Tối ưu hóa quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch với dấu ấn NUT (C52B1)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày carcinôm có biểu hiện protein nhân trong tinh hoàn (carcinôm NUT) là tân sinh biểu mô ác tính hiếm gặp, đặc trưng bởi đột biến tái sắp xếp gen NUTM1. Chẩn đoán và phát hiện carcinôm NUT là một thách thức đối với bác sĩ giải phẫu bệnh, nhất thiết phải có bằng chứng trực tiếp xác định đột biến tái tổ hợp gen NUTM1 bằng các kĩ thuật sinh học phân tử hoặc gián tiếp thông qua biểu hiện protein trên hóa mô miễn dịch.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tối ưu hóa quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch với dấu ấn NUT (C52B1)

HỘI THẢO KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU BỆNH CÁC TỈNH PHÍA NAM LẦN THỨ 14 TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH VỚI DẤU ẤN NUT (C52B1) Phan Thế Anh1, Dương Ngọc Thiên Hương2, Lưu Thị Thu Thảo1, Đặng Hoàng Minh1, Nguyễn Vũ Thiện1, Võ Thị Ngọc Diễm1,2 TÓM TẮT 75 Hematoxylin để tối ưu quy trình. Kết quả: Quy Đặt vấn đề: Carcinôm có biểu hiện protein trình nhuộm tối ưu cho dấu ấn NUT (C52B1) có nhân trong tinh hoàn (carcinôm NUT) là tân sinh đặc điểm như sau tỉ lệ pha loãng kháng thể là 1:50 biểu mô ác tính hiếm gặp, đặc trưng bởi đột biến tái trong dung môi TBS, thời gian bộc lộ kháng sắp xếp gen NUTM1. Chẩn đoán và phát hiện nguyên 60 phút, thời gian ủ kháng thể thứ nhất 90 carcinôm NUT là một thách thức đối với bác sĩ giải phút và thời gian nhuộm Hematoxyin 15 giây. Kết phẫu bệnh, nhất thiết phải có bằng chứng trực tiếp luận: Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình nhuộm xác định đột biến tái tổ hợp gen NUTM1 bằng các dấu ấn NUT (C52B1). Quy trình này có thể giúp kĩ thuật sinh học phân tử hoặc gián tiếp thông qua giảm thiểu thời gian và nguồn lực tiêu hao cho các biểu hiện protein trên hóa mô miễn dịch. Sử dụng quy trình thực nghiệm trong nghiên cứu và chẩn hóa mô miễn dịch với dấu ấn NUT (C52B1) có độ đoán carcinôm NUT. nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán carcinôm Từ khóa: NUT (C52B1), hóa mô miễn dịch, NUT. Tuy nhiên, hiện tại chưa có quy trình chuẩn tối ưu hóa, carcinôm NUT hóa hóa mô miễn dịch cụ thể nào dành cho dấu ấn này. Nghiên cứu được thực hiện với mục đích tối SUMMARY ưu hóa quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch với OPTIMIZING NUT (C52B1), từ đó, có thể ứng dụng trong nghiên IMMUNOHISTOCHEMICAL cứu, chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân. Đối PROTOCOL FOR NUT (C52B1) tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu MARKER thực nghiệm 10 quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch Objectives: Nuclear protein in testis (NUT) với kháng thể đơn dòng NUT (C52B1) có nguồn carcinoma is a rare and aggressive epithelial gốc từ thỏ trên mô chứng tinh hoàn bình thường malignancy characterized by NUTM1 gene của người trưởng thành và đánh giá các yếu tố ảnh rearrangement. Diagnosing NUT carcinoma is a hưởng như dung môi pha loãng, tỉ lệ pha loãng, challenge for pathologists, necessitating the thời gian bộc lộ kháng nguyên, thời gian ủ kháng evidence of NUTM1 gene rearrangement, which thể thứ nhất và thời gian nhuộm tương phản với can be detected either directly via molecular techniques or indirectly through protein expression 1 Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh on immunohistochemistry. The application of the Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 2 anti-NUT rabbit monoclonal antibody has demonstrated high sensitivity and specificity in Chịu trách nhiệm chính: Võ Thị Ngọc Diễm identifying NUT carcinoma. This research aimed to ĐT: 0903309274 optimize the protocol for the NUT (C52B1) marker Email: votngocdiem@ump.edu.vn in immunohistochemical assays. Methods: This Ngày nhận bài: 30/09/2024 empirical study investigated ten protocols for anti- Ngày phản biện khoa học: 10/10 và 12/10/2024 NUT monoclonal rabbit antibody using formalin- Ngày duyệt bài: 15/10/2024 594
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 545 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024 fixed paraffin-embedded (FFPE) control tissue cho bệnh nhân. Trên phương diện mô bệnh blocks. Several factors affecting the expression of học, carcinôm NUT có đặc điểm hình thái NUT (C52B1), such as solvent type, antibody không đặc hiệu và có sự chồng lấp với một số dilution ratio, antigen retrieval time, antibody bệnh lí ác tính thường gặp hơn như carcinôm tế incubation time, and hematoxylin staining duration, bào gai biệt hóa kém, carcinôm không biệt hóa were evaluated based on their influence on the của vùng mũi xoang, carcinôm vòm hầu, quality of immunohistochemical staining results. carcinôm thần kinh nội tiết, u nguyên bào thần Results: The optimal immunohistochemical kinh khứu, melanôm, sarcôm Ewing, sarcôm protocol for the NUT (C52B1) marker involved a 1:50 dilution ratio in Tris-Buffered Saline solvent. cơ vân,…[3]. Vì vậy, chẩn đoán carcinôm Antigen retrieval was achieved after 60 minutes, NUT là một thách thức đối với bác sĩ giải phẫu followed by 90 minutes of antibody incubation. bệnh nếu chỉ đơn thuần dựa trên các đặc điểm Hematoxylin staining was optimal at 15 seconds. mô bệnh học mà không có các xét nghiệm hỗ Conclusions: Our study successfully established an trợ như hóa mô miễn dịch và sinh học phân tử optimized protocol for NUT (C52B1) marker in [3,8]. Hiện nay, hóa mô miễn dịch là một kĩ immunohistochemical procedures. This protocol thuật nhanh chóng và được ứng dụng rộng rãi can streamline experimental workflows and reduce trong chẩn đoán, định hướng điều trị và tiên the resources needed for research and diagnosis of lượng cho bệnh nhân. Năm 2008, Stelow EB NUT carcinoma. đã khảo sát sự hiện diện của phức hợp protein Keywords: NUT (C52B1), BRD-NUT, một sản phẩm của đột biến tái tổ immunohistochemistry, optimizing, NUT hợp gen NUTM1, bằng kháng thể đa dòng. carcinoma Tuy nhiên, kháng thể này không được xem là lí tưởng vì nó có thể phản ứng chéo với các I. ĐẶT VẤN ĐỀ protein không phải NUT [7]. Để khắc phục Carcinôm có biểu hiện protein nhân trong tình trạng này, Haack H đã sử dụng kháng thể tinh hoàn (carcinôm NUT) là tân sinh biểu mô đơn dòng có nguồn gốc từ thỏ NUT (C52B1). ác tính hiếm gặp, đặc trưng bởi đột biến tái sắp Khi so sánh với kĩ thuật lai tại chỗ phát huỳnh xếp gen NUTM1 [3]. U thường gặp ở người trẻ quang, độ nhạy và độ đặc hiệu của dấu ấn này và xuất hiện ở các vị trí giải phẫu phân bố dọc lần lượt là 87% và 100% với giá trị tiên đoán đường giữa cơ thể như trung thất và vùng đầu dương 100% và giá trị tiên đoán âm 99% [4]. cổ. Tiên lượng của những bệnh nhân carcinôm Hiện tại, chưa có một quy trình chuẩn hóa nào NUT rất xấu với thời gian sống trung vị 6,5 dành cho dấu ấn NUT (C52B1). Hơn nữa, sự tháng do u kém đáp ứng với phương pháp hóa khác biệt về điều kiện kĩ thuật như quá trình cố xạ trị thông thường [3,5]. Trong những năm định bệnh phẩm, quy trình xử lí mô, nồng độ gần đây, các thử nghiệm lâm sàng ở pha I/II kháng thể, thời gian bộc lộ kháng nguyên, thời với liệu pháp nhắm trúng đích như thuốc ức gian ủ kháng thể, hệ thống nhận diện tín hiệu chế miền bromo và miền đoạn cuối phụ (BET) và hệ thống nhuộm tự động có thể dẫn đến sự và thuốc ức chế men histone deacetylase đã không đồng thuận trong đánh giá kết quả chứng minh được tính hiệu quả trong điều trị nhuộm hóa mô miễn dịch giữa các phòng xét cá thể hóa [5]. Do đó, việc chẩn đoán chính nghiệm. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu xác carcinôm NUT là cần thiết để bác sĩ lâm này với mục đích khảo sát một số yếu tố ảnh sàng có thể lựa chọn biện pháp điều trị tối ưu hưởng đến sự biểu hiện của dấu ấn NUT 595
HỘI THẢO KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU BỆNH CÁC TỈNH PHÍA NAM LẦN THỨ 14 (C52B1). Từ đó, chúng tôi có thể đưa ra quy 2.2. Phương pháp nghiên cứu trình nhuộm hóa mô miễn dịch tối ưu để ứng Thời gian và địa điểm nghiên cứu: dụng trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Mô cho bệnh nhân. phôi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong 2.1. Đối tượng nghiên cứu thời gian từ 10/2023 đến 06/2024. Kháng thể NUT (C52B1) (#3625) là kháng Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực thể đơn dòng có nguồn gốc từ thỏ (IgG) của nghiệm. hãng Cell Signaling Technology (Danvers, Các biến số nghiên cứu chính: Massachusetts, USA). Tính đặc hiệu của dấu ấn NUT (C52B1): Mô chứng: Chứng dương bao gồm mô tinh Có, không. hoàn bình thường của người trưởng thành và u Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm tinh bào. Chứng âm bao gồm mô đại tràng dấu ấn NUT (C52B1) bao gồm dung môi pha bình thường, carcinôm tuyến không xác định loãng, tỉ lệ pha loãng, thời gian bộc lộ kháng khác của đại tràng và carcinôm không biệt hóa nguyên, thời gian ủ kháng thể thứ nhất và thời của vùng mũi xoang. Tất cả mô chứng đều gian nhuộm Hematoxylin ở các điều kiện khác được cố định trong dung dịch formalin đệm nhau được trình bày như Error! Reference trung tính 10%. source not found.. Bảng 14: 10 quy trình thực nghiệm nhuộm hóa mô miễn dịch với dấu ấn NUT (C52B1) Quy trình I II III IV V VI VII VIII IX X Nước Dung môi pha loãng TBS TBS TBS TBS TBS TBS TBS TBS TBS RO Tỉ lệ pha loãng 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100 1:50 1:50 1:25 Thời gian bộc lộ 32 32 60 90 60 90 60 60 60 60 kháng nguyên (phút) Thời gian ủ kháng thể 32 32 60 60 90 90 90 90 60 60 (phút) Thời gian nhuộm 120 120 60 60 60 60 15 15 15 15 Hematoxylin (giây) Từ viết tắt: RO: Reverse Osmosis; TBS: khuếch đại OptiView DAB IHC Detection Kit Tris-Buffered Saline. và dung dịch Hematoxylin. Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch: Bước 2: Chuẩn bị tiêu bản: Cắt mỏng mẫu Bước 1: Chuẩn bị hóa chất bao gồm kháng mô vùi nến, mỗi lát dày 3 μm. Ủ trong tủ ấm thể thứ nhất NUT (C52B1), dung dịch EZ 37oC qua đêm. Sấy tiêu bản ở 60–65oC trong prep, dung dịch Ventana Ultra Cell 2 giờ trước khi nhuộm. Conditioning 1 (CC1), kháng thể thứ hai Bước 3: Vận hành điều chỉnh trên máy Horseradish peroxidase (HRP), chất chỉ thị nhuộm tự động Ventana BenchMarkXT của màu 3,3′-diaminobenzidine (DAB), bộ kit hãng Roche theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 596
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 545 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024 Bước 4: Đánh giá tiêu bản hóa mô miễn III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU dịch để lựa chọn quy trình tối ưu nhất. Tiêu 3.1. Biểu hiện của dấu ấn NUT (C52B1) bản sẽ được đánh giá độc lập bởi 02 bác sĩ giải trên một số mô chứng phẫu bệnh (NVT và VTND). Trong trường Ở mô tinh hoàn, các tế bào tiền tinh trùng hợp không đồng thuận, tiêu bản sẽ được hội có tín hiệu DAB lan tỏa ở nhân với cường độ chẩn và đưa ra kết luận cuối cùng. mạnh. Trong khi đó, tế bào u tinh bào bắt màu Đạo đức trong nghiên cứu: Nghiên cứu khu trú ở nhân với cường độ yếu. Đối với mô đã được thông qua Hội đồng Đạo đức trong đại tràng bình thường, carcinôm tuyến không Nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược TP. xác định khác ở đại tràng và carcinôm không Hồ Chí Minh, số 901/HĐĐĐ-ĐHYD ngày 05 biệt hóa của vùng mũi xoang, hoàn toàn không tháng 10 năm 2023. ghi nhận bất kì tín hiệu DAB nào (Hình 26). Hình 26: Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với dấu ấn NUT (C52B1) trên mô tinh hoàn bình thường ở người trưởng thành (A; 200x), u tinh bào (B; 200x), mô đại tràng bình thường (C; 200x), carcinôm tuyến không xác định khác ở đại tràng (D; 200x) và carcinôm không biệt hóa của vùng mũi xoang (E; 200x) 597
HỘI THẢO KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU BỆNH CÁC TỈNH PHÍA NAM LẦN THỨ 14 3.2. Kết quả nhuộm dấu ấn NUT DAB. Ở quy trình II, khi sử dụng TBS, tín hiệu (C52B1) trên mô chứng tinh hoàn ở 10 quy DAB đã xuất hiện nhưng tín hiệu này yếu, trình thực nghiệm không sắc nét, không đồng đều trong cùng một Ở quy trình I, với dung môi pha loãng là ống sinh tinh và giữa các ống sinh tinh với nước RO, hầu như toàn bộ mô chứng không nhau (Hình 27). bắt màu, chỉ khoảng 1% tế bào có tín hiệu Hình 27: Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch ở quy trình I (A; 100x) và quy trình II (B; 100x). Hình phóng đại (200x): Một số tế bào dương tính rải rác với dấu ấn NUT (C52B1). Vị trí khoanh tròn: Vùng không có tín hiệu DAB Ở quy trình III và IV, kết quả nhuộm cho có tín hiệu DAB nhiều hơn và tương đối đồng thấy số lượng tiền tinh trùng có tín hiệu DAB đều trong cùng một ống sinh tinh hơn so với tương tự nhau. Tuy nhiên, cường độ tín hiệu quy trình III và IV. Tuy nhiên, cường độ tín không đồng đều, chưa sắc nét. Sự phân định hiệu chưa sắc nét, sự phân định giữa tế bào có giữa tế bào có tín hiệu và tế bào không có tín tín hiệu và tế bào không có tín hiệu chưa rõ hiệu không rõ ràng. Ở quy trình V và VI, kết ràng (Hình 28). quả nhuộm ghi nhận số lượng tiền tinh trùng Hình 28: Kết quả nhuộm dấu ấn NUT (C52B1) ở quy trình III (A; 200x), quy trình IV (B; 200x), quy trình V (C; 200x) và quy trình VI (D; 200x). Hình phóng đại (400x): Sự phân định giữa tế bào có tín hiệu (mũi tên vàng) và không có tín hiệu (mũi tên đỏ) không rõ ràng 598
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 545 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024 Ở quy trình IV và VI, với thời gian bộc lộ kháng nguyên 90 phút ở 95oC, nghiên cứu ghi nhận một số biến đổi do nhiệt như mô chứng bị khô, viền ống sinh tinh bị co rút, biến dạng, một số tế bào tiền tinh trùng, tinh bào, tế bào Sertoli có hiện tượng tiêu biến nhân và tan bào tương (Hình 29). Hình 29: Những biến đổi do nhiệt khi bộc lộ kháng nguyên ở nhiệt độ cao ở quy trình IV (A; 100x) và quy trình VI (B; 100x) (hình phóng đại 400x). (*): Hiện tượng tiêu biến nhân và tan bào không có tín hiệu rõ ràng. Tuy nhiên, tín hiệu tương của các tiền tinh trùng, tinh bào và tế DAB không sắc nét. Ở quy trình VIII và X, số bào Sertoli trong một số ống sinh tinh lượng tiền tinh trùng có tín hiệu DAB biểu Ở quy trình VII và IX, kết quả cho thấy số hiện lan tỏa, đồng đều, màu nhuộm sắc nét, lượng tiền tinh trùng có tín hiệu DAB lan tỏa, không ghi nhận biến đổi do nhiệt. Sự phân tương đối đồng đều trong cùng một ống sinh định giữa tế bào có tín hiệu và tế bào không có tinh, không ghi nhận biến đổi do nhiệt. Sự tín hiệu rõ ràng (Hình 30). phân định giữa tế bào có tín hiệu và tế bào Hình 30: Kết quả nhuộm NUT (C52B1) ở quy trình VII (A; 200x), quy trình VIII (B; 200x), quy trình IX (C; 200x) và quy trình X (D; 200x). Hình phóng đại (400x): Sự phân định giữa tế bào có và không có tín hiệu DAB có thể quan sát một cách rõ ràng 599
HỘI THẢO KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU BỆNH CÁC TỈNH PHÍA NAM LẦN THỨ 14 IV. BÀN LUẬN trong quá trình nhuộm hóa mô miễn dịch. 4.1. Tính đặc hiệu của dấu ấn NUT Điều này khiến cho kháng thể không thể (C52B1) nhận diện và liên kết tốt với kháng nguyên. Protein NUT là một protein không cấu Do đó, ở quy trình I, tín hiệu DAB rất yếu trúc được mã hóa bởi gen NUTM1 nằm trên hoặc không có tín hiệu. Ngược lại, môi nhiễm sắc thể 15q14 [2]. Bình thường, trường ion hóa của TBS không chỉ giúp duy protein này biểu hiện mạnh và lan tỏa trên trì cấu trúc và chức năng của kháng thể trong các tế bào tiền tinh trùng ở tinh hoàn. Trong quá trình ủ mà còn tạo điều kiện thuận lợi khi đó, buồng trứng và một số loại u mầm cho phản ứng kháng nguyên–kháng thể xảy bào như u nghịch mầm, u tinh bào, carcinôm ra. Vì thế, ở quy trình II, mặc dù tín hiệu phôi lại có biểu hiện yếu và khu trú. Đáng DAB chưa mạnh nhưng nó đã thể hiện tính chú ý, các mô cơ quan lành tính khác và tân khả thi hơn so với nước RO. Dựa trên kết sinh không có đột biến tái sắp xếp gen quả nhuộm của 2 quy trình này, việc sử dụng NUTM1 hoàn toàn không biểu hiện protein TBS làm dung môi pha loãng cho dấu ấn này [4]. Sau khi nhuộm hóa mô miễn dịch NUT (C52B1) là sự lựa chọn phù hợp, đặt trên một số mô chứng, chúng tôi thấy rằng nền tảng cho việc tiếp tục tối ưu hóa các yếu chỉ có mô tinh hoàn và mô u tinh bào có biểu tố khác trong quy trình nhuộm. hiện với dấu ấn NUT (C52B1). Trong khi đó, 4.2.2. Thời gian bộc lộ kháng nguyên mô đại tràng bình thường, carcinôm tuyến Việc cố định mẫu bệnh phẩm trong dung không xác định khác ở đại tràng và carcinôm dịch formalin đệm trung tính 10% là một không biệt hóa của vùng mũi xoang âm tính bước quan trọng giúp bảo tồn các vật chất di hoàn toàn với dấu ấn này. Kết quả của chúng truyền, protein cũng như duy trì hình thái và tôi tương đồng với nghiên cứu của Haack H cấu trúc tế bào. Tuy nhiên, quá trình này [4]. Điều này cho thấy dấu ấn NUT (C52B1) đồng thời tạo ra các liên kết chéo giữa có tính đặc hiệu, tránh được tình trạng phản protein, hình thành một lớp “mặt nạ” che phủ ứng chéo với các protein không phải NUT. bề mặt kháng nguyên và làm giảm khả năng 4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu gắn kết của kháng nguyên với kháng thể [1]. hiện của dấu ấn NUT (C52B1) Do đó, việc bộc lộ kháng nguyên trước giai 4.2.1. Dung môi pha loãng đoạn ủ kháng thể trong quy trình nhuộm hóa Theo khuyến cáo, kháng thể tốt nhất nên mô miễn dịch trở nên cần thiết. Hiện nay, được pha loãng bằng dung dịch pha loãng phương pháp bộc lộ kháng nguyên bằng của nhà sản xuất [1]. Tuy nhiên, do dung nhiệt là kĩ thuật phổ biến nhất, được áp dụng dịch pha loãng này có giá thành cao, một số rộng rãi trong hầu hết các phòng xét nghiệm dung dịch khác như nước RO hoặc Tris- giải phẫu bệnh. Các yếu tố như nhiệt độ, thời Buffered Saline (TBS) có thể được sử dụng gian bộc lộ kháng nguyên và độ pH của dung thay thế. Để đánh giá ảnh hưởng của nước dịch đệm đều đóng vai trò quan trọng, ảnh RO và TBS trên biểu hiện của dấu ấn NUT hưởng trực tiếp đến kết quả nhuộm hóa mô (C52B1), chúng tôi thực nghiệm quy trình I miễn dịch [1]. Theo ghi nhận của Haack H, và II. Khi sử dụng nước RO, sự thiếu hụt các dung dịch bộc lộ kháng nguyên có pH đệm ion đệm cần thiết và môi trường pH trung 9,0 cho kết quả nhuộm NUT (C52B1) tối ưu tính đã làm giảm sự ổn định của kháng thể hơn so với các dung dịch có trị số pH khác 600
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 545 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024 [4]. Dựa trên cơ sở này, chúng tôi sử dụng cho kết quả nhuộm không sắc nét. Khi giảm dung dịch CC1 có pH đệm 9,0 để khảo sát thời gian ủ kháng thể xuống còn 60 phút, ảnh hưởng của thời gian bộc lộ kháng chúng tôi nhận thấy tỉ lệ pha loãng 1:25 ở nguyên trên biểu hiện của dấu ấn NUT quy trình X cho kết quả nhuộm với cường độ (C52B1). Từ các quy trình thực nghiệm III mạnh, sắc nét, khá đồng đều (tương tự quy đến VI, kết quả cho thấy không có sự khác trình VIII). Ngược lại, với tỉ lệ pha loãng biệt rõ rệt về cường độ và mức độ tín hiệu 1:50 ở quy trình IX, các tế bào tiền tinh trùng DAB trên các tế bào tiền tinh trùng giữa thời có tín hiệu DAB không sắc nét (tương tự quy gian bộc lộ 90 phút (quy trình IV và VI) và trình VII). Dựa trên kết quả thực nghiệm từ 60 phút (quy trình III và V). Đáng chú ý, thời các quy trình VII đến X, chúng tôi nhận thấy gian bộc lộ kháng nguyên kéo dài ở nhiệt độ quy trình VIII là quy trình nhuộm hóa mô cao (95oC) đã dẫn đến những biến đổi do miễn dịch tối ưu nhất. Nồng độ kháng thể nhiệt trên mô chứng (Hình 4). Điều này gây cao kết hợp với thời gian ủ kéo dài trong 90 ra hiện tượng “âm tính giả” trên một số ống phút đã tạo điều kiện cho kháng thể tiếp xúc sinh tinh. Chính vì thế, việc bộc lộ kháng và liên kết với kháng nguyên một cách hiệu nguyên trong thời gian 60 phút là lựa chọn quả hơn. Nhờ đó, tín hiệu DAB ở quy trình tối ưu, không chỉ giúp giảm thiểu các biến VIII trở nên sắc nét và đồng đều hơn so với đổi do nhiệt trên mô bệnh phẩm mà còn đảm quy trình VII và IX. Hơn nữa, tỉ lệ pha loãng bảo tính chính xác của kết quả nhuộm hóa 1:50 giúp tối ưu hóa lượng kháng thể sử mô miễn dịch. dụng, tránh lãng phí và tiêu hao quá nhiều 4.2.3. Tỉ lệ pha loãng và thời gian ủ như ở tỉ lệ 1:25 (quy trình X). Điều này góp kháng thể phần tiết kiệm chi phí mua kháng thể, đặc Thời gian ủ kháng thể phụ thuộc vào độ biệt khi tiến hành trên các nghiên cứu có cỡ nhạy và nồng độ của kháng thể thứ nhất [1]. mẫu lớn. Trong nghiên cứu của Martinez L, tác giả ghi 4.2.4. Thời gian nhuộm Hematoxylin nhận quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch với Bước cuối cùng trong quá trình nhuộm tỉ lệ pha loãng 1:25, thời gian bộc lộ kháng hóa mô miễn dịch là nhuộm Hematoxylin và nguyên 40 phút và thời gian ủ kháng thể dán lamelle. Hematoxylin là hóa chất được trong 32 phút cho kết quả tối ưu [6]. Tuy sử dụng để nhuộm tương phản trong hầu hết nhiên, theo khuyến cáo của nhà sản xuất, tỉ lệ xét nghiệm hóa mô miễn dịch. Đối với các pha loãng của NUT (C52B1) chỉ dao động từ kháng nguyên ở nhân tế bào, việc kiểm soát 1:50 đến 1:200. Do đó, để kiểm nghiệm nồng thời gian nhuộm Hematoxylin là điều tối độ và thời gian ủ kháng thể tối ưu, chúng tôi quan trọng. Nếu quá trình nhuộm tương phản so sánh chất lượng tiêu bản nhuộm hóa mô diễn ra quá lâu, Hematoxylin có thể che lấp miễn dịch ở 3 tỉ lệ pha loãng khác nhau, lần tín hiệu DAB trên nhân tế bào, dẫn đến “âm lượt là 1:100, 1:50 và 1:25. Khi ủ kháng thể tính giả” và làm sai lệch kết quả phân tích trong thời gian 90 phút, với tỉ lệ pha loãng [1]. Trong nghiên cứu, chúng tôi đã so sánh 2 1:50 ở quy trình VIII, phần lớn các tế bào mốc thời gian nhuộm Hematoxylin lần lượt tiền tinh trùng cho tín hiệu DAB với cường là 60 giây và 15 giây tương ứng với quy trình độ mạnh, sắc nét, khá đồng đều. Trong khi V và VII. Dựa trên kết quả thực nghiệm, đó, tỉ lệ pha loãng 1:100 ở quy trình VII lại chúng tôi thấy rằng thời gian nhuộm tương 601
HỘI THẢO KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH GIẢI PHẪU BỆNH CÁC TỈNH PHÍA NAM LẦN THỨ 14 phản với Hematoxylin trong 15 giây là tối TP. Hồ Chí Minh đã cấp kinh phí thực hiện ưu, giúp phân biệt rõ ràng giữa các tế bào có đề tài theo Hợp đồng số 126/2024/HĐ- và không có tín hiệu DAB. Thời gian nhuộm ĐHYD ngày 17 tháng 04 năm 2024. ngắn hơn này không những giúp bảo tồn các tín hiệu DAB yếu mà còn đảm bảo độ chính TÀI LIỆU THAM KHẢO xác cao hơn trong phân tích kết quả hóa mô 1. Dabbs DJ. Diagnostic miễn dịch. Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications. 5 ed. China: Elsevier. V. KẾT LUẬN 2019. Dấu ấn NUT (C52B1) có tính đặc hiệu 2. French CA. Pathogenesis of NUT midline cao, chỉ biểu hiện ở tế bào tiền tinh trùng carcinoma. Annual Review of Pathology: trong tinh hoàn và u tinh bào. Qua 10 quy Mechanisms of Disease. 2012;7(1):247-65. trình thực nghiệm trên mô tinh hoàn bình 3. French CA, Stelow EB, Minato H. NUT thường của người trưởng thành, với hệ thống carcinoma. In: WHO Classification of nhuộm hóa mô miễn dịch tự động Ventana Tumours Editorial Board: Head and Neck BenchMarkXT, chúng tôi xác định quy trình Tumours. Lyon (France): International VIII là quy trình nhuộm tối ưu với đặc điểm: Agency for Research on Cancer. 2022. Tỉ lệ pha loãng 1:50 trong dung môi TBS, 4. Haack H, Johnson LA, Fry CJ, et al. thời gian bộc lộ kháng nguyên 60 phút ở pH Diagnosis of NUT midline carcinoma using a đệm 9,0 và nhiệt độ 95oC, thời gian ủ kháng NUT-specific monoclonal antibody. The thể thứ nhất 90 phút và thời gian nhuộm American Journal of Surgical Pathology. tương phản với Hematoxylin 15 giây. Quy 2009;33(7):984. trình này không chỉ giúp tiết kiệm chi phí 5. Lauer UM, Hinterleitner M, Horger M, et tiêu hao cho kháng thể mà còn tránh được al. NUT Carcinoma—An Underdiagnosed tình trạng biến đổi do nhiệt trong quá trình Malignancy. Frontiers in Oncology. bộc lộ kháng nguyên và hiện tượng nhuộm 2022;12:914031. tương phản quá mức. 6. Martinez L. The Optimization of the Hạn chế của nghiên cứu Nuclear Protein in Testis (NUT) Antibody Nghiên cứu chỉ thực hiện tối ưu hóa quy and its Importance and Impact in the trình nhuộm dấu ấn NUT (C52B1) trên hệ Pathology Lab: University of South Florida. thống nhuộm hóa mô miễn dịch tự động 2017. Ventana BenchMarkXT của hãng Roche. Do 7. Stelow EB, Bellizzi AM, Taneja K, et al. đó, quy trình này có thể không đạt hiệu quả NUT rearrangement in undifferentiated tương tự trên các hệ thống nhuộm hóa mô carcinomas of the upper aerodigestive tract. miễn dịch tự động khác. The American Journal of Surgical Pathology. 2008;32(6):828-34. VI. LỜI CẢM ƠN 8. Wang L, Zhu Z, Wang W, et al. Sinonasal Nghiên cứu được sự hỗ trợ kinh phí từ NUT carcinoma: A retrospective case series Đề tài Nghiên cứu khoa học cấp cơ sở của from a single institution. Front Surg. Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Nhóm 2023;10:1098704. tác giả trân trọng cảm ơn Đại học Y Dược 602