Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu quy trình thu nhận fucoidan phân tử thấp từ rong mơ Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ XUÂN SƠN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG

PHÂN TỬ THẤP TỪ RONG MƠ SARGASSUM TẠI NHA

TRANG - KHÁNH HÒA BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC

TÓM TĂT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số

: 9540105

KHÁNH HÒA - 2018

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

2. TS. Nguyễn Duy Nhứt

Phản biện 1: GS.TS Trần Thị Luyến

Phản biện 2: TS. Khổng Trung Thắng

Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại Trường

Đại học Nha Trang vào hồi .... giờ .... ngày ..... tháng ..... năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia và Thư viện Trường Đại học

Nha Trang

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ

Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học

Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản

Mã số: 9540105

Nghiên cứu sinh: ThS. Lê Xuân Sơn

Khóa: 2011

Ngƣời hƣớng dẫn: 1) PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

Đại học Nha Trang

2) TS. Nguyễn Duy Nhứt

Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:

Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất

fucoidan và fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ:

1) Luận án đã khảo sát hàm lượng fucoidan từ 5 loài rong mơ Sargassum thu mẫu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy rong mơ S. polycystum có hàm lượng fucoidan (so với hàm lượng chất khô) cao nhất và đạt mức 3,54 ± 0,02%, tiếp theo thứ tự hàm lượng fucoidan giảm dần là các loài rong: S. oligocystum với hàm lượng 3,23 ± 0,02%, S. swartzii với hàm lượng 2,94 ± 0,01%, S. deticarpum với hàm lượng: 2,04 ± 0,00%, S. mcclurei với hàm lượng 1,34 ± 0,06%.

2) Luận án đã xác định được các điều kiện tối ưu hóa cho quá trình chiết fucoidan từ rong S. polycystum: chiết bằng dung dịch HCl 2M tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 16/1, pH tối ưu của dung môi chiết là 3,4, nhiệt độ chiết tối ưu là 770C, trong thời gian chiết tối ưu là 48 phút và phương thức chiết sử dụng là xay - chiết với hiệu suất chiết đạt 84,17%.

3) Luận án đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình phân cắt fucoidan tự nhiên từ rong S. polycystum tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp (Khối lượng phân tử ≤100kDa) có hoạt tính làm giảm lipid máu: phân cắt bằng hỗn hợp H2O2/ascorbic acid với nồng độ tối ưu là 37,5/37,5 (mmol/mmol, ở nhiệt độ tối ưu là 680, thời gian cắt mạch tối ưu là 96 phút và hiệu suất cắt mạch đạt 85,18%.

4) Luận án đã đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm F- KLPTT từ rong S. polycystum cho thấy ở liều dùng F-KLPTT 2580 mg/kg/ngày và sử dụng liên tục trong 7 ngày thì sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp không gây độc với chuột thí nghiệm, ở liều dùng 1.400mg/kg khối lượng/ngày trong thời gian 90 ngày không gây bất cứ một ảnh hưởng nào tới trạng thái sinh lý của chuột lang thí nghiệm.

5) Luận án đã đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ 05 loài rong mơ (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) ở phân đoạn có khối lượng phân tử 10÷100kDa và phân đoạn có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa cho thấy fucoidan khối lượng phân tử thấp 10÷100kDa từ 03 loài S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei có hoạt tính làm giảm lipid máu của chuột lang sau

1

28 ngày nuôi thử nghiệm.

6) Luận án đã xác định cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy cấu trúc một mảnh đại diện của phân đoạn là: fuc-uro-hexSO3H-hex.

7) Luận án đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang - Khánh Hòa. Kết quả đánh giá sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp được sản xuất theo quy trình luận án đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm về các chỉ tiêu kim loại nặng và vi sinh vật.

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH

PGS. TS. Vũ Ngọc Bội TS. Nguyễn Duy Nhứt Lê Xuân Sơn

2

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Rong mơ có chứa nhiều hợp chất sinh học có giá trị dược dụng cao. Trong số đó, fucoidan là polysaccharid có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như hoạt tính chống đông máu, kháng khuẩn, kháng vi rút, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, miễn dịch và có hoạt tính làm giảm lipid máu. Nhiều kết quả nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng fucoidan khối lượng phân tử thấp (F- KLPTT) có hoạt tính sinh học và đặc biệt là hoạt tính làm giảm lipid máu cao hơn so với fucoidan phân tử lượng lớn.

Từ fucoidan tự nhiên, người ta có thể phân cắt thành (F- KLPTT). Quá trình phân cắt fucoidan có thể được thực hiện bằng một số phương pháp khác nhau như phương pháp enzyme, phương pháp hóa học. Trong đó, phương pháp phân cắt fucoidan bằng phương pháp hóa học sử dụng tác nhân H2O2 kết hợp với axit ascorbic được chứng minh là không ảnh hưởng đến cấu trúc tự nhiên của fucoidan.

Vùng biển Nha Trang được coi là vùng biển ấm có nguồn lợi rong mơ Sargassum khá đa dạng về thành phần loài với trữ lượng lớn và có chứa fucoidan với hàm lượng cao. Hiện đã có một số công trình công bố nghiên cứu về fucoidan từ rong mơ thu mẫu tại vùng biển Nha Trang. Tuy vậy, chưa có công trình nào công bố về fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Nha Trang - Khánh Hòa. Do vậy việc tiến hành nghiên cứu về fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Khánh Hòa làm cơ sở cho việc phát triển thương mại hóa sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng là hướng nghiên cứu cần thiết và có triển vọng. Chính vì thế, luận án thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học”.

2. Mục đích của luận án

Xây dựng qui trình sản xuất fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học làm

giảm lipid máu bằng phương pháp hóa học từ nguyên liệu rong mơ Khánh Hòa.

3. Nguyên vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1. Nguyên vật liệu

+ Nguyên liệu rong: 05 loài rong mơ S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S.

denticarpum, S. swartzii thu mẫu tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa.

+ Chuột thí nghiệm: Chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300 ÷ 350g/con được sử dụng để đánh giá độc tính và hoạt tính làm giảm lipid máu của sản phẩm F- KLPT. Chuột lang do Viện Vaccine và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp.

3.2. Phạm vi nghiên cứu

1) Đánh giá hàm lượng fucoidan của 05 loài rong mơ: S. polycystum, S. mcclurei, S.

oligocystum, S. swartzii, S. denticarpum thu mẫu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa.

2) Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết fucoidan tự nhiên từ loài rong mơ Sargassum

có hàm lượng fucoidan cao nhất trong 05 loài đã được đánh giá.

3) Nghiên cứu điều kiện tối ưu cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu bằng tác nhân hỗn hợp hydrogen peroxide và axit ascorbic.

4) Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của fucoidan khối lượng phân tử thấp thu

3

nhận được trên chuột thí nghiệm.

5) Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của các phân đoạn fucoidan khối lượng phân

tử thấp trên chuột thí nghiệm.

6) Phân tích đặc trưng cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm

giảm lipid máu.

7) Đề xuất quy trình và sản xuất thử sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp có

hoạt tính làm giảm lipid máu.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại của Việt Nam và thế giới: Xác định hàm lượng fucoidan bằng phương pháp so màu của Dische và Shettles trên thiết bị ELISA MR- 96A (Mindray); Xác định thành phần đường đơn của fucoidan bằng phương pháp sắc ký khí thông qua phản ứng axetyl hóa các sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự trên máy GC17A Shimadzu FID; Các phương pháp các định cấu trúc của fucoidan: Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của fucoidan được đo trên máy Bruker AVANCE 500, Phổ hồng ngoại IR đo trên máy IMPACT 410 của hãng NICOLET (Mỹ), Phổ ESI-MS đo trên thiết bị LC/MSD ion trap 1100 tại Viện Hoá Học.

Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn và hoạt tính làm giảm lipid máu của (F- KLPTT) trên chuột thí nghiệm. Đồng thời, luận án cũng sử dụng các phương pháp toán học trong tối ưu hóa quá trình thí nghiệm nhằm đảm bảo kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao.

Các kết quả thí nghiệm đều được xử lý thống kê, kiểm định so sánh các giá trị trung bình giữa các nhóm bằng phần mềm MS Excel 2010, SPSS 18. Phân tích dữ liệu và tiên đoán bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Modde 5.0

5. Kết cấu của luận án

Luận án bao gồm 170 trang, trong đó: mở đầu: 3 trang, tổng quan: 36 trang, phương pháp nghiên cứu: 23 trang, kết quả nghiên cứu: 84 trang, kết luận và kiến nghị: 2 trang, danh mục công trình đã công bố của luận án: 1 trang, tài liệu tham khảo 21 trang. Luận án có 35 bảng, 86 hình, 164 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 13 tài liệu, tiếng Anh: 151 tài liệu) và phụ lục.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ

1.1.1. Phân loại rong mơ

Ở Việt Nam, có khoảng 147 loài rong nâu, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum (rong mơ) có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài được phân bố phổ biến ở các vùng ven biển và đảo. Riêng ở Khánh Hòa, sản lượng khai thác rong mơ tự nhiên ước tính khoảng 7.300 tấn khô/năm trên diện tích phân bố trên 1.167 ha.

Rong mơ Sargassum được phân loại: Ngành Phaeophyta; Lớp: Phaeophyceae; Bộ:

Fucales; Họ: Sargassaceae; Chi: Sargassum.

1.1.2. Cấu trúc thành tế bào rong nâu

Thành phần của thành tế bào rong nâu chủ yếu là cellulose được cấu tạo từ các phân tử glucose liên kết với nhau nhờ các liên kết β-(1-4)-glucoside. Fucoidan tồn tại trong cấu trúc thành tế bào rong nâu có thể ở trạng thái tự do hoặc là tạo cầu nối giữa các phân tử cellulose và alginate bằng các liên kết hydro.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ FUCOIDAN

1.2.1. Fucoidan và hoạt tính sinh học

Fucoidan là thuật ngữ gọi tên cho các sulfate polysaccharid có cấu tạo bao gồm 02

thành phần chính là L-fucose và gốc sulfate tồn tại trong thành tế bào của rong nâu. Trong cấu

trúc phân tử fucoidan còn có thể có các gốc đường đơn khác như galactose, glucose, manose,

xylose,… và axit uronic. Hàm lượng fucoidan khoảng từ 2 ÷ 10% so với khối lượng rong khô,

tồn tại trong cấu trúc thành tế bào và không bào của rong nâu, khối lượng trung bình khoảng 7

kDa đến 22.000 kDa tùy thuộc vào từng loài, điều kiện môi địa lý, thời gian thu hoạch của

rong. Hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của fucoidan rất đa dạng, tùy thuộc vào từng

loài của rong nâu, đặc tính cấu trúc, KLPT,… Fucoidan có khả năng hỗ trợ điều trị rất nhiều

chứng bệnh như kháng rối loạn lipid máu và bệnh vữa xơ động mạch, chống béo phì, kháng

ung thư, điều trị gan, tăng cường hệ miễn dịch, chữa bệnh dạ dày, kháng viêm, chống đông

máu, kiểm soát đường huyết,...

1.2.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam

Ở Việt Nam, fucoidan được các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam nghiên cứu trong

khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Nhìn chung, tình hình nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu

Việt Nam chưa nhiều, các công bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với

hoạt tính gây độc tế bào, một số ít đặc tính cấu trúc fucoidan của một số loài rong được công

bố. Đặc biệt, việc nghiên điều về F- KLPTT từ các loài rong mơ thu mẫu tại Nha Trang -

Khánh Hòa và hoạt tính của F- KLPTT hầu như chưa được nghiên cứu và công bố.

5

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

* Rong mơ nguyên liệu: sử dụng 5 loài rong mơ S. polycystum, S. oligocystum, S.

mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii thu mẫu tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa.

* Động vật thử nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300÷350g/con được sử dụng để đánh giá độc tính và hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu của sản phẩm F- KLPTT do đề tài nghiên cứu.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích

- Định lƣợng fucoidan: phương pháp của Dische và Shettles (1948), fucose được sử

dụng làm chất chuẩn.

- Phƣơng pháp xác định thành phần đƣờng đơn của fucoidan: phương pháp sắc ký khí thông qua phản ứng axetyl hóa các sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự (2007).

- Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sulfat và axít uronic: Hàm lượng sulfate và axit

uronic trong phân tử fucoidan được xác định theo phương pháp Scott.

- Phƣơng pháp phân tích đặc tính cấu trúc fucoidan:

+ Phổ hồng ngoại (IR)

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) + Phổ khối lượng MS

2.2.2. Định lƣợng vi sinh vật

- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ g) theo TCVN 4884: 2005

- Xác định Coliforms theo TCVN 6846: 2007

- Xác định E. coli theo TCVN 6848: 2007

- Xác định S. aureus theo TCVN 4830-1: 2005

- Xác định C. perfringens theo TCVN 4991: 2005

- Xác định Salmonella theo TCVN 8342: 2010

- Xác định V. parahaemolyticus theo TCVN 7905-1: 2008

- Xác định tổng số bào tử NM - NM (BT/g) theo TCVN 5166: 1990

2.2.3. Định lƣợng một số thành phần khác

- Xác định độ ẩm theo TCVN 3700: 1990.

- Xác định thủy ngân (Hg) theo TCVN 7604: 2007.

- Xác định Cadmi (Cd) theo TCVN 7603: 2007.

- Xác định chì (Pb) theo TCVN 7602: 2007.

- Xác định Arsen (As) theo TCVN 7601: 2007.

- Xác định thiết (Sn) theo TCVN 7788: 2007.

- Xác định Methyl thủy ngân theo AOAC 988.11.

2.2.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện tại hình 2.1.

6

Rong nguyên liệu

Xử lý Đánh giá: Hàm lượng fucoidan

Sấy khô Cắt nhỏ Lựa chọn loại rong

tách

Chiết

Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết fucoidan

Lọc lần 1

Bã rong

Dd CaCl2 bão hòa Kết tủa aginate canxi (pH=6,5)

Lọc lần 2

Tạp chất Lọc lần 3

Ethanol 96% Kết tủa fucoidan thô

Ly tâm

Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPT thấp

Sấy

Fucoidan tự nhiên

Cắt mạch

Đánh giá: Thành phần hóa học

Phân đoạn

Fucoidan KLPT thấp

Đánh giá chất lượng: - Thành phần hóa học - Độc tính của sản phẩm - Hoạt tính làm giảm lipid máu - Đặc tính cấu trúc

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Trên cơ sở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định

các thông số phù hợp cho từng công đoạn.

7

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG FUCOIDAN CÓ TRONG 05 LOÀI RONG MƠ

SARGASSUM THU MẪU TẠI KHÁNH HÕA

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy hàm lượng fucoidan thu nhận từ loài S. polycystum tương ứng 3,54±0,02%, cao nhất trong 05 loài rong mơ Sargassum được khảo sát, thấp nhất là loài rong S. mcclurei (1,34±0,01%). Do vậy, loài rong S. polycystum được luận án lựa chọn làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu thu nhận F-KLPTT ứng dụng trong hỗ trợ điều trị làm giảm lipid máu.

3.2. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT FUCOIDAN TỰ NHIÊN TỪ RONG MƠ S.

POLYCYSTUM

3.2.1. Xác định phƣơng thức chiết fucoidan

Nghiên cứu của Luận án cho thấy sử dụng phương thức xay - chiết với tốc độ quay của dao 750 vòng/phút trong suốt quá trình chiết cho phép thu fucoidan từ rong S. polycystum với hiệu suất chiết là 25,84±0,03% cao hơn gấp 1,53 lần so với sử dụng phương thức ngâm chiết chỉ cho phép thu fucoidan từ rong S. polycystum với hiệu suất là 16,85±0,07%. Do vậy, phương thức xay – chieetss được Luận án lựa chọn để nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.

3.2.2. Xác định tỉ lệ dung môi: nguyên liệu rong (DM/NL)

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy hiệu suất chiết fucoidan từ rong S. polycystum tăng khi tỉ lệ DM/NL tăng trong khoảng từ 8/1 (v/w) đến 16/1 (v/w) và đạt giá trị cao nhất tại tỉ lệ DM/NL là 16/1(v/w), tương ứng với hiệu suất chiết là 29,10±0,29%. Với các tỷ lệ DM/NL lớn hơn giá trị 16/1, hiệu suất chiết fucoidan tăng ít và không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Do vậy, Luận án lựa chọn tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu rong là 16/1 (v/w) làm thông số cố định cho các quá trình nghiên cứu chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.

3.2.3. Xác định pH dung môi chiết

Nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng khảo sát pH có giá trị từ 2 ÷ 9, hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum đạt giá trị cao nhất 42,94±1,86% tại pH 3 và giá trị thấp nhất tại pH 9. Do vậy, pH 3 được luận án lựa chọn làm thông số cố định cho các nghiên cứu tiếp theo và chọn khoảng pH 2 ÷ 5 làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.

3.2.4. Xác định nhiệt độ chiết Nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C, nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum là 800C. Vì vậy, luận án lựa chọn nhiệt độ 800C là thông số cố định cho quá trình nghiên cứu chiết chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum tiếp theo và chọn khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.

3.2.5. Xác định thời gian chiết

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 phút, hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum đạt giá trị cao nhất 82,67% khi thời gian gian chiết là 50 phút. Vì vậy, luận án lựa chọn khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.

8

3.3. TỐI ƢU HÓA QUÁ TRÌNH CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG MƠ S.

POLYCYSTUM THEO PHƢƠNG PHÁP BOX-WILSON

Từ kết quả nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum, Luận án lựa chọn thông số biên cho quá trình nghiên cứu tối ưu công đoạn chiết: Nhiệt độ (Z1): 60 ÷ 90 (0C); thời gian xay chiết (Z2): 40 ÷ 60 (phút); pH: (Z3): 2 ÷ 5 để tìm điều kiện chiết tối ưu phù hợp với hàm mục tiêu - hiệu suất chiết fucoidan. Kết quả quy hoạch thực nghiệm được thể hiện tại bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hiệu suất chiết fucoidan ở các điều kiện khác nhau

Số TN

1 Z1 60 Z2 40 Z3 2,0 X2 -1 X3 -1 (%) 70,91 X1 -1

2 90 40 2,0 -1 -1 72,39 1

3 60 60 2,0 1 -1 70,25 -1

4 90 60 2,0 1 -1 71,81 1

5 60 40 5,0 -1 1 70,58 -1

6 90 40 5,0 -1 1 71,06 1

7 60 60 5,0 1 1 69,91 -1

8 90 60 5,0 1 1 69,44 1

9 60 50 3,5 0 0 81,21 -1

10 90 50 3,5 0 0 82,11 1

11 75 40 3,5 -1 0 83,63 0

12 75 60 3,5 1 0 81.91 0

13 75 50 2,0 0 -1 76,21 0

14 75 50 5,0 0 1 74,84 0

15 75 50 3,5 0 0 83,63 0

16 75 50 3,5 0 0 83,69 0

17 75 50 3,5 0 0 83,51 0

Hình 3.1. Mô hình 3D bề mặt đáp ứng tối ƣu hóa của các yếu tố tới hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum

Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0, kết quả

thu được phương trình hồi quy của hiệu suất chiết fucoidan như sau:

9

2 - 1,15X2

2 2- 5,29X3

Y = 84,04 + 0,44X1 - 0,59X2 - 0,64X3 -1,78X1 Kết quả tối ưu hóa công đoạn chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum: Nhiệt độ chiết

770C, thời gian chiết 48 phút, pH của dung môi chiết: 3,4.

3.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỰ NHIÊN

Kết quả phân tích cho thấy thành phần mol của L-Fucose chiếm tỉ lệ cao nhất 40,48%, kế đến là D Galactose chiết tỷ lệ 26,75% và D Glucose chiếm tỉ lệ thấp nhất là 6,07%. Hàm lượng sulfate được quy về SO3Na chiếm tỉ lệ 25,6% (w/w), axit uronic chiếm tỉ lệ 23,74% (w/w) so với tổng lượng mẫu phân tích.

Rong khô nguyên liệu

Xử lý

Rửa

Xay chiết

+ Tỉ lệ Dung môi/rong:16/1 + pH:3,4 + Nhiệt độ:770C + Thời gian:48 phút

Lọc lần 1

Bã rong

Dd CaCl2 bão hòa

Kết tủa aginate canxi (pH=6,5)

Alginate canxi

Lọc lần 2

Tạp chất

Lọc lần 3

Ethanol 96%

Kết tủa fucoidan thô

Ly tâm

Sấy

Fucoidan tự nhiên

3.5. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN TỰ NHIÊN

Hình 3.2. Sơ đồ quy trình thu nhận fucoidan tự nhiên từ rong mơ S. polycystum

10

Thuyết minh quy trình

Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được, luận án đề xuất quy trình thu nhận fucoidan tự

nhiên từ rong mơ S. polycystum trình bày ở hình 3.2.

* Rong nguyên liệu: rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang -

Khánh Hòa, thời gian thu hoạch rong vào khoảng tháng 4 và tháng 5 hàng năm

* Xử lý: sau khi thu hoạch, rong được rửa sạch tạp chất, chất bẩn bám trên rong bằng

nước biển sạch, phân loại và sấy khô, đạt tiêu chuẩn.

* Rửa: Trước khi tiến hành xay chiết, rong khô được rửa bằng nước ngọt để loại bỏ

muối, vi sinh vật bám trên rong và các tạp chất khác.

* Xay chiết: Chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum trong điều kiện tối ưu: Tỷ lệ DM/NL 16/1, pH 3,4, nhiệt độ chiết 770C và thời gian xay chiết 48 phút. Phương pháp chiết ngâm dầm có sử dụng xay chiết với tốc độ 750 v/p.

* Lọc lần 1: sau công đoạn xay - chiết, tiến hành lọc để loại bỏ bã rong bằng vải lọc có

kích thước lỗ 100 micron và thu dịch chiết fucoidan.

* Kết tủa alginat canxi: kết tủa acid alginic bằng dung dịch CaCl2 bão hòa để tạo tủa

alginate.

* Lọc lần 2: sau khi tủa alginate canxi, tiến hành lọc hỗn hợp qua vải để loại bỏ kết tủa

thu dịch lọc.

* Lọc lần 3: lọc dịch qua cột cát và than hoạt tính nhằm loại bỏ các tạp chất, tiếp tục dịch lọc được cho chảy qua cột nhựa trao đổi cation để loại bỏ các ion kim loại nặng tồn tại trong dịch rong.

* Kết tủa fucoidan: sử dụng ethanol 96 để kết tủa fucoidan ở nồng độ 65%.

* Ly tâm: tiến hành ly tâm ở 3.000 v/p. * Sấy: tiến hành sấy khô kết tủa fucoidan ở nhiệt độ 650C trong thời gian 12 giờ, thu

được bột fucoidan tự nhiên.

3.6. NGHIÊN CỨU TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN TẠO

THÀNH FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP

3.6.1. Xác định nồng độ H2O2/ascorbic acid Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy, nồng độ H2O2/ascorbic acid phù hợp cắt mạch fucoidan thành F-KLPTT là 35/35 mmol/mmol. Do vậy, Luận án lựa chọn giá trị nồng độ nồng độ H2O2/ascorbic acid: 35/35 mmol/mmol là thông số cố định cho quá trình nghiên cứu điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT tiếp theo.

3.6.2. Xác định nhiệt độ

Nghiên cứu của Luận án cho thấy nhiệt độ thích hợp để cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT là 600C. Do vậy, nhiệt độ 600C được Luận án lựa chọn là thông số cố định cho quá trình nghiên cứu điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT tiếp theo.

3.6.3. Xác định thời gian cắt mạch fucoidan

Từ kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy thời gian thích hợp cắt mạch fucoidan tự

nhiên thành F-KLPTT là 90 phút.

11

3.7. TỐI ƢU HÓA CÔNG ĐOẠN CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN THÀNH

FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP

Từ kết quả nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cắt mạch fucoidan, Luận án lựa chọn các thông số biên cho quá trình nghiên cứu tối ưu công đoạn cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT là nhiệt độ (U1): 50 ÷ 90 (0C); thời gian (U2): 75 ÷ 105 (phút); nồng độ H2O2/ascorbic acid (U3): 30/30 ÷ 40/40(mmol/mmol). Hàm mục tiêu - Hiệu suất cắt mạch fucoidan tạo thành F-KLPTT, kết quả thực nghiệm được trình bày tại bảng 3.2.

Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0 thu được phương trình

2

2 – 1,62X2

hồi quy thể hiện hiệu suất cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT như sau:

2 – 11,41X3 Y = 82,16 – 0,67X1 + 0,93X2 + 11,36X3 – 2,59X1 Bảng 3.2. Hiệu suất cắt mạch fucoidan ở các điều kiện khác nhau

Số TN U1 U2 U3 X1 X2 X3

50 75 30 55,08 1 -1 -1 -1

90 75 30 53,98 2 1 -1 -1

50 105 30 56,99 3 -1 1 -1

90 105 30 54,63 4 1 1 -1

50 75 40 77,94 5 -1 -1 1

90 75 40 75,84 6 1 -1 1

50 105 40 79,88 7 -1 1 1

90 105 40 77,78 8 1 1 1

50 90 35 79,17 9 -1 0 0

90 90 35 80,11 10 1 0 0

70 75 35 79,21 11 0 -1 0

70 105 35 82,02 12 0 1 0

70 90 30 59,39 13 0 0 -1

70 90 40 82,25 14 0 0 1

70 90 35 81,75 15 0 0 0

70 90 35 81,58 16 0 0 0

70 90 35 82,83 17 0 0 0

Hình 3.3. Mặt đáp tối ƣu thực nghiệm của các yếu tố tới hiệu suất cắt mạch

fucoidan tụ nhiên tạo F- KLPTT

12

Kết quả tối ưu điều kiện cắt mạch fucoidan tạo thành fucoidan KLPTT: Nhiệt độ 680C, thời gian 96 phút và nồng độ H2O2/ascorbic acid là 37,5/37,5 (mmol/mmol).

3.8. ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI CỦA SẢN PHẨM FUCOIDAN KLPTT TỪ RONG MƠ S. POLYCYSTUM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN

Kết quả phân tích HPLC của sản phẩm F-KLPTT bảo quản ở nhiệt độ 40C không có sự biến đổi trong thời gian 24 tháng được thể hiện tại hình 3.4 và hình 3.5

Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT ở thời điểm ban đầu Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT sau 24 tháng bảo quản ở nhiệt độ 40C

Kết quả phân tích HPLC của sản phẩm F-KLPTT bảo quản trong điều kiện bình thường ở nhiệt độ phòng được thể hiện tại các hình 3.6 ÷ 3.19.

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 2 Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 4 Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 7

Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 9 Hình 3.10. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 11 Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 13

Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 15 Hình 3.13. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 17 Hình 3.14. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 19

13

Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 20 Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTTtại tháng thứ 21 Hình 3.17. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 22

Hình 3.18. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 23 Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại tháng thứ 24

Fucoidan KLPTT bảo quản ở nhiệt độ 40C không có sự biến đổi trong thời gian 24 tháng, nhưng khi fucoidan KLPTT được bảo quản trong điều kiện bình thường thì tại thời điểm tháng thứ 19, trên sắc ký đồ xuất hiện peak mới, chứng tỏ đã xảy ra phân rã.

3.9. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN TẠO THÀNH

F- KLPTT

Quy trình cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT được trình bày tại hình 3.20.

Thuyết minh quy trình:

* Chuẩn bị dung dịch fucoidan 1%: Hòa tan fucoidan tự nhiên thu được từ quy trình thu nhận fucoidan từ rong mơ Sargassum trong nước cất 2 lần, đạt nồng độ dung dịch fucoidan 1%.

* Cắt mạch: sử dụng thiết bị khuấy từ có gia nhiệt để cắt mạch fucodidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT. Quá trình cắt mạch được thực hiện trong điều kiện tối: nhiệt độ 680C, nồng độ H2O2/ascorbic acid 37,5/37,5 (mmol/mmol) thời gian cắt mạch 96 phút.

* Bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid: bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid bằng

dung dịch tiến hành điều chỉnh pH của hỗn hợp về 6,5 bằng dd NaOH 30% .

* Lọc rây phân tử kích thƣớc 100kDa: phân đoạn phân tử fucoidan bằng hệ thống lọc rây phân tử có kích thước rây 100kDa, dung dịch fucoidan KLPT được chia làm 2 phần. Phần dung dịch chứa fucoidan có KTPT lớn hơn 100kDa cho quay lại công đoạn cắt mạch ở điều kiện nồng độ H2O2/ascorbic là 37,5mmol/37,5mmol, nhiệt độ: 680C và thời gian 96 phút. Phần dung dịch fucoidan có KTPT nhỏ hơn 100kDa tiếp tục đi qua hệ thống lọc rây phân tử kích thước lọc 10kDa.

* Lọc rây phân tử kích thƣớc 10kDa: dung dịch fucoidan KLPTT có KTPT nhỏ hơn

100kDa đi qua hệ thống lọc rây phân tử có kích thước 10kDa.

14

* Kết tủa và ly tâm fucoidan KLPTT: kết tủa fucoidan KLPTT ở mỗi phân đoạn bằng

ethanol 96%. Tiến hành ly tâm thu kết tủa fucoidan KLPTT gồm 02 phân đoạn: fucoidan KLPTT có KLPT trong khoảng (10 ÷ 100kDa] và fucoidan KLPTT có KLPT nhỏ hơn 10kDa. * Sấy: Tiến hành sấy fucoidan KLPTT trong điều kiện nhiệt độ sấy 650C trong thời gian sấy 12 giờ, thu nhận 02 sản phẩm fucoidan KLPTT: fucoidan KLPTT có KLPT lớn hơn

Dd fucoidan 1%

+ H2O2/ascorbic:37,5mmol/37,5mmol + Nhiệt độ:680C + Thời gian:96 phút

Cắt mạch

Bất hoạt H2O2/ axit ascorbic

Lọc rây phân tử kích thước100kDa

Dd fucoidan KLPT≤100kDa

Dd fucoidan KLPT>100kDa

Lọc rây phân tử kích thước10kDa

Dd fucoidan KLPT>10kDa

Dd fucoidan KLPT≤10kDa

Kết tủa và ly tâm fucoidan KLPT thấp

Fucoidan KLPT≤10kDa

Fucoidan KLPT>10kDa

+ Nhiệt độ:650C + Thời gian:12 giờ

Sấy

Fucoidan KLPT≤10kDa

Fucoidan KLPT>10kDa

10kDa và fucoidan có KLPT nhỏ hơn hoặc bằng 10kDa.

Hình 3.20. Quy trình phân cắt fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT

3.10. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SẢN PHẨM FUCOIDAN KHỐI LƢƠNG PHÂN TỬ THẤP

3.10.1. Thử nghiệm sản xuất fucoidan khối lƣợng phân tử thấp

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy các sản phẩm fucoidan KLPTT được sản xuất từ fucoidan tự nhiên thu nhận từ 05 loài rong mơ Sargassum đều có khối lượng phân tử trung bình nằm trong khoảng 10kDa

Shouzhu HAO (2009).

15

Bảng 3.3. Khối lƣợng phân tử và kí hiệu của các phân đoạn F-KLPTT từ 5 loài rong Sargassum

STT Loài rong Khối lƣợng phân tử Kí hiệu phân đoạn

10kDa

10kDa

10kDa

10kDa

10kDa

3.10.2. Xác nhận sự có mặt của nhóm fucose và sulfate trong phân tử

polysaccharide của sản phẩm F-KLPTT

Luận án đã tiến hành phân tích phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ 1H-NMR để

xác nhận sự có mặt của nhóm fucose và sulfate trong phân tử polysaccharide.

3.10.2.1. Đặc trƣng cấu trúc từ phổ hồng ngoại IR

Tiến hành phân tích phổ phổ hồng ngoại IR của F-KLPTT từ 05 loài rong mơ Sargassum (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii), kết quả

được trình bày tại các hình 3.21 đến hình 3.30.

Hình 3.21. Phổ IR của Pol.H10 Hình 3.22. Phổ IR của Pol.L10

Hình 3.23. Phổ IR của Oli.H10 Hình 3.24. Phổ IR của Oli.L10

16

Hình 3.25. Phổ IR của Mcc.H10 Hình 3.26. Phổ IR của Mcc.L10

Hình 3.27. Phổ IR của Den.H10 Hình 3.28. Phổ IR của Den.L10

Hình 3.29. Phổ IR của Swa.H10 Hình 3.20. Phổ IR của Swa.L10

Từ kết quả phân tích trên phổ IR của 10 mẫu fucoidan cho thấy gốc sulfate gắn ở vị trí

equatorial tại vị trí C2 hoặc/và C3 của vòng α-L-fucose.

3.10.2.2. Các đặc tính cấu trúc thu đƣợc từ phổ cấu trúc 1H-NMR Kết quả phân tích phổ cấu trúc 1H-NMR của F- KLPTT từ 05 loài rong mơ Sargassum (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) được trình bày tại các hình 3.31÷3.40 đã chứng tỏ các sản phẩm có mặt gốc đường fucose trong mạch polysaccharid của 10 mẫu sản phẩm F- KLPTT.

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của Pol.H10 Hình 3.32. Phổ 1H-NMR của Pol.L10

17

Hình 3.33. Phổ 1H-NMR của Oli.H10 Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của Oli.L10

Hình 3.35. Phổ 1H-NMR của Mcc.H10 Hình 3.36. Phổ 1H-NMR của Mcc.L10

Hình 3.37. Phổ 1H-NMR của Den.H10 Hình 3.38. Phổ 1H-NMR của Den.L10

Hình 3.39. Phổ 1H-NMR của Swa.H10 Hình 3.30. Phổ 1H-NMR của Swa.L10

Từ kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR và phổ 1H-NMR và của các mẫu F-KLPTT từ 5 loài rong mơ (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) đã cho thấy sản phẩm là polysaccharide có chứa nhóm fucose và sulfate. Trong đó, gốc sulfate gắn ở vị trí equatorial tại vị trí C2 hoặc/và C3 của vòng α-L-fucose.

3.11. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA SẢN PHẨM

F- KLPTT

3.11.1. Đánh giá độc tính cấp của sản phẩm fucoidan KLPTT

* Về cân nặng của chuột thí nghiệm:

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy không có sự sai khác về khối lượng trung bình giữa của các nhóm chuột uống fucoidan KLPTT với các liều uống 630mg/kg,

18

1882mg/kg và 2580mg/kg so với nhóm chứng không uống fucoidan KLPTT. Kết quả này chứng tỏ fucoidan KLPTT không độc với chuột thí nghiệm.

* Về kết quả giải phẫu chuột thí nghiệm:

Kết quả giải phẫu chuột của Luận án cũng cho thấy không có sự sai khác về khối lượng trung bình của thận, gan, lách giữa các nhóm chuột uống fucoidan với các liều uống 630mg/kg, 1882mg/kg và 2580mg/kg và nhóm chứng không uống fucoidan KLPPT. Chứng tỏ fucoidan KLPPT không độc với chuột thí nghiệm.

3.11.2. Đánh giá độc tính bán trƣờng diễn

* Đánh giá độ đồng nhất của chuột thử nghiệm

Kết quả phân tích phương sai một yếu tố, kiểm định Duncan cho thấy các chuột sử dụng trong thí nghiệm không khác nhau về các chỉ số huyết học. Như vậy các nhóm chuột thí nghiệm đều có trạng thái sinh lý khỏe mạnh trước khi thí nghiệm.

* Đánh giá chỉ số huyết học của chuột lang uống sản phẩm fucoidan KLPTT

Kết quả đánh giá chỉ số huyết học của chuột lang cho uống sản phẩm fucoidan KLPTT sản xuất theo quy trình của luận án với liều uống trung bình 1.400 mg/kg/ngày và uống liên tục trong 90 ngày cho thấy chuột lang uống fucoidan KLPTT không có bất cứ một sự thay đổi bất thường nào về trị số huyết học.

* Đánh giá khối lƣợng cơ thể, nội tạng của chuột uống sản phẩm fucoidan KLPTT

+ Về khối lƣợng cơ thể chuột: Kết quả đánh giá cho thấy chuột lang uống sản phẩm fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum với liều uống trung bình 1.400mg/kg/ngày sau 90 ngày nuôi không có bất kỳ sự thay đổi bất thường về khối lượng. Kết quả này chứng tỏ fucoidan KLPTT không gây độc đối với chuột lang thí nghiệm.

+ Về khối lƣợng nội tạng chuột: Kết quả đánh giá cho thấy chuột lang uống sản phẩm fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum với liều 1.400mg/kg cơ thể/ngày không có bất cứ một biến đổi bất thường nào về khối lượng nội tạng sau 90 ngày nuôi. Kết quả này chứng tỏ fucoidan KLPTT không gây độc đối với chuột lang thí nghiệm.

3.12. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH LÀM GIẢM LIPID MÁU CỦA CÁC PHÂN

ĐOẠN F- KLPTT TỪ CÁC LOÀI RONG KHÁC NHAU

3.12.1. Đánh giá các chỉ số lipid máu của chuột dùng thử nghiệm

Kết quả đánh giá của Luận án cho thấy các nhóm chuột lang được chọn dùng trong đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của sản phẩm fucoidan KLPTT đồng nhất về các chỉ tiêu lipid máu tại thời điểm ban đầu và hoàn toàn bình thường về các chỉ tiêu sinh hóa máu.

3.12.2. Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT

* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. polycystum

Kết quả đánh giá của Luận án cho thấy sản phẩm fucoidan KLPTT Pol.H10 (100 kDa≥KLPT>10kDa) có tác dụng làm giảm lipid máu của chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.

* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. oligocystum

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy fucoidan có KLPT trong khoảng (10 ÷100kDa] (Oli.H10) có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang và fucoidan có KLPT

19

nhỏ hơn 10 kDa (Oli.L10) không có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.

* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. mcclurei

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy fucoidan có KLPT trong khoảng (10 ÷100kDa) cũng có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang và fucoidan KLPT nhỏ hơn 10 kDa (Mcc.L10) không có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.

* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S.

denticarpum

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy F-KLPTT từ rong mơ S. denticarpum ở cả 02 phân đoạn có KLPT (10 ÷ 100kDa) và phân đoạn KLPT nhỏ hơn 10kDa không có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.

* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. swartzii

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy cả 02 phân đoạn có KLPT trrong khoảng (10 ÷100kDa) và phân đoạn KLPT nhỏ hơn 10kDa từ rong mơ S. swartzii không có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.

3.13. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CẤU TRÖC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN

Pol.H10 CÓ HOẠT TÍNH LÀM GIẢM LIPID MÁU

3.13.1. Thành phần hóa học của phân đoạn fucoidan Pol.H10 từ rong mơ S.

polycystum

Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy thành phần hóa học của phân đoạn fucoidan Pol.H10 từ S. polycystum có thành phần gồm các gốc đường như fucose, galactose, glucose, mannose,... và các nhóm điện tích như sulfate và axit uronic tương tự như mẫu fucoidan tự nhiên từ rong S. polycystum. Trong đó, thành phần mol của L-Fucose là 41,04%, D galactose là 26,71% và hàm lượng D glucose chiếm tỉ lệ thấp nhất là 6,01%. Hàm lượng sulfate được quy về SO3Na chiếm tỉ lệ 24,90% (w/w), axit uronic chiếm tỉ lệ 21,35% (w/w) so với tổng lượng mẫu phân tích.

3.13.2. Đặc trƣng cấu trúc của phân đoạn fucoidan Pol.H10 thể hiện qua phổ NMR

và phổ IR

* Phổ 13C-NMR và phổ IR

* Phổ 13C-NMR * Phổ 1H-NMR

Hình 3.31. Phổ 13C-NMR của mẫu Pol.H10 Hình 3.32. Phổ 1H-NMR của mẫu Pol.H10

20

* Phổ H-HCOSY * Phổ 1H-NMR

Hình 3.33. Phổ H-HCOSY của mẫu Pol.H10 Hình 3.34. Phổ IR của mẫu Pol.H10

 Phổ khối MS+n Phổ +MS cho thấy phân đoạn có mảnh chủ yếu là 251 và 233

Hình 3.35. Phổ MS+n của mẫu fucoidan Pol.H10

Hình 3.36. Phổ khối MS2 của mảnh 251 Hình 3.37. Phổ khối MS2 của mảnh 233

Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ NMR, IR, MS cho thấy cấu trúc một

mảnh đại diện của phân đoạn của fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum là:

fuc-uro-hexSO3H-hex

Trong đó, thành phần đường chủ yếu trong mạch phân tử polysaccharide là gốc -L- fucose và β-D-Galactose, liên kết đường chủ yếu là (1→3)-α-L-Fucp, một phần liên kết (1→4)-α-L-Fucp, nhóm sulfate ở vị trí C2 của vòng fucose chiếm ưu thế.

3.14. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN

TỬ THẤP TỪ RONG NÂU SARGASSUM POLYCYSTUM

21

Từ các nghiên cứu của Luận án cho phép đề xuất quy trình sản xuất (F- KLPTT) từ rong

Rong mơ nguyên liệu

Xử lí

Rửa

Xay - chiết

+ Dung môi/rong: 16/1(v/w) + pH: 3,4 + Nhiệt độ: 770C + Thời gian: 48 phút

Lọc lần 1

Bã rong

Dd CaCl2 bão hòa

Kết tủa aginat canxi (pH=6,5)

Lọc lần 2

Tạp chất

Lọc lần 3

Ethanol 96%

Kết tủa fucoidan

Sấy

Ly tâm

Sản phẩm fucoidan tự nhiên

Hòa tan

Cắt mạch fucoidan

+ H2O2/ascorbic acid: 37,5mmol/37,5mmol + Nhiệt độ: 680C + Thời gian: 96 phút

Bất hoạt H2O2/ascorbic acid

Lọc rây phân tử kích thước100kDa lần 1

Dd fucoidan KLPT>100kDa

Lọc rây phân tử kích thước10kDa

Dd fucoidan KLPT>10kDa

Dd fucoidan KLPT≤10kDa

Ethanol 96%

Kết tủa phân đoạn fucoidan KLPTT và Ly tâm

Fucoidan KLPT>10kDa

Fucoidan KLPT≤10kDa

Sấy (t=650C; τ=12 giờ)

Fucoidan KLPT>10kDa

Fucoidan KLPT≤10kDa

mơ S. polycystum được trình bày tại hình 3.37.

Hình 3.38. Quy trình sản xuất fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum

Thuyết minh quy trình:

22

* Rong nguyên liệu: rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang -

Khánh Hòa đã đạt độ trưởng thành.

* Xử lý: sau khi thu hoạch, rong được rửa sạch tạp chất, chất bẩn bám trên rong bằng

nước biển sạch, phân loại và sấy khô, đạt tiêu chuẩn.

* Rửa: rong được rửa bằng nước ngọt nhằm loại bỏ muối, vi sinh vật trên cây rong và

các tạp chất khác.

* Xay chiết: điều kiện chiết tối ưu fucoidan từ rong mơ S. polycystum là tỷ lệ DM/NL

16/1, pH 3,4, nhiệt độ chiết 770C và thời gian xay chiết 48 phút.

* Lọc lần 1: sau công đoạn xay - chiết, tiến hành lọc bằng vải lọc có kích thước lỗ 100

micron và thu dịch chiết fucoidan.

* Kết tủa alginat canxi: Điều chỉnh pH của dịch lọc về pH 6,5 bằng dung dịch NaOH 30% và bổ sung dung dịch CaCl2 bão hòa vào khuấy đều đến khi không còn kết tủa alginat canxi tạo thành.

* Lọc lần 2: Sau khi tủa alginate canxi tiến hành lọc qua vải lọc có kích thước lỗ 100

micron để loại bỏ kết tủa thu dịch lọc.

* Kết tủa fucoidan: sử dụng ethanol 96% để kết tủa fucoidan ở nồng độ 65%.

* Ly tâm: tiến hành ly tâm thu kết tủa 3.000v/p. * Sấy: sấy khô ở nhiệt độ 650C trong thời gian 12 giờ, thu được bột fucoidan tự nhiên. * Hòa tan: Hòa tan fucoidan tự nhiên trong nước cất 2 lần để đạt nồng độ dung dịch

fucoidan 1%.

* Cắt mạch: Quá trình cắt mạch được thực hiện trong điều kiện tối: nhiệt độ 680C,

nồng độ H2O2/ascorbic acid 37,5/37,5 (mmol/mmol) thời gian cắt mạch 96 phút.

* Bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid: Tiến hành bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic

acid bằng dung dịch tiến hành điều chỉnh pH của hỗn hợp về 6,5 bằng dd NaOH 30%.

* Lọc rây phân tử kích thƣớc 100kDa: phân đoạn phân tử fucoidan bằng hệ thống lọc rây phân tử có kích thước rây 100kDa, dung dịch fucoidan KLPT được chia làm 2 phần. Phần dung dịch chứa fucoidan có KTPT lớn hơn 100kDa cho quay lại công đoạn cắt mạch ở điều kiện tối ưu.

* Lọc rây phân tử kích thƣớc 10kDa: sau quá trình lọc, dung dịch được chia làm 2 phần. Phần dung dịch fucoidan có KLPT trong khoảng (10 ÷ 100kDa] và dung dịch fucoidan KLPTT có KLPT nhỏ hơn 10kDa.

* Kết tủa và ly tâm fucoidan KLPTT: kết tủa fucoidan KLPTT ở mỗi phân đoạn bằng ethanol 96%. Tiến hành ly tâm thu kết tủa fucoidan KLPTT gồm 02 phân đoạn: fucoidan KLPTT có KLPT trong khoảng (10 ÷ 100kDa] và fucoidan KLPTT có KLPT nhỏ hơn 10kDa. * Sấy: Tiến hành sấy fucoidan KLPTT trong điều kiện nhiệt độ sấy 650C trong thời gian sấy 12 giờ, thu nhận 02 sản phẩm fucoidan KLPTT: fucoidan KLPTT có KLPT lớn hơn 10kDa và fucoidan có KLPT nhỏ hơn hoặc bằng 10kDa.

3.15. SẢN XUẤT THỬ VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM FUCOIDAN

KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP

3.15.1. Phân tích kim loại nặng và vi sinh của sản phẩm F- KLPTT

Kết quả phân tích sản phẩm F- KLPTT sản xuất theo quy trình của Luận án tại bảng 3.4

23

và 3.5 cho thấy sản phẩm đạt được tiêu chuẩn an toàn thực phẩm về các chỉ tiêu kim loại nặng và vi sinh theo các quy định hiện hành của Việt Nam.

Bảng 3.4. Kết quả phân tích hóa lí của sản phẩm F- KLPTT

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị Phƣơng pháp kiểm Kết quả

1 Thủy ngân (Hg) mg/kg TCVN 7604: 2007 0

2 Cadmi (Cd) mg/kg TCVN 7603: 2007 2,0

3 Chì (Pb) mg/kg TCVN 7602: 2007 0

4 Arsen (As) mg/kg TCVN 7601: 2007 0

5 Thiết (Sn) mg/kg TCVN 7788: 2007 0

6 Methyl thủy ngân mg/kg AOAC 988.11 0

Bảng 3.5. Kết quả phân tích vi sinh của sản phẩm F- KLPTT

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị Phƣơng pháp kiểm

1 TS VKHK Khuẩn lạc/g TCVN 4884: 2005

2 Coliforms Khuẩn lạc/g TCVN 6846: 2007 Kết quả 102 3

3 E. coli Khuẩn lạc/g TCVN 6848: 2007 0

4 Salmonella Khuẩn lạc/g TCVN 8342: 2010 0

5 S. aureus Khuẩn lạc/g TCVN 4830-1: 2005 5

6 C. perfringens Khuẩn lạc/g TCVN 4991: 2005 3

7 V. parahaemolyticus Khuẩn lạc/g TCVN 7905-1: 2008 4

8 TS BTNMNM BT/g TCVN 5166: 1990 6

3.15.2. Sơ bộ tính giá chi phí nguyên vật liệu

Sơ bộ tính chi phí sản xuất fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum là 12.803.000

đồng/kg sản phẩm (Mười hai triệu tám trăm chín lẻ ba nghìn đồng).

24

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy Luận án đã hoàn thành tất cả các nội dung

nghiên cứu và mục tiêu đã đặt ra, thể hiện qua các kết luận sau:

1) Luận án đã đánh giá hàm lượng fucoidan từ 5 loài rong mơ Sargassum thu mẫu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa và nhận thấy rong mơ S. polycystum có hàm lượng fucoidan cao nhất và đạt mức 3,54 ± 0,02%, tiếp đến là các loài rong: S. oligocystum, với hàm lượng 3,23 ± 0,02%, S. swartzii, với hàm lượng 2,94 ± 0,01%, S. deticarpum, với hàm lượng: 2,04 ± 0,00% và S. mcclurei, với hàm lượng fucoidan là 1,34 ± 0,06%.

2) Luận án đã xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết fucoidan từ rong S. polycystum theo phương thức xay - chiết: chiết bằng dung dịch HCl 2M ở pH 3,4, nhiệt độ 770C, trong thời gian 48 phút và hiệu suất chiết đạt 84,17%.

3) Các điều kiện thích hợp cho quá trình phân cắt fucoidan tự nhiên từ rong S. polycystum tạo thành F-KLPTT, có khối lượng phân tử từ 10÷100kDa và có hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu: phân cắt bằng hỗn hợp H2O2/axit ascorbic với nồng độ tối ưu là 37,5/37,5 (mmol/mmol, ở nhiệt độ 680, thời gian cắt mạch 96 phút và hiệu suất cắt mạch đạt 85,18%.

4) Kết quả đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm F-KLPTT từ rong S. polycystum cho thấy ở liều dùng F-KLPTT 2580 mg/kg/ngày và sử dụng liên tục trong 7 ngày thì sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp không gây độc với chuột thí nghiệm, ở liều dùng 1.400mg/kg khối lượng/ngày trong thời gian 90 ngày không gây bất cứ một ảnh hưởng nào tới trạng thái sinh lý của chuột lang thí nghiệm.

5) Kết quả đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ 05 loài rong mơ (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) cho thấy fucoidan khối lượng phân tử thấp 10÷100kDa từ 03 loài S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei có hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu của chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.

6) Kết quả xác định cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang, Khánh Hòa cho thấy cấu trúc một mảnh đại diện của phân đoạn là: fuc-uro-hexSO3H-hex.

7) Luận án đã xuất quy trình sản xuất sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S. polycystum Nha Trang và sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp sản xuất theo quy trình đề xuất đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm về kim loại nặng và vi sinh vật, với có chi phí nguyên vật liệu là 12.803.000 đồng/1kg sản phẩm.

2. ĐỀ XUẤT KIẾN NGHỊ

Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất một số kiến nghị như sau:

- Tiếp tục nghiên cứu đánh giá thêm các hoạt tính sinh học khác của fucoidan khối lượng phân tử thấp chẳng hạn như hoạt tính kháng ung thư của fucoidan khối lượng phân tử thấp 5 loài rong mơ nói trên.

- Tiến hành sản xuất fucoidan khối lượng phân tử thấp từ từ 03 loài S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei Nha Trang - Khánh Hòa ở quy mô pillot để tiến tới phát triển thương mại hóa sản phẩm F- KLPTT và thử nghiệm sử dụng F- KLPTT từ rong mơ trong sản xuất thực phẩm chức năng làm giảm lipid máu.

25

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1) Nguyễn Duy Nhứt, Phạm Đức Thịnh, Bùi Minh Lý, Nguyễn Bá Hành, Nguyễn Thị Lan Phương, Nguyễn Thị Lan, Lê Xuân Sơn (2011), “Độc tính của fucoidan khối lượng phân tử thấp tách chiết từ rong nâu Khánh Hòa”, Quyển 4. Sinh học và nguồn lợi sinh vật biển, Nxb Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, Trang 635-642.

2) Lê Xuân Sơn, Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Duy Nhứt (2016), “Tối ưu hóa công đoạn chiết fucoidan từ rong nâu Sargassum polycystum C. Agardh 1824”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Trang 86-90.

3) Lê Xuân Sơn, Nguyễn Duy Nhứt, Vũ Ngọc Bội, Đặng Xuân Cường (2017), “Cắt mạch fucoidan tách chiết từ rong nâu Saragssum polycystum và đánh giá hoạt tính kháng loạn lipid máu của sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Số 18 (2)

26