Tạo phôi trâu Việt Nam bằng thụ tinh in vitro

27(3): 82-87 T¹p chÝ Sinh häc 9-2005<br /> <br /> <br /> <br /> t¹o ph«i tr©u ViÖt Nam b»ng thô tinh in vitro<br /> <br /> Lª V¨n Ty<br /> ViÖn C«ng nghÖ sinh häc<br /> Hoµng NghÜa S¬n<br /> ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi<br /> NguyÔn Méng Hïng<br /> Tr−êng ®¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §HQG Hµ Néi<br /> <br /> Tr©u ViÖt Nam lµ gia sóc truyÒn thèng g¾n kü thuËt cßn cã thÓ thùc hiÖn trong bÊt kú tr¹ng<br /> liÒn víi nÒn s¶n xuÊt lóa n−íc vµ lµ mét m¾t th¸i sinh lý nµo cña con vËt; ®iÒu mµ g©y rông<br /> xÝch sinh th¸i quan träng cña nÒn n«ng nghiÖp trøng nhiÒu kh«ng thùc hiÖn ®−îc ®L t¹o ra mét<br /> n−íc ta. MÆc dï cã tÇm quan träng nh−ng c«ng nguån nguyªn liÖu trøng tr©u lín, gîi l¹i hy<br /> viÖc ch¨n nu«i tr©u ë n−íc ta hiÖn nay cßn ch−a väng sö dông kü thuËt nµy kÕt hîp víi thô tinh<br /> ®−îc quan t©m. Con tr©u bÞ c¹nh tranh bëi con in vitro ®Ó t¹o mét l−îng ph«i lín tõ c¸c ®éng<br /> bß ngay c¶ ë c¸c vïng cã ®iÒu kiÖn sinh th¸i vËt cã n¨ng suÊt cao. Kü thuËt thu trøng bß,<br /> thÝch hîp nhÊt cho loµi ®éng vËt nµy, còng nh− trøng tr©u b»ng ovum-pickup (OPU) ®ang ®−îc<br /> c¶ ë n¬i tr×nh ®é ch¨n nu«i cña ng−êi d©n cßn bÞ cËp nhËt ë n−íc ta.<br /> h¹n chÕ, ®Æc biÖt ë c¸c vïng nói. ViÖc ®−a å ¹t §Ó chuÈn bÞ cho viÖc thô tinh in vitro trøng<br /> c¸c gièng ®éng vËt míi thay thÕ c¸c loµi ®éng tr©u thu ®−îc tõ con tr©u cã n¨ng suÊt cao, trong<br /> vËt ®L thÝch nghi l©u ®êi ®ang lµ c©u hái ®Æt ra khu«n khæ c«ng tr×nh nµy chóng t«i muèn ®−a<br /> cho chiÕn l−îc ph¸t triÓn bÒn v÷ng nÒn ch¨n ra mét sè kÕt qu¶ thô tinh trøng tr©u trong èng<br /> nu«i quèc gia. nghiÖm trªn nguån nguyªn liÖu lµ trøng thu<br /> Nãi riªng vÒ ®µn tr©u, theo sè liÖu th«ng kª, ®−îc tõ lß mæ, nh»m t×m hiÓu vÒ c¸c ®iÒu kiÖn<br /> hiÖn nay cã xu thÕ æn ®Þnh hoÆc gi¶m ®i. NÕu nu«i thµnh thôc trøng, thô tinh trøng, nu«i ph«i<br /> gi÷ æn ®Þnh con sè nµy th× ®Õn n¨m 2010, ®µn sau khi thô tinh, t¹o ra mét m« h×nh thö nghiÖm<br /> tr©u ViÖt Nam cã kho¶ng 3 triÖu con. Khi sè víi c¸c th«ng sè kü thuËt nh»m tiÕn tíi s¶n xuÊt<br /> l−îng kh«ng thÓ t¨ng th× râ rµng mét nhu cÇu ph«i tr©u cao s¶n.<br /> ®Æt ra lµ ph¶i t¨ng vÒ chÊt l−îng. Sù gia t¨ng vÒ<br /> chÊt l−îng, n¨ng suÊt vµ ®a d¹ng vÒ s¶n phÈm I. ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu<br /> ch¾c ch¾n lµ ®Þnh h−íng cho ch¨n nu«i tr©u<br /> trong m«i tr−êng c¹nh tranh hiÖn nay. §Ó ®¸p<br /> 1. Thu vµ nu«i thµnh thôc trøng tr©u<br /> øng nhu cÇu nµy, viÖc c¶i t¹o di truyÒn con tr©u<br /> ®ang lµ xu thÕ tÊt yÕu. ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh tõ th¸ng 3 ®Õn<br /> CÊy ph«i tr©u lÇn ®Çu tiªn thµnh c«ng vµo th¸ng 4 n¨m 2004 t¹i ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi, tp<br /> n¨m 1983 [5] t¹i Hoa Kú ®L më ra mét kh¶ Hå ChÝ Minh. Trøng tr©u ®−îc thu t¹i lß mæ<br /> n¨ng míi ®Èy nhanh tiÕn ®é di truyÒn loµi ®éng Vissan, ngay vµo lóc mæ tr©u trong mét buång<br /> vËt nµy. Tuy nhiªn ngay sau ®ã ng−êi ta thÊy v« trïng l−u ®éng cã g¾n ®Ìn cùc tÝm. Trøng<br /> r»ng kü thuËt g©y rông trøng nhiÒu ë tr©u ®−îc hót tõ c¸c nang cã kÝch th−íc tõ 2 ®Õn<br /> kh«ng ®¸p øng ®−îc viÖc ®−a c«ng nghÖ nµy 8mm nhê mét xy-lanh 10ml cã g¾n kim sè 18,<br /> vµo ¸p dông khi mçi ca g©y rông trøng chØ cã ®−îc b¶o qu¶n trong c¸c èng poliethylen 10ml<br /> thÓ t¹o ra rÊt Ýt nghÐ. Nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhê chøa 3ml dung dÞch Hepes-TCM 199,5 IU/ml<br /> cã bé dß siªu ©m cã tÇn sè cao viÖc hót trøng heparin, 5% FBS hoÆc 5% dÞch nang ®L ®−îc<br /> tõ c¸c ®éng vËt lín nh− tr©u ®−îc c¶i tiÕn, cho läc qua mµng v« trïng. PhÇn kh«ng gian cßn l¹i<br /> phÐp thu trøng hai lÇn trong mét tuÇn, ®Æc biÖt cña èng ®−îc b¬m hçn khÝ 5% CO2, 7% O2,<br /> 82<br /> 88% N 2 trén s½n tõ mét gèi khÝ. èng ®−îc lÇn trong ba lo¹i m«i tr−êng ®ång thêi lµ ba<br /> ®Ëy kÝn, gi÷ trong bé æn nhiÖt x¸ch tay ë lo¹i m«i tr−êng nu«i (b¶ng 1). C¸c trøng lo¹i<br /> nhiÖt ®é 38o C vµ ®−a vÒ phßng thÝ nghiÖm. A vµ B [12], cã líp cumulus toµn vÑn, ®−îc<br /> chän ®Ó tiÕn hµnh nu«i thµnh thôc.<br /> T¹i phßng thÝ nghiÖm, trøng ®−îc röa hai<br /> B¶ng 1<br /> C¸c m«i tr−êng ®Ó nu«i thµnh thôc trøng tr©u<br /> M«i tr−êng Thµnh phÇn<br /> M1 TCM 199, 10 % FBS, 50 µM xysteamin, 10 IU/ml eCG, 5 IU/ml hCG,<br /> 1µg/ml estradiol<br /> M2 TCM 199, 20 % dÞch nang tr©u, 50 µM xysteamin<br /> M3 TCM 199, 20 % dÞch nang tr©u, 3 µg/ml estradiol, 50 µM xysteamin<br /> <br /> <br /> DÞch nang cña buång trøng tr©u (BFF) ®−îc 2. Ho¹t ho¸ tinh trïng tr©u<br /> thu tõ c¸c nang kh«ng tho¸i ho¸ cã ®−êng kÝnh 6-<br /> 8mm; dÞch nang ®−îc läc v« trïng, ph©n thµnh Do kh«ng cã nguån tinh trïng tr©u ®«ng<br /> c¸c l−îng 1ml, b¶o qu¶n ®«ng l¹nh ë nhiÖt ®é- l¹nh, thÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh víi tinh trïng<br /> 20oC, gi¶i ®«ng vµ dïng hÕt mét lÇn. t−¬i ®−îc thu trùc tiÕp tõ mµo tinh hoµn cña c¸c<br /> 10 trøng ®−îc tuyÓn chän nh− vËy ®−îc nu«i con tr©u ®ùc tõ lß mæ. Trong thêi gian vËn<br /> thµnh thôc trong 1 giät (50 µl) dung dÞch cã chuyÓn, tinh hoµn ®−îc gi÷ trong n−íc sinh lý<br /> thµnh phÇn nªu trªn cã phñ dÇu, trong ®Üa nhùa 5 v« trïng ®Ó ®−a vÒ phßng thÝ nghiÖm vµ tiÕn<br /> cm . Trong suèt qu¸ tr×nh thao t¸c, nhiÖt ®é cña hµnh thu tinh trïng trong vßng 1 giê. Do cã sè<br /> c¸c dung dÞch ®−îc duy tr× ë 36-39oC. Trøng l−îng tinh trïng lín, tinh trïng ®−îc trùc tiÕp sö<br /> ®−îc nu«i thµnh thôc trong 18 ®Õn 20 giê trong lý swim-up trong m«i tr−êng Tyrode c¶i tiÕn<br /> ®iÒu kiÖn h¹n chÕ ¸p suÊt O2, duy tr× thµnh phÇn kh«ng chøa BSA (Sperm-TALP) 60 phót [8].<br /> khi trén 5% CO2, 7% O2, 88% N2 trong mét hép C¸c tinh trïng khoÎ ë pha dung dÞch trªn ®−îc<br /> nhùa, cã ®¸y chøa n−íc, ®−îc ®Æt trong tñ nu«i ë thu l¹i vµ ly t©m 200 g, trong 10 phót. Tinh<br /> nhiÖt ®é æn ®Þnh 39oC. Mçi thö nghiÖm ®−îc bè trïng tr©u sau khi ly t©m ®−îc pha vµo dung<br /> trÝ sao cho cã Ýt nhÊt 5 lÇn lÆp l¹i. dich Sperm-TALP (b¶ng 2).<br /> B¶ng 2<br /> M«i tr−êng thô tinh in vitro (TALP)<br /> Thµnh phÇn Nång ®é (mM) mg/100 ml mg/500 ml<br /> NaCl 100 582 2910<br /> KCl 3,10 23,0 115,0<br /> Na HCO3 25,0 209 2910<br /> Na H2PO4H2O 0,29 4,10 20,50<br /> Hepes 10,0 238 1190<br /> Na Lactat (siro 60%) 21,6 368 µl 1840 µl<br /> Phenol Red 1 l/ml 100 µl 500 µl<br /> CaCl2 2H2O 2,10 29,0 145,0<br /> MgCl2 6H2O 1,50 31,0 155,0<br /> <br /> 3. Thô tinh trøng tr©u chøa BSA hoÆc glucoza), cã bæ sung 5 IU/ml<br /> heparin (H3149, Sigma), 10 mM penixillamin<br /> ViÖc thô tinh ®−îc tiÕn hµnh trong c¸c giät (P4875, Sigma), 15 mM hypot«rin (H1384,<br /> 50µl m«i tr−êng thô tinh TALP-IVF (kh«ng Sigma) vµ 1 mM epinephrin (E4250, Sigma).<br /> 83<br /> M«i tr−êng ®−îc c©n b»ng trong pha khÝ vµ Hai d¹ng m«i tr−ång nu«i ph«i sau thô tinh<br /> nhiÖt ®é tr−íc khi chuyÓn 10 trøng ®L thµnh ®−îc thö nghiÖm lµ SOF, 5% FBS [8] vµ SOF,<br /> thôc vµo. Tinh trïng ®L ho¹t hãa ®−îc ly t©m lÇn 5% FBS kÕt hîp víi c¸c côm tÕ bµo èng dÉn<br /> thø hai, pha l¹i vµo dung dÞch TALP-IVF råi trøng cña tr©u ë giai ®o¹n ngay sau rông trøng.<br /> ®−îc ®−a vµo giät thô tinh víi thÓ tÝch sao cho N¨m trøng sau khi thô tinh IVF ®−îc chuyÓn<br /> nång ®é cña tinh trïng trong giät m«i tr−êng ®¹t vµo giät nu«i 50 µl cã c¸c thµnh phÇn nªu trªn.<br /> 2x106 /ml. Nu«i trøng víi tinh trïng trong c¸c Tr−êng hîp nu«i kÕt hîp víi côm tÕ bµo th× cho<br /> ®iÒu kiÖn gièng nh− nu«i thµnh thôc trøng: nhiÖt vµo mçi giät kho¶ng 200 côm. C¸c giät nu«i cã<br /> ®é 39o C, khÝ trén 5% CO2, 7% O2, 88% N2, ®é phñ dÇu ®−îc c©n b»ng nhiÖt ®é vµ pha khÝ<br /> Èm bLo hoµ, trong 20-22 giê. tr−íc khi chuyÓn trøng ®L thô tinh vµo.<br /> 4. T¹o côm tÕ bµo èng dÉn trøng tr©u ViÖc nu«i ph«i sau thô tinh ®−îc duy tr× ë<br /> møc Êp suÊt O2 thÊp, cã chÕ ®é khÝ vµ nhiÖt ®é<br /> èng dÉn trøng tr©u míi ®éng dôc (c¨n cø nh− khi nu«i thµnh thôc trøng. Sau 4 ngµy,<br /> vµo møc ®é ph¸t triÓn cña thÓ vµng trªn buång ph«i l¹i ®−îc chuyÓn sang m«i tr−êng míi, cã<br /> trøng cïng bªn) ®−îc thu ngay sau khi tr©u bÞ thµnh phÇn tÕ bµo t−¬ng tù, ®L ®−îc c©n b»ng<br /> giÕt mæ. C¸c èng dÉn trøng nµy ®−îc b¶o qu¶n trong khÝ trén tr−íc khi chuyÓn Ýt nhÊt mét giê.<br /> trong dÞch sinh lý cã bæ sung chÊt kh¸ng sinh vµ T×nh tr¹ng ph¸t triÓn cu¶ ph«i ®−îc ®¸nh gi¸<br /> ®−îc chuyÓn vÒ phßng thÝ nghiÖm. T¹i ®©y, èng d−íi kÝnh hiÓn vi lËp thÓ vµo lóc thay m«i<br /> dÉn trøng ®−îc lo¹i bá c¸c m« liªn kÕt m« mì tr−êng nu«i. Tû lÖ ph«i tõ hai tÕ bµo trë lªn,<br /> b¸m dÝnh, c¾t bá phÇn phÔu, nhóng nhanh vµo ph«i nang vµ ph«i d©u ®−îc tÝnh vµo thêi ®iÓm<br /> cån 900 vµ thÊm kh« trong vßng 30 gi©y. Dïng kÕt thóc nu«i ph«i vµo ngµy thø 7.<br /> xy-lanh 10ml b¬m vµo mçi èng dÉn trøng 1ml<br /> dung dÞch TCM 199. Dïng kÑp vuèt nhÑ èng<br /> theo chiÒu tõ phÝa tö cung xuèng, sao cho líp II. KÕt qu¶ nghiªn cøu<br /> niªm m¹c bªn trong t¸ch rêi vµo dung dÞch ch¶y<br /> vµo mét èng nhùa 1,5ml. Dïng xy-lanh 10ml C¶ ba m«i tr−êng nu«i thµnh thôc trøng<br /> víi kim 18 hót lªn ®Èy xuèng vµi lÇn sao cho ®Òu cho kÕt qu¶ thô tinh IVF t¹o ph«i ph¸t<br /> c¸c m¶nh niªm m¹c vì ra thµnh c¸c côm cã kÝch triÓn ®Õn giai ®o¹n cã ph«i d©u vµ ph«i nang.<br /> th−íc t−¬ng ®èi ®ång nhÊt 200-400µ. Nu«i c¸c NÕu nh− m«i tr−êng cã kÕt hîp víi FBS vµ<br /> côm tÕ bµo nµy trong m«i tr−êng TCM 199, hoãc-m«n vµ m«i tr−êng ®−îc bæ sung 20%<br /> 10% FBS trong 10-12 giê; kiÓm tra nÕu thÊy c¸c dÞch nang cho tû lÖ t¹o ph«i tõ 2 tÕ bµo trë lªn<br /> côm tÕ bµo chuyÓn ®éng m¹nh nhê c¸c vi-l«ng, vµ tû lÖ t¹o ph«i d©u ph«i nang lµ nh− nhau th×<br /> kh«ng bÞ nhiÔm th× cã thÓ dïng ®Ó nu«i kÕt hîp m«i tr−êng ®−îc bæ sung dÞch nang vµ hoãc-<br /> víi ph«i. m«n tá ra cã −u thÕ h¬n c¶ vÒ tû lÖ thô tinh vµ<br /> tû lÖ tao ph«i d©u vµ ph«i nang. Trong c¶ hai<br /> 5. Nu«i ph«i sau khi thô tinh tr−êng hîp, P ®Òu nhá h¬n 0,05 (b¶ng 3).<br /> B¶ng 3<br /> Sù ph¸t triÓn cña ph«i sau IVF<br /> Sè PD+PN/<br /> M«i tr−êng Sè ph«i > 2 tÕ bµo (%) Sè PD, PN PD+PN/TS (%)<br /> trøng P2TB (%)<br /> M1 (n=5) 500 281 (56+17,6)a 82 30,0+4,1a 16,4+3,6a<br /> M2 (n=5) 450 258 (57,3+5,57)b 69 28,4+4,6b 15,3+3,8b<br /> M3 (n=5) 450 318 (70,7+16,16)c 117 37,5+6,2c 26,0+4,4c<br /> Ghi chó: PD: ph«i d©u; PN: ph«i nang; P2TB: ph«i cã tõ 2 tÕ bµo trë lªn; TS: tæng sè trøng.<br /> c-b, P < 0,05; c-a, P < 0,05<br /> <br /> Tû lÖ t¹o ph«i d©u vµ ph«i nang ®−îc c¶i tr−êng SOF cã bæ sung tÕ bµo còng lµm cho tû<br /> thiÖn khi nu«i ph«i sau thô tinh trong m«i lÖ ph«i nang ph¸t triÓn trªn tæng sè ph«i d©u vµ<br /> tr−êng SOF cã bæ sung c¸c côm tÕ bµo. M«i ph«i nang sau 7 ngµy nu«i cao h¬n cã ý nghÜa<br /> 84<br /> so víi m«i tr−êng SOF kh«ng bæ sung tÕ bµo ®−îc nu«i thµnh thôc trong m«i tr−êng M2 ®−îc<br /> (C¸c trøng tham gia vµo thÝ nghiÖm nµy ®Òu thô tinh trong c¸c ®iÒu kiÖn nh− nhau) (b¶ng 4).<br /> B¶ng 4<br /> So s¸nh hai m«i tr−êng nu«i ph«i sau thô tinh<br /> Th«ng sè SOF SOF+tÕ bµo<br /> Sè trøng ®−a vµo nu«i 450 450<br /> Sè ph«i > 2 tÕ bµo (%) 258 (57,3+5,8) 263 (58,4+8,8)<br /> Sè ph«i d©u, ph«i nang (%) 69 (28,4+4,6) 109 (43,5+7,2)<br /> Sè ph«i nang (%) 32 (44,4+2,9)a 71 (66,2+15,9)b<br /> Ghi chó: b-a, P < 0,05<br /> III. Th¶o luËn ®ång kÝch thÝch cïng víi c¸c gonadotropin lªn<br /> trøng cña kh«ng riªng tr©u mµ c¶ c¸c loµi thó<br /> HiÖn t−îng sèc nhiÖt ®ùîc h¹n chÕ tèi ®a kh¸c [7]. Thªm vµo ®ã, mARN phiªn mL cho<br /> nhê viÖc hót trøng ngay sau khi buång trøng thô quan IGF-1 cã biÓu hiÖn trªn tÕ bµo cumulus,<br /> ®−îc c¾t rêi khái c¬ thÓ cña con vËt; trøng ®−îc tÕ bµo nang tæ hîp trøng tr©u, trong khi IGF-1<br /> chuyÓn ngay vµo m«i tr−êng nu«i vµ cho vµo vµ b¶n th©n insulin lµm t¨ng sù thµnh thôc, t¨ng<br /> b×nh æn nhiÖt x¸ch tay (38oC). thô tinh vµ t¨ng tû lÖ ph¸t triÓn thµnh ph«i nang<br /> [11]. C¸c yÕu tè cã trong dÞch nang nh− vËy,<br /> Nh÷ng tæn th−¬ng c¬ häc còng ®−îc h¹n chÕ d−íi t¸c dông cña FSH lµm gia t¨ng nguyªn<br /> vµ lo¹i trõ bëi tr−íc khi chuyÓn vµo giät nu«i ph©n, t¨ng tæng hîp protein vµ steroit. ViÖc thö<br /> thµnh thôc, chØ nh÷ng tæ hîp trøng nµo cã líp tÕ nghiÖm nu«i thµnh thôc trøng tr©u víi tõng yÕu<br /> bµo cumulus nguyªn vÑn míi ®−îc chän cho tè cña dÞch nang còng cho c¸c kÕt qu¶ d−¬ng<br /> môc ®Ých thÝ nghiÖm. Tuy nhiªn, viÖc ®¸nh gi¸ tÝnh: EGF lµm gia t¨ng ®é t¬i phång cña líp<br /> sù ®ång nhÊt cña chÊt nguyªn sinh cña tÕ bµo cumulus, gia t¨ng ®é thµnh thôc cña nh©n vµ tû<br /> trøng ë giai ®o¹n nµy lµ kh«ng kh¶ dÜ. §Ó h¹n lÖ thô tinh [3]. Cßn thªm IGF-2 lµm t¨ng tû lÖ<br /> chÕ c¸c trøng kÐm chÊt l−îng, trøng chØ ®−îc t¹o ph«i còng nh− tû lÖ ph«i ®¹t giai ®o¹n ph¸t<br /> thu tõ c¸c nang 2-8mm cã dÞch nang kh«ng bÞ triÓn ph«i nang [4]. Ngay tõ b−íc thµnh thôc<br /> ®ôc. trøng, t¹o ra mét trøng thµnh thôc toµn vÑn cã<br /> ViÖc nu«i thµnh thôc trøng tr©u trong m«i hoµn chØnh c¸c thµnh phÇn, kh«ng nh÷ng chØ<br /> tr−êng cã bæ sung dÞch nang [2] dL ®−îc tiÕn ®¶m b¶o cho qu¸ tr×nh thô tinh, qu¸ tr×nh ph¸t<br /> hµnh trong nhiÒu c«ng tr×nh IVF tr©u. DÞch nang triÓn cña ph«i ®Õn giai ®o¹n ph«i nang mµ cho<br /> mét mÆt cã thÓ thay thÕ huyÕt thanh, mÆt kh¸c toµn bé qu¸ tr×nh ph¸t triÓn hoµn thiÖn cña mét<br /> kh«ng nhÊt thiÕt ph¶i bæ sung hooc-m«n. DÞch c¸ thÓ ®éng vËt. ViÖc sö dông dÞch nang cho qu¸<br /> nang nh− vËy cã thÓ thu dÔ dµng tõ nh÷ng nang tr×nh thµnh thôc trøng lµ kÐo qu¸ tr×nh t¹o ph«i<br /> kh«ng tho¸i ho¸ cã kÝch th−íc tõ 8mm trë lªn, in vitro gÇn víi qu¸ tr×nh t¹o ph«i in vivo.<br /> ®−îc sö dông hiÖu qu¶ cho IVF thay v× ph¶i lo¹i ViÖc nu«i thµnh thôc trøng tr©u trong m«i<br /> bá trong qu¸ tr×nh thu trøng. DÞch nang cña tr−êng cã bæ sung 20% dÞch nang cho kÕt qu¶<br /> buång trøng tr©u chøa s½n ®a d¹ng c¸c hoãc- thô tinh vµ kÕt qu¶ ph«i ph¸t triÓn ®Õn giai ®o¹n<br /> m«n nh− FSH, LH, estradiol, progiesteron [9], ph«i nang vµ ph«i d©u t−¬ng tù nh− tr−êng hîp<br /> c¸c yÕu tè ph¸t triÓn chuyÓn ho¸ vµ c¸c protein dïng FBS cã bæ sung eCG, hCG vµ estradiol;<br /> øc chÕ [10]. Mét sè yÕu tè ph¸t triÓn nh− IGF-2, trong khi ®ã, m«i tr−êng cã bæ sung dÞch nang<br /> EGF vµ TGF-α còng t×m thÊy trong dÞch nang ë 20% kÕt hîp víi hooc-m«n cã møc estradiol cao<br /> mét sè loµi ®éng vËt cã vó kh¸c [1]. Sù h÷u Ých (3 µg/ml) kh«ng nh÷ng lµm gia t¨ng tû lÖ thô<br /> cña dÞch nang tr©u cã thÓ xuÊt ph¸t tõ c¸c yÕu tè tinh mµ cßn lµm t¨ng tû lÖ t¹o ph«i d©u vµ ph«i<br /> kÝch thÝch nµy. Thùc tÕ cho thÊy c¸c yÕu tè ph¸t nang. §iÒu nµy kh«ng lo¹i trõ kh¶ n¨ng lµ t¸c<br /> triÓn t¸ch ra tõ nang trøng trî gióp qu¸ tr×nh dông trùc tiÕp cña c¸c hooc-m«n nµy lªn sù<br /> thµnh thôc cña trøng, thô tinh vµ ph¸t triÓn cña thµnh thôc cña trøng, lµm cho trøng cã kh¶ n¨ng<br /> ph«i sau thô tinh; c¸c yÕu tè nµy ho¹t ®éng nh− ph¸t triÓn ë c¸c giai ®o¹n tiÕp theo. ChÊt<br /> 83<br /> 85<br /> estradiol t−¬ng ®èi nhËy c¶m ®èi víi buång phßng thÝ nghiÖm. C¸c tÕ bµo khai th¸c tõ c¸c<br /> trøng cña tr©u nãi chung vµ ®èi víi qu¸ tr×nh èng dÉn trøng nh− vËy cã thÓ b¶o qu¶n ®«ng<br /> nu«i thµnh thôc trøng tr©u nãi riªng. Khi kÕt hîp l¹nh còng nh− t¸i sö dông.<br /> víi FSH hoÆc PMSG, Uoc et al. 1992 [13] cho Trong thÝ nghiÖm, tû lÖ t¹o ph«i nang trong<br /> thÊy estradiol lµm gia t¨ng sè trøng rông ë tr©u m«i tr−êng cã bæ sung tÕ bµo cao h¬n cã ý<br /> cã vµ kh«ng cã chu kú. Trong ®iÒu kiÖn in vitro, nghÜa (P < 0,05) so víi tr−êng hîp nu«i trong<br /> estradiol lµm gia t¨ng ®é thµnh thôc cña trøng, m«i tr−êng SOF th«ng th−êng, trong khi tæng sè<br /> gia t¨ng tû lÖ h×nh thµnh cùc cÇu [12]. ph«i nang vµ ph«i d©u còng ®−îc c¶i thiÖn (P <<br /> ThÝ nghiÖm t¹o ph«i tr©u b»ng IVF nµy cña 0,05) nÕu nu«i ph«i sau thô tinh trong m«i<br /> chóng t«i mét mÆt kh¼ng ®Þnh c¸c ®iÒu kiÖn cña tr−êng nµy.<br /> phßng thÝ nghiÖm lµ t−¬ng thÝch ®Ó t¹o ph«i<br /> th«ng qua viÖc sö dông quy tr×nh t¹o ph«i th«ng IV. KÕt luËn<br /> th−êng víi viÖc nu«i thµnh thôc trøng tr©u trong<br /> Nh×n chung l¹i, víi viÖc sö dông m«i tr−êng<br /> TCM 199 cã bæ sung 10% FBS vµ c¸c hoãc-<br /> nu«i thµnh thôc trøng tr©u th«ng th−êng vµ m«i<br /> m«n víi kÕt qu¶ lµ 16% ph«i nang ph«i d©u trªn<br /> tr−êng c¶i tiÕn víi 20% dÞch nang cña buång<br /> tæng sè trøng nu«i vµ 30% trªn sè trøng thô tinh.<br /> trøng tr©u còng nh− thö nghiÖm nu«i ph«i sau<br /> ThÝ nghiÖm còng cho thÊy −u thÕ cña viÖc sö<br /> khi thô tinh trong m«i tr−êng SOF vµ SOF kÕt<br /> dông dÞch nang cña buång trøng tr©u lµ rÊt râ<br /> hîp víi tÕ bµo èng dÉn trøng, c«ng tr×nh t¹o<br /> rµng. Cã mét nguån dÞch nang thuËn tiÖn ®Ó<br /> ph«i b»ng thô tinh trong èng nghiÖm cña chóng<br /> nu«i thµnh thôc trøng tr©u, tuy nhiªn ®Ó cã hiÖu<br /> t«i ®L cã c¸c th«ng sè: tû lÖ t¹o ph«i ®¹t 28.4<br /> qu¶ tèt h¬n, viÖc bæ sung c¸c chÊt kÝch thÝch<br /> ®Õn 43,5 % ph«i d©u vµ ph«i nang. ViÖc dïng<br /> nh»m ph¸t huy c¸c yÕu tè cã Ých vµ k×m hLm<br /> m«i tr−êng SOF cã bæ sung c¸c côm tÕ bµo èng<br /> c¸c yÕu tè øc chÕ ch¾c ch¾n lµ môc ®Ých nghiªn<br /> dÉn trøng cho phÐp tû lÖ ph«i nang c¨ng në cã<br /> cøu trong giai ®o¹n tíi.<br /> thÓ ®¹t tíi 66,2 % tæng sè ph«i d©u vµ ph«i nang.<br /> ViÖc nu«i ph«i tr©u sau thô tinh cho ®Õn nay ViÖc n©ng cao tû lÖ thµnh thôc cña trøng vµ tû lÖ<br /> vÉn cßn lµ ®èi t−îng cña c¸c c«ng tr×nh nghiªn t¹o ph«i nang nh− vËy vÉn cßn lµ nh÷ng th¸ch<br /> cøu. ChÝnh giai ®o¹n nµy quyÕt ®Þnh chÊt l−îng thøc nh»m ®−a viÖc s¶n xuÊt ph«i tr©u in vitro<br /> ph¸t triÓn cña ph«i ë c¸c giai ®o¹n tiÕp theo. ¸p dông vµo thùc tÕ.<br /> HiÖn t−îng thai to quan s¸t thÊy trong viÖc t¹o<br /> ph«i IVF ë bß [6] ®Æt c©u hái vÒ vÊn ®Ò dinh Tµi liÖu tham kh¶o<br /> d−ìng cña ph«i, vÒ viÖc bæ sung huyÕt thanh vµ<br /> c¸c axit amin ë giai ®o¹n nµy. In vivo, c¸c hîp 1. Ackland J. F. et al., 1992: Physio. Rev.,<br /> tö h×nh thµnh trong èng dÉn trøng vµ chØ chuyÓn 72: 731-787.<br /> vµo tö cung tõ ngµy thø 5, khi ph«i ®¹t giai ®o¹n 2. Chauhan M. S. et al., 1997: Theriogenology,<br /> ph¸t triÓn thµnh ph«i d©u vµ ph«i nang. Trong 48: 461-469.<br /> c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ®Çu tiªn, c¸c t¸c gi¶<br /> ®L sö dông èng dÉn trøng ®éng vËt ®Ó nu«i ph«i 3. Chauhan M. S. et al., 1999: Vet. Rec.,<br /> sau thô tinh. C¸c ph«i nang hoµn chØnh trong 144: 266-267.<br /> èng dÉn trøng cã kh¶ n¨ng chÞu ®−îc qu¸ tr×nh 4. Chauhan M. S. et al., 1998: Vet. Rec.,<br /> b¶o qu¶n ®«ng l¹nh vµ gi¶i ®«ng, cho tû lÖ cÊy 142: 727-728.<br /> ph«i cao vµ lÇn ®Çu tiªn ®L cho ra nghÐ lµ ph«i 5. Drost M., 1983: II Symposium on<br /> ®−îc nu«i trong èng dÉn trøng cña cõu sau thô advanced Tops in Animal Reproduction:<br /> tinh [6]. Tuy quy tr×nh nµy lµm gia t¨ng chÊt 167-179.<br /> l−îng cña ph«i nh−ng rÊt khã kh¨n khi ¸p dông<br /> cho s¶n xuÊt ph«i víi sè l−îng lín. ViÖc kÕt hîp 6. Galli C. et al., 2001: Theriogenology, 55:<br /> m«i tr−êng SOF víi côm tÕ bµo èng dÉn trøng 1341-1357.<br /> tr©u ë giai ®o¹n tr©u võa rông trøng (suy ®o¸n tõ 7. Gasparrini B., 2002: Theriogenology, 57:<br /> tr¹ng th¸i cña thÓ vµng) lµ gi¶i ph¸p võa kÕt hîp 237-258.<br /> ®−îc yÕu tè tÕ bµo võa kÕt hîp ®−îc yÕu tè m«i<br /> 8. Holm P. et al., 1999: Theriogenology, 52:<br /> tr−êng, l¹i hoµn toµn cã thÓ thùc hiÖn trong<br /> 683-700.<br /> 82<br /> 86<br /> 9. Palta P. et al., 1996: Ind. J. Exp. Biol., 36: Dev., 49: 277-285.<br /> 768-774. 12. Ty L. V. et al., 2001: Theriogenology, 55:<br /> 10. Palta P. et al., 1996: Ind. J. Exp. Biol., 406 abst<br /> 34: 606-608.<br /> 13. Uoc N. T. et al., 1992: Theriogenology, 38:<br /> 11. Pawshe C. H. et al., 1998: Mol. Reprod. 471-478.<br /> <br /> production by in vitro fertilization of VietNam swamp<br /> buffalo embryos.<br /> Le Van Ty, Hoang nghia son, nguyen mong hung<br /> <br /> Summary<br /> <br /> This study was undertaken in order to test the ability of replacement of the foetal bovine serum (FBS)<br /> supplemented with hormones by the buffalo follicular fluid (BFF) in the oocyte maturation medium and the<br /> effect of co-culture with oviduct cells on the subsequent embryo development in Vietnam swamp buffalo.<br /> 1400 cumulus enclosed oocytes (COC) were collected from the buffalo ovaries in slaughter-house in the<br /> way with minimize temperatural choc. COCs were randomtly cultured in three maturation medium varieties:<br /> TCM 199 supplemented with 10% FBS, 10 IU/ml eCG, 5 IU/ml hCG, 1 µg/ml estradiol (M1); TCM 199 with<br /> 20% buffalo follicular fluid (BFF) without hormones (M2) or TCM 199 with 20% BFF and the same level of<br /> eCG, hCG as M1 but 3 µg/ml estradiol (M3).<br /> The effect of oviduct cells was evaluated by the embryo co-culture in two medium varieties: synthetic<br /> oviduct fluid (SOF) and SOF with oviduct cells after the maturation in the medium M2 and IVF.<br /> No significal differences were observed in the maturation and the formation of morulas and blastocyts by<br /> using the routine maturation medium (M1) and TCM 199 supplemented with 20% BFF but the rate of<br /> formation of two-cell and more-cell embryos and the rate of total morula and blastocyts were clearly improved<br /> in the case of combined BFF and hormones (M3) (26.5% vs 16.3%, P < 0.05). The co-culture with oviduct<br /> cells not only improved the percentage of total embryos developed into morula blastocyt stage but also<br /> increased the rate of blastocyt formation in comparision with the medium without cells (66.2% vs 44.4%, P <<br /> 0.05).<br /> This first try of in vitro embryo production in the swamp buffalo indicated the comparable rate<br /> (approximately 20%) of blastocyts can be obtained from total using oocytes.<br /> <br /> Ngµy nhËn bµi 5- 6-2004<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 83<br /> 87<br />