Thiết lập mô hình lây nhiễm Burkholderia pseudomallei với dòng tế bào Monocyte like U937 và dòng tế bào Monocyte likeraw 264.7

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017<br /> <br /> <br /> THIẾT LẬP MÔ HÌNH LÂY NHIỄM BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI<br /> VỚI DÒNG TẾ BÀO MONOCYTE-LIKE U937 VÀ DÒNG TẾ BÀO<br /> MONOCYTE-LIKERAW 264.7<br /> Đường Thị Hồng Diệp*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Mô hình lây nhiễm Burkholderia pseudomallei với các dòng tế bào khác nhau đặc biệt là<br /> macrophage để nghiên cứu sinh bệnh học của vi khuẩn này được các nhà khoa học trên thế giới hết sức quan tâm.<br /> Mục tiêu: Tìm ra mô hình lây nhiễm tế bào thích hợp để nghiên cứu sinh bệnh học của Burkholderia<br /> pseudomallei cụ thể là quan sát và nghiên cứu sự hình thành tế bào lớn đa nhân ở ký chủ (được cho là một trong<br /> những độc tính của vi khuẩn).<br /> Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: Burkholderia pseudomallei chủng PP844, phân lập từ bệnh nhân<br /> mắc bệnh melioidosis, cho lây nhiễm với 2 dòng tế bào: U937 và RAW 264.7 bằng nhiều MOI khác nhau để khảo<br /> sát khả năng xâm lấn và kích thích sự tạo thành tế bào lớn đa nhân ở tế bào ký chủ.<br /> Kết quả: B. pseudomallei có khả năng xâm lấn vào dòng tế bào chuột RAW 264.7 cao hơn gấp 40 lần so với<br /> khả năng xâm lấn vào dòng tế bào người U937. Sự hình thành tế bào lớn đa nhân được tìm thấy ở RAW 264.7,<br /> nhưng không tìm thấy ở dòng tế bào U937.<br /> Kết luận: Có thể dùng cả 2 loại tế bào RAW 264.7 và U937 để nghiên cứu sinh bệnh học của B.<br /> pseudomallei, tuy nhiên tùy vào mục đích nghiên cứu sẽ chọn dòng tế bào thích hợp.<br /> Từ khóa: Burkholderia pseudomallei, tế bào lớn đa nhân, RAW 264.7, U937<br /> ABSTRACT<br /> INFECTION ASSAY IN 2 CELL LINES RAW 264.7 AND U937 WITH BACTERIA BURKHOLDERIA<br /> PSEUDOMALLEI<br /> Duong Thi Hong Diep * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 21 - No 1 - 2017: 90 - 96<br /> <br /> Objectives: To establish an infection assay of Burkholderia pseudomallei, causative agent of melioidosis with 2 cell<br /> lines RAW 264.7 and U937 in order to study bacterial pathogenicity.<br /> Material and Method: Infect B. pseudomallei PP844, isolated from melioidosis patient, to RAW 264.7 and U937<br /> cell lines to study the invasion capability and to observe multinucleated giant cell (MNGC) formation.<br /> Results: B. pseudomallei can invade into RAW 264.7 cells with 40 folds higher than into U937. MNGC formation<br /> after infection assay can be observed in RAW 264.7 cells but not in U937.<br /> Conclusion: RAW 264.7 cells are suitable for studying MNGC formation after infection. The right infection model<br /> should be chosen follow up the purpose of study.<br /> Key words: Burkholderia pseudomallei, multinucleated giant cell (MNGC), RAW 264.7, U937<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ pseudomallei (B.pseudomallei) là tác nhân gây nên<br /> bệnh Melioidosis hay còn được gọi theo tên của<br /> Theo Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát<br /> nhà khoa học lần đầu tiên phát hiện ra nó là<br /> dịch bệnh Mỹ (CDC) thì vi khuẩn gram âm<br /> bệnh Whitmore. Bệnh nhân thường có biểu hiện<br /> Burkholderia pseudomallei phổ biến ở khu vực cấp tính như sốt cao, nhức đầu, chán ăn, ho, đau<br /> Đông Nam Á và phía Bắc Australia. Burkholderia ngực và đau nhức các cơ bắp. Khi diễn biến nặng<br /> <br /> <br /> Bộ môn Hoá Sinh – Khoa Y – Đại học Đại học Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. Đường Thị Hồng Diệp ĐT: 0989369390 Email: diepdh@yahoo.com<br /> <br /> 90 Chuyên Đề Nội Khoa<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> có thể gây nhiễm trùng máu, do đó nguy cơ tử chính xác tác nhân gây bệnh tại tuyến địa<br /> vong cao (tới 40% ở vùng đông bắc Thái lan và phương, nên bệnh nhân nặng đã tử vong trước<br /> 15% ở Úc)(1, 9) dù được điều trị thích hợp. B. khi được chuyển lên thành phố Hồ Chí Minh, do<br /> pseudomallei kháng với hầu hết các kháng sinh vậy không được thống kê trong nghiên cứu này.<br /> thông thường như penicillin, ampicillin, kháng Ở Việt Nam, các trường hợp bệnh đã được ghi<br /> sinh cephalosporin thế hệ 1 và 2, gentamicin, nhận từ thời thuộc Pháp và thời kỳ chiến tranh<br /> tobramycin, streptomycin, polymyxin(7). trên các đối tượng là lính Pháp và sau đó là lính<br /> Khi điều trị bệnh nhân cần được điều trị kéo Mỹ tham chiến tại Việt Nam. Đến nay chỉ có một<br /> dài, kháng sinh dùng trong pha cấp tính là vài báo cáo ca bệnh trong nước về melioidosis, vì<br /> Ceftazidime 50mg/kg (tối đa 2g) truyền tĩnh vậy nên chưa có cái nhìn đầy đủ về dịch tễ học,<br /> mạch mỗi 6-8 giờ hoặc Meronem 25mg/kg (tối đa cũng như các bệnh cảnh lâm sàng của một căn<br /> 1g) truyền tĩnh mạch mỗi 8 giờ. Trong pha củng bệnh nguy hiển (được Trung tâm phòng ngừa và<br /> cố , kháng sinh được dùng là Trimethoprim- kiểm soát bệnh tật Hòa Kỳ coi là một vũ khí sinh<br /> sulfamethoxazole uống mỗi 12 giờ hoặc học tiềm năng) mà Việt Nam nằm trong vùng<br /> Doxycycline uống mỗi 12 giờ hoặc dịch tễ. Một báo cáo ở miền Bắc Việt Nam cho<br /> Amoxicillin/acid-clavulanic uỗng mỗi 8 giờ. Thời thấy, trong khoảng thời gian từ 1997 – 2005 có 54<br /> gian điều trị trong mỗi pha phụ thuộc vào bệnh bệnh nhân được chẩn đoán xác định là<br /> cảnh lâm sàng có thể kéo dài từ 2 tới 6 tháng(1, 3, 9). Melioidosis với kết quả cấy máu hoặc các dịch cơ<br /> Điều nguy hiểm là bệnh tuy đã được điều trị thể dương tính với B. pseudomallei, các bệnh nhân<br /> nhưng lại dễ tái phát vì vi khuẩn có khả năng đến 18 tỉnh thành quanh Hà Nội(7,8). Bệnh<br /> tồn tại trong mọi loại tế bào của cơ thể kể cả Melioidosis có thể điều trị được bằng kháng sinh<br /> macrophage, do đó sức khỏe của bệnh nhân bị nếu phát hiện và chẩn đoán được sớm, tuy nhiên<br /> suy kiệt do bệnh tái đi tái lại hoặc điều trị không bệnh có thể tái phát và hiện nay chưa có<br /> đúng phác đồ. vacxin phòng bệnh<br /> Vi khuẩn đi vào cơ thể người thông qua Với sự phát triển của kỹ thuật phân lập, nuôi<br /> đường hô hấp (hít phải khí bụi có vi khuẩn) hoặc cấy và sinh học phân tử những hiểu biết về cơ<br /> vết trầy xước ở da khi tiếp xúc trực tiếp với nước chế bệnh sinh và điều hòa biểu hiện gene của<br /> bùn lầy hoặc đất đai nông nghiệp nhiễm khuẩn. B.pseudomallei ngày càng gia tăng. Holden và<br /> Khi Burkholderia pseudomallei xâm nhập vào cơ cộng sự năm 2004 đã công bố trình tự hoàn<br /> thể người chúng có thể gây bệnh ngay (thời gian chỉnh của bộ gene B.pseudomallei, gồm 2<br /> ủ bệnh 1-21 ngày) hoặc nằm yên đến vài chục chromosome vòng: 4.07 Mb (megabase pair)<br /> năm (ghi nhận tới 60 năm) chờ khi cơ thể suy và 3.17 Mb(4).<br /> yếu là lúc thuận lợi để gây bệnh(5, 9), do đó bệnh Để hiểu biết thêm về cơ chế bệnh sinh và<br /> thường gặp ở những bệnh nhân suy giảm miễn đóng góp kiến thức cho nghiên cứu vắc xin sau<br /> dịch, bệnh nhân đái tháo đường, suy thận(1,2,8). này, dựa vào những kiến thức đã biết chúng tôi<br /> Ở Nam Việt nam, những ca melioidosis vẫn mong muốn thiết lập một mô hình lây nhiễm<br /> được ghi nhận, tuy nhiên nó không phải là bệnh B.pseudomallei trên dòng tế bào người và tế bào<br /> nhiễm trùng phổ biến ở các tỉnh thành lân cận chuột nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Nghiên<br /> thành phố Hồ Chí Minh(6). Điều này khác với cứu được thiết kế với 2 mục tiêu cụ thể như sau:<br /> vùng đông bắc Thái Land (Ubon Ratchathani), (1) thiết lập mô hình lây nhiễm B.pseudomallei<br /> cách tây bắc thành phố Hồ Chí Minh 500km, nơi vớidòng tế bào U937 người và dòng tế bào RAW<br /> mà B. pseudomallei gây nên một phần năm số ca 264.7 chuột (tế bào monocyte-like, tiền thân của<br /> nhiễm trùng máu từ cộng đồng. Có thể do thiếu đại thực bào), so sánh khả năng xâm nhập của vi<br /> các phương tiện để có thể phân lập và chẩn đoán khuẩn vào từng loại tế bào; (2) nghiên cứu khả<br /> <br /> <br /> Tiêu Hóa 91<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017<br /> <br /> năng kích thích sự hình thành tế bào ký chủ mật độ quang OD600 được tiến hành qua thí<br /> khổng lồ đa nhân của vi khuẩn để chọn ra mô nghiệm sau. Cắn tế bào vi khuẩn sau khi ly tâm<br /> hình phù hợp nhất. Kết quả của nghiên cứu này 7000 x g, đổ bỏ PBS, thêm vào 1ml PBS mới trộn<br /> sẽ được sử dụng làmmô hình lây nhiễm nghiên đều, pha loãng dần theo tỷ lệ 1:10; 1:100; 1:1000;<br /> cứu điều hòa biểu hiện gene gây bệnh của yếu tố 1: 10 000; 1: 100 000; 1: 1000 000 và 1: 1000 000 0<br /> phiên mã RpoS và RpoN2 ở B. pseudomallei. và đo mật độ quang từng nồng độ. Tiến hành<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU song song, mỗi nồng độ sẽ cấy trên đĩa thạch<br /> TSA (Tryptic Soy Agar) theo kỹ thuật drop plate<br /> Nuôi cấy vi khuẩn Burkholderia pseudomallei technique, ủ trong tủ ấm 37oC, 48 giờ. Đếm số<br /> Vi khuẩn Gram-âm B. pseudomallei chủng khuẩn lạc CFU (colony forming unit) và nhân<br /> PP844 được phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh với hệ số pha loãng. Như vậy CFU trong 1ml sẽ<br /> melioidosis tại bệnh viện Srinagarind, tỉnh Khon tỷ lệ với OD600 đo được.<br /> Kaen, Thái lan (cung cấp bởi PGS. TS. Nuôi cấy tế bào U937 và RAW 264.7<br /> Utainsincharoen, đại học Mahidol, Thái lan). B.<br /> Dòng tế bào người monocyte-like U937 và<br /> pseudomallei PP844 được lưu trữ ở -80oC trong<br /> dòng tế bào chuột monocyte-like RAW 264.7<br /> LB (Luria-Bertani: Tryptone 10g, NaCl 10g, Yeast<br /> được mua từ ATCC (American tissue<br /> extract 5g, nước 950ml)media và 60% glycerol<br /> cell culture).<br /> (v/v). Trước mỗi lần làm thí nghiệm, PP844 được<br /> lấy ra từ -80oC và nuôi cấy trong 10ml TSB Chuẩn bị môi trường RPMI: 1 gói RPMI 1640<br /> (Tryptic soy broth) không chứa kháng sinh, ở Gibco (Invitrogen) (Roswell Park Memorial<br /> 37oC, trong máy lắc 200rpm. Canh cấy qua đêm Institute medium)pha trong 1L nước cất tinh<br /> được inoculate 0,1% (v/v) trong 5ml TSB mới sạch cấp độ 3B (3B grade), bổ sung 2mM<br /> cũng ở 37oC, lắc 200rpm thêm 6 giờ. Vi khuẩn Glutamine, 25mM Hepes buffer và 2g NaHCO3,<br /> sau khi được kích hoạt sẽ cấy trên đĩa thạch điều chỉnh pH 7,4. Cho vào môi trường nuôi cấy<br /> Ashdown agar (môi trường chọn lọc của 1% (v/v) penstep (Penicillin + streptomycin 15140<br /> B.pseudomallei) trong tủ ấm 37oC để phân lập Gibco (Invitrogen)) để tránh tế bào bị lây nhiễm.<br /> khuẩn lạc. Sau 48 giờ đến 72 giờ khuẩn lạc đã Bổ sung FBS (Fetal bovine serum) 10% (v/v). Hòa<br /> mọc, dùng que cấy, lấy 1 khuẩn lạc, cho vào tan các thành phần, sau đó lọc qua filter<br /> 10ml TSB, nuôi cấy trong môi trường lỏng qua 0,02nmpore. Lấy ra 10ml RPMI, để trong tủ ấm<br /> đêm ở 37oC, lắc 200rpm. Inoculate 0,1% (v/v) vào 37oC 24-48h, kiểm tra xem có bị nhiễm khuẩn<br /> 5ml TSB mới thêm 6h, để chắc chắn vi khuẩn đủ không bằng cách quan sát độ đục hoặc cấy trên<br /> khỏe để tiến hành thí nghiệm. thạch agar, trước khi sử dụng.<br /> <br /> Thu thập tế bào vi khuẩn bằng ly tâm 7000 Chuẩn bị tế bào: vial U937 lấy ra từ nito lỏng,<br /> x g, đổ bỏ môi trường, rửa các tế bào vi khuẩn rã đông nhanh trong 1 phút ở 37oC (water bath),<br /> thu được 2 lần bằng PBS. Mỗi lần rửa đều ly chuyển sang 10ml RPMI đã làm ấm ở 37oC trong<br /> tâm ở 7000 x g, đổ bỏ môi trường. Cho vi vòng 15 phút, lắc đều, quay ly tâm lạnh 2000<br /> khuẩn thu được sang tube 1,5ml, thêm 1ml vòng/phút, 5 phút ở 4oC. Thu cặn lắng, rửa lại 1-2<br /> PBS, trộn đều, sau đó đo mật độ quang ở bước lần bằng 10ml RPMI mới. Lần rửa cuối cùng, thu<br /> sóng 600nm để xác định số lượng tương đối tế cặn lắng (tế bào), trộn đều tế bào trong 1ml<br /> bào vi khuẩn trong 1ml PBS. Pha loãng vi RPMI mới. Đếm tế bào bằng phương pháp<br /> khuẩn và hiệu chỉnh số lượng vi khuẩn như trypan blue trên hematocytometer. Điều chỉnh<br /> mong muốn để tiến hành lây nhiễm vào tế bào số tế bào thích hợp đưa vào nuối cấy trong 20ml<br /> ký chủ, bằng cách đo mật độ quang (OD600). RPMI trong flask T75 và đặt vào tủ ấm 37oC, 5%<br /> CO2. Theo dõi tình trạng tế bào mỗi 12 giờ. Thay<br /> Mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn và<br /> <br /> <br /> 92 Chuyên Đề Nội Khoa<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> môi trường mỗi 2 ngày, cắt giảm số tế bào sau ấm 5% CO2, 37oC trong 2 giờ để vi khuẩn có thể<br /> mỗi 24h. Làm thí nghiệm tính thời gian số tế bào xâm nhập vào tế bào.<br /> tăng sinh gấp đôi, ghi nhận. Sau đó lớp tế bào RAW 264.7 đã bị vi khẩn<br /> Chuẩn bị môi trường DMEM: 1 lọ Hyclone xâm nhập, sẽ được rửa 2 lần với PBS để loại bỏ<br /> classical DMEM chứa nồng độ glucose caodạng hết vi khuẩn ở bên ngoài chưa vào trong tế bào<br /> bột khô 67g pha được 1L DMEM 5X. Bổ sung được. Mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 12<br /> thêm sodium bicarbonate 7,5g. Từ stock 5X pha giếng sẽ được cho vào 2ml DMEM mới chứa<br /> 1L DMEM 1X sẵn sàng sử dụng. Chỉnh pH 7.0 – Kanamycin 250 µg/ml, ủ tiếp 2 giờ trong tủ ấm<br /> 7.4. Lọc bởi filter cup 0,02nm trong tủ hood. 5% CO2 để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn bên ngoài<br /> Kiểm tra tránh nhiễm khuẩn. Từ DMEM 1X pha tế bào. Sau 2h, đổ bỏ DMEM, rửa 2 lần với PBS.<br /> môi trường hoàn chỉnh để sử dụng (cho thêm Cho vào mỗi giếng 2ml DMEM mới chứa<br /> vào 1L DMEM 1X: 1% (v/v) L-glutamine, 10% Kanamycin 50µg/ml và nuôi cấy RAW 264.7 đã<br /> (v/v) FBS (Hyclone), chú ý khi đổi DMEM và bị lây nhiễm cho tới thời điểm kết thúc, thu mẫu<br /> FBS của hãng khác. tế bào sau 0 giờ, 2 giờ và 4 giờ sau lây nhiễm.<br /> Vial được lưu trữ ở nito lỏng, rã đông nhanh Đối với đĩa 12 giếng nuôi cấy U937 cũng tiến<br /> 1 phút trong tủ ấm 37oC hoặc water bath, chuyển hành tương tự.<br /> tế bào qua 10ml DMEM, lắc đều rửa, quay ly tâm Để kiểm tra xem Kanamycin 250 µg/ml có<br /> lạnh 2000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, thu cặn loại bỏ hết vi khuẩn ngoài tế bào RAW 264.7 và<br /> lắng (tế bào), đổ bỏ môi trường. Pha loãng tế bào U937 hay không, trước khi hút bỏ môi trường,<br /> trong 1ml DMEM, đếm tế bào bằng phương mẫu môi trường sẽ được cấy trên đĩa thạch agar<br /> pháp trypan blue trên hematocytometer. Nuôi để tìm khuẩn lạc vi khuẩn.<br /> cấy 1x 104 tế bào với 5ml DMEM hoàn chỉnh<br /> Thí nghiệm lây nhiễm sẽ làm lại 3 lần độc<br /> trong flask T25.<br /> lập, mỗi lần làm sẽ lặp lại 3 giếng cùng một MOI<br /> Quy trình lây nhiễm để lấy số liệu thống kê.<br /> Sau khi tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy Tại mỗi thời điểm thu nhận mẫu tế bào ở 0<br /> khoảng 10canh cấy (passage) trong T25 flask, tế giờ, 2 giờ, 4 giờ sau lây nhiễm, môi trường sẽ<br /> bào được thu hoạch bằng scraper, quay ly tâm được hút bỏ, rửa tế bào RAW 264.7 hoặc U937 2<br /> lạnh, lấy tế bào, rửa và đếm. Tế bào RAW 264.7 lần với PBS và ly giải tế bào bằng 200µl 0.1%<br /> được chuyển qua đĩa cấy tế bào 12 giếng mỗi Triton X-100 (Sigma Chemicals, Co) để giải<br /> giếng 5 x 104 cells. Đến ngày làm lây nhiễm lớp phóng ra vi khuẩn. Để đánh giá mức độ xâm lấn,<br /> tế bào trên bề mặt đĩa được rửa 2 lần bằng dung dịch ly giải tế bào tại thời điểm 0 giờ, 2 giờ, 4<br /> dịch PBS (phosphate buffered saline) pH7.4, giờở mỗi MOI 2, 10, 20 sẽ được pha loãng 1:10;<br /> trước khi cho 2ml DMEM hoàn chỉnh. 1:100; 1: 1000; 1: 10 000; 1: 100 000 và 1: 1 000 000<br /> Song song đó vi khuẩn B. pseudomallei cũng và cấy trên đĩa thạch TSA và sẽ đếm số khuẩn<br /> được thu hoạch bằng ly tâm lạnh, rửa, đo mật độ lạc CFU sau 48 giờ ủ ở 37oC trong tủ ấm.<br /> quang OD600 và hiệu chỉnh số vi khuẩn cho thích Song song với thí nghiệm xác định khả năng<br /> hợp. Quá trình lây nhiễm bắt đầu khi cho vi xâm lấn của vi khuẩn, thí nghiệm lây nhiễm<br /> khuẩn B. pseudomallei vào các giếng đã có sẵn tế được tiến hành đồng thời trên những đĩa nuôi<br /> bào RAW 264.7 vớilần lượt MOI (multiplicity of cấy tế bào 12 giếng khác để quan sát mức độ tạo<br /> infection) là 1, 10 và 100. Lắc nhẹ để phân bổ đều thành tế bào đa nhân ở những tế bào RAW 264.7<br /> vi khuẩn cho mỗi tế bào. Trong 12 giếng, 1 giếng và U937 bị nhiễm B. pseudomallei. Tại mỗi thời<br /> sẽ chỉ có tế bào RAW 264.7 (mock) để kiểm soát điểm sau lây nhiễm 0h, 2h, 4h mẫu tế bào được<br /> lây nhiễm chéo. Để đĩa nuôi cấy 12 giếng vào tủ thu thập, hút bỏ môi trường DMEM, rửa 2 lần<br /> <br /> <br /> Tiêu Hóa 93<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017<br /> <br /> với PBS, nhuộm Giemsa, chụp hình, đếm tế bào KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> đa nhân, thống kê số liệu.<br /> B. pseudomallei kích thích sự tạo thành tế<br /> bào đa nhân ở RAW 264.7 chứ không kích<br /> thích sự tạo tế bào đa nhân (MNGC) ở U937<br /> Tại mỗi thời điểm sau lây nhiễm 0 giờ, 2 nhân. Sau lây nhiễm 2 giờ số tế bào đa nhân<br /> giờ, 4 giờ các tế bào RAW 264.7 được rửa 2 lần quan sát được còn nhỏ và ít. 4 giờ sau lây<br /> với PBS, để khô ở nhiệt độ phòng và nhuộm nhiễm số tế bào đa nhân tăng lên cả về kích<br /> với Giemsa, để quan sát sự tạo thành tế bào đa thước và số lượng (Hình 2B).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. RAW 264.7 mock (A) và RAW 264.7 lây nhiễm với B.speudomallei (B,C)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Các tế bào U937 mock (A) và U937 lây nhiễm với (B), không có sự hình thành tế bào lớn đa nhân<br /> Tuỳ thuộc vào MOI (lượng vi khuẩn dùng lớn đa nhân hầu như đạt kích thước tối đa, sau<br /> để tiến hành thí nghiệm lây nhiễm so với số tế đó tế bào bị ly giải, giải phóng ra B.<br /> bào ký chủ)và tùy thuộc vào thời gian mà sự pseudomallei (Hình 1C). Cùng tại thời điểm<br /> hình thành tế bào đa nhân nhiều hơn hay ít 4giờ sau lây nhiễm sự tạo thành tế bào lớn đa<br /> hơn. Để quan sát kỹ hơn tế bào lớn đa nhân, ở nhân ở RAW264.7, lây nhiễm B. pseudomalli<br /> thí nghiệm lặp lại đã làm thêm giếng và để tới với MOI 20, sẽ thấy rõ hơn và lớn hơn về kích<br /> 16 giờ mới thu thập tế bào, kết quả cho thước so với tế bào RAW264.7 lây nhiễm B.<br /> thấyởthời điểm 16 giờ sau lây nhiễm, tế bào pseudomallei MOI 2. Khi để lâu hơn, sẽ quan<br /> <br /> <br /> 94 Chuyên Đề Nội Khoa<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> sát thấy sự ly giải các tế bào lớn đa nhân. Điều Khả năng xâm lấn của vi khuẩn B.<br /> này phù hợp với kết quả của những nghiên pseudomallei vào RAW 264.7 cao hơn<br /> cứu khác cho rằng khả năng kích thích sự tạo vào U937<br /> tế bào lớn đa nhân là độc tính của B. Tại mỗi thời điểm sau lây nhiễm 0 giờ, 2<br /> pseudomallei mà không quan sát thấy ở các vi giờ, 4 giờ tế bào RAW 264.7 và U937 được thu<br /> khuẩn Gram- âm khác. Từ kết quả thí nghiệm thập. Tế bào được ly giải bằng 200µl 0,1%<br /> này cũng đưa ra nhận xét về thời gian kéo dài Triton X-100 (Sigma Chemicals, Co) để giải<br /> thí nghiệm lây nhiễm không nên quá 16giờ đối phóng ra vi khuẩn. Dịch ly giải được pha<br /> với MOI 2, 10, 20. Nếu giảm MOI xuống 0.1 thì loãngdần 10, 100, 1000, 10 000 lần và nuôi cấy<br /> có thể kéo dài thời gian lây nhiễm. Hoặc rút trên đĩa thạch TSA 48 giờ. CFU được đếm và<br /> tính toán dựa trên phần mềm Sigma stat với p<br /> ngắn thời gian thí nghiệm nếu lây nhiễm với<br />  0.01, kết quả được biểu diễn bằng đồ thịvà<br /> MOI 50 hoặc 100 để đảm bảo kết quả có độ tin<br /> bảng (hình 3 và bảng 1).<br /> cậy cao, vì khi tế bào lớn đa nhân bị ly giải sẽ<br /> phóng thích B. pseudomallei và tiếp tục lây<br /> nhiễm sang các tế bào bên cạnh, sẽ không so<br /> sánh được với số vi khuẩn đưa vào khi bắt<br /> đầu quá trình lây nhiễm.Đối với thí nghiệm<br /> trên dòng tế bào U937 người, mặc dù quan sát<br /> thấy rõ B. pseudomallei xâm nhập vào tế bào,<br /> tăng sinh nội bào, nhưng không quan sát thấy<br /> sự tạo thành tế bào lớn đa nhân dưới kính<br /> hiển vi. Kéo dài thí nghiệm lây nhiễm lâu hơn, Hình 3. Sự xâm lấn của B.pseudomallei MOI khác<br /> chỉ thấy ly giải từng tế bào U937 khi số vi nhau vào RAW 264.7 và U937<br /> khuẩn tăng sinh đủ nhiều. Điều này phù hợp Như vậy với từng MOI khác nhau số vi<br /> với những báo cáo quốc tế và có thể giải thích khuẩn vào tế bào chủ khác nhau, tuy nhiên<br /> tại sao B. pseudomallei có thể tồn tại trong cơ theo cùng một tỷ lệ là khoảng 4.5% số vi<br /> thể người tới 60 năm mới phát bệnh, khi có cơ khuẩn lây nhiễm ban đầu vào được RAW<br /> hội. Khả năng xâm lấn và tồn tại nội bào của B. 264.7 và 0,1% B. pseudomallei vào được U937<br /> sau 4h lây nhiễm (Bảng 1).<br /> pseudomallei đã được báo cáo từ năm 1990.<br /> Những năm gần đây nghiên cứu sự ảnh Khả năng xâm lấn của B. pseudomallei vào<br /> hưởng các yếu tố của vi khuẩn này tới sự hình RAW 264.7 (4,5%) cao hơn vào U937 (0,1%)<br /> (Hình 3).<br /> thành tế bào lớn đa nhân đang được đặc biệt<br /> quan tâm(2). Tuy nhiên dùng dòng tế bào nào Cả hai mô hình tế bào này đều thích hợp cho<br /> làm mô hình lây nhiễm hiệu quả để khảo sát thí nghiệm lây nhiễm. Tuy nhiên, nếu để quan<br /> sát và đếm tế bào lớn đa nhân thì mô hình tế bào<br /> sự hình thành tế bào lớn đa nhân vẫn đang<br /> RAW 264.7 thích hợp hơn U937. Tế bào U937 có<br /> còn tranh cãi. Từ quan sát trong thí nghiệm<br /> thể được kích hoạt bởi PMAphorbol 12 –<br /> này, có thể đưa ra kết luận, sự hình thành tế<br /> myristate 13-acetate để bám dính vào đĩa nuôi<br /> bào lớn đa nhân sẽ dễ dàng hơn ở dòng tế bào<br /> cấy, trước khi làm lây nhiễm, nhưng khảo sát sự<br /> kết dính (RAW 264.7 là tế bào bán kết dính, hình thành tế bào đa nhân ở dòng tế bào này vẫn<br /> U937 là tế bào không kết dính). còn cần phải nghiên cứu thêm.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tiêu Hóa 95<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017<br /> <br /> Bảng 1. So sánh khả năng lây nhiễm của người.Tuy nhiên khả năng kích thích tạo thành<br /> B.pseudomallei MOI khác nhau vào RAW 264.7 và tế bào đa nhân, được cho là tính độc của B.<br /> U937 pseudomallei, lại chỉ quan sát được ở dòng tế bào<br /> RAW 264.7. Vì vậy tùy mục đích nghiên cứu sẽ<br /> lựa chọn những dòng tế bào khác nhau để làm<br /> mô hình lây nhiễm. Mô hình lây nhiễm này sẽ<br /> được tác giả sử dụng để khảo sát vai trò yếu tố<br /> phiên mã RpoS và RpoN2 của B. pseudomallei<br /> trong điều hòa biểu hiện gene gây bệnh và dùng<br /> để so sánh khả năng lây nhiễm của vi khuẩn này<br /> vào dòng tế bào gan người.<br /> Cám ơn: Trân trọng cám ơn GS.TS. Sumalee Tungpradabkul,<br /> GS.TS. Ratchanee đại học Mahidol, Thái lan đã cung cấp chủng vi<br /> khuẩn B. pseudomallei và giúp đỡ hoàn thành nghiên cứu này.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> KẾT LUẬN 1. Cheng, AC, and Currie BJ (2005), Melioidosis: epidemiology,<br /> pathophysiology, and management. Clin Microbiol Rev, 18(2): p.<br /> Melioidosis là một bệnh dịch địa phương, 383-416.<br /> 2. Currie B (1995), Pseudomonas pseudomallei-insulin interaction.<br /> thường gặp ở vùng nhiệt đới, gây nên bởi vi<br /> Infection and immunity, 63(9): p. 3745.<br /> khuẩn Gram-âm B. pseudomallei. CDC Hoa kỳ 3. Dance D (2014), Treatment and prophylaxis of melioidosis.<br /> xếp vi khuẩn này vào loại B tác nhân sinh học International journal of antimicrobial agents, 43(4): p. 310-318<br /> 4. Holden MT, et al. (2014), Genomic plasticity of the causative<br /> nguy hiểm. Tuy nhiên hiện nay chưa cóvaccine agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei. Proc Natl Acad<br /> cho bệnh này, biểu hiện bệnh rất khác nhau ở Sci U S A, 101(39): p. 14240-5.<br /> từng bệnh nhân và điều trị khó khăn, vì vi 5. Ngauy V, et al. (2005), Cutaneous melioidosis in a man who was<br /> taken as a prisoner of war by the Japanese during World War II.<br /> khuẩn kháng với hầu hết các loại kháng sinh Journal of Clinical Microbiology, 43(2): p. 970-972.<br /> thông thường. Ngay cả sau khi điều trị kháng 6. Parry C.M., et al. (1999), Melioidosis in Southern Vietnam:<br /> clinical surveillance and environmental sampling. Clinical<br /> sinh thành công, tỷ lệ tái phát là 30-40%. Vì vậy<br /> Infectious Diseases, 29(5): p1323-1326.<br /> nghiên cứu sinh bệnh học của B. pseudomallei 7. Phuong, DM., et al (2008),Clinical and microbiological features of<br /> được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. Ở melioidosis in northern Vietnam. Transactions of the Royal<br /> Society of Tropical Medicine and Hygiene, 102 (Supplement 1):<br /> Việt nam có ghi nhận những ca bệnh pS30-S36.<br /> melioidosis, tuy nhiên nghiên cứu công bốcủa 8. Simpson AJ and Wuthiekanun V (2005), Interaction of insulin<br /> Việt nam lại vô cùng hạn chế. Nghiên cứu này with Burkholderia pseudomallei may be caused by a<br /> preservative. Journal of clinical pathology, 53(2): p. 159-160.<br /> nhằm thiết lập một mô hình lây nhiễm hiệu quả, 9. Wiersinga WJ, Currie BJ, and Peacock SJ (2012), Melioidosis. N<br /> có thể thực hiện được trong phòng thí nghiệm, Engl J Med, 367(11): p. 1035-44.<br /> giúp ích một cách thiết thực cho nghiên cứu sinh<br /> bệnh học của B. pseudomallei. Nghiên cứu này Ngày nhận bài báo: 18/11/2016<br /> cho thấy B. pseudomallei có thể lây nhiễm cả 2 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/12/2016<br /> dòng tế bào RAW 264.7 chuột và U937 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2017<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 96 Chuyên Đề Nội Khoa<br />