TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

116
lượt xem 19
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thuốc trừ sâu hóa học đƣợc sử dụng trong sản xuất nông nghiệp đem lại cho chúng ta năng suất cao và nhiều lợi ích kinh tế, tuy nhiên chúng cũng đem đến những vấn đề nhƣ ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Do đó, nhu cầu ngày càng cao trong nông nghiệp là tìm ra phƣơng pháp bảo vệ cây trồng hòa hợp với hệ sinh thái tự nhiên. Kiểm soát sinh học là một sự lựa chọn thay thế có nhiều tiềm năng trong việc ngăn cản sự tàn phá do...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09 / 2007
LỜI CẢM ƠN Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con trƣởng thành nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tôi xin chân thành cám ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm cùng thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt mọi kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập ở trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Thầy Zhang Liqun ở Đại Học Nông Nghiệp Trung Quốc đã cung cấp mẫu vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 và các tài liệu phục vụ cho thí nghiệm. Ban giám đốc cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hƣớng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tất cả các anh chị thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật Khoa Nông Học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Các bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực hiện khóa luận. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên Trần Nguyễn Thúy An iii
TÓM TẮT Đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện. Địa điểm: trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007. Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng. Việc phát triển các phƣơng pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân tử mới đã đƣợc phát triển nhƣ những phƣơng pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trƣờng. Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất. Những dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Nội dung nghiên cứu 1. Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu. 2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. 3. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Kết quả đạt đƣợc Chọn đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích nghiên cứu. Đạt đƣợc quy trình tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. iv
SUMMARY Tran Nguyen Thuy An, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, “Establishing an optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating”. This subject was conducted at Nong Lam University from March to August in 2007. Pseudomonas fluorescens is the most extensively studied biocontrol-agent because of their strongly antifungal ability and their broad host range. The development of sensitive methods for observing Pseudomonas fluorescens cells in a population in biofilms or in plant roots is of great importance for studying these systems. In response to this problem, novel molecular markers have been developed recently as specific methods for tracing the distribution, population and metabolic activity of target microorganisms in a certain environment. Among them, the green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria has proved to be the most powerful tool. The GFP-marked Pseudomonas fluorescens strain can be conveniently observed by using fluorescence microscopy to study their behaviour. Researching contents are 1. Selecting the Pseudomonas fluorescens strains which have strongly antifungal ability, appropriate antibiotic resistance and fluoresce under short wave length ultraviolet light. 2. Researching the optimal conditions to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating. 3. Performing PCR to confirm the gfp gene in Pseudomonas fluorescens after conjugation. Obtaining results The appropriate Pseudomonas fluorescens strains have been selected. The optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating has been obtained. v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa acid amin bp base pair DNA Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid F Fertility GFP Green Fluorescent Protein Hfr High frequency recombinance IS Insert sequence kb Kilo base kDa Kilo dalton MCS Multi cloning site Nm Nano metre PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Tn Tranposon UV Ultraviolet (light) w/v Weight for volume KB King’s B NST Nhiễm sắc thể TGE Transposable genetic element dNTP deoxyribonucleotide_5_triphosphate LB Luria – Bertain vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế lai giữa F+ và F- .........................................................................................7 Hình 2.2 Sự hình thành thể Hfr từ thể F+............................................................................8 Hình 2.3 Cơ chế lai giữa Hfr và F- ......................................................................................8 Hình 2.4 Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr ....................................................................8 Hình 2.5 Cơ chế lai giữa F’và F-..........................................................................................9 Hình 2.6 Cấu trúc một trình tự chèn ..................................................................................11 Hình 2.7 Cấu trúc transposon .............................................................................................12 Hình 2.8 Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp 3 thành phần ....................................................15 Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của thiết bị electroporation .................................................17 Hình 2.10 Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp CaCl2 ................................................18 Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP ........................................................................................24 Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp ......................................................................... 29 Hình 4.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trƣờng KB ............................36 Hình 4.2 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 .......................................................38 Hình 4.3 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 .......................................................39 Hình 4.4 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 .......................................................40 Hình 4.5 Đối chứng trên môi trƣờng M9 ..........................................................................41 Hình 4.6 Kết quả đối chứng ...............................................................................................45 vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan trong thí nghiệm ........................................................................................................ 30 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................................................. 34 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens...................................................... 35 Bảng 4.3 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................. 36 Bảng 4.4 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ............................................................... 37 Bảng 4.5 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo tỉ lệ vi khuẩn ...................................................................................................... 38 Bảng 4.6 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB ................................................. 40 viii
MỤC LỤC Chƣơng 1 ............................................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ....................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu ......................................................................................................... 3 Chƣơng 2 ............................................................................................................................... 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................................... 4 2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn ................................................... 4 2.1.1 Giới thiệu ....................................................................................................... 4 2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn .......................................................... 4 2.1.2.1 Biến nạp (transformation) .......................................................................... 4 2.1.2.2 Tải nạp (transduction) ................................................................................ 5 2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) .............................................................................. 7 2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic element_TGE) .............................................................................................................. 10 2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị ................... 11 2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị ..................................... 11 2.2 Plasmid ....................................................................................................... 13 2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid ......................... 15 2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) .......................... 15 2.3.2 Phƣơng pháp điện biến nạp .......................................................................... 16 2.3.2.1 Phƣơng pháp ............................................................................................ 16 2.3.3 Phƣơng pháp Calcium chloride.................................................................... 18 2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học .................... 19 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................ 20 2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ......................................... 20 2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................... 21 2.6 Protein GFP ................................................................................................ 24 2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm ................................................................................... 24 2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp ............................................................... 25 Chƣơng 3 ............................................................................................................................. 28 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 28 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................. 28 3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm ................................................... 28 3.2.1 Vật liệu ......................................................................................................... 28 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp............................. 28 3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 ............................. 29 3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ........................................................ 29 3.2.2 Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy vi khuẩn ..................................... 31 3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu ........................................ 31 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 31 Chƣơng 4 ............................................................................................................................. 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 34 4.1 Kết quả ....................................................................................................... 34 4.1.1 Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn ................................. 34 ix
4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB .......................... 36 4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần ........................ 37 4.1.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn .............. 37 4.1.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn ................................................ 38 4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB ... 39 4.1.3.4 Kết quả đối chứng .................................................................................... 40 4.2 Thảo luận .................................................................................................... 41 4.2.1 Các thông số tối ƣu cho quá trình tiếp hợp .................................................. 41 4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần ..................................................... 41 4.2.3 Môi trƣờng tối ƣu cho chọn lọc ................................................................... 43 4.2.4 Kết quả đối chứng ........................................................................................ 42 4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 44 Chƣơng 5 ............................................................................................................................. 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 47 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 47 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 48 PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 51 x
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thuốc trừ sâu hóa học đƣợc sử dụng trong sản xuất nông nghiệp đem lại cho chúng ta năng suất cao và nhiều lợi ích kinh tế, tuy nhiên chúng cũng đem đến những vấn đề nhƣ ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Do đó, nhu cầu ngày càng cao trong nông nghiệp là tìm ra phƣơng pháp bảo vệ cây trồng hòa hợp với hệ sinh thái tự nhiên. Kiểm soát sinh học là một sự lựa chọn thay thế có nhiều tiềm năng trong việc ngăn cản sự tàn phá do bệnh cây trồng mà không gây ô nhiễm. Kiểm soát sinh học liên quan đến việc sử dụng vi sinh vật để ức chế bệnh cây và tăng cƣờng sức khỏe cây trồng. Nó đặc biệt thích hợp để ngăn chặn những bệnh từ đất mà việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học cho đến nay vẫn chƣa đem lại hiệu quả. Kháng sinh đƣợc cho là một trong những cơ chế quan trọng nhất trong việc kiểm soát sinh học những bệnh từ đất. Nhiều loài vi khuẩn sử dụng trong những nghiên cứu kiểm soát sinh học là những loài có thể tạo ra kháng sinh. Agrobacterium tạo ra agrocin 84 và 434 có nguồn gốc từ nucleoside. Chủng Baccillus kiểm soát bệnh cây trồng tạo ra lipopeptide fengycin, một phức hợp aminopolyol zwittermycin A và kanosamine. Tác nhân kiểm soát sinh học Pseudomonas là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về khả năng tạo ra kháng sinh. Chúng tạo ra một chuỗi những kháng sinh phenolic, nhƣ là 2,4- diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG), pyoluteorin, pyrrolnitrin, và ít nhất 4 loại phenazine khác nhau. Bên cạnh đó, chúng có phổ kí chủ rộng, bao gồm cà chua, bí, cà rốt, và bắp cải. Những điều kiện trên đem đến cho chúng tiềm năng phát triển nhƣ một loại thuốc trừ sâu sinh học đối với nhiều loại cây trồng. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định khả năng định cƣ của vi khuẩn Pseudomonas trên rễ cây trồng 1
rất quan trọng. Cần phát triển một phƣơng pháp hữu hiệu để quan sát những tế bào vi khuẩn riêng lẻ trong một tập đoàn vi khuẩn trong những mô hình thí nghiệm và môi trƣờng tự nhiên nhƣ trong biofilm hay trên rễ cây trồng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Protein green fluorescent (gfp) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng minh là có giá trị trong nhiều nghiên cứu sinh học khác nhau. Theo Bloemberg và ctv (1997) gfp mang lại khả năng nghiên cứu nghiên cứu tế bào mà không phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Thêm vào đó, những tế bào đƣợc đánh dấu gfp có thể quan sát bằng kính hiển vi có gắn bộ lọc huỳnh quang thông thƣờng nếu đƣợc kích thích ở bƣớc sóng thích hợp, đáp ứng đầy đủ tính chất cho một hệ thống “marker gene”, “reporter gene” nhằm kiểm soát khả năng định cƣ của vi khuẩn đối kháng trên đất hay cây trồng. Để đánh dấu vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với marker GFP chúng ta có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp, trong đó tiếp hợp ba thành phần là một trong những phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện và có chi phí thấp. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần”. Đề tài này tiếp tục từ nghiên cứu “Chuyển gene gfp (Green Fluorescent Protein) vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Đỗ Thị Ngọc Hân, trƣờng Đại học Nông Lâm thực hiện, và nghiên cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, Đại học Nông Lâm thực hiện. 1.2 Mục đích 1- Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm. 2
2- Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. 1.3 Yêu cầu Chọn lọc đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm. Xây dựng đƣợc quy trình tiếp hợp plasmid pUT-gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. 3
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu Trong các quần thể vi khuẩn, đột biến liên tục xảy ra do các lỗi trong quá trình sao chép. Nếu có sự chọn lọc thuận lợi cho một đột biến cụ thể nào đó (ví dụ nhƣ tính kháng kháng sinh), thể đột biến đó sẽ nhanh chóng trở thành thành phần chính trong quần thể nhờ vào tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng. Thêm vào đó,vì vi khuẩn là những sinh vật đơn bội nên ngay cả những đột biến lặn cũng sẽ đƣợc biểu hiện. Do đó, những đột biến trong quần thể vi khuẩn có thể gây ra vấn đề trong việc chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn. Mặt khác, vi khuẩn có những cơ chế chuyển gene sang vi khuẩn khác nên 1 đột biến xảy ra trong 1 tế bào có thể lan truyền sang các tế bào khác. Chuyển gene ở vi khuẩn chỉ đi theo một hƣớng duy nhất là từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận. Thể cho thƣờng chỉ truyền đi một phần nhỏ DNA của chúng nên không tạo thành các hợp tử hoàn chỉnh mà chỉ tạo thành các hợp tử không hoàn chỉnh. Các gene của vi khuẩn thƣờng chỉ truyền trong cùng loài nhƣng thỉnh thoảng sự chuyển gene tới các loài khác cũng có thể xảy ra. 2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn 2.1.2.1 Biến nạp (transformation) Biến nạp là phƣơng pháp chuyển gene nhờ sự thu nhận các DNA tự do trong môi trƣờng xung quanh của thể nhận, các DNA này có nguồn gốc từ thể cho. Các yếu tố ảnh hƣởng đến biến nạp 4
Kích thƣớc DNA: DNA mạch đôi có trọng lƣợng ít nhất 5x105 dalton cho kết quả biến nạp tốt nhất (Mayer, 2007). Do đó, biến nạp dễ bị ảnh hƣởng bởi các nuclease có trong môi trƣờng. Tính khả nạp của thể nhận: một số vi khuẩn có thể hấp thụ DNA một cách tự nhiên. Tuy nhiên, chúng chỉ có thể thực hiện điều đó vào một thời kì cụ thể trong chu kì sinh trƣởng khi chúng tạo ra một loại protein đặc biệt gọi là yếu tố khả biến. Ở giai đoạn này, vi khuẩn đƣợc gọi là khả nạp. Những loài vi khuẩn khác thì không thể thu nhận DNA một cách tự nhiên nhƣng ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro bằng cách xử lý với hóa chất (ví dụ nhƣ CaCl2). Các giai đoạn trong biến nạp 1. Thu nhận DNA: sự hấp thu DNA ở vi khuẩn G- và G+ khác nhau. Vi khuẩn G+ thu nhận DNA dƣới dạng mạch đơn còn mạch bổ sung đƣợc tạo thành trong thể nhận. Trái lại, vi khuẩn G- thu nhận DNA mạch đôi. 2. Tái tổ hợp tƣơng đồng: sau khi DNA từ thể cho đƣợc thu nhận, xuất hiện một sự tái tổ hợp qua lại giữa NST và DNA từ thể cho. Sự tái tổ hợp này đòi hỏi tính tƣơng hợp và gây ra sự thay thế DNA giữa thể cho và thể nhận. 3. Sự tái tổ hợp đòi hỏi các gene điều khiển tái tổ hợp ở vi khuẩn (recA, B, và C) và tính tƣơng đồng giữa các DNA liên quan. Kiểu tái tổ hợp này gọi là tái tổ hợp chung hay tái tổ hợp tƣơng đồng. Vì đòi hỏi sự tƣơng đồng, chỉ DNA từ các loài vi khuẩn có mối liên quan gần mới có nhiều khả năng biến nạp thành công. Tuy nhiên, cũng có những trƣờng hợp hiếm chuyển gene xảy ra giữa những loài vi khuẩn ít liên quan. Về tầm quan trọng, biến nạp xảy ra trong tự nhiên có thể dẫn đến sự gia tăng độc tính. Ngoài ra, biến nạp còn đƣợc sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. 2.1.2.2 Tải nạp (transduction) Tải nạp là quá trình chuyển thông tin di truyền từ thể cho sang thể nhận nhờ 1 bacteriophage (hay phage). 5
Lớp vỏ của phage có thể bảo vệ DNA không bị ảnh hƣởng bởi các nuclease trong môi trƣờng. Hầu hết các trƣờng hợp chuyển gene bằng con đƣờng tải nạp xảy ra trong cùng loài. Tuy nhiên, đối với phage có phổ kí chủ rộng thì chuyển gene cũng có thể xảy ra giữa các loài. Khả năng tải nạp của phage liên quan đến vòng đời của chúng. Thông thƣờng ngƣời ta chia tải nạp thành hai loại là tải nạp phổ biến và tải nạp đặc hiệu. Tải nạp phổ biến là quá trình tải nạp mà bất kì gene nào của vi khuẩn cho cũng có tiềm năng đƣợc chuyển qua vi khuẩn nhận. Phage làm trung gian tải nạp phổ biến sẽ làm gãy DNA tế bào chủ thành những mảnh nhỏ. Trong quá trình chúng gói DNA vào các hạt phage nhờ cơ chế “headfull”, thỉnh thoảng một số mảnh của DNA tế bào chủ cũng đƣợc gói ngẫu nhiên vào lớp vỏ của phage. Do đó, bất kì gene nào từ thể cho cũng có khả năng đƣợc chuyển đi miễn là kích thƣớc của chúng vừa với phần đầu của phage. Khi phage có chứa DNA của thể cho xâm nhiễm vào thể nhận, DNA thể cho sẽ xâm nhập vào thể nhận và xảy ra sự tái tổ hợp tƣơng đồng thay thế DNA giữa thể cho và thể nhận. Tải nạp đặc hiệu: là quá trình tải nạp mà chỉ có những gene nhất định nào đó từ thể cho có thể chuyển sang thể nhận. Những phage khác nhau có thể chuyển những gene khác nhau nhƣng 1 phage cụ thể nào đó chỉ chuyển đƣợc những gene nhất định nào đó. Tải nạp đặc hiệu có trung gian là phage tiềm tan hay phage ôn hòa, gene nào đƣợc chuyển phụ thuộc vào vị trí mà prophage chèn vào NST. Trong quá trình tách ra của prophage, thỉnh thoảng xảy ra lỗi làm một số DNA của tế bào chủ cũng đƣợc tách ra cùng với DNA phage. Chỉ có những DNA của tế bào chủ ở 2 phía nơi prophage chèn vào mới có thể đƣợc chuyển. Sau khi nhân lên và đƣợc phóng thích, các phage xâm nhiễm vào thể nhận. Sự tiềm tan hóa xảy ra giúp các gene từ thể cho đƣợc chuyển ổn định.Thể nhận lúc này có hai bản sao của gene đƣợc chuyển. Cũng có thể xảy ra sự tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các gene của thể cho và thể nhận. Về tầm quan trọng, sự biến đổi tiềm tan (phage) xuất hiện trong tự nhiên là nguồn tạo ra các chủng vi khuẩn độc. 6
2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) Tiếp hợp là quá trình chuyển DNA từ thể cho sang thể nhận qua sự tiếp xúc trực tiếp giữa các tế bào. Ở vi khuẩn có 2 kiểu giới tính là thể cho (male) và thể nhận (female). Sự truyền vật chất di truyền chỉ đi theo một con đƣờng là từ thể cho sang thể nhận. Các kiểu giới tính ở vi khuẩn Thể cho: vi khuẩn có khả năng của 1 thể cho nếu trong tế bào có sự hiện diện của yếu tố giới tính F. Yếu tố F là 1 đoạn DNA dạng vòng có khả năng tự sao chép trong tế bào, chúng là 1 đơn vị sao chép độc lập còn đƣợc gọi chung là plasmid. Yếu tố F có những gene cần thiết cho sự tự sao chép và khả năng truyền DNA của chúng cho thể nhận. Yếu tố F còn mã hóa cho khả năng tạo pili giới tính trên bề mặt vi khuẩn. Các pili này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiếp hợp. Thể nhận: vi khuẩn là 1 thể nhận khi chúng không có yếu tố F. Các trạng thái tồn tại của yếu tố F (i) F+: vi khuẩn đƣợc gọi là F+ khi chúng có chứa yếu tố F, mà yếu tố F trong trƣờng hợp này chỉ chứa các gene cần thiết cho sự tự sao và chuyển DNA, không có gene nào của NST đƣợc kết hợp vào. F+ F- F+ F- F+ F+ F+ F+ Hình 2.1: Cơ chế lai giữa F+ và F- (Mayer, 2007). 7
Khi lai F+ với F-, F- sẽ trở thành F+ trong khi F+ vẫn là F+. Do đó, yếu tố F có khả năng lan truyền. Mức độ chuyển gene NST trong trƣờng hợp này rất thấp. (ii) Hfr (high frequency recombinance): vi khuẩn đƣợc gọi là 1 thể Hfr khi chúng có yếu tố F kết hợp vào NST nhờ sự tái tổ hợp. Khi lai Hfr với F-, F- hiếm khi trở thành Hfr còn Hfr vẫn là Hfr. Mức độ chuyển các gene của thể cho F+ Hfr trong trƣờng hợp này khá cao. Hình 2.2: Sự hình thành thể Hfr từ thể F+ (Mayer, 2007). Hfr F- Hfr F- Hfr F- Hfr F- Hình 2.3: Cơ chế lai giữa Hfr và F- (Mayer, 2007). (iii) F’: trong trƣờng hợp này yếu tố F độc lập với NST của tế bào chủ nhƣng chúng có mang một số gene của tế bào chủ. F’ tạo thành khi tách yếu tố F ra khỏi NST trong 1 thể Hfr. Thỉnh thoảng khi yếu tố F đƣợc Hfr F’ Hình 2.4: Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr 8 (Mayer, 2007).
tách ra, các gene ở 2 bên có thể đƣợc tách ra theo tạo thành thể F’. Khi lai F’ với F-, F- sẽ trở thành F’ còn F’ vẫn là F’. Mức độ chuyển gene cao với các gene của NST nằm trên F’ và thấp với các gene vẫn nằm trong NST thể cho. F’ F- F’ F- F’ F’ F’ F’ Hình 2.5: Cơ chế lai giữa F’ và F- (Mayer, 2007). Về tầm quan trọng, đối với vi khuẩn G- đây là con đƣờng chính để chuyển gene. Chuyển gene có thể xảy ra giữa các loài vi khuẩn khác nhau. Việc truyền tính kháng nhiều loại kháng sinh bằng con đƣờng tiếp hợp hiện là vấn đề lớn trong việc chữa trị các bệnh cho vi khuẩn. Vì thể nhận sẽ trở thành thể cho sau khi nhận plasmid nên có thể dễ dàng hiểu đƣợc tại sao 1 gene kháng kháng sinh chứa trên plasmid có thể nhanh chóng chuyển 1 quần thể nhạy thành 1 quần thể kháng với kháng sinh đó. Vi khuẩn G+ cũng có những plasmid chứa các gene kháng với nhiều loại kháng sinh, các gene này có thể đƣợc chuyển đi bằng con đƣờng tiếp hợp hay tải nạp. Theo Mayer (2007), cơ chế tiếp hợp ở vi khuẩn G+ hơi khác với vi khuẩn G- đó là thể cho sẽ tạo 1 chất dính gây ra sự kết hợp với thể nhận và chuyển DNA. Cameron (2007) cho rằng tiếp hợp là một phƣơng pháp rất hiệu quả để đƣa DNA vào thể nhận. Nó có thuận lợi là DNA đƣa vào ở dạng mạch đơn nên dễ dàng hơn cho việc tái tổ hợp tƣơng đồng so với DNA đƣa vào ở dạng mạch kép (biến nạp 9
và điện biến nạp). Tiếp hợp cũng là con đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để đƣa DNA từ E.coli vào vi khuẩn vùng rễ. Cơ chế quá trình tiếp hợp Việc truyền yếu tố F từ một vi khuẩn F+ sang một vi khuẩn F- đòi hỏi một sự tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào. Khi nuôi chung với vi khuẩn F- các vi khuẩn F+ sẽ có phản ứng của giới tính đực kéo dài pili sinh dục của mình và bám vào một thụ thể của tế bào vi khuẩn nhận, sau đó pili co lại để kéo tế bào nhận lại gần. Giai đoạn tiếp theo vi khuẩn cho tiết ra enzyme làm tan vách tế bào của vi khuẩn nhận và truyền DNA của mình vào. Hiện tƣợng tái tổ hợp sẽ diễn ra sau đó. Quá trình truyền vật chất di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận xảy ra theo các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: sự tiếp xúc ngẫu nhiên xuất hiện vài phút sau khi trộn vi khuẩn với nhau. Xác suất của sự tiếp xúc phụ thuộc vào nồng độ của hai nòi vi khuẩn. Giai đoạn 2: là sự bắt cặp giữa tế bào nhận và tế bào cho. Tế bào nhận đóng vai trò thụ động, màng tế bào của nó bị hòa tan tại chổ tiếp xúc với pili sinh dục của vi khuẩn đực, tạo thành những cầu nguyên sinh chất có đƣờng kính từ 10 – 30 µm. Quá trình này phụ thuộc vào pH, điều kiện dinh dƣỡng trong môi trƣờng. Giai đoạn 3: các DNA của tế bào cho chuyển sang tế bào nhận theo cấu trúc thẳng. Số lƣợng gene chuyển sang phụ thuộc vào thời gian tiếp hợp. Giai đoạn 4: là quá trình tái tổ hợp giữa nhiễm sắc thể của thể nhận và đoạn vật chất di truyền của thể cho, quá trình này đòi hỏi tính tƣơng đồng. Cuối cùng là sự tái tạo nhiễm sắc thể trong những thế hệ sau, thể lai đƣợc hình thành. 2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic element_TGE) Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (TGE) là những đoạn DNA có khả năng di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác. 10