Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc sử dụng tế bào nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp đã được nghiên cứu và sản xuất nhiều loại vaccine phòng bệnh cho động vật có xương sống nhưng được vận dụng hạn chế trong nghiên cứu bệnh thủy sản nói chung và bệnh tôm nói riêng. Nghiên cứu này tiến hành sàng lọc 150 chủng nấm men Pichia pastoris có mang gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus đốm trắng nhằm tạo nguyên liệu cho sản xuất toreline phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 SÀNG LỌC CÁC DÒNG NẤM MEN MANG GEN VP28 THÍCH HỢP ĐỂ SẢN XUẤT TOLERINE PHÒNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM NUÔI Ngô Thị Ngọc Thủy1*, Đặng Thị Trà My1 TÓM TẮT Việc sử dụng tế bào nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp đã được nghiên cứu và sản xuất nhiều loại vaccine phòng bệnh cho động vật có xương sống nhưng được vận dụng hạn chế trong nghiên cứu bệnh thủy sản nói chung và bệnh tôm nói riêng. Nghiên cứu này tiến hành sàng lọc 150 chủng nấm men Pichia pastoris có mang gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus đốm trắng nhằm tạo nguyên liệu cho sản xuất toreline phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Các chủng nấm men được chọn lọc dựa trên kiểu hình (Mut+), số lượng bản sao gen mục tiêu, khả năng biểu hiện protein và tốc độ sinh trưởng. Quá trình sàng lọc đã chọn được 125 chủng mang kiểu hình Mut+, 82 chủng có mang 14-16 bản sao của gene VP28-His trong genome và 8 chủng có khả năng biểu hiện protein tốt. Trong 8 chủng chọn lọc, chủng 11 cho tốc độ sinh trưởng nhanh, đạt mật độ tế bào cao nhất (3,92x109 tế bào/ml) và lượng protein VP28 nhiều nhất sau 84 giờ kích thích biểu hiện. Chủng này được dùng làm nguyên liệu để điều chế toreline phòng bệnh đốm trắng trong các nghiên cứu tiếp theo. Từ khóa: VP28, Pichia pastoris, bệnh đốm trắng. I. ĐẶT VẤN ĐỀ tiêm. Việc dùng vaccine bằng cách tiêm ngoài Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus gây việc yêu cầu nhiều công lao động, dễ gây stress bệnh nghiêm trọng và phổ biến ở tôm nuôi. cho vật chủ, có thể tạo ổ viêm tại vị trí tiêm, Bệnh này là nguyên nhân chủ yếu gây ra những nó còn không thích hợp trong điều kiện thực tế tổn hại kinh tế lớn đối với ngành công nghiệp nuôi tôm khi số lượng vật chủ thường lớn và nuôi tôm trên toàn thế giới. Gần đây, nhiều loại rất mẫn cảm với sự thay đổi của điều kiện môi vaccine phòng bệnh đốm trắng đã được nghiên trường. Vì vậy, việc nghiên cứu vaccine tái tổ cứu như vaccine bất hoạt, vaccine nhược độc hợp và quản lý bằng phương pháp cho ăn đã (Namikoshi et al., 2004; Singh et al., 2005) được trú trọng nhiều hơn, đặc biệt là các protein hoặc vaccine tái tổ hợp dùng để tiêm cho tôm hay DNA vaccine chế tạo từ gen VP28 của virus (Namikoshi et al., 2004; Rout et al., 2007; gây bệnh đốm trắng trên các hệ thống biểu hiện Witteveldt et al., 2004b). Những loại vaccine khác nhau (Caipang et al., 2008; Fu et al., 2011; này có một số nhược điểm như có yếu tố rủi Kim et al., 2007; Kumar et al., 2008; Ning et do tiềm tàng khi vaccine nhược độc trở thành al., 2011; Musthaq and Jimmy,2011; Satoh et có độc lực, hay cần bổ sung thêm chất bổ trợ al.; Witteveldt et al., 2004a; Witteveldt et al., hoặc phải đưa vào vật chủ vài lần bằng đường 2004b; Witteveldt et al., 2006). 1 Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: thuyngo8@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 75
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Trong thực tế, có 4 hệ thống biểu hiện sự 03 chủng đối chứng (chủng nấm men GS115 sống: tế bào vi khuẩn, nấm men, tế bào côn trùng mang plasmid pPICK9K rỗng). Các chủng nấm và các hệ thống biểu hiện bằng tế bào động vật men này được hình thành từ 03 đợt hóa biến có vú và tế bào thực vật đã được nghiên cứu sử nạp pPICK9K-VP28 vào tế bào nấm men của dụng để sản xuất vaccine (Hansson et al., 2000). đề tài cấp Bộ “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất Việc sử dụng tế bào nấm men để điều chế protein tolerin có khả năng hạn chế lây lan của virus vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cho người và gia gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương súc đã được ứng dụng rộng rãi do nấm men kết phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long». Bên cạnh hợp được những ưu điểm của sinh vật đơn bào đó, nghiên cứu còn sử dụng một số loại trang và sinh vật có nhân điển hình. Ví dụ như các thiết bị, dụng cụ, hóa chất dùng trong nghiên ưu điểm của việc sản xuất protein tái tổ hợp từ cứu sinh học phân tử và nuôi cấy nấm men như tế bào nấm men Pichia pastoris bao gồm: sinh máy luân nhiệt, máy quang phổ so màu, tủ ấm trưởng nhanh, cho mật độ tế bào lớn, sản xuất ra lắc, máy ly tâm, bộ điện di đứng, môi trường nhiều protein, không bị tạp nhiễm với nội độc tố Yeast extract Peptone Dextrose (YPD), YPD- và thể thực khuẩn, dễ thao tác di truyền, không Agar, YPD- Geneticin, Minimal dextrose (MD), là vật mang các tác nhân gây bệnh cho người,… Minimal methanol (MM),... (Eda và Pinar, 2012; Li et al., 2007). Theo 2.2. Phương pháp nghiên cứu Balamurugan et al., (2007) đã cho thấy, hiệu suất 2.2.1. Chọn lọc dòng nấm men có kiểu biểu hiện protein trên tế bào nấm men P. pastoris hình Mut+ cao gấp 10-100 lần so với trên tế bào E. coli. Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào nấm men làm hệ thống 153 chủng P. pastoris pPIC9K-VP28 nghiên biểu hiện để sản xuất vaccine phòng bệnh đốm cứu sẽ được cấy 3 đợt (50 chủng thí nghiệm và trắngcòn hạn chế và vaccine nàycòn chưa được 01 chủng đối chứng/đợt) lần lượt trên các môi thử nghiệm trên tôm (Jha et al., 2007; Jha et al., trường MM, và MD ở 280C trong 2-3 ngày để 2006a; Jha et al., 2006b; Mavichak et al., 2010; kiểm tra khả năng sử dụng methanol. Các chủng Sarathi et al., 2008). Mut+ và MutS được phân biệt dựa vào mức độ tăng sinh của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình Nghiên cứu này tiến hành nhằm chọn lọc thường trên cả hai môi trường MM và MD; được dòng nấm men thích hợp làm nguyên liệu trong khi đó, MutS chỉ tăng trưởng trên môi để điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm trường MD mà không hoặc tăng trưởng rất yếu trắng cho tôm nuôi. Đây là nghiên cứu thuộc trên môi trường MM. Các chủng có khả năng đề tài cấp Bộ: "Bước đầu nghiên cứu, sản xuất mọc tốt trên cả 2 môi trường sẽ được chọn cho tolerine có khả năng hạn chế lây lan của virus nghiên cứu tiếp theo. gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long" thực hiện 2.2.2. Chọn lọc dòng P. pastoris mang năm 2013-2015. nhiều gen bản sao của gen mục tiêu Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 đã chọn II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP lọc theo 2 phương pháp trên sẽ được cấy chuyển NGHIÊN CỨU sang môi trường YPD-Agar có bổ sung Geneticin 2.1. Vật liệu nghiên cứu (G418) nồng độ 0,25 mg/l; và 4 mg/ml. So sánh Vật liệu nghiên cứu chính là 150 chủng khả năng phát triển của các dòng P. pastoris nấm men Pichia pastoris GS115 (Invitrogen) pPIC9K-VP28 trên 2 môi trường này. Theo lý mang plasmid pPIC9K-VP28 (Invitrogen) và thuyết, dòng nấm men có khả năng mọc trên môi 76 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 trường có 0,25 mg G418 có và 4 mg G148 lần nitrocellulose bằng máy chuyển màng semi dry lượt có 01 và 14-16 copy gene VP28-His. với cường độ dòng điện 1mA/cm2 trong 2 giờ. 2.2.3. Chọn lọc dòng nấm men có khả Sau đó, màng được giữ ở 4°C trong dung dịch năng sinh tổng hợp protein VP28 5% (w/v) sữa gầy hòa tan trong dung dịch đệm • Xác định dòng nấm men có khả năng sinh TBS (10 mM Tris-HCl,pH 8,0 ± 0,2, 150 mM tổng hợp protein VP28 NaCl) có 0,05% Tween. Màng được rửa 03 lần bằng dung dịch TBS-T; rồi được ủ với kháng Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 và đối thể sơ cấp - kháng thể đa dòng kháng thỏ chứng P. pastoris pPIC9K được biểu hiện trên đặc hiệu cho protein VP28 (Genesis, #GB- môi trường nuôi cấy sinh khối Buffered glycerol- 10006) - trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với complex medium (BMGY) và kích thích 2% tỷ lệ pha loãng 1:1.000 trong 2 giờ trên máy methanol trên môi trường Buffered methanol- lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó, màng lai được complex medium (BMMY) trong 72 giờ. Quy rửa 3 lần bằng TSB-T và ủ với kháng thể thứ trình biểu hiện như sau: Các khuẩn lạc đơn P. cấp - kháng thể thỏ kháng His (Santa Cruz, pastoris pPIC9K-VP28 được tăng sinh trong 100 #sc-803) trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với ml môi trường BMGY ở 280C, 250 vòng.phút-1 tỷ lệ pha loãng 1/500 qua đêm ở 4oC. Cuối cho đến khi OD600 2-6. Sau đó dịch được ly tâm cùng, màng lai được rửa 3 lần trong TBS-T và thu sinh khối và huyền phù trong môi trường được hiện màu bằng hỗn hợp 3,76 ml TBS/T BMMY và đo OD600 dịch đạt 1,0. Tiếp theo dịch với một phần tư viên DAB 10 mg cùng 3 µl chứa chủng được kích thích sẽ thêm methanol H2O2 30% cho đến khi xuất hiện vạch protein 100% để đạt nồng độ 2% và đem lắc ở 280C, quan tâm với độ đậm mong muốn. 250 vòng.phút-1. Sau 24 giờ nuôi cấy các erlen chứa dịch được thêm methanol để đạt nồng độ • Xác định chủng nấm men cho sinh khối cuối 2%. Sự hiện diện của protein VP28 trong tốt nhất xác tế bào được kiểm tra bằng SDS-PAGE và Các chủng nấm men – kết quả chọn lọc khẳng định lại bằng phương pháp Western blot theo các phương pháp trên –được nuôi cấy tăng với kháng thể đặc hiệu VP28 (Invitrogen, Mỹ). sinh trên môi trường BMGY và kích thích biểu Phương pháp phân tích SDS-PAGE và hiện protein trên môi trường BMMY trong điều Western blot: Tế bào nấm men P. pastoris kiện nồng độ methanol 2%, nhiệt độ nuôi cấy pPIC9K-VP28 được ly trích protein tổng số 280C và tốc độ lắc ở 150 và 250 vòng.phút-1. bằng cách bổ sung NaOH 0,4 M ủ ở nhiệt độ Mỗi chủng được nuôi cấy trong 03 erlen 500 phòng trong 5 – 10 phút. Sau đó dung dịch được ml khác nhau. Tốc độ sinh trưởng của các dòng ly tâm 14.000 vòng.phút-1 trong 1 phút để thu nấm men được xác định bằng cách lấy 1 ml mẫu cặn tủa. Huyền phù cặn trong 50 µl dung dịch theo thời gian nuôi cấy (0, 12, 24, 36, 48, 60 và đệm tải mẫu (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ± 0,2; 72 giờ) pha loãng theo cơ số 10 và cấy trang 100 mMdithiotreitol; 2% w/v SDS; 0.1% w/v trên môi trường YPD-Agar. bromophenol blue and 10% v/vglycerol) rồi đun • Xác định lượng protein VP28 sôi hỗn hợp ở 1000C trong 3 phút; cuối cùng Tất cả các chủng nấm men được chọn lọc sẽ ly tâm lấy 5-12 µl dịch nổi để điện di SDS – được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường BMGY PAGE gel và nhuộm Coomassie Blue R-50. Để và kích thích biểu hiện protein trên môi trường phân tích Western blot, protein đã phân tách BMMY trong điều kiện nồng độ methanol 2%, trên bản gel SDS-PAGE được chuyển qua màng nhiệt độ nuôi cấy 280C và tốc độ lắc ở 250 vòng. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 77
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 phút-1. Tại 84 giờ sau kích thích biểu hiện, các dung dịch nuôi cấy theo thời gian (0, 12, 24, 36, chủng được thu mẫu, các mẫu thu được cân sinh 48, 60, 72, 84 giờ). khối (xác tế bào) sao cho khối lượng xác tế bào III. KẾT QUẢ là tương đương. Các mẫu này được phân tích sự 3.1. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris hiện diện của protein VP28 bằng phương pháp GS115 có kiểu hình Mut+ SDS-PAGE và Western-Blot, xác định độ lớn 153 khuẩn lạc được được dùng để kiểm của các vạch thể hiện protein tương ứng để chọn tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy lần lượt trên chủng nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, khả năng môi trường MM, MD ở 280C trong 3 ngày. Sau sinh protein VP28 theo thời gian của 1 chủng ba ngày nuôi cấy, thu được 125 khuẩn lạc mọc được chọn cũng được xác định bằng cách phân tốt trên môi trường có và không có bổ sung tích Western-Blot của xác tế bào trong 1 ml methanol (Bảng 1). Bảng 1: Kết quả kiểm tra tốc độ tăng trưởng trên môi trường chứa methanol Nấm men kiểm tra Chủng mọc tốt trên 2 môi trường TT Tên nhóm thí nghiệm (chủng) (chủng) 1 2 (pPICK9K-VP28) 50 42 2 ĐC 2 (pPICK-9K) 1 0 3 3 (pPICK9K-VP28) 50 45 4 ĐC 3 (pPICK9K) 1 0 5 7 (pPICK9K-VP28) 50 38 6 ĐC 7 (pPICK9K) 1 0 Theo tính toán lý thuyết cấu trúc pPICK9K- 3.2. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris VP28 được biến nạp vào nấm men sẽ xảy ra GS115 mang nhiều bản sao gen mục tiêu hiện tượng tái tổ hợp vật chất di truyền giữa cấu Quá trình sàng lọc dòng P. pastoris có mang trúc gen AOX1 của vector pPIC9K với AOX1 nhiều bản sao gen mục tiêu được thực hiện bằng ở genome của nấm men, có thể tạo thành 2 cách cấy chuyển 125 khuẩn lạc sang môi trường dạng kiểu hình nấm men Mut+ và Muts. Ở kiểu YDP-Agar có bổ sung G418 ở các nồng độ 0,25 hình Mut+, gen AOX1 tự nhiên của nấm men mg/l và 4 mg/l. Kết quả sàng lọc đã xác định còn nguyên vẹn nên nó có thể phát triển mạnh được 113/125 khuẩn lạc có khả năng kháng trên môi trường có methanol do biến dưỡng Geneticin 418 ở nồng độ 0,25 mg/l và 82/125 methanol tốt. Ngược lại, ở kiểu hình Muts gen khuẩn lạc có khả năng kháng G418 ở nồng độ 4 AOX1 bị bất hoạt làm nấm men phát triển kém mg/l. Theo lý thuyết, 82 khuẩn lạc này có chứa trên môi trường có methanol. 14-16 copy gene VP28-His trong genome và chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28. 78 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Bảng 2: Kết quả sàng lọc các dòng nấm men trên môi trường có bổ sung Geneticin G418 Tên nhóm thí Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc kháng Số khuẩn lạc kháng 4 mg TT nghiệm kiểm tra 0,25 mg G418/l G418/l 1 2 (pPICK9K-VP28) 42 40 26 2 ĐC 2 (pPICK9K) 1 0 0 3 3 (pPICK9K-VP28) 45 42 28 4 ĐC 3 (pPICK9K) 1 0 0 5 7 (pPICK9K-VP28) 38 31 26 6 ĐC 7 (pPICK9K) 1 0 0 3.3. Kết quả chọn lọc dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp protein VP28 • Khả năng sinh tổng hợp protein VP28 Hình 1: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 bằng SDS-PAGE (A) và Western-Blot (B) M1: Thang protein opti protein marker G252 ; M2: Thang protein Bio basic BSM0671 ĐC, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143: chủng nấm men đối chứng, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143 82 chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 kích thước khoảng 30 KDa bằng cả hai phương đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm men mang pháp phân tích SDS-PAGE và Western Blot pPICK9K rỗng (đối chứng âm) được cảm ứng (Hình 1); các chủng này được dùng để nghiên biểu hiện protein trên môi trường nuôi cấy cứu tiếp theo. sinh khối BMGY và kích thích methanol 2% • Xác định sinh khối của các dòng nấm men trên môi trường BMMY trong 72 giờ. Sự hiện diện của protein VP28 trong xác tế bào và dịch 8 chủng nấm men đã qua sàng lọc và 1 nuôi cấy được phân tích bằng kỹ thuật SDS- chủng đối chứng được tiến hành nuôi cấy, kích PAGE và Western Blot với kháng thể đặc hiệu thích biểu hiện protein bằng methanol 2% ở của VP28. Kết quả biểu hiện protein đã xác nhiệt độ 280C và tốc độ lắc 150 vòng/phút. Kết định được 55 chủng có sự hiện diện của protein quả cho thấy, tốc độ sinh trưởng của các chủng VP28 bằng kỹ thuật Western Blot. Tuy nhiên, nấm men nghiên cứu khác nhau. Chủng 11 có chỉ có 8 chủng: (3 chủng của nhóm 2 (1, 11, tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế 42); 2 chủng của nhóm 3 (57, 100) và 03 chủng bào nấm men cao nhất ở 108 giờ sau kích thích của nhóm 7 (126, 143, 147) cho vạch rõ ràng ở biểu hiện bằng methanol 2% (2,99*109tế bào/ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 79
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 ml), sau đó là chủng 57 (2,59*109tế bào/ml). và 168 giờ cho chủng 120 (Hình 2). Bên cạnh Các chủng còn lại có tốc độ sinh trưởng chậm đó, mật độ tế bào nấm men thu được trong 1 ml hơn – thời gian cho sinh khối tối đa lâu hơn – môi trường nuôi cấy tại thời điểm sinh trưởng 120 giờ cho chủng 1, 132 giờ cho chủng 42, cao nhất của các chủng này cũng thấp hơn giá chủng 126, chủng 143; 157 giờ cho chủng 147, trị đạt được của chủng 11 ở 108 giờ (P
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hình 3: Tốc độ sinh trưởng của các dòng nấm men ở tốc độ lắc 250 vòng.phút-1 3.4. Khả năng sinh protein của các dòng và Western blot (Hình 4). Kích thước vạch tế bào nấm men chọn lọc protein của chủng nấm men không khác nhau Kết quả phân tích protein trong cùng rõ rệt trên bản gel SDS-PAGE; song vạch thể một lượng xác nấm men ở 9 mẫu chọn lọc hiện protein VP28 được quan sát thấy rõ ở cho thấy các chủng đều có khả năng biểu các chủng 11, 42 và 147 trên bản gel Western- hiện protein VP28 – đều cho 1 vạch rõ ở kích blot. Từ kết quả này, chủng 11 được chọn để thước khoảng 30 kDatrên bản gel SDS-PAGE nghiên cứu tiếp theo. Hình 4: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 trong 9 chủng nấm men chọn lọc M1: Thang protein Bio basic BSM0671; M2: PageRuler #26619 ĐC, 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147: chủng đối chứng, chủng 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 81
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Lượng protein VP28 được chủng 11 biểu Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protein hiện theo thời gian được xác định theo thời gian vỏ VP 28 đã được dòng hóa vào tế bào nấm men sau kích thích biểu hiện: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 và việc sàng lọc 150 chủng nấm men từ 03 đợt và 84 giờ. Kết quả cho thấy lượng protein VP28 dòng hóa khác nhau đã cho 9 chủng có biểu được tạo ra tăng dần theo thời gian kích thích; hiện protein VP28 tốt trong tế bào. Chín chủng lượng protein cao nhất đạt tại 84 giờ (Hình 5). này đều cho vạch protein đặc hiệu cho VP28 ở khoảng 30 kDa trên bản gel SDS-PAGE và Western-blot. Kết quả này tương tự như kết quả của Wang (2009) khi tác giả đã xác định được vạch khoảng 30 kDa trên bản gel của các dòng nấm men P.pastoris có chứa gen mã hóa protein vỏ VP28. Trong khi đó Jha et al., (2007) lại xác định được vạch ở vị trí 35 kDa trên bản gel phân tách protein của SDS-PAGE và Western- blot. Sự khác biệt về giá trị trọng lượng thực của protein (28 kDa) và giá trị được xác định Hình 5: Sự hiện diện của protein VP28 theo (30 kDa, hoặc 35 kDa) có thể do việc gắn thêm thời gian trong xác tế bào nấm men chủng 11 các nucleotide mã hóa các axit amin của histaq M: Thang PageRuler #26619 hoặc do quá trình đường hóa (glycosylation) ĐC: chủng đối chứng ở 84 giờ hay phospo hóa (phosphorylation) – những hiện 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 chủng 11 ở các giờ 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 sau biểu hiện tượng thường gặp khi sử dụng tế bào nấm men làm hệ thống biểu hiện. IV. THẢO LUẬN Kết quả biểu hiện protein của các chủng Việc sử dụng tế bào nấm men để sản xuất nấm men chọn lọc đã cho thấy chủng 11 có tốc vaccine phòng bệnh cho động vật trên cạn đã độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế bào lớn được nghiên cứu rộng rãi như bệnh Gumboro trong thời gian ngắn. Cụ thể, ở điều kiện 280C, trên gà (infectious bursal disease), dịch tiêu nồng độ methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 chảy cấp trên lợn (porcine epidemic diarrhea), vòng.phút-1, chủng nấm men 11, nuôi cấy trong bệnh sốt lợn cổ điển (classical swine fever), erlen 500 ml đạt mật độ tế bào tối đa tại 84 giờ bệnh do virus viêm gan B trên người,…(Eda sau kích thích biểu hiện. Trong các trường hợp Celik và Pinar Calik, 2012; Rabert et al., 2013; nuôi cấy trong nồi lên men ở tốc độ khuấy tương Shin và Yoo, 2013); tuy nhiên ứng dụng này còn tự (250 vòng/phút), tốc độ sinh trưởng của nấm chưa được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy men nhanh hơn, đạt mật độ tế bào tối đa ở 72 sản, đặc biệt là trong việc chế tạo vaccine phòng giờ (Asada et al., 2011; Cai et al., 2014). Trong bệnh cho tôm nuôi. Hiện nay, mới chỉ có hai phần lớn các nghiên cứu về tốc độ sinh trưởng nhóm nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men P. của nấm men, tốc độ sinh trưởng của nấm men pastoris để dòng hóa gen mã hóa protein vỏ: được tính toán dựa trên giá trị OD600 của dung VP19, VP28, VP26 (Jha et al., 2007; Jha et al., dịch nuôi cấy theo thời gian; trong nghiên cứu 2006a; Wang, 2009), VP37 (Liu et al., 2006), này giá trị OD600 của các chủng cũng được xác và protein PmRab7 – a shrimp WSSV-binding định (không trình bày trong bài) nhưng không protein - (Jupatanakul et al., 2010) trong phòng tìm thấy sự sai khác giữa các chủng nghiên cứu, bệnh đốm trắng cho crayfish và tôm nuôi. 82 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 vì vậy tốc độ tăng trưởng được xác định bằng bình hoặc các chất phụ gia (axit casamino, cách đếm trực tiếp khuẩn lạc nấm men thông qua sorbitol, EDTA),… (Peng et al., 2011; Rabert phương pháp trang đĩa dịch nuôi cấy ở các nồng et al., 2013; Shi et al., 2003). Song, trong điều độ pha loãng khác nhau. Hơn thế nữa, phần lớn kiện thực tế của phòng thí nghiệm, các nghiên các tài liệu đều xác định việc tăng trưởng của cứu về ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả chủng nấm men sau dòng hóa trong điều kiện năng lên men của chủng nấm men chọn lọc còn sử dụng nồi lên men trong khi nghiên cứu này chưa được thực hiện. được tiến hành trên erlen 500 ml nên một số yếu KẾT LUẬN tố môi trường như pH, nồng độ methanol, hàm Chủng nấm men P. pastoris GS115 số 11 lượng oxy… không được kiểm soát chặt chẽ, có tốc độ sinh trưởng nhanh cho 3,92x109 tế do đó có thể làm ảnh hưởng đến mật độ tế bào bào/ml sau 84 giờ kích thích biểu hiện ở điều cũng như làm giảm khả năng biểu hiện protein kiện lên men trong bình lắc ở 280C, nồng độ của dòng nấm men. Đó có thể là các lý do khiến methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 vòng/ mật độ tế bào nấm men cao nhất mà nghiên cứu phút đã được chọn lọc từ 150 chủng nấm men này tìm được (3,92x109 tế bào/ml) khác với mật sau dòng hóa. Đây cũng là chủng có khả năng độ nấm men ở các nghiên cứu khác – như 2,4 x biểu hiện protein VP28 tốt nhất – kết quả chạy 109 tế bào/ml với chủng nấm men chứa gen quy điện di phân tách protein trên SDS-PAGE và định protein CHRM2 (Asada et al., 2011). kết quả phân tích Western-blot bằng kháng thể Theo các nhà nghiên cứu, ngoài tốc độ lắc, đặc hiệu của VP28 cho vạch rõ ở khoảng 30 nhiều yếu tố khác nữa có thể ảnh hưởng đến việc kDa. Chủng này được chọn làm nguyên liệu biểu hiện protein ở nấm men P. pastoris như pH, điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm nhiệt độ, nồng độ methanol, thành phần trung trắng cho tôm nuôi. TÀI LIỆU THAM KHẢO Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T., Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H., H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N., 2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus Murata, T., Haga, T., Iwata, S., Kobayashi, T., (Marsupenaeus) japonicus from white spot 2011. Evaluation of the Pichia pastoris expression syndrome disease after oral administration of system for the production of GPCRs for structural recombinant VP28 expressed in Brevibacillus analysis. Microbial Cell Factories 10. brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320. Balamurugan, V., Reddy, G.R., Suryanarayana, V.V.S., Eda Celik, Pinar Calik, 2012. Production of recombinant 2007. Pichia pastoris: A notable heterologous proteins by yeast cells. Biotechnology Advances expression system for the production offoreign 30, 1108-1118. proteins—Vaccines Indian J. Biotechnol. 6, 175- Fu, L.L., Wang, Y.B., Wu, Z.C., Li, W.F., 2011. In vivo 186 assessment for oral delivery of Bacillus subtilis Cai, F., Li, T., Xie, Y., He, X., 2014. Expression of harboring a viral protein (VP28) against white functional single-chain variable domain fragment spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei. (scFv) antibody against Metolcarb in Pichia Aquaculture 322, 33-38. pastoris. Annals of Microbiology 64, 589-597. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 83
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hansson, M., Nygren, P., Stahl, S., 2000. Design and Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I., production of recombinant sub-unit vaccines. Wada, S., Hatai, K., Inagawa, H., Takahashi, Y., Biotechnology and Applied Biochemistry 32, 95- Yoshimura, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Aoki, T., 107. 2010. The effect of liposome-coated recombinant Jha, R.K., Xu, Z.R., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., Shen, protein VP28 against white spot syndrome virus in J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. Journal white spot syndrome virus using recombinant of Fish Diseases 33, 69-74. oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish & Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa, Shellfish Immunology 22, 295-307. T., Nishioka, T., Arimoto, M., Muroga, K., 2004. Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006a. Protection of Vaccination trials with Penaeus japonicus to Procambarus clarkii against white spot syndrome induce resistance to white spot syndrome virus. virus using recombinant subunit injection vaccine Aquaculture 229, 25-35. expressed in Pichia pastoris. Fisheries Science 72, Ning, D., Leng, X., Li, Q., Xu, W., 2011. Surface- 1011-1019. displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce Jha, R.K., Xu, Z.R., Shen, J., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, protection against white spot syndrome virus in W.F., 2006b. The efficacy of recombinant vaccines crayfish by oral administration. J. Appl. Microbiol. against white spot syndrome virus in Procambarus 111, 1327-1336. clarkii. Immunology Letters 105, 68-76. Peng, H., Liu, H.P., Chen, B., Hao, H., Wang, K.J., Jupatanakul, N., Wannapapho, W., Eurwilaichitr, L., 2011. Optimized production of scygonadin in Flegel, T.W., Sritunyalucksana, K., 2010. Cloning Pichia pastoris and analysis of its antimicrobial and expression of recombinant shrimp PmRab7 (a and antiviral activities. Protein Expr. Purif. 82, virus-binding protein) in Pichia pastoris. Protein 37-44. Expr. Purif. 76, 1-6. Rabert, C., Weinacker, D., Pessoa Jr, A., FarÃas, J.G., Kim, C.S., Kosuke, Z., Nam, Y.K., Kim, S.K., Kim, 2013. Recombinants proteins for industrial uses: K.H., 2007. Protection of shrimp (Penaeus Utilization of Pichia pastoris expression system. chinensis) against white spot syndrome virus Braz. J. Microbiol. 44, 351-356. (WSSV) challenge by double-stranded RNA. Fish Rout, N., Kumar, S., Jaganmohan, S., Murugan, V., & Shellfish Immunology 23, 242-246. 2007. DNA vaccines encoding viral envelope Kumar, S.R., Ahamed, V.P.I., Sarathi, M., Basha, proteins confer protective immunity against A.N., Hameed, A.S.S., 2008. Immunological WSSV in black tiger shrimp. Vaccine 25, 2778- responses of Penaeus monodon to DNA vaccine 2786. and its efficacy to protect shrimp against white Musthaq S Syed, Jimmy Kwang., 2011. Oral spot syndrome virus (WSSV). Fish & Shellfish Vaccination of Baculovirus-Expressed VP28 Immunology 24, 467-478. Displays Enhanced Protection against White Spot Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G., Ilangovan, K., Syndrome Virus in Penaeus monodon. PLoS ONE Suzara, V.V., Duzgunes, N., Renugopalakrishnan, 6. V., 2007. Expression of recombinant proteins in Sarathi, M., Simon, M.C., Venkatesan, C., Hameed, Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142, A.S.S., 2008. Oral administration of bacterially 105-124. expressed VP28dsRNA to protect Penaeus Liu, Q.H., Huang, J., Han, W.J., Liang, Y., Lu, C.L., monodon from white spot syndrome virus. Marine Wang, Q.Y., 2006. Expression, purification Biotechnology 10, 242-249. and characterization of WSSV-VP37 in Pichia Satoh, J., Kim, H.J., Matsui, T., Nishizawa, T., pastoris. Aquaculture 258, 55-62. Optimization of WSSV rVP Expression in E. 84 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 coli Cells and Minimum Dose of rVPs for Oral Virus (WSSV) and the Expressions in Pichia Vaccination in Kuruma Shrimp. Fish Pathology Pastoris. Master’s thesis, Jimei University. China. 45, 169-174. Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., van Hulten, Shi, X., Karkut, T., Chamankhah, M., Alting-Mees, M., M.C.W., 2004a. Protection of Penaeus monodon Hemmingsen, S.M., Hegedus, D., 2003. Optimal against white spot syndrome virus by oral conditions for the expression of a single-chain vaccination. Journal of Virology 78, 2057-2061. antibody (scFv) gene in Pichia pastoris. Protein Witteveldt, J., Vlak, J.A., Van Hulten, M.C.W., 2004b. Expr. Purif. 28, 321-330. Protection of penaeus monodon against white spot Shin, M.K., Yoo, H.S., 2013. Animal vaccines based syndrome virus using a WSSV subunit vaccine. on orally presented yeast recombinants. Vaccine Fish & Shellfish Immunology 16, 571-579. 31, 4287-4292. Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2006. Singh, I.S.B., Manjusha, M., Pai, S.S., Philip, R., 2005. Increased tolerance of Litopenaeus vannamei Fenneropenaeus indicus is protected from white to white spot syndrome virus (WSSV) infection spot disease by oral administration of inactivated after oral application of the viral envelope protein white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic VP28. Diseases of Aquatic Organisms 70, 167- Organisms 66, 265-270. 170. Wang, L., 2009. Cloning of Envelope Protein Genes vp26 and vp28 of Shrimp White Spot Syndrome TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 85
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 SCREENING SUITABLE PICHIA PASTORIS STRAINS CARRIED VP28 GENE TO PRODUCE TOLERINE AGAINST WHITE SPOT DISEASE IN SHRIMP Ngo Thi Ngoc Thuy1*, Dang Thi Tra My1 ABSTRACT The use of Pichia pastoris as the expression system to produce recombinant proteins for disease prevention in inverterbrate has been published widely; however, it has been limited used in aqua- culture, especially in preventation of shrimp diseases. This study is aimed to find a suitable strain from 150 strains of P. pastoris carrying pPick9K-VP28 vectors to produce tolerine against white spot disease in shrimp. Those strains were screened based on the phenotype (Mut+), copy number of VP 28 gene, the ability to express VP28 protein and growth rate of yeast strains. The selection process figured 125 strains of phenotype Mut+, in which, 82 strains have got 14-16 copy gene of VP28-His in genome. Further screening showed that recombinant VP28 protein was well expressed in 8 P.pastoris strains; the expressing protein was given a clear specific band of about 30kDa on SDS-PAGE gel and Western-blot cellulose membrane. Finally, one strain – strain 11 – revealed quick growth with the highest cell density of 3.92 x 109cfu/ml at 84 hours post stimulation and ef- fectively expressed rVP28 the protein was selected to produce tolerine against white spot disease in future studies. Keywords: VP28, Pichia pastoris, White spot disease. Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015 Ngày duyệt đăng: 15/6/2015 1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research,Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: thuyngo8@yahoo.com 86 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015