1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng một vai trò quan trọng đối với
sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa…Trong công
tác khai thác và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh
giá đặc điểm kiểu gene là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ
cho việc xác định, phân biệt các giống/loài khác nhau mà còn giúp tìm hiểu
mối quan hệ di truyền của chúng. Sự phát triển mạnh mẽ của các phương
pháp và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh
chóng được ứng dụng trong nghiên cứu di truyền về kiểu gene. Hiện nay,
phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử trong việc định danh và nghiên cứu di
truyền ngày càng được sử dụng phổ biến. Sử dụng vùng gene chỉ thị DNA
barcode là một công cụ mới, đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới, dựa
trên sự tiến hóa và sự khác biệt trình tự của các nucleotide cho phép phân
loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống/loài khác nhau.
N. nucifera là loài sen thuộc nhóm thực vật thủy sinh sống trong các ao
hồ, đầm lầy, được trồng ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Thừa Thiên Huế, hiện
nay có nhiều giống sen màu sắc hoa khác nhau đang được trồng tại nhiều nơi
ở các khu vực ngoại thành và nội thành. Sen Trắng Trẹt Lõm là giống sen
Huế bản địa xưa, được biết đến như một giống sen cung đình rất nổi tiếng, đã
được trồng từ xa xưa trên các hồ sen của khu vực nội thành, hồ lăng tẩm và
các hồ sen thuộc vùng di tích của Cố đô Huế. Giống sen này có hương thơm
dịu dàng, hoa trắng thanh khiết, củ và hạt sen có hương vị và chất lượng đặt
biệt, mang thương hiệu “sen Huế”, rất được du khách ưa chuộng.
Trong những năm gần đây, phong trào trồng sen ở Huế đã được đầu tư
và phát triển mạnh. Một số địa phương đã chuyển đổi diện tích trồng lúa
kém hiệu quả sang trồng sen lấy hạt. Do vậy, ngoài việc trồng các giống
sen trắng có nguồn gốc lâu năm ở Huế, người dân cũng đã du nhập một số
giống sen hồng từ các địa phương khác nhau về trồng ở Huế, đặc biệt là
giống Sen Hồng Cao Sản - một giống sen chuyên cho hạt, mang nhiều đặc
2
tính vượt trội về điều kiện sống và cho năng suất cao hơn các giống sen địa
phương. Việc trồng nhiều loại sen nội nhập ở Huế đã dẫn tới hiện trạng gây
lẫn giống, thoái hóa giống và có nguy cơ làm giảm đi số lượng các giống
sen bản địa, quý hiếm ở Huế.
Cây sen đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống như
trang trí nghệ thuật, hoa cảnh, văn hóa tâm linh, ẩm thực và y học…Nhiều
nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy các bộ phận khác nhau của cây
sen có thể được sử dụng làm món ăn và vị thuốc có giá trị trong y học cổ
truyền do có chứa nhiều hợp chất có bản chất là alkaloid và flavonoid với
nhiều hoạt tính dược lý như chống viêm, chống mất trí nhớ, chống oxy hóa và
hoạt tính ức chế khối u, có tác dụng trong việc cải thiện sức khỏe của con
người. Vì thế, việc nghiên cứu sự sai khác di truyền giữa các mẫu sen trồng tại
Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị, tuyển chọn giống có sự khác biệt di
truyền về kiểu gene đặc trưng để đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp
chất tách chiết từ hạt sen của giống sen được tuyển chọn là việc làm rất cần
thiết. Xuất phát từ cở sở khoa học nêu trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen
trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách
từ hạt sen”. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu về cấp độ phân tử của
một số vùng gene chỉ thị, thiết lập mối quan hệ di truyền ở các mẫu sen khác
nhau trồng tại Huế, cung cấp dữ liệu khoa học liên quan đến hoạt tính sinh học
của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen của giống sen địa phương.
2. Mục tiêu của đề tài
2.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa
trên một số vùng gene chỉ thị và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp
chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Cung cấp dữ liệu khoa học về sự khác biệt trình tự các nucleotide của
các vùng gene chỉ thị thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác
nhau tại Huế, ký gửi dữ liệu và được cấp mã số trên GenBank.
3
- Đánh giá việc ứng dụng một số vùng gene chỉ thị của hệ gene nhân và hệ
gene lục lạp trong nghiên cứu phát hiện sự khác biệt trình tự các nucleotide của
các vùng gene thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại
Huế. Khảo sát qui luật khác biệt, thiết lập mối quan hệ phát sinh dựa trên các
vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng ở Huế,
làm cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn giống khác biệt đặc trưng để nghiên
cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học.
- Nghiên cứu phân lập các hợp chất tinh khiết và thử nghiệm hoạt tính
sinh học của các hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen khác biệt đặc
trưng được tuyển chọn, tạo tiền đề cho việc khai thác và sử dụng bền vững
giống sen này tại Huế.
3. Những đóng góp mới của đề tài
- Đề tài đã đóng góp một số kết quả mới sau đây:
1. Xây dựng được bộ dữ liệu về sự khác biệt trình tự các nucleotide của
1 vùng gene chỉ thị từ hệ gene nhân và 9 vùng gene chỉ thị từ hệ gene lục
lạp của 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế. Từ đó đã ký
gửi và được cấp mã số truy cập của 330 trình tự nucleotide của 10 vùng
gene chỉ thị thu được từ 33 mẫu sen ở Huế trên GenBank.
2. Bước đầu phát hiện được qui luật khác biệt trình tự các nucleotide của
một số vùng gene chỉ thị giữa 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở
Huế, xây dựng được cây quan hệ phát sinh giữa 33 mẫu sen dựa trên các
vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide, và tuyển chọn được giống Sen
Trắng Trẹt Lõm có sự khác biệt đặc trưng về trình tự các nucleotide để
nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hạt sen.
3. Bước đầu phân lập được ba hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-
Butanol của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm có bản chất alkaloid: nuciferine
(C19H21NO2), armepavine (C19H23O3N), và anonaine (C17H15NO2).
4. Bước đầu ghi nhận ba hợp chất này có hoạt tính chống oxy hóa mạnh
nhưng không thể hiện hoạt tính gây độc lên ba dòng tế bào ung thư MKN7,
SK-Mel-2 và KB ở các nồng độ được nghiên cứu.
4
4. Cấu trúc lận án
Luận án gồm 139 trang. Phần mở đầu 05 trang, kết luận và kiến nghị 02
trang, các công trình đã công bố 01 trang, tài liệu tham khảo 23 trang và phụ
lục. Nội dung chính của luận án chia làm 03 chương: Chương 1: Tổng quan
gồm 44 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu gồm 18 trang
và Chương 3: Kết quả và thảo luận 46 trang.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu mới nhất trong và ngoài
nước về các vấn đề ứng dụng chỉ thị phân tử vào phân tích đa dạng di truyền,
xác định loài ở thực vật nói chung và ở cây sen (N. nucifera) nói riêng. Các
nghiên cứu về chiết tách hợp chất từ các bộ phận khác nhau ở cây sen và thử
hoạt tính sinh học của chúng.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu cây sen
Nguồn vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu di truyền: Lá của 33 mẫu
sen được thu thập ở 33 địa điểm trồng sen khác nhau tại Huế. Các mẫu sen
được thu thập dựa trên kết quả công bố của Nguyễn Thị Quỳnh Trang và cs
(2017) dựa trên đặc điểm hình thái tập đoàn 66 mẫu sen thu tại Huế.
Nguyên liệu sử dụng chiết tách hợp chất: Hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02)
thu tại hồ Tịnh Tâm, phường Thuận Lộc, thành phố Huế.
2.1.2. Nguồn vật liệu sử dụng trong sinh học phân tử: Mười cặp mồi
barcode đặc hiệu cho 10 vùng gene chỉ thị DNA được tham khảo từ Dong
và cs (2012), Cuenoud và cs (2002), White và cs (1990).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp sinh học phân tử
2.2.1.1. Chiết tách lục lạp: Lá sen được bảo quản ở 4°C trong bóng tối
khoảng 1 đến 2 ngày để loại bỏ tinh bột tồn tại trong mô lá. Lục lạp được
chiết tách và tinh sạch theo mô tả của Lang và cs (2011).
5
2.2.1.2. Chiết tách DNA từ hệ gene nhân và cpDNA từ lục lạp: Lá sen và lục
lạp được sử dụng làm nguyên liệu chiết tách và tinh sạch DNA và cpDNA
dựa trên phương pháp CTAB theo mô tả của Doyle (1987).
2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA và
cpDNA: Sử dụng phương pháp điện di trên agarose và phương pháp quang
phổ trên máy Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific).
2.2.1.4. Phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt
(MJ - MiniTM Persanol Thermal Cycle, Bio - Rad) theo chu trình nhiệt như
sau: biến tính sợi đôi DNA/cpDNA ở 95oC/5 phút, tiếp đến là 30 chu kỳ:
95oC/1 phút, 50 - 55oC/50 giây, 72oC/1 phút, và 72oC/10 phút.
2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được tinh
sạch bằng Kít Isolate II PCR and Gel (Bioline).
2.3.1.6. Phương pháp tạo dòng gene: Tạo dòng gene được thực hiện theo
phương pháp TA cloning vào vector pGEM® -T Easy.
2.2.1.7. Phương pháp tinh sạch plasmid:
DNA plasmid tái tổ hợp tinh sạch từ các dòng khuẩn lạc dương tính bằng
kít EZ-10 Spin Column Plasmid ADN Minipreps kit, BS6141 (BioBase).
2.2.1.8. Phương pháp giải trình tự gene: Các gene mục tiêu được tiến hành
giải trình tự dựa trên phương pháp Sanger trên hệ thống phân tích ABI
PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.2.1.9. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền: Các trình tự nucleotide được
sắp xếp dựa trên chương trình Clustals và hiệu chỉnh bằng phần mềm BioEdit
7.0.5. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA X trên
phương pháp Maximum Like hood (ML). Trình tự nucleotide của các vùng
gene được so sánh với các trình tự nucleotide được công bố trên GenBank
bằng chương trình BLAST. Phân tích đa hình DNA dựa trên các thông số bao
gồm số lượng vị trí đa hình (S), tổng số đột biến (Eta), số lượng các kiểu đơn
bội (h), đa dạng các kiểu đơn bội (Hd), số lượng các nucleotide khác biệt trung
bình (k), đa dạng nucleotide (π), số lượng sự kiện tối thiểu để xảy ra quá trình
tái tổ hợp (Rm). Tính trung lập được kiểm tra dựa trên 5 phương pháp bao gồm