Phúc trình thực tập Protein và Enzyme

Chia sẻ: Lê Thị Thanh Tuyền | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

303
lượt xem 45
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phúc trình thực tập Protein và Enzyme có kết cấu nội dung gồm 5 bài giới thiệu đến các bạn những kiến thức về trích ly Protein, phương pháp sắc ký, định lượng Protein bằng phương pháp Bradford, xác định hoạt tính Protease bằng phương pháp Kunitz cải tiến,... Đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho các bạn chuyên ngành Sinh học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phúc trình thực tập Protein và Enzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÚC TRÌNH THỰC TẬP PROTEIN & ENZYME MÃ HỌC PHẦN: NHÓM: 12B SINH VIÊN THỰC HIỆN: TRẦN QUỐC KHÁNH MSSV: B1303671 CẦN THƠ, 11.2015
MỤC LỤC BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN ................................................................................................. 1 I.ĐỊNH NGHĨA ....................................................................................................................... 1 II.NGUYÊN TẮC ................................................................................................................... 1 III.DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU ..................................................... 1 1.Dụng cụ thí nghiệm: ....................................................................................................... 1 2.Quy trình trích ly protein: ................................................................................................ 2 IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................... 3 1.Kết quả: ........................................................................................................................... 3 2.Thảo luận: ....................................................................................................................... 3 BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ .......................................................................................... 4 I.DỤNG CỤ, HÓA CHẤT ...................................................................................................... 4 1.Dụng cụ ........................................................................................................................... 4 2.Hóa chất ........................................................................................................................... 4 II.TIẾN HÀNH ....................................................................................................................... 4 III.KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................................................ 5 1.Kết quả ............................................................................................................................ 5 2.Thảo luận ........................................................................................................................ 7 2.1Phương pháp trao đổi ion .......................................................................................... 7 2.2Trạng thái tích điện của protein – enzyme ở điều kiện trích ly, pH 4, pH 6 .......... 7 2.3pH của mỗi phân đoạn được rửa giải. Ý nghĩa thực tiễn của các trị số pH vừa xác định được trong quá trình tinh sạch ........................................................................ 7 2.4Hiện tượng nhiều hơn 1 phân đoạn protein được rửa giải khỏi cột gel trao đổi ion .................................................................................................................................... 8 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD ...................... 9 I.GIỚI THIỆU ........................................................................................................................ 9 II.NỘI DUNG THỰC HÀNH .............................................................................................. 10 1.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .......................................................................................... 10 2.Tiến hành thí nghiệm .................................................................................................... 10 2.1Xây dựng đường chuẩn BSA. ................................................................................. 10 2.2Định lượng protein có trong mẫu. .......................................................................... 11 III.KẾT QUẢ ........................................................................................................................ 11 1.Xây dựng đường chuẩn BSA. ....................................................................................... 11 2.Định lượng protein có trong mẫu ................................................................................. 12 IV.ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THẢO LUẬN ......................................................................... 13 BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN ......................................................................................................................................... 15 I.THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT ................................................................................. 15 II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ............................................................................................. 15 1.Dựng đường chuẩn Tyrosin .......................................................................................... 15 2.Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến .................................. 16 3.Tính toán kết quả: ......................................................................................................... 18 III.ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THẢO LUẬN ......................................................................... 18 BÀI 5: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE( SDS – PAGE) ................................................................................. 19
BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN I. ĐỊNH NGHĨA Trích ly enzyme là quá trình thu nhận enzyme thô từ các nguồn nguyên liệu động vật, thực vật và vi sinh vật để thực hiện các bước tinh sạch và các nghiên cứu khác. Dịch trích enzyme thô từ thịt khóm là nguồn enzyme thô cho các thí nghiệm kế tiếp để tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford, khảo sát hoạt tính bằng phương pháp Kunitz cải tiến, và xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDSPAGE. II. NGUYÊN TẮC Thu nhận các enzyme trong tế bào nhưng vẫn duy trì hoạt động của enzyme ở mức cao nhất, tránh gây biến tính và hạn chế những ảnh hưởng bất lợi tới enzyme. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: Cắt, nghiền, ép bằng thủ công và dùng máy ép nước trái > Tế bào được bao bọc và bảo vệ bởi màng tế bào nên để ly trích enzyme trước tiên ta cần phá vỡ màng tế bào. Chú ý: Mẫu cần được làm sạch và phải trữ lạnh nếu chưa tiến hành trích ly enzyme. Thu nhận enzyme bằng phương pháp li tâm: Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong công nghệ enzyme nhằm tách enzyme ngoại bào hay nội bào (sau khi phá vỡ tế bào) ra khỏi dung dịch. III. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU 1. Dụng cụ thí nghiệm: Cân điện tử 1500gr Micropipette Đĩa petri Máy ly tâm lạnh Đầu cole các loại Dao, thớt, vải lọc Máy ép nước trái cây Ống eppendorf Tủ lạnh 1
Nguyên liệu: 1/4 trái khóm (lấy phần vỏ). 2. Quy trình trích ly protein: ¼ trái khóm (m1 gr) Thu phần vỏ(m2 gr) Ép Bả khóm Vắt (Bằng vải the) Cặn Tổng dịch trong (V ml) Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút trong 20 phút) Bỏ Cặn Dịch trong (V0 ml) Bỏ Trữ mẫu (dịch enzyme): 22ml/bọc + 1ml/ống eppendoft (6 ống) + 1 bọc trữ phần mẫu dư 60ml. Ghi tên nhãn và đem vào tủ lạnh trữ ở 20oC. 2
Ghi nhận tổng thể tích dịch enzyme thu được V2 (ml). Lưu ý: Toàn bộ quy trình cần thao tác nhanh, trong điều kiện lạnh 4oC (trữ trong các dụng cụ đặt trong khay nước đá khi chờ đợi các nhóm và thực hiện các bước) để hạn chế sự biến tính của enzyme cũng như hạn chế sự phân giải của các enzyme proteolytic có trong dịch chiết. IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả: Thu được dịch trích enzyme thô từ thịt khóm. Khối lượng ¼ trái khóm (m1): 344,4gr Khối lượng vỏ (m2): 139,9gr Dịch trong V0: 88ml 2. Thảo luận: Phần trăm vỏ khóm thu được so với nguyên liệu ban đầu là: Phần trăm vỏ khóm = (m1/m2)*100 = (139,9/344,4)*100 = 40,6% Tại sao phải xác định các thông số đầu vào của mỗi nguyên liệu? Để tính hiệu xuất thu hồi. Hiểu được công dụng, liều lượng trong từng trường hợp sử dụng. Đạt hiệu trái cao trong sản xuất, tránh lãng phí nguyên liệu. 3
BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ I. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 1. Dụng cụ Hệ thống sắc ký lỏng bơm nhu động Máy phân đoạn sắc ký (fraction collector) Cốc thủy tinh, Ống eppendorf,… 2. Hóa chất Gel SP – StreamLine Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4 Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 6 II. TIẾN HÀNH Bước 1. Chuẩn bị gel SP – StreamLine: Cân bằng 10 gram bằng gel SP – StreamLine bằng dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4. Bước 2. Chuẩn bị cột gel SP – StreamLine: Nhồi gel vào cột thủy tinh, cân bằng cột gel với dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4 (3 lần thể tích cột), tốc độ dòng chảy 1 mL/phút. Bước 3. Load mẫu lên cột: Bơm 40 mL dung dịch nước khóm (bromelain) pha loãng với dung dịch ammonium acetate (tỉ lệ 1:1) qua cột với tốc độ 1 mL/phút. Bước 4. Rửa cột gel: Rửa cột bằng dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4 với tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút; theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ, cho đến khi phân đoạn protein không bám trên cột được đẩy ra hết khỏi cột. Thu phân đoạn protein không bám, đồng nhất mẫu và xác định thể tích (VUB mL). Bước 5. Rửa giải: Protein bám trên cột gel được rửa giải bằng dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 6 với tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút; thu dung dịch protein được rửa giải; theo dõi sắc ký đồ để xác định các phân đoạn protein khác nhau. 4
Bước 6. Thu phân đoạn và trữ mẫu: Thu mẫu vào các ống nghiệm thủy tinh trong quá trình sắc ký (trung bình khoảng 5 mL/ống). Xác định lượng protein trong mỗi ống bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 280 nm (OD280) Thu, tách riêng các phân đoạn protein dựa theo sắc ký đồ vẽ được từ số liệu OD280. Đồng nhất mỗi phân đoạn riêng biệt và xác định tổng thể tích của mỗi phân đoạn (VUB, VF1, VF2,…). Trữ enzim ở 200C: + 6 ống eppendorf, mỗi ống chứa 1 mL dịch enzim (để xác định hàm lượng protein, hoạt tính enzim và điện di SDS – PAGE trong các bài sau). + Phần dịch enzim của mỗi phân đoạn còn dư cho vào 1 bọc khác để trữ lại. III. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 1. Kết quả Bảng 1. Kết quả đo OD ở bước sóng 280 nm Ống nghiệm Chỉ số OD Ống nghiệm Chỉ số OD 1 0,117 41 0,212 2 0,121 42 0,243 3 0,106 43 0,331 4 0,098 44 0,245 5 0,096 45 0,287 6 0,101 46 0,528 7 0,350 47 0,564 8 3,000 48 0,667 9 3,000 49 0,775 10 3,000 50 0,799 11 3,000 51 0,697 12 3,000 52 0,615 13 3,000 53 0,511 14 3,000 54 0,400 15 3,000 55 0,321 16 3,000 56 0,266 17 1,931 57 0,229 18 1,305 58 0,207 19 0,936 59 0,190 20 0,697 60 0,185 21 0,548 61 0,183 22 0,417 62 0,178 23 0,317 63 0,181 5
24 0,278 64 0,189 25 0,262 65 0,192 26 0,248 66 0.193 27 0,237 67 0,199 28 0,222 68 0,201 29 0,206 69 0,204 30 0,199 70 0,205 31 0,195 71 0,208 32 0,193 72 0,208 33 0,190 73 0,207 34 0,183 74 0,214 35 0,179 75 0,198 36 0,176 76 0,189 37 0,176 77 0,177 38 0,175 78 0,172 39 0,188 79 0,165 40 0,233 Bi ểu đồ sắc ký dựa vào chỉ số OD ở độ hấp thụ 280 nm 3.5 3 2.5 Chỉ số đo OD 2 1.5 1 0.5 0 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 Thứ tự ống nghiệm Hình 2.1 Biểu đồ sắc ký dựa vào chỉ số OD ở độ hấp thụ 280 nm Bảng 2.2 Kết quả phân đoạn thu được Phân đoạn UB F1 F2 F3 Số ống thu được 5 39 41 44 45 55 67 76 Đỉnh Không xác định được 43 50 71 72 Bảng 2.3 Tổng thể tích và thể tích trữ lại của mỗi phân đoạn Phân đoạn UB F1 F2 F3 Tổng thể tích (ml) 175 20 55 50 Thể tích trữ lại (ml) 6 6 6 6 6
2. Thảo luận 2.1 Phương pháp trao đổi ion  Nguyên lý chung của sắc ký trao đổi ion: Tách các phân tử dựa trên điện tích: protein mang điện tích bề mặt, tùy vào pH của môi trường chúng sẽ tích điện dương hay âm, với pH pI protein sẽ tích điện âm. Vì vậy có thể chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein dựa vào pI và độ bền pH của protein.  Có hai loại gel trao đổi ion: Gel trao đổi ion dương: có các nhóm chức năng mang điện tích âm, tương tác ion với các protein mang điện tích dương. Gel trao đổi ion âm: có các nhóm chức năng mang điện tích dương, tương tác ion với các protein mang điện tích âm. Các protein được đẩy tuần tự theo lực tương tác, các protein tương tác ion yếu với gel sẽ được đẩy ra trước. 2.2 Trạng thái tích điện của protein – enzyme ở điều kiện trích ly, pH 4, pH 6  pH 4: Gel trao đổi ion sử dụng trong thí nghiệm mang điện tích âm. pI của bromelain là 4,6 nên khi rửa cột gel bằng pH 4 bromelain (và một số protein khác) sẽ tích điện dương (pH pI). Do vậy chúng không thể bám vào cột gel và sẽ bị đẩy ra khỏi cột. 2.3 pH của mỗi phân đoạn được rửa giải. Ý nghĩa thực tiễn của các trị số pH vừa xác định được trong quá trình tinh sạch Bảng 2.4 Giá trị pH của mỗi phân đoạn Phân đoạn UB F1 F2 F3 7
pH 4 4,5 6 6 Ý nghĩa: UB: pH pI) trong khi hạt gel vẫn tích điện âm. Do điện tích cùng dấu nên bromelain không bám vào hạt gel và bị đẩy ra ngoài. Tuy nhiên hỗn hợp protein không bám ngoài bromelain còn có một số protein tích điện âm khác. Vận tốc di chuyển của protein qua cột tùy thuộc vào điện tích thực của chúng tại điểm pH tương ứng. Đối với sắc ký trao đổi ion âm, những protein càng âm sẽ tách giải càng sớm. Trong các loại protein đó thì protein có điện tích âm lớn sẽ có ái lực với gel nhỏ nhất nên sẽ bị đẩy ra khỏi gel đầu tiên, kế đến là protein có điện tích âm nhỏ hơn. Vì vậy khi rửa giải bằng dung dịch đệm pH 6 sẽ thu được nhiều hơn 1 phân đoạn. 8
BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I. GIỚI THIỆU Như đã biết, có nhiều phương pháp định lượng protein như: phương pháp quan phổ, phương pháp BCA, phương pháp Lowry, phương pháp Bradford… Nhưng trong quá trình học chúng ta sử dụng phương pháp Bradford. Phương pháp Bradford thực hiện trên phản ứng của protein với thuốc thử Bradford được thực hiện trong môi trường acid mạnh. Nguyên tắc phương pháp này: Dựa trên sự biến đổi độ hấp thụ ánh sáng (OD) của Coomassie Brilliant Blue trong tương tác với protein. Trong môi trường acid mạnh, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ bước sóng cực đại ở 595 nm. Hình 1: Công thức cấu tạo của Comassie brilliant blue G250 (Nguồn: Bài giảng Protein và enzyme Nguyễn Đức Độ) Độ hấp thụ ở bước sóng có liên quan chặc chẽ, liên quan trực tiếp tới nồng độ protein. 9
Phương pháp Bradford có độ nhạy cao (xác định protein trong khoảng 0,02 – 2 mg/ml), đơn giản, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, do các protein có độ hấp thụ khác nhau nên cần chú ý chọn loại protein có cấu trúc tương đồng với protein cần xác định hàm lượng làm chất chuẩn. II. NỘI DUNG THỰC HÀNH 1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất  Thiết bị, dụng cụ. Máy đo quang phổ. Micropipette và đầu cole. Ống nghiệm thuỷ tinh. Cuvette phastic.  Hoá chất. Dung dịch comassie brilliant blue (CBB) G250. Bovine serum albumin (BSA) 1mg/ml. Cồn tuyệt đối. 2. Tiến hành thí nghiệm 2.1 Xây dựng đường chuẩn BSA.  Chuẩn bị đường chuẩn Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240 và 300 g / ml . Bảng 1: Bảng pha nồng độ dung dịch chuẩn Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 [BSA] ( g / ml ) 0 30 60 120 180 240 300 VBSA ( l ) 0 30 60 120 180 240 300 VNước cất ( l ) 1000 970 940 880 820 760 700  Quy trình thực hiện Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Bước 1: Chuẩn bị dung dịch BSA và nước cất. Đánh số thứ tự các ống nghiệm trên khay theo thứ tự từ 2 – 7 (Tương ứng với nồng độ dãy protein BSA chuẩn). 10
Bước 2: Lấy đúng thể tích BSA và nước cất theo bảng trên vào các ống nghiệm vừa đánh số. Lắc đều dung dịch vừa pha. Bước 3: Đánh số các ống nghiệm trên khay theo thứ tự từ 1 đến 7 (Tương ứng với nồng độ dãy protein BSA chuẩn). Lấy 100 l dung dịch từ các ống nghiệm ở bước 2 vào các ống nghiệm vừa đánh dấu (Hút riêng 1000 l nước cất cho vào ống nghiệm 1). Bước 4: Cho 2ml thuốc thử CBB vào ống nghiệm ở bước 3. Lắc đều ống nghiệm tránh tạo bọt. Bước 5: Sau 10 phút, tiến hành đo OD595nm các ống nghiệm ở và ghi nhận kết quả. 2.2 Định lượng protein có trong mẫu.  Pha loãng mẫu Chuẩn bị các mẫu protein: mẫu thô, mẫu trích protein UB, mẫu F1, mẫu F2 và mẫu F3 . Trong đó, chỉ có mẫu thô pha loãng 5 lần, các mẫu còn lại không pha loãng.  Định lượng protein có trong mẫu Quy trình thực hiện: Bước 1: Đánh số các ống nghiệm theo thứ tự tương ứng với thứ tự mẫu: UB, F3 , F1 , F2 và mẫu thô. Bước 2: Lấy 100 l dung dịch các mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm trên (Chú ý mẫu thô lấy mẫu đã pha loãng). Bước 3: Thêm 2ml dung dịch thuốc thử CBB vào mỗi ống nghiệm trên. Lắc đều các ống nghiệm tránh tạo bọt. Bước 4: Sau 10 phút tiến hành đo OD595nm các ống nghiệm và ghi nhận kết quả. III. KẾT QUẢ 1. Xây dựng đường chuẩn BSA. Bảng 2: Kết quả đo OD595nm đường chuẩn BSA [BSA] ( g / ml ) 0 (Đ/C) 30 60 120 180 240 300 Giá trị OD1 0,654 0,730 0,840 1,024 1,196 1,324 1,415 11
Giá trị OD2 0,656 0,770 0,862 1,044 1,231 1,350 1,422 Giá trị OD3 0,646 0,759 0,879 1,066 1,235 1,372 1,435 Giá trị ODTB 0,652 0,753 0,860 1,045 1,221 1,349 1,424 ODTB – ODĐ/C 0,000 0,101 0,208 0,393 0,569 0,697 0,772 Hình 2: Biểu đồ đường chuẩn BSA Nhận xét: Từ biểu đồ đường chuẩn BSA ta nhận được phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0027x + 0,0389 với độ tin cậy R2 = 0,9809 Trong đó: y là giá trị ODTB – ODĐ/C x là nồng độ BSA ( g / ml ). Hệ số R2 càng lớn, phân bố càng chuẩn, độ tin cậy càng cao. Từ biểu đồ trên, ta thấy R2 > 95% chứng tỏ phương tình tuyến tính có độ tin cậy cao và có sự phân bố chuẩn. Nghĩa là ta có thể xác định được 98,09% hàm lượng protein trong mẫu. 2. Định lượng protein có trong mẫu Bảng 3: Kết quả đo OD595nm hàm lượng protein trong mẫu Loại mẫu UB F3 F1 F2 mẫu thô Giá trị OD1 0,748 0,700 0,690 1,000 1,126 12
Giá trị OD2 0,720 0,653 0,656 0,982 1,149 Giá trị OD3 0,703 0,659 0,669 0,996 1,111 Giá trị ODTB 0,724 0,671 0,672 0,993 1,129 ODTB ODĐ/C 0,072 0,019 0,020 0,341 0,477 Công thức tính hàm lượng protein trong mẫu: y 0,0389 Nồng độ protein = 0,0027 Hàm lượng protein trong mẫu ( mg / ml ) = Nồng độ protein * Hệ số pha loãng * 103 Bảng 4: Hàm lượng protein trong mẫu (mg/ml) y Hệ số Tổng [protein] Hàm lượng protein Hàm lượng pro pha loãng thể tích ( g / ml ) trong mẫu trong mẫu (ml) ( mg / ml ) (mg/tổng ml) UB 0,072 1 175 12,2593 0,0123 2,1525 F3 0,019 1 50 0,0000 0,0000 0,0000 F1 0,02 1 20 0,0000 0,0000 0,0000 F2 0,341 1 55 111,8889 0,1119 6,1545 mẫu thô 0,477 5 88 162,2593 0,8113 71,3944  Chú ý: Sinh viên không được tự ý điều chỉnh máy đo quang phổ . Pha loãng mẫu theo sự hướng dẫn của cán bộ phụ trách. Đo mẫu có nồng độ từ thấp đến cao. Quá trình lắc các ống tránh nghiệm tạo bọt. IV. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THẢO LUẬN Từ kết quả hàm lượng protein trong các mẫu, ta nhận thấy hàm lượng protein trong mẫu thô cao nhất, kế đến là phân đoạn F2, đến UB, cuối cùng là phân đoạn F1 và F3 không chứa protein. Nguyên nhân: Mẫu thô là enzyme của dịch trích ly , chưa được tinh sạch bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion nên chứa các nhiều loại enzyme (protein) khác nhau là các 13
loại protein bám lẫn không bám trên cột gel. Do đó hàm lượng protein trong mẫu cao nhất. Hàm lượng protein chứa trong UB là hàm lượng các loại protein không bám trên gel có trong dịch trích ly. Phân đoạn F1 và F3 không chứa protein do phân đoạn F1 là phân đoạn đầu trong quá trình rửa giải khi mới thay đổi dung dịch đệm nên có thể protein bám trên cột gel chưa bị rửa trôi khỏi cột, phân đoạn F3 là phân đoạn sau cùng trong quá trình rửa giải của nhóm nên có thể trước đó protein bám trên cột đã được rửa và đẩy hết khỏi cột. Do đó, ở hai phân đoạn này không chứa protein. Phân đoạn F2 là phân đoạn giữa trong quá tình rửa giải của nhóm, khi đó lượng dung dịch đệm đã đủ để đẩy các protein bám trên cột gel ra ngoài, nên hàm lượng protein trong phân đoạn này khá cao và cao hơn hẳn các phân đoạn khác. Riêng nguyên nhân hàm lượng protein trong phân đoạn F 2 cao hơn cả UB là do trong mẫu dịch trích ly chứa nhiều protein bám trên cột gel hơn các loại protein không bám. 14
BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN I. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Máy đo quang phổ, máy lắc ủ, máy ly tâm tốc độ cao ( 14.000 v/p), cân, … Micropipet 20, 100, 200, 1000; ống eppendorf loại 1,5 ml … Dung dịch đệm Naphosphate Casein 1% (m/v) Dung dịch acid Trichloroacetic 15% (w/v) Tyrosin 1µmol/ml II. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Dựng đường chuẩn Tyrosin Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Dựng đường chuẩn Tyrosin theo bảng sau: 15
Bảng 1. Nồng độ Tyrosin Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 [Tyrosin] (µmol/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 VTyrosin (µl) 0 300 600 900 1200 1500 Pha loãng (µl) 1500 1200 900 600 300 0 Bảng 2. Số liệu có được khi đem đo OD ở bước sóng 280nm: Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Lần 1 0,088 0,124 0,155 0,194 0,221 0,249 Lần 2 0,087 0,123 0,153 0,190 0,217 0,250 Lần 3 0,088 0,122 0,156 0,183 0,215 0,253 Trung bình 0,087667 0,123 0,154667 0,189 0,217667 0,250667 Trung bình hiệu 0 0,035333 0,067 0,101333 0,13 0,163 chỉnh Hình 1: Biểu đồ đường chuẩn Tyrosin 2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến Thí nghiệm được tiến hành trong các ống eppendorf. Tương ứng mỗi mẫu enzyme, ta thực hiện một mẫu đối chứng để khi đo độ hấp thụ ta chuyển giá trị mẫu đối chứng về 0. Dựa vào hàm lượng protein chọn độ pha loãng là: 1 và mẫu thô là 5. Các bước đo hoạt tính mẫu đối chứng emzyme Các bước đo hoạt tính mẫu 16
180 µl đệm phosphate pH 7,5 20 µl enzyme ↓ Ủ 370C, 20 phút Bổ sung 600 µl Casein 1% ↓ Lắc ủ 10 phút, 370C Bổ sung 600 µl TCA 15% ↓ Ổn định 40C, 10 phút Ly tâm 10.000 v/p, 10 phút, 40C ↓ Đo độ hấp thụ ở 280 nm 180µl dung dich đệm 20µl enzyme ↓ Ủ 370C, 20 phút Bổ sung 600 µl TCA 15% ↓ Lắc ủ 10 phút, 370C Bổ sung 600 µl Casein 1% ↓ Ổn định 40C, 10 phút Ly tâm 10.000 v/p, 10 phút 40C ↓ Đo độ hấp thụ ở 280 nm Số liệu có được khi đem đo mẫu với đối chứng ở bươc sóng 280 nm. Bảng 3. Giá trị OD của mẫu ở bước sóng 280nm OD UB Thô F1 F2 F3 Đối chứng 0,310 0,324 0,291 0,286 0,286 Lần 1 0,341 0,848 0,320 0,378 0,309 Lần 2 0,335 0,877 0,309 0,415 0,318 17
Lần 3 0,348 0,817 0,320 0,384 0,319 Trung bình 0,341 0,847 0,316 0,392 0,315 Trung bình 0,031 0,523 0,025 0,106 0,029 hiệu chỉnh Từ phương trình đường chuẩn ta suy ra được hàm lượng tyrosin trong dịch thủy phân. Bảng 4. Hàm lượng Tyrosin trong dịch thủy phân UB Thô F1 F2 F3 Khối lượng 1,9 17,086 1,716 4,216 1,839 Tyrosin (µM/ml) 3. Tính toán kết quả: Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml enzyme được tính theo công thức: U = [(a x Vt)/(T x VE)] x k* Trong đó: U: Hoạt tính trong 1ml dung dịch enzyme a: Nống độ Tyrosin trong dung dịch thủy phân (µM/ml) Vt: Thể tích tổng dung dịch phản ứng (1400µl) T: Thời gian phản ứng (10 phút) VE: Thể tích enzyme (20µl) k*: hệ số pha loãng Theo tính toán ta có được đơn vị hoạt tính. Bảng 5. Giá trị đơn vị hoạt tính UB Thô F1 F2 F3 Đơn vị 13,3 598,01 12,012 29,512 12,873 hoạt tính Đơn vị hoạt tính riêng: Umg = U/[Protein tổng] Bảng 6. Giá trị hoạt tính riêng UB Thô F1 F2 F3 Đơn vị 6,179 8,25 0 4,795 0 họạt tính riêng Độ tinh sạch có đượclà 0.58. III. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THẢO LUẬN 18