Tiêu chuẩn hóa cao chiết hỗn hợp từ bốn loại dược liệu

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> <br /> TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT HỖN HỢP TỪ BỐN LOẠI DƯỢC LIỆU<br /> Phạm Đình Duy*, Trần Văn Thành*, Trương Thị Thu Trang**, Trịnh Thị Thu Loan*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Y học cổ truyền từ rất lâu đã có các bài thuốc từ dược liệu điều trị viêm họng hiệu quả, an toàn,<br /> kinh tế. Trong số các dược liệu đó, có thể kể đến Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Tuy nhiên, các<br /> bài thuốc này thường được sử dụng riêng lẻ, bào chế theo các phương pháp truyền thống, không che được mùi vị<br /> khó chịu, bất tiện cho người bệnh. Vì vậy, việc phối hợp các dược liệu dưới dạng cao chiết trong cùng một dạng<br /> bào chế hiện đại, dễ sử dụng là một vấn đề đang được quan tâm. Xuất phát từ những thực tế nêu trên và nhằm<br /> góp phần đáp ứng nhu cầu điều trị hiệu quả, đa dạng hóa sản phẩm, đề tài được thực hiện với mục tiêu là tiêu<br /> chuẩn hóa cao chiết hỗn hợp từ 4 dược liệu: Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Hỗn hợp cao chiết<br /> được tiêu chuẩn hoá có thể sử dụng để điều chế các dạng bào chế hiện đại hoá thuận tiện cho người dùng.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao dược liệu được chiết từ sự phối hợp<br /> của 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Phương pháp nghiên cứu: Cao dược<br /> liệu hỗn hợp được chiết từ 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành được Bộ môn<br /> Dược cổ truyền, khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược Tp.HCM cung cấp sẽ được tiêu chuẩn hóa dựa theo<br /> những chỉ tiêu được qui định trong DĐVN V gồm: cảm quan, tỉ trọng, mất khối lượng do làm khô, cắn không<br /> tan trong nước, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric, tro sulfat, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính,<br /> định lượng. Riêng định tính và định lượng sẽ định tính và định lượng nhóm hoạt chất chính là saponin bằng sắc<br /> ký lỏng hiệu năng cao.<br /> Kết quả: Đã tiêu chuẩn hoá được cao chiết dược liệu từ sự phối hợp của 4 loại dược liệu.<br /> Kết luận: Cao chiết dược liệu của hỗn hợp 4 loại dược liệu đã được tiêu chuẩn hoá có thể dùng làm nguyên<br /> liệu đầu vào để điều chế thành các thành phẩm bào chế.<br /> Từ khóa: cao dược liệu chuẩn hoá, cam thảo bắc, cát cánh, rẻ quạt, sâm đại hành<br /> ABSTRACT<br /> STANDARDIZATION OF THE EXTRACT FROM FOUR HERBAL PLANTS<br /> Pham Dinh Duy, Tran Van Thanh, Truong Thi Thu Trang, Trinh Thi Thu Loan<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 112 - 120<br /> Objectives: Traditional medicine has various precious remedies from medicinal herbs to treat sore throat<br /> effectively, safely and economically. Among those herbs, there are Glycyrrhiza uralensis, Platycodon<br /> grandiflorum, Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa. However, these remedies are often used alone and<br /> prepared according to traditional methods that can not cover unpleasant taste and unconviene for the patients.<br /> Therefore, the combination of various plant extracts and transform in modern and easy-to-use dosage form is a<br /> matter of concern. From the above mentioned arguments, this research is carried out with the goal of<br /> standardization of plant extracts containing 4 medicinal herbs.<br /> Materials and Methods: Subjects of study: Plant extract containing simultaneously four herbals:<br /> Glycyrrhiza uralensis, Platycodon grandiflorum, Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa. Herbal extract<br /> which was obtained from 4 medicinal herbs including Glycyrrhiza uralensis, Platycodon grandiflorum,<br /> <br /> *Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Công ty Huỳnh Tấn<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Văn Thành ĐT: 0919000008 Email: tranvanthanh@ump.edu.vn<br /> <br /> <br /> <br /> 112 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa, supplied by Department of Traditional Pharmaceutics, Faculty of<br /> Traditional Medicine, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City was standardized based on the<br /> criterias specified in Vietnamese pharamcopoeia V including: botanic characteristic, density, mass loss due to<br /> drying, water insoluble ash, total ash, insoluble ash in hydrochloric acid, sulfate ash, bioburdern, qualitative,<br /> quantitative. Herbal extract was quantified based on the main active ingredient, saponin, by HPLC (high-<br /> performance liquid chromatography). Althought there are various active ingredients in this extract, however, only<br /> acid glycyrrhizic must be quantified due to the monograph of Glycyrrhiza uralensis in Vietnamese<br /> pharmacopoeia. There is not quantification request yet for other herbal extract as described in Vietnamese<br /> pharmacopoeia.<br /> Results: The herbal extract was standardized according to Vietnamese pharmacopoeia V.<br /> Conclusion: This herbal extract was standardized that could be used as active ingredients to make the final<br /> pharmaceutical dosage form.<br /> Keywords: glycyrrhiza uralensis, platycodon grandiflorum, iris domestica, eleutherine bulbosa<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ Nguyên liệu, thiết bị<br /> Y học cổ truyền từ rất lâu đã có các bài thuốc Cao dược liệu được chiết từ sự phối hợp của<br /> từ dược liệu điều trị viêm họng hiệu quả, an 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ<br /> toàn, kinh tế. Trong số các dược liệu đó, có thể quạt, Sâm đại hành.<br /> kể đến Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại Nguồn gốc: Bộ môn Bào chế, khoa Y học cổ<br /> hành(3,4,5). Tuy nhiên, các bài thuốc này thường truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.<br /> được sử dụng riêng lẻ, bào chế theo các phương Acid glycyrrhizic chuẩn (Tinh khiết 97,3%,<br /> pháp truyền thống (ngâm, hầm, hãm, sắc), Ban NCKH - ĐHYD), petroleum ether (Trung<br /> không tiện cho việc sử dụng, không che được Quốc, TC USP30), cloroform (Trung Quốc, TC<br /> mùi vị khó chịu, khó bảo quản, hoạt chất không USP30), ethyl acetat (Trung Quốc, TC USP30),<br /> ổn định. Vì vậy, việc phối hợp các dược liệu acid acetic, n-butanol (Trung Quốc, TC USP30),<br /> dưới dạng cao chiết trong cùng một dạng bào anhydrid acetic (Trung Quốc, TC USP30), acid<br /> chế hiện đại, dễ sử dụng là một vấn đề đang sulfuric đậm đặc (Trung Quốc, TC USP30),<br /> được quan tâm. Hơn nũa, cùng với xu hướng methanol (Merck-Đức, TK cho HPLC),<br /> acetonitril (Merck-Đức, TK cho HPLC), acid<br /> thế giới quay trở về với thiên nhiên, tận dụng<br /> acetic (Merck-Đức, TK cho HPLC).<br /> nguồn dược liệu tự nhiên ưu đãi, kết hợp đông<br /> dược với công nghệ sản xuất tiên tiến, các dạng Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ), cân xác định<br /> bào chế hiện đại có nguồn gốc thảo dược mang độ ẩm Ohaus (Thụy Sĩ), lò nung Carbolite (Anh),<br /> máy HPLC Shimadzu (Nhật), máy quang phổ<br /> lại nhiều sự tiện lợi cho người sử dụng.<br /> UV Viber (Pháp).<br /> Xuất phát từ những thực tế nêu trên và<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> nhằm góp phần đáp ứng nhu cầu điều trị hiệu<br /> quả, đa dạng hóa sản phẩm, đề tài được thực Cao dược liệu hỗn hợp được chiết từ 4 loại<br /> hiện với mục tiêu là tiêu chuẩn hóa cao chiết hỗn dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt,<br /> hợp từ 4 dược liệu: Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ Sâm đại hành được Bộ môn Bào chế khoa Y học<br /> cổ truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> quạt, Sâm đại hành nhằm sử dụng cho việc bào<br /> cung cấp sẽ được tiêu chuẩn hóa dựa theo<br /> chế viên ngậm trị viêm họng.<br /> những chỉ tiêu được qui định trong dược điển<br /> ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Việt Nam (DĐVN) V gồm: cảm quan, tỉ trọng,<br /> Thiết kế nghiên cứu mất khối lượng do làm khô, cắn không tan trong<br /> Nghiên cứu thí nghiệm. nước, tro toàn phần, tro không tan trong acid<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 113<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> hydrocloric, tro sulfat, giới hạn nhiễm khuẩn, (pH=13). Đậy nắp 2 ống nghiệm và lắc với lực<br /> định tính, định lượng. Riêng định tính và định như nhau theo chiều dọc của ống trong 1 phút.<br /> lượng sẽ định tính và định lượng nhóm hoạt Để yên rồi quan sát chiều cao cột bọt của 2 ống<br /> chất chính là saponin. nghiệm. Nếu chiều cao cột bọt trong 2 ống tương<br /> Cảm quan đương nhau thì sơ bộ kết luận trong cao dược<br /> liệu có saponin nhóm triterpenoid.<br /> Chất lỏng sánh, màu nâu đen, có mùi đặc<br /> trưng, vị hơi đắng chát. Phản ứng Liebermann - Burchard<br /> Tỉ trọng Cân khoảng 2 g cao dược liệu cho vào bình<br /> lắng gạn và lắc với ether dầu hỏa (3 lần, mỗi lần<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 6.5.<br /> 20 ml). Gạn bỏ lớp ether, chuyển phần cao ra<br /> Mất khối lượng do làm khô bình nón, chiết bằng methanol (3 lần, mỗi lần 20<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.6. ml methanol). Gộp chung các dịch chiết, lọc qua<br /> Cắn không tan trong nước giấy. Cô cạn dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.10. 2 ml anhydrid acetic rồi thêm vào 2 ml<br /> cloroform. Thêm thật chậm 1-2 ml acid sulfuric<br /> Tro toàn phần<br /> đậm đặc theo thành ống nghiệm. Nếu xuất hiện<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.8.<br /> vòng ngăn cách có màu từ hồng đến đỏ tím, có<br /> Tro không tan trong acid hydrocloric thể sơ bộ kết luận trong cao dược liệu có chứa<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.7. saponin nhóm triterpenoid.<br /> Tro sulfat Sắc ký lớp mỏng<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.9. Phương pháp<br /> Giới hạn nhiễm khuẩn Phân tách các chất chiết được trong cao<br /> Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 13.6. thành ba phân đoạn có độ phân cực khác nhau,<br /> tiến hành sắc ký mỗi phân đoạn với một hệ<br /> Định tính saponin trong cao dược liệu<br /> dung môi khai triển, thực hiện song song và so<br /> Được thực hiện theo tài liệu(1,2,5).<br /> sánh với 2 dược liệu chuẩn là Cam thảo bắc và Cát<br /> Phản ứng tạo bọt cánh (Viện Y Dược học dân tộc TP. Hồ Chí Minh).<br /> Cân khoảng 0,5 g cao dược liệu cho vào<br /> Điều kiện sắc ký<br /> becher 100 ml. Thêm 20 ml nước cất, đun nóng<br /> Bản mỏng<br /> nhẹ trên bếp cách thủy, khuấy đều, lọc qua giấy<br /> lọc. Lấy khoảng 5 ml dịch lọc cho vào ống Silica gel F254 (3 x 12 cm).<br /> nghiệm 1,6 cm x 16 cm. Đậy nắp ống nghiệm và Hệ dung môi khai triển<br /> lắc mạnh theo chiều dọc của ống trong 1 phút. Hệ 1: CHCl3 - MeOH (9:1).<br /> Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt. Nếu có bọt Hệ 2: CHCl3 - MeOH (7:3).<br /> bền trong 15 phút, kết luận trong cao có saponin. Hệ 3: n-butanol - acid acetic - H2O (4:1:5).<br /> Phản ứng Fontan - Kaudel Thể tích chấm: 5 µl.<br /> Cân khoảng 0,5 g cao dược liệu cho vào<br /> Thuốc thử phát hiện<br /> becher 100 ml. Thêm 20 ml nước cất, đun nóng<br /> Thuốc thử vanillin – sulfuric.<br /> nhẹ trên bếp cách thủy, khuấy đều, lọc qua giấy<br /> lọc. Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 5 ml Chuẩn bị dung dịch thử<br /> dịch lọc. Sau đó, thêm vào ống nghiệm thứ nhất Cân 2 g cao dược liệu cho vào bình nón 100<br /> 5 ml acid hydrochloric 0,1 N (pH=1) và ống ml. Lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 20 ml,<br /> nghiệm thứ hai 5 ml natri hydroxyd 0,1 N gạn bỏ lớp ether. Chiết phần cao còn lại bằng<br /> <br /> <br /> <br /> 114 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> methanol 3 lần, mỗi lần 20 ml (đun 20 phút trên Định lượng saponin trong cao dược liệu<br /> bếp cách thủy, nhiệt độ 80°C). Định lượng saponin toàn phần bằng phương<br /> Gộp các dịch chiết methanol, cô cạn trên bếp pháp cân<br /> cách thủy rồi hòa tan cắn vào 20 ml nước cất. Nguyên tắc<br /> Chuyển vào bình lắng gạn rồi lắc với 20 ml<br /> Chiết saponin ra khỏi cao dược liệu bằng<br /> cloroform. Tách lấy lớp cloroform, đem chấm sắc<br /> methanol. Dựa vào khả năng kết tủa của<br /> ký với hệ dung môi khai triển 1.<br /> saponin với aceton để tách riêng saponin. Cân<br /> Lớp nước còn lại được lắc tiếp với 20 ml và tính hàm lượng saponin toàn phần trong<br /> ethyl acetat. Tách lấy lớp ethyl acetat, đem chấm cao dược liệu.<br /> sắc ký với hệ dung môi khai triển 2.<br /> Tiến hành<br /> Phần nước còn lại được cô đến cắn rồi hòa<br /> Cân chính xác khoảng 1 g cao dược liệu cho<br /> tan cắn vào trong 5 ml methanol để chấm sắc ký<br /> vào bình nón nút mài 100 ml. Lắc với ether dầu<br /> với hệ dung môi khai triển 3. hỏa (3 lần, mỗi lần 20 ml), gạn bỏ lớp ether. Chiết<br /> Chuẩn bị dung dịch đối chiếu cao với methanol (3 lần, mỗi lần 20 ml) ở 80°C,<br /> Cân 5 g mỗi dược liệu chuẩn Cam thảo bắc, trong 20 phút, thỉnh thoảng lắc đều, lọc qua<br /> Cát cánh đem chiết với methanol 3 lần, mỗi lần bông. Gộp toàn bộ dịch chiết, lọc qua giấy lọc.<br /> với 20 ml (đun 20 phút trên bếp cách thủy, nhiệt Dịch chiết được cô trên bếp cách thủy (ở 80°C)<br /> độ 80°C). đến khi còn khoảng 20 ml. Cho từ từ từng giọt<br /> dịch chiết cô đặc vào 1 becher chứa sẵn 100 ml<br /> Gộp các dịch chiết methanol, cô cạn trên bếp<br /> aceton, khuấy đều. Lọc lấy tủa, sấy khô đến khối<br /> cách thủy. Hòa tan cắn trong 5 ml methanol. lượng không đổi ở 105°C rồi đem cân.<br /> Tiến hành chấm sắc ký Hàm lượng saponin toàn phần được tính<br /> Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 ml mỗi theo công thức:<br /> dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển<br /> khai sắc ký cho đến khi dung môi cách mép trên<br /> của bản mỏng 1 cm thì lấy bản mỏng ra, để khô Trong đó:<br /> ở nhiệt độ phòng. X (%): hàm lượng saponin toàn phần.<br /> Lần lượt soi bản mỏng dưới đèn UV 254 nm P (g): lượng cao đã cân ban đầu.<br /> và UV 365 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử m (g): khối lượng tủa thu được.<br /> phải cho vết có cùng màu và cùng giá trị Rf với Định lượng acid glycyrrhizic trong cao dược<br /> các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. liệu bằng HPLC<br /> Cuối cùng là phun thuốc thử vanilin - Acid glycyrrhizic là hoạt chất chính của Cam<br /> sulfuric rồi hơ nhẹ bản mỏng trên bếp điện để thảo bắc, đại diện cho nhóm có tác dụng trị liệu<br /> của cao dược liệu, vì vậy chọn acid glycyrrhizic<br /> hiện rõ các vết. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử<br /> là chất chỉ điểm cho việc định lượng.<br /> phải cho vết có cùng màu và cùng giá trị Rf với<br /> các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Chuẩn bị mẫu<br /> Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 4,8<br /> Định tính acid glycyrrhizic trong cao dược liệu<br /> mg acid glycyrrhizic chuẩn (độ tinh khiết 97,3%)<br /> bằng phương pháp HPLC<br /> cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml<br /> Thời gian lưu của pic acid glycyrrhizic trên methanol, siêu âm 10 phút để nguội, thêm<br /> sắc ký đồ mẫu thử phải tương ứng với thời gian methanol đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc<br /> lưu trên sắc ký đồ acid glycyrrhizic chuẩn. 0,45 µm. Dung dịch chuẩn có nồng độ 46,8 µg/ml.<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 115<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 5,36 Điều kiện sắc ký<br /> g cao dược liệu cho vào bình định mức 50 ml, Pha động: Acid acetic-Acetonitril-Nước<br /> thêm 20 ml methanol, siêu âm 10 phút, thêm (3:41:59).<br /> methanol đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc Cột sắc ký: Phenomenex, C 18 (150 x 4,6 mm,<br /> 0,45 µm. 5 µm).<br /> Tiến hành chạy sắc ký hai dung dịch (dung Đầu dò: PDA, 285 nm.<br /> dịch thử và dung dịch chuẩn), mỗi dung dịch 3<br /> Tốc độ dòng: 1 ml/phút.<br /> lần, ghi nhận diện tích pic và lấy kết quả trung bình.<br /> Thể tích tiêm: 20 µl.<br /> Hàm lượng acid glycyrrhizic trong cao được<br /> tính theo công thức: Thẩm định qui trình định lượng acid<br /> glycyrrhizic bằng phương pháp HPLC<br /> X (%) = x Cc x x k x 100 Qui trình định lượng acid glycyrrhizic được<br /> Trong đó: thẩm định định về tính phù hợp hệ thống, độ<br /> X (%): hàm lượng acid glycyrrhizic trong cao đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng<br /> dược liệu. theo qui định chung.<br /> Sc: diện tích pic trung bình của mẫu chuẩn. KẾT QUẢ<br /> St: Diện tích pic trung bình của mẫu thử. Kết quả tổng hợp các thông số chỉ tiêu chất<br /> Cc: nồng độ của mẫu chuẩn. lượng của cao dược liệu về cảm quan, tỉ trọng,<br /> F: độ pha loãng của mẫu thử. mất khối lượng do làm khô, cắn không tan trong<br /> k: độ tinh khiết của chất chuẩn. nước, tro toàn phần, tro không tan trong acid<br /> hydrocloric, tro sulfat, giới hạn vi sinh, định tính,<br /> H: độ ẩm của cao dược liệu.<br /> định lượng được trình bày trong Bảng 1.<br /> m: khối lượng cao dược liệu.<br /> Bảng 1. Bảng tổng hợp kết quả các thông số chỉ tiêu chất lượng của cao dược liệu<br /> STT Thông số Kết quả đạt được<br /> Chất lỏng sánh, màu nâu đen, có mùi<br /> 1 Cảm quan<br /> đặc trưng, vị đắng chát<br /> 2 Tỉ trọng (n = 3) 1,267 ± 0,006<br /> 3 Mất khối lượng do làm khô (n = 3) 52,6 ± 0,79%<br /> 4 Cắn không tan trong nước (n =3) 2,84 ± 0,28%<br /> 5 Tro toàn phần (n = 3) 3,83 ± 0,2%<br /> 6 Tro không tan trong acid hydrocloric (n=3) 0,41 ± 0,012%<br /> 7 Tro sulfat (n = 3) 4,46 ± 0,25%<br /> Giới hạn vi sinh: Đạt<br /> - Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ≤ 5.104 cfu/g (ml)<br /> - Tổng số Enterobacteria: ≤ 500 cfu/g (ml)<br /> 8<br /> - Tổng số nấm mốc và men: ≤ 500 cfu/g (ml)<br /> - Không được có Salmonella trong 10g (ml), Escherichia coli, Pseudomonas<br /> aeruginosa, S.aureus trong 1g (ml)<br /> Định tính:<br /> - Saponin:<br /> +Phản ứng tạo bọt Dương tính<br /> +Phản ứng Fontan - Kaudel Dương tính<br /> 9 +Phản ứng Liebermann - Burchard Dương tính<br /> + Sắc ký lớp mỏng: trên sắc ký đồ, cao cho các vạch tương ứng với các vạch của Đúng<br /> dịch chiết Cam thảo bắc và Cát cánh chuẩn.<br /> - Acid glycyrrhizic: thời gian lưu của pic AG trên sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với Đúng<br /> thời gian lưu trên sắc ký đồ mẫu AG chuẩn.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 116 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> STT Thông số Kết quả đạt được<br /> Định lượng:<br /> 10 - Hàm lượng saponin toàn phần (n = 3) 9,13%<br /> - Hàm lượng acid glycyrrhizic (n = 3) 0,083%<br /> Kết quả định tính saponin bằng các phản ứng đến đỏ tím.<br /> (Hình 1) Vậy có thể kết luận trong cao dược liệu có<br /> Đối với phản ứng tạo bọt chứa saponin nhóm triterpenoid.<br /> Dung dịch sau khi lắc có bọt bền trong 15 phút. Kết quả định tính saponin bằng sắc ký lớp<br /> mỏng ở cả 3 phân đoạn ở bước sóng UV 254<br /> Đối với phản ứng Fontan - Kaudel<br /> nm, UV 365 nm và sau khi phun thuốc thử<br /> Sau khi lắc mạnh rồi đề yên trong 15 phút,<br /> Trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng (SKLM),<br /> cột bọt trong hai ống cao ngang nhau và bền<br /> mẫu cao cho các vạch tương ứng với các vạch<br /> như nhau.<br /> của dịch chiết Cam thảo bắc và Cát cánh chuẩn<br /> Đối với phản ứng Liebermann - Burchard (Hình 2).<br /> Xuất hiện vòng ngăn cách có màu từ hồng<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> A B C<br /> Hình 1. Kết quả định tính. A: phản ứng tạo bọt, B: phản ứng Fontan - Kaudel,<br /> C: phản ứng Liebermann – Burchard<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> A B C<br /> 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3<br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả SKLM với 1: Cam thảo bắc, 2: Cao dược liệu, 3: Cát cánh. A: SKLM phân đoạn trong cloroform<br /> ở bước sóng UV 254, UV 365 và sau khi phun thuốc thử. B: SKLM phân đoạn trong ethyl acetat ở bước sóng UV<br /> 254, UV 365 và sau khi phun thuốc thử. C: SKLM phân đoạn trong methanol ở bước sóng UV 254, UV 365 và<br /> sau khi phun thuốc thử<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 117<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> Thông số kỹ thuật của cao dược liệu<br /> Bảng 2. Thông số kỹ thuật cao dược liệu<br /> STT Chỉ tiêu Mức chất lượng đạt được<br /> 1 Cảm quan Chất lỏng sánh, màu nâu đen, có mùi đặc trưng, vị đắng chát<br /> 2 Tỉ trọng 1,264 - 1,276<br /> 3 Mất khối lượng do làm khô 51,5 - 53,5%<br /> 4 Cắn không tan trong nước 2,5 - 3,5 %<br /> 5 Tro toàn phần 3,5 - 4,2 %<br /> 6 Tro không tan trong HCl 0,4 - 0,45%<br /> 7 Tro sulfat 4 - 5%<br /> 4<br /> - Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ≤ 5.10 cfu/g (ml)<br /> - Tổng số Enterobacteria: ≤500 cfu/g (ml)<br /> 8 Giới hạn nhiễm khuẩn - Tổng số nấm mốc và men: ≤500 cfu/g (ml)<br /> - Không được có: Salmonella trong 10g (ml) Escherichia coli,<br /> Pseudomonas aeruginosa, S.aureus trong 1 g (ml)<br /> Định tính:<br /> - Saponin:<br /> +Phản ứng tạo bọt Dương tính<br /> +Phản ứng Fontan - Kaudel Dương tính<br /> 9 +Phản ứng Liebermann - Burchard Dương tính<br /> + Sắc ký lớp mỏng Trên sắc ký đồ, cao dược liệu cho các vạch tương ứng với các vạch<br /> của dịch chiết Cam thảo bắc và Cát cánh chuẩn<br /> - Định tính acid glycyrrhizic Thời gian lưu của pic AG trên sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời<br /> gian lưu trên sắc ký đồ AG chuẩn<br /> Định lượng:<br /> 10 - Hàm lượng saponin toàn phần 8-10%<br /> - Hàm lượng acid glycyrrhizic 0,080-0,087%<br /> Từ những kết quả nghiên cứu, thông số kỹ Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu giả định không<br /> thuật của cao được đề nghị như sau (Bảng 2). xuất hiện pic của acid glycyrrhizic.<br /> Kết quả thẩm định qui trình định lượng acid Sắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của acid<br /> glucyrrhizic bằng phương pháp HPLC glycyrrhizic có thời gian lưu tương ứng với<br /> thời gian lưu trên sắc ký đồ mẫu acid<br /> Tính phù hợp hệ thống<br /> glycyrrhizic chuẩn.<br /> Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống<br /> Vậy qui trình định lượng đạt độ đặc hiệu.<br /> được trình bày ở Bảng 3 cho thấy qui trình định<br /> lượng đạt tính phù hợp hệ thống.<br /> Độ tuyến tính<br /> Bảng 3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống Kết quả độ tuyến tính của phương pháp<br /> Lần bơm Thời gian Diện tích pic Hệ số bất Số đĩa lý<br /> được trình bày trong Bảng 4 cho thấy có sự<br /> lưu (phút) (mAu x phút) đối As thuyết N tương quan tuyến tính giữa nồng độ acid<br /> 1 9,70 158671 1,183 2208 glycyrrhizic và diện tích pic, phương trình hồi<br /> 2 9,69 152524 1,176 2197 qui có dạng ŷ = 7510,3 x (hệ số b không có ý<br /> 3 9,93 157457 1,150 2170<br /> nghĩa, p = 0,098 > 0,05).<br /> 4 10,02 155486 1,146 2199<br /> 5 9,98 152960 1,149 2167 Bảng 4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính<br /> 6 9,98 154150 1,135 2162 Mẫu 1 2 3 4 5<br /> TB 9,88 155208 1,157 2184 Nồng độ (µg/ml) 5,353 10,705 21,410 53,525 107,050<br /> RSD (%) 1,5 1,59 1,6 0,91 Diện tích pic 25363 61687 155598 373289 792938<br /> <br /> Độ đặc hiệu Độ chính xác<br /> Kết quả độ đặc hiệu được trình bày trong Kết quả định lượng 6 mẫu thử được trình<br /> Hình 3 cho thấy: bày trong Bảng 5 cho thấy qui trình định lượng<br /> <br /> <br /> <br /> 118 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> acid glycyrrhizic đạt độ chính xác. trong Bảng 6 cho thấy phương pháp đạt yêu cầu<br /> Độ đúng về độ đúng.<br /> Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> A B<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> C D<br /> Hình 3. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu: (A) mẫu trắng, (B) mẫu giả định, (C) mẫu chuẩn, (D) mẫu thử<br /> Bảng 5. Kết quả khảo sát độ chính xác<br /> Mẫu 1 2 3 4 5 6 TB RSD<br /> Diện tích pic 79980 79457 78856 79032 79238 78225<br /> Hàm lượng (mg) 0,1160 0,1164 0,1137 0,1131 0,1141 0,1152 0,1148 1,15<br /> Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng<br /> Mức khảo sát (%) Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg) Tỉ lệ phục hồi (%) Tỉ lệ phục hồi trung bình<br /> 2,28 2,259 99,08<br /> 80 2,29 2,277 99,43 100,02<br /> 2,30 2,335 101,54<br /> 2,70 2,733 101,22<br /> 100 2,71 2,756 101,70 101,56<br /> 2,68 2,727 101,75<br /> 3,29 3,299 100,27<br /> 120 3,33 3,347 100,51 100,30<br /> 3,30 3,304 100,12<br /> BÀN LUẬN lượng. Tuy nhiên, phương pháp định lượng<br /> Cao chiết của hỗn hợp 4 dược liệu được trong Dược điển Việt Nam V không thể áp dụng<br /> đánh giá các chỉ tiêu chung theo hướng dẫn cho cao chiết hỗn hợp nên chúng tôi đã xây<br /> trong Dược điển Việt Nam V. Các chỉ tiêu cảm dựng phương pháp định lượng bằng Sắc ký lỏng<br /> quan, tỉ trọng, cắn không tan trong nước, tro hiệu năng cao. Phương pháp định lượng acid<br /> toàn phần, tro sulfat, giới hạn nhiễm khuẩn là glycyrrhizic bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> các chỉ tiêu cần được yêu cần chung cho tất cả được xây dựng và thẩm định đạt các yêu cầu<br /> các chiết xuất dược liệu. Trong cao chiết hỗn hợp như tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ<br /> này, acid glycirrhizic là chất có tác động kháng lặp lại. Đối với các dược liệu còn lại, trong Dược<br /> viêm, kháng khuẩn và tăng sức đề kháng được điển Việt Nam V chỉ yêu cầu định tính bằng các<br /> qui định định lượng trong Dược điển Việt Nam phản ứng hoá học. Phản ứng định tính hoá học<br /> V nên được sử dụng là chất chỉ điểm trong định cho Rẻ quạt và Sâm đại hành bị nhiễu khi có sự<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 119<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> hiện diện của các dược liệu còn lại nên không TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> được thực hiện. Cũng vì lý do tương tự nên việc 1. Bộ Y tế (2005). Kiểm nghiệm dược phẩm. NXB Y học Hà Nội,<br /> khảo sát để chọn hệ dung môi chạy định tính pp.131-137.<br /> 2. Bộ Y tế (2019). Dược điển Việt Nam V. NXB Y học Hà Nội, PL-<br /> trên sắc ký bản mỏng cũng không thể tiến hành 1.20, PL-6.5, PL-9.6, PL-9.7, PL-9.8, PL-9.9, PL-11.3, PL-11.6, PL-<br /> với dược liệu Rẻ quạt và Sâm đại hành. 13.6.<br /> 3. He J, Chen L, Heber D, et al (2006). “Antibacterial compounds<br /> KẾT LUẬN from Glycyrrhiza uralensis”. Journal of Natural Products, 69:121-<br /> 124.<br /> Cao hỗn hợp được chiết từ 4 loại dược liệu<br /> 4. Maiti B, Nagori BP, Singh R, et al (2011). “Recent trends in<br /> gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt và Sâm đại herbal drugs: a review”. International Journal of Drug Research and<br /> hành đã được tiêu chuẩn hóa. Những thông số Technology, 1(1):17-25.<br /> 5. Ngô Văn Thu, Trần Hùng (2011). Dược liệu học, NXB Y học Hà<br /> kỹ thuật của cao đã được xác định. Cao đã được Nội, 1:205-211, 215-221, 227-231, 256, 424-425.<br /> dùng trong bào chế viên nén ngậm trị viêm họng 6. Ren P, Sun G (2008). “HPLC determination of glycyrrhizic acid<br /> (sẽ được công bố ở công trình khác). Phương and glycyrrhetic acid in Fuzilizhong Pills”. Asian Journal of<br /> Traditional Medicines, 3(3): 110-116.<br /> pháp HPLC định lượng acid glycyrrhizic trong<br /> cao cũng đã được xây dựng và thẩm định, Ngày nhận bài báo: 28/07/2019<br /> phương pháp đạt yêu cầu về tính phù hợp hệ Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019<br /> thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019<br /> và độ đúng.<br /> Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành<br /> cảm ơn ThS. Phạm Thị Hóa đã cung cấp cao<br /> dược liệu để thực hiện đề tài này.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 120 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br />