Tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhược độc bằng phương pháp knock out gen aroA

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21<br /> <br /> TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHƯỢC ĐỘC<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCK-OUT GEN aroA<br /> Trương Ngọc Thùy Liên*, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc Bình<br /> Trung tâm Công nghệ sinh học tp Hồ Chí Minh, *truongngocthuylien@gmail.com<br /> TÓM TẮT: Với mục tiêu phát triển vaccine kháng lại sự xâm nhiễm của Aeromonas hydrophila trên cá,<br /> chủng A. hydrophila đột biến được tạo ra bằng phương pháp knock-out gen aroA, gen mã hóa 5enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase. Đoạn giữa dài 683 bp của gen này được thay thế bằng gen<br /> kháng Kanamycin KmR tạo tổ hợp gen (cassette) aroA:KmR. Chủng E. coli Sm10λpir chứa vector pGP704<br /> có mang cassette aroA:KmR được sử dụng để tiếp hợp với A. hydrophila hoang dã tạo chủng đột biến.<br /> Độc lực của chủng A. hydrophila đột biến được kiểm tra bằng phương pháp tiêm vào cá tra giống. Kết quả<br /> cho thấy LD50 của chủng đột biến lớn hơn 107 CFU/ml, trong khi chủng hoang dã có LD50 thấp hơn 103<br /> CFU/ml. Như vậy, chủng M25 A. hydrophila đột biến bất hoạt gen aroA có độc lực thấp hơn nhiều<br /> (>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu.<br /> Từ khóa: Aeromonas hydrophila, đột biến, knock-out gen, nhược độc, vaccine.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Trong các bệnh thường gặp ở cá tra, bệnh<br /> nhiễm trùng huyết do Aeromonas hydrophila<br /> gây thiệt hại thứ hai, chỉ sau bệnh gan thận mủ,<br /> tỷ lệ gây chết có thể lên đến 80%. Hiện nay,<br /> người nuôi cá tra chủ yếu sử dụng kháng sinh<br /> để chữa bệnh cho cá, để giảm thiểu việc sử<br /> dụng kháng sinh việc nghiên cứu tạo vaccine rất<br /> cần thiết.<br /> Trong các phương pháp tạo vaccine, phương<br /> pháp knock-out gen tạo vaccine sống nhược độc<br /> là phương pháp phổ biến và rất hữu hiệu. Với<br /> chiến lược lựa chọn gen mục tiêu cho phương<br /> pháp knock-out gen, có 2 hướng là loại bỏ yếu<br /> tố gây độc hoặc gây đột biến khuyết dưỡng.<br /> Trong đó, đột biến gen aroA là một đột biến<br /> khuyết dưỡng được nhiều nghiên cứu lựa chọn.<br /> Gen aroA mã hóa cho enzyme 5enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase, là<br /> enzyme cần thiết cho sinh tổng hợp folate; các<br /> dòng đột biến gen aroA bị mất độc tính do<br /> không thể phát triển được trong mô vì không thể<br /> tự tổng hợp folate đồng thời không thể thu nhận<br /> được folate từ bên ngoài [1]. Thune et al. (1999)<br /> [3] đã sử dụng phương pháp knock-out để tạo<br /> chủng E. ictaluri đột biến gen aroA. Vaughan<br /> (1993) [4] đã nghiên cứu về độc tính của<br /> Aeromonas salmonicida đột biến aroA trên cá<br /> hồi Atlantic (10 đến 15 g) kết quả ở nồng độ<br /> 106CFU dòng đột biến không gây chết cá trong<br /> khi dòng hoang dại gây chết 100% cá ở cùng<br /> <br /> nồng độ. Priebe et al. (2001) [2] tạo đột biến<br /> loại bỏ gen aroA trên đối tượng Pseudomonas<br /> aeruginosa. Dòng đột biến được chứng minh<br /> nhược độc khi chủng qua cả đường mũi và<br /> màng bụng chuột với liều lên đến 5.109 CFU<br /> đều không gây bệnh. Moral et al. (1998) [1] đã<br /> nghiên cứu gây đột biến khuyết dưỡng loại bỏ<br /> gen aroA làm mất độc tính của vi khuẩn A.<br /> hydrophila và dùng như vaccine cho cá hồi. Kết<br /> quả khi tiêm với nồng độ 108 CFU/ml vào cá<br /> hồi, chủng đột biến không gây bệnh, trong khi<br /> đó, 50% LD của dòng hoang dã là 106CFU/ml.<br /> Ngoài đặc tính nhược độc, dòng đột biến<br /> gen aroA còn thể hiện tính an toàn khi đưa ra<br /> môi trường tự nhiên, điều này được chứng minh<br /> trong nghiên cứu của Vivas et al. (2004) [5],<br /> dòng đột biến có khả năng sống sót trong nước<br /> thấp hơn so với dòng hoang dã và không tồn tại<br /> lâu trong môi trường nuôi cá.<br /> Từ những vấn đề trên, nghiên cứu này được<br /> tiến hành với mục tiêu tạo ra chủng Aeromonas<br /> hydrophila đột biến gen aroA (GeneID:<br /> 4489425) nhược độc có thể ứng dụng làm<br /> vaccine cho cá tra và an toàn khi đưa ra môi<br /> trường tự nhiên.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Chủng Aeromonas hydrophila hoang dã<br /> được phân lập từ cá bệnh ở An Giang. Vi khuẩn<br /> được cấy trên môi trường RS (Rimler Shott)<br /> 15<br /> <br /> Truong Ngoc Thuy Lien et al.<br /> <br /> (HiMedia) là môi trường đặc hiệu để phân lập<br /> A. hydrophila. Các dòng vi khuẩn thu nhận<br /> được sẽ được định danh bằng cách giải trình tự<br /> đoạn gen 16S ribosomal.<br /> Cá tra được ương nuôi từ giai đoạn noãn<br /> hoàng đến 7-10 g trong bể composite. Trước khi<br /> tiến hành thử nghiệm, cá (n=10) được kiểm tra<br /> sự hiện diện của A. hydrophila bằng cách cấy<br /> mẫu máu trên môi trường RS.<br /> Tạo chủng A. hydrophila nhược độc<br /> Tạo plasmid mang cassette aroA::KmR<br /> Đoạn đầu HaroA và đoạn cuối TaroA của<br /> gen aroA được khuếch đại từ bộ gen A.<br /> hydrophila, gen kháng kháng sinh Kanamycin<br /> KmR được khuếch đại từ pCAMBIA (Canada)<br /> bằng các cặp mồi (bảng 1), chuyển vào pJET1.2<br /> Blunt (Fermentas) và nhân dòng E. coli DH5α<br /> (Invitrogen). Ba đoạn gen này sau đó được cắt<br /> và nối với nhau bằng các enzyme cắt hạn chế<br /> <br /> SacI, BamHI, XbaI (New England Biolabs) để<br /> tạo thành cassette aroA::KmR có thứ tự nối như<br /> sau: HaroA-KmR-TaroA. Cassette có 2 vùng<br /> đầu và cuối tương đồng với gen aroA, đoạn<br /> giữa là marker chọn lọc KmR. Casstte được<br /> chuyển vào plasmid pGP704 (Đại học Harvard)<br /> và được biến nạp E. coli Sm10 λpir (Biomedal).<br /> Gen kháng Kanamycin được dùng với mục đích<br /> knockout đoạn gen aroA đồng thời là marker<br /> chọn lọc các dòng đột biến tạo thành ở các thí<br /> nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, do tính an toàn của<br /> vi khuẩn biến đổi gen, tránh sự phát tán gen<br /> kháng kháng sinh ra môi trường bởi hiện tượng<br /> chuyển gen ngang, các chủng đột biến sau khi<br /> tạo thành cần được loại bỏ gen kháng<br /> Kanamycin trong các nghiên cứu tiếp theo. Đó<br /> là lý do cặp mồi khuếch đại gen KmR được chèn<br /> thêm đoạn trình tự FRT 5’ GAAGTTCCTATT<br /> CtctagaaaGtATAGGAACTTC 3’ là trình tự<br /> nhận biết của hệ thống λ Red Recombinase.<br /> <br /> Bảng 1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong quá trình tạo cassette<br /> S<br /> TT<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Tên mồi<br /> aroA -F1<br /> aroA -R3<br /> aroA -F3<br /> aroA -R1<br /> FKm<br /> <br /> 3<br /> <br /> RKm<br /> <br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> <br /> aroA_F4<br /> aroA_R4<br /> aroA_F5<br /> aroA_R5<br /> FpJET1.2<br /> RpJET1.2<br /> <br /> Gen<br /> HaroA<br /> TaroA<br /> Kanamycin<br /> (KmR)<br /> <br /> aroA<br /> aroA<br /> aroA<br /> aroA<br /> <br /> Trình tự<br /> 5’- AAGAGCTCTTGTGCCACCCGCAGTCTTGC -3’<br /> 5’- AAGGATCCTTCACCGCGAAGCTGCG - 3’<br /> 5’- AAGGATCCATGCGGCCATGACCATCG -3’<br /> 5’- AATCTAGATCACGCGCGCTGACTGAT -3’<br /> 5’AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATA<br /> GGAACTTCGGAATAGGAACTTCCCAGCCAGCCAA-3’<br /> 5-’AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTC<br /> TCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATC<br /> CAGT-3’<br /> 5’- GGAGCCGGTCAATCTGTTCC- 3’<br /> 5’- CGGGGATGTGGTTCATGTCC- 3’<br /> 5’- GCTGGTCAGCTTTATGGATGGC- 3’<br /> 5’- ATCTAGCCCGCACGGGCAG- 3’<br /> 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3'<br /> 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'<br /> <br /> Tiếp hợp<br /> E. coli Sm10 λpir mang cassette (chủng<br /> cho) và chủng A. hydrophila hoang dã (chủng<br /> nhận) được tăng sinh trong môi trường LB đến<br /> giữa pha tăng trưởng (OD600=1), sau đó dịch<br /> tăng sinh được bổ sung BSA 2 mg/ml và 10<br /> mM MgSO4. Chủng cho và chủng nhận được<br /> trộn chung theo tỷ lệ 1: 9, đưa hỗn hợp lên<br /> màng nitrocellulose (Whatman) có đường kính<br /> 16<br /> <br /> Enzyme cắt<br /> hạn chế<br /> SacI<br /> BamHI<br /> BamHI<br /> XbaI<br /> BamHI<br /> BamHI<br /> <br /> lỗ màng 0,45 µm. Màng được chuyển lên môi<br /> trường LB agar bổ sung BSA 2 mg/ml và 10<br /> mM MgSO4 và phủ lên bằng LB agar cùng loại,<br /> ủ ở 28oC, 4 giờ. Vi khuẩn sau đó được thu nhận,<br /> trộn đều dịch vi khuẩn (resuspension) và cấy<br /> trải trên môi trường LB agar bổ sung kanamycin<br /> và colistin, chọn lọc các dòng A. hydrophila<br /> mang cassette. Các khuẩn lạc thu nhận được sẽ<br /> được kiểm tra kiểu gen bằng PCR.<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21<br /> <br /> với trình tự của gen aroA và gen kháng<br /> kanamycin (AAF65337.1) được công bố trên<br /> Genbank (không trình bày) chứng tỏ các đoạn<br /> gen đã được nhân dòng thành công.<br /> <br /> Thử nghiệm độc lực<br /> Chủng đột biến và hoang dã được tăng sinh<br /> trong môi trường LB lỏng đến khi OD600 đạt<br /> 1,45 (khoảng 109 CFU/ml). Sinh khối vi khuẩn<br /> được ly tâm ở 2.200 g trong 15 phút ở 4oC, sau<br /> đó trộn đều dịch vi khuẩn và pha loãng trong<br /> NaCl 0,65% [3].<br /> Cá được bố trí thí nghiệm trong bể plastic<br /> 100 lít, mỗi bể 10 cá. Nồng độ vi khuẩn tiêm<br /> vào cá, đối với chủng A. hydrophila hoang dã là<br /> 103, 104, 105, 106 CFU/ml, đối với chủng đột<br /> biến là 104, 105, 106, 107 CFU/ml, đối chứng âm<br /> tiêm nước muối 0,65%. Mỗi công thức lặp lại 3<br /> lần. Theo dõi và ghi nhận số lượng cá chết trong<br /> 2 tuần.<br /> <br /> Các đoạn gen này được nối với nhau theo<br /> thứ tự ở hình 1. Cassette tạo thành được chuyển<br /> vào vector pGP704 và nhân dòng trong E. coli<br /> Sm10λpir. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm<br /> cắt plasmid nhân dòng với enzyme BglII (hình<br /> 2d) cho thấy đã tạo được cassette và nhân dòng<br /> thành công plasmid pGP704 trong E. coli<br /> Sm10λpir.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Tạo cassette mang gen aroA đột biến<br /> Kết quả nhân dòng các đoạn HaroA (kích<br /> thước 354 bp), TaroA (kích thước 363 bp) được<br /> kiểm tra bằng cặp mồi FpJET1.2/RpJET1.2 cho<br /> sản phẩm kích thước lần lượt là 473 bp và 482<br /> bp; cũng như kết quả nhân dòng gen KmR (kích<br /> thước 1327 bp) được trình bày lần lượt ở hình<br /> 2A, 2B, 2C. Các đoạn gen được giải trình tự và<br /> đối chiếu cho thấy có sự trùng khớp 99-100%<br /> A<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5 6<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ cassette và các cặp mồi dùng cho<br /> phản ứng PCR kiểm tra chủng A. hydrophila đột<br /> biến<br /> B<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 500 bp<br /> <br /> C<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> D<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 4 kb<br /> 2 kb<br /> 1500 bp<br /> 1000 bp<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> trên gel agarose 1%<br /> A: 2-6. Các dòng E. coli DH5α chứa plasmid<br /> pJET::HaroA, 1. thang DNA, 7. đối chứng(-); B: 15. Các dòng E. coli DH5α chứa plasmid<br /> pJET::TaroA. 7. Thang DNA, 6. Đối chứng(-); C: 2.<br /> Khuẩn lạc E. coli DH5α chứa pJET::KmR, 3. thang<br /> DNA, 1. đối chứng (-); D: 2. Kết quả cắt plasmid<br /> pGP704 chứa cassette với BglII, 1. Thang DNA, 3.<br /> pGP704 chứa cassette.<br /> <br /> 17<br /> <br /> Truong Ngoc Thuy Lien et al.<br /> <br /> Tiếp hợp tạo chủng đột biến<br /> Do plasmid pGP704 có yếu tố di động<br /> mobRP4 cần thiết cho quá trình tiếp hợp, tuy<br /> nhiên, do mang vùng khởi đầu sao chép R6K<br /> nên để tự nhân lên trong tế bào, pGP704 cần có<br /> sự hiện diện của protein pi, mã hóa bởi gen pir.<br /> Do đó, pGP704 mang cassette aroA::KmR được<br /> biến nạp vào E. coli Sm10λpir, điều này giúp<br /> kiểm soát việc tái tổ hợp cassette từ pGP704<br /> vào bộ gen của A. hydrophila.<br /> Chủng E. coli Sm10λpir mang cassette được<br /> tiếp hợp với A. hydrophila hoang dã để tạo<br /> <br /> chủng đột biến. Trong quá trình tiếp hợp, nhờ<br /> vào mobRP4, plasmid pGP704 mang cassette<br /> đột biến từ tế bào E. coli sẽ di chuyển vào tế<br /> bào A. hydrophila. Do có sự tương đồng giữa<br /> HaroA và TaroA với gen aroA, sẽ có sự trao đổi<br /> chéo tương đồng diễn ra giữa cassette trên<br /> plasmid pGP704 và gen aroA trên genome của<br /> A. hydrophila, kết quả là gen aroA bị knock-out<br /> và thay thế bằng cassette. Bên cạnh đó, do<br /> A. hydrophila không có gen pir nên pGP704<br /> không thể tự sao chép và nhân lên trong các thế<br /> hệ tế bào.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> B<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 3. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR các khuẩn lạc thu nhận được sau tiếp<br /> hợp bằng cặp mồi aroA-F1/R1. Giếng 2-12 hình A, B, C. Các khuẩn lạc sau tiếp hợp; giếng 13 hình<br /> A, B, C. Thang DNA; giếng 1 hình A, B, C. Đối chứng (-)<br /> Sau khi tiếp hợp, vi khuẩn được cấy trải trên<br /> LB-kanamycin-colistin, kết quả thu được 33<br /> khuẩn lạc. 33 khuẩn lạc này được PCR kiểm tra<br /> với cặp mồi aroA-F1/aroA-R1 khuếch đại gen<br /> aroA, với dòng hoang dã sẽ cho băng kích thước<br /> 1,4 kb, dòng đột biến sẽ cho băng kích thước<br /> khoảng 2,1 kb. Kết quả điện di ở hình 3 cho thấy,<br /> <br /> 18<br /> <br /> có 2 khuẩn lạc ở giếng 11 hình 3A và giếng 4<br /> hình 3C đều cho một băng duy nhất và có kích<br /> thước tương đồng với dòng đột biến dự kiến.<br /> Hai dòng vi khuẩn, kí hiệu lần lượt là M10<br /> và M25, được tiếp tục kiểm tra bằng PCR với<br /> các cặp mồi 16S-F/16S-R, aroA-F4/aroA-R4,<br /> aroA-F5/aroA-R5, FKm/RKm, F-pGP704/R-<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21<br /> <br /> pGP704 như ở hình 1 và kết quả được trình bày<br /> ở hình 4.<br /> Kết quả PCR 2 dòng M10 và M25 với cặp<br /> mồi 16S-F/16S-R, đều cho băng DNA kích<br /> thước 686 bp đặc hiệu cho A. hydrophila (giếng<br /> 2, 3, hình 4A).<br /> Tương tự khi sử dụng cặp mồi aroAF1/aroA-R1 khuếch đại gen mục tiêu aroA,<br /> A<br /> <br /> D<br /> <br /> B<br /> <br /> M10 và M25 (giếng 3, 4, hình 4B) đều cho băng<br /> có kích thước khoảng 2,1 kb tương đương với<br /> kích thước cassette trong khi chủng hoang dã<br /> (giếng 2, hình 4B) chỉ cho băng kích thước<br /> khoảng 1,4 kb. Hơn nữa, khi sử dụng cặp mồi<br /> FKm/RKm kiểm tra sự hiện diện của gen KmR,<br /> dòng M10 và M25 đều cho kết quả dương tính<br /> (giếng 3,4, hình 4E). Điều này cho thấy có sự<br /> hiện diện của cassette trong M10 và M25.<br /> C<br /> <br /> E<br /> <br /> F<br /> <br /> Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.<br /> A: 3. M10; 4. M25; 1.Thang DNA; 2. A. hydrophila hoang dã (+); 5. Chứng (-); B: 3. M10; 4. M25; 5.Thang<br /> DNA; 2. A. hydrophila hoang dã (+); 1. Chứng (-); C: 2. M10; 3. M25; 1.Thang DNA; 4. A. hydrophila hoang<br /> dã (+); 5. Chứng (-); E: 3. M10; 4. M25; 5.Thang DNA; 2. pGP704::cassette (+); 1. Chứng (-);<br /> D: 3. M10; 4. M25; 5.Thang DNA; 2. A. hydrophila hoang dã (+); 1. Chứng (-); F: 3. M10; 4. M25; 5. Thang<br /> DNA; 2. pGP704::cassette (+); 1. Chứng (-).<br /> <br /> Đồng thời, khi sử dụng cặp mồi aroAF4/aroA-R4 khuếch đại đoạn giữa của gen<br /> aroA kích thước 683 bp, cả 2 dòng dòng M10<br /> và M25 (giếng 2, 3, hình 4C) đều cho kết quả<br /> âm tính, trong khi dòng hoang dã (giếng 4, hình<br /> 4C) cho kết quả dương tính chứng tỏ ở 2 dòng<br /> M10 và M25, đoạn gen này đã bị loại bỏ. Bên<br /> cạnh đó, khi kiểm tra với cặp mồi aroAF5/aroA-R5 phía ngoài gen aroA, dòng M10 và<br /> M25 (giếng 3, 4, hình 4D) cho băng DNA kích<br /> <br /> thước khoảng 2, 3 kb lớn hơn so với dòng<br /> hoang dã (giếng 2, hình 4D) có kích thước<br /> khoảng 1,7 kb. Điều này chứng tỏ ở vị trí của<br /> gen aroA trong genome M10 và M25, đã có đột<br /> biến knock-out đoạn DNA kích thước 683 bp<br /> và thay thế bằng gen KmR kích thước khoảng<br /> 1,3 kb.<br /> Cuối cùng, cặp mồi F-pGP704/R-pGP704<br /> đặc hiệu được sử dụng để kiểm tra sự tồn tại của<br /> plasmid pGP704, cả 2 dòng M10 và M25 (giếng<br /> 19<br /> <br />