2. Một số hình ảnh vi nhân giống cây cọc tào từ phôi soma

23

1. Bài báo 1: Đánh giá mức độ biến dị của cây cọc rào (Jatropha curcas L.) được

nhân giống in vitro thông qua tái sinh phôi. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan,

Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 2015, 13(2A): 477-483. 2. Bài báo 2: Ảnh hưởng của một số acid amine và spemindin lên sự hình thành

phôi vô tính cây cọc rào (Jatropha curcas L.). Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim

Loan, Trần Trọng Tuấn, Lê Thanh Tuấn, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Thái Xuân Du,

Nguyễn Đình Lâm, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí Sinh học, 2013, 35(3se):136-144. 3. Bài báo 3: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế b o đánh giá mức độ bội thể của

cây cọc rào (Jatopha curcas L.) nhân giống in vitro. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị

Kim Loan, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân

Du, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2014, 52(4D): 42-50.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ