intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm Staphylococcus Aureus

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:8

176
lượt xem
14
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu Tiêu chuẩn kiểm nghiệm Staphylococcus Aureus trình bày lịch sử phát hiện Staphylococcus Aureus, phân bố, đặc điểm của Staphylococcus Aureus, đặc điểm sinh hoá, khả năng gây bệnh, ý nghĩa của việc kiểm tra vi khuẩn, môi trường và hóa chất, phân tích định tính Staphylococcus Aureus.

 

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm Staphylococcus Aureus

  1. 1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN STAPYLOCOCCUS AUREUS Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có mủ. Năm  1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu. 1.2. PHÂN BỐ Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như thịt, sữa… Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi. Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh. Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội (opportunist type) vì sự có mặt rộng rãi và   thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS Staphylococcus aureus  là vi khuẩn hiếu khí hay kị  khí tùy ý, hình cầu, gram  dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên   men và sinh acid từ  mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn  cảm với novobiocine, cả khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl.   Một số  dòng có khả  năng làm tan máu trên môi trường thạch máu. Đường kính vòng   tan máu phụ  thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ  hơn đường kính của khuẩn lạc.   Hầu hết các dòng đều tạo sắc tố vàng sau 1­2 ngày nuôi cấy  ở nhiệt độ  phòng. Hầu  hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ  trên  15oC, nhiều nhất khi tăng trưởng  ở  35­37oC. S. aureus phân bố  khắp nơi, nhưng chủ  yếu được phân lập từ  da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. S.aureus có  thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá   trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của  S.aureus trong thực phẩm  chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
  2. 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁ Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol, manitol Không lên men salicin, raffinose,inulin. Có khả năng chịu mặn cao Làm đông tụ sữa Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu. Phản ứng indol­,NH3­, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương. 1.6. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM: Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm đó và  bị ngộ độc. Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống trong thực phẩm mà chỉ  cần có độc tố của chúng. Loại này thường có tính chất cục bộ, ít có khả  năng truyền   nhiễm Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có vsv gây  bệnh. Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm đó bị ngộ  độc). Bản   chất   của   ngoại   độc   tố   là   protein   nên   chúng   kém   chịu   nhiệt   (trừ   độc   tố  của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu(tính kháng  nguyên mạnh) do vậy có thể  phát hiện được bằng phản  ứng kháng nguyên – kháng  thể. Độc tố  gây viêm dạ  dày, viêm ruột. Type A và D gây ngộ  độc thực phẩm cho   người.
  3. TRIỆU CHỨNG BỆNH: Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố  này, sau 30’­ 6h (phụ  thuộc vào cá   thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắt bụng, tiêu chảy,   nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng, đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn   tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72h, nạn nhân không chết nhưng rất đau đớn do  các phản ứng cực kỳ dữ dội. Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc. Là độc tố  bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố  này.  100oC/30’; 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp, nước súp   (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường  hay nhiễm loại vsv này. Con đường lây nhiễm chủ  yếu thông qua tiếp xúc từ  nhà bếp, quá trình chế  biến. BIỆN PHÁP PHÒNG NGỪA: Kiểm tra sức khoẻ công nhân. Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú. Trử lạnh thực phẩm 
  4. 2.1. Ý NGHĨA CỦA VIỆC KIỂM TRA VI KHUẨN Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh  và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết   tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 2.2 MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được đẻ  phân tích   định tính S.aureus hay trong định lượng bằng phương pháp MPN. Môi trường thạch máu: Máu được sử  dụng là máu cừu hay bê non dưới 5 tháng   tuổi đã được loại bỏ  các sợi máu hay máu đã được bổ  sung chát chống đông   citrate. Môi trường cần được pha chế ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm   tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ  trứng tươi và  potassium tellurite chỉ  được bổ  sung vào môi trường sau khi khử  trùng và làm  nguội đến khoảng 60oC. Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA) Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ  được cố  định bằng 0,1% EDTA hay sodium   oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ. 2.3 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH STAPHYLOCOCCUS AUREUS Cấy 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều   và  ủ   ở  37oC trong 24 giờ. Dung que cấy vòng ria dịch mẫu từ   ống (+) (môi trường   chuyển từ  màu đỏ  sang màu vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch   Baird Parker,  ủ  ở 37oC trong 24 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên môi 
  5. trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1­1,5mm có vòng sáng  chung quanh khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc  đặc trưng, cấy vào  ống môi trường đặc  trưng BHI, ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ. Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml   huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Thực hiện song song  một  ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là có  S.  aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) (có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống  đối chứng không có) 2.3.1. ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC ĐỒNG NHẤT MẪU VÀ PHA LOÃNG Cân chính xác 10 ± 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha  loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị  dãy pha loãng  thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một th ể  tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa. PHÂN LẬP MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC Cấy  0,1ml  mẫu  nguyên  hoặc   đã   pha   loãng  vào  đĩa   môi   trường   thạch  Baird   Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt  môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa cho môi trường thạch Baird   Parker cho mỗi độ  pha loãng. Thực hiện tương tự  với môi trường thạch máu. Lật  ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1oC trong 24­48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đổi  với môi trường thạch máu. Sau 24 giờ, khuẩn lạc  S.  aureus  trên môi trường thạch Baird Parker ó đường  kính khoảng 0,5­1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1­2mm bao quanh.   Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến  48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc  S. aureus có đường kính khoảng 1­1,5mm, màu đen bóng,  lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2­4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn  
  6. lạc một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn l ạc như trên.  Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc. Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ   ủ   S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng,  đục, lồi có màu xá hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1­2mm. Hầu hết  S. aureus có  vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. KHẲNG ĐỊNH Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng   từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1oC trong 24 giờ. Cấy  sinh khối vi khuẩn từ  môi trường TSA vào các  ống nghiệm chứa huyết tương đã rã   đông, ủ ở 37 ± 1oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời   gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ  lệ  khẳng định dựa trên số  khuẩn lạc đặc trưng và   không đặc trưng. Thực hiện tương tự  với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường  thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương được hình thành   (mọi mức độ  đông kết đều được xem là (+)). Kết quả  là (­) khi không có hình thành   khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. CÁCH TÍNH KẾT QUẢ Mật độ S. aureus trong mẫu được tính như sau: Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) =  F: độ pha loãng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số  khuẩn lạc đặc trưng
  7. Ha: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so   với số khuẩn lạc không đặc trưng 2.3.2. ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Phương pháp này dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ  S. aureus  thấp nhưng mật mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương   pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với ba độ  pha loãng   thập phân liên tiếp (ví dụ  10­1; 10­2; 10­3). Tuỳ  theo yêu cầu về  độ  chính xác của kết  quả  phân tích, có thể  sử  dụng phương pháp MPN với hệ  thống 9  ống nghiệm (3 độ  phoãng với 3 lần lặp lại  ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm ( 3 độ pha  loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng). Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa 10% muối  NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu  ở  độ  pha loãng khác nhau vào  ống 10ml môi trường,  ủ   ở  37oC trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để  tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong   48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để  thực hiện các   thử nghiệm khẳng định S. aureus tương tự  trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc.  Các đĩa cho kết quả  khẳng định  S. aureus  (+) được đối chiếu với các  ống nghiệm   trong hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi   độ  pha loãng. Tra bảng MPN để  suy ra mật độ   S. aureus trong mẫu (số  MPN/g hay  MPN/ml). Quy trình định lượng S. aureus được tóm tắt qua hình sau.
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2