Tiểu luận: Điện di trên polyacrylamide gel

Chia sẻ: Nguyễn Thuần | Ngày: | Loại File: PPTX | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

717
lượt xem 66
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài Điện di trên polyacrylamide gel gồm các nội dung chính: điện di là gì? Điện di trên polyacrylamide gel, cơ chế và ứng dụng điện di trên polyacrylamide gel.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận: Điện di trên polyacrylamide gel

SEMINA Chủ đề : Điện di trên polyacrylamide gel GVHD: TH.S Nguyễn Thị Vân Anh SVTH: Nguyễn Thị Thuần
1 Điện di là gì ? NỘI 2 Điện di Polyacrylamide gel DUNG 3 Cơ chế 4 Ứng dụng
1 Điện di là gì ? Điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis ) áp dụng trong sinh học phân tử Kĩ thuật này sử dụng một là một kĩ thuật để phân tích dung dịch đệm (buffer) để dẫn các phân tử DNA, RNA hay diện và tạo điện trường đều, protein dựa trên các đặc một bản gel (thường là agarose điểm vật lý của chúng như hay polyacrylamide) đóng vai kích thước, hình dạng hay trò là thể nền để phân tách các điểm đẳng điện tích phân tử, và các chất nhuộm (isoelectric point) khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Quá trình polymer II.1. Polyacrylamide gel là gì ? hóa được xúc tác bởi ammoniumpersulfate (APS),N,N,N’,N’- tetramethylethylenedia mine (TEMED). - Acrylamide là một đơn Gel polyacrylamide là gel phân tử có cấu trúc: được tạo thành do sự CH2=CH–CO–NH2 polymer hóa các đơn phân - Bis- tử acrylamide có cấu trúc: acrylamide và N,N’- CH2=CH–CO–NH–CH2– methylene-bis-acrylamide. NH–CO–CH=CH2.
Gel Agarose Gel Polyacrylamide v Tách các đoạn DNA có v Phân tách đoạn DNA có kích kích thước 0,5 – 20 Kb thước < 1000 cặp base v Điện di theo phương v Điện di theo phương thẳng nằm ngang đứng v Phân giải thay đổi khi v Độ phân giải cao và ít thay nồng độ Agarose hay loại đổi có thể phân biệt được Agarose thay đổi những đoạn chỉ cách nhau 1 v Bước chuẩn bị đơn giản nucleotide v Bước chuẩn bị phức tạp hơn phương pháp sử dụng NGUYÊN TẮC: Dựa vào đặc Agarose tính tích điện, tốc độ di chuyển khác nhau của các Tách riêng biệt theo khả năng phân tử ion hay các tiểu di động trong trường điện từ phần protein trong trường về 2 cực âm và dương điện
Nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại nếu nồng độ gel cao sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ, cho phép phân tách các phân t ử sinh học có kích thước nhỏ Kích thước của lỗ gel Sự dịch chuyển Của các Điện tích của phân phân tử cần phân tách tử trên gel Các phân tử tích điện âm Điện trường sẽ di chuyển về cực dương
2 Điện di Polyacrylamide gel 1. Nguyên tắc điện di trên polyacrylamide Dùng dể phân tách các đoạn phân tử DNA, RNA và Gel có thể dài Có thể đúc bản DNA/RNA từ 10 – 100 cm gel ở các nồng Gel phải được tùy thuộc vào độ khác nhau đặt giữa 2 tấm yêu cầu phân của kính ngăn cách tích và chúng polyacrylamide bởi miếng đệm thường chạy từ 3,5% - 20% trong phương tùy thuộc vào ( gel spacers) thẳng đứng kích thước để ngăn cho phân tử protein polyacrylamide hoặc DNA không tiếp xúc quan tâm
1. Nguyên tắc điện di trên polyacrylamide Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên k ết có thể đ ược đi ều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Mức độ liên kết chéo Độ xốp của gel Chiều dài chuỗi Nồng độ acrylamide
3 Cơ chế loại gel hay được sử dụng nhất v Phân tich và thu ́ hồi cac đoan DNA ́ ̣ - Polyacrylamide gel có chiều dài từ 5- không biên tinh dung để ́ ́ ̀ 2.000 bp. phân tách và tinh sạch các ̣ Hai loai v Nồng độ đoan DNA sợi đôi ̣ polyacrylamid polyacrylamide gel e gel thường được sử dụng được sử dung ̣ trong khoảng từ ́ - Polyacrylamide gel biên ̀ la: 3,5-20% tùy thuộc tinh bằng urea và ́ vào kích thước formamide dung để phân ̀ của đoạn DNA tách và tinh sach cac đoan ̣ ́ ̣ quan tâm DNA sợi đơn Hiêu quả của sự phân tách DNA trong loại gel ̣ Khi nồng độ acrylamide cao thì hiệu quả phân tích nucleotide càng này phụ thuôc vào nông độ cua acrylamide, ̣ ̀ ̉ thấp kích thước và điện tích của DNA
Phương pháp điên di ̣ polyacrylamide gel không biến tính Lau sạch 2 tấm Chuẩn bị kính dùng làm Chuẩn bị dung polyacrylamide khuôn gel avà dịch không biến tính miếng đệm Rót dung dịch gel Nối buồng điện vào giữa 2 tấm di với bộ nguồn kính. Rồi gắn lược vào Trộn mẫu DNA Rút lược, tháo với lượng thích băng, gắn khuôn hợp của đệm, gel vào buồn đặt mẫu vào điện di bằng giếng đệm 1*TBE
̣ 2. Phát hiên DNA trong polyacrylamide gel ̣ ̀ Nhuôm băng ethidium bromide tránh tạo ra bọt khí ̣ ́ ́ hoăc nêp gâp cua ̉ Saran wrap Lây gel và tấm ́ kính đỡ raThâm ́ Phủ lên bề khô bề măt gel ̣ mặt gel bằng giây thâm ́ ́ bằng giấy Kimwipe nylon (Saran wrap) Polyacrylamide có thể lam mât huynh quang ̀ ́ ̀ Quan sát và cua EtBr, do đó không thể phat hiên cac ̉ ́ ̣ ́ chụp ảnh băng DNA băng phương phap nay nêu ham ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ trên may soi lượng cua nó thâp hơn 10 g. ̉ ́ tử ngoai.̣
Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc Ø Cho phép phát 1) Dùng các dung dịch hiện một lượng diamine silver cho thấm protein ở dạng vào gel và pha loãng các vết trong dung dịch acid của polyacrylamide formaldehyde Hai phương gel và một pháp nhuộm lượng nhỏ bạc thường nucleic acid (pg) được sử dụng 2) Thấm dung dịch silver Ø nhạy gấp là nitrate vào gel trong môi 1.000-10.000 trường acid yếu và dùng lần phương formaldehyde khử có chọn pháp nhuộm lọc các ion bạc thành bạc bằng EtBr kim loại dưới điều kiện kiềm Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng
Các bước nhộm bằng bạc Cố định nucleic acid Rửa gel trong nước Nhuộm gel trong dung trong acetic acid 7,5% khử ion tối thiểu 2 dịch bạc với sự có tối thiểu 5 phút phút mặt của formaldehyde Dùng acetic acid lạnh 7,5%. Để dừng Rửa gel sau khi Phát triển màu của p/ư phất triển màu nhuộm bạc gel thu hình ảnh càng nhanh càng tốt
Phóng xạ tự ghi Cố định nucleic acid Tiến hành rửa gel trong acetic acid 7,5% trong nước khử ion Ủ phim phóng xạ Dùng giấy thấm Kimwipe khoảng 24h. Quan để thấm khô bê ̀mặt gel sát kết quả.
Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel Chạy điện di Ly tâm 12.000 vòng/phút polyacrylamide gel ở 4ºC, lấy thể nổi Xác định vị trí DNA Kết tủa DNA bằng ethanol ở 4ºC trong 30ph Cắt băng DNA ra khỏi gel, chuyển vào eppendorf tube Ly tâm 12.000 vòng trong 10ph ở 4ºC để thu hồi Bổ sung đệm chiết DNA ủ ở 37ºC kèm lắc nhẹ
4 Ứng dụng β-galactosidase là enzym xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β1,4 D galactosidase trong đường lactose thành glucose và β- galactose Sản xuất được enzym này và giúp cho các sản Quá trình phẩm sữa dễ tiêu hóa Nghiên cứu biểu hiện β- thực hiện (nhất là người trong hệ galactosidase trong E.coli tiêu hóa của họ thiếu BL21 loại enzym này) Chèn gen đã tinh sạch vào vector Biểu hiện được biểu hiện Nạp vào tế protein này ở pET bào nhiệt độ và pH Tinh sạch E.coli BL21 thích hợp sau khi vector tái tổ cảm ứng với h ợp IPGT
Các bước cụ thể Chủng vsv tái tổ Phản ứng gắn sản h ợp Khuếch đại phẩm PCA từ Baccillus subtilis bằng PCA vector tạo dòng vào G1, vector vector biểu hiện pET22b (+) Điện di biến tính Được nhuộm trên bằng Coomassie Biến nạp vector polyacrylamide Brillliant Blue biểu hiện vào E.coli gel 12,5 % theo trong 3 giờ BL21 Laemmli(1970) Rửa với dung dịch 30% (v/v) metanol +10%(v/v)acid Điện di SDS Nuôi cấy E.coli axetic cho đến khi có màu trên BL21 và biểu trong còn băng protein có polyacrylamide hiện màu xanh gel