Thiết lập chất chuẩn berberin chloride

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN BERBERIN CHLORIDE<br /> Huỳnh Thị Ngọc Ngân*, Trương Vũ Hoài Thu*, Nguyễn Minh Đức**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Berberin clorid là alkaloid quan trọng có trong nhiều loài dược liệu khác nhau. Đề tài này nhằm<br /> thiết lập chất chuẩn berberin chloride đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference standard) theo hướng dẫn<br /> trong các ISO Guide.<br /> Phương pháp: Chất điều chế được định tính bằng TLC, IR, HR-MS và định lượng bằng HPLC. Sau đó<br /> đóng gói và đánh giá đồng nhất lô, đánh giá liên phòng thí nghiệm. Xử lý kết quả theo Anova và ISO Guides.<br /> Kết quả: chất chuẩn berberin chlorid thiết lập được có hàm lượng 93,73%, theo nguyên trạng.<br /> Kết luận: Đã thiết lập chất chuẩn berberin cloride theo ISO Guides. Chất chuẩn này có thể dùng trong<br /> nghiên cứu hay kiểm nghiệm dược liệu chứa berberin chlorid.<br /> Từ khóa: berberin chlorid, ISO Guide 35, ISO 13528, đồng nhất lô, đánh giá liên phòng thí nghiệm, giá trị<br /> ấn định, z-core<br /> ABSTRACT<br /> PREPARE BERBERIN CHLORIDE AS REFERENCE STANDARD<br /> Huynh Thi Ngoc Ngan, Truong Vu Hoai Thu, Nguyen Minh Duc<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 361-365<br /> Objective: Berberin chloride is a major alkaloid in plants. In this paper we report the establishment of<br /> berberin chloride as reference standards following validation requirements of ISO Guides.<br /> Method: The substance was identified by TLC, IR, HR-MS and assayed by HPLC. The interlaboratory<br /> validation was performed after the substance was packaged to 10 mg/vial and tested for batch homogeneity. The<br /> results was evaluated by Anova and ISO Guides.<br /> Results: Berberin chloride was prepared as a reference standard with 93.73% purity as basis.<br /> Conclusion: Berberin cloride reference standard was well prepared according to ISO Guides. This reference<br /> standard can be used for reseach purpose or to control the quality of medical plant that contain berberin chlorid.<br /> Keywords: berberin chlorid, ISO Guide 35, ISO 13528, batch homogeneity, interlaboratory validation,<br /> assigned value, z-core<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference<br /> Berberin clorid là alkaloid quan trọng có standard) theo hướng dẫn trong các ISO Guide.<br /> trong nhiều loài dược liệu khác nhau như vàng ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU<br /> đắng, hoàng liên, hoàng bá…và các chế phẩm Đối tượng nghiên cứu<br /> như Berberal, Strep-Berin. Vì vậy, hợp chất này Berberin clorid (10,93 g) được Ban nghiên<br /> được sử dụng như chất chuẩn để kiểm định các cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y<br /> dược liệu và thành phẩm trên thị trường. Đề tài Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.<br /> này nhằm thiết lập chất chuẩn berberin chloride<br /> Chất chuẩn đối chiếu: Chuẩn của Viện<br /> <br /> *Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, Thành phố Hồ Chí Minh.<br /> **Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> <br /> Tác giả liên lạc: ThS.DS. Huỳnh Thị Ngọc Ngân ĐT: 0988 334 618 Email: nganhtn@pnt.edu.vn<br /> Tác giả liên liên lạc: BS CK2. Nguyễn Phú Hữu ĐT: 0918650345 Email: bsphuhuu2012@gmail.com<br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 361<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh, số lô lệch chuẩn tương đối của diện tích pic berberin<br /> QT122 030910, hàm lượng 90,62% tính theo không được lớn hơn 1,5%.<br /> nguyên trạng. Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô trong quá<br /> Phương pháp nghiên cứu trình đóng gói<br /> Định tính, xác định cấu trúc và định lượng Berberiin clorid sau khi định tính, định<br /> Định tính lượng sẽ được đóng lọ ở điều kiện tiêu chuẩn<br /> Berberin clorid được định tính bằng phương trong Glove-Box (chứa 99,9% nitơ, độ ẩm 10%)<br /> pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với 3 hệ dung vào các lọ thủy tinh màu nâu và đóng kín, có lớp<br /> môi khác nhau, sắc ký lỏng hiệu năng cao đệm teflon, mỗi lọ 20 mg, đóng 100 lọ.<br /> (HPLC), hồng ngoại (IR) so với chất chuẩn. Lấy 11 lọ ( N + 1) để đánh giá đồng nhất lô<br /> Xác định cấu trúc trong quá trình đóng gói, mỗi lọ kiểm tra 2 lần.<br /> Phổ hồng ngoại đo trên máy Shimadzu Đánh giá kết quả theo ISO Guides(1,2).<br /> FTIR-8201PC, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Đánh giá chất chuẩn liên phòng thí nghiệm<br /> (NMR) thực hiện trên máy Bruker 500 MHz Thành phẩm sau khi được đóng gói và đánh<br /> NMR, phổ khối có độ phân giải cao (HR-MS) đo giá đồng nhất lô đạt yêu cầu được lấy mẫu ngẫu<br /> trên máy Bruker µQ-TOF MS. nhiên và tiến hành định lượng tại ba phòng thí<br /> Định lượng bằng HPLC nghiệm (PTN) độc lập đạt GLP hoặc ISO 17025,<br /> trong đó có ít nhất một phòng thí nghiệm có đủ<br /> Tiến hành theo Dược điển Việt Nam<br /> thẩm quyền và có ý nghĩa pháp lý đối với Việt<br /> (DĐVN) IV, chuyên luận “Berberin clorid”.<br /> Nam. Mỗi PTN định lượng 6 lọ. Tính thống kê<br /> Định lượng HPLC được thực hiện trên máy kết quả từ 3 phòng thí nghiệm theo Anova<br /> Shimadzu LC-20A (Nhật) và Agilent (Anh) với (n=18). Nếu Ftn ≤ Ftc, kết quả trung bình của 3<br /> detector dãy diod quang (PDA) và sử dụng các PTN khác nhau không có nghĩa, phương pháp<br /> chất chuẩn đối chiếu. phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng chất<br /> Điều kiện sắc ký chuẩn đánh giá không phụ thuộc vào PTN tham<br /> gia đánh giá.<br /> Cột: C18, 250 x 4,6 mm, 5m.<br /> Xác định giá ấn định, độ không đảm bảo đo và<br /> Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydro<br /> giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm(3)<br /> phosphat và 1,7 g natri lauryl sulfat trong hỗn<br /> hợp nước - acetonitril (1:1) vừa đủ 1000 ml. Tiến hành xác định giá trị công bố trên phiếu<br /> kiểm nghiệm khi kết quả đánh giá liên phòng thí<br /> Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.<br /> nghiệm đạt yêu cầu (Ftn ≤ Ftc). Giá trị ấn định<br /> Thể tích tiêm: 10 l. x*(n) được chọn khi giá trị s* không thay đổi sau n<br /> Bước sóng phát hiện: 345 nm. lần tính (lấy 3 số lẻ phía sau dấu phẩy); sử dụng<br /> Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 100 ppm. giá trị ấn định x*(n) để đánh giá từng kết quả<br /> phân tích theo test-z, loại bỏ các kết quả phân<br /> Lựa chọn cột: Hoà tan 1 mg berberin clorid<br /> tích có z > 2,0; chọn các giá trị z ≤ 2,0, tính giá<br /> và 1 mg palmatin clorid trong 10 ml pha động.<br /> trị trung bình.<br /> Tiến hành sắc ký và chọn cột sắc ký cho độ<br /> phân giải giữa palmatin và berberin không KẾT QUẢ<br /> nhỏ hơn 1,5. Định tính và xác định cấu trúc<br /> Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống SKLM: Trên ba hệ dung môi sắc ký khác<br /> sắc ký: Tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, độ nhau, berberin clorid đều cho một vết có màu<br /> sắc và Rf trùng với berberin clorid chuẩn. Khi<br /> <br /> <br /> <br /> 362 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> thêm palmatin vào mẫu thử thấy có vết palmatin Bảng 1. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của berberin<br /> tách ra rõ, chứng tỏ hệ dung môi khai triển đặc clorid điều chế (125 MHz, m = ppm) trong CD3OD)<br /> hiệu đối với berberin clorid và mẫu thử không với chất chuẩn(4)<br /> lẫn palmatin, nếu có chỉ với lượng không đáng Aglycon Đường<br /> kể. Berberin Berberin Berberin Berberin<br /> Vị trí (4) Vị trí (4)<br /> điều chế điều chế<br /> Phổ IR của mẫu berberin clorid điều chế phù 1 105,43 106,57 10 150,36 152,26<br /> hợp với phổ của mẫu chuẩn (Hình 1). 2 147,63 150,00 11 126,67 128,35<br /> HPLC: Thời gian lưu của mẫu điều chế và 3 149,76 152,06 12 123,53 124,49<br /> mẫu chuẩn trùng nhau khi tiêm triển khai trên 4 108,43 109,40 12a 132,94 135,33<br /> 4a 130,64 131,92 13 120,18 121,54<br /> HPLC trong cùng điều kiện sắc ký.<br /> 5 26,35 28,25 13a 137,41 139,80<br /> Phổ HR-MS của mẫu điều chế cho các mảnh 6 55,19 57,26 13b 120,42 121,89<br /> có số khối 336,1257 m/z, 337,1282 m/z, (M+) = 8 145,42 146,35 OCH2O 102,07 103,63<br /> 336,36 tương ứng với công thức C20H18NO4 8a 121,37 123,40 9-OMe 61,95 62,58<br /> của berberin clorid. 9 143,61 145,93 10-OMe 57,06 57,78<br /> <br /> Phổ NMR: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của<br /> berberin clorid điều chế phù hợp với berberin<br /> clorid theo tài liệu đã công bố(4) (Bảng 1, Hình 2).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Phổ IR của berberin clorid điều chế (a) và chuẩn (b)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Phổ 1H-NMR (a) và phổ 13C-NMR của berberin clorid điều chế<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 363<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> <br /> Định lượng berberin clorid bằng phương pháp Định lượng: Kết quả định lượng cho thấy<br /> HPLC hàm lượng trung bình của berberin clorid được<br /> Bảng 2. Kết quả kiểm tra tính tương thích hệ thống xác định là 92,99% (n = 6), tính theo hiện trạng.<br /> berberin clorid (n=6) Suy ra hàm lượng berberin clorid tính theo chế<br /> Thời gian Diện tích Hệ số kéo Số đĩa lý phẩm khan là 101,08%> 95,00%.<br /> lưu đỉnh đuôi T thuyết Vậy, berberin clorid điều chế đủ điều kiện để<br /> Trung bình 9,744 2153136 1,5 32403 thiết lập chất chuẩn theo DĐVN IV.<br /> RSD% 97 0,40 0,70 1,<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Sắc ký đồ định lượng berberin clorid (a): dung dịch phân giải chứa berberin clorid và palmatin; (b): mẫu<br /> thử: (c): mẫu chuẩn<br /> Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô trong quá Vậy, kết quả 92,87% và 94,66% không bất<br /> trình đóng gói thường, nghĩa là chuỗi dữ liệu trên không có giá<br /> Bảng 3. Kết quả định lượng đánh giá đồng nhất lô trị bất thường.<br /> STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2 (%) Đánh giá sự đồng nhất giữa các lọ theo ISO<br /> 1 5 93,97 93,84 GUIDE 35, ta có:<br /> 2 21 94,03 94,36<br /> 3 29 93,54 94,38<br /> 4 32 93,93 94,02<br /> 5 66 94,00 94,29 Do đó áp dụng công thức chuyển đổi để<br /> 6 67 93,55 92,87<br /> tínhubb. Kết quả thu được như sau:<br /> 7 77 94,66 93,72<br /> 8 83 94,23 93,25<br /> 9 87 93,22 93,42<br /> 10 92 93,95 94,22<br /> 11 95 94,16 92,94<br /> Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm<br /> Dixon: Xếp các kết quả trên theo thứ tự tăng dần,<br /> xét hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất so với chuỗi<br /> 2<br /> dữ liệu: 0,010 < u = 0,047 < 0,120, do đó kết luận<br /> bb<br /> Xmin = 92,87%  G = 0,235 < G0,05 = 0,468, các lọ berberin clorid điều chế được đóng gói<br /> Xmax = 94,66%  G = 0,208 < G0,05 = 0,468. đồng nhất.<br /> <br /> <br /> <br /> 364 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Đánh giá liên phòng thí nghiệm Từ kết quả trên, tính z-core. Kết quả tất cả 18<br /> Bảng 4. Kết quả định lượng berberin clorid điều chế giá trị đều có |z| ≤ 2,0. Do đó, hàm lượng trung<br /> (%) tại ba phòng thí nghiệm bình berberin clorid được tính như sau:<br /> Mẫu PTN1 PTN2 PTN3 Hàm lượng trung bình: X = 93,73% (n = 18).<br /> 1 93,84 92,89 93,31 Độ lệch s: 0,45.<br /> 2 94,36 94,18 93,9<br /> 3 94,38 93,44 93,48<br /> Độ không đảm bảo đo µ: 0,150.<br /> 4 94,02 93,81 93,26 Như vậy, chất điều chế berberin điều chế đạt<br /> 5 94,29 93,31 93,96 tiêu chí của một chuẩn gốc với hàm lượng được<br /> 6 92,87 94,01 93,55 xác định là 93,73% tính theo nguyên trạng.<br /> TB 93,96 93,61 93,58<br /> KẾT LUẬN<br /> PTN1: Phòng kiểm tra chất lượng Công ty<br /> Cổ phần Hóa Dược phẩm Mekophar. Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập<br /> chất chuẩn berberin clorid từ dược liệu có hàm<br /> PTN2: Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối<br /> lượng cao (93,73%) tính theo nguyên trạng.<br /> chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh.<br /> Trong quy trình thiết lập, chất chuẩn này được<br /> PTN3: Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm<br /> định tính, xác định cấu trúc, định lượng dựa vào<br /> nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh.<br /> quy trình HPLC đã thẩm định và chất chuẩn<br /> Phân tích phương sai một yếu tố theo Anova gốc, đánh giá tính đồng nhất lô đóng gói. Các<br /> cho thấy Ftn = 1,259 < Ftc = 3,682, do đó kết luận chất chuẩn cũng đã được thẩm định tại ba<br /> kết quả trung bình của ba phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn<br /> khác nhau không có nghĩa, phương pháp phân ISO/GLP. Kết quả đánh giá và thẩm định cho<br /> tích có độ lặp lại cao, hàm lượng berberin clorid thấy chất chuẩn berberin clorid thiết lập có chất<br /> điều chế được không phụ thuộc vào phòng thí lượng cao, đáng tin cậy, đạt tiêu chí chuẩn gốc<br /> nghiệm tham gia đánh giá. để đưa vào phục vụ yêu cầu nghiên cứu, kiểm<br /> Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo nghiệm các dược liệu chứa berberin clorid.<br /> và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm của TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> berberin clorid 1. ISO Guide 34 (2009). General requirements for the competence of<br /> Bảng 5. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng reference material producers.<br /> 2. ISO Guide 35 (2006). Reference materials — General and statistical<br /> berberin clorid điều chế (n = 18)<br /> principles for certification.<br /> Số lần thay đổi x*(0) x*(1) x*(2) x*(3) 3. ISO 13528 (2005). Statistical methods for use in proficiency testing by<br /> δ = 1,5 x s* - 0,90 0,80 0,80 interlaboratory comparisons.<br /> s* - δ - 93,00 92,93 92,93 4. Grycová L, Dotál J, Marek R (2007). Quaternary protoberberine<br /> s* + δ - 94,65 94,54 94,54 alkaloids. Phytochemistry, 68:pp.150-175.<br /> <br /> TB 93,71 93,73 93,73 93,73<br /> Ngày nhận bài báo: 31/01/2019<br /> Độ lệch s 0,47 0,45 0,45 0,45<br /> x* mới 93,83 93,73 93,73 93,73 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 12/02/2019<br /> s* mới 0,550 0,508 0,508 0,508 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019<br /> Sau ba lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi<br /> (= 0,508), khi đó giá trị x* được chọn là 93,73%.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 365<br />