Thiết lập quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao góp phần sàng lọc phát hiện sớm

Chia sẻ: ViJenchae ViJenchae | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của những bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9%. Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng là những người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98%.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thiết lập quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao góp phần sàng lọc phát hiện sớm

ĐẦU VÀ CỔ THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DNA EBV TRONG MÁU NGOẠI VI VỚI ĐỘ NHẠY CAO GÓP PHẦN SÀNG LỌC PHÁT HIỆN SỚM HỒ HỮU THỌ1, TRIỆU THỊ NGUYỆT1, ĐỖ TRÂM ANH2, NGUYỄN ĐÌNH ỨNG, ĐINH THỊ THU HẰNG3, BÙI TIẾN SỸ4, HOÀNG ĐÀO CHINH5, LÊ MINH KỲ6, VŨ TRƯỜNG PHONG, NGÔ THANH TÙNG7, NGUYỄN KIM LƯU8, NGUYỄN VĂN BA, HỒ ANH SƠN3, HOÀNG VĂN LƯƠNG3, NGHIÊM ĐỨC THUẬN2 TÓM TẮT Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của những bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9%. Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng là những người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98%. Quy trình kỹ thuật định lượng cf-DNA EBV đã được kiểm định với bộ mẫu chuẩn quốc tế được cung cấp bởi Đại học Hồng Kông. Quy trình được thiết lập trong nghiên cứu góp phần sàng lọc phát hiện sớm bệnh ung thư vòm mũi họng. SUMMARY Development of ultrasensitive q-pcr assay based on circulating EBV DNA for early detection of nasopharyngeal carcinoma In our study, we have establihed successfully an ultrasensitive qPCR assay for detection cf-EBV DNA. Evaluation on clinical samples has proven a remarkably high sensitivity of 96.9% and high specificity of 98%. Moreover, we have also validated the performance of the optimal qPCR assay using the international standard panel that was provided by Chinese University of Hong Kong. ĐẶT VẤN ĐỀ xác định trong hầu hết các tế bào của khối UTVMH. Triển vọng to lớn của DNA-EBV lưu hành trong máu Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là loại ung thư ngoại vi đối với sàng lọc phát hiện sớm, tiên lượng rất phổ biến ở một số nước Châu Á, trong đó có Việt và đánh giá mức độ đáp ứng điều trị UTVMH đã Nam[1,2]. Bệnh nhân UTVMH thường được chẩn được khẳng định qua hàng loạt các nghiên cứu trên đoán ở giai đoạn muộn, đồng thời các triệu chứng thế giới trong hơn 15 năm qua. Tuy nhiên, hiện vẫn của bệnh thường không đặc hiệu và khó phân biệt chưa có xét nghiệm DNA-EBV chuẩn hóa nào được với các bệnh lý khác ở vùng lân cận. Bên cạnh đó, sử dụng trên lâm sàng. Tại Việt Nam, quy trình định UTVMH thường có di căn hạch sớm [3]. Hậu quả là lượng DNA-EBV hiện nay có độ nhạy còn thấp với nhiều bệnh nhân UTVMH được chẩn đoán ở giai ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml huyết tương, nên đoạn tiến triển kèm theo di căn, điều trị khó khăn mà chỉ phát hiện được DNA-EBV trong máu ngoại vi ở hiệu quả không cao. 64%-68% số bệnh nhân UTVMH[4-6]. Thực tế này đặt UTVMH liên quan mật thiết với nhiễm virus ra yêu cầu cần thiết lập quy trình phát hiện định Epstein Barr (EBV), hệ gen của virus này đã được lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao 1 Labo Nghiên cứu Gen, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y 2 Khoa Tai-Mũi-Họng - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y 3 Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y 4 Khoa Sinh học Phân tử - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 5 Khoa Xạ phẫu và Xạ trị - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 6 Trung tâm Ung Bướu và phẫu thuật Đầu cổ - Viện Tai-Mũi-Họng Trung Ương 7 Khoa Ung thư Đầu cổ và xạ trị - Bệnh viện K 8 Trung tâm Ung Bướu và Y học Hạt nhân - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y 74 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM
ĐẦU VÀ CỔ ở nước ta, góp phần sàng lọc phát hiện các trường Phản ứng PCR được tiến hành trên hệ thống hợp mắc ung thư vòm mũi họng ở giai đoạn sớm. máy Rotor-Gene Q với thể tích phản ứng là 20µl và 8,6µl dịch chiết DNA được sử dụng làm khuôn. Dữ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU liệu realtime PCR được thu thập bởi hệ thống Rotor- Vật liệu nghiên cứu Gene Q và lưu trong máy tính sau đó sẽ được phân tích bằng phần mềm Rotor-Gene Q. Mỗi mẫu được Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Mẫu máu ngoại vi chạy 02 lần lặp lại, mỗi lần chạy luôn kèm theo các được chống đông bằng EDTA của 32 bệnh nhân chứng âm không chứa khuôn DNA. Đường chuẩn được chẩn đoán xác định UTVMH dựa vào kết quả được thiết lập sử dụng mẫu chuẩn DNA quốc tế của giải phẫu bệnh của sinh thiết vòm mũi họng (nhóm Đại học Hồng Kông với dãy nồng độ xác định. Giá trị bệnh). Mẫu máu ngoại vi được chống đông bằng trung bình kết quả định lượng của 02 lần lặp lại EDTA của 105 người khỏe mạnh (nhóm chứng). được sử dụng để tính toán nồng độ. Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA từ Phương pháp xử lý số liệu huyết tương bao gồm bộ Kit tách chiết Anapure DNA/RNA Viral Mini Kit, Isopropanol, Ethanol 100%. Nồng độ của DNA-EBV huyết tương được tính Hóa chất dùng trong phản ứng Realtime PCR như: theo đơn vị số copy/ml huyết tương. Quantitect Probe master mix, Quantitect SYBR KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN master mix, Primer, Probe, DMSO. Kết quả tối ưu quy trình realtime PCR phát hiện Panel mẫu chuẩn định lượng DNA của EBV với DNA-EBV. giải nồng độ xác định và mẫu huyết tương chuẩn dương tính với DNA-EBV của Đại học Hồng Kông, Tiến hành thiết kế các bộ primer/probe như mô được GS. Allen Chan chuyển cho nhóm nghiên cứu. tả trong phần phương pháp nghiên cứu, bộ primer/probe (III) được tiếp tục sử dụng để tối ưu Máy Roto-Gene Q, Tủ hút thao tác di truyền, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt. máy li tâm, khối ổn nhiệt có lắc, máy vortex, NanoDrop. Tối ưu nồng độ mồi Phương pháp nghiên cứu Thu thập và bảo quản mẫu Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5ml/lần được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA. Trong vòng 6h sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến labo, tách huyết tương. Tách chiết DNA từ huyết tương DNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit Anapure DNA/RNA Viral Mini Kit với quy trình được cải tiến góp phần làm tăng độ nhạy phát hiện DNA- EBV trong máu ngoại vi. Hình 1. Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng qPCR Thiết kế trình tự primer/probe cho phản ứng realtime PCR Các phản ứng realtime PCR (0.1Q), (0.2Q), (0.3Q), Trình tự mồi và probe được thiết kế và đánh giá (0.4Q), (0.5Q) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng bằng phần mềm Oligo Primer Analysis Software. độ primer lần lượt là 0,1µM, 0,2µM, 0,3µM, 0,4µM và Thiết kế 3 bộ primer/probe cho phản ứng Realtime 0,5µM. Phản ứng (am Q) là chứng âm không có PCR định lượng DNA-EBV nhắm vào các vùng DNA Khuôn DNA và nồng độ primer 0,2µM. khác nhau trên bộ gen của EBV: EBNA1, LMP1 và BamH1-W. Các bộ primer/probe được đánh giá sơ Tối ưu nồng độ Probe bộ sử dụng chứng dương DNA được tách chiết từ mẫu huyết tương chuẩn của Đại học Hồng Kông. Bộ primer/probe có tín hiệu khuếch đại sớm và độ đặc hiệu cao nhất được lựa chọn để tiếp tục tối ưu thành phần phản ứng và chu trình nhiệt. Realtime PCR định lượng TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 75
ĐẦU VÀ CỔ Hình 2. Tối ưu nồng độ probe cho phản ứng Realtime PCR Hình 3. Tối ưu nồng độ DMSO cho phản ứng Realtime PCR Các phản ứng realtime PCR (35 0.2-1+), (35 0.1-1), (35 0.05-1) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng độ Các phản ứng realtime PCR (10%-Q), (7.5%-Q), probe lần lượt là 0,2µM, 0,1µM, 0,05µM. Phản ứng (5%-Q), (2.5%-Q) có cùng lượng Khuôn DNA và (35 0.2-1-) là chứng âm không có Khuôn DNA và nồng độ DMSO lần lượt là 10%, 7,5%, 5% và 2,5%. nồng độ probe là 0,2µM. Phản ứng (SS-Q) là chứng dương không bổ sung DMSO. Tối ưu nồng độ DMSO Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR TT Các bước Nhiệt độ Thời gian Đơn vị 1 Biến tính ban đầu 95 15 Phút 2 Khuếch đại Biến tính 94 15 Giây Số chu kỳ: Gắn mồi 63 30 Giây 45 Kéo dài 72 30 Giây 3 Lưu mẫu 25 ∞ Nồng độ các thành phần phản ứng Realtime PCR đã tối ưu: STT Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ phản ứng Đơn vị Thể tích phản ứng (µl) 1 Quantitect Probe master mix 5 1 X 10 2 Primer III/F 10 0,2 µM 0,4 3 Primer III/R 10 0,2 µM 0,4 4 Probe III 10 0,05 µM 0,1 5 DMSO 100 2,5 % 0,5 6 Khuôn DNA 8,6 Tổng 20 Kết quả đánh giá quy trình trên bộ panel mẫu chuẩn quốc tế. 76 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM
ĐẦU VÀ CỔ Đồng thời, khả năng định lượng của quy trình realtime PCR tối ưu cũng được đánh giá trên panel bộ mẫu chuẩn quốc tế và thu được đường chuẩn với hệ số tương quan tuyến tính là R2=0.99613 (Hình 5). Như vậy, quy trình realtime PCR tối ưu có tương quan tuyến tính rất tốt và có khả năng định lượng DNA-EBV với độ tin cậy cao. Hình 4. Độ nhạy của quy trình trên bộ panel mẫu chuẩn quốc tế Toàn bộ số mẫu (9/9) trong bộ panel mẫu chuẩn quốc tế với đều cho tín hiệu khuếch đại, mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất là 25copy/ml. Chứng âm không có khuôn DNA không cho tín hiệu khuếch đại. Hình 5. Đường chuẩn của quy trình tối ưu trên bộ Kết quả thí nghiệm trên cho thấy, quy trình panel mẫu chuẩn quốc tế realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm không cho tín hiệu khuếch đại) và có khả năng phát Tương quan tuyến tính giữa giá trị Ct với log của hiện được mẫu DNA của EBV có nồng độ thấp nhất nồng độ DNA-EBV có trong các mẫu khác nhau của trong bộ panel mẫu chuẩn quốc tế. Kết quả thí bộ panel mẫu chuẩn quốc tế từ 25 - 150.000copy/ml. nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát hiện của quy trình realtime PCR tối ưu là 25 copy/ml huyết tương, tốt hơn rất nhiều so với các nghiên cứu khác trong nước đã công bố cho đến nay với ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml[4-6]. Đánh giá hiệu quả của quy trình tối ưu trên các mẫu lâm sàng, góp phần sàng lọc phát hiện sớm UTVMH Hình 5. Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm định lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Kết quả xác định được DNA-EBV trong máu DNA-EBV trong các mẫu dương tính ở nhóm bệnh ngoại vi của 96,9% số bệnh nhân UTVMH (31/32), nhân UTVMH dao động trong khoảng từ 53copy/ml- do đó độ nhạy của xét nghiệm là 96,9%. Nồng độ 3,8x105copy/ml. TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 77
ĐẦU VÀ CỔ Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết quả DNA- 3. Stacey EM, F.R., "The nose, paranasal sinuses, EBV dương tính ở 2/105 trường hợp, tương ứng với and nasopharynx”, in: Sternberg SS, editor, độ đặc hiệu là 98% (103/105). Với 2 trường hợp Diagnostic Surgical Pathology, vol1, 3nd edition. nhóm chứng khoẻ mạnh dương tính với DNA-EBV, Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, 1999. nồng độ DNA-EBV xác định đều dưới 40copies/ml 1: p. 885-917. và xét nghiệm lại sau 2 tuần đều cho kết quả âm 4. Phạm Huy Tần, T.H.T., Trần Thị Thuý Hằng, tính, giúp phân biệt với những trường hợp dương Nguyễn Đình Phúc, Trần Vân Khánh, Nồng độ tính thật. EBV-DNA huyết tương của bệnh nhân ung thư Như vậy, quy trình định lượng nồng độ DNA- vòm mũi họng và mối tương quan với chẩn đoán EBV trong máu ngoại vi đã được thiết lập và đánh giai đoạn TNM (Tumor Nodes Metastasis). Tạp giá trên panel mẫu chuẩn quốc tế của Đại học Hồng chí nghiên cứu Y học, 2015. 95(3): p. 24-31. Kông với ngưỡng phát hiện là 25copy/ml. Đồng thời, 5. Tú, Đ.V., Đánh giá nồng độ EBV-DNA trong đánh giá trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu được độ huyết tương bệnh nhân ung thư vòm mũi họng nhạy 97% và độ đặc hiệu 98%. Kết quả đạt được giai đoạn II-III trước và sau điều trị. Luận văn tốt tương đương với các công bố trên thế giới[7,8,9]. nghiệp bác sỹ nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội, KẾT LUẬN 2012. Quy trình realtime PCR định lượng DNA EBV 6. Nguyễn Tuyết Mai, Đ.V.T., Mối tương quan giữa với độ nhạy cao (25copy/ml) đã được thiết lập thành nồng độ EBV-DNA huyết tương với kết quả điều công trong nghiên cứu này và quy trình đã được trị trong ung thư vòm họng giai đoạn II, III tại đánh giá chất lượng trên bộ mẫu chuẩn quốc tế bệnh viện K. Y học Việt Nam, 2012. 1: p. 43-46. đảm bảo độ tin cậy cao. 7. Lo, Y.M., et al., Quantitative analysis of cell-free Hiệu quả sàng lọc chẩn đoán sớm UTVMH trên Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients nhóm đối tượng nghiên cứu của quy trình tối ưu định with nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res, lượng DNA EBV tự do lưu hành trong máu ngoại vi 1999. 59(6): p. 1188-91. đạt được độ nhạy là 96,9% và và độ đặc hiệu 98%. 8. Shao, J.Y., et al., Comparison of plasma TÀI LIỆU THAM KHẢO Epstein-Barr virus (EBV) DNA levels and serum EBV immunoglobulin A/virus capsid antigen 1. Yu, W.M. and S.S. Hussain, Incidence of antibody titers in patients with nasopharyngeal nasopharyngeal carcinoma in Chinese carcinoma. Cancer, 2004. 100(6): p. 1162-70. immigrants, compared with Chinese in China and South East Asia: review. J Laryngol Otol, 9. Kondo, S., et al., Diagnostic value of serum 2009. 123 (10): p. 1067-74. EBV-DNA quantification and antibody to viral capsid antigen in nasopharyngeal carcinoma 2. Vokes, E.E., D.N. Liebowitz, and R.R. patients. Cancer Sci, 2004. 95(6): p. 508-13. Weichselbaum, Nasopharyngeal carcinoma. Lancet, 1997. 350(9084): p. 1087-91. 78 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM