TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:41

Thêm vào BST

Báo xấu

91
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngày nay, các công nghệ sản xuất các hóa chất có giá trị thƣơng mại từ các chất không tan trong nƣớc nhƣ các hydrocarbon từ nguồn dầu mỏ bằng xúc tác sinh học đang rất đƣợc quan tâm. Các tế bào thƣờng đƣợc sử dụng làm xúc tác sinh học vì có sẵn các cofactor (NADH,…) và có khả năng tái tạo các cofactor này. Khả năng tái tạo các cofactor của tế bào rất cần thiết cho các phản ứng oxy hóa và khử. Trong ngành công nghệ hóa chất, nguyên liệu để tổng hợp hóa chất thƣờng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGUYỄN TRẦN MINH ANH TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4 LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4 LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: GS. TS. HISAO OHTAKE NGUYỄN TRẦN MINH ANH TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  OVEREXPRESS GENE ALKB1/B2 ENCODING FOR N-ALKANE MONOOXYGENASE IN Rhodococcus opacus B4 GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Pro.Dr. HISAO OHTAKE NGUYEN TRAN MINH ANH Dr. LE DINH DON TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô khác trong trƣờng đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi. TS. Lê Đình Đôn và GS. TS. Hisao Ohtake, TS. Honda, TS. Sameshima, TS. Yamashita đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Tập thể phòng thí nghiệm sinh hóa, khoa công nghê ̣ sinh ho ̣c, đa ̣i ho ̣c Osaka đã tạo mọi điều kiện giúp em hoàn thành đề tài. Trƣờng Đại Học Osaka, Nhật Bản đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Tập thể các bạn sinh viên trong lớp CNSH 28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn cha mẹ và tất cả những ngƣời thân trong gia đình luôn là nguồn động viên và khích lệ to lớn cho con trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Tháng 06 năm 2006 Nguyễn Trần Minh Anh iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN TRẦN MINH ANH, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2006. “CHUYỂN PLASMID CHỨA GENE ALKB1, ALKB2 VÀO Rhodococcus opacus B4 ĐỂ TĂNG NĂNG SUẤT TẠO ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE PHÂN GIẢI N- ALKANE TẠO N-ALCOHOL”. Giáo viên hƣớng dẫn: GS. TS. HISAO OHTAKE TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Khóa luận nhằm tạo chủng Rhodococcus opacus B4 có biểu hiện của enzyme n- alkane monooxygenase tăng so với dòng chƣa biến nạp, bằng cách tạo plasmid chứa gene alkB1/alkB2 rồi chuyển plasmid đó vào R. opacus B4. Một số kết quả đạt đƣợc: - Tạo đƣợc plasmid mới có promoter mạnh và có chứa gene alkB1/ alkB2. - Tạo đƣợc dòng R. opacus B4 mới có biểu hiện gene alkB1/ alkB2 tăng so với dòng tự nhiên. - Đề xuất: kiểu bể phản ứng dành cho R. opacus. iv
MỤC LỤC TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các hình ........................................................................................................vii Danh sách sơ đồ và bảng ............................................................................................. viii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích và yêu cầu .............................................................................................. 1 1.2.1. Mục đích .......................................................................................................... 1 1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................ 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 2 2.1. Tầm quan trọng của sản xuất hóa chất bằng sinh vật ............................................ 2 2.2. Giới thiệu chung về loài vi khuẩn Rhodococcus ................................................... 3 2.3. Giới thiệu về Rhodococcus opacus B4 .................................................................. 5 2.4. N- alkane monooxygenase .................................................................................... 8 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 11 3.1. Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 11 3.2. Vật liệu ................................................................................................................ 11 3.2.1. Chủng vi khuẩn và phƣơng pháp nuôi cấy .................................................... 11 3.2.2. Plasmid .......................................................................................................... 11 3.2.3. PCR primers .................................................................................................. 11 3.2.4. Môi trƣờng ..................................................................................................... 12 3.3. Chiến lƣợc thí nghiệm tổng quát ......................................................................... 14 3.4. Phƣơng pháp ........................................................................................................ 15 3.4.1. Kỹ thuật ......................................................................................................... 15 3.4.1.1. PCR............................................................................................................ 15 3.4.1.2. Thiết kế mồi ............................................................................................... 15 v
3.4.1.3. Sắc ký khí .................................................................................................. 16 3.4.2. Phƣơng pháp .................................................................................................. 18 3.4.2.1. Phân lập Rhodococcus opacus B4 ............................................................. 18 3.4.2.2. Phƣơng pháp khuếch đại đoạn gene bằng PCR......................................... 18 3.4.2.3. Phƣơng pháp tách plasmid từ vi khuẩn ..................................................... 18 3.4.2.4. Ligation vào T- vector ............................................................................... 19 3.4.2.5. Kỹ thuật blunt-end ..................................................................................... 19 3.4.2.6. Chuyển nạp bằng phƣơng pháp shock nhiệt.............................................. 19 3.4.2.7. Điện chuyển ............................................................................................... 20 3.4.2.8. Xác định hoạt tính enzyme ........................................................................ 20 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 22 4.1. Kết quả ................................................................................................................. 22 4.2. Thảo luận ............................................................................................................. 24 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 27 5.1. Kết luận................................................................................................................ 27 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 27 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 28 vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Công nghiệp sản xuất hóa chất ........................................................................ 2 Hình 2.2: Vi khuẩn Rhodococcus opacus B4 .................................................................. 6 Hình 2.3: Mô hinh AlkB – alkane hydroxylase ............................................................... 8 ̀ Hình 4.1: Kết quả điện di sau khi xử lý enzyme cắt...................................................... 22 Hình 4.2: Kết quả điện di sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI ......................... 22 Hình 4.3: Nồng độ các mảnh DNA sau khi tách từ gel band ........................................ 23 Hình 4.4: Điện di kết quả PCR khuẩn lạc ..................................................................... 23 Hình 4.5: Kết quả điện di khẳng định plasmid mới tạo................................................. 24 vii
DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất phenol từ benzen ............................................................. 3 Sơ đồ 2.2: Con đƣờng chuyể n hóa của n-octane ............................................................. 9 Sơ đồ 2.3: Cơ chế oxy hóa nhóm methyl cuối của n- alkane ........................................ 10 Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm tổng quát .................................................................... 14 Bảng 2.1: Đặc tính sinh lý sinh hóa của Rhodococcus .................................................... 6 viii
1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, các công nghệ sản xuất các hóa chất có giá trị thƣơng mại từ các chất không tan trong nƣớc nhƣ các hydrocarbon từ nguồn dầu mỏ bằng xúc tác sinh học đang rất đƣợc quan tâm. Các tế bào thƣờng đƣợc sử dụng làm xúc tác sinh học vì có sẵn các cofactor (NADH,…) và có khả năng tái tạo các cofactor này. Khả năng tái tạo các cofactor của tế bào rất cần thiết cho các phản ứng oxy hóa và khử. Trong ngành công nghệ hóa chất, nguyên liệu để tổng hợp hóa chất thƣờng không phân cực nhƣ các hydrocarbon trong dầu mỏ và các dẫn xuất của chúng. Các nguyên liệu này và các sản phẩm tạo thành có độc tính cao đối với các xúc tác sinh học và làm giới hạn việc ứng dụng xúc tác sinh học trong ngành công nghiệp hóa chất. Giải pháp cho vấn đề này là phải sử dụng các vi sinh vật chủ (host strain) có khả năng chịu đƣợc các dung môi hữu cơ làm xúc tác sinh học. Rhodococcus opacus B4 thâ ̣m chí có t hể số ng, sinh trƣởng tố t và có thể xúc tác nhiều phản ứng sinh tổng hợp trong môi trƣờng thâ ̣m chí chỉ có dung môi hƣ̃u cơ nên là đối tƣơ ̣ng đang rấ t đƣơ ̣c quan tâm . Và trong các phản ứng mà nó xúc tác , phản ứng chuyể n đổ i n- alkane đóng mô ̣t phầ n quan tro ̣ng. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Tạo chủng R. opacus có biểu hiện gene alkB cao hơn chủng bình thƣờng, nhằm phục vụ cho sản xuất hóa chất bằng xúc tác sinh học sau này. 1.2.2. Yêu cầu Tạo chủng R. opacus có năng suất chuyển hóa n- alkane cao hơn chủng bình thƣờng.
2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tầ m quan tro ̣ng của sản xuấ t hóa chấ t bằ ng sinh vâ ̣t Quá trình xử lý sinh học đƣợc áp dụng khi cần thiết để giảm ch i phí và năng lƣơ ̣ng cho toàn bô ̣ quá trinh sản xuấ t . ̀ Sản xuất bằn g xúc tác sinh ho ̣c đơn giản , ít tốn hóa chất và năng lƣợng hơn sử dụng xúc tác hóa học . Bên ca ̣nh đó còn có thể ta ̣o các sản phẩ m đă ̣c hiê ̣u về cấ u trúc không gian (stereo-), điề u khiể n đƣơ ̣c nơi phản ƣ́ng xảy ra trên cơ chấ t (regio-) và tránh đƣợc sản p hẩ m phụ không mong muốn . Cả tế bào vi sinh vật là xúc tác sinh học lý tƣởng vì có khả năng tái tạo các co factor (nhƣ NAD(P)H ...), rấ t cầ n thiế t cho phản ứng sinh tổng hợp . Cho đế n nay , xúc tác sinh học đƣợc ứng dụng trong ngàn h công nghiê ̣p hóa chấ t để sản xuấ t các hóa chấ t đă ̣c biê ̣t , polymer và mô ̣t số các hóa chấ t quan tro ̣ng khác. Xƣ̉ lý hóa ho ̣c Xƣ̉ lý sinh ho ̣c Xƣ̉ lý hóa ho ̣c Hình 2.1: Công nghiệp sản xuất hóa chất
So sánh sản xuấ t phenol tƣ̀ benzel bằ ng con đƣờng sinh ho ̣c và hóa ho ̣c 3 Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất phenol từ benzene Tính khả thi về mă ̣t kinh tế của việc sử dụng xúc tác sinh học phụ thuô ̣c nhiề u yế u tố nhƣ loại xúc tác sinh học , loại bể phản ƣ́ng , cấ u hinh máy móc ... Phầ n lớn các ̀ phản ứng chuyển hóa đang đƣợc quan tâm là phản ứng chuyển hóa các chất không phân cƣ̣c . Các hợp chất phân cực không tan trong nƣớc và rất độc đ ối với các tế bào . Mă ̣t khác , enzyme ổ n đinh hơn trong dun g môi hƣ̃u cơ (11). Vì vậy, bể phản ƣ́ng hai ̣ pha lỏng gồ m có pha nƣớc và pha dung môi hƣ̃u cơ thƣờng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng. 2.2. Giới thiệu chung Loài vi khuẩ n Rhodococcus. spp đƣơ ̣c Zopf đề cập lần đầu tiên vào năm 1891, là loài vi khuẩ n mang sắ c tố đỏ , quan tro ̣ng về mă ̣t thú y, bê ̣nh lý, công nghiê ̣p. Hầ u hế t họ rhodococci (ngoại trƣ̀ R. equi là nguồn gây bệnh trên thú và ngƣời) có tiềm năng thƣơng ma ̣i cao do có khả năng tạo nhiều chất hoạt tính bề mặt – acid mycolic – và có hệ thống enzyme có tác dụng chuyển hóa và phân hủy sinh học . Rhodococcus opacus B4, đƣợc phân lập từ vùng đất nhiễm dầu, là đối tƣợng lý tƣởng dùng trong phân hủy sinh ho ̣c các loa ̣i hydrocarbon vì nó có thể phân hủy nhiều loại hợp chất hữu cơ phổ biế n trong môi trƣờng, bề mặt vi khuẩn có tính kỵ nƣớc và hấp thụ nguồn hydrocarbon bằng cách tạo các chất hoạt hóa bề mặt nên chịu đƣợc nhiều loại dung môi hữu cơ khác nhau. Hiê ̣n nay, viê ̣c sƣ̉ du ̣ng hê ̣ thố ng oxy hóa alkane của vi khuẩ n làm xúc tác sinh học trong sản xuất hóa chất và dƣơ ̣c phẩ m rấ t đƣơ ̣c quan tâm . Các phản ứng sinh học
này thu hút nhiều sự quan tâm vì việc đƣa nguyên tử [O] vào các hóa chất bất h oạt4 nhƣ alkane bằ ng con đƣờng hóa ho ̣c cổ điể n có nhiề u khó khăn . Mô ̣t phầ n vì các chấ t oxy hóa mạnh cần để kích h oạt nguyên tƣ̉ C thƣờng không tƣơng thích với cơ chấ t . Phầ n khác vì thƣờng ta ̣o ra các sả n phẩ m oxy hóa phu ̣ khác thông qua các phản ƣ́ng phụ. Tính kỵ nƣớc của vi khuẩn giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi độc tính của các hợp chất tan trong nƣớc . Chỉ có Rhodococcus có thể chịu đƣợc nồ ng đô ̣ cao chấ t hƣ̃u cơ tan . Hơn nƣ̃a, lipid hoa ̣t hóa bề mă ̣t rhodococci góp phần tạo khả năng trao đổi alkane. Sƣ̣ trao đổ i alkane đƣơ ̣c mã hóa chủ yế u bởi gene alkane hydroxylase (alk) đƣợc bảo tồn trong nhiều l oài vi khuẩ n . AlkB có tinh bảo tồ n cao và có nhiề u ph iên ́ bản nên biểu hiện của mỗi loại alkB đƣợc điều khiển bởi mỗi loại nhân tố phiên mã khác nhau. Cho đế n nay, ngƣời ta đã biế t đế n 60 dạng alkB có trinh tƣ̣ rấ t đa da ̣ng. ̀ Alkane chiế m tƣ̀ 20 – 50% trong thành phầ n dầ u thô , phụ thuộc vào nguồn dầu . Tuy nhiên, nhiề u loại sinh vâ ̣t nhƣ vi khu ẩn, cây cố i và mô ̣t số l oài đô ̣ng vâ ̣t cũng sản sinh ra alkane. Alkane trơ về mă ̣t hóa học và phải đƣợc hoạt hóa trƣớc khi chuyển hóa. Khi có mă ̣t oxygen , phản ứng oxy hóa thƣ ờng bắt đầu từ oxy hóa nhóm methyl cuối cùng tạo n- alcohol và sau đó quá trinh oxy hóa tiế p tu ̣c bởi enzyme dehydrogenase để ̀ tạo acid béo tƣơng ứng. Mô ̣t vài l oài vi khuẩ n chỉ có mô ̣t loa ̣i alkane hydroxylase, trong khi mô ̣t số loài khác có nhiề u da ̣ng alkane hydroxylase hơn. Các l oại alkane hydroxylase này thƣờng có dạng cơ chất tƣơng tự nhau , chỉ khác nhau là chúng đƣợc tạ o ra ở phase ổ n đinh ban đầ u hay phase tăng trƣởng trong giai đoạn sinh trƣởng của vi khuẩ n (17). ̣ Hầu hế t các l oài vi khuẩ n có khả năng chuyể n hóa chuỗi alkane dài hơn 10 nguyên tƣ̉ C (C12 tới C 20 hay thâ ̣m chí C 30). Trong khi rấ t nhiề u loài vi sinh vâ ̣ t có khả năng sƣ̉ du ̣ng alkane có chuỗi C dài , dạng thể lỏng thì mô ̣t số l oài vi khuẩ n Gram (+) nhƣ Corynebacterium – Nocardia – Mycobacterium – Rhodococcus chỉ có thể chuyể n hóa các alkane chuỗi ngắ n , dạng thể khí. AlkB1, alkB2 là các gene có sẵn trong genome của R. opacus B4, mã hóa cho enzyme n- alkane monooxygenases (2 enzyme liên kết với màng tế bào), có tác dụng xúc tác quá trình oxy hóa nhóm methyl cuối cùng trong mạch carbon của n- alkane để tạo alcohol, aldehyde và acid béo (các hợp chất hữu cơ quan trọng trong ngành công
nghiệp hóa chất). Alcohol, aldehyde và acid béo là các loại hóa chất rất quan trọng 5 trong các quá trình sản xuất và trong đời sống hằng ngày. Nhƣng để sản xuất các chất này bằng con đƣờng hóa học phải cần qui trình sản xuất ở nhiệt độ và áp suất cao. Nhân tố chính và qu an tro ̣ng nhấ t để có thể giảm chi phí của t oàn bô ̣ qui trình sản xuất là chi phí xúc tác sinh học , quyế t đinh bởi giá cả của môi trƣờng và nguồ n C ̣ dùng cho tế bào , hoạt tính và tính ổn định của xúc tác sinh học trong đi ều kiện sản xuấ t. Nế u h oạt tính xúc tác sinh học gấp đ ôi và ổ n đinh sẽ giảm t oàn bô ̣ chi phí của ̣ quá trình đến 5,7 USD/kg (đố i với fed – batch) và 5,9 USD/kg (đố i với qui trinh sản ̀ xuấ t liên tục). Vì vậy việc tăng hoạt tính của enzyme đóng vai trò rất quan trọng . 2.3. Giới thiệu về Rhodococcus opacus B4 Tƣ̀ trƣớc đế n nay, họ rhodococci rấ t ít đƣơ ̣c quan tâm vì nhiều lý do. Mô ̣t trong nhƣ̃ng lý do đó là ho ̣ vi khuẩ n này sinh trƣởng châ ̣m , khó phân lập và thiế u dấ u hiê ̣u để nhận biết có phải là nguồn gây bệnh hay không . Gầ n đây, họ vi khuẩn này đang là đố i tƣơ ̣ng nghiên cƣ́u trên nhiề u quố c gia . Mô ̣t trong nhƣ̃ng nghiên cứu là ứng dụng chúng vào biến đổi hóa học và sinh tổng hợp các hơ ̣p chấ t hữu cơ. R. opacus chiế m phầ n lớn trong quầ n thể vi sinh vâ ̣t số ng trong đấ t . R. opacus có thể sống ở 33oC, nhƣng không thể sống ở 42oC, có thể sống ở nhiệt độ thấp (4 – 10oC) và trong kh oảng pH rô ̣ng (5 – 9). Rhodococcus opacus có nhiễm sắc thể dạng thẳng và các plasmid dạng thẳng , có kích thƣớc rất lớn, có thể sử dụng nhiều loại chấ t hƣ̃u cơ làm nguồ n hydrocarbon nhƣ benzene , toluene, napthalene, n- alkane... Khi có mă ̣t n- alkane , rhodococci tạo ra 1 loại saccharide ngoại bào gọi là EPS (extra cellular polysaccharides ), phát triển cấu trúc màng nội bào , cũng nhƣ tăng cƣờng phát triể n vách tế bào (Ivshina và ctv, 1982; Glazacheva và ctv, 1990). Khi tăng trƣởng trên n- alkane lỏng, rhodococci có khả năng tổ ng hơ ̣p các chấ t h oạt tính bề mặt giúp giảm đô ̣ căng bề mă ̣t của nƣớc , tạo thể sữa và có nhiều ƣu điểm trong việc tổng hơ ̣p các chấ t tẩ y rƣ̉a. Các chất hoạt tính bề mặt từ rhodococci ít độc hại hơn 100 lầ n so với các chấ t tẩ y rƣ̉a tổ ng hơ ̣p khác . Rhodococci rấ t đƣơ ̣c quan tâm về mă ̣t sinh thái và cả về mă ̣t công nghiê ̣p vì chúng có khả năng tổng hợp cá c acid ngoa ̣i bào , bao gồ m các acid amine thiết yếu khi phát triển trên n- alkane.
6 Hình 2.2: Vi khuẩn Rhodococcus opacus B4 Bảng 2.1: Đặc tính sinh lý sinh hóa của Rhodococcus Nguồ n tạ o acid : Nhạ y cả m vớ i : Glucose - Penicillin G - Mannitol O Polymicine B - Inositol O O/129 - Sorbitol O Nalidixic acid - Rhamnose - Tobramicine - Sucrose - Chloramphenicol + Melibiose - Thủ y phân : Amigdalin - Aesculin - Arabinose - Gelatin - Glycerol O Agar - Maltose - Starch - Galactose - Tween 40 + Mannose - Tween 80 + Starch - Fructose O
7 Thử nghiệ m sinh Phả n ứ ng Gram + hóa Tạ o bào tử - Urease + Khoả ng pH tăng 5 -> 9 Lysine decarboxylase - trưở ng Nồ ng độ NaCl tăng Ornithine - trưở ng (%) decarboxylase tố i thiể u 0 β-galactosidase + tố i đa 9 Arginine dihydrolase - Tryptophane Nguồ n carbon sử dụ ng - deaminase Glucose - Tạ o Indole - Arabinose - Voges-Proskauer + Khử Nitrate thành Mannose - - Nitrogen Mannitol + Hình thành H2S - Alkaline N-acetyl-glucosamine + + phosphatase Maltose - Esterase + Gluconate + Esterase lipase + Caprate - Lipase + Adipate + Leucine arylamidase + Malate + Valine arylamidase + Citrate - Acid phosphatase + Phenyl-acetate + α-glucosidase + Acetic acid - β-glucosidase + Tăng trưởng trên Citric acid nd nhiề u môi trường + rắ n D-Alanine - TSA + L-Alanine - TSA + 3%NaCl + L-Alaninamide - NA + L-Serine - NA + 3%NaCl + L-Leucine nd TSB +
(O: oxy hóa , nd: chƣa xác đinh) ̣ 8 2.4. N- alkane monooxygenase (hydroxylase) Tên chính thƣ́c của loại enzyme này l à n- alkane monoxygenase, ngoài ra còn có nhiều tên gọi khác nhƣ alkane 1- hydroxylase, fatty acid - hydroxylase, lauric acid - hydroxylase, - hydroxylase. Hình 2.3: Mô hinh AlkB – alkane hydroxylase (17) ̀ Enzyme alkB đƣơ ̣c giả thiế t là có 6 trục xoắn, đƣơ ̣c sắ p xế p theo hình lu ̣c giác , tạo ra mô ̣t túi dài ky ̣ nƣớc cho alkane ma ̣ch thẳ ng có thể che n vào . Các phân tử histidine có tinh bảo tồ n cao gắ n với nhân Fe. ́ Tính chất: không bền, trọng lƣợng phân tử lớn, tƣơng đối không tan, khó tinh chế, là protein liên kết màng có mang 2 nguyên tử Fe nhƣng không mang nhân heme (chỉ có 1 lƣơ ̣ng nhỏ heme và flavin).
9 n – Octane Pseudomonas oleovorans Alkane 1 - monooxygenase Octane hydroperoxide 1 – Octanol Salmonella choleraesuis Alkyl hydroperoxide reductase Alcohol dehydrogenase 1 – Octanal Aldehyde dehydrogenase Octanoate Acyl – CoA synthetase Octanoyl – CoA Intermediary metabolism (KEGG) Sơ đồ 2.2: Con đƣờng chuyể n hóa của n-octane  Cơ chế hoạt đô ̣ng:
AlkB chuyể n 1 nguyên tƣ̉ oxygen tƣ̀ phân tƣ̉ O 2 đến nhóm methyl cu ối cùng 10 của phân tử alkane để tạo alcohol , còn electron từ rubredoxin khử nguyên tử O còn lại thành H2O.
11 Sơ đồ 2.3: Cơ chế oxy hóa nhóm methyl cuối của n- alkane(18) Rubredoxin là 1 loại protein có khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ thấ p , có chứ a nhân Fe , có vai trò quan tro ̣ng trong viê ̣c vâ ̣n chuyể n điê ̣n tƣ̉ trong tế bào .