Protein CagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

110
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vi khuẩn Helicobacter pylori sống trong lớp niêm mạc dạ dày của người và của một số động vật. Chúng là các “vi khuẩn chậm”, vì không có xu hướng tấn công vật chủ. Các bệnh như viêm loét và ung thư dạ dày, loét hành tá tràng …là kết quả tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ kéo dài tới hàng chục năm [3]. Các nghiên cứu cho thấy, 90% vi khuẩn H. pylori “bơi “ trong lớp niêm mạc của dạ dày mà không tương tác trực tiếp với dạ dày. Năm 1999, Fiocca phát hiện: vi...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Protein CagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori

TCNCYH 23 (3) 2003 Protein CagA x©m nhËp tÕ bµo ung th− d¹ dµy AGS qua con ®−êng dÞch thÓ cña Helicobacter pylori Juanita. L. M 1, NguyÔn ThÞ Hång H¹nh2 1 Tr−êng §¹i häc tæng hîp Michigan (Mü) 2 ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc C¸c dÞch thÓ cña vi khuÈn Helicobacter pylori chøa c¸c protein ®éc chÊt ®−îc h×nh thµnh tõ líp mµng ngoµi cña vi khuÈn Helicobacter pylori. Sù x©m nhËp cña chóng vµo tÕ bµo ung th− d¹ dµy AGS C120 ®· lµm t¨ng tæng hîp cña interleukin IL-8. I. §Æt vÊn ®Ò trong tÕ bµo biÓu m« d¹ dµy lµ do cagA cña vi khuÈn H. pylori th©m nhËp vµo tÕ bµo qua cÇu Vi khuÈn Helicobacter pylori sèng trong nèi hay cßn do nh÷ng lý do kh¸c nh− t−¬ng t¸c líp niªm m¹c d¹ dµy cña ng−êi vµ cña mét sè víi cagA cña dÞch thÓ? C©u tr¶ lêi sÏ gióp hiÓu ®éng vËt. Chóng lµ c¸c “vi khuÈn chËm”, v× râ mèi t−¬ng t¸c cña vi khuÈn víi vËt chñ trong kh«ng cã xu h−íng tÊn c«ng vËt chñ. C¸c bÖnh qu¸ tr×nh bÖnh lý. nh− viªm loÐt vµ ung th− d¹ dµy, loÐt hµnh t¸ trµng …lµ kÕt qu¶ t−¬ng t¸c gi÷a vi khuÈn vµ Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i xem xÐt vËt chñ kÐo dµi tíi hµng chôc n¨m [3]. t−¬ng t¸c gi÷a dÞch thÓ cña vi khuÈn Helicobacter pylori, chñng VNH85 víi tÕ bµo C¸c nghiªn cøu cho thÊy, 90% vi khuÈn H. ung th− AGS C120. Chóng t«i ®· x¸c nhËn, pylori “b¬i “ trong líp niªm m¹c cña d¹ dµy c¸c protein cagA trong dÞch thÓ ®· x©m nhËp mµ kh«ng t−¬ng t¸c trùc tiÕp víi d¹ dµy. N¨m vµo tÕ bµo ung th− d¹ dµy AGS vµ lµm t¨ng qu¸ 1999, Fiocca ph¸t hiÖn: vi khuÈn Helicobacter tr×nh tæng hîp interleukin IL- 8 cña tÕ bµo. pylori cã thÓ tiÕt ra thÓ dÞch chøa protein toxin II. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p vacA [5]. Ýt nhÊt hai protªin n÷a lµ CagA vµ nghiªn cøu HP1125 [7] còng ®−îc t×m thÊy trong c¸c dÞch 1. §èi t−îng thÓ [NguyÔn ThÞ Hång H¹nh vµ cs c¸c kÕt qu¶ ch−a c«ng bè]. - Vi khuÈn Helicobacter pylori, chñng VNH- Helicobacter pylori ®−îc chia thµnh hai 85 lo¹i: Lo¹i I mang ®¶o bÖnh lý cag dµi ~ 40 kb - TÕ bµo AGS (cã nguån gèc tõ ung th− d¹ vµ lo¹i II kh«ng mang cag. C¸c chñng vi dµy ng−êi nhËn tõ ACTT (American Type khuÈn thuéc lo¹i I th−êng lµm t¨ng tæng hîp culture) interleukin IL-8 trong tÕ bµo d¹ dµy [10]. 2. Ph−¬ng ph¸p Stefano t×m thÊy protein cagA ®−îc m· ho¸ bëi gien cagA n»m trong ®¶o bÖnh lý cag ®· th©m 2.1. Nu«i vi khuÈn H. pylori vµ t¸ch chiÕt nhËp vµo trong tÕ bµo chñ qua mét cÇu tiÕp c¸c thÓ dÞch cña vi khuÈn. hîp. Bªn trong tÕ bµo, protein ®−îc phospho Vi khuÈn Helicobacter pylori, dßng VNH- ho¸ bëi c¸c Kinase [4] 85 [1] ®−îc nu«i trong m«i tr−êng Brucella Kh«ng râ, sù tæng hîp cña interleukin IL-8 láng cã bæ sung 5% huyÕt thanh bß vµ c¸c 49
TCNCYH 23 (3) 2003 kh¸ng sinh t−¬ng øng. Sau 3-4 ngµy, c¸c thÓ gel Polyacrylamid Gradient nång ®é tõ 4 ®Õn dÞch ®−îc thu nhËn b»ng ly t©m dÞch næi ë 20%, sau ®ã ®−îc chuyÓn vµo mµng Hybond C 100.000g trong hai giê ë 4o C vµ lai víi kh¸ng thÓ ®a dßng kh¸ng protein 2.2. Nu«i cÊy tÕ bµo. cagA. 2.6. §Þnh l−îng interleukin IL-8. TÕ bµo AGS [2] nhËn tõ ACTT (American Type culture) ®−îc nu«i trªn ®Üa Petri 35 mm Interleukin IL-8 cã trong dÞch næi nu«i cÊy (Corning Glas Works, Corning, NY) trong m«i tÕ bµo ®−îc ®Þnh l−îng b»ng ph−¬ng ph¸p tr−êng Dulbecco / Eagle (Gibco-BLR) cã bæ Elisa. ChÕ phÈm sinh häc “ Quantikine “ cña sung 10% huyÕt thanh bß, penicillin (100 R&D system, Inc. ®−îc sö dông. S¶n phÈm µg/ml) vµ streptomycin (100 µg/ml) trong ®iÒu mµu cña ph¶n øng Elisa ®−îc ®o ë b−íc sãng kiÖn 5% CO2 ë 37o C. AGS C120 lµ dßng c¸c tÕ 550 nm bµo ung th− AGS ®−îc biÕn n¹p 240 Gastrin III. KÕt qu¶ contruct (240 GasLuc) chøa phÇn ®iÒu khiÓn cña gen IL-8 vµ ®· ®−îc chän läc trªn m«i 1. X©y dùng ®−êng chuÈn ®Þnh l−îng IL- tr−êng G418 (Gibco-BLR). 8. 2.3. Xö lý tÕ bµo AGS C120 víi c¸c dÞch §−êng chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh IL-8 ®−îc tr×nh thÓ cña vi khuÈn. bÇy ë h×nh 1. L−îng IL-8 nhá nhÊt cã thÓ x¸c C¸c tÕ bµo AGS ®¹t 80% confluence ®−îc ñ ®Þnh bëi ph−¬ng ph¸p lµ 6,2 pcg. víi dÞch thÓ ë nång ®é 3,5 µg / ml. Sau c¸c 2. Sù x©m nhËp cña c¸c thÓ dÞch cña vi kho¶ng thêi gian 12 giê, 24 vµ 48 giê, tÕ bµo khuÈn Helicobacter pylori vµo tÕ bµo AGS. ®−îc röa b»ng 1 x PBS l¹nh vµ ®−îc xö lý víi C¸c ph©n tÝch Western cho thÊy, tõ sau 12 Trypsin-EDTA trong vßng 10 phót ë 37o C. giê ®−îc ñ víi c¸c dÞch thÓ cña vi khuÈn Còng ë c¸c thêi ®iÓm 3, 6 vµ 21 giê, 50 µl m«i Helicobacter pylori, mét sè b¨ng protein cã tr−êng nu«i cÊy tÕ bµo ®−îc lÊy ®Ó x¸c ®Þnh ph©n tö l−îng 40 kDa, 35 kDa vµ 16 kDa ®· hµm l−îng IL-8. ®−îc ph¸t hiÖn thªm trªn Western ®å, chøng tá 2.4. §Þnh l−îng protein: Protein ®−îc x¸c c¸c dÞch thÓ ®· th©m nhËp vµo trong tÕ bµo ung ®Þnh b»ng Braford. th− AGS. 2.5. Tña miÔn dÞch vµ ph©n tÝch Western. C¸c protªin cã träng l−îng nhá h¬n CagA chøng tá, protein ®· bÞ c¾t bëi mét vµi protease TÕ bµo AGS thu thËp ë 12, 18 vµ 24 giê sau ë bªn trong tÕ bµo (h×nh 2). Hai protein cña tÕ khi ñ víi c¸c dÞch thÓ ®−îc lµm tan trong dung bµo ung AGS cã ph©n tö l−îng >85 kDa cho dÞch RIPA [0.15 mM NaCl / 0.05 mM Tris-HCl ph¶n øng chÐo víi kh¸ng thÓ ®a dßng kh¸ng pH 7. 2 / 1% Triton X-100 / 1% sodium cagA còng ®−îc ph¸t hiÖn trªn Western ®å. deoxycholate/ 0.1% SDS., 200mM vanadate, 5 mg/ml hçn hîp protease ]. 200 µl cña dÞch tan 3. Sù t¨ng tiÕt cña IL-8 d−íi ¶nh h−ëng ®−îc trén víi 50 µl kh¸ng thÓ ®a dßng kh¸ng cña c¸c dÞch thÓ cagA vµ ö tiÕp ë 4oC qua ®ªm. Cho thªm 50 µl C¸c ph©n tÝch cho thÊy, trong thÝ nghiÖm h¹t Sepharose g¾n protein A ®Ó tña phøc miÔn ®èi chøng, c¸c tÕ bµo ung th− d¹ dµy AGS dÞch. Hoµ tña protein trong 1x dung dÞch C120 tæng hîp IL-8 invitro. D−íi ¶nh h−ëng Laemmili (200 mM Tris-HCl pH 8., 8% SDS., cña c¸c thÓ dÞch cña H. pylori, chóng ®· gia 1%Bromophenol Blue vµ 400 mM DTT). t¨ng tæng hîp IL-8 lªn kho¶ng 1,5 lÇn. L−îng Protein ®−îc ph©n gi¶i b»ng SDS - PAGE trªn interleukin IL-8 ®−îc tiÕt vµo m«i tr−êng tû lÖ 50
TCNCYH 23 (3) 2003 thuËn víi thêi gian ñ cña dÞch thÓ víi vi khuÈn (h×nh 3). OD (550nm) 1.5 1.0 0.5 6.2 12.5 25 50 (pcg) H×nh 1- §−êng chuÈn x¸c ®Þnh hµm l−îng cña IL-8 IV. Bµn luËn ung th− [6,9]. Sù t¨ng biÓu hiÖn cña MMP-9- mét protªinase g¾n liÒn víi kh¶ n¨ng C¸c kÕt qu¶ ph©n tÝch cña chóng t«i cho tÊn c«ng cña c¸c tÕ bµo ung th− d¹ dµy còng thÊy, dÞch thÓ cña vi khuÈn H. pylori, khi th©m n»m trong sù ¶nh h−ëng cña interleukin IL- 8 nhËp vµo trong tÕ bµo ung th− AGS ®· lµm t¨ng [8]. møc ®é tæng hîp cña interleukin IL-8 trong tÕ bµo. C¸c nhµ khoa häc NhËt x¸c nhËn: møc ®é Nh− vËy, chóng t«i ®· ph¸t hiÖn protein tæng hîp interleukin IL-8 cña c¸c tÕ bµo ung cagA cã thÓ ®i vµo tÕ bµo biÓu m« d¹ dµy qua th− d¹ dµy cã quan hÖ trùc tiÕp víi qu¸ tr×nh con ®−êng dÞch thÓ. Nh÷ng nghiªn cøu tiÕp t¹o c¸c m¹ch m¸u míi ®Ó nu«i m« ung th− sau sÏ ®−îc tËp trung vµo b¶n chÊt cña c¸c mèi còng nh− sù ph¸t triÓn vµ di c¨n cña c¸c m« t−¬ng t¸c sÏ lµm s¸ng tá ý nghÜa sinh häc cña hiÖn t−îng võa ®−îc miªu t¶. 1 2 3 4 kDa H×nh 2- Protein cagA cña dÞch thÓ (chØ b»ng mòi tªn) x©m nhËp vµo 184 trong tÕ bµo ung th− AGS 121 85 1- tÕ bµo AGS kh«ng ñ víi dÞch thÓ. 68 52 2-4: AGS ®−îc ñ víi c¸c dÞch thÓ 40 1 sau 12, 24 vµ 48 giê. 28 2 Ph©n tö l−îng cña c¸c protein 22 chuÈn ®−îc chØ ë phÝa tr¸i cña h×nh. 16,8 3 51
TCNCYH 23 (3) 2003 IL-8 (pcg/ml) OD (550nm) a 1440 3 b 960 2 c 480 1 240 3 6 21 giê H×nh 3- Sù th©m nhËp cña c¸c thÓ dÞch cña vi khuÈn H. pylori, chñng VNH 85 vµo trong tÕ bµo AGS C120 lµm t¨ng qu¸ tr×nh tiÕt IL-8 vµo m«i tr−êng a) TÕ bµo AGS 120 ®−îc ñ víi IL-1β b) TÕ bµo AGS ®−îc ñ víi c¸c dÞch thÓ cña vi khuÈn c) TÕ bµo AGS kh«ng bÞ xö lý. V. KÕt luËn 3. Blaser, M.J and Parsonet, J: Parasitism by Qua nghiªn cøu nµy, chóng t«i xin rót ra the slow bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostatis and neoplasia. J. mét sè kÕt luËn nh− sau: Clin. Investig. 1994 94: 4- 8. 1. Protein cagA cã thÓ th©m nhËp vµo tÕ 4. Censini, S., Stein, M and Covacci, A.: bµo biÓu m« d¹ dµy b»ng con ®−êng dÞch thÓ Cellular responses induced after contact with cña vi khuÈn Helicobacter pylori Helicobacter pylori. Current opinion in 2. Bªn trong tÕ bµo biÓu m« d¹ dµy, Microbiology. 2000, 4: 41- 46. protein cagA ®· lµm t¨ng qu¸ tr×nh tæng hîp 5. Fiocca, R., Necchi, V., Sommi, P., Ricci, cña IL-8 lªn g¾p gÇn 2 lÇn. V., Telford, J., Cover, T.L., Solicia, E.: Tµi liÖu tham kh¶o Release of Helicobacter pylori vacuolating 1. Lª B¨ng S¬n vµ NguyÔn ThÞ Hång H¹nh: cytotoxin by both a specific secrection pathway Study on Helicobacter pylori, strain 85 isolated and budding of outer membrane vesicles. from a Vietnamese patient. International Uptake of released toxin and vesicles by gastric epithelium. J. Pathol. 1999, 188: 220-226. workshop on Biology. Hanoi- Viet Nam. 1. 2001: 414 - 417. 6. Kido, S., Kitadai, Y., Hattori, N et al: Interleukin IL-8 and vascular endothelial 2. Baranco, S.C., Townsend,C.M., growth factor- prognostic factors in human Casartelli, Jr.C., Macik, B.G., Burger, N.L., Boerwinkle, W.R and Gourley, W.K: gastric carcinomas?. 2001, Eur J. of Cancer Establishment and characterization of an 37 : 1482- 1487. invitro model system for human 7. Kim, J.S., Chang, J.H., Seo, W.Y., Yu, adernocarcinoma of the stomach. Cancer Res. G.J., Chung, S.I. and Yum, J.S.: Cloning and 1983, 43: 11703 - 1709. characterization of a 22-kDa Outer-Membrane 52
TCNCYH 23 (3) 2003 Protein (Omp22) from Helicobacter pylori. IL- 8 correlates with vascularity in human Mol. Cells. 2001, 10 (6): 633 - 641. gastric carcinomas. Am. J. Pathol. 2001, 152 : 93-100. 8. Kitadai, Y., Haruma, K., Mukaida, N et al: Regulation of disease – prograsion genes in 10. Stein, M., Rappuoli, R and Covacci, A: human gastric carcinoma cells by interleukin Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter IL-8. 2000, Clin Cancer Res. 6 : 2735- 2740. pylori CagA antigen after cag-driven host cell translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 9. Kitadai, Y., Haruma, K., Sumii, K., 1263 - 1268. Yamamoto, S., Ue, T., Yozaki, H., Yasui, W., Ohmoto, Y., Kajiyama, G., Filder, I. J and C«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®−îc tiÕn hµnh Tahara, E [1998]. Expression of interleukin t¹i tr−êng §¹i häc Tæng hîp Michigan (Mü). Summary The protein cagA enters the AGS cells via the interaction of the vesicles of Helicobacter pylori The vesicles formed from the outer membrane of the bacterium Helicobacter pylori contain many protein toxins such as cagA.,vacA, HP1125. The entry of the toxin-bearing particles into the gastric cancerous cells AGS led to the increased synthesis of interleukin IL-8. 53