Tinh sạch protein (p-1)

Chia sẻ: Nguyen Phuonganh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:20

Thêm vào BST

Báo xấu

208
lượt xem 86
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tinh sạch protein (p-1)

Tinh sạch protein (p-1) Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với
những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. I. Giới thiệu chung Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau: 1. Nhận biết protein mục tiêu 2. Ly trích protein từ tế bào 3. Thu nhận protein mục tiêu dựa
trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực 4. Phân tách protein bằng điện di trên gel 5. Xác định trọng lượng và khối lượng của protein II. Nhận biết protein mục tiêu Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để
xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào. Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể
đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2
thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng. III. Ly trích protein từ tế bào Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta cần phân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiều protein
mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sự mày mò qua từng thí nghiệm. Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơn lắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau
khi đã qua thử nghiệm hoạt tính. Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả. lực
Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein tích điện âm
cũng ion dương tương tác với nó (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein . Xác định khối lượng của protein Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để phân tích trong hóa học hữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên, cho đến gần đây, khả năng bay hơi quá thấp của protein
đã làm mất tác dụng của phép ghi phổ khối lượng trong việc nghiên cứu các phân tử này. Khó khăn này đã được khắc phục khi có những kỹ thuật chuyển protein và những đại phân tử khác thành dạng khí được đưa vào ứng dụng là matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) và electrospray spectrometry. Ở đây tập trung vào kỹ thuật MALDI. Trong kỹ thuật này, những ion protein được phóng ra và sau đó được tăng tốc qua một điện trường. Những ion này sẽ di chuyển qua một đường ống dài được hút chân không (flight tube), ion nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanh
nhất và đến đầu đọc trước nhất. Vì vậy, dựa vào thời gian bay (time of flight - TOF) trong điện trường ta có thể biết khối lượng của protein (hay chính xác hơn là tỉ lệ giữa khối lượng với điện tích). Với một lượng nhỏ phân tử sinh học, dù nhỏ đến khoảng vài picomole đến vài femtomole, vẫn có thể phân tích được với cách này. Một máy phổ ghi khối lượng dạng MALDI-TOF dược dùng phân tích hỗn hợp insulin và β- lactoglobulin. kết quả khối lượng của 2 protein này lần lượt là 5733.9 và 18,364, so với kết quả tính toán la 5733.5 và 18,388. Thí nghiệm này cho thấy MALDI-
TOF thật sự là một kỹ thuật chính xác để xác định khối lượng protein. Kỹ thuật này còn được ứng dụng trong việc xác định dựa vào khối lượng của peptide (peptide mass fingerprinting). kỹ thuật này đã mở rộng khả năng ứng dụng của điện di hai chiều. Mẫu cần nghiên cứu được chiết và phân ra một cách riêng biệt bằng các phương pháp hóa học hay enzyme học. Khối lượng của các phân đoạn protein được xác định bằng phương pháp khối phổ. Cuối cùng, khối lượng của peptide được so với những số liệu đã có được tính trên máy vi tính. Kỹ thuật này cho kết quả khá tốt.
Ví dụ, trong số 150 protein của nấm men được phân tách bằng điện di 2 chiều, kỹ thuật này đã giúp xác định được 80% protein. Siêu ly tâm Siêu ly tâm không chỉ là một phương pháp có thể phân tách một hỗn hợp thô các thành phần của tế bào mà còn rất hiệu quả trong việc phân tách và phân tích những phân tử sinh học. Với phương pháp này, chúng ta không chỉ xác định được khối lượng và tỉ trọng mà còn biết được cả hình dạng của một phân tử cũng như phân tích những tương tác giữa
các phân tử. Để có được những điểm này, chúng ta cần một diễn tả một cách toán học là một phân tử bị tác động bởi lực ly tâm như thế nào. Dưới tác động của lực ly tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua một môi trường lỏng. Để biết được tốc độ di chuyển của phân tử ta cần phải tính hệ số lắng (s) theo công thức với m là khối lượng phân tử, v là thể tích từng phần (nghịch đảo của tỉ trọng phân tử), p là tỉ trọng của môi trường và f là hằng số lắng thường được biểu hiện là đơn vị Svedberg (S) bằng 10-3 s. Giá trị S càng nhỏ, phân tử di chuyển càng chậm.
Vận tốc lắng của một phân tử phụ thuộc vào khối lượng của nó. Một phân tử có cùng hình dạng cũng như tỉ trọng với các phân tử khác nhưng nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn Hình dạng cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt. Hệ số ma sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng có cùng khối lượng. Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những phân tử hình cầu dù chúng có cùng khối lượng. Một phân tử đặc di chuyển mau
hơn một phân tử ít đặc hơn bởi vì nghịch đảo của lực đẩy đối với phân tử đặc nhỏ hơn. Vận tốc lắng còn phụ thuộc vào tỉ trọng của dung dịch (p). các phân tử lằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và không di chuyển khi p = 1. Một kỹ thuật tách protein dựa vào hệ số lắng khác nhau của các protein là kỹ thuật ly tâm phân đoạn. đầu tiên là tạo khuynh độ tỉ trọng trong một ống ly tâm bằng cách trộn 2 dung dịch có tỉ trọng khác nhau, một có tỉ trọng cao, một có tỉ trọng thấp. Ví dụ, hỗn hợp sucrose 20% và sucrose 5%
có khuynh độ tỉ trọng từ 5% ở phía trên đến 20% ở đáy tube. một lượng nhỏ dung dịch hổn hợp protein được nạp vào phía trên của khuynh độ về tỉ trọng. khi máy quay, protein sẽ di chuyển theo khuynh độ và tách ra dựa trên hệ số lắng của chúng. thời gian và tốc độ ly tâm có được qua thực nghiệm. Ta tạo một lỗ ở đáy ống ly tâm để thu nhận các phân đoạn của protein. Khối lượng protein được xác định trực tiếp bằng trạng thái lắng cân bằng có nghĩa là mẫu được ly tâm ở vận tốc thấp đủ để sự lắng cân bằng với sự khuếch tán. kỹ thuật
này xác định khối lượng protein rất chính xác và có thể sử dụng cho protein không qua biến tính vì vậy cấu trúc bậc bốn của protein vẫn được bảo tồn. Đây là điểm lợi thế của phương pháp này so với SDS-PAGE, chỉ định được khối lượng của protein khi đã bị biến tính. Với hai phương pháp này, SDS-PAGE cho ta biết khối lượng từng đơn phân, siêu ly tâm phân đoạn cho ta biết khối lượng của dạng đa phân, ta có thể kết hợp để biết có bao nhiêu đơn phân trong một protein đa phân.