Tìm môi trường thay thế Mrs Broth để tăng sinh Lactobacillus plantarum L5 ứng dụng trong sản xuất banh mì bột chua

Chia sẻ: Lý Mân Hạo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết này nêu lên chủng Lactobacillus plantarum L5 được phân lập từ nem chua có hoạt tính protease và lên men đường lactose, kháng nấm Aspergillus in vitro được sử dụng để sản xuất giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên men với nấm men để sản xuất bánh mì bột chua. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tìm môi trường thay thế Mrs Broth để tăng sinh Lactobacillus plantarum L5 ứng dụng trong sản xuất banh mì bột chua

TÌM MÔI T Ư NG THAY THẾ MRS BROTH ĐỂ TĂNG SINH LACTOBACILLUS PLANTARUM L5 ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BÁNH MÌ BỘT CHUA Huỳnh Thị Yến*, Võ Ngọc Huy n, Hồ Lý Hải Vân, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Lê Nguyễn Bích Hi n Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Chủng Lactobacillus plantarum L5 được phân lập từ nem chua có hoạt tính protease và lên men đường lactose, kháng nấm Aspergillus in vitro được sử dụng để sản xuất giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên men với nấm men để sản xuất bánh mì bột chua. Sinh khối tạo thành trong môi trường sữa gầy hoàn nguyên bổ sung glucose, K2HPO4 và MnSO4 cao hơn hẳn khi nuôi cấy trong môi trường MRS. Tăng nồng độ glucose từ 2,0 đến 20,0g/l không làm tăng sinh khối nhưng làm tăng nồng độ acid tổng sau khi lên men 24 giờ và 48 giờ. Hoạt tính protease và khả năng kháng nấm Aspergillus sp. khi nuôi cấy trong môi trường sữa gầy cũng cao hơn so với khi nuôi cấy trong MRS sau 24 giờ. Sử dụng dịch nuôi cấy L. plantarum L5 đồng lên men nấm men thu được bánh mì có thời gian bảo quản là 6 ngày dài hơn bảo quản bằng Canxi propionate và Natri benzoate chỉ được 4 ngày. Sau khi nướng mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 trong bánh mì là 109 cfu/g tăng lên 1010 cfu/g sau 5 ngày bảo quản. Từ khóa: Acid tổng, bánh mì bột chua, lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum L5), sinh khối, ức chế nấm. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm mốc là nguyên nhân chính gây hư hỏng bánh mì. Thông thường, các công ty sản xuất bổ sung chất bảo quản để kéo dài thời gian bảo quản như benzoate natri và canxi propionate. Các chất này thể hiện nguy cơ gây tính kháng và ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe [1]. Bánh mì làm từ bột chua là phương pháp cải thiện cảm quan và kéo dài thời gian bảo quản truyền thống ở châu Âu, trong đó tác nhân chính là vi khuẩn lên men Lactobacillus plantarum L5 [2]. Lactobacillus plantarum L5 có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và thường được coi là an toàn (GRAS) [1]. Phân lập, tuyển chọn Lactobacillus plantarum L5 từ bột chua hoặc thực phẩm lên men truyền thống dựa vào hoạt tính kháng nấm [2], [3], [4] là ước đầu để sản xuất giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên men với nấm men nhằm kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì. Tuy nhiên môi trường lên men thu sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 còn phụ thuộc vào từng chủng, đó chính là nội dung của nghiên cứu này. 314
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng Lactobacillus plantarum L5 được phân lập từ nem chua do PTN Viện Khoa học Ứng dụng Hutech cung cấp. Nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae được mua của nhà sản xuất Saf- Instant, natri benzoate được mua từ nhà sản xuất Guangdong Guanghua Sci-tech Co., Ltd và canxi propionate từ nhà sản xuất Melbourne Food Ingredient Depot và bột mì số 11 là bột mì thông dụng. 2.2 Phương pháp 2.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 Giữ giống vi khuẩn trên MRS Agar. Nhân giống vi khuẩn bằng cách nuôi cấy L. plantarum L5 trong MRS Broth 37oC, 24 giờ. 2.2.2 Chọn môi trường thu sinh khối Môi trường lên men: Đối chứng là môi trường MRS, các môi trường SG0, SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6, SG7: Môi trường được pha từ sữa gầy hoàn nguyên, bổ sung: K2HPO4 0,3%, MnSO4 0,014% và Glucose 2,0 g/L; 2,5; 5,0; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 và 20 g/L. Môi trường lên men sau tiệt trùng được cấy mật độ giống 106 cfu/ml điều chỉnh dựa vào đường chuẩn tế bào. Lên men ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/ phút. Sau 24-48 giờ mang huyền phù đo OD 600 nm, so với đường chuẩn để tính mật độ tế bào. 2.2.3 Xác định sinh khối Xây dựng đường chuẩn tế bào trên môi trường MRS và môi trường sữa gầy SG0. Chủng Lactobacillus plantarum L5 được nuôi cấy trong 2 môi trường MRS và SG0 như trên, được đo OD 600 nm và trải đ a trên MRS Agar đồng thời từ một huyền phù vi khuẩn, ủ 37 oC, 2 ngày, đếm khuẩn lạc. Đường chuẩn là đồ thị biểu diễn OD 600 nm phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn cfu/ml. 2.2.4 Xác định acid tổng Dịch lên men sau 24 giờ hoặc 48 giờ được hút 10 ml, ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút thu dịch, chuẩn độ bằng NaOH 0.1N với thuốc thử là phenolphthalein đến khi dung dịch có màu hồng nhạt, pH = 8,2 – 8,3. Acid tổng được tính quy ra % acid Lactobacillus plantarum L5. 2.2.5 Khảo sát hoạt tính ức chế nấm A.niger in vitro Cách phân lập nấm mốc Aspergillus niger từ bánh mì: Mua bánh mì ở tiệm bánh về và xịt phun nước tạo độ ấm, bỏ bánh mì vào bọc hoặc hũ nhựa 5-7 ngày. Thu mẫu mốc có tơ trắng và bào tử đen. Sau đó dùng que cấy vòng lấy trực tiếp mẫu mốc cấy vào môi trường PDA để nuôi mốc. Bằng phương pháp phòng ẩm soi nấm dưới kính hiển vi. Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến. Chủng nấm Aspergillus niger được đục từ môi trường PDA đã cấy trước đó 3 ngày và đặt vào tâm đ a, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Dùng que cấy vòng cấy 2 vạch vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 đã được tăng sinh 24 giờ trong MRS Broth cách mép đ a 1,5 cm (2 315
vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đ a trên cùng một đường kính). Đ a đối chứng âm không ria vi khuẩn. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37 oC trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỷ lệ kháng nấm. 2.2.6 Làm bánh mì bột chua Mỗi mẻ bột nhào được chuẩn bị từ 250 g bột mì số 11, 35 g Sucrose, 2.5g NaCl, 25 g trứng, 135 ml huyền phù vi khuẩn Lactobacillus planterum L5 nuôi trong môi trường sữa gầy, 15g ơ động vật và 3 g nấm men bánh mì (107 cfu/g bột). Bột nhào được khuấy trộn trong máy trộn bột vận tốc 1000 vòng/phút trong 13 phút, sau đó để bột nghỉ 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó được chia thành từng phần khối lượng 50 g và dạng hình cầu, lên men thời gian nhất định ở 40 oC. Nướng được thực hiện trong lò với nhiệt độ được điều chỉnh và kiểm soát trong 13 phút, sau đó bánh mì được làm nguội ở nhiệt độ phòng và đem phân tích. 2.2.7 Khảo sát vi khuẩn lên men Lactobacillus plantarum L5 trong bánh mì bột chua sản xuất khi đồng lên men vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 với nấm men Xử lý mẫu bánh mì phân tích vi sinh Cân 10 g bánh mì sau nướng và bảo quản sau 5 ngày (bảo quản bánh mì trong túi polyethylene đã xử lý cồn). Đồng nhất mẫu trong 90ml môi trường Buffered pepton water. Pha loãng theo dãy thập phân 10-6, 10-7, 10-8 bằng môi trường Buffered pepton water. Sử dụng môi trường PCA áp dụng phương pháp đỗ đ a cấy trang cho chỉ tiêu TPC. Hút 0.1ml của từng nồng độ 10-6, 10-7, 10-8 trang trên môi trường PCA. Ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 72 giờ. Khảo sát tổng nấm mốc phân tích sau 5 ngày Sử dụng môi trường DG 18 bổ sung Acid Tartric chuẩn pH bằng 3.5. Đồng nhất 10g bánh mì sau nướng bằng cách bổ sung 90ml Buffered pepton water (sử dụng chung với test chỉ tiêu TPC) sẽ được 10-1. Hút 0.3 ml mẫu bánh mì đã đồng nhất 10-1 trang trên môi trường DG 18. Sau 5 ngày mẫu bánh mì được đồng nhất bằng 90 ml Buffered pepton water. Pha loãng theo dãy thập phân 10-2. Hút 0.1ml trang trên môi trường DG 18. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Định lượng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 từ bánh mì bột chua Cân 10 g bánh mì sau nướng và bảo quản sau 5 ngày (bảo quản bánh mì trong túi polyethylene đã xử lý cồn (sử dụng chung với test chỉ tiêu TPC). Đồng nhất mẫu trong 90 ml môi trường Buffered pepton water. Pha loãng theo dãy thập phân 10-6, 10-7, 10-8 bằng môi trường Buffered pepton water. Sử dụng môi trường MRS Agar bổ sung Bromocresol Purple đỗ đ a. Hút 0.1 ml của từng nồng độ 10-6, 10-7, 10-8 trang trên môi trường MRS Agar bổ sung Bromocresol Purple. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 – 72 giờ. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần. 316
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hình thái vi khuẩn Chủng L.plantarum L5 là vi khuẩn lên men Lactobacillus plantarum L5 có khuẩn lạc trên MRS Agar: Tròn, to, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục, rìa tròn. Đây là vi khuẩn hình que ngắn, gram dương, không sinh bào tử, không di động, catalase âm tính. Hình 1: Hình thái khuẩn lạc (a), tế bào vi khuẩn (b) chủng Lactobacillus plantarum L5 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường lên mật độ Lactobacillus plantarum L5 và acid tổng trong dịch lên men Bảng 1: Mật độ, Acid tổng và khả năng phân giải protein của Lactobacillus plantarum L5 nuôi cấy trong các môi trường Môi trường mật độ (cfu/ml ) %TA Đường kính vòng phân giải Protein (D-d), mm MRS 3,8 x 109 1,25 - SG0 1,3 x 1010 0,38 6,5 SG1 1,1 x 1010 0,36 8,5 SG2 1,4 x 1010 0,47 7,5 9 SG3 7,8 x 10 0,54 8,3 SG4 1,4 x 1010 0,74 12,0 SG5 1,1 x 1010 0,73 6,7 SG6 1,3 x 1010 0,82 13,3 SG7 1,4 x 1010 0,87 11,0 Mật độ tế bào trong môi trường MRS sau 24 giờ tăng sinh là 3 x 109 cfu/ml, trong khi đó ở môi trường sữa gầy SG0 là 1,31 x 1010 cfu/ml. Khi tăng nồng độ đường glucose trong môi trường sữa gầy lên từ từ qua các mức từ 2,0 g/L lên 2,5; 5,0; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 và 20 g/L (bằng nồng độ đường trong môi trường MRS thì mật độ tế bào không tăng, thậm chí giảm. L. plantarum L5 được báo cáo trước đó là có khả năng lên men đường lactose, nên có thể sử dụng đường lactose trong môi trường sữa gầy là xấp xỉ 48 g/L (Hình 2). 317
Hình 2: Mật độ tế bào trong môi trường MRS và SG có hàm lượng đường tăng dần Nồng độ đường trong thành phần SG tăng dẫn đến pH dịch lên men giảm dần và đồng thời giá trị Acid tổng tăng (Hình 3). Hoạt tính kháng nấm đóng vai trò quan trọng giúp chọn môi trường lên men thu giống khởi động Lactobacillus plantarum L5 đồng lên me với nấm men làm nổi bột nhào. Hình 3: Acid tổng và pH dịch lên men trên 8 môi trường Sữa Gầy có hàm lượng đường tăng dần 3.3 Phân lập nấm mốc từ bánh mì bị mốc Mốc có bào tử màu đen, hình thái dưới kính hiển vi cho thấy bào tử đ nh đặc trưng cho chi Aspergillus, có thể là Aspergillus niger . 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường lên khả năng ức chế nấm mốc Vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 được nuôi cấy trong môi trường Sữa Gầy có khả năng kháng nấm cao hơn trong môi trường MRS (Hình 4). Cần khảo sát thêm hoạt tính kháng nấm mốc khi sử dụng môi trường lên men với nồng độ glucose khác nhau. Hình 4: Khả năng kháng nấm chủng L5 trên môi trường MRS và SG0 318
3.5 Định lượng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 của bánh mì sau khi nướng và sau bảo quản Vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 là tác nhân bảo quản nhờ khả năng ức chế nấm mốc. Bảng 2: Mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 trong bánh mì sau nướng và sau bảo quản 5 ngày ở nhiệt độ phòng trong bao polyethylene Chủng Lactobacillus sp.L5 sau nướng Lactobacillus sp.L5 sau 5 ngày bảo quản Trung bình 1,84×109 cfu/g 41⨯1010 cfu/g Như vậy, vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 vẫn còn sống sót trong bánh mì và tăng sinh khối từ 109 cfu/g lên 1010 cfu/g. 3.6 Khảo sát thời gian bảo quản bánh mì Bảng 3: Thời gian bánh mì không mọc tơ nấm Bánh mì ật độ (cfu/g) Nhiễm nấm (ngày) BML5 106 5-6 ngày BMCaP - 4 ngày BMNaB - 4 ngày Chú thích: BML5: Bánh mì bổ sung L. plantarum L5 – BMNaB: Bánh mì bổ sung Natri benzoate – BMCaP: Bánh mì bổ sung Canxi propionate. Bánh mì có bổ sung khuẩn L. plantarum L5 có thời gian bảo quản lâu hơn so với bánh mì bổ sung chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate từ 1 đến 2 ngày. 4 KẾT LUẬN Chủng Lactobacillus sp.L5 thể hiện hoạt tính kháng nấm in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MRS và sữa gầy. Môi trường sữa gầy bổ sung glucose từ 2.0 – 20 g/L khi nồng độ glucose càng tăng thì nồng độ acid tổng càng giảm, tương đương pH càng cao nhưng acid tổng vẫn thấp hơn khi nuôi cấy trong môi trường MRS. Ngược lại, sinh khối thu được trong môi trường MRS lại thấp hơn nhiều (22%) so với sinh khối thu được trong môi trường sữa gầy. Tăng nồng độ đường glucose không làm tăng sinh khối. Bánh mì sản xuất từ việc sử dụng dịch nuôi cấy L5 trong môi trường sữa gầy đồng thời lên men với nấm men chứa mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 cao 109 cfu/g sau nướng, tăng lên 1010 cfu/g sau 5 ngày bảo quản có thể là lý do kéo dài thời gian bảo quản bánh mì Lactobacillus plantarum L5 so với bánh mì bảo quản bằng hóa chất 1-2 ngày. Các nghiên cứu đang được hoàn thiện. 319
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari (2013). Chapter 6 "Lactic Acid Bacteria in Biopreservation and the Enhancement of the Functional Quality of Bread" in Lactic Acid Bacteria - R & D for Food, Health and Livestock Purposes., pp: 155-172. [2] Hassan, Y. I. and Bullerman, L. B. (2008). Antifungal activity of Lactobacillus paracasei ssp. tolerans isolated from a sourdough bread culture. International Journal of Food Microbiology, 121: 112-115. [3] Magnusson, J., K. Strom, S. Roos, J. Sjogren, and J. Schnurer. 2003. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. Fems Microbiology Letters 219(1):129-135. [4] Sjogren, J., J. Magnusson, A. Broberg, J. Schnurer, and L. Kenne. (2003). Antifungal 3-Hydrôxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Appl. Environ. Microbiol. 69(12):7554-755. 320