Luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ TRANG

TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ VỎ MÃNG CẦU TA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ ỨNG

DỤNG TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 9.54.01.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TP.HCM - Năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ TRANG

TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ VỎ MÃNG CẦU TA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ ỨNG

DỤNG TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 9.54.01.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS PHAN TẠI HUÂN

TP.HCM- Năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học

từ vỏ mãng cầu ta (Annona Squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm” là công

trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn PGS.TS Phan Tại Huân. Các số

liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác cho tới thời điểm này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 02 năm 2023

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ

mãng cầu ta (Annona Squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm”. Tôi đã nhận

được rất nhiều sự giúp đỡ và tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học,

cán bộ, giảng viên, chuyên viên Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm - Trường

Đại học Nông Lâm TP.HCM; tập thể Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Viện Công nghệ

sinh học và Thực phẩm -Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM; tập thể Ban Giám

hiệu, Phòng Sau Đại học, cán bộ các phòng, ban chức năng Trường Đại học Nông

Lâm TP.HCM. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy Phan Tại Huân đã trực tiếp hướng dẫn,

góp ý, hỗ trợ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý đồng nghiệp, sinh viên đại học ngành Công nghệ

Thực phẩm, ngành đảm bảo chất lượng các khóa Trường Đại học Công nghiệp

TP.HCM và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện và hoàn thành luận án.

Cuối cùng, Tôi xin gửi lời biết ơn đến gia đình đã luôn đồng hành, động viên, khích

lệ, ủng hộ về tài chính và thời gian trong suốt chặng đường khó khăn để hoàn thành

luận án nghiên cứu này. Đặc biệt, Tôi xin tặng ba mẹ các thành quả mà con đã đạt

được.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Trang

iii

TÓM TẮT

Tên luận án: “Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta

(Annona Squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm”.

Tác giả: Nguyễn Thị Trang

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm. Mã số: 9.54.01.01

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định phương pháp trích ly tối ưu để thu

nhận dịch chiết có hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa cao từ vỏ mãng

cầu ta (Annona Squamosa L.). Đồng thời, định danh các hợp chất có hoạt tính sinh

học sinh học, đánh giá khả năng kháng khuẩn, tính an toàn của dịch chiết và ứng dụng

dịch chiết trong bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh. Bên cạnh đó, xác định

nồng độ chất mang phù hợp để sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta, xác định các chỉ

tiêu hóa lý, đánh giá khả năng kháng khuẩn và xây dựng mô hình dự đoán shelf – life

của dịch chiết và bột sấy phun.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, vỏ mãng cầu sấy ở nhiệt độ khoảng 600C trong 8 giờ sẽ

thu được bột vỏ mãng cầu có hàm ẩm khoảng 12%, có hàm lượng polyphenol và hoạt

tính sinh học cao hơn so với các chế độ sấy khác. Trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu

ta có hỗ trợ vi sóng với nồng độ ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25

(g/mL), thời gian 5 phút, công suất 214 W thu được dịch chiết có hàm lượng TPC

100,15 mg GAE/g CK, hoạt tính kháng oxy hóa 673,0 mol TE/g CK (DPPH) và

1409,6 mol TE/g CK (ABTS) cao nhất so với các phương pháp khác. Dịch chiết,

bột sấy phun vỏ mãng cầu ta có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như tanin,

saponin, steroid, terpenoid, coumarin v.v. có khả năng kháng lại vi khuẩn

Staphylococus aureus (ATCC 29213), Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia

coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella spp. và

Lysteria spp. Tôm thẻ chân trắng được nhúng vào dung dịch chitosan 1,5% có bổ

sung dịch chiết mãng cầu với hàm lượng polyphenol 300 mg GAE/l, bảo quản ở 40C

sau 12 ngày sản phẩm có độ giảm khối lượng tôm nhỏ nhất, chỉ số PV là 4,93 meq/kg,

chỉ số TBARs là 1,73 mg MDA/kg, tổng hàm lượng nitơ bay hơi TVB-N đạt 28,39

mg N/100g, mẫu giữ được màu sắc và cấu trúc tốt hơn so với các mẫu còn lại.

Nghiên cứu cho thấy, sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu với gum arabic 10%, bột sấy

phun có hàm lượng polyphenol cao hơn so với các nồng độ khác, có độ ẩm 4,73%,

độ hòa tan từ 87,25%, độ hút ẩm 34,57 g/100g, tỷ trọng 371,81 g/L.

Nghiên cứu đã sử dụng hệ số Q10 để khảo sát sự suy giảm TPC và TEAC của dịch

chiết, bột sấy phun vỏ mãng cầu ta với chất mang gum arabic 10%. Ở nhiệt độ 300C,

thời hạn bảo quản dịch chiết có TPC và TEAC còn lại 85% so với ban đầu lần lượt là

30,79 ngày; 15,54 ngày theo DPPH và 14,4 ngày theo ABTS; thời gian bảo quản GA

10% có TPC, TEAC còn 85% lần lượt là 13,17 ngày; 18,27 ngày (DPPH) và 24,73

ngày (ABTS) ngày. Sự suy giảm TPC và TEAC theo DPPH và ABTS đều phù hợp

với mô hình bậc 2 với hệ số tương quan (R2) lớn hơn 0,95.

Nghiên cứu cũng đã xác định dịch chiết vỏ mãng cầu ta không tạo ra tác dụng phụ

đối với hành vi và bệnh lý tổng quát của chuột ở nghiên cứu độc tính mãn và độc tính

cấp (LD50 7000 mg/kg) và có khả năng phòng viêm khớp dạng thấp.

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC NGHIÊN CỨU SINH

PGS.TS. Phan Tại Huân Nguyễn Thị Trang

ABSTRACT

Extraction of bioactive compounds from custard apple (Annona Squamosa L.)

peel and its application in food

Ph.D. candidate: Nguyen Thi Trang

Major: Food Technology Major code: 9.54.01.01

The study aimed to optimize the extraction of the custard apple, Annona Squamosa

L. (AS), peel to obtain extracts with high polyphenol content and antioxidant activity.

With that, phytochemical screening of the extract was performed. Antibacterial

activities and the acute and chronic toxicity of the extract were also determined.

Custard apple peel extract was tested as a natural additive for the preservation of

Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei) during cold storage. Besides, the

spray-dried encapsulation of AS peel extract was conducted at different

concentrations of carrier agents. The physical properties, antioxidant, and

antibacterial properties of the spray-dried product were evaluated. Then, modeling

was used to predict the shelf-life of the extracts and encapsulated powders.

The study results showed that the extraction pretreatment of AS peels with hot-air

drying at 60°C for 8 hours led to a moisture content of ≤ 12% and the best total

polyphenol content (TPC) and biological activities. Microwave-assisted extraction

(MAE) can be successfully used to extract polyphenols from the AS peel. The

optimum condition was found at an ethanol concentration of 60%, extraction time of

5 min, a solvent-solid ratio of 25 mL/g, and microwave power of 214 W. Under these

conditions, the extract of custard apple peel achieved a TPC of 100.15 mg GAE/g

d.w, an antioxidant activity of 673.0 µmol TE/g in the DPPH assay, and 1409.6 µmol

TE/g in the ABTS assay.

The bioactive compounds in the AS peel extracts and powder products showed the

presence of tannins, saponins, steroids, terpenoids, and coumarins. Antimicrobial

activity of the AS peel extract was proven against six bacterial strains possibly

causing food poisoning diseases, including Staphylococcus aureus (ATCC 29213),

Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella

typhimurium (ATCC 14028), Shigella spp. and Listeria spp.

Shrimps treated with a 1,5% chitosan-AS extract coating solution had lower increases

in weight loss, pH, PV (4.93 meq/kg), TBARs (1.73 mg MDA/kg), TVB-N (28.39

mg N/100g), and improved color and texture properties, compared with the control

samples during 12 days of cold storage (4°C). The best quality was obtained from

shrimps coated with chitosan-incorporated AS extract at a concentration of 300 mg

GAE/L.

A concentration of 10% gum arabic (GA) was considered proper to obtain the AS

peel extract encapsulation with the highest TPC. The spray-dried powder was

obtained at a very low moisture content of 4.73%, water solubility index of 87.25 %,

hygroscopicity of 34.57 g/100 g, and bulk density of 371.81 g/L.

The shelf life of the product was assessed by using the Q10 value. It showed that the

TPC and TEAC degradation rates of the AS peel extract are greater than those

obtained with the spray-dried powder. The TPC and TEAC retentions of 85% of the

AS peel extracts were 30.79 days, 15.54 days (according to DPPH assay), and 14.4

days (according to ABTS assay), respectively. While those obtained with the 10%

GA spray-dried powder were 13.17 days, 18.27 days (DPPH assay), and 24.73 days

(ABTS assay), respectively. The degradations of TPC and TEAC according to the

DPPH and ABTS assays were correlated well with the developed second-order

models by a correlation coefficient (R2) greater than 0.95.

The study also showed that AS peel extract demonstrated no adverse effects on the

general behavior and pathology determinations of mice in chronic and acute toxicity

testing (LD50 7000 mg/kg), and proved potential prevention and treatment of

rheumatoid arthritis.

vii

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 ................................................................................................................ 1

TỔNG QUAN ............................................................................................................. 1

1.1. Tổng quan về polyphenol ..................................................................................... 1

1.1.1. Phân loại polyphenol ......................................................................................... 1

1.1.2. Hoạt tính sinh học của polyphenol .................................................................... 3

1.2. Tổng quan về mãng cầu ta ................................................................................... 5

1.2.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 5

1.2.2. Đặc điểm ........................................................................................................... 5

1.2.3. Hoạt tính sinh học mãng cầu ............................................................................. 6

1.2.4. Một số nghiên cứu về mãng cầu ta trong và ngoài nước .................................. 6

1.3. Tổng quan về trích ly ........................................................................................... 8

1.3.1. Nguyên lý quá trình trích lytrích ly ................................................................... 8

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly ..................................................... 8

1.3.3. Các phương pháp trích ly .................................................................................. 9

1.4. Kỹ thuật sấy phun tạo sản phẩm bột hòa tan ...................................................... 13

1.5. Nghiên cứu về độc tính và kháng viêm của nguyên liệu thực vật ..................... 14

1.6. Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản thủy hải sản.............................................. 15

CHƯƠNG 2 .............................................................................................................. 18

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 18

2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 18

2.1.1 Nguyên liệu ...................................................................................................... 18

2.1.2. Hóa chất và thiết bị ......................................................................................... 19

2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................... 20

viii

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính

kháng oxy hóa ........................................................................................................... 22

2.2.2. Trích ly vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ enzyme (pectinase, cellulase, hỗn hợp

pectinase/ cellulase) với dung môi nước ................................................................... 22

2.2.3. Trích ly vỏ mãng cầu ta bằng phương pháp khuấy từ ..................................... 23

2.2.4. Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có hỗ trợ vi sóng ........................ 24

2.2.5. Sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu, xác định tính chất hóa lý bột sấy phun..... 26

2.2.6. Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn (shelf-life) bảo quản dịch chiết, bột sấy

phun ........................................................................................................................... 26

2.2.7. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết và

bột sấy phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta ............................................................. 27

2.2.8. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu ................................................ 29

2.2.9. Ứng dụng dịch chiết mãng cầu trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột .. 30

2.2.10. Ứng dụng dịch chiết bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh ............. 31

2.3. Các phương pháp phân tích ................................................................................ 32

2.3.1. Xác định phenolic tổng theo phương pháp Folin- Ciocalteu .......................... 32

2.3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol theo phương pháp DPPH 33

2.3.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol theo phương pháp ABTS 33

2.3.4. Định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học............................................. 33

2.3.5. Xác định thời hạn bảo quản (Shelf - life) cao chiết, bột sấy phun vỏ mãng cầu

................................................................................................................................... 34

2.3.6 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý tôm thẻ chân trắng ......................................... 35

2.3.7. Xác định một số tính chất hóa lý của bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta ........... 37

2.3.8. Các thông số đánh giá tính an toàn của dịch chiết vỏ mãng cầu ta ................. 38

2.3.9. Phân tích huyết học và sinh hóa máu .............................................................. 39

2.3.10. Xác định khối lượng cơ quan tương đối ....................................................... 39

2.3.11. Phân tích nước tiểu ........................................................................................ 40

2.3.12. Đánh giá mô học ........................................................................................... 40

2.3.13. Đánh giá các thông số thực nghiệm mô hình trị viêm khớp dạng thấp ở chuột

bằng dịch chiết vỏ mãng cầu ta ................................................................................. 40

2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 41

CHƯƠNG 3 .............................................................................................................. 42

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 42

3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến TPC và TEAC của vỏ mãng cầu ta ...................... 42

3.2. Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu với sự hỗ trợ của enzyme

với dung môi nước .................................................................................................... 44

3.2.1. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase .................................................. 44

3.2.2. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi .......................................................... 45

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly ............................................................. 47

3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng pH ................................................................................... 49

3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme ............................................................. 52

3.3. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ khuấy từ với dung môi ethanol ................ 55

3.3.1. Ảnh hưởng thời gian trích ly ........................................................................... 55

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol .............................................................. 56

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM ................................................................... 56

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ........................................................................... 57

3.4. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng ...................................................... 58

3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol .............................................................. 58

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ........................................... 59

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly ............................................................. 60

3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng công suất trích ly ............................................................ 61

3.4.5. Tối ưu hóa trích ly TPC, TEAC từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ vi sóng ............ 62

3.5. Tính chất hóa lý bột sấy phun vỏ mãng cầu ta với chất mang khác nhau.......... 68

3.5.1 Độ ẩm, TPC, TEAC của bột sấy phun với gum arabic và maltodextrin .......... 68

3.5.2 Độ màu, hiệu suất thu hồi bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta ............................. 70

3.5.3. Tỷ trọng, độ hút ẩm, độ hòa tan và góc nghỉ của bột sấy phun dịch chiết vỏ

mãng cầu ta................................................................................................................ 71

3.5.4. Đặc điểm hình dạng và kích thước phân bố hạt của bột sấy phun .................. 73

3.6. Xây dựng mô hình dự đoán thời gian bảo quản (shelf-life) dịch chiết và bột sấy

phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta .......................................................................... 76

3.6.1. Xây dựng mô hình dự đoán thời gian bảo quản dịch chiết vỏ mãng cầu ta .... 76

3.6.2. Xây dựng mô hình shelf – life (mô hình dự đoán thời gian bảo quản) cho bột

sấy phun GA 10% ..................................................................................................... 80

3.7. Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học, đánh giá khả năng kháng khuẩn cao

chiết và bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta ....................................................... 83

3.7.1. Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học .................................................. 83

3.7.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết và

bột sấy phun vỏ mãng cầu ta ..................................................................................... 85

3.8. Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh ........ 91

3.8.1. Ảnh hưởng nồng độ polyphenol dịch chiết đến khối lượng tôm .................... 91

3.8.2. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến giá trị pH ....................... 92

3.8.3. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số PV ....................... 93

3.8.4. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số TVB–N ............... 95

3.7.5. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số TBARs ................ 96

3.7.6. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến giá trị màu sắc ............... 97

3.7.7. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến cấu trúc theo thời gian bảo

quản ......................................................................................................................... 101

3.9. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu ta và ứng dụng dịch chiết vỏ mãng

cầu ta trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột .................................................. 103

3.9.1. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu ta .......................................... 103

3.9.2. Ứng dụng dịch chiết vỏ mãng cầu ta trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở

chuột ........................................................................................................................ 110

CHƯƠNG 4 ............................................................................................................ 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 120

4.1. Kết luận ............................................................................................................ 120

4.2. Đề xuất ............................................................................................................. 121

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .................................... 122

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 123

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 151

xii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) ABTS

Bond dissociation enthalpy BDE

Cyclooxygenase COX

Cytosolic Response phospholipase A2 cPLA2

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH

Folin-ciocalteu FCA

Gum arabic GA

Gallic acid equivalent GAE

Hàm lượng polyphenol tổng TPC

Trolox equivalent TE

TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity

Bạch cầu hạt GRA

Hemoglobin HGB

Human leucocyte antigen HLA

Bạch cầu lympho LYM

Microwvave assisted extraction MAE

Mezoneuronbenthamianum baill MB

Maltodextrin MD

Malondialdehyde MDA

Monocyte MONO

Nuclear Factor-kappa B NF-κB

Prostaglandin PG

Enzyme phospholipase PLA2

Tiểu cầu PLT

Chỉ số oxy hóa lipid – peroxide PV

Hồng cầu RBC

Khối lượng cơ quan tương đối ROW

Response surface modelling RSM

xiii

TBARs Các chất phản ứng acid thiobarbituric

Acid tricloacetic TCA

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN

Texture profile analysis TPA

TVB-N Tổng hàm lượng nitơ bay hơi

Tumor necrosis factor nk: natural killer cell TNF

WBC White Blood Cell NEU

xiv

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hợp chất polyphenol và khả năng kháng khuẩn, kháng mốc........... 4

Bảng 1.2 Bậc phân loại của mãng cầu ta .................................................................... 5

Bảng 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase đến TPC và TEAC ............. 44

Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến TPC và TEAC ............................................ 47

Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến TPC và TEAC ...................................... 48

Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến TPC và TEAC ............................................................ 50

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến TPC và TEAC ................................. 51

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến TPC và TEAC ................................ 54

Bảng 3.7 Kế hoạch thực nghiệm RSM tối ưu hóa TPC, TEAC theo DPPH, ABTS 63

Bảng 3.8 Hệ số của phương trình hồi quy của 3 hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3 .............. 66

Bảng 3.9 Độ ẩm, TPC, TEAC của dịch chiết và bột sấy phun ................................. 70

Bảng 3.10 Độ màu và hiệu suất thu hồi bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta ................ 71

Bảng 3.11 Tỷ trọng, độ hút ẩm, độ hòa tan, góc nghỉ của chất mang và bột sấy phun

................................................................................................................................... 72

Bảng 3.12 Phương trình hồi quy và thời gian bảo quản TPC, TEAC của dịch chiết

giảm còn 85% so với ban đầu ................................................................................... 77

Bảng 3.13 Đánh giá độ tin cậy của mô hình shelf – life của dịch chiết .................... 79

Bảng 3.14 Phương trình hồi quy và thời gian bảo quản TPC, TEAC của bột sấy

phun suy giảm còn 85% ............................................................................................ 82

Bảng 3.15 Đánh giá độ tin cậy của mô hình shelf – life bột sấy phun GA 10% ...... 83

Bảng 3.16 Các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong dịch chiết và bột sấy phun . 84

Bảng 3.17 Đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết vỏ quả mãng cầu ta ......... 86

Bảng 3.18 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun MD 12% ................... 87

Bảng 3.19 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun GA 10% .................... 88

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của dịch chiết mãng cầu đến lượng thức ăn, nước uống tiêu

thụ và khối lượng cơ thể chuột ................................................................................ 104

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của dịch chiết đến thành phần huyết học máu ngoại vi chuột

................................................................................................................................. 106

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của dịch chiết mãng cầu đến thành phần sinh hóa máu ngoại

vi chuột .................................................................................................................... 107

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của dịch chiết mãng cầu đến khối lượng cơ quan chuột .... 108

Bảng 3.24 Ảnh hưởng dịch chiết mãng cầu đến thành phần nước tiểu chuột ........ 109

Bảng 3.25 Thay đổi lượng bạch cầu trong máu ngoại vi của chuột bình thường ... 113

Bảng 3.26 Thay đổi lượng bạch cầu máu ngoại vi của chuột bình thường và viêm

khớp dạng thấp ........................................................................................................ 113

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của chiết xuất vỏ mãng cầu ta trên tổng số bạch cầu ngoại vi

ở chuột viêm khớp dạng thấp .................................................................................. 114

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của dịch chiết xuất lên các loại bạch cầu ngoại biên ở chuột

viêm khớp dạng thấp ............................................................................................... 114

Bảng 3.29 Nhiệt độ khớp cổ chân của chuột bình thường và viêm khớp dạng thấp

................................................................................................................................. 115

Bảng 3.30 Nhiệt độ khớp cổ chân ở chuột viêm khớp dạng thấp ........................... 116

xvi

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1.1 Quả mãng cầu ta .......................................................................................... 6

Hình 2. 1 Nguyên liệu vỏ mãng cầu .......................................................................... 18

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................ 21

Hình 2.3 Sơ đồ kháng khuẩn ..................................................................................... 28

Hình 3.1 Độ ẩm nguyên liệu theo thời gian sấy ở những nhiệt độ khác nhau .......... 42

Hình 3.2 TPC và TEAC của vỏ mãng cầu theo nhiệt độ sấy .................................... 43

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến TPC và TEAC ................................ 55

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ................................................................ 56

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM ..................................................................... 57

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................. 58

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ................................................................ 59

Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM ............................................................................ 60

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian trích ly ............................................................... 61

Hình 3.10 Ảnh hưởng của công suất ......................................................................... 61

Hình 3.11 Ảnh hưởng của công suất ......................................................................... 67

Hình 3.12 Mô hình dự đoán về việc tối ưu hóa chiết xuất polyphenol ..................... 68

Hình 3.13 Gum arabic 10% ....................................................................................... 74

Hình 3.14 Maltodextrin 12%..................................................................................... 74

Hình 3.15 Đường cong phân bố kích thước hạt của GA (a) và GA 10% (b) ........... 75

Hình 3.16 Đường cong phân bố kích thước hạt của MD (a) và MD 12% (b) .......... 75

Hình 3.17 Sự giảm TPC của dịch chiết theo nhiệt độ ............................................... 77

Hình 3.18 Sự giảm DPPH của dịch chiết theo nhiệt độ ............................................ 77

Hình 3.19 Sự giảm ABTS của dịch chiết theo nhiệt độ ............................................ 77

Hình 3.20 Sự giảm TPC của GA 10% theo nhiệt độ ................................................ 81

Hình 3.21 Sự giảm DPPH của GA 10% theo nhiệt độ ............................................. 81

Hình 3.22 Sự giảm DPPH của GA 10% theo nhiệt độ ............................................. 81

Hình 3.23 Đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết vỏ mãng cầu .......................... 86

Hình 3.24 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun MD 12% ................... 88

xvii

Hình 3.25 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun GA 10% .................... 89

Hình 3.26 Sự thay đổi khối lượng của các mẫu theo thời gian bảo quản ................. 91

Hình 3.27 Sự thay đổi giá trị pH của các mẫu theo thời gian bảo quản ................... 93

Hình 3.28 Sự thay đổi chỉ số PV của các mẫu theo thời gian bảo quản ................... 94

Hình 3.29 Chỉ số TVB-N của các mẫu theo thời gian bảo quản ............................... 95

Hình 3.30 Sự thay đổi chỉ số TBARs của các mẫu theo thời gian bảo quản ............ 97

Hình 3.31 Sự thay đổi giá trị L* của các mẫu theo thời gian bảo quản .................... 98

Hình 3.32 Sự thay đổi giá trị a* của các mẫu theo thời gian bảo quản .................... 99

Hình 3.33 Sự thay đổi giá trị b* của các mẫu theo thời gian bảo quản .................... 99

Hình 3.34 Sự thay đổi giá trị E* của các mẫu theo thời gian bảo quản .............. 100

Hình 3.35 Độ chắc các mẫu theo thời gian bảo quản.............................................. 101

Hình 3.36 Độ đàn hồi của các mẫu theo thời gian bảo quản .................................. 102

Hình 3.37 Hình thái ngoài tim, gan, thận và dạ dày của chuột thí nghiệm ............. 110

Hình 3.38 Trọng lượng cơ thể ở chuột đối chứng và chuột tiêm CFA trong 12 ngày

................................................................................................................................. 112

Hình 3.39 Ảnh hưởng dịch chiết đến trọng lượng chuột ....................................... 112

Hình 3.40 Đường kính mắt cá chân của chuột viêm khớp dạng thấp (FCA) và chuột

bình thường ............................................................................................................. 116

Hình 3.41 Đường kính mắt cá chân của chuột viêm khớp dạng thấp (FCA) và chuột

bình thường ............................................................................................................. 117

Hình 3.42 Hình thái ngoài khớp cổ chân chuột bị viêm khớp dạng thấp do FCA sau

2 tuần ....................................................................................................................... 119

Hình 3.43 Hình thái ngoài khớp cổ chân chuột bị viêm khớp dạng thấp với tác dụng

của AS sau 10 tuần .................................................................................................. 119

xviii

MỞ ĐẦU

Việc ứng dụng dịch chiết thô từ thực vật có nhiều thành phần có hoạt tính sinh học

trong chế biến thực phẩm hiện đang là một xu hướng trong nghiên cứu ứng dụng tại

Việt Nam và Thế giới. Và nhiều nghiên cứu cho thấy, dịch chiết chứa polyphenol có

tác dụng chống oxy hóa, ôi hóa trong bảo quản các sản phẩm thịt cá nhằm kéo dài

thời gian bảo quản (Maqsood và ctv, 2015). Trong công nghệ bảo quản rau quả,

polyphenol kết hợp với màng bao ăn được như alginate, carragenan, gum arabic...

làm giảm mất nước, thay đổi cấu trúc, giảm hóa nâu trái cây khi cắt lát và tăng thời

gian tồn trữ rau quả (Azarakhsh và ctv, 2012). Đặc biệt hơn nữa, một số polyphenol

có tác dụng kháng khuẩn, kháng mốc cao như flavonoids, tannin, phenolic acid,

saponin, coumarin, stilbenes (Daglia, 2012). Tuy nhiên, hiệu quả bảo quản các hợp

chất polyphenol phụ thuộc vào sự ổn định và tính khả dụng của các thành phần hóa

học này. Trong thực tế, nồng độ polyphenol sau trích ly khá cao và có hương vị cảm

quan thấp. Do đó, polyphenol thường đề xuất sử dụng ở dạng bột sấy phun nâng cao

tính tiện dụng sản phẩm và hạn chế được nhược điểm trên (Ersus và Yurdagel, 2007).

Mãng cầu ta trong y học cổ truyền Việt Nam đã được sử dụng làm thuốc chống viêm,

chữa lành vết thương, thuốc chống sốt rét, điều trị tiêu chảy và kiết lỵ. Dầu từ lá mãng

cầu có khả năng chống muỗi (Saxena và ctv, 2009), cao từ lá mãng cầu có khả năng

chống nấm mốc (Kalidindi và ctv, 2015). Dịch chiết từ vỏ cây mãng cầu có khả năng

kháng khuẩn tốt đối với các vi khuẩn gây bệnh thông thường như Bacillus coagulans,

Escherichia coli (Vyas và ctv, 2012). Việc trích ly polyphenol ngoài yêu cầu hàm

lượng cao còn phải có hoạt tính sinh học cao, quá trình này phụ thuộc nhiều vào

phương pháp trích ly. Hiện nay, quả mãng cầu ta được tiêu thụ dưới dạng quả tươi ở

thị trường trong nước hoặc chế biến dưới dạng rượu vang hay nước ép trái cây lên

men. Vỏ mãng cầu được xem là phụ phẩm của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm

rượu vang, nước ép lên men, thịt quả đóng hộp. Thành phần chính của vỏ mãng cầu

ta gồm carbohydrate, protein, amino acid, glycosidice, alkaloid, flavonoid, phenolic,

steroid, saponin, các chất béo và chất béo no (Linn và ctv, 2013). Nên tận dụng nguồn

phụ phẩm vỏ mãng cầu để trích ly các hợp chất có giá trị ứng dụng trong công nghiệp

xix

thực phẩm, dược phẩm sẽ tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và hạn chế sự ô

nhiễm môi trường. Việc lựa chọn phương pháp trích ly để thu nhận dịch chiết có hàm

lượng polyphenol và hoạt tính sinh học cao phụ thuộc vào điều kiện kinh tế, dạng

nguyên liệu, loại hợp chất polyphenol, bản chất dung môi …. (Wang và Weller,

2006). Tuy nhiên, việc nghiên cứu trích ly và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh

học từ vỏ mãng cầu ta trong công nghệ thực phẩm còn khá hạn chế. Do đó, nghiên

cứu phương pháp trích ly các hợp chất polyphenol từ vỏ mãng cầu ta để đạt hiệu quả

cao nhất và ứng dụng dịch chiết sau khi trích ly trong quá trình bảo quản, chế biến

thực phẩm có ý nghĩa khoa học rất quan trọng và mang tính cấp thiết trong việc cung

cấp thực phẩm an toàn. Vì những lý do trên, đề tài “Trích ly các hợp chất có hoạt

tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) và ứng dụng trong thực

phẩm” đã được thực hiện.

Mục tiêu của luận án

Nghiên cứu các thông số tối ưu để trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong

vỏ mãng cầu ta, từ đó đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro, đánh giá độc tính,

kháng viêm khớp dạng thấp in vivo ở chuột; ứng dụng dịch chiết trong bảo quản tôm

thẻ chân trắng và xây dựng mô hình shelf-life dịch chiết và bột sấy phun dịch chiết.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

- Tính cấp thiết: Đề tài nghiên cứu khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học từ

vỏ quả mãng cầu ta (Annona squamosa L.), mở ra triển vọng ứng dụng các hợp chất

này một cách hiệu quả trong bảo quản và chế biến thực phẩm.

- Ý nghĩa khoa học: Đề tài đã sử dụng các kỹ thuật khác nhau như enzyme, vi

sóng để thu dịch chiết từ vỏ quả mãng cầu ta, sấy phun thu sản phẩm dạng bột và

đánh giá các tính chất sinh học của chúng (khả năng kháng oxy hóa và khả năng

kháng khuẩn in vitro, độc tính cấp và bán mãn tính, khả năng kháng viêm khớp in

vivo trên chuột). Khả năng sử dụng dịch trích từ vỏ quả mãng cầu ta để bảo quản tôm

thẻ chân trắng.

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài là cơ sở để tận dụng một loại phụ phẩm

nông nghiệp là vỏ mãng cầu ta để thu các sản phẩm có hàm lượng polyphenol cao,

có thể ứng dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên có nguồn gốc thực vật có thể

thay thế các chất bảo quản hóa học, cũng như sử dụng để phát triển các sản phẩm

thực phẩm chức năng.

- Những điểm mới của luận án

Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống trên một đối tượng nguyên liệu mới

là vỏ quả mãng cầu ta (Annona Squamosa L.) cụ thể như sau:

• Xác đinh nhiệt độ sấy phù hợp để sấy vỏ mãng cầu ta vẫn giữ được hàm lượng

polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa cao.

• Tối ưu hóa điều kiện trích ly làm giàu hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính

kháng oxy hóa từ vỏ mãng cầu.

• Đề tài đã vi bao sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu với chất mang gum arabic.

• Xây dựng mô hình shelf-life dịch chiết, bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu.

• Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh.

• Đánh giá tính an toàn và khả năng kháng viêm khớp dạng thấp ở chuột của dịch

chiết vỏ mãng cầu ta.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về polyphenol

Hợp chất polyphenol là những hợp chất trong phân tử chứa một hoặc nhiều vòng

benzen, trong đó có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn với vòng benzen và

một số chất có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn cả vitamin. Polyphenol phân bố rộng

rãi trong giới thực vật, đại diện cho một nhóm lớn có nhiều hơn 10.000 hợp chất khác

nhau (Kuppusamy và ctv, 2015).

1.1.1. Phân loại polyphenol

Polyphenol được phân thành 3 nhóm chính như sau: flavonoids (flavones,

flavanones, flavonols, flavanonols, flavan-3-ols, isoflavones, neoflavonoids,

chalcones, anthocyanidins); stilbenoids; phenolic acids (benzoic acids,

hydroxycinnamic acids) (Papuc và ctv, 2017).

Flavonoid: là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, còn gọi là

những hợp chất màu phenol thực vật, tạo màu cho nhiều rau, quả, hoa. Phần lớn có

màu vàng (flavus nghĩa là màu vàng), một số có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng

được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng bộ khung (Ajila và ctv,

2011).

Về mặt hóa học, flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm 15 nguyên tử cacbon và 2

vòng benzen, có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và

B nối nhau qua một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6. Vòng thơm

bên trái gọi là vòng A, vòng thơm bên phải gọi là vòng B, vòng trung gian chứa

nguyên tử oxy gọi là vòng pyran (Fantini và ctv, 2015).

Flavonoid là chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào, ngăn ngừa nguy cơ xơ vữa động mạch,

tai biến mạch máu, lão hóa, ung thư, chống dị ứng, chống huyết khối và chống giãn

mạch máu (Huntley, 2009). Hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid mạnh hơn nhiều

so với vitamin C, E, selenium và kẽm. Flavonoid có tác dụng chống co thắt những cơ

quan cơ trơn như: túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số cơ quan khác. Nhiều

flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavonol có tác dụng thông tiểu rõ rệt.

Acid phenolic

Acid phenolic thuộc loại non-flavonoid, được chia thành hai nhóm chính: acid

benzoid và các dẫn xuất acid cinnamic, dựa trên cấu trúc bộ khung carbon tương ứng

hydroxybenzoic acid (C1-C6) và hydroxycinamic (C3-C6). Hydroxybenzoic acid

gồm có: acid gallic, p-hydroxybenzoic, protocatechuic, vanillic, acid xyringic. Acid

hydroxycinamic gồm có: acid caffeic, ferulic, p-coumaric, sinapic,…(Gallardo và

ctv, 2006)

Acid phenolic trong thực vật có chức năng rất đa dạng như hấp thụ dinh dưỡng, tổng

hợp protein, quang hợp ….

Acid caffeic ngăn chặn có chọn lọc quá trình sinh tổng hợp leukotrienes, liên quan

đến các bệnh điều hòa miễn dịch, hen suyễn và dị ứng (Yasuko và ctv, 1984).

Acid caffeic và một số ester của chúng có hoạt tính chống khối u, chống lại chất sinh

ung thư ruột kết (Yasuko và ctv, 1984) và hoạt động như chất ức chế vi-rút suy giảm

miễn dịch ở người (King và ctv, 1999). Acid chlorogenic có thể ức chế quá trình

peroxyd hóa lipid trong gan chuột do carbon tetrachloride - chất gây ung thư gan.

Acid caffeic và acid ferulic có thể giải độc các chất chuyển hóa hydrocacbon thơm

đa vòng gây ung thư (Huang và ctv, 1996).

Stilbene là phytoalexins (C6-C2-C6) có trong thực vật có thể chống lại mầm bệnh, các

tổn thương gây ra ở người. Thành phần chính stilbene là resveratrol (3,5,4'-

trihydroxystilbene) có khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư và chống

lão hóa (Crozier và ctv, 2009).

Ligans thực vật là một trong nhiều loại phytoestrogen, có hiệu quả như chất chống

oxy hóa, giảm nguy cơ ung thư và các bệnh tim mạch (Vanharanta và ctv, 1999).

Các polyphenol khác: đại diện chính là curcumin (1,7-bis-(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) có trong củ nghệ, có hoạt tính kháng u,

chống viêm, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn ở loài gặm nhấm và

con người (Masuelli và ctv, 2013).

1.1.2. Hoạt tính sinh học của polyphenol

Polyphenol là những chất chuyển hóa thứ cấp do thực vật tự sản xuất để bảo vệ trước

sự tấn công của các sinh vật khác dựa trên đặc tính kháng khuẩn và kháng dinh dưỡng.

Sử dụng nhiều thực phẩm giàu polyphenol như trái cây, rau, quả và ngũ cốc nguyên

cám sẽ giảm các nguy cơ về bệnh mạn tính như tim mạch, ung thư, tiểu đường v.v.

(Mierziak và ctv, 2014).

Hoạt tính kháng oxy hóa của polyphenol

Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic gồm loại bỏ các gốc tự do, ức chế quá

trình oxy hóa lipid, giảm sự hình thành hydroperoxide (Sato và ctv, 1996).

Hoạt tính chống ung thư

Nhiều polyphenol như proanthocyanidins, flavonoid, resveratrol, tannin,

epigallocatechin-3-gallate, acid gallic và anthocyanin có tác dụng chống ung thư ở dạ

dày, tá tràng, ruột kết, gan, phổi, tuyến vú hoặc da (Johnson và ctv, 1994).

Proanthocyanidins có khả năng chống ung thư vú và ức chế di căn ung thư (Mantena

và ctv, 2006). Anthocyanin giảm sự suy giãn tĩnh mạch và hình thành khối u máu

(Bagchi và ctv, 2004). Resveratrol, epigallocatechin-3-gallate chống ung thư tuyến

tiền liệt, gây chết các tế bào khối u (Landis-Piwowar và ctv, 2007). Acid gallic,

flavone có khả năng ngăn chặn hình thành ung thư ruột bằng cách ức chế DNA

(Giftson và ctv, 2010).

Hoạt tính chống viêm

Resveratrol có trong nho có đặc tính chống viêm, giảm viêm, ngăn chặn các cytokine

tiền viêm và ngăn chặn gen có khả năng gây viêm mãn tính (Chuang và McIntosh,

2011).

Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol

Polyphenol có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng vi-rút. Các nhóm hợp

chất như flavan-3-ols, flavanol, tanins có tính kháng khuẩn cao do ức chế sự hình

thành màng tế bào sinh học, trung hòa độc tố vi khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của

polyphenol được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm, chữa bệnh nhằm hạn

chế sử dụng chất bảo quản hóa học và kháng sinh tổng hợp (Daglia, 2012).

Bảng 1.1 Một số hợp chất polyphenol và khả năng kháng khuẩn, kháng mốc

Loại polyphenol Loại vi khuẩn Loại nấm mốc/ nấm men

Flavonoid V.cholerae, S.mutans, C.jejuni Candida albicans

C.perfringes, E.coli, B.Cereus Microsporum gypseum

H.pylori, S.aureus, L.acidophilus Trichophyton

A.naeslundii, P.oralis, mentagrophytes

P.gingivalis, P.melaninogenica, Trichophyton rubrum

F.nucleatum, C.pneumonia

Tannin Salmonella, Staphylococcus Candida parapsilosis

Helicobacter, E.coli, Bacillus

Clostridium, Campylobacter

Listeria

Acid phenolic S.aureus, L.monocytogenes, C. parapsilosis, C.

E.coli, P.aeruginosa tropicalis

Saponin S.mutans, E.coli, S.aureus

Coumarin Salmonella, Staphylococcus Candida albicans,

mutans, S. aureus, E.coli Cadida parapsilosis

Stilbene Pseudomonas aeruginosa, S. C. herbarum, M.

aureus, B. subtilis aucupariae, A. niger, B.

cinerea

(Daglia, 2012)

1.2. Tổng quan về mãng cầu ta

1.2.1. Nguồn gốc

Mãng cầu ta có tên khoa học là Annona squamosa Linn, thuộc họ Annonaceae,

khoảng 135 chi với 2300 loài, chi điển hình là Annona (Bhardwaj và ctv, 2014).

Bảng 1.2 Bậc phân loại của mãng Mãng cầu ta là một loại thực vật có hoa, thân

cầu ta gỗ, được phân bố ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ và

Bậc phân loại Tây Ấn. Ngày nay, mãng cầu được trồng ở các

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới Giới Plantae

(Bhardwaj và ctv, 2014). Mãng cầu ta được Ngành Magnoliophyta

phân bậc như trong Bảng 1.2. Lớp Magnoliopsida

Tại Việt Nam, ở miền Nam, mãng cầu ta được Bộ Magnoliales trồng nhiều nhất ở tỉnh Tây Ninh (khu vực Họ Annonaceae quanh núi Bà Đen) và một số tỉnh khác như Bà Chi Annona Rịa-Vũng Tàu, An Giang. Ở miền Bắc, mãng

Loài Annona squamosa cầu ta được trồng chủ yếu ở các tỉnh có rừng

như Lạng Sơn, Lào Cai, Sơn La.

1.2.2. Đặc điểm

Mãng cầu ta mọc ở độ cao 1000 m so với mực nước biển, phát triển và sinh trưởng

tốt trong điều kiện nhiệt độ 10-200C và tối đa là 22-280C.

Quả có dạng hình tròn, hình oval hoặc hình nón, đường kính khoảng 6-10 cm, vỏ dày

có vảy hoặc những mắt nhỏ, khối lượng khoảng 100-230 g/quả, thịt quả có màu trắng

kem, ngọt và ngon. Phần ăn được chiếm 28-37% tổng trọng lượng quả và hạt chiếm

với 23-40%. Hạt mãng cầu ta có hình bầu dục, màu nâu đen, cứng.

Vỏ quả chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có khả năng kháng oxy hóa và

kháng khuẩn, đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng rất đáng để nghiên cứu và khai thác

(SVGK Dowluru và ctv, 2015) và các hợp chất sinh học có trong vỏ quả mãng cầu

với tỷ lệ như sau: 15,78% alkaloid; 20,05% tannin; 5,86% saponin và 23,87%

flavonoid (Roy và Sasikala, 2016).

1.2.3. Hoạt tính sinh học mãng cầu

Hình 1.1 Quả mãng cầu ta

Trong các loài Annona, hoạt tính dược lý cây mãng cầu ta vượt trội hơn các loài

còn lại. Các hoạt tính dược lý từ các bộ phận của cây mãng cầu ta như chống oxy

hóa, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư, hạ đường

huyết, chống đái tháo đường, bảo vệ gan v.v. (Pandey và ctv, 2011). Trong nông

nghiệp, dịch chiết xuất từ lá, hạt mãng cầu ta có thể diệt côn trùng, sâu bệnh (Ashok

Sharma và ctv, 2013). Do đó, việc khai thác tối ưu các bộ phận của cây mãng cầu

ta được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu hiện nay.

1.2.4. Một số nghiên cứu về mãng cầu ta trong và ngoài nước

Phan và Nguyễn, (2019) đã tối ưu hoá quá trình lên men rượu dịch quả mãng cầu

ta với nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với

thông số hàm lượng chất khô hòa tan là 19°Bx, tỉ lệ men 2%, thời gian lên men là

Dũng & Hường, (2019) đã đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ enzyme

44 giờ, sản phẩm có độ cồn 5,10% (v/v).

celluclast 1,5L, dung môi đến ly hợp chất polyphenol từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ

enzyme. Kết quả cho thấy, dịch trích có hàm lượng polyphenol cao nhất với thời gian

trích ly 67,69 phút, nhiệt độ 510C và tỷ lệ enzyme celluclast 1,5L/dung môi là 1,8%

(v/w), dịch chiết thu được có hàm lượng polyphenol tổng số là 48,23 mg GAE/g CK.

Kothari và ctv, (2009) đã trích ly hạt quả mãng cầu có hỗ trợ vi sóng tỷ lệ nguyên

liệu/ dung môi là 1/50 (g/mL), thời gian trích ly từ 50 giây đến 5 phút ngắn hơn nhiều

so với ngâm chiết bằng soxhlet, hỗn hợp dung môi chloroform/ methanol, chloroform/

hexane cho hiệu quả trích ly cao hơn so với hỗn hợp dung môi nước/metanol và

ethanol.

Deng và ctv, (2015) đã tối ưu hóa hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxy

hóa dịch chiết vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ siêu âm bằng phương pháp đáp ứng bề mặt.

Kết quả hàm mục tiêu hàm lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng oxy hóa có mô

hình bậc 2 và tương thích với thực nghiệm ở điều kiện tối ưu nồng độ dung môi

(13,2%-46,8%), thời gian siêu âm (33,2-66,8 phút) và nhiệt độ (43,2-76,80C), tỷ lệ

dung môi trên chất rắn là 20/1 (mL/g), aceton 32,68% và 67,230C trong 42,54 phút

dịch chiết có tổng hàm lượng phenolic là 26,81 mg GAE/g CK.

HemLatha và Satyanarayana, (2015) đã trích ly rễ mãng cầu ta bằng dung môi cồn để

điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột với tác nhân gây phù nề chân chuột là

carrageenan. Kết quả cho thấy với liều 200 và 400 mg/kg thể trọng chuột, dịch chiết

rễ mãng cầu có khả năng ức chế viêm tốt hơn thuốc diclofenac natri (100 mg/kg)

(P<0,01).

Tóm lại, đã có nhiều nghiên cứu về thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học,

trích ly có hỗ trợ vi sóng ở hạt, siêu âm vỏ mãng cầu (Annona squamosa L.), khả

năng kháng viêm ở rễ mãng cầu. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đầy đủ, so sánh giữa

các phương pháp trích ly, đánh giá độc tính của dịch chiết vỏ mãng ta và ứng dụng

trong bảo quản thực phẩm, dược phẩm. Từ đó, nội dung nghiên cứu chính của luận

án được tiến hành như sau:

Nội dung 1: Nghiên cứu điều kiện sấy và ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến

hàm lượng polyphenol (TPC) và hoạt tính kháng oxy hóa (TEAC). Xác định điều

kiện trích ly tối ưu.

Nội dung 2: Sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta.

Nội dung 3: Ứng dụng dịch chiết vỏ mãng cầu ta trong bảo quản tôm thẻ chân trắng

(Litopenaeus vannamei) ở điều kiện lạnh (4±10C).

Nội dung 4: Đánh giá tính an toàn và ứng dụng dịch chiết mãng cầu trong điều trị

viêm khớp dạng thấp ở chuột.

1.3. Tổng quan về trích ly

Trích ly là quá trình một hợp chất chuyển từ pha này sang pha khác bằng cách cho

hai pha tiếp xúc với nhau. Mục tiêu là tách biệt và cô lập các hợp chất cụ thể từ một

hỗn hợp của nhiều hợp chất hay tách chất mục tiêu ra khỏi tạp chất. Hai pha đều có

thể ở trạng thái lỏng gọi là kỹ thuật trích ly lỏng - lỏng. Trích ly cũng có thể thực hiện

giữa một pha rắn và một pha lỏng (kỹ thuật trích ly rắn - lỏng), hoặc giữa pha khí với

pha lỏng còn gọi là hấp thụ (Roy và Sasikala, 2016).

1.3.1. Nguyên lý quá trình trích lytrích ly

Phương pháp trích ly bằng dung môi là cho dung môi tiếp xúc với mẫu trích ly (hai

pha lỏng- rắn tiếp xúc với nhau một phần hoặc toàn bộ). Hợp chất cần trích ly sẽ hòa

tan vào dung môi cho đến khi đạt sự cân bằng về nồng độ.

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

Tốc độ trích ly phụ thuộc vào kích thước nguyên liệu, bản chất chất cần trích ly, thể

tích dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly (Chew và ctv, 2011).

Dung môi trích ly: mỗi dung môi có độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt khác

nhau dẫn đến hiệu suất trích ly khác nhau.

Nhiệt độ trích ly: nhiệt độ trích ly tăng, độ nhớt dung môi giảm, tốc độ khuếch tán

các phân tử hòa tan vào dung môi tăng.

Thời gian trích ly: thời gian trích ly tăng, lượng chất khuếch tán tăng nhưng thời

gian trích ly kéo dài sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.

Kích thước nguyên liệu: kích thước nguyên liệu quá to, dung môi khó thấm ướt

nguyên liệu dẫn đến hoạt chất khó trích hết. Ngược lại, kích thước nguyên liệu càng

nhỏ, thời gian để chất tan đi từ không bào ra bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung

môi càng ngắn do đó “quãng đường” trích ly đã được thu hẹp, diện tích bề mặt tiếp

xúc của nguyên liệu với dung môi cũng tăng lên, nhờ đó rút ngắn thời gian và nâng

cao hiệu quả trích ly.

1.3.3. Các phương pháp trích ly

Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật có thể trích ly bằng các phương pháp

cổ điển, phần lớn là dựa trên khả năng chiết xuất của dung môi kết hợp với các yếu

tố như: nhiệt độ, thời gian… điển hình phương pháp này là trích ly soxhlet, trích ly

lỏng - lỏng có áp lực (Azmir và ctv, 2013). Tuy nhiên, các phương pháp trích ly cổ

điển có các nhược điểm thời gian kéo dài, độ chọn lọc trích ly thấp, dung môi phải có

độ tinh khiết cao. Do đó, các phương pháp trích ly mới như trích ly có hỗ trợ siêu âm,

vi sóng, enzyme đã khắc phục được các hạn chế trên và an toàn với môi trường do

tuân thủ các tiêu chuẩn hiện hành của các cơ quan môi trường toàn cầu và cơ quan

quản lý (Wong-Paz và ctv, 2017).

1.3.3.1.Phương pháp trích ly ngâm chiết

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan các hợp

chất polyphenol trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng phù hợp, ở nhiệt độ

phòng hoặc được gia nhiệt. Dung môi ngấm qua thành tế bào nguyên liệu, các hợp

chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi. Sau đó, dịch chiết được lọc thô, cô quay

đuổi dung môi. Đây là phương pháp thường được thực hiện trích ly các hợp chất có

hoạt tính sinh học.

Quá trình trích ly ngâm chiết phụ thuộc vào cấu tạo bề mặt, kích thước của nguyên

liệu trích ly. Nhiệt độ trích ly càng cao càng tốt vì nhiệt độ cao làm tăng độ hòa tan

của chất cần chiết vào dung môi, làm giảm độ nhớt dung môi, tăng hệ số khuếch tán

và tăng quá trình trích ly. Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể hòa tan một số chất

không mong muốn và làm giảm hoạt tính sinh học.

Ưu điểm: phương pháp trích ly ngâm chiết là một phương pháp đơn giản, không cần

thiết bị phức tạp đắt tiền và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn.

Nhược điểm: sử dụng nhiều dung môi hữu cơ độc hại, gây ô nhiễm môi trường, ảnh

hưởng đến sức khỏe. Thời gian trích ly dài, hợp chất trích ly bị biến đổi, giảm hiệu

quả trích ly. Ngoài ra, quá trình trích ly còn chịu sự ảnh hưởng của các yếu tố bên

ngoài như ánh sáng, nhiệt độ, không khí, pH .v.v.

Một số nghiên cứu trích ly ngâm chiết

Tối ưu hóa trích ly polyphenol từ Thymus serpyllum L. có hỗ trợ khuấy từ không gia

nhiệt với kích thước nguyên liệu 0,3 mm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/30, ethanol

50%, dịch chiết có hàm lượng polyphenol tổng 26,6 mg GAE/L và thời gian trích ly

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Jovanović và ctv, 2017).

Nghiên cứu tối ưu hóa trích ly polyphenol từ Chokeberry bằng phương pháp ngâm

chiết với điều kiện trích ly tối ưu: kích thước hạt 0,75 mm, ethanol 50%, tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi là 1/20, dịch chiết thu được có hàm lượng polyphenol tổng 27,7 mg

GAE/g và anthocyanin chiếm khoảng 0,27% hàm lượng polyphenol tổng (Ćujić và

ctv, 2016).

Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ hạt và vỏ quả Corylus avellana L.

bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, hiệu quả trích ly

vỏ của Corylus avellana L. cao hơn nguyên hạt (khoảng 30%) và hàm lượng

polyphenol 502 mg GAE/g CK (Contini và ctv, 2008).

Như vậy, phương pháp ngâm chiết đã được ứng dụng nhiều trong trích ly các hợp

chất có hoạt tính sinh học và hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc vào kích thước

hạt, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, nồng độ dung môi, thời gian trích ly v.v.

1.3.3.2. Trích ly có hỗ trợ enzyme

Về mặt sinh học, thành tế bào thực vật được cấu tạo nhiều polysaccharide liên kết với

nhau như tinh bột, cellulose, hemicellulose và pectin tạo thành hàng rào ngăn cản sự

giải phóng các chất nội bào. Trong đó, các hợp chất phenolic được bao quanh bởi các

chuỗi polysaccharide của thành tế bào như cellulose, hemicellulose, pectin bằng các

liên kết kị nước và liên kết hydro. Đối với flavonoid, chúng được bao quanh bởi liên

kết glycosidic với các gốc đường thông qua nhóm OH (O- glycosidic) hoặc thông qua

liên kết cacbon-cacbon (C-glycosidic) (Acosta-Estrada và ctv, 2014). Quá trình trích

ly sử dụng hỗn hợp các enzyme thủy phân carbohydrate như cellulase, hemicellulase

và pectinase sẽ xúc tác tốt hơn để phá vỡ cấu trúc thành tế bào, đẩy nhanh quá trình

giải phóng các phân tử sinh học nội bào, giải phóng polyphenol nâng cao hiệu quả

trích ly polyphenol.

Trích ly bằng enzyme có nhiều ưu điểm như: hiệu quả trích ly cao, thân thiện môi

trường và thực hiện dễ dàng. Các chất được trích ly có độ tinh khiết cao, có họat tính

sinh học cao do quá trình trích ly được thực hiện trong điều kiện ôn hòa so với các

phương pháp trích ly không enzyme (Puri và ctv, 2012).

Enzyme pectinase có pH tối ưu từ 4,0 – 5,0; nhiệt độ tối ưu từ 40 – 600C và cellulase

có pH tối ưu từ 4,5 – 6,0; nhiệt độ tối ưu từ 50 – 600C. Nhìn chung, hai enzyme này

có pH/nhiệt độ tối ưu gần nhau nên việc trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học

bằng hỗn hợp enzyme sẽ tăng hiệu quả trích ly.

Một số nghiên cứu trích ly có hỗ trợ enzyme

Với nồng độ enzyme 2% (cellulase, pectinase và hỗn hợp cellulase/pectinase) hỗ trợ

trích ly polyphenol từ vỏ táo trong 12 giờ dịch chiết thu được có hàm lượng

polyphenol tổng (mg/mL) lần lượt là 0,30±0,02; 0,16±0,01; 0,33±0,02 ở 300C;

0,34±0,01; 0,19±0,01; 0,35±0,02 ở 400C và 0,34±0,01; 0,22±0,01 và 0,38±0,02 ở

500C. Kết quả cho thấy enzyme cellulase có kết quả cao hơn pectinase và hỗn hợp

enzyme pectinase và cellulase dịch chiết có hàm lượng polyphenol cao nhất (Park và

Kim, 2009).

Sử dụng enzyme thương mại (celluclast 1,5L, pectinex ultra và novoferm ) thủy phân

bã nho để thu được dịch chiết giàu phenolic. Hoạt tính chống oxy hóa lần lượt là

86,8±0,81; 82,9±0,31 và 90±0,37% sau 12 giờ đối với celluclast 1,5 L, pectinex ultra

và novoferm ở nồng độ enzyme pha loãng 1/10 (v/v) so với nguyên liệu (Gómez-

García và ctv, 2012).

1.3.3.3. Trích ly có hỗ trợ vi sóng

Vi sóng là một dạng năng lượng điện từ không ion hóa ở những tần số khác nhau, có

giá trị từ 300MHz đến 300GHz. Trích ly có hỗ trợ vi sóng là quá trình sử dụng năng

lượng vi sóng nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân tách các chất cần trích

ly khỏi gian bào thực vật, di chuyển vào dung môi (Camel, 2001). Dưới tác dụng vi

sóng, nước trong tế bào nguyên liệu nóng lên, áp suất bên trong tế bào tăng đột ngột

làm các mô vỡ ra và polyphenol là hợp chất lưỡng cực (nhóm hydroxyl) có thể hấp

thụ năng lượng vi sóng. Dung môi thường sử dụng để trích ly các hợp chất có hoạt

tính sinh học có hỗ trợ vi sóng là aceton, ethanol hoặc hỗn hợp chúng. Do đó, trích ly

có hỗ trợ vi sóng là một kỹ thuật có thể được sử dụng cho việc trích ly các hợp chất

polyphenol (Mandal và ctv, 2007).

Trích ly có hỗ trợ vi sóng là một phương pháp nhanh, kỹ thuật tự động nên có thể

thay thế các phương pháp thông thường. Ứng dụng phương pháp trích ly có hỗ trợ vi

sóng là tách chiết các hợp chất thứ cấp ở thực vật như flavonoid, quinon,

pheninpropanoid, terpenoid, ankaloid (Zhang và ctv, 2008).

Cơ chế trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có hỗ trợ vi sóng gồm ba bước: đầu

tiên là phân tách các phân tử chất tan ra khỏi vị trí đã cố định trong tế bào thực vật

dưới tác động của nhiệt độ và áp suất, thứ hai là khuyếch tán dung môi vào bên trong

thành tế bào thực vật và cuối cùng là khuyếch tán phân tử chất tan từ bên trong tế bào

sang dung môi chiết (Alupului và ctv, 2012).

Quá trình trích ly polyphenol trong nguyên liệu có hỗ trợ vi sóng khi nhiệt độ cao

cường độ khuếch tán dung môi vào gian bào thực vật tăng, khả năng trích ly tăng và

các hợp chất không mong muốn cũng tăng. Do đó, các mức năng lượng phải được

lựa chọn một cách chính xác để tránh nhiệt độ tăng quá cao có thể dẫn tới sự suy giảm

hàm lượng polyphenol và hoạt tính sinh học (Camel, 2001). Ưu điểm của phương

pháp vi sóng là giảm thời gian trích ly, giảm lượng dung môi sử dụng, cải thiện hiệu

suất chiết trích ly, thích hợp với các thành phần kém bền với nhiệt và có khả năng tự

động hóa và có độ chính xác cao (Cravotto và ctv, 2008).

Một số nghiên cứu trích ly có hỗ trợ vi sóng

Tối ưu hóa trích ly xanthone từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) có hỗ trợ

vi sóng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với thông số tối ưu như: thời gian 2,24

phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 25 mL/g và nồng độ ethanol 71%. Dịch chiết thu

được có hàm lượng TPC 320,31 mg GAE/g CK, hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH,

ABTS và FRAP lần lượt 83,63%, 93,77% và144,56 mg Trolox equivalent/g CK

(Mohammad và ctv, 2019).

Tối ưu hóa trích ly các hợp chất phenolic từ quả cây Melastoma sanguineum bằng

phương pháp bề mặt đáp ứng có hỗ trợ vi sóng với ethanol 31,33%, tỷ lệ dung

môi/nguyên liệu 32,21 mL/g, thời gian 45 phút, nhiệt độ 52,240C và công suất 500

W, hàm lượng phenolic tổng là 39,02 ± 0,73 mg GAE/g CK. Phương pháp trích ly có

hỗ trợ vi sóng hiệu quả cao hơn so với phương pháp ngâm nước (25,79 ± 1,03 mg

GAE/g CK) và trích ly bằng soxhlet (18,40 ± 1,34 mg GAE/g CK); nhiệt độ trích ly,

thời gian và lượng dung môi ít hơn (Zhao và ctv, 2018).

Tối ưu hóa trích ly các hợp chất phenolic từ vỏ Carob Pods bằng phương pháp bề

mặt đáp ứng với thiết kế thí nghiệm Box– Behnken bốn yếu tố, 5 điểm trung tâm. Kết

qủa cho thấy với nhiệt độ 800C, ethanol 35% (v/v), tỷ lệ MD/NL 35 mL/g và thời

gian 29,5 phút dịch chiết thu được có TPC 33,6 mg GAE/g CK và hàm lượng

polysaccharide 345,4 mg glucose/g CK (Quiles-Carrillo và ctv, 2019).

Tóm lại, hiệu quả quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có hỗ trợ vi

sóng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tỷ lệ NL/DM, thời gian, nồng độ dung môi,

công suất v.v.

1.4. Kỹ thuật sấy phun tạo sản phẩm bột hòa tan

Sấy phun là một trong những phương pháp hiệu quả cho việc chuyển sản phẩm dạng

lỏng thành sản phẩm dạng bột. Sấy phun có thể áp dụng với cả các sản phẩm có thành

phần nhạy cảm với nhiệt (polyphenols) và sản phẩm chịu nhiệt nên được sử dụng

nhiều trong ngành dược phẩm và thực phẩm (Goula và Adamopoulos, 2004).

Sấy phun là sự bao bọc siêu nhỏ trong lớp polymer/lớp phủ polymer có tác dụng làm

giảm độ ẩm, hạn chế tiếp xúc oxy và các enzyme làm giảm chất lượng thực phẩm

(Wang và ctv, 2009). Hơn nữa, tùy thuộc vào các polymer sử dụng, có thể làm tăng

tốc độ hòa tan của sản phẩm và kiểm soát các biến đổi về cảm quan (Goubet và ctv,

1998). Thực phẩm và phụ gia sau sấy phun có dạng bột khô, kích thước và trọng

lượng giảm hơn so với ban đầu, họat tính sinh học ổn định, giúp cho quá trình vận

chuyển và xử lý dễ dàng hơn.

Cơ sở khoa học của quá trình sấy phun là quá trình bốc hơi nước ra khỏi vật liệu dưới

tác dụng của nhiệt. Nước tách khỏi vật liệu do chênh lệch độ ẩm giữa bề mặt và bên

trong vật liệu; chênh lệch áp suất hơi riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi

trường xung quanh.

Sự thay đổi về thành phần hóa học trong các sản phẩm bột sấy phun phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như: nhiệt độ đầu vào/đầu ra, tốc độ dòng nhập liệu, tốc độ dòng khí,

loại chất mang, áp suất đầu phun v.v. (Chiou và Langrish, 2007). Mỗi loại chất mang

đều có ưu và nhược điểm riêng về thành phần, tính chất, chi phí và hiệu quả sấy phun.

Hiện nay, gum arabic và maltodextrin được sử dụng rộng rãi nhất do bảo vệ tốt

polyphenol và tiết kiệm được chi phí.

1.5. Nghiên cứu về độc tính và kháng viêm của nguyên liệu thực vật

Nghiên cứu độc tính

Độc tính (toxicity) là thuật ngữ dùng để mô tả những tác động xấu của chất độc lên

cơ thể sinh vật. Tùy thuộc vào mức độ của độc tính, chất độc có thể gây chết hoặc

gây tác hại lên từng cơ quan của cơ thể. Độc tính của thuốc thường xảy ra ở liều

vượt quá hiệu quả điều trị của một loại thuốc, lúc đó tác dụng độc hại và điều trị

có thể xảy ra đồng thời.

Độc tính là một khái niệm định lượng, miêu tả tính chất gây độc của chất độc đối với

cơ thể sống. Biên độ gây hiệu ứng độc của một chất độc dao động rất lớn: từ liều

gây hiệu ứng độc mãn tính đến liều gây chết tức khắc.

Mô hình độc tính cấp LD50 của dịch chiết hạt A. squamosa L. bằng ethanol ở liều

uống 5000 mg/kg thể trọng (Banna và ctv., 2016). Khả năng gây độc cấp tính qua

đường miệng của chiết xuất bằng nước lá A. squamosa L. không tìm thấy LD50 ở liều

5000 mg/kg thể trọng trên chuột thí nghiệm (Utami, 2018). Như vậy, chưa có nghiên

cứu khảo sát độc tính chiết xuất từ vỏ quả A. squamosa L. Do đó, trong nghiên cứu

này chúng tôi đánh giá độc tính cấp và bán mãn tính qua đường miệng của chiết xuất

nước vỏ quả A. squamosa L. trên chuột nhằm khẳng định tính an toàn của chiết xuất.

Nghiên cứu kháng viêm

Những thập kỷ gần đây, sự gia tăng các bệnh viêm mãn tính như tiểu đường, bệnh

tim mạch, hen suyễn, viêm khớp dạng thấp, bệnh thoái hóa thần kinh. Điều quan trọng

là các bệnh viêm mãn tính cũng làm tăng nguy cơ phát triển ung thư nên cần phải tìm

các loại thuốc chống viêm mới. Đó là các hợp chất polyphenolic tự nhiên, chế phẩm

trích chiết từ thực phẩm giàu polyphenol, có đặc tính chống oxy hóa mạnh. Các chất

chiết xuất tự nhiên giàu polyphenol có khả năng chống viêm và khả năng điều chỉnh

các chất trung gian gây viêm quan trọng như cyclooxygenase-2, prostaglandin E2,

chất tổng hợp oxit nitric cảm ứng và oxit nitric, trong các tế bào đại thực bào

(Chojnacka và Lewandowska, 2021).

Dịch chiết từ Pleurotuseryngii có hàm lượng phenolic là 0,11±0,02 μmol GAE/mg

CK, gồm nhiều hợp chất như acid galic monohydrat, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-

propionic acid, methyl galat, acid ellagic, acid syringic, và catechin…có tác dụng

chống viêm trong các đại thực bào RAW264.7 do ức chế sản xuất quá mức các chất

trung gian gây viêm bao gồm oxit nitric và các loại oxy phản ứng (Hu và ctv, 2018).

Chiết xuất hoa houblon đã sử dụng trong quá trình lên men bia (Humulus lupulus L.)

làm giảm đáng kể tác nhân gây tiền viêm cyclooxygenase -2 ở mRNA (47%) và mức

protein (32%) sau 24 giờ điều trị đại thực bào của chuột do dịch chiết có nhiều thành

phần có hoạt tính kháng viêm như flavonol, proanthocyanidin, acid hydroxycinnamic

và flavanol monome cao (Caban và ctv, 2020).

1.6. Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản thủy hải sản

Thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của nước ta, đặc biệt, ngành

tôm (tôm thẻ chân trắng) đóng vai trò quan trọng trong xuất khẩu thủy sản Việt Nam.

Tôm có nhiều chất đạm, ít chất béo, đặc biệt ít cholesterol là thực phẩm tốt sức khỏe

(Pan và ctv, 2019). Tuy nhiên, tôm sau thu hoạch dễ bị biến đổi màu sắc, phân hủy

do các enzyme thủy phân protein, oxy hóa lipid và vi sinh vật. Một số phương pháp

bảo quản thủy hải sản hiện nay như kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm và sử dụng chất bảo

quản để duy trì, kéo dài thời gian sử dụng như acid ethylenediaminetetraacetic, acid

benzoic, polyphosphat, acid ascorbic và natri clorua (Pan và ctv, 2019). Trong số đó,

sulfite là chất bảo quản được sử dụng để kiểm soát sự hình thành melanosis ở tôm có

thể gây dị ứng, thậm chí rối loạn nghiêm trọng ở những người bị hen suyễn (Pardio

và ctv, 2011). Do đó, các phương pháp bảo quản mới, an toàn người sử dụng, vẫn giữ

được mùi vị, màu sắc và cấu trúc sản phẩm luôn được quan tâm. Chất kháng khuẩn

tự nhiên như các hợp chất phenolic từ thực vật ngày càng được chú ý như các chất

phụ gia tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn có thay thế chất bảo

quản tổng hợp.

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu màng bao kết hợp bổ sung dịch chiết

chứa polyphenol trong bảo quản lạnh tôm và các loại thủy hải sản khác khá phổ biến.

Sử dụng màng chitosan có bổ sung dịch chiết lá chanh (Citrus aurantiifolia) bảo quản

lạnh chả cá thác lác (Chitala chitala) đã hạn chế được tốc độ oxy hoá lipid, duy trì

giá trị cảm quan và mật độ vi sinh của sản phẩm vẫn nằm trong mức cho phép sau 15

ngày bảo quản lạnh (Thủy và Thơm, 2018).

Với dịch chiết cây diệp hạ châu 0,02% (Phyllanthus amrus Schum.et Thonn) đã cải

thiện giá trị cảm quan, sự oxi chất béo cá bóp phi lê (Rachycentron canadum) trong

điều kiện bảo quản lạnh (Phú và ctv, 2020).

Sử dụng màng polyethylen phủ chitosan/acid gallic được xử lý bằng plasma để bảo

quản phi lê cá rô phi (Orechromis niloticus). Màng polyethylen phủ chitosan và acid

gallic được xử lý bằng plasma có khả năng chống oxy hóa tốt hơn màng chitosan phủ

polyethylen và chitosan hoặc acid galic riêng lẻ. Kết quả cá rô phi được bao phủ màng

có bổ acid agalic/chitosan/polyethylen có thể ức chế vi sinh vật, làm chậm quá trình

tạo các hợp chất nitơ dễ bay hơi sau 14 ngày bảo quản. Chỉ số TBARs của các mẫu

được bao bởi các màng acid galic/polyethylen là 0,26mg MDA/kg; galic

acid/chitosan/polyethylen là 0,24mg MDA/kg thấp hơn mẫu đối chứng là 0,30mg

MDA/kg vào ngày thứ 14 (Wong và ctv, 2020).

Nghiên cứu ảnh hưởng của lớp phủ chitosan-carvacrol có hoặc không bổ sung

caprylic đến chất lượng tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Litopenaeus vannamei)

trong 10 ngày bảo quản đá. Kết quả tôm so lớp phủ chitosan-carvacrol ức chế đáng

kể sự phát triển vi sinh vật hiếu khí, pH và tổng hàm lượng nitơ cơ bản dễ bay hơi

(TVB-N) của với đối chứng chỉ phủ lớp chitosan. Lớp phủ chitosan-carvacrol cũng

làm chậm quá trình hình thành sắc tố đen và tính cảm quan của tôm. Việc bổ sung

acid caprylic vào lớp phủ chitosan-carvacrol giúp sản phẩm tôm có cấu trúc tốt (Wang

và ctv, 2018).

Như vậy, việc kết hợp dịch chiết giàu polyphenol với màng bao chitosan đã kéo dài

thời gian bảo quản sản phẩm, các chỉ tiêu thường được sử dụng để nghiên cứu về bảo

quản thủy hải sản như: pH, tổng nitơ dễ bay hơi, các chất phản ứng acid thiobarbituric,

độ cứng, cảm quan, số lượng vi sinh vật...

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Quả mãng cầu ta (Annona squamosa L.) từ vùng trồng thuộc núi Bà Đen (Tây Ninh),

được thu hoạch từ tháng 8 đến tháng 11. Quả chín được rửa sạch dưới vòi nước chảy,

để ráo, tách vỏ. Tiến hành sấy nguyên liệu với các thông số như sau: chiều cao nguyên

liệu trong khay sấy 5-10 mm, sấy ở 55 - 600C đến độ ẩm khoảng 12% đem nghiền

(hạt có kích thước ≤ 0,5mm) và đóng gói chân không bằng túi PE và bảo quản ở nhiệt

độ phòng trong bóng tối.

Hình 2. 1 Nguyên liệu vỏ mãng cầu

Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) được lựa chọn có cấu trúc nguyên vẹn,

còn sống, kích cỡ 50-55 con/kg. Tôm được đựng trong hộp xốp có chứa chứa đá bào

với tỷ lệ với tỷ lệ tôm/đá là 1/2 (w/w) và được chuyển đến phòng thí nghiệm trong

vòng 30 phút. Tại phòng thí nghiệm, các túi mẫu được tiếp tục đặt trong thùng xốp

và giữ lạnh ở 00-40C bằng tủ lạnh.

Chuột nhắt trắng Swiss albino (23 - 25g), mua Viện Pasteur Tp. HCM. Chuột được

nuôi tại nhà động vật, vườn thực nghiệm Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm,

Trường đại học Công nghiệp Tp.HCM, được duy trì ở nhiệt độ (29 ± 20C), độ ẩm

tương đối (50 ± 10%), chu kỳ sáng/tối là 12 giờ/12 giờ (Han và ctv, 2019). Lồng nuôi

chuột được làm bằng kính, kích thước 15cm x 30cm. Máng treo bằng inox móc vào

thành lồng để đựng thức ăn và nước uống. Nước uống sạch chứa trong bình có vòi

uống, sử dụng thức ăn viên nhân tạo dành cho động vật gặm nhấm (Griffioen và ctv,

2015).

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Đức); 6-hydroxy - 2, 5, 7, 8-

tetramethylchroman-2- carboxylic acid (Trolox), (Đức); 2,2-azinobis (3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS), (Mỹ); 2-thiobarbituric acid (TBAR),

(Đức); Pectinex Ultra SP-L (Đan mạch); Celluclast 1.5L (Đan mạch); Mueller-Hilton

Agar (MHA), (Ấn Độ), Maltodextrin (DE 15-20), gum arabic (Trung Quốc);

Gentamycin 10µg/mL (Việt Nam) và các hóa chất khác thỏa mãn điều kiện để sử

dụng trong phân tích.

Thiết bị

Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu

Tên dụng cụ và thiết bị Xuất xứ STT

Thiết bị cô quay chân không RV 10 Đức 1

Tủ ấm Shellab, Model 1525-2E Mỹ 2

Thiết bị sấy SHELLAB-USA-CE3F-2 Mỹ 3

Máy ly tâm EBA200S Đức 4

Máy siêu âm Ultrasonic processor model GE 750 Mỹ 5

Bể ổn nhiệt lạnh Bibby - R000100032 Anh 6

Tủ sấy Memmert Đức 7

Máy sấy phun (LabPlant SD-Basic) Anh 8

Máy nghiền búa kích thước lỗ sàng 20mesh Việt Nam 9

Thiết bị đo độ nhớt Brookfield (Model DIGITAL Mỹ 10 DV – III Ultra Rheometer)

11 Máy đo độ Brix điện tử atago model pal-1 Nhật

Máy đo quang phổ UV-VIS Model: UVS-2800 Mỹ 12 LABOMED – UVS9060

2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố, mỗi nghiệm thức lặp lại 3

lần.

Sấy (50, 60, 70, 800C, độ ẩm <12%

Chọn nhiệt độ sấy phù hợp

Khuấy từ

Cellulase

Pectinase/ Cellulase

Pectinase

Vi sóng

Chọn phương pháp trích ly hiệu quả Dựa vào TPC, TEAC

Tối ưu hóa trích ly vi sóng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt

Vi bao dịch chiết vỏ mãng cầu

Dịch chiết vỏ mãng cầu

- Xác định các chỉ số hóa lý bột sấy phun - Đánh giá khả năng kháng khuẩn - Xây dựng mô hình shelf- life bột sấy phun

Vỏ mãng cầu

- Định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học - Đánh giá khả năng kháng khuẩn -Ứng dụng dịch chiết bảo quản tôm thẻ chân trắng - Xây dựng mô hình shelf- life dịch chiết - Đánh giá tính an toàn dịch chiết và khả năng phòng viêm khớp dạng thấp

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính

kháng oxy hóa

Sấy vỏ mãng cầu ở nhiệt độ (500C, 600C, 700C, 800C) với chiều cao lớp nguyên liệu

trong khay sấy 5-10 mm, sấy đến độ ẩm khoảng 12%, nghiền hạt có kích thước ≤

0,5mm. Sau đó, xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa bằng

phương pháp ngâm chiết với dung môi nước, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/8, thời

gian trích ly 2 giờ, nhiệt độ trích ly 600C, dịch chiết được ly tâm, lọc xác định hàm

lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH, ABTS. Từ đó, chọn được

nhiệt độ để sấy nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu.

2.2.2. Trích ly vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ enzyme (pectinase, cellulase, hỗn hợp

pectinase/ cellulase) với dung môi nước

2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme pectinase và cellulase

Thí nghiệm được thực hiện tỷ lệ enzyme pectinase:cellulase lần lượt 0:3, 2:1, 1:1,

2:1, 3:0. Các yếu tố cố định: tỷ lệ NL/DM là 1/14, nồng độ enzyme 0,2% v/w, thời

gian 60 phút, pH 4,5 và nhiệt độ 500C. Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm

2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Thí nghiệm được thực hiện tỷ lệ NL/DM: 1/8, 1/10, 1/12, 1/14 và 1/16. Các yếu tố cố

định: nồng độ enzyme 0,2% v/w, thời gian 60 phút, nhiệt độ 500C; pH 4,5 (pectinase,

hệ enzyme pectinase/cellulase), pH 5 (cellulase), tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase

(được xác định ở mục 2.2.2.1). Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ

tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly

Thí nghiệm được thực hiện với thời gian trích ly lần lượt là 20; 40; 60; 80, 100 phút.

Các yếu tố cố định: nồng độ enzyme 0,2% v/w, nhiệt độ 500C; pH 4,5 (pectinase, hệ

enzyme pectinase/cellulase), pH 5 (cellulase), tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase (được

xác định ở mục 2.2.2.1)), tỷ lệ NL/DM (được xác định ở mục 2.2.2.2). Khối lượng

vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng

polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất.

2.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng pH

Thí nghiệm được thực hiện với pH: 3,5; 4; 4,5; 5 và 5,5; 6. Các yếu tố cố định: nồng

độ enzyme 0,2% v/w, nhiệt độ 500C, tỷ lệ enzyme pectinase và cellulase (được xác

định ở mục 2.2.2.1), tỷ lệ NL/DM (được xác định ở mục 2.2.2.2) và thời gian (được

xác định ở mục 2.2.2.3). Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu

theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ

Thí nghiệm được thực hiện với nhiệt độ: 40; 45; 50; 55 và 600C. Các yếu tố cố định:

nồng độ enzyme 0,2% v/w (tỷ lệ enzyme pectinase và cellulase (được xác định ở mục

2.2.2.1), tỷ lệ NL/DM (được xác định ở mục 2.2.2.2), thời gian (được xác định ở mục

2.2.2.3) và pH (được xác định ở mục 2.2.2.4). Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí

nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng

oxy hóa.

2.2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme

Thí nghiệm được thực hiện với nồng độ enzyme: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5% (v/w). Các

yếu tố cố định: tỷ lệ enzyme pectinase và cellulase (được xác định ở mục 2.2.2.1), tỷ

lệ NL/DM (được xác định ở mục 2.2.2.2), thời gian (được xác định ở mục 2.2.2.3),

pH (được xác định ở mục 2.2.2.4) và nhiệt độ (được xác định ở mục 2.2.2.5). Khối

lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng

polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.3. Trích ly vỏ mãng cầu ta bằng phương pháp khuấy từ

2.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly

Thí nghiệm được thực hiện ở các thời gian trích ly lần lượt 30, 40, 50, 60 phút. Các

yếu tố cố định: nhiệt độ 600C, tỷ lệ NL/DM là 1/25 và nồng độ ethanol 50%. Khối

lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng

polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol

Thí nghiệm được thực hiện ở các nồng độ ethanol lần lượt là 40%, 50%, 60%, 70%.

Các yếu tố cố định: nhiệt độ 600C, tỷ lệ NL/DM là 1/25 và thời gian trích ly (được

xác định ở mục 2.2.3.1). Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu

theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Thí nghiệm được thực hiện ở tỷ lệ NL/DM lần lượt là 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 (g/mL).

Các yếu tố cố định: nhiệt độ 600C, thời gian trích ly (được xác định ở mục 2.2.3.1)

và nồng độ ethanol (được xác định ở mục 2.2.3.2). Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi

thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng

oxy hóa.

2.2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly

Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ lần lượt là 400C, 500C, 600C, 700C. Các yếu tố

cố định: thời gian trích ly (được xác định ở mục 2.2.3.1) nồng độ ethanol (được xác

định ở mục 2.2.3.2) và tỷ lệ NL/DM (được xác định ở mục 2.2.3.3). Khối lượng vỏ

mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol

và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.4. Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có hỗ trợ vi sóng

2.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol

Thí nghiệm được thực hiện ở các nồng độ ethanol lần lượt là 40%, 50%, 60%, 70%.

Các yếu tố cố định: tỷ lệ NL/DM 1/25, thời gian 3 phút, công suất 166 W. Khối lượng

vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng

polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Thí nghiệm được thực hiện ở tỷ lệ NL/DM: 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 (g/Ml). Các yếu tố

cố định: thời gian trích ly 3 phút, công suất 166 W và nồng độ ethanol (được xác định

ở mục 2.2.4.1). Khối lượng vỏ mãng cầu của mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí

nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly

Thí nghiệm được thực hiện ở các thời gian trích ly: 1, 3, 5, 7 phút. Các yếu tố cố định:

công suất 166 W, nồng độ ethanol (được xác định ở mục 2.2.4.1) và tỷ lệ NL/DM

(được xác định ở mục 2.2.4.2). Khối lượng vỏ mãng cầu mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu

theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa.

2.2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng công suất vi sóng

Thí nghiệm được thực hiện ở công suất lần lượt là 95, 166, 214, 284 W. Các yếu tố

cố định: nồng độ ethanol (được xác định ở mục 2.2.4.1) và tỷ lệ NL/DM (được xác

định ở mục 2.2.4.2), thời gian (được xác định ở mục 2.2.4.3). Khối lượng vỏ mãng

cầu mỗi thí nghiệm 2g. Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hàm lượng polyphenol và hoạt

tính kháng oxy hóa.

2.2.4.5. Tối ưu hóa trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong vỏ mãng

cầu ta có hỗ trợ vi sóng

Thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có hỗ trợ

vi sóng được thiết kế theo phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface

methodology) (Box- Belnken,1960) với 3 lần thí nghiệm lặp tại điểm tâm, sử dụng

phần mềm JMP để bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu. Với các biến độc lập nồng độ

ethanol (X1, %); thời gian (X2, phút); tỷ lệ NL/DM (X3, g/mL); công suất trích ly (X4,

W). Với biến phụ thuộc là hàm lượng TPC (Y1, mg GAE/g DW); hoạt tính kháng oxy

hóa theo DPPH (Y2, mol TE/g DW); hoạt tính kháng oxy hóa theo ABTS (Y3, mol

TE/g DW). Phạm vi và giá trị tại tâm của các biến độc lập được bố trí theo Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Bảng giá trị thực và mã hóa của biến độc lập

Khoảng biến thiên Yếu tố Ký hiệu

-1 50 0 60 1 70 Nồng độ ethanol (%) X1

3 5 7 Thời gian (phút) X2

X3 1/20 1/25 1/30 Tỷ lệ NL/DM (g/mL)

Công suất X4 154 214 274

Hàm lượng TPC, hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH, ABTS được biểu diễn theo

phương trình hồi quy:

+ + Yi = Bo +

Trong đó: Yi :là hàm mục tiêu; Bo là hằng số, Bi hệ số bậc 1; Bii hệ số bậc 2 và Bij là

tương tác các biến độc lập trong phương trình hồi quy; Xi, Xj là biến độc lập

2.2.5. Sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu, xác định tính chất hóa lý bột sấy phun

Mục đích: chọn chất mang phù hợp có thể giữ được hàm lượng polyphenol cao và có

hoạt tính kháng oxy hóa tối ưu; đánh giá các tính chất hóa lý bột sấy phun.

Cách tiến hành: Trong nghiên cứu này, dịch chiết vỏ mãng cầu ta được tiến hành trích

ly theo các thông số tối ưu (mục 2.2.4.5), tiến hành ly tâm, lọc thô, lọc tinh rồi cô đặc

chân không ở 45°C bằng thiết bị cô quay (Bibby RE-301, Vương quốc Anh) cho đến

khi dung dịch đạt 40Brix. Sau đó, phối trộn dịch chiết với maltodextrin (MD), gum

arabic (GA) lần lượt như sau: MD 10%, MD 12%, MD 14%, MD 16%; GA 6%, GA

8%, GA 10%, GA 12% and GA 14%; hỗn hợp dung dịch được đồng hóa với tốc độ

khuấy 2000 vòng/phút trong 5 phút, lọc. Các thông số sấy phun như sau: tốc độ dòng

cấp 500 - 750 mL/giờ, áp suất máy nén 2,5 - 3 bar, nhiệt độ đầu vào và đầu ra lần lượt

150°C và 80°C.

Các chỉ tiêu phân tích: TPC, TEAC và các tính chất hóa lý bột sấy phun (độ ẩm, dung

trọng, góc nghỉ, hình dạng, phân bố kích thước hạt v.v.)

2.2.6. Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn (shelf-life) bảo quản dịch chiết, bột

sấy phun

Dự đoán về thời hạn sử dụng các sản phẩm thực phẩm thường dựa trên các nguyên

tắc động học phản ứng hóa học phụ thuộc nhiệt độ. Hệ số nhiệt độ Q10 được dùng để

dự đoán gián tiếp thời hạn sử dụng sản phẩm, dựa trên tỷ lệ thời gian suy giảm hoạt

chất cần xác định ở hai nhiệt độ khác nhau (cách nhau 10oC). Hệ số này thường được

áp dụng để tiết kiệm thời gian khảo sát vì có thể dự đoán thời hạn sử dụng một cách

nhanh chóng và chính xác (Muoi và Quoc, 2018).

Mục tiêu: dự đoán thời gian bảo quản hàm lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng

oxy hóa của dịch chiết và bột sấy phun vỏ mãng cầu ta theo thời gian bảo quản dựa

trên mô hình dự đoán shelf-life của dịch chiết và bột sấy phun.

Cách tiến hành khảo sát: dịch chiết vỏ mãng cầu ta được trích ly có hỗ trợ vi sóng

với các thông số tối ưu mục 2.2.4.5 sau đó lọc thô, ly tâm 8000 vòng/phút, thời gian

5 phút, lọc tinh, cô quay chân không, tiếp theo định mức 50mL bằng nước cất và đựng

trong chai thủy thủy tinh tối màu. Mẫu bột sấy phun được thu nhận mục 2.2.4 có hàm

lượng TPC, TEAC cao nhất được chọn để đánh giá shelf-life, bột được đóng gói trong

túi PE (kích thước 4cmx6,5cm có ziplock đáy phẳng có ghép mí và bao bởi túi PE

lớn (kích thước 15cmx 20cm) có ziplock đáy phẳng. Cả dịch chiết và bột sấy phun

được bảo quản trong tủ vi khí hậu độ ẩm 85% ở 2 mức nhiệt độ lần lượt là 60oC và

70oC trong khoảng thời gian 7 ngày.

Hàm mục tiêu: hàm lượng TPC và TEAC theo thời gian bảo quản.

2.2.7. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết

và bột sấy phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta

Mục đích: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi sinh vật gây bệnh

thường gặp bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy.

Yếu tố khảo sát: nồng độ dịch chiết: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 10 mg/mL; nồng độ

bột sấy phun: 800, 400, 200, 100, 50, 25 mg/mL được hòa tan trong DMSO 5%.

Yếu tố cố định: thể tích môi trường MHA cho vào đĩa petri: 25 mL/đĩa (Wiegand và

ctv, 2008). Giống vi khuẩn: Staphylococus aureus (ATCC 29213), Bacillus cereus

(ATCC 10876), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC

14028), Shigella spp. và Lysteria spp. Số lượng tế bào vi khuẩn trong dịch vi khuẩn

thử nghiệm: 108 vi khuẩn/mL. Lượng dịch vi khuẩn cho vào mỗi đĩa: 100 µl (Bayer

và ctv, 1966). Lượng dịch mẫu nghiên cứu cho vào đĩa giấy kháng khuẩn: 10 µl. Nhiệt

độ nuôi vi khuẩn: 37,50C. Đối chứng dương gentamycin 10 μg/đĩa, đối chứng âm

DMSO 5%. Thời gian đọc kết quả 18-24 giờ.

Chỉ tiêu khảo sát: đường kính vòng kháng khuẩn (đường kính vòng kháng khuẩn gồm

Giống vi sinh vật

Hấp tiệt trùng 121°C trong 20 phút.

Cấy ria tạo khuẩn lạc đặc trưng

Môi trường NBA

Đổ đĩa

Ủ 24 giờ, 37°C

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy trên

Hấp tiệt trùng 121°C trong 20 phút.

Môi trường NBA

môi trường thạch nghiêng

Đổ thạch nghiêng.

Ủ 24 giờ, 37°C. Dịch vi khuẩn hòa tan vào 6ml nước

muối sinh lý, lắc đều. Đo OD 625 nm.

Nước muối sinh lý

So sánh với độ lệch chuẩn Mcfarland, điều

Hấp tiệt trùng 121°C trong

Môi trường MHA

20 phút. Đổ đĩa

chỉnh đến mật độ 1,5x10

CFU/ml.

Cao chiết/ /bột

Hút 0,1 ml vi khuẩn trải khô

trên đĩa thạch

10µ dịch ứng với mõi nồng độ

Đặt đĩa giấy đã thấm dịch mãng

cầu vào đĩa thạch

Ủ 16- 24 giờ ở nhiệt độ 37°C

DMSO 5%

Gentamycin 10µg/đĩa

Đo vòng kháng

đường kính đĩa giấy và vòng vô khuẩn).

Hình 2.3 Sơ đồ kháng khuẩn

2.2.8. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu

Sau 7 ngày, chuột được nuôi để thích nghi, 60 con chuột đực được phân bố ngẫu

nhiên thành các nhóm (n = 6). Quy trình thử nghiệm được tuân thủ nghiêm ngặt theo

tuyên bố Helsinki (2007) (Lahoti và ctv, 2014).

Nghiên cứu được thiết kế dựa trên các khuyến nghị của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

(Akramas và ctv, 2015) và theo hướng dẫn đánh giá độc tính thảo dược của tổ chức

hợp tác và phát triển tinh tế (Trio và ctv, 2014), hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng

và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày

27/10/2015 của Cục trưởng Cục Khoa học Công nghệ và Đào tạo, Bộ Y tế, Việt Nam.

Các khuyến nghị đã được tuân theo về số lượng và giới tính của động vật được sử

dụng (Olaya và ctv, 2010).

Thử nghiệm độc tính cấp tính

Nghiên cứu độc tính cấp tính qua đường miệng của dịch chiết được đánh giá theo

hướng dẫn 423 của tổ chức hợp tác kinh tế và phát triển trên chuột Swiss albino đực

(23 ± 2g) với liều thử nghiệm giới hạn là 7000 mg/kg thể trọng. Liều lượng được tính

bằng cách đánh giá hàm lượng chất khô trong chiết xuất (cao chiết sử dụng cho chuột

uống được pha loãng trong nước cất). Động vật được cho nhịn ăn qua đêm trước mỗi

thí nghiệm. 30 chuột đực được chia thành 5 nhóm (n = 6). Nhóm 1 là đối chứng âm,

nhóm 2, 3, 4, 5 là nhóm được thử nghiệm uống dịch chiết với liều 1000, 3000, 5000,

7000 mg/kg thể trọng. Trước khi chuột được uống dịch chiết, khối lượng cơ thể từng

con được xác định và liều lượng dịch chiết được tính theo khối lượng cơ thể. Các con

chuột được quan sát trong 24 giờ đầu sau khi uống. Sau đó, chuột tiếp tục uống dịch

chiết trong 7 ngày liên tục và theo dõi đến 14 ngày về những biểu hiện hành vi, nhiệt

độ, hô hấp, co giật, run, màu mắt, da, khối lượng cơ thể, lượng thức ăn, nước uống.

Sau đó, động vật được gây chết bằng cách cho hít khí CO2 và tiến hành giải phẫu

(Bachmanov và ctv, 2002; Webster và Liljegren, 1955).

Thử nghiệm độc tính bán mãn tính

Nghiên cứu độc tính mãn bằng đường uống được thực hiện theo hướng dẫn 407 của

Tổ chức Hợp tác Kinh tế và Phát triển. Chuột Swiss albino đực trưởng thành khỏe

mạnh (23 ± 2g) được chia thành 5 nhóm (n = 6) và được nuôi trong điều kiện tiêu

chuẩn. Nhóm 1 là nhóm đối chứng và 4 nhóm còn lại là nhóm thử nghiệm uống dịch

chiết với liều lượng là 100, 300, 500, 700 mg/kg thể trọng (liều lượng được tính bằng

cách đánh giá hàm lượng chất khô trong chiết xuất, cao chiết được pha loãng trong

nước cất trước khi cho chuột uống) trong 60 ngày liên tục và theo dõi đến 90 ngày

(Kifayatullah và ctv, 2015). Những con chuột được quan sát hàng ngày về các hành

vi bất thường và các dấu hiệu bất lợi khác của độc tính. Mức tiêu thụ thức ăn, nước

uống, khối lượng cơ thể được ghi lại hàng tuần. Vào cuối quá trình thử nghiệm, sử

dụng khí CO2 để gây chết động vật thí nghiệm trước khi giải phẫu. Mẫu máu được

lấy cho các xét nghiệm huyết học, sinh hóa. Gan, thận, tim đã được thu thập, cân và

phân tích mô bệnh học (Bachmanov và ctv, 2002; Webster và Liljegren, 1955).

2.2.9. Ứng dụng dịch chiết mãng cầu trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột

Chuột đực Swiss Albino 6 tuần tuổi, có trọng lượng khoảng 32-34 g, được mua từ

Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh (Việt Nam). Tất cả các con chuột không được

giao phối. Chuột được nuôi tại nhà động vật trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí

Minh ở 25 ± 20C và độ ẩm 55 ± 5%, chế độ sáng/tối là 16 giờ ánh sáng/ 8 giờ tối mỗi

ngày ít nhất một tuần trước khi kiểm tra. Chuột được nuôi trong lồng, tiếp cận thực

ăn, đồ uống tự nhiên. Tất cả các quy trình về phúc lợi và thực nghiệm của động vật

được thực hiện theo hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm theo tuyên

bố Helsinki (1975) (Carlson và ctv, 2004).

Điều trị với các tác nhân thử nghiệm bắt đầu vào ngày thứ 7 (từ khi chuột được thu

nhận về). Các phương pháp điều trị sử dụng theo đường uống cho chuột. Chuột thí

nghiệm được chia thành nhiều nhóm:

Nhóm đối chứng: 5 con chuột trong nhóm này, chúng được tự do tiếp cận với nước

và thức ăn trong 12 ngày.

Nhóm mô hình viêm khớp dạng thấp (FCA): 25 con chuột trong nhóm này, chúng

tiêm với liều duy nhất 0,1 mL FCA cho mỗi con chuột. Sau đó, chúng được nuôi theo

dõi trong 12 ngày tiếp theo (Lee và ctv, 2004).

Sau thành công mô hình viêm khớp dạng thấp (12 ngày), những con chuột của nhóm

FCA bị viêm khớp được chia thành 5 nhóm: 5 con chuột/nhóm, chuột được điều trị

trong 10 tuần.

(i) Nhóm đối chứng tiêu cực (không được điều trị): 5 con chuột trong nhóm này được

ăn thức ăn và nước bình thường trong 10 tuần.

(ii) Nhóm đối chứng tích cực (mobic): 5 con chuột trong nhóm này điều trị bằng

đường uống thuốc với liều lượng 1 mg mobic/kg thể trọng, hai lần mỗi ngày trong 10

tuần (Lee và ctv, 2004).

(iii) Dịch chiết vỏ mãng cầu ta liều thấp, 200 mg/kg/ngày (ASL): 5 con chuột trong

này nhóm được điều trị bằng đường miệng với 200 mg chiết xuất vỏ quả mãng cầu/kg

thể trọng, hai lần mỗi ngày trong 10 tuần.

(iv) Dịch chiết vỏ mãng cầu liều trung bình, 300 mg/kg/ngày (ASM): 5 con chuột ở

nhóm này được điều trị bằng miệng với 300 mg chiết xuất vỏ quả mãng cầu/ kg thể

trọng, hai lần mỗi ngày trong 10 tuần.

(v) Dịch chiết vỏ mãng cầu liều cao, 400 mg/kg/ngày (ASH): 5 con chuột trong này

nhóm được điều trị bằng miệng với 400 mg chiết xuất vỏ quả mãng cầu/kg thể trọng,

hai lần mỗi ngày trong 10 tuần (Zhang và ctv, 2014).

Các thông số theo dõi: trọng lượng cơ thể, đường kính khớp, thể tích cẳng chân (mức

độ phù nề), nhiệt độ bàn chân và phân tích huyết học và sinh hóa máu, đánh giá mô

học khớp được thực hiện trong quá trình nghiên cứu.

2.2.10. Ứng dụng dịch chiết bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh

Chuẩn bị dịch chiết vỏ mãng cầu Annona squamosa L.

Tiến hành trích ly polyphenol từ bột vỏ mãng cầu có hỗ trợ vi sóng với dung môi

ethanol 60%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 25/1 (v/w), công suất 214 W, thời gian 5

phút. Dịch chiết thu được đem ly tâm (lực ly tâm tương đối (RCF) 2403 xg, 15 phút)

bỏ bã sau đó lọc tinh bằng giấy Whatman số 4 và cô quay chân không với thiết bị cô

quay (KIA, Bibby RE-301, Vương quốc Anh) cho đến khi bay hơi hết dung môi. Dịch

chiết tiến hành xác định TPC và bảo quản trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ 0 -

40C.

Chuẩn bị dung dịch chitosan 1,5% có bổ sung dịch chiết vỏ mãng cầu ta và mẫu

tôm

Chuẩn bị dung dịch chitosan 1,5%: cân 15g chitosan (loại thực phẩm) hòa tan 900

mL nước cất, khuấy 10 phút, bổ sung 15 mL acid axetic băng rồi khuấy trong 1 giờ ở

400C, định mức 1000 mL bằng nước cất, bảo quản ở 4°C trong 16 giờ. Các chiết xuất

vỏ mãng cầu ta bổ sung vào dung dịch chitosan đã chuẩn bị trước với nồng độ 100

(M1), 200 (M2), 300 (M3) và 400 (M4) (mg GAE/L) của tổng hàm lượng polyphenol.

Tôm được làm sạch và chia ngẫu nhiên thành sáu nhóm: nhóm đối chứng (không

nhúng chitosan) (M), nhóm nhúng chitosan (M0), và các nhóm (M1, M2, M3 và M4)

nhúng vào dung dịch chitosan có bổ sung dịch chiết vỏ mãng cầu với nồng độ tương

ứng là 100, 200, 300 và 400 mg GAE/L ở 40C trong 20 phút. Sau đó, tôm được làm

ráo nước ở phòng nhiệt độ trong 10 phút để tạo màng chitosan. Các mẫu tôm được

đóng gói và được bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 10C. Sau đó, tôm sẽ được đo các thông số

hóa lý như khối lượng, pH, PV, TVB-N, TBARs, màu sắc, cấu trúc...vào ngày 0, 3,

6, 9 và 12 trong quá trình bảo quản.

2.3. Các phương pháp phân tích

2.3.1. Xác định phenolic tổng theo phương pháp Folin- Ciocalteu

Tổng hàm lượng polyphenol (TPC) được xác định theo phương pháp Folin- Ciocalteu

như được mô tả trong nghiên cứu (Sripakdee và ctv, 2015; El-Shourbagy và El-Zahar,

2014; Jagtap và Bapat, 2013) có chỉnh sửa. Dịch chiết mẫu (0,1 mL) phản ứng với

1,8 mL thuốc thử Folin Ciocalteu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thêm 1,2 mL natri

cacbonat (15%, w/v). Sau 90 phút đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm ở nhiệt độ

phòng. Kết quả được biểu thị bằng mg acid gallic đương lượng trên g mẫu khô (mg

GAE/g CK).

2.3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol theo phương pháp DPPH

Hoạt tính thu gom gốc tự do của chiết xuất vỏ mãng cầu theo gốc 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) được xác định theo phương pháp được mô tả bởi (El-

Shourbagy và El-Zahar, 2014; Jagtap và Bapat, 2013; Sripakdee và ctv, 2015) có

chỉnh sửa. Dịch chiết mẫu (0,1 mL) được bổ sung 4 mL thuốc thử DPPH và giữ trong

bóng tối ở nhiệt độ phòng thời gian 30 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 517

nm (Thermo, Genesys 10 UV). Trolox làm chất chuẩn và kết quả được biểu thị bằng

μmol trolox đương lượng trên gam mẫu khô (μmol TE/g CK).

2.3.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol theo phương pháp ABTS

Khả năng chống oxy hóa 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

(ABTS) xác định theo phương pháp được mô tả bởi (El-Shourbagy và El-Zahar, 2014;

Jagtap và Bapat, 2013; Sripakdee và ctv, 2015) có chỉnh sửa. Hút 0,1 mL dịch chiết

sau đó thêm 3 mL dung dịch ABTS để trong bóng tối ở nhiệt độ phòng với thời gian

15 phút. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 734 nm (Thermo, Genesys 10 UV). Trolox

làm chất chuẩn và kết quả được biểu thị bằng μmol trolox đương lượng trên gam mẫu

khô (μmol TE/g CK).

2.3.4. Định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học

Phân tích định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học được điều chỉnh từ các phương

pháp được mô tả bởi (Ayoola và ctv, 2008; Godghate và Sawant, 2013).

Tannin: 5 mL dịch chiết được pha với 10 mL nước cất và 2-3 giọt FeCl3 5%, xuất

hiện kết tủa xanh lục chứng tỏ có tanin ngưng tụ.

Steroid: 1 mL dịch chiết được trộn với 10 mL cloroform và 2-3 giọt acid sulfuric

đậm đặc, nếu hình thành một lớp màu vàng, có sự hiện diện của steroid.

Terpenoids: 2 mL dịch chiết được trộn với 2 mL anhydrit axetic và 2-3 giọt acid

sulfuric đậm đặc, xuất hiện giao diện màu xanh lá cây cho thấy sự hiện diện của

terpenoit.

Saponin: 5 mL dịch chiết và 10 mL nước cất được khuấy trộn 30 phút trong ống

đong, có xuất hiện bọt, cho thấy dịch chiết có saponin.

Anthocyanin: 2 mL dịch chiết được trộn với 2 mL HCl 2N và 2-3 giọt NH3, dung

dịch có màu đỏ hồng chuyển sang màu xanh lam, kết luận có sự hiện diện của

anthocyanin.

Coumarin: 2 mL dịch chiết được thêm vào 3 mL NaOH 10%, dung dịch xuất hiện

màu vàng cho thấy có coumarin.

Emodin: 2 mL dịch chiết được thêm vào 2 mL NH4OH và 3 mL benzen, dung dịch

xuất hiện màu đỏ cho thấy sự hiện diện của emodin.

Leucoanthocyanin: 5 mL dịch chiết được thêm vào 5 mL rượu isoamyl, dung dịch

xuất hiện lớp màu đỏ bên trên cho thấy sự hiện diện của leucoanthocyanidin.

2.3.5. Xác định thời hạn bảo quản (Shelf - life) cao chiết, bột sấy phun vỏ mãng

cầu

Dự đoán về thời hạn sử dụng các sản phẩm thực phẩm dựa trên nguyên tắc động học

phản ứng hóa học phụ thuộc nhiệt độ. Để xác định thời gian bảo quản sản phẩm nhanh

nhất, người ta sử dụng Q10 - là một hệ số dùng để dự đoán gián tiếp thời hạn sử dụng

sản phẩm, dựa trên tỷ lệ thời gian suy giảm hoạt chất cần xác định ở hai nhiệt độ khác

nhau (thường cách nhau 100C). Hệ số này thường được áp dụng để tiết kiệm thời gian

do có thể dự đoán thời hạn sử dụng một cách nhanh chóng và chính xác (Fu và

Labuza, 1993).

0𝐶

Hệ số Q10 được tính toán theo công thức (2-1) (Xiao, 2000)

𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0+10𝑜𝐶)

0C: là thời

(2 - 1) 𝑄10 =

Trong đó: Q10: là hệ số nhiệt độ khi tăng nhiệt độ lên 100C; Shelf life at T0

gian bảo quản hàm lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng oxy hóa khảo sát được ở

các thí nghiệm trên ở 600C (ngày); Shelf life at T0+100C: là thời gian bảo quản hàm

0C: là nhiệt độ bảo quản ở 600C.

lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng oxy hóa ở các thí nghiệm trên ở 700C, (ngày);

Thời gian bảo quản hàm lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng oxy hóa của cao

𝑇1−𝑇2 10

chiết và bột sấy phun vỏ mãng cầu ta ở 300C được dự đoán theo công thức (2 - 2)

(2 - 2) 𝑓2 = 𝑓1 ∗ 𝑄10

Trong đó: f2: là thời gian bảo quản hàm lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng oxy

hóa được ước tính ở nhiệt độ bảo quản 300C (ngày); f1: là thời gian bảo quản hàm

lượng polyphenol tổng, hoạt tính kháng oxy hóa ở 600C (ngày); T1: là nhiệt độ bảo

quản ở 600C; T2: là thời gian bảo quản được dự đoán 300C.

2.3.6 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý tôm thẻ chân trắng

Xác định sự thay đổi khối lượng

Tôm được bảo quản trong túi polyethylen, cân bằng cân phân tích (phòng thí nghiệm)

lặp lại ba lần. Tỷ lệ hao hụt khối lượng tôm trước và sau khi bảo quản được sử dụng

để tính toán mức giảm khối lượng (%) (Wang và ctv, 2018).

Xác định giá trị pH

Xác định pH tôm được thực hiện theo (Mohammadalinejhad và ctv, 2020) với một ít

sửa đổi. Tôm được băm nhỏ và đem cân 1g, đồng nhất mẫu với 9 mL nước cất trong

60 phút. Hỗn hợp được đem đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong 2 phút. Đo

pH của hỗn hợp bằng máy đo pH, lặp lại 3 lần.

Xác định chỉ số oxy hóa lipid – peroxide (PV) của tôm thẻ chân trắng

Các giá trị peroxide được ước tính theo phương pháp chuẩn độ iốt (Maghami và ctv,

2019) có sửa đổi. Cân khoảng 5 g mẫu tôm cho vào ống li tâm, thêm 5 mL chloroform

và 10 mL acetic acid tiến hành lắc đều trên máy lắc, sau đó thêm 1 mL dung dịch KI

bão hòa; để yên trong bóng tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn; tiếp theo thêm

75 mL nước cất và vài giọt chất chỉ thị hồ tinh bột, lắc đều. Dung dịch Na2S2O3 được

sử dụng để tiến hành chuẩn độ đến khi màu xanh tím hay tím nhạt mất màu thì dừng

lại, ghi kết quả thể tích dung dịch Na2S2O3. Lặp lại các bước trên với mẫu trắng.

Xác định tổng nitơ bay hơi (TVB-N)

Tổng giá trị nitơ bay hơi được xác định theo phương pháp chưng cất nước với các

sửa đổi (Feng và ctv, 2016). Cân 5 g mẫu và 2 g MgO cho vào ống Kjeldahl, sau đó

cho thêm 50 mL nước cất bình cất. Bình nón chứa 25 mL H3BO3 1%, tiến hành chưng

cất trong 10 phút. Sau khi chưng cất, dung dịch thu được trong bình nón được chuẩn

độ bằng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh

sang hồng.

Xác định các chất phản ứng acid thiobarbituric (TBARs)

Quá trình oxy hóa lipid diễn ra thông qua cơ chế chuỗi gốc tự do tạo ra nhiều sản

phẩm cuối cùng, nổi bật là aldehyde. Một trong những aldehyde được nghiên cứu

nhiều nhất là malondialdehyde (MDA)– sản phẩm phụ cuối cùng của quá trình oxy

hóa lipid. Phương pháp phổ biến nhất để xác định là thông qua phản ứng của MDA

với TBA tạo ra một hợp chất dimeric màu hồng hấp thụ ở bước sóng 532 nm, từ đó

đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết.

Cân và nghiền 5 g mẫu, thêm 25 mL dung dịch TCA 7,5% tiến hành lọc và định mức

thành 50 mL. Hút 5 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 5 mL dung dịch TBA

0,02 M, đun hỗn hợp trên bằng phương pháp cách thủy sôi trong 40 phút, làm mát

đến nhiệt độ phòng và đo quang ở 532 nm (Liao và ctv, 2018).

Xác định giá trị màu sắc của tôm thẻ chân trắng

Mô hình L*a*b* là một tiêu chuẩn quốc tế cho phép đo màu do Commission

Internationale d’Eclairage (CIE) phát triển vào năm 1976. Hệ màu L*a*b* bao gồm

các thành phần như độ sáng với giá trị L* biểu thị độ đậm nhạt trên thang điểm từ 0

đến 100 cùng với hai thành phần màu trên thang điểm từ -120 đến +120: a* biểu thị

xanh lục (-) sang đỏ (+) và b* biểu thị xanh lam vàng (+) sang vàng (-). Các giá trị

L*, a*, b* thường được sử dụng trong phân tích thực phẩm (Yam và Papadakis,

2004).

Giá trị màu sắc được xác định bằng thiết bị đo màu Minolta model CR-400, trong

không gian màu CIE LAB ở ba vùng (đầu, thân và đuôi) trên vỏ tôm. Mỗi mẫu tôm,

được tiến hành đo ba lần tại mỗi vị trí và tính giá trị trung bình. Tổng khác biệt về

màu sắc (giá trị E), cho biết sự khác biệt màu sắc giữa các con tôm ở giai đoạn đầu

lưu trữ, sau khoảng thời gian lưu trữ và được tính toán theo công thức sau: ΔE =

√(𝐿 − 𝐿0)2 + (𝑎 − 𝑎0)2 + (𝑏 − 𝑏0)2, trong đó L0, a0 và b0 là giá trị của các tham số

màu L*, a* và b* khi bắt đầu lưu trữ (Yuan và ctv, 2016).

Xác định độ chắc của tôm thẻ chân trắng

TPA là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá cấu trúc của thực phẩm. Ưu

điểm chính của TPA là có thể đánh giá nhiều biến (độ cứng, độ đàn hồi, độ kết dính,

độ dính, độ đàn hồi, độ dễ gãy, độ dẻo, độ dai...) với một chu kỳ nén kép (Huidobro

và ctv, 2001).

Phương pháp xác định cấu trúc của tôm đã được thực hiện bằng máy đo cơ lý (Texture

Analyzer, Brookfield CT3, USA) với một ít sửa đổi (Farajzadeh và ctv, 2016). Thịt

tôm được cắt ở đoạn thân giữa (đốt thứ 3 và 4) với kích thước khoảng 1x1x1 cm, sau

đó được đặt trên tấm phẳng. Tiến hành phép đo bằng pít tông hình trụ đường kính

38,1 mm (TA4/1000). Con tôm bị nén đến 20% chiều cao với 2 chu kỳ liên tiếp, thời

gian giữa mỗi chu kỳ là 1 giây, tốc độ biến dạng 1 mm/s, lực nén 1N. Xác định các

giá trị gồm độ cứng (hardness) và độ đàn hồi (springiness) của tôm thẻ chân trắng.

2.3.7. Xác định một số tính chất hóa lý của bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta

Xác định dung trọng của khối bột: bột (2 g) được chuyển vào ống đong 10 mL có

chia vạch. Tỷ trọng khối bột được tính bằng tỷ lệ khối lượng bột và thể tích (thể tích

ống đong bột chiếm) (Nishad và ctv, 2017).

Xác định độ hút ẩm: cân 1,5 g bột sấy phun vào hộp kín, đặt trong bình hút ẩm có

chứa dung dịch bão hòa natri cacbonat trong 7 ngày bảo quản. Độ hút ẩm được định

nghĩa là khối lượng ẩm (g) được hấp thụ bởi 100 g bột (Quoc và Muoi, 2018).

Xác định chỉ số hòa tan trong nước (WSI): 2 g bột sấy phun hòa tan 25 mL nước

cất, cho vào ống ly tâm 100 mL, ủ trong 30 phút ở 370C, ly tâm ở tốc độ 5000

vòng/phút trong 20 phút. Phần nổi phía trên được tách ra sấy khô đến khối lượng

không đổi ở 103 ±20C. WSI được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa khối lượng phần bột

vừa sấy khô so với lượng bột ban đầu (Nishad và ctv, 2017).

Xác định góc nghỉ: góc nghỉ được xác định dựa trên góc được hình thành giữa mặt

bên và mặt đáy của hình nón thu được khi đổ bột từ một độ cao cố định qua một cái

phễu trên một mặt phẳng nằm ngang (Moreira và ctv, 2009).

Xác định hiệu suất sấy phun: hiệu suất sấy phun được biểu thị bằng phần trăm trọng

lượng khô của sản phẩm cuối cùng so với tổng lượng hàm lượng chất khô của nguyên

liệu đầu vào (Pereira và ctv, 2014).

Độ ẩm: bột sấy phun được xác định dựa trên phương pháp AOAC (AOAC, 2005).

Đo màu: giá trị màu được xác định bằng hệ thống CIE L*, a*, b* bằng máy đo màu

Minolta (model CR-400). Cảm biến đã được hiệu chuẩn với một ô tiêu chuẩn màu

trắng. L* đại diện cho độ sáng trên thang điểm từ 0 (tối) đến 100 (sáng). Trong đó:

a* là thành phần đại diện cho sự khác biệt giữa màu xanh lá cây và màu đỏ, và b* đại

diện cho sự khác biệt giữa màu xanh lam và màu vàng (Quek và ctv, 2007). Các phép

đo màu được lặp lại ba lần cho mỗi mẫu và giá trị trung bình được ghi lại.

Xác định kích thước hạt: kích thước hạt của bột sấy phun vỏ mãng cầu được xác

định bằng cách sử dụng máy phân tích phân bố kích thước hạt tán xạ laser (Horiba

LA-960, Nhật Bản).

2.3.8. Các thông số đánh giá tính an toàn của dịch chiết vỏ mãng cầu ta

Quan sát lâm sàng và tỷ lệ sống sót

Chuột được quan sát hàng ngày trong suốt 14 ngày nghiên cứu độc tính cấp tính và

90 ngày nghiên cứu độc tính bán mãn tính. Sự thay đổi các dấu hiệu được so sánh với

tình trạng cơ bản như hệ thần kinh trung ương (hoạt động vận động, mất điều hòa,

phản xạ nghiêng, phản xạ giác mạc, liệt bàn chân, hoạt động cầm nắm, phản ứng báo

động, run, giật đầu và co giật); mắt (nhãn khoa, ngoại nhãn, giãn đồng tử, rung giật

nhãn cầu, chảy nước mắt, giãn màng mi và đục giác mạc); da (xanh xao, tím tái và

sung huyết); các dấu hiệu chung (tiết nước bọt, cương cứng ở đuôi, tiêu chảy, mất

nước, khó thở, chảy nước mũi, thụ động, hung hăng, sợ hãi) (Sathishkumar và ctv,

2012).

Khối lượng cơ thể

Động vật được cân hàng tuần và ngày cuối cùng của quá trình thử nghiệm bằng cân

(𝑊𝑓−𝑊𝑖)

điện tử (GS-SHINKO, Nhật Bản), mức độ tăng trọng (%) theo công thức (2-3):

𝑊𝑖

Mức độ tăng trọng (%) = 𝑥 100 (2-3)

Trong đó: Wf: khối lượng cuối cùng; Wi: khối lượng đầu (Kim và ctv, 2015)

Thức ăn, nước uống tiêu thụ

Lượng thức ăn và nước uống được ghi lại hàng ngày. Lượng thức ăn và nước tiêu thụ

được đo lường trước khi cung cấp cho mỗi nhóm, phần còn lại được thu nhận và tính

toán vào ngày hôm sau để có được sự khác biệt. Thức ăn hàng ngày tính theo đơn vị

g/ngày và lượng nước tiêu thụ là mL/ngày (Ballou và Lozanski, 1992).

2.3.9. Phân tích huyết học và sinh hóa máu

Vào ngày cuối cùng của quá trình thí nghiệm, các con chuột được gây chết bằng khí

CO2 sau khi nhịn ăn qua đêm (8 giờ). Mẫu máu được lấy vào ống nghiệm có acid

ethylen diamine tetra axetic làm chất chống đông máu để phân tích huyết học. Máu

đựng trong ống nghiệm không có acid ethylene diamine tetra acetic dùng để phân tích

sinh hóa, đông lại sau khi ly tâm ở 2500 v/phút trong 15 phút và thu huyết thanh. Mẫu

máu được bảo quản ở 40C và gửi đến cơ quan xét nghiệm để phân tích huyết học,

sinh hóa. Hồng cầu (RBC), hemoglobin (HGB), tiểu cầu (PLT), bạch cầu (WBC),

bạch cầu mono (MONO), bạch cầu lympho (LYM), bạch cầu hạt (GRA) của các

nhóm thử nghiệm (uống dịch chiết) được xác định và so sánh với nhóm đối chứng.

Phân tích sinh hóa được thực hiện trên huyết thanh sau khi ly tâm máu và các thông

số như tổng protein, glucose, riglyceride, aspartate transaminase (AST), alanine

transaminase (ALT), ankaline phosphat (ALP), creatin, urê được xác định cho nhóm

đối chứng và nhóm uống dịch chiết.

2.3.10. Xác định khối lượng cơ quan tương đối

Sau khi lấy máu, các cơ quan quan trọng như gan, thận, tim, dạ dày của nhóm uống

dịch chiết được tách ra, cân khối lượng từng cơ quan trên cân điện tử (M) và so sánh

với nhóm đối chứng (Müller-Ladner và ctv, 2005). Khối lượng cơ quan tương đối

(ROW) của mỗi con chuột được tính theo công thức (2-4):

𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑛ộ𝑖 𝑡ạ𝑛𝑔 𝑡𝑢𝑦ệ𝑡 đố𝑖 (𝑔)

𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ơ 𝑡ℎể 𝑐ℎ𝑢ộ𝑡 𝑣à𝑜 𝑛𝑔à𝑦 𝑝ℎẩ𝑢 𝑡ℎ𝑢ậ𝑡 (𝑔)

ROW (%) = 𝑥100 (2-4)

2.3.11. Phân tích nước tiểu

Các con chuột được đặt riêng lẻ trong các lồng kính đã khử trùng, có sẵn nước, nhưng

không có thức ăn. Nước tiểu được thu thập 0,3 mL trong 16 giờ. Sau đó đo lượng

nước và lượng nước tiểu. Các thông số xét nghiệm gồm thể tích, glucose, thể ceton,

pH, khối lượng riêng, tế bào máu, protein nước tiểu phân tích bằng máy phân tích

nước tiểu Siemens Clinitek (Đức) (Halldorsdottir và ctv, 2000).

2.3.12. Đánh giá mô học

Gan, thận, tim, dạ dày được bảo quản trong dung dịch formandehyt 10%, cố định

trong 36 - 48 giờ và trải qua các quy trình mô học thông thường để kiểm tra mô bệnh

học. Các phần mô được kiểm tra dưới kính hiển vi với vật kính x 10 để kiểm tra hình

thái, tình trạng tế bào và mô (Halldorsdottir và ctv, 2000).

2.3.13. Đánh giá các thông số thực nghiệm mô hình trị viêm khớp dạng thấp ở

chuột bằng dịch chiết vỏ mãng cầu ta

Trọng lượng, nhiệt độ, đường kính, thể tích: Mức độ nghiêm trọng của viêm khớp

và khả năng hồi phục khớp được xác định bằng sự thay đổi trọng lượng cơ thể, nhiệt

độ bàn chân, đường kính khớp, thể tích cẳng chân. Các thông số trên được đo vào các

ngày 3, 6, 9 và 12 (sau khi khởi phát viêm khớp) và các tuần 4, 6, 8 và 10 (sau khi

bắt đầu uống dịch chiết). Sử dụng thước đo kỹ thuật số verniercalliper đo đường kính

khớp cổ chân tại vùng cẳng – bàn chân (Gate và ctv, 2014).

Đo mức độ phù nề (thể tích) cẳng chân chuột bằng phương pháp đo thể tích nước sử

dụng plethysmometer. Sử dụng nhiệt kế hồng ngoại microlife để đo nhiệt độ bàn chân

(Lahoti và ctv, 2014).

Phân tích huyết học và sinh hóa máu: chuột được gây mê, máu thu nhận từ tĩnh

mạch đuôi, được đựng trong ống tráng K2EDTA, bảo quản lạnh ở 40C. Sau đó, mẫu

máu được gửi đến khoa huyết học và sinh hóa, bệnh viện 175 Thành phố Hồ Chí

Minh để phân tích và đọc kết quả (Akramas và ctv, 2015).

Đánh giá mô học: mô khớp chuột được cố định trong formalin 10%, mẫu được gửi

đến khoa giải phẫu bệnh, bệnh viện 175 Thành phố Hồ Chí Minh để nhuộm mẫu mô

và đọc kết quả.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thống kê và xử lý trên Excel. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy

giá trị trung bình. Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV để phân tích thống

kê số liệu thí nghiệm, đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu phân tích.

Xử lý số liệu thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm kiểu

thí nghiệm phối hợp có tâm (CCD) được bố trí bằng phần mềm JMP 14.2. Mối quan

hệ giữa yếu tố khảo sát và chỉ tiêu theo dõi thể hiện dưới dạng bề mặt đáp ứng. Phương

trình hồi quy bậc 2 được xây dựng để xác định ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến

chỉ tiêu theo dõi.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến TPC và TEAC của vỏ mãng cầu ta

Nguyên liệu vỏ mãng cầu có độ ẩm cao (65-68%) được hành sấy đối lưu ở nhiệt độ

từ 500C đến 800C đến đạt độ ẩm khoảng 12%. Hàm ẩm vỏ mãng cầu theo thời gian

Độ ẩm (%)

50℃ 60℃ 70℃ 80℃

Thời gian (giờ)

sấy ở những nhiệt độ khác nhau được0thể hiện ở Hình 3.1.

Hình 3.1 Độ ẩm nguyên liệu theo thời gian sấy ở những nhiệt độ khác nhau

Quá trình sấy khô giúp kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm do giảm hoạt độ nước,

ngăn cản sự phát triển vi sinh vật, ức chế hoạt động enzyme (Capecka và ctv, 2005).

Nhiệt độ sấy càng cao, thời gian sấy càng ngắn, cụ thể: khi sấy ở 500C thời gian sấy

10 giờ; nhưng khi sấy 600C, 700C, 800C thì thời gian sấy giảm từ 8 giờ đến 5,5 giờ.

Quá trình sấy diễn ra do chênh lệch áp suất hơi riêng phần nước giữa bề mặt nguyên

liệu và môi trường xung quanh. Nhiệt độ sấy càng cao, khả năng truyền nhiệt không

khí nóng vào nguyên liệu càng lớn nên ẩm trên bề mặt nguyên liệu sẽ bốc hơi nhanh

hơn so với sấy ở nhiệt độ thấp.

Khi sấy vỏ mãng cầu đến độ ẩm yêu cầu (khoảng 12%), đem đi nghiền mịn (hạt có

kích thước ≤0,5 mm) để giảm kích thước hạt, tăng diện tích truyền khối, tăng tốc độ

giải phóng hợp chất có hoạt tính sinh học vào dung môi (Bach và ctv, 2020).

Tiếp theo, bột vỏ mãng cầu được trích ly bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi

nước, tỷ lệ NL/DM là 1/8, thời gian 60 phút, nhiệt độ 600C dịch chiết thu được có

TPC và TEAC có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu bột vỏ mãng cầu ở

nhiệt độ sấy khác nhau (p<0,05). Ở nhiệt độ sấy 600C, dịch chiết vỏ mãng cầu ta có

TPC, TEAC giá trị cao nhất lần lượt là 48,26±0,45 mg GAE/g CK; 240,22±1,10 µmol

TE/g CK (DPPH), 366,31±2,75 µmol TE/g CK (ABTS) chứng tỏ nhiệt độ sấy ảnh

DPPH

ABTS

TPC b

a a

hưởng rất lớn đến TPC và TEAC.

K C g / E T

K C g / E A G g m

l o m 

400 350 300 250 200 150 100 50 0

Nhiệt độ sấy (C)

Hình 3.2 TPC và TEAC của vỏ mãng cầu theo nhiệt độ sấy

Hàm lượng TPC và TEAC của nguyên liệu sau khi sấy phụ thuộc nhiều vào nguyên

liệu, phương pháp xử lý nguyên liệu trước khi sấy, phương pháp sấy, nhiệt độ sấy,

phương pháp trích ly và dung môi sử dụng để trích ly v.v. Ở nhiệt độ sấy thấp, thời

gian sấy kéo dài, nguyên liệu tiếp xúc với oxy tăng, phản ứng oxy hóa do enzyme

oxydase xúc tác tăng làm giảm hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học (Yap và ctv,

2020). Kết quả nghiên cứu của nhóm tương đồng với nghiên cứu lá đu đủ sấy ở nhiệt

độ 600C giữ được TPC và TEAC cao hơn so với phương pháp phơi khô hoặc sấy ở

nhiệt độ 700C, 800C (Yap và ctv, 2020); do đó, chọn nhiệt độ 600C để sấy nguyên

liệu vỏ mãng cầu trong tất cả nghiên cứu của luận án.

3.2. Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu với sự hỗ trợ của

enzyme với dung môi nước

3.2.1. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase

Enzyme pectinase có pH tối ưu từ 4,0 – 5,0; nhiệt độ tối ưu từ 40 – 600C và cellulase

có pH tối ưu từ 4,5 – 6,0; nhiệt độ tối ưu từ 50 – 600C. Nhìn chung, hai enzyme này

có pH, nhiệt độ tối ưu gần nhau nên cũng thuận lợi khi thực hiện trích ly ở cùng điều

kiện thí nghiệm.

Vỏ quả mãng cầu ta có chứa các thành phần như: cellulose, hemicellulose, pectin, β-

glucan, gum, lignin và giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Quá trình nghiền

và trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ phóng thích cùng với dịch trích, dịch

trích có trạng thái keo, độ nhớt cao, hợp chất polyphenol khó thoát ra ngoài. Enzyme

pectinase phân cắt pectin, làm suy yếu hoặc phá vỡ thành tế bào; còn enzyme cellulase

phân cắt cellulose, hemicellulose có trong nguyên liệu giúp hợp chất polyphenol dễ

dàng thoát ra ngoài. Do vậy, chúng tôi sử dụng hỗn hợp hai enzyme pectinase và

cellulase để trích ly thu nhận polyphenol từ vỏ quả mãng cầu và tiến hành khảo sát tỷ

lệ hai enzyme để tìm ra tỷ lệ thích hợp.

Bảng 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase đến TPC và TEAC

TEAC

Tỷ lệ enzyme TPC (µmol TE/g CK)

pectinase/cellulase (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

0/3 51,52± 0,39a 387,89± 4,51a 707,20 ± 2,67a

2/1 55,89 ± 0,55b 416,65± 5,58b 765,09 ± 5,65b

1/1 56,16± 0,45b 560,60 ± 3,37c 894,21 ± 7,76c

1/2 53,87 ± 0,39d 417,84 ± 4,72b 795,68 ± 5,27d

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

3/0 54,80± 0,73d 397,55± 3,39d 891,69 ± 9,94c

Tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase thay đổi từ 0/3 đến 1/1, dịch chiết có TPC tăng từ

52,52 đến 56,16 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 387,89 lên 560,60 µmol TE/g CK

(DPPH) và từ 707,20 lên 894,2 µmol TE/g CK (ABTS). Khi tỷ lệ enzyme trong hệ

từ 1/2 đến 3/0 thì TPC giảm (54,8 mg GAE/g CK); TEAC giảm (397,55 µmol TE/g

CK, DPPH; 791,68 µmol TE/g CK, ABTS) (Bảng 3.1). Tuy nhiên, với tỷ lệ enzyme

pectinase/cellulase là 1/1 dịch chiết thu được có TPC không có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê so với tỷ lệ pectinase/cellulase là 2/1 nhưng TEAC theo DPPH, ABTS

cao nhất so với các tỷ lệ còn lại nên chọn tỷ lệ pectinase/cellulase là 1/1 cho các

nghiên cứu tiếp theo.

Hàm lượng TPC và TEAC cao nhất ở tỷ lệ enzyme 1/1 do pectinase phân hủy các

liên kết α-1,4-glycoside mạch chính của acid polygalacturonic hoặc pectin khử ester

và enzyme cellulase thủy phân ngẫu nhiên liên kết β-D 1,4- glycoside ở giữa mạch

của chuỗi cellulose làm phá vỡ cấu trúc thành tế bào, giúp giải phóng các thành phần

bên trong tế bào gồm cả nước, các hợp chất tan vào dung môi (Trung và ctv, 2014).

Kết quả khảo sát của nhóm tương đồng với nghiên cứu sử dụng hỗn hợp enzyme

pectinex Ultra SP-L (P) và viscozyme L (V) tỷ lệ 2P/2V (% enzyme) để trích ly

polyphenol tổng, flavonoid và vitamin C từ quả sơ ri (Trung và ctv, 2014); nghiên

cứu sử dụng tỷ lệ pectinase/cellulase là 1/1 để nâng cao hiệu suất trích ly dịch trái

quách có hỗ trợ enzyme trong sản xuất thức uống (Limonia acidissima L.) (Sharma

và ctv, 2013) và nghiên cứu sử dụng tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase là 1/1 đã nâng

cao sản lượng và chất lượng trong trích dầu ô liu (Macedo và ctv, 2021). Do đó, chọn

tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase là 1/1 làm thông số cố định cho các thí nghiệm tiếp

theo.

3.2.2. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Tỷ lệ NL/DM ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly, hiệu quả kinh tế và quá trình tinh

sạch. Sự chênh lệch gradient nồng độ giữa cấu tử cần trích ly có trong nguyên liệu và

dung môi là động lực của quá trình trích ly, giúp các cấu tử trong nguyên liệu hòa tan

vào dung môi nhanh và triệt để hơn (Naviglio và ctv, 2019). Khi thể tích dung môi

tăng, chênh lệch nồng độ chất tan bên trong nguyên liệu và dung môi tăng, động lực

của quá trình trích ly tăng. Tuy nhiên, thể tích dung môi tăng thì oxy hòa tan trong

dung môi càng lớn không chỉ làm giảm hàm lượng polyphenol mà còn giảm hoạt tính

chống oxy hóa của polyphenol (Sattler và ctv, 1989).

Cả ba thí nghiệm enzyme pectinase, cellulase, hỗn hợp pectinase/cellulase (1/1) khi

tăng tỷ lệ NL/DM từ 1/8 đến 1/14 cả TPC và TEAC dịch chiết tăng tuy nhiên nếu

tăng đến 1/16, cả TPC và TEAC đều giảm và đạt cực đại ở tỷ lệ NL/DM 1/14 (Bảng

3.2).

Cụ thể: với enzyme pectinase, tỷ lệ NL/DM tăng từ 1/8 đến 1/14, TPC tăng từ 42,48

lên 55,45 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 236,95 lên 394,50 µmol TE/g CK (DPPH),

từ 595,12 lên 785,34 µmol TE/g CK (ABTS) và đạt cực đại ở tỷ lệ NL/DM 1/14. Nếu

tăng tỷ lệ NL/DM 1/16 thì TPC giảm (53,12 mg GAE/g CK) và TEAC giảm (366,76

µmol TE/g CK, DPPH, 669,41 µmol TE/g CK ABTS).

Enzyme cellulase, khi tăng tỷ lệ NL/DM từ 1/8 đến 1/14 thì TPC tăng từ 41,30 lên

54,59 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 251,04 lên 418,92 µmol TE/g CK (DPPH) và

593,10 đến 866,36 µmol TE/g CK (ABTS). Tuy nhiên, khi tỷ lệ NL/DM là 1/16,

TPC giảm (51,84 mg GAE/g CK), TEAC giảm (372,32 µmol TE/g CK, DPPH;

741,30 µmol TE/g CK, ABTS).

Và hỗn hợp pectinase và cellulase, tăng tỷ lệ NL/DM từ 1/8 đến 1/14 thì TPC tăng từ

43,68 lên 57,43 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 324,62 lên 570,18 µmol TE/g CK

(DPPH); từ 470,97 đến 892,57 µmol TE/g CK (ABTS). Tuy nhiên, tỷ lệ NL/DM là

1/16 thì TPC và TEAC giảm lần lượt 56,08 mg GAE/g CK, 534,20 µmol TE/g CK

(DPPH) và 751,41 µmol TE/g CK (ABTS) và TPC, TEAC đạt cực đại ở tỷ lệ NL/DM

là 1/14.

Với kết quả phân tích ở trên, tỷ lệ NL/DM là 1/14 dịch chiết có TPC và TEAC cao

hơn khi trích ly có hỗ trợ enzyme đơn/ hỗn hợp enzyme và có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với các tỷ lệ NL/DM còn lại nên chọn tỷ lệ NL/DM là 1/14 cho các thí

nghiệm tiếp theo. Kết quả của nghiên cứu phù hợp với trích ly các hợp chất

polyphenol từ bã quả ô liu với tỷ lệ NL/DM là 1/15 (Macedo và ctv, 2021).

Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến TPC và TEAC

TEAC (µmol TE/g CK)

Tỷ lệ NL/DM (g/mL) TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

Pectinase

1:8

1:10

1:12

1:14

42,48± 2,03a 50,50 ± 0,27b 51,79 ± 0,54c 55,45 ± 0,13d 53,12± 0,33e 236,95 ± 11,56a 335,68 ± 7,73b 386,53± 3,87c 394,50 ± 5,90d 366,76± 7,73 e 595,12± 3,07a 643,23 ± 10,80 b 665,91 ± 8,25 c 785,34 ± 2,98 d 669,41 ± 4,74 c 1:16

Cellulase

1:8

1:10

1:12

1:14

41,30 ± 0,96a 46,19 ± 0,43b 49,65 ± 0,27c 54,59± 0,70d 51,84 ± 0,90e 593,10 ± 7,54 a 615,63 ± 2,84b 696,47± 4,39c 866,36 ± 3,28d 741,30 ± 7,52e 1:16

251,04 ± 3,21a 312,25 ± 3,77 b 366,99 ± 4,92c 418,92± 3,81d 372,32 ± 3,80 e Pectinase/ cellulase (tỷ lệ 1/1)

1:8

1:10

1:12

1:14

Các giá trị trong một cột (mỗi enzyme) có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

43,68 ± 0,74a 49,88 ± 1,34b 53,97 ± 0,38c 57,43 ± 0,49d 56,08 ± 0,23e 324,62 ± 5,23a 420,26 ± 6,63b 453,25± 5,68c 570,18± 6,51d 534,20 ± 5,94e 470,97 ± 6,34a 680,08± 4,50b 813,99 ± 7,72c 892,57± 3,88d 751,41 ± 6,82e 1:16

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly

Thời gian trích ly ảnh hưởng đến sự thấm dung môi, hòa tan của chất tan, hiệu quả

và tốc độ trích ly nên hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong dịch chiết

sẽ khác nhau ở thời gian khác nhau (Gómez-García và ctv, 2012). Phản ứng thủy phân

do enzyme xúc tác cần thời gian tối thiểu để enzyme tác động đến toàn bộ cơ chất, thời

gian trích ly kéo dài thì hiệu quả trích ly cũng tăng thêm. Tuy nhiên, thời gian trích ly

quá dài, lượng cơ chất gần như cạn kiệt, hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết giảm do

bị oxy hóa bởi môi trường xung quanh. Kết quả ảnh hưởng thời gian trích ly đến TPC

và TEAC của dịch chiết vỏ mãng cầu ta đối với mỗi enzyme được trình bày Bảng 3.3.

Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến TPC và TEAC

TEAC (µmol TE/g CK) Thời gian (phút) TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

Pectinase

100 48,89 ± 0,79 a 50,68 ±0,39 b 52,68 ±0,52 c 54,13±0,76 d 48,56 ± 0,13 a 340,76 ± 3,45a 423,79 ± 6,86b 454,46 ± 10,35c 594,50 ± 2,58d 456,09 ± 9,34c 587,16 ± 8,82a 728,01 ± 9,13b 743,80± 7,54c 828,47 ± 5,65d 625,71 ± 8,09e

Cellulase

100 44,38 ± 0,72 a 48,83 ± 0,22 b 49,07 ± 0,67c 50,71 ± 0,28d 49,81± 0,65cd 571,14 ± 5,06a 594,33 ± 4,87b 638,36± 9,37c 734,61 ± 9,37d 636,26 ± 6,85e

381,66 ± 2,55a 422,37 ± 5,09b 438,57 ± 5,97c 487,44 ± 7,67d 409,17 ± 5,50e Pectinase/ Cellulase (tỷ lệ 1/1)

Các giá trị trong một cột (mỗi enzyme) có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

100 56,56 ± 0,12a 59,00 ± 0,06 b 62,87 ± 0,31c 60,10 ± 0,77d 61,03 ± 1,14dc 354,65 ± 4,40a 490,26 ± 8,20b 573,30± 2,00c 563,85± 3,94d 561,59± 5,92e 686,49 ± 2,75a 886,06 ± 6,53b 937,43 ± 8,07c 875,11 ± 6,76b 753,92 ± 4,52d

Cụ thể, với pectinase thời gian trích ly từ 20 đến 80 phút, TPC tăng từ 48,89 đến

54,13 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 340,76 đến 594,50 µmol TE/g CK (DPPH) và

từ 587,16 đến 828,47 µmol TE/g CK (ABTS). Khi thời gian trích ly 100 phút thì TPC

giảm (48,56 mg GAE/g CK) và TEAC giảm (456,09 µmol TE/g CK (DPPH), 725,71

µmol TE/g CK (ABTS) và hiệu quả trích ly đạt cực đại với thời gian 80 phút.

Và cellulase, TPC tăng từ 44,38 đến 50,71 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 381,66 đến

487,44 µmol TE/g CK (DPPH) và từ 571,14 đến 734,61 µmol TE/g CK (ABTS) khi

tăng thời gian trích ly từ 20 phút đến 80 phút. Kéo dài thời gian trích ly đến 100 phút,

TPC giảm (49,81 mg GAE/g CK), TEAC giảm (409,17 µmol TE/g CK, DPPH;

636,26 µmol TE/g CK, ABTS) và đạt cực đại ở thời gian 80 phút.

Hỗn hợp pectinase và cellulase, thời gian trích ly từ 20 phút đến 60 phút TPC tăng từ

56,56 đến 62,87 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 354,61 lên 573,30 µmol TE/g CK

(DPPH); từ 686,49 lên 937,43 µmol TE/g CK (ABTS). Khi tăng thời gian trích ly vỏ

mãng cầu ta đến 100 phút thì TPC giảm (60,03 mg GAE/g CK) và TEAC giảm

(561,59 µmol TE/g CK (DPPH); 753,92 µmol TE/g CK (ABTS).

Như vậy, với enzyme pectinase, cellulase, hỗn hợp pectinase/cellulase dịch chiết vỏ

mãng cầu ta có TPC và TEAC cao nhất ở thời gian trích ly lần lượt 80 phút, 80 phút,

60 phút nên chọn thời gian tương ứng để cố định cho các thí nghiệm tiếp theo của

mỗi enzyme.

3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng pH

pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme xúc tác do thay đổi mức độ

ion hóa cơ chất và enzyme, độ bền enzyme. pH môi trường trích ly có tính acid tác

động đến sự ổn định liên kết hydro, giảm độ bền của màng tế bào thực vật, tăng khả

năng khuếch tán các chất ra khỏi màng tế bào; hợp chất polyphenol bền hơn và kìm

hãm hoạt động enzyme polyphenoloxidase; còn ở pH cao, hợp chất polyphenol dễ

oxy hóa (Naczk và Shahidi, 2004). Ảnh hưởng pH đến TPC và TEAC của dịch chiết

của mỗi enzyme được trình bày Bảng 3.4.

Với pectinase, pH từ 3,5 đến 4,5 TPC và TEAC có xu hướng tăng và đạt cực đại ở

pH 4,5; cụ thể: TPC tăng từ 44,27 đến 52,86 mg GAE/g CK), TEAC tăng từ 344,63

lên 422,61 µmol TE/g CK (DPPH), từ 599,47 tới 807,25 µmol TE/g CK (ABTS) và

có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Từ những nhận định trên, chúng tôi chọn pH 4,5

cố định cho các thí nghiệm tiếp theo đối với enzyme pectinase.

Trích ly có hỗ trợ cellulase, khi pH dung môi từ 4 đến 5, TPC và TEAC có xu hướng

tăng, cụ thể: TPC tăng từ 45,82 đến 53,60 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 303,33 lên

437,59 µmol TE/g CK (DPPH) và từ 615,32 tới 767,69 µmol TE/g CK (ABTS). Tuy

nhiên, ở pH 6 cả TPC và TEAC giảm lần lượt là 45,76 mg GAE/g CK; 277,43 µmol

TE/g CK (DPPH); 675,29 µmol TE/g CK (ABTS) và đạt cực đại ở pH 5 nên chọn

pH này cho các nghiên cứu tiếp theo.

Với hỗn hợp pectinase/ cellulase (tỷ lệ 1/1), pH trích ly tăng từ 3,5 đến 4,5; TPC tăng

từ 51,82 đến 57,14 mg GAE/g CK; TEAC tăng từ 409,13 lên 660,87 µmol TE/g CK

(DPPH); 777,59 đến 831,55 µmol TE/g CK (ABTS) và đạt cực đại ở pH 4,5 nên chọn

pH này cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến TPC và TEAC

TEAC (µmol TE/g CK) pH TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

Pectinase

3,5

4,5

5,5 44,27 ± 0,77a 47,14 ± 0,32b 52,86 ± 0,21c 49,66 ± 0,22d 45,81 ± 0,59e 344,63± 5,83a 374,50 ± 5,90b 422,61 ± 4,54c 389,44 ± 6,33d 356,62 ± 6,03e 599,47 ± 4,84a 665,20 ± 4,08b 807,25 ± 9,82c 711,49 ± 9,44d 633,09 ± 4,7e

Cellulase

4,5

5,5

6 45,82± 0,32a 47,99 ± 0,54b 53,60 ± 0,28c 48,43± 0,39b 45,76 ± 0,49a 615,32 ± 3,90a 657,87 ± 2,74b 767,69 ± 4,90c 696,41 ± 2,64d 675,29 ± 2,02e

303,33 ± 3,74a 387,03 ± 4,46b 437,59 ± 4,74c 395,56 ± 5,29d 277,43 ± 5,93e Pectinase/ cellulase (tỷ lệ 1/1)

3,5

4,5

Các giá trị trong một cột (mỗi enzyme) có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

5,5 51,82 ± 0,64a 55,39 ± 0,12b 57,14 ± 0,67c 54,38 ± 0,60d 52,13 ± 0,58e 409,13 ± 6,17a 548,88 ± 4,12b 660,87 ± 3,59c 603,70 ± 5,07d 399,19 ± 3,25e 767,59 ± 2,38a 779,24 ± 4,24b 831,55 ± 4,49c 822,84 ± 9,81c 771,01 ± 6,26a

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly

Cùng với thời gian, nhiệt độ được xem là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly

và hoạt tính sinh học của dịch chiết. Nhiệt độ trích ly tăng, các phần tử trong hệ trích

ly chuyển động hỗn độn với vận tốc cao hơn, độ nhớt dung môi giảm, sự khuếch tán

các hợp chất polyphenol vào dung môi tăng nên hiệu quả trích ly tăng (Spigno và ctv,

2007). Kết quả Bảng 3.5 cho thấy, khi nhiệt độ trích ly tăng từ 400C đến 500C, dịch

chiết có TPC và TEAC tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ trích ly cả TPC và TEAC đều

giảm và cả ba nghiệm thức về trích ly có hỗ trợ enzyme, dịch chiết thu được có TPC

và TEAC đạt cực đại ở 500C.

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến TPC và TEAC

TEAC (µmol TE/g CK) Nhiệt độ (0C) TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

Pectinase

60 52,09b ± 0,16a 54,73c ± 1,03b 59,44 ± 1,98c 56,24± 0,12d 52,59 ± 0,37a 375,40 ± 7,07a 480,59 ± 4,17b 536,16± 8,02c 485,16± 3,89d 433,17 ± 2,99e 733,47 ± 7,92a 760,35 ± 5,99b 820,10 ± 3,71c 763,10 ± 2,36d 616,71 ± 6,61e

Cellulase

60 48,21 ± 0,48a 50,41 ± 0,16b 55,22 ± 0,17c 51,14 ± 0,06d 50,62 ± 0,39b 495,30 ± 9,91a 524,34 ± 5,32b 663,61 ± 6,76c 536,32 ± 5,51d 524,48 ± 4,78b

392,63 ± 4,45a 409,37 ± 2,58b 512,95 ± 2,60c 448,81 ± 2,58d 443,59 ± 4,48e Pectinase/ cellulase (tỷ lệ 1/1)

60 52,66 ± 0,73a 54,11 ± 0,21b 58,24 ± 0,59c 54,73 ± 0,34b 54,03 ± 0,71b 403,76 ± 3,16a 460,32 ± 2,72b 498,46 ± 4,28c 448,52 ± 3,34d 440,90± 5,94e 599,82 ± 2,09a 641,11 ± 4,12b 782,63 ± 3,26c 741,44 ± 2,72d 726,37 ± 9,45e

Các giá trị trong một cột (mỗi enzyme) có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Cụ thể, với pectinase khi nhiệt độ tăng từ 400C đến 500C, TPC tăng từ 52,09 đến

59,44 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 375,40 đến 536,16 µmol TE/g CK (DPPH) và

từ 733,47 đến 820,10 µmol TE/g CK (ABTS). Tuy nhiên, khi nhiệt độ trích 600C thì

TPC giảm (52,59 mg GAE/g CK), TEAC giảm (423,17 µmolTE/g, DPPH; 616,71

µmol TE/g CK ABTS) và hiệu quả trích ly tốt nhất ở 500C.

Trích ly có hỗ trợ cellulase, nhiệt độ trích ly từ 40 đến 500C, TPC tăng từ 48,21 lên

55,22 mg GAE/g CK; TEAC tăng từ 392,63 lên 512,95 µmol TE/g CK (DPPH) và từ

495,30 đến 663,61 µmol TE/g CK (ABTS). Nhưng khi tăng nhiệt độ 600C, TPC giảm

(50,62 mg GAE/g CK), TEAC giảm (443.59 µmol TE/g CK, DPPH; 524,48 µmol TE/g

CK, ABTS) và đạt cực đại ở 500C.

Với hỗn hợp pectinase/celluluase, nhiệt độ trích ly tăng từ 400 đến 500C thì TPC tăng

từ 52,66 lên 58,24 mg GAE/g CK, TEAC từ 403,76 đến 498,46 µmol TE/g CK

(DPPH); từ 599,82 đến 782,63 µmol TE/g CK (ABTS). Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ

lên 600C thì TPC giảm (54,03 mg GAE/g CK), TEAC giảm (440,90 µmol TE/g CK

(DPPH) và 641,37 µmol TE/g CK (ABTS).

Nhiệt độ trích ly tăng sẽ làm yếu các liên kết giữa polyphenol – protein, polyphenol

– polysaccharide trong nguyên liệu nên giải phóng polyphenol dễ dàng hơn (Youssef

và El-Adawi, 2006). Tuy nhiên, khi nhiệt độ ≥ 600C, các hợp chất polyphenol bị oxy

hóa vì 600C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động enzyme polyphenoloxidase nên hàm

lượng polyphenol giảm (Akowuah và ctv, 2009). Để tiết kiệm chi phí về năng lượng

cũng như giảm đến mức thấp nhất ảnh hưởng của nhiệt độ đến TPC và TEAC nên

chọn nhiệt độ trích ly 500C và kết quả nghiên cứu của nhóm tương đồng với nghiên

cứu sử dụng enzyme pectinase trích ly polyphenol từ vỏ táo (Min và Cherl, 2009).

3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme

Khi tăng nồng độ enzyme thì hiệu suất trích ly tăng do khả năng phân hủy thành tế

bào nguyên liệu tăng, tạo điều kiện thuận lợi để giải phóng polyphenol. Nồng độ

enzyme tăng thì hiệu suất trích ly và chi phí trích ly tăng nên cần xác định nồng độ

enzyme thích hợp để đạt được hiệu quả trích ly và hiệu quả kinh tế (Ghandahari Yazdi

và ctv, 2019).

Cả ba nghiệm thức trích ly vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ enzyme, khi tăng nồng độ enzyme

pectinase, cellulase, hỗn hợp pectinase/cellulase (tỷ lệ 1/1) thì hàm lượng polyphenol

và hoạt tính kháng oxy hóa cũng tăng. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ enzyme

thì hàm lượng TPC không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.6).

Với enzyme pectinase, nồng độ enzyme từ 0,1% đến 0,2% TPC tăng từ 61,22 đến

62,99 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 473,37 đến 548,11 µmol TE/g CK (DPPH), từ

735,8 đến 829,36 µmol TE/g CK (ABTS) và đạt cực đạt ở nồng độ enzyme 0,2%.

Khi nồng độ enzyme cellulase tăng từ 0,1% đến 0,2%, TPC tăng từ 61,61 đến 63,17

(mg GAE/g CK), TEAC tăng từ 521,91 lên 563,64 µmol TE/g CK (DPPH) và từ

735,36 lên 813,76 µmol TE/g CK (ABTS). Nồng độ enzyme tăng từ 0,3% đến 0,5%,

TPC giảm từ 61,91 xuống 60,22 (mg GAE/g CK), TEAC giảm từ 533,10 xuống

525,63 µmol TE/g CK (DPPH) và từ 773,01 còn 755,91 µmol TE/g CK (ABTS)

Và hỗn hợp pectinase/ cellulase (tỷ lệ 1/1), nồng độ enzyme từ 0,1% đến 0,2% thì TPC

tăng từ 61,77 đến 63,59 mg GAE/g CK, TEAC tăng từ 494,65 lên 576,30 µmol TE/g

CK (DPPH) và từ 656,30 lên 831,29 µmol TE/g CK, (ABTS) (Bảng 3.6) và đạt cực

đại ở nồng độ 0,2% chọn nồng độ enzyme cho hỗn hợp 0,2% cho các nghiên cứu tiếp

theo.

Nguyên nhân ở nồng độ enzyme nhỏ hơn và cùng thời gian, pectinase và cellulase

thủy phân cơ chất thấp nên hợp chất polyphenol thoát ra dung môi thấp. Khi nồng độ

enzyme tăng, các polysaccharide thành tế bào nguyên liệu bị thủy phân nhiều hơn so

với cùng thời gian trích ly, enzyme xúc tác phá vỡ liên kết ether và ester giữa phenol

và polymer của thành tế bào thực vật (Hong và ctv, 2013), hợp chất polyphenol được

giải phóng ra nhiều hơn (Fu và ctv, 2011). Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ

enzyme càng lớn, hiệu suất của phản ứng enzyme càng tăng, TPC dịch chiết tăng.

Tuy nhiên, nếu lượng enzyme tăng quá cao so với lượng cơ chất thì hiệu suất phản

ứng sẽ không tăng, không hiệu quả kinh tế (Objectives, 2021). Về ý nghĩa thống kê,

TPC cao nhất ở nồng độ enzyme 0,2% không khác biệt với các nồng độ khác, hoạt

tính chống oxi hóa cao nhất theo DPPH ở 0,2%, có sự khác biệt với các nồng độ còn

lại, hoạt tính chống oxi hóa cao nhất theo ABTS cũng ở 0,2% nhưng không có sự

khác biệt với tỷ lệ 0,5% nên chọn nồng độ enzyme cellulase 0,2%.

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến TPC và TEAC

TEAC (µmol TE/g CK)

Nồng độ Enzyme (%) TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

Pectinase

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 61,22 ± 0,38a 62,99 ± 0,82b 61,78 ± 0,52a 61,09 ± 0,75a 61,90± 0,64a 473,37 ± 5,25a 548,11± 4,03b 521,17 ± 3,81c 476,77 ± 3,98d 478,85 ± 4,80d 735,80 ± 4,63a 829,36 ± 7,03b 776,60 ± 2,81c 728,79 ± 4,84d 728,09 ± 3,00d

Cellulase

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 61,61 ± 0,17a 63,17 ± 0,44b 61,91 ± 0,39a 60,91 ± 0,45c 60,22 ± 0,96c 735,36 ± 4,46a 813,76 ± 3,54b 773,01± 5,71c 761,33 ± 3,14d 750,91 ± 4,02e

521,91 ± 3,50a 563,64 ± 3,87b 573,10 ± 1,71c 527,94 ± 3,72d 515,63 ± 4,99e Pectinase/ cellulase (tỷ lệ 1/1)

0,1

0,2

0,3

0,4

Các giá trị trong một cột (mỗi enzyme) có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

0,5 61,77 ± 0,21a 63,59 ± 0,34b 61,03 ± 0,54a 59,56± 0,67c 59,47 ± 0,38c 494,65± 2,54a 576,30 ± 5,16b 558,22 ± 3,29c 545,53 ± 3,30d 549,60 ± 4,82e 656,30± 8,37a 831,29 ± 8,40b 753,84 ± 9,68c 693,18 ± 4,85d 697,24 ± 5,60e

Dựa vào kết quả phân tích ở trên, cho thấy trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học

từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ hỗn hợp pectinase và cellulase với các thông số tỷ lệ

pectinase/cellulase là 1/1, nồng độ enzyme 0,2%, pH 5, nhiệt độ 500C, thời gian 60

phút dịch chiết thu được có hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa cao

hơn so với trích ly có hỗ trợ enzyme pectinase, cellulase. Kết quả của nhóm tương

đồng với nghiên cứu trích ly polyphenol từ vỏ táo với nồng độ enzyme 2% hỗn hợp

enzyme pectinase và cellulase dịch chiết có hàm lượng polyphenol cao nhất (Park và

Kim, 2009).

3.3. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ khuấy từ với dung môi ethanol

3.3.1. Ảnh hưởng thời gian trích ly

Thời gian trích ly đóng vai trò rất quan trọng nếu thời gian phù hợp không những

mang lại hiệu suất trích ly cao mà còn tiết kiệm chi phí năng lượng. Thời gian trích

ly tăng, các hợp chất có hoạt tính sinh học khuếch tán vào dung môi càng nhiều nhưng

TPC

DPPH

ABTS

1200

1000

800

600

chỉ xảy ra trong một giới hạn thời gian nhất định (Deng và ctv, 2015).

K C g / E T

400

K C g / E A G g m

200

l o m 

Thời gian (phút)

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến TPC và TEAC

Thời gian trích ly tăng từ 30 phút đến 50 phút, TPC tăng từ 84,19 lên 91,15 mg GAE/g

CK, TEAC tăng từ 511,97 lên 531,58 mol TE/g CK (DPPH); từ 903,78 lên 989,51

mol TE/g CK (ABTS). Tuy nhiên, kéo dài thời gian trích ly (60 phút), TPC và TEAC

đều có xu hướng giảm lần lượt là 87,04 mg GAE/g CK; 500,45 mol TE/g CK

(DPPH); 928,21 mol TE/g CK (ABTS) (Hình 3.3). Vì sau thời gian trích ly, lượng

chất tan trong dung môi đạt cân bằng (Silva và ctv, 2007) và thời gian trích ly kéo

dài, các hợp chất polyphenol tiếp xúc với oxy không khí càng nhiều nên bị oxy hóa

giảm hoạt tính sinh học (Yap và ctv, 2020). Với thời gian trích ly 50 phút, TPC và

TEAC dịch chiết vỏ mãng cầu cao nhất nên chọn thời gian này để tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol

Ethanol và nước là một trong những dung môi sử dụng nhiều nhất để trích ly

polyphenol từ thực vật do thân thiện với môi trường và hiệu suất trích ly cao. Việc

bổ sung nước vào ethanol với tỷ lệ phù hợp tạo điều kiện thuận lợi chiết xuất

polyphenol có tính phân cực từ cao đến thấp (Chew và ctv, 2011).

Khi tăng nồng độ ethanol từ 40% lên 50%, TPC và TEAC của dịch chiết tăng tuy

nhiên khi nồng độ ethanol 70% thì hàm lượng TPC và TEAC dịch chiết giảm, đạt cực

đại ở nồng độ ethanol 50%; cụ thể, TPC 93,71 mg GAE/g CK; TEAC 529,03 mol

TE/g CK (DPPH); 968,67 mol TE/g CK (ABTS). Kết quả nghiên cứu của nhóm

tương đồng trích ly phenolic từ cám lúa mì với ethanol 50% (Wang và ctv, (2008).

TPC

DPPH

ABTS

1200

1000

800

600

Do đó, nhóm chọn dung môi ethanol 50% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

K C g / E T

400

K C g / E A G g m

200

l o m 

98 96 94 92 90 88 86 84 82 80 78

Nồng độ ethanol (%)

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM

Khi tăng thể tích dung môi, hiệu quả trích ly tăng dần và có khuynh hướng giảm nếu

tiếp tục tăng thể tích dung môi. Thể tích dung môi càng lớn, chênh lệch gradient nồng

độ chất cần trích ly ở bên trong và bên ngoài tế bào càng lớn, dung môi dễ dàng thẩm

thấu sâu vào tế bào thực vật, hòa tan các cấu tử cần trích ly (Al-Farsi và ctv, 2008).

Sự khác nhau về tỷ lệ NL/DM phụ thuộc vào phương pháp trích ly, loại dung môi,

nguyên liệu và thành phần hóa học của polyphenol.

Hiệu suất trích ly polyphenol có thể cải thiện khi tỷ lệ NL/DM cao hơn hoặc là dung

môi không bão hòa (Takeoka và Dao, 2003).

K C g / E T

K C g / E A G g m

l o m 

98 96 94 92 90 88 86 84 82

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

1:15

1:20

1:25

1:30

Tỷ lệ NL/DM (g/ml)

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM

Quá trình trích ly polyphenol vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ vi sóng với ethanol 50%, thời

gian 50 phút, nhiệt độ trích ly 600C, TPC và TEAC giữa các mẫu có sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê (p<0,05). Với tỷ lệ NL/DM là 1/25, dịch chiết có TPC và TEAC đạt

giá trị cao nhất là 95,59  0,51 mg GAE/g CK, 541,01 9,73 mol TE/g CK (DPPH),

896,92  17,92 mol TE/g CK (ABTS) so với các tỷ lệ còn lại nên chọn tỷ lệ NL/DM

là 1/25 (g/mL) được cố định và thực hiện nghiên cứu tiếp.

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly

polyphenol từ thực vật. Các hợp chất polyphenol dễ bị oxy hóa dưới tác dụng nhiệt

độ. Nhiệt độ phù hợp có thể làm mềm mô thực vật, làm suy yếu thành tế bào thực vật,

phá hủy liên kết polyphenol-protein, polyphenol-polysaccharide. Nhiệt độ trích ly

tăng sẽ cung cấp năng lượng cho các phần tử trong hệ trích ly chuyển động hỗn độn

với vận tốc cao hơn, độ hòa tan tăng, độ nhớt giảm, tăng hệ số khuếch tán các hợp

chất polyphenol vào dung môi thúc đẩy nhanh quá trình trích ly, tăng hiệu quả trích

1200

1000

800

600

ly (Spigno và ctv, 2007).

K C g / E T

400

K C g / E A G g m

200

l o m 

98 96 94 92 90 88 86 84 82 80

Nhiệt độ (C)

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ trích ly tăng từ 400C đến 600C, TPC tăng từ 85,80 đến 95,47 mg GAE/g CK,

TEAC từ 479,51 đến 527,82 mol TE/g CK (DPPH) và từ 814,17 đến 1080,91 mol

TE/g CK (ABTS). Nhưng nhiệt độ trích ly tăng lên 700C thì TPC giảm (93,66 mg

GAE/g CK) và TEAC giảm (509,63 mol TE/g CK theo DPPH; 970,65 mol TE/g

CK theo ABTS), TPC và TEAC đạt cực đại ở nhiệt độ trích ly 600C. Do polyphenol

là hợp chất kém bền nhiệt, khi nhiệt độ trích ly quá cao, hợp chất có hoạt tính sinh

học bị phá hủy, dẫn đến sự suy giảm của hàm lượng TPC và hoạt tính oxy hóa cũng

giảm theo (Ju và Howard, 2003).

3.4. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng

3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol

Ethanol là một dung môi có độ phân cực thấp, nước là một dung môi phân cực mạnh

và khi pha trộn cùng nhau thì độ phân cực của dung môi sẽ tăng, các hợp chất phenolic

cũng phân cực, do đó TPC tổng số thu được sẽ tăng theo độ phân cực của dung môi

dẫn đến hoạt tính kháng oxy cũng tăng theo (Zhang và ctv, 2008). Khi tăng nồng độ

ethanol từ 40% đến 60% thì TPC tăng từ 82,06 đến 96,27 mg GAE/g CK, TEAC tăng

từ 489,90 đến 589,46 mol TE/g CK (DPPH), từ 1191,52 đến 1242,98 mol TE/gCK

(ABTS) và đạt cực đại ở nồng độ ethanol 60%. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ

ethanol lên 70% thì TPC, TEAC giảm. Vì vậy, để đạt hiệu suất trích ly polyphenol

TPC

DPPH

ABTS

100

1200

1000

800

600

và TEAC tối ưu nhất ứng với nồng độ ethanol 60%.

K C g / E T

K C g / E A G g m

400

l o m 

200

Nồng độ ethanol (%)

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Tỷ lệ NL/DM là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Thể tích

dung môi quá thấp không đủ để tạo động lực cho quá trình thẩm thấu, khuếch tán vào

nguyên liệu, các hợp chất cần chiết không hòa tan hết vào dung môi, dẫn đến hiệu

quả thấp (Kossah và ctv, 2010).

Khi tỷ lệ NL/DM tăng từ 1/20 đến 1/25, dịch chiết có TPC tăng từ 92,09 đến 96,12

mg GAE/g CK và TEAC tăng từ 550,22 đến 617,35 mol TE/g CK (DPPH); từ

1267,39 đến 1361,38 mol TE/g CK (ABTS). Khi lượng dung môi tăng, các hợp chất

có tính sinh học tiếp xúc với dung môi dễ dàng hơn, khả năng thẩm thấu cao hơn do

sự khác biệt gradient nồng độ giữa dung môi và các chất hòa tan lớn, nhiều hợp chất

sinh học có thể hòa tan tốt hơn (Cacace và Mazza, 2003). Tuy nhiên, khi tỷ lệ NL/DM

tăng đến tỷ lệ 1/35 thì TPC và TEAC giảm lần lượt là 88,94 mg GAE/g CK; 546,99

mol TE/g CK (DPPH), 1261,69 mol TE/g CK (ABTS). Nguyên nhân, các hợp chất

có tính hoạt chất sinh học sẽ không tăng khi quá trình trích ly đạt trạng thái cân bằng

sau thời gian trích ly với lượng dung môi nhất định (Herodež và ctv, 2003); lượng

dung môi sử dụng càng nhiều thì lượng oxy hòa tan càng lớn làm giảm hoạt tính

kháng oxy hóa của polyphenol (Kossah và ctv, 2010). Tỷ lệ NL/DM là 1/25, dịch

chiết có TPC và TEAC cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các tỷ lệ còn lại

TPC

DPPH

ABTS

nên chọn tỷ lệ này có các nghiên cứu tiếp theo.

K C g / E T

K C g / E A G g m

l o m 

100 98 96 94 92 90 88 86 84 82

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

1 : 20

1 : 25

1 : 30

1 : 35

Tỷ lệ NL/DM (g/ml)

Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly

Thời gian là một yếu tố quan trọng của quá trình trích ly bằng vi sóng, các hợp chất

nhạy cảm bởi nhiệt độ như polyphenol sẽ bị giảm đáng kể khi thời gian trích ly kéo

dài. Một trong những ưu điểm chính của phương pháp vi sóng là thời gian trích ly rất

ngắn (vài phút hoặc vài giây) so với các kỹ thuật thông thường (Routray và Orsat,

2012).

Thời gian trích ly từ 1 đến 5 phút, hàm lượng TPC từ 92,13 đến 98,63 mg GAE/g

CK, TEAC từ 549,03 đến 603,02 mol TE/g CK (DPPH); từ 1159,24 đến 1283,51

mol TE/g CK (ABTS). Nếu kéo dài thời gian trích ly (7 phút) thì TPC và TEAC

giảm và đạt cực đại ở thời gian trích ly 5 phút. Vì vậy, để đạt hiệu suất trích ly tối ưu

các hợp chất có hoạt tính sinh học trong vỏ mãng cầu ta, nhóm nghiên cứu chọn thời

gian trích ly 5 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.

TPC

DPPH

ABTS

1400

100

1200

1000

800

K C g / E T

600

K C g / E A G g m

400

l o m 

200

Thời gian (phút)

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian trích ly

3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng công suất trích ly

Công suất vi sóng ảnh hưởng khá lớn đến nhiệt độ trích ly nên tăng công suất vi sóng

sẽ kéo theo nhiệt độ dung môi trích ly tăng dẫn đến gia tăng hiệu quả trích ly các

chất. Tuy nhiên, công suất cao có thể làm suy giảm TPC và TEAC trong quá trình

trích (Simić và ctv, 2016).

Công suất vi sóng nhỏ thời gian trích ly kéo dài còn công suất lớn gây thất thoát về

hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học. Vì thế, lựa chọn công suất trích ly phù hợp

nhằm giảm thiểu thời gian và đạt hiệu suất trích ly mong muốn, nhóm đã tiến hành

thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng công suất tới quá trình trích ly bằng vi sóng và đạt

TPC

ABTS

DPPH c

100

1400

1200

1000

800

600

được kết quả như Hình 3.10

K C g / E T

K C g / E A G g m

400

200

l o m 

284

166

214

Công suất trích ly (W)

Hình 3.10 Ảnh hưởng của công suất

Tăng công suất trích ly từ 95 lên 214 W thì TPC và TEAC tăng theo lần lượt là 90,07

đến 97,62 mg GAE/g CK; 518,29 đến 613,15 mol TE/g CK (DPPH); 1009,40 đến

1279,37 mol TE/g CK (ABTS). Do năng lượng vi sóng rất lớn, nên công suất tăng

thì nhiệt độ sẽ tăng cao đột ngột, các phân tử trong tế bào của nguyên liệu chuyển

động hỗn loạn, thành tế bào nhanh chóng bị phá vỡ, quá trình truyền khối diễn ra

nhanh hơn, hàm lượng TPC thu được sẽ nhiều hơn nên TEAC sẽ cao hơn.

Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng công suất trích ly (284 W) thì TPC giảm (91,76 mg

GAE/g CK) và TEAC giảm (463,51 mol TE/g CK, DPPH; 1121,4 mol TE/g CK

ABTS). Do polyphenol rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, khi công suất vi sóng lớn, năng

lượng vi sóng tăng cao đột biến, gây giảm của các hợp chất phenolic, TEAC giảm

(Simić và ctv, 2016). Với công suất 214 W, dịch chiết vỏ mãng cầu ta có TPC và

TEAC cao nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ba mức công suất còn

lại nên chọn công suất 214 W để trích ly nguyên liệu vỏ mãng cầu ta.

Tóm lại, dưa vào các kết quả nghiên cứu sàng lọc bên trên cho thấy đối với phương

pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng dịch chiết thu được có hàm lượng polyphenol tổng và

hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với phương pháp trích ly có hỗ trợ khuấy từ,

enzyme (pectinase, cellulase và hỗn hợp pectinase/cellulase) nên được lựa chọn để

tiếp tục tối ưu ở bước tiếp theo.

3.4.5. Tối ưu hóa trích ly TPC, TEAC từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ vi sóng

Dựa vào kết quả tối ưu của từng thí nghiệm đơn trích ly vỏ mãng cầu có hỗ trợ vi

sóng với ethanol 60%, thời gian 5 phút, tỉ lệ NL/DM là 1/ 25 g/mL, công suất trích ly

214 W, 54 thí nghiệm được bố trí để tối ưu hóa bốn biến độc lập riêng lẻ trong CCD

được áp dụng cho tổng số polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả về hàm

lượng TPC (Y1, mg GAE/g DW); hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH (Y2, mol TE/g

DW); hoạt tính kháng oxy hóa theo ABTS (Y3, mol TE/g DW) thu được từ thí

nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong Bảng 3.7.

Bảng 3.7 Kế hoạch thực nghiệm RSM tối ưu hóa TPC, TEAC theo DPPH, ABTS

Thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 X1 50 70 50 70 50 70 50 70 50 70 50 70 50 70 50 70 50 70 60 60 60 60 60 60 60 60 60 50 70 50 70 50 70 50 70 50 X2 3 3 7 7 3 3 7 7 3 3 7 7 3 3 7 7 5 5 3 7 5 5 5 5 5 5 5 3 3 7 7 3 3 7 7 3 X3 20 20 20 20 30 30 30 30 20 20 20 20 30 30 30 30 25 25 25 25 20 30 25 25 25 25 25 20 20 20 20 30 30 30 30 20 X4 154 154 154 154 154 154 154 154 274 274 274 274 274 274 274 274 214 214 214 214 214 214 154 274 214 214 214 154 154 154 154 154 154 154 154 274 Y1 90,26 92,87 93,04 91,43 91,70 92,59 94,98 91,52 91,40 92,63 92,37 91,65 90,69 91,04 92,21 90,56 96,37 97,92 96,75 96,76 96,98 97,47 98,81 97,28 100,5 100,24 100,42 90,68 92,27 92,73 91,61 90,45 91,55 95,40 91,10 91,40 Y2 404,53 570,90 419,36 453,05 400,21 557,90 452,00 426,06 453,41 487,62 439,58 504,33 417,16 436,57 444,32 427,88 593,92 595,01 646,84 586,46 559,53 547,12 589,88 593,98 680,26 697,03 692,75 409,21 575,45 419,15 457,47 404,89 553,34 451,50 430,63 476,23 Y3 1228,76 1208,06 1255,71 1240,78 1223,41 1206,49 1236,03 1241,90 1275,61 1231,49 1279,87 1280,31 1280,38 1245,83 1313,37 1231,12 1341,40 1316,25 1344,58 1317,84 1348,46 1336,50 1310,44 1351,33 1415,12 1410,65 1409,95 1241,65 1225,38 1231,11 1240,78 1236,31 1207,21 1229,89 1262,75 1281,34

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 70 50 70 50 70 50 70 50 70 60 60 60 60 60 60 60 60 60 3 7 7 3 3 7 7 5 5 3 7 5 5 5 5 5 5 5 274 274 274 274 274 274 274 214 214 214 214 214 214 154 274 214 214 214 20 20 20 30 30 30 30 25 25 25 25 20 30 25 25 25 25 25 92,75 92,76 91,44 90,69 90,01 92,52 91,70 96,98 98,23 96,13 96,76 96,87 97,57 98,91 97,18 99,35 99,35 101,05 462,18 444,46 538,06 421,68 436,44 457,89 419,41 581,61 594,95 638,54 591,86 563,67 547,61 585,03 580,41 650,43 649,98 667,55 1231,49 1265,79 1285,26 1281,15 1255,34 1308,67 1225,44 1341,40 1322,79 1349,27 1319,41 1339,89 1336,50 1304,88 1356,03 1396,44 1419,88 1405,48

Phân tích Anova trong Bảng 3.7 cho thấy số liệu thí nghiệm phù hợp với mô hình đa

thức bậc hai với hệ số xác định bội (R2) cho các hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3 ở mức cao.

Giá trị R2 của TPC, DPPH và ABTS lần lượt là 0,968; 0,928 và 0,916, trong khi các

Adj điều chỉnh lần lượt là 0,957; 0,902 và 0,885. So sánh hệ số xác định R2

giá trị R2

Adj không có sự khác biệt lớn nên các mô hình tối

với hệ số xác định đã điều chỉnh R2

ưu TPC, DPPH và ABTS có ý nghĩa cao (Myers và ctv, 2004). Điều đó chứng minh

rằng các mô hình bậc hai là đủ điều kiện để giải thích ảnh hưởng của các biến độc lập

đến hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3.

Các hệ số của mô hình đa thức bậc hai được xác định bằng cách sử dụng giá trị P-

value (mức ý nghĩa) và được liệt kê trong Bảng 3.8. Giá trị P-value ( 0,05) cho thấy

tác động đáng kể hơn đến các biến phụ thuộc (Amin và Anggoro, 2004). Có thể thấy

rằng hầu hết các biến độc lập và sự tương tác của các biến có ảnh hưởng đáng kể đến

Y1, Y2, Y3. Từ Bảng 3.8, phương trình hồi quy của hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3 theo biến

mã hóa được thiết lập như sau:

2 – 2,64X2

2 – 2,01X3

2 – 1,19X4

2 – 0,73X1X2

Y1 = 99,54 + 0,41X2 – 0,32X4 – 1,86X1

2 –

–0,33X1X3 + 0,27X2X3 – 0,36X3X4 (1)

2 – 80,65X3

2 – 47,81X4

Y2 = 647,76 + 23,23X1 – 10,82X2 – 11,27X3 – 43,76X1

2 –

17,64X1X2 – 10,77X1X3 – 15,82X1X4 +14,12X2X4 (2)

2 – 34,1X2

2 – 26,53X3

2 – 36,2X4

Y3 = 1381,11 – 10,92X1 + 18,01X4 – 36,41X1

7,82X1X4 (3)

Các phương trình trên cho thấy, các yếu tố như tỷ lệ NL/DM, nồng độ ethanol, thời

gian trích ly và công suất vi sóng đều ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol (Y1),

hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH (Y2) và ABTS (Y3). Sáu biểu đồ thể hiện ảnh

hưởng của các yếu tố khảo sát đến hàm mục tiêu TPC, DPPH, ABTS được thể hiện

ở Hình 3.11. Các biểu đồ thể hiện đường bao đồng mức của bề mặt đáp ứng đối với

các hàm mục tiêu ở các thông tối ưu xung quanh các giá trị trung tâm trong mô hình

tối ưu CCD.

Sự thay đổi nồng độ ethanol (X1), thời gian chiết (X2), tỷ lệ NL/DM (X3), công suất

vi sóng (X4) ảnh hưởng đến tổng hàm lượng polyphenol (Y1), hoạt tính chống oxy

hóa theo DPPH (Y2) và ABTS (Y3). Ngoài mức giá trị tối ưu, tất cả các giá trị Y1, Y2,

Y3 đều giảm nhẹ.

Tối ưu hóa chiết xuất polyphenol từ vỏ quả mãng cầu ta đã được thực hiện để thu

được các giá trị đáp ứng tối đa đã chọn. Theo quan sát, các đường đồng mức cho phép

xác định sự tương tác của các yếu tố tối ưu của các biến đến quá trình trích ly. Phương

trình hàm mục tiêu hàm tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly để thu

được dịch chiết có TPC, hoạt tính chống oxy hóa (DPPH và ABTS) cao nhất

TPC, Y1 (mg GAE/g CK)

DPPH,Y2 (mol TE/g CK)

ABTS, Y3 (mol TE/g CK)

Số hạng

Bảng 3.8 Hệ số của phương trình hồi quy của 3 hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3

P-value

99,54179

<,0001*

647,75611

<,0001* 1381,1099 <,0001*

Hằng số Bo

Bậc 1

-0,104444

0,3735

23,226111

<,0001*

-10,92167

0,0029*

0,4077778

0,0011*

-10,82306

0,0263*

5,8966667

0,0947

-0,038611

0,7411

-11,26611

0,0211*

-0,929167

0,7887

-0,322778

0,0083*

-3,304167

0,4850

18,007778 <,0001*

Bậc 2

-1,861852

<,0001*

-43,76167

0,0011*

-36,41148

0,0003*

B11

-2,636852

<,0001*

-19,20917

0,1295

-34,09648

0,0006*

B22

-2,014352

<,0001*

-80,65167

<,0001*

-26,53398

0,0059*

B33

-1,191852

0,0004*

-47,80917

0,0004*

-36,20148

0,0003*

B44

Tương tác

-0,7325

<,0001*

-17,63906

0,0010*

3,913125

0,2905

B12

-0,330625

0,0105*

-10,76719

0,0365*

-3,65125

0,3235

B13

0,265625

0,0371*

1,4240625

0,7761

-1,336875

0,7163

B23

0,06375

0,6074

-15,81844

0,0029*

-7,824375

0,0384*

B14

-0,15125

0,2264

14,120312

0,0071*

-1,7025

0,6436

B24

-0,355625

0,0063*

-9,747812

0,0571

1,199375

0,7443

B34

0,968259

0,92794

0,915536

0,902073

0,885215

Adj

0,956865 * P-value < 0,05 thì có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.

Hệ số Hệ số Hệ số

. Dựa vào Hình 3.11 dự đoán theo lý thuyết của mô hình để hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3

đạt cực đại thì điều kiện trích ly như sau: nồng độ ethanol 60% (X1), thời gian chiết

5 phút (X2), tỷ lệ dung môi-rắn 25/1 (mL/g) (X3) và công suất vi sóng 214 W (X4)

được dự đoán và chọn làm điều kiện để chiết polyphenol từ vỏ mãng cầu.

Hình 3.11 Ảnh hưởng của công suất

X1: nồng độ ethanol (% v/v); X2: thời gian chiết (phút); X3: tỷ lệ NL/DM (mL/g);

X4: công suất vi sóng (W) và Y1: TPC (mg GAE/g CK); Y2: hoạt động loại bỏ tận

gốc bởi DPPH (mol TE/g CK); Y3: hoạt động loại bỏ tận gốc bởi ABTS (mol TE/g

CK).

Hình 3.12 Mô hình dự đoán về việc tối ưu hóa chiết xuất polyphenol

Trong các điều kiện tối ưu đã chọn, kết quả thực nghiệm cho thấy TPC tối ưu là

100,15 ± 0,68 mg GAE/g CK, 673,0 ± 20,44 µmol TE/g CK (DPPH) và 1409,6 ±

8,11 µmol TE/g CK (ABTS) không chênh lệch nhiều so với các giá trị dự đoán của

mô hình TPC là 99,54 mg GAE/g CK, 647,76 µmol TE/g CK (DPPH) và 1381,11

µmol TE/g CK (ABTS) (Hình 3.12). Như vậy, các giá trị đo được của các hàm mục

tiêu rất phù hợp với các dự đoán của mô hình hồi quy. Do đó, phương trình hồi quy

bậc hai là phù hợp để dự đoán điều kiện tối ưu trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu ta.

3.5. Tính chất hóa lý bột sấy phun vỏ mãng cầu ta với chất mang khác nhau

3.5.1. Độ ẩm, TPC, TEAC của bột sấy phun với gum arabic và maltodextrin

Độ ẩm là một tính chất quan trọng của bột sấy phun, liên quan đến hiệu quả sấy, độ

chảy, độ dính, độ ổn định của bột trong quá trình bảo quản (Akhavan Mahdavi và ctv,

2016). Độ ẩm của bột sấy phun giảm rõ rệt so với độ ẩm nguyên liệu ban đầu. Độ ẩm

của mẫu bột sấy phun từ 3,03% đến 4,73% và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

(p<0,05) với nguyên liệu chất mang ban đầu và kết quả khá tương đồng với bột sấy

phun dịch chiết cây dâu tây (Berberis vulgaris) với chất mang là maltodextrin, gum

arabic và gelatin độ ẩm của bột sấy từ 3,07% đến 4,98% (Akhavan Mahdavi và ctv,

(2016) hay độ ẩm bột sấy phun cà chua từ 4,16% đến 11,27% (Goula và ctv, 2004).

Bột sấy phun có độ ẩm thấp, tạo thuận lợi cho quá trình bảo quản do hạn chế sự phát

triển vi sinh vật vì hoạt độ nước bột sấy phun thấp.

Polyphenol là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học, khá nhạy cảm với nhiệt độ, ánh

sáng và oxy trong không khí nên khó bảo quản trong thời gian dài (Tolun và ctv,

2016). Những vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách sấy phun với các chất

mang như maltodextrin (MD), gum arabic (GA), tinh bột biến tính… (Quoc và Van

Muoi, 2018).

Bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu có TPC và TEAC giảm so với dịch chiết (95,42

mg GAE/g CK, TPC), TEAC (626,59 µmolTE/g CK, DPPH; 1325,81 µmolTE/g CK

ABTS). Cụ thể, với chất mang gum arabic 10%, có TPC (57,27± 0,81mg GAE/g CK),

TEAC (298,60 ± 5,13 𝜇mol TE/g CK, DPPH; 664,78 ± 11,03 𝜇mol TE/g CK, ABTS)

cao nhất so với các nồng độ còn lại và cao hơn bột sấy phun được sấy phun bằng

maltodextrin; với maltodextrin 12%, TPC (46,47±0,45 mg GAE/gCK), TEAC

(253,32±2,52 𝜇mol TE/g CK, DPPH; 578,96±6,07 𝜇mol TE/g CK, ABTS) cao nhất

so với các nồng độ còn lại (Bảng 3.9). Kết quả nghiên cứu có sự tương đồng với bột

sấy phun dịch chiết đậu nành (Georgetti và ctv, (2008), bột sấy phun gấc (Tuyen và

ctv, 2010).

Khi sấy ở nhiệt độ cao (150oC), các hợp chất polyphenol khá nhạy cảm nhiệt độ nên

dễ bị polymer hóa, mất hoạt tính sinh học (Mishra và ctv, 2014). Mặt khác, MD và

GA không có phenolic nên khi sử dụng làm chất mang sẽ làm giảm hàm lượng TPC

bột sau sấy (Tolun và ctv, 2016). Bột sấy phun với chất mang MD có TPC và TEAC

thấp hơn GA do cấu tạo MD gồm các chuỗi amylose và amylopetin kết hợp theo hình

xoắn ốc, khi hòa tan MD vào dịch trích ly, chuỗi xoắn ốc sẽ bao lấy phần dịch trích

do quá trình hydrate hóa, làm cho chuỗi xoắn ốc bị gián đoạn, cấu trúc hạt bị gãy vỡ,

dẫn đến hàm lượng TPC bị thất thoát nhiều và giảm hàm lượng các chất chống oxi

hóa (Chronakis, 1998). Từ đó chọn bột sấy phun với GA 10%, MD 12% cho các

nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.9 Độ ẩm, TPC, TEAC của dịch chiết và bột sấy phun

TEAC TPC (mgGAE/g (μmol TE/g CK) Mẫu Độ ẩm (%) CK) DPPH ABTS

1325,81a ± Dịch chiết - 95,42± 0,23k 626,23 ± 2,00k 10,54l

Maltodextrin 3,9±0,02a - - -

Gum arabic 7,23 ±0,12h - - -

GA 6% 4,56±0,02d 46,90±0,23cd 230,88±1,16b 542,11±0,93cd

GA 8% 4,68±0,13e 47,07±1,26e 239,35±2,01c 540,93±3,41c

GA 10% 4,73±0,07f 57,27 ± 0,81j 298,60 ± 5,13f 664,78 ±11,03l

GA 12% 4,98±0,19g 55,25±0,67f 290,03±0,96 641,61±1,98k

MD 10% 3,69±0,01e 44,62±0,20c 244,98±1,01d 551,54±2,50e

MD 12% 3,62±0,05d 46,47±0,45d 253,32±2,52e 578,96±6,07f

MD 14% 351±0,06b 43,22±0,30b 231,17±1,70b 531,87±3,85b

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p< 0,05.

MD 16% 3,03±0,07a 41,47±0,31a 222,41±1,72a 515,16±12,24a

3.5.2. Độ màu, hiệu suất thu hồi bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta

Các thông số về màu sắc (L*, a*, b*) của chất mang và sản phẩm bột sấy phun có sự

khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Chất mang MD trắng và sáng nhất so với các mẫu

còn lại. Bột sấy phun của các mẫu có thông số độ sáng L* giảm và các chỉ số a, b thay

đổi mạnh do bị ảnh hưởng màu sắc của dịch chiết vỏ mãng cầu. Sự thay đổi màu sắc

bột sấy phun phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ, màu sắc dịch chiết, nhiệt độ

sấy, tốc độ dòng nạp liệu, tốc độ dòng khí và hàm lượng chất rắn hòa tan (Fernandes

và ctv, 2012). Ngoài ra, nhiều hợp chất phenolic bị phân hủy do nhiệt độ sấy cao, các

phenolic còn lại như tannin có thể phản ứng chậm với sắt tạo thành phức tối màu

(Mishra và ctv, 2014). Thêm vào đó, các thành phần có trong dịch chiết như đường,

protein dưới tác dụng của nhiệt độ cao sẽ xảy ra phản ứng maillard tạo màu nâu cho

mẫu bột (Tonon và ctv, 2010) và bột sấy phun có kích thước hạt nhỏ hơn so với chất

mang ban đầu, diện tích bề mặt tăng nên quá trình oxy hóa sắc tố nhanh chóng xảy ra

(Desobry và ctv, 1997).

Bảng 3.10 Độ màu và hiệu suất thu hồi bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta

Mẫu MD G MD 12% GA 10%

L* 98,44±0,03a 81,74±0,01b 93,43±0,04c 74,53±0,18d

a* 0,16±0,04a 0,95±0,01b 0,68±0,15c 1,70±0,01d Màu

b* 1,33±0,01a 9,36±0,03b 5,10±0,02c 9,34±0,01d

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một hàng khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p< 0,05

suất - - 49,57±0,06a 60,53±0,09b Hiệu (%)

Hiệu suất thu hồi bột phụ thuộc vào nhiệt độ đầu vào/đầu ra trong quá trình sấy, loại

chất mang, tốc độ dòng chảy, tốc độ dòng khí (Arepally và Goswami, 2019). Hiệu

suất thu hồi bột sấy phun GA 10% (60,53%) cao hơn MD 12% (49,57%) cao hơn bột

sấy phun lá Morinda citrifolya L, (39 (Krishnaiah và ctv, 2012) và tương đương bột

sấy từ lá Lyppia sidoides (66 - 69%) (Fernandes và ctv, 2012).

3.5.3. Tỷ trọng, độ hút ẩm, độ hòa tan và góc nghỉ của bột sấy phun dịch chiết

vỏ mãng cầu ta

Chất mang GA và MD có vai trò quan trọng trong quá trình sấy phun, ảnh hưởng đến

tỷ trọng, độ hút ẩm, chỉ số hòa tan trong nước và góc nghỉ của bột sấy phun (Bảng

3.11).

Sự thay đổi tỷ trọng của chất mang và bột sấy phun có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê (p<0,05). Bột sấy phun có dung trọng từ 371,81 đến 520,60 g.l-1, đối với chất mang

dung trọng từ 472,81 đến 540,28 g.l-1. Khi sấy nhiệt độ cao, dịch chiết cùng chất

mang được phun qua vòi phun có kích thước nhỏ với tốc độ lớn tạo thành giọt rất

nhỏ, bề mặt của giọt lỏng nhanh chóng khô, tạo thành lớp không thấm nước trên bề

mặt (hạn chế kết tụ giọt) sau đó thành các bong bóng hơi (tăng kích thước) nên tỷ

trọng nhỏ hơn so với chất mang ban đầu (Tonon và ctv, 2008). Ngoài ra, tỷ trọng của

mẫu bột còn phụ thuộc vào tổng lượng nạp liệu, tốc độ dòng nạp liệu, tốc độ dòng

khí, áp suất phun (Chegini và Ghobadian, 2005). Kết quả nghiên cứu của nhóm tương

đồng với tỷ trọng bột sấy phun nước trái cây Açai khi sử dụng GA và MD (Tonon và

ctv, 2009).

Bảng 3.11 Tỷ trọng, độ hút ẩm, độ hòa tan, góc nghỉ của chất mang và bột sấy phun

Mẫu Độ hòa tan Độ hút ẩm (g.100g-1) Tỷ trọng (g.l-1) (%) Góc nghỉ ( 0)

MD 540,28±1,6d 20,38±0,25a 93,20±0,64a 30,73±0,50a

GA 472,81±7,02b 24,39±0,29b 85,32±0,41b 32,46± 0,42b

MD 12% 520,60±0,1c 27,94±0,41c 94,02±0,32c 35,92± 0,61c

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

GA 10% 371,81±0,5a 34,57±0,35d 87,52±0,50d 38,40± 0,25d

Độ hút ẩm mẫu bột GA 10% (34,57%) lớn hơn mẫu bột MD 12% (27,94%) và cao

hơn so với chất mang ban đầu. MD 12% có độ hút ẩm thấp nhất, thấp hơn bột sấy

phun từ dịch quả AmLa (49,82%) (Mishra và ctv, 2014) và bột sấy phun saffron

(Crocus sartivus) (46,6 - 63,47%) (Khazaei và ctv, 2016), GA 10% có độ hút ẩm cao

nhất do có nhiều nhóm ưa nước vì thế dễ dàng liên kết với các phân tử nước từ không

khí xung quanh (Akhavan Mahdavi và ctv, 2016).

Độ hòa tan là một trong những tính chất quan trọng nhất của bột sấy phun, bột có khả

năng hòa tan trong nước cao thì có tính ứng dụng cao. Độ hòa tan của bột sấy phun

MD 12% là 94,02% và có sự khác biệt rất ít với độ hòa tan của MD ban đầu (93,20%).

Đối với chất mang GA và bột sau sấy phun GA 10% có độ hòa tan lần lượt là 85,32%

87,32%. Bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu với chất mang GA 10%, MD 12% có

độ hòa tan cao hơn dầu bơ (7,61-18,05%) (Bae và Lee, 2008), bột cà chua (17,65% -

26,73%) (Sousa và ctv, 2008) và bột gấc (36,91–38,25%) (Tuyen và ctv, 2010).

Góc nghỉ cho biết tính chất dòng chảy của bột từ đó đề xuất quá trình xử lý, thiết kế

thiết bị sấy phun. Góc nghỉ dưới 300 thì khả năng lưu chuyển tốt, 300-450 có tính cố

kết, 450-550 thì bột có sự kết dính thực sự và khi góc nghỉ lớn hơn 550 thì bột chảy rất

chậm chạp, tính cố kết cao khả năng lưu chuyển rất hạn chế (Geldart và ctv, 2006).

Bột sấy phun MD 12% có góc nghỉ là 35,920 tăng 5,190 so với chất mang MD ban

đầu; bộ sấy phun GA 10% có góc nghỉ 37,40 tăng 6,060 so với GA và đều có tính cố

kết. Bột có độ hút ẩm càng cao thì bột dễ dàng hút ẩm không khí xung quanh bề mặt

hạt bột, làm các hạt bột dễ kết dính nhau, khi tỷ lệ các hạt kết dính nhau chiếm phần

lớn thì giảm khả năng chảy dẫn đến góc chảy lớn. Bên cạnh đó, khi kích thước hạt

bột càng nhỏ thì diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng tăng, lực ma sát lớn nên

cũng làm giảm khả năng chảy của bột (Ersus và Yurdagel, 2007).

3.5.4. Đặc điểm hình dạng và kích thước phân bố hạt của bột sấy phun

Kết quả phân tích bề mặt hạt bột sấy phun với những vật liệu vi bao khác nhau bằng

kỹ thuật kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy bột sấy phun MD 12 %, GA 10%

có hình dạng gần giống nhau như bề mặt nhẵn, lõm. Tuy nhiên, bột sấy phun MD

12% có dạng hình cầu, tương đối đồng nhất; còn bột sấy phun GA 10% kích thước

hạt không đồng nhất và nhiều vết lõm hơn (Hình 3.13; 3.14). Vết lõm trên bề mặt hạt

bột sấy phun hình thành do sự co rút khi sấy ở nhiệt độ cao (ẩm mất nhanh) và làm

nguội trong cylon. Bề mặt hạt bột có nhiều vết lõm sẽ có diện tích tiếp xúc lớn hơn

so với hạt bột có bề mặt nhẵn nên ảnh hưởng đến tính chất vật lý của hạt như độ hút

hút ẩm, góc nghỉ, độ hoà tan... Hình dạng hạt bột sấy phun phụ thuộc rất lớn vào loại

chất mang, nhiệt độ sấy. Nhiệt độ sấy cao (đầu vào) hạt bột có xu hướng bề mặt nhẵn,

mịn và cứng; còn nhiệt độ sấy thấp hạt bột có thể bị co lại và có bề mặt lõm (Tonon

và ctv, 2009). Hình dạng của bột sấy phun trong nghiên cứu tương đồng với nghiên

cứu sấy phun dịch chiết lá ổi với chất mang MD, hỗn hợp MD và GA (Tuan và ctv,

2016).

Hình 3.14 Maltodextrin 12% Hình 3.13 Gum arabic 10%

Sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng lazer Horiba LA-960 để đo kích thước hạt và

sự phân bố kích thước hạt của chất mang (GA, MD), bột sấy phun (GA 10%, MD

12%). Sau khi sấy phun, kích thước hạt GA 10% và MD 12% có sự thay đổi rõ rệt,

kích thước hạt nhỏ hơn so với chất mang ban đầu và dao động khá rộng với tỷ lệ %

khác nhau. Với chất mang GA và MD kích thước hạt dao động từ ban đầu lần lượt là

0,510 m đến 300,518 m (58 kích thước) và từ 1,729 m đến 451,556 m (42 kích

thước). Kích thước hạt trung bình MD, GA lần lượt là 97,802 m và 65,927 m. Kích

thước bột sấy phun có sự thay đổi đáng kể, đường kính hạt trung bình của bột sấy

phun MD 12%, GA 10% lần lượt 24,304 m; 19,599 m. Kết quả nghiên cứu của

nhóm tương đồng với bột sấy phun dịch chiết rễ cây hà thủ ô với chất mang là

maltodextrin và gum arabic (Quoc và Van Muoi, 2018). Sự thay đổi kích thước hạt

có thể làm thay đổi các tính chất vật lý như dung trọng, độ phân tán, hình dạng, góc

chảy, khả năng hút ẩm v.v.

(a)

(b)

(a)

(b)

Hình 3.15 Đường cong phân bố kích thước hạt của GA (a) và GA 10% (b)

Hình 3.16 Đường cong phân bố kích thước hạt của MD (a) và MD 12% (b)

Với chất mang là GA có sự phân bố kích thước hạt bột rộng hơn so với các hạt bột

được tạo ra với MD, nên GA 10% có kích thước hạt đồng nhất và ổn định hơn so với

MD 12%. Mặt khác, GA 10% có kích thước trung bình nhỏ hơn MD 12%, nên gum

arabic có khả năng bảo vệ hợp chất sinh học tốt hơn maltodextrin (Tonon và ctv,

2011). Do đó, sử dụng gum arabic làm chất mang trong sấy phun ổn định hơn và có

thể cải thiện được một số tính chất của sản phẩm so với sử dụng maltodextrin. Kết

quả này tương đồng với nghiên cứu sấy phun nước ép Acai với chất mang là

maltodextrin và gum arabic kích thước trung bình với chất mang MD (13,98 m) lớn

hơn chất mang GA (13,83 m) (Tonon và ctv, 2011).

3.6. Xây dựng mô hình dự đoán thời gian bảo quản (shelf-life) dịch chiết và bột

sấy phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta

3.6.1. Xây dựng mô hình dự đoán thời gian bảo quản dịch chiết vỏ mãng cầu ta

TPC và TEAC dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta giảm rõ rệt dưới tác dụng nhiệt độ theo

thời gian bảo quản. Sau 7 ngày bảo quản, tốc độ giảm TPC và TEAC của dịch chiết

ở 700C cao hơn so với bảo quản ở 600C; cả TPC và TEAC dịch chiết giảm lần lượt là

63,85%, 53,75% (DPPH) và 56,70% (ABTS); trong khi ở 600C, cả TPC và TEAC

dịch chiết giảm lần lượt là 69,56%, 57,52% (DPPH) và 66,68% (ABTS). Ở cùng nhiệt

độ, tốc độ giảm TPC thấp hơn so TEAC và tương đồng với nghiên cứu shelf–life cao

chiết rễ cây hà thủ ô (Muoi và Quoc, 2018). Sự giảm TPC và TEAC của dịch chiết

khi bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ cao là do hợp chất polyphenol không bền

(Tolun và ctv, 2016).

Chất lượng một số loại thực phẩm sẽ suy giảm theo thời gian bảo quản phụ thuộc vào

phương pháp bảo quản, tính chất nguyên liệu… chỉ số chất lượng sẽ giảm theo nhiều

mô hình khác nhau như: mô hình bậc 1, mô hình bậc 2, mô hình hàm mũ, mô hình

hyperbol….hay một số mô hình đường phức tạp khác (Deng và ctv, 2018; Kim và

ctv, 2018). Tuy nhiên, bảo quản dịch chiết nhiệt độ 600C, 700C thì sự suy giảm TPC,

TEAC theo DPPH và ABTS đều thích hợp với mô hình bậc 2, hệ số tương quan (R2)

lớn hơn 0,95 (Hình 3.17, 3.18, 3.19). Hệ số tương quan của các mô hình trong nghiên

cứu này tương tự với hệ số tương quan (R2 > 0,98) của mô hình shelf – life carotene

trong bột gấc (Minh và ctv, 2013) hay nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản

đến TPC và TEAC trong quả kiwi (Kim và ctv, 2018).

Dựa vào TPC và TEAC của dịch chiết theo thời gian bảo quản ở 600C, 700C còn lại

85% so hàm lượng ban đầu để xây dựng phương trình hồi quy và thời gian TPC và

TEAC theo DPPH và ABTS.

110

T P C ( % )

100

TPC_60 y = -0,3437x2 - 2,2805x + 101,44 R² = 0,9851

TPC_70 y = 0,4419x2 - 8,6878x + 102,43 R² = 0,9806

Ngày

TPC 60

TPC 70

110

A B T S ( % )

Hình 3.17 Sự giảm TPC của dịch chiết theo nhiệt độ

D P P H ( % )

ABTS_60 y = 0,2618x2 - 7,2324x + 103,36 R² = 0,9528

DPPH_60 y = 0,0396x2 - 7,0284x + 103,32 R² = 0,9732

65 ABTS_70 y = 0,6606x2 - 10,859x + 101,15 R² = 0,9858

DPPH_70 y = 0,7949x2 - 12,232x + 101,25 R² = 0,9842

ABTS 60

6 Ngày ABTS 70

DPPH 60 Poly. (DPPH 60)

Ngày DPPH 70 Poly. (DPPH 70)

Hình 3.19 Sự giảm ABTS của dịch chiết theo Hình 3.18 Sự giảm DPPH của dịch chiết theo nhiệt độ nhiệt độ

Bảng 3.12 Phương trình hồi quy và thời gian bảo quản TPC, TEAC của dịch chiết

Nhiệt độ

Hệ số tương

Phương trình hồi quy

Thời gian (ngày)

(0C)

quan (R2)

y = -0,3437x2 - 2,2805x + 101,44

0,9851

4,35

TPC

y = 0,4419x2 - 8,6878x + 102,43

0,9806

2,27

TEAC-

y = 0,0396x2 - 7,0284x + 103,32

0,9732

2,65

DPPH

y = 0,7949x2 - 12,232x + 101,25

0,9842

1,47

TEAC-

y = 0,2618x2 - 7,2324x + 103,36

0,9528

2,83

ABTS

y = 0,6606x2 - 10,859x + 101,15

0,9858

1,65

giảm còn 85% so với ban đầu

Dựa theo phương trình hồi quy ở Bảng 3.12, thời gian bảo quản để TPC dịch chiết

còn lại 85% là 4,35 ngày, còn TEAC theo DPPH, ABTS lần lượt là 2,65 và 2,83 ngày

ở 600C. Trong khi thời gian bảo quản dịch chiết để TPC, TEAC bằng 85% so với ban

đầu là 2,27 ngày đối với TPC; 1,47 và 1,65 ngày đối với TEAC theo DPPH, ABTS ở

700C. Từ đó, tính được hệ số Q10 của TPC và TEAC theo DPPH, ABTS theo công

0𝐶

thức 2-1 (Fu và Labuza, 1997; Muoi và Quoc, 2018).

0𝐶

= = 1,92 𝑄10−𝑇𝑃𝐶 = 4,35 2,27 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0 + 100𝐶)

0𝐶

= = 1,80 𝑄10−𝐷𝑃𝑃𝐻 = 2,65 1,47 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0 + 10𝑜𝐶)

= = 1,72 𝑄10−𝐴𝐵𝑇𝑆 = 2,83 1,65 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0 + 100𝐶)

Mỗi loại thực phẩm có thể có một hay nhiều chỉ số đánh giá sự suy giảm chất lượng

như chất lượng cảm quan, hàm lượng vi sinh vật, màu sắc, giá trị dinh dưỡng và một

số chỉ số hóa lý v.v. Đặc biệt, hệ số Q10 tương đối thấp liên quan đến sự giảm các hợp

chất có hoạt tính sinh học như: Q10 từ 1,5 – 2 đối với quá trình oxy hóa (Labuza và

ctv, 1979), Q10 = 2,44 đối với carotenoid tổng suy giảm còn 30% trong bột gấc (Minh

và ctv, 2013), Q10 = 2,65 đối với TPC trong dịch chiết rễ cây hà thủ ô (Muoi và Quoc,

2018) hay Q10 = 1,34 đối với TPC trong quả kiwi (Kim và ctv, 2018). Kết quả nghiên

cứu của nhóm tương đương với khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến TPC

và TEAC trong quả kiwi, Q10 của TPC và TEAC lần lượt là 1,43 và 1,43 (Kim và ctv,

2018).

Từ hệ số Q10 có thể ước tính được thời gian suy giảm của TPC và TEAC còn 85% ở

300C theo công thức (2 – 2) (Labuza và ctv, 1979; Minh và ctv, 2013; Muoi và Quoc,

60−30

𝑇1−𝑇2

10 = 4,35. 1,92

10 = 30,79 (ngày)

2018).

𝑓2−𝑇𝑃𝐶 = 𝑓1−𝑇𝑃𝐶. 𝑄10−𝑇𝑃𝐶

60−30

𝑇1−𝑇2

10 = 2,65. 1,80

10 = 15,45 (ngày)

60−30

𝑇1−𝑇2

10 = 2,83. 1,72

10 = 14,4 (ngày)

𝑓2−𝐷𝑃𝑃𝐻 = 𝑓1−𝐷𝑃𝑃𝐻. 𝑄10−𝐷𝑃𝑃𝐻

𝑓2−𝐴𝐵𝑇𝑆 = 𝑓1−𝐴𝐵𝑇𝑆. 𝑄10−𝐴𝐵𝑇𝑆

Dựa vào kết quả ước tính thời gian bảo quản TPC và TEAC suy giảm còn 85% và

thời gian bảo quản thực tế ở 300C, ta thấy tốc độ suy giảm của TEAC nhanh hơn so

với TPC. Ước tính thời gian suy giảm của TPC còn 85% là 30,79 ngày, TEAC là

15,45 ngày theo DPPH và 14,4 ngày theo ABTS ở 30oC.

TEAC (μmol TE/g CK)

TPC

Ngày bảo

(mg GAE/

%TPC

DPPH

ABTS

quản

DPPH

ABTS

g CK)

(%)

94,49 ± 0,23a

100

624,59 ± 2,36a

1325,81± 5,44a

100

14,4

1104,7 ± 14,28b 83,32

15,45

520,20 ±7,82b

83,29

30,79

79,63 ± 0,81b

84,27

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 3.13 Đánh giá độ tin cậy của mô hình shelf – life của dịch chiết

Đánh giá độ tin cậy mô hình shelf-life dịch chiết vỏ mãng cầu, tiến hành thử nghiệm

bảo quản quản dịch chiết ở 300C, kết quả cho thấy: sau 30,39 ngày bảo quản dịch

chiết có TPC bằng 84,27% so với TPC ban đầu; DPPH bằng 83,29% DPPH ban đầu

sau 15,45 ngày; và ABTS bằng 83,32% so với ban đầu sau 14,4 ngày bảo quản. Kết

quả thử nghiệm cho thấy thời gian ước tính để duy trì TPC, TEAC bằng 85% giá trị

ban đầu và thời gian duy trì thực tế (Bảng 3.13) không có sự sai khác đáng kể (0,73%

đối với TPC; 1,71% theo DPPH và 1,68% theo ABTS) nên mô hình shelf-life dịch

chiết có độ tin cậy cao, từ đóa có thể ứng dụng vào trong thực tế để dự đoán thời gian

bảo quản sản phẩm ở những nhiệt độ tương ứng.

3.6.2. Xây dựng mô hình shelf – life (mô hình dự đoán thời gian bảo quản) cho

bột sấy phun GA 10%

Tương tự như dịch chiết, bột sấy phun GA 10% có TPC và TEAC cũng giảm dần

theo thời gian bảo quản. Cụ thể: ở 700C tốc độ giảm TPC và TEAC của bột sấy phun

cũng cao hơn so với bảo quản ở 600C. Với GA 10% sau 7 ngày bảo quản, ở 600C bột

sấy phun TPC, TEAC theo DPPH, ABTS giảm lần lượt là 16,75%, 14,97% và

15,14%; còn ở 700C, cả TPC và TEAC theo DPPH, ABTS giảm lần lượt là 23,75%,

21,84% và 22,11%.

Bột sấy phun GA 10% khi bảo quản ở nhiệt độ 60oC và 70oC, cả TPC và TEAC (theo

DPPH và ABTS) đều thích hợp với mô hình bậc 2, hệ số tương quan (R2) lớn hơn

0,98. Hệ số tương quan của các mô hình trong nghiên cứu tương đồng với hệ số tương

quan của mô hình shelf – life các bột sấy phun rễ cây hà thủ ô với chất mang là

maltodextrin và gum arabic (Muoi và Quoc, 2018). Nhìn chung, bột sấy phun chỉ hạn

chế sự giảm TPC và TEAC chứ không bảo toàn tính chất của sản phẩm. Sự giảm

chậm này do trong quá trình sấy phun ở nhiệt độ cao, các hợp chất nhạy cảm với nhiệt

đã bị mất đi nhanh chóng, còn lại các chất có hoạt tính sinh học tương đối bền với

nhiệt nên khả năng duy trì TPC và TEAC trong thời gian dài. Mặt khác, vật liệu sấy

phun gum arabic tạo màng bảo vệ tốt các hợp chất polyphenol do hạn chế polyphenol

tiếp xúc với nhiệt độ, ánh sáng, oxy không khí trong suốt thời gian bảo quản. Ngoài

ra, bột sấy phun có hoạt độ nước thấp nên hạn chế sự phát triển của vi sinh vật góp

phần hạn chế suy giảm chất lượng trong quá trình bảo quản (Gharsallaoui và ctv,

2007).

Dựa vào hàm lượng TPC, TEAC (DPPH và ABTS) của bột sấy phun GA 10% bảo

quản ở 600C và 700C còn 85% so với hàm lượng TPC, TEAC ban đầu để xây dựng

phương trình hồi quy và thời gian bảo quản sản phẩm.

105

T P C ( % )

TPC_60 y = 0,0749x2 - 3,3554x + 102,1 R² = 0,9375

TPC_70 y = -0,0396x2 - 3,4926x + 101,42 R² = 0,9812

6 8 Thời gian (ngày)

TPC 60 Poly. (TPC 60)

TPC 70 Poly. (TPC 70)

105

D P P H ( % )

A B T S ( % )

DPPH_60 y = -0,2961x2 - 0,2063x + 100,72 R² = 0,9852

ABTS_60 y = -0,1462x2 - 1,3869x + 101,09 R² = 0,9708

DPPH_70 y = -0,0946x2 - 2,2695x + 98,787 R² = 0,9793

ABTS_70 y = 0,1338x2 - 4,2418x + 101,05 R² = 0,988

8 Thời gian (ngày)

6 8 Thời gian (ngày)

DPPH 60 Poly. (DPPH 60)

DPPH 70 Poly. (DPPH 70)

ABTS 60 Poly. (ABTS 60)

ABTS 70 Poly. (ABTS 70)

Hình 3.20 Sự giảm TPC của GA 10% theo nhiệt độ

Hình 3.21 Sự giảm DPPH của GA 10% theo Hình 3.22 Sự giảm DPPH của GA 10% theo

nhiệt độ nhiệt độ

Dựa theo phương trình hồi quy ở Bảng 3.14, thời gian bảo quản bột sấy phun GA

10% có TPC, TEAC (theo DPPH và ABTS) còn 85% so với ban đầu ở 600C lần lượt

là 5,86; 6,95 và 6,77 ngày; còn ở 700C lần lượt là 4,47; 5,02 và 4,39 ngày.

Từ bảng 3.14, ta có thể xác định được hệ số Q10 của TPC, TEAC theo DPPH, ABTS

của bột sấy phun GA 10% theo công thức (2 – 1) (Fu và Labuza, 1997; Minh và ctv,

𝑜𝐶

2013; Muoi và Quoc, 2018):

= = 1,31 𝑄10−𝑇𝑃𝐶−𝐺𝐴10% = 5,86 4,47 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0 + 10𝑜𝐶)

𝑜𝐶

= = 1,38 𝑄10−𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐺𝐴10% = 6,85 5,02 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0 + 10𝑜𝐶)

= = 1,54 𝑄10−𝐴𝐵𝑇𝑆−𝐺𝐴10% = 6,77 4,39 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 𝑇0 𝑠ℎ𝑒𝑙𝑓 𝑙𝑖𝑓𝑒 𝑎𝑡 (𝑇0 + 10𝑜𝐶)

Bảng 3.14 Phương trình hồi quy và thời gian bảo quản TPC, TEAC của bột sấy

Gum arabic 10%

Hệ số

Nhiệt độ

Thời gian

Phương trình hồi quy

tương quan

(0C)

(ngày)

(R2)

y = 0,0749x2 - 3,3554x + 102,1

0,9375

5,86

TPC

y = -0,0396x2 - 3,4926x + 101,42

0,9812

4,47

y = -0,2961x2 - 0,2063x + 100,72

0,9852

6,95

TEAC-

y = -0,0946x2 - 2,2695x + 98,787

0,9793

5,02

DPPH

y = -0,1462x2 - 1,3869x + 101,09

0,9708

6,77

TEAC-

y = 0,1338x2 - 4,2418x + 101,05

0,988

4,39

ABTS

phun suy giảm còn 85%

Từ hệ số Q10 có thể ước tính được thời gian suy giảm của TPC và TEAC còn 85% ở

300C theo công thức (2 – 2) (Labuza và ctv, 1979; Minh và ctv, 2013; Muoi và Quoc,

60−30

𝑇1−𝑇2

10 = 5,86. 1,31

10 = 13,17 (ngày)

2018):

60−30

𝑇1−𝑇2

10 = 6,85. 1,38

10 = 18,27 (ngày)

𝑓2−𝑇𝑃𝐶−𝐺𝐴10% = 𝑓1−𝑇𝑃𝐶−𝐺𝐴. 𝑄10−𝑇𝑃𝐶−𝐺𝐴

60−30

𝑇1−𝑇2

10 = 6,77. 1,54

10 = 24,73 (ngày)

𝑓2−𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐺𝐴10% = 𝑓1−𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐺𝐴. 𝑄10−𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐺𝐴

𝑓2−𝐴𝐵𝑇𝑆−𝐺𝐴10% = 𝑓1−𝐴𝐵𝑇𝑆−𝐺𝐴. 𝑄10−𝐴𝐵𝑇𝑆−𝐺𝐴

Thời gian bảo quản bột sấy phun GA 10% để TPC và TEAC còn 85% theo mô hình

và thời gian bảo quản thực tế ở 300C nhận thấy tốc độ suy giảm của TEAC chậm hơn

so với TPC. Ước tính thời gian suy giảm TPC, TEAC (theo DPPH, ABTS) còn 85%

của bột sấy phun GA 10% lần lượt là 13,17; 18,27 và 24,73 ngày. Độ tin cậy của mô

hình được đánh giá từ ngày 0 đến ngày thử nghiệm ở 300C, nhận thấy tỷ lệ duy trì

thực tế của GA 10% là 80,08% theo TPC; với TEAC còn 81,21% (DPPH); 78,64%

(ABTS). Độ chênh lệch giữa giá trị duy trì và giá trị thực tế của GA 10% là 4,92%

đối với TPC; TEAC theo DPPH là 3,79% ; TEAC theo ABTS là 6,36%. Kết quả, cho

thấy sự khác biệt giữa duy trì (85%) và giá trị thực tế của TPC, TEAC không đáng

kể, do đó mô hình có độ tin cậy cao và có thể sử dụng trong việc khảo sát sự suy giảm

của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thời gian bảo quản ở những nhiệt độ bất

kỳ. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu xây dựng mô hình shelf – life

cho chế phẩm sấy phun từ rễ cây hà thủ ô (Muoi và Quoc, 2018).

GA 10%

TEAC (μmol TE/g CK)

Ngày

TPC

% TPC

bảo

DPPH

ABTS

%ABTS

(mgGAE/gCK)

DPPH

quản

66,27 ± 0,06a

100

480,59± 4,50a

100

754,32 ± 3,69a

100

13,17

53,07 ± 3,29b

80,08

18,27

390,31 ± 42,50b 81,21

24,73

593,17 ± 13,13b

78,64

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05

Bảng 3.15 Đánh giá độ tin cậy của mô hình shelf – life bột sấy phun GA 10%

3.7. Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học, đánh giá khả năng kháng

khuẩn cao chiết và bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta

3.7.1. Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học

Dịch chiết và bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta có nhiều hợp chất có hoạt tính

sinh học được trình bày ở Bảng 3.16 dựa vào các phương pháp định tính các hợp chất

có hoạt tính sinh học của (Ayoola và ctv, 2008).

Dịch chiết và bột sấy phun có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như tannin,

saponin, steroid, terpenoids, coumarin.

Tannin là hỗn hợp của acid gallic và acid digallic ở dạng tự do cũng như dạng kết

hợp với glucose, tồn tại trong không bào. Tannin có khả năng kháng nhiều vi khuẩn

như: Bacillus, Staphilococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus v.v.(Scalbert và

ctv, 2005).

Bảng 3.16 Các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong dịch chiết và bột sấy phun

Stt Loại hợp chất Dịch chiết Bột sấy phun MD 12% Bột sấy phun GA 10%

1 2 3 4 5 6 7 8 Tanins Saponin Steroid Terpenoid Anthoxyanin Leucoanthoxyanin Coumarin Emodin + + + + - - + - + + + + - - + - + + + + - - + -

(-): không có mặt; (+): có mặt

Dựa vào phương pháp “thử bọt”, dịch chiết có sự tồn tại của saponin. Saponin có tác

dụng bảo vệ cơ thể con người chống lại bệnh ung thư, giảm cholesterol, hạ đường

huyết, trong điều trị tăng calci niệu ở người, chống ngộ độc chì cấp tính (Shi và ctv,

2004). Ngoài ra, saponin có khả năng kháng nhiều chủng vi khuẩn như Escherichia

coli, Pseudomonas aerugenosa, Salmonella typhi, Shigella flexnerri, Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilys v.v.(Ehsan và Hawa, 2011).

Sự hiện diện của terpenoid cho thấy mức độ phong phú các lớp chất có trong vỏ quả

mãng cầu ta. Terpenoid có tác dụng hạ đường huyết, chống ung thư (Cör và ctv, 2018)

và kháng khuẩn cao như: Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus

luteus và Escherichia coli (Ankli và ctv, 2000). Ngoài ra, dịch chiết vỏ mãng cầu ta

cũng có sự hiện diện của steroid, coumarin. Kết quả nghiên cứu của nhóm tương đồng

với nghiên cứu định tính các hợp chất trong vỏ quả mãng cầu ta Annona squamosa

L. (Pal và Sampath Kumar, 1995).

Coumarin (1,2-benzopyrone; 2H-1-benzopyran-2-one; phenylpropanoids; acid cis-o-

coumarinic; anhydrid coumarinic) thuộc nhóm lớn các hợp chất có nhiều trong thực

vật, vi khuẩn và nấm (Anand và ctv, 2012; Okeke và ctv, 2001). Coumarin có khả

năng kháng khuẩn, ức chế cycloxygenase, chống đột biến gen, kháng viêm, chống

đông huyết, làm giãn mạch và chống ung thư, kích thích thần kinh trung ương (Thakur

và ctv, 2015).

Các kết quả trên cho thấy vỏ mãng cầu ta có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như

kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa nên khai thác hợp lý phụ phẩm này sẽ được

ứng dụng nhiều trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm cũng như mỹ phẩm cũng như

giảm ô nhiễm môi trường.

3.7.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết

và bột sấy phun vỏ mãng cầu ta

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết và bột sấy phun được tiến hành khảo

sát trên các chủng vi khuẩn: Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia coli (ATCC

25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella spp. và Lysteria spp. phân

lập từ thịt gà và fillet cá basa của Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp nhất mà

tại đó xuất hiện vòng vô khuẩn; nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng

khuẩn càng cao.

Dimethyl sulfoxide (DMSO) là dung môi hữu cơ có khả năng hòa tan tan hầu hết các

hợp chất hữu cơ bao gồm carbohydrate, polymer, peptide cũng như nhiều muối vô cơ

nhưng không phản ứng với chất cần hòa tan. DMSO 5% được chọn làm đối chứng

âm, làm dung môi để hòa tan cao chiết và không kháng các chủng vi khuẩn thử

nghiệm như Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria spp., Escherichia coli

(AlzorekyNakahara, 2003).

Khả năng kháng khuẩn của cao chiết vỏ mãng cầu ta: cao chiết đều kháng được

các chủng vi sinh vật nghiên cứu và đường kính vòng kháng khuẩn phụ thuộc vào

nồng độ cao chiết.

Đối chứng dương gentamycin cùng nồng độ 10 μg/đĩa nhưng khả năng kháng khuẩn

với từng loại vi khuẩn là khác nhau (Bảng 3.17), cụ thể đường kính vòng kháng khuẩn

Bacillus cereus (25,42 mm) > Shigella spp. (19,40 mm) > Lysteria spp. (19,25 mm)

> E. coli (19,23 mm), S. aureus (16,80 mm) > S. typhimurium (15,90 mm). Trong đó,

B. cereus và Shigella spp. bị bởi kháng sinh này với đường kính vòng kháng không

có sự khác biệt (Okeke và ctv, 2001).

Đường kính vòng tròn kháng khuẩn (mm)

S. aureus

B. cereus

Listeria sp.

Shigella sp.

E. coli

S. typhimurium

Nồng độ chất kháng (mg/mL)

11,86±0,02bA 12,10±0,07bB 10,39±0,05bC 10,24±0,13bD 8,41± 0,06 cD 10,59±0,03cA 10,27±0,07cB 7,55±0,05 dD 9,62±0,18dB 9,22±0,04dA 6,25±0,08 eC 9,16±0,06eB 8,32±0,03eA 6,44±0,10fA 6,50±0,06fA - - - - - -

9,56±0,0bE 8,87±0,0cD 8,34±0,02 dE 7,22±0,03 eD 7,04±0,03fB -

11,25±0,02bF 9,40±0,05cE 8,42±0,06dE 7,47±0,18eE 6,94±0,0 fC -

8,87±0,01cC 8,67±0,04dC 6,39±0,05eC - - -

- 16,80±0,05aA 25,42±0,73aB 19,25±0,05aC 19,40±0,08aD 19,23±0,87aC

- 15,90±0,09 aE

800 400 100 50 25 10 Đối chứng âm DMSO5% Gentamycin 10μg/đĩa Các kí tự in hoa, in thường khác nhau trong cùng một cột, một hàng khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p< 0,05. G: Gentamycin; D: DMSO 5%.

Bảng 3.17 Đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết vỏ quả mãng cầu ta

A: S. aureus; B: B. cereus; C: Listeria sp; D: Shigella sp; E: E. coli; F: S. typhimuriumi; G: gentamycine. Các số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tương ứng với nồng độ (mg/mL) 800, 400, 100, 50, 25, 10 maltodextrin, DMSO 5%.

Hình 3.23 Đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết vỏ mãng cầu

Kháng sinh gentamycin có khả năng kháng khuẩn cao là nhờ vào sự ức chế tổng hợp

protein và phá vỡ toàn bộ màng tế bào vi khuẩn. Quá trình này bao gồm việc khuếch

tán qua màng ngoài và hấp thụ tế bào chất, gentamycin sẽ di chuyển nhanh chóng qua

màng để gắn kết ribosom của vi khuẩn, làm ức chế tổng hợp protein, làm giảm độ

chính xác của các RNA thông tin, dẫn đến kết hợp sai các acid amin trong chuỗi

polypeptid của vi khuẩn (Zembower và ctv, 1998).

Khi nồng độ dịch chiết giảm, đường kính vòng kháng khuẩn cũng giảm, MIC đối với

Lysteria spp.và Shigella spp. nồng độ 50 mg/mL và S. aureus, B. subtilys, E. coli, S.

typhimurium, Lysteria spp., Shigella spp. là 25 mg/mL.

Khả năng kháng khuẩn và MIC của bột sấy phun

Bột sấy phun MD12% đều kháng các chủng vi sinh vật nghiên cứu và đường kính

vòng kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ bột sấy phun (Bảng 3.18).

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

S.aureus

B. cereus

Listeria sp. Shigella sp. E.coli

S. typhimurium 9,88±0,03Àf

9,32±0,08Aa - - - - -

13,60 ±0,01Ab ức chế - - - -

8,04±0,06Ac 7,14±0,02Ba - - - -

11,30±0,02Ad - - - - -

8,84±0,48Ae 6,78±0,01Bb - - - -

- - - - -

- 17,46±0,04Ba

- 25,26±0,09Bb

- 19,07±0,10Cc

- 18,72±0,04Bd

- 19,84±0,05Ce

- 18,24±0,02Bf

độ Nồng chất kháng (mg/mL) 800 400 200 100 50 Đối chứng âm DMSO5% Gentamycin 10μg/đĩa

Các kí tự in hoa, in thường khác nhau trong cùng một cột, một hàng khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05, G: Gentamycin; XD: gồm MD-DMSO 5%.

Bảng 3.18 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun MD 12%

Cùng nồng độ chất kháng khuẩn (800 mg/mL, MIC) đường kính vòng kháng khuẩn

giữa các chủng vi khuẩn khác nhau có sự khác biệt ý nghĩa trong thống kê (p<0,05)

như S. aureus là 9,32±0,08 mm, B. cereus là 13,60±0,01 mm, E. coli là 8,84±0,48

mm, Shigella spp. (11,30±0,02 mm), S. typhimurium 9,88±0,03 mm) và MIC 400

mg/mL: Listeria spp. (7,14±0,02mm), E. coli (6,78±0,01mm).

A: S. aureus; B: B. cereus; C: Listeria sp; D: Shigella sp; E: E. coli; F: S. typhimuriumi; G: gentamycine. Các số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tương ứng với nồng độ (mg/mL) 800, 400, 200, 100, 50, maltodextrin, DMSO 5%.

Hình 3.24 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun MD 12%

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

S.aureus

B. cereus

Listeria sp. Shigella sp. E.coli

Nồng độ chất kháng (mg/mL)

9,28±0,06bB

8,13±0,1bA 6,97±0,23cA 6,55±0,03dA 6,03±0,05eA - - - 17,4±0,04Ba

6,81±0,02cA - - - - - 25,56±0,08aC

9,45±0,07bB 6,74±0,04cA 6,58±0,05dA - - - - 19,96±0,03aB

9,45±0,039bB - - - - - - 19,88±0,09aB

9,93±0,50bC 7,69±0,27cB 7,18±0,05dB - - - - 20,03±0,10aB

S. typhimurium 9,49±0,24bB 7,86±0,028cB 6,89±0,35dB - - - - 16,11±0,12 dB

800 400 200 100 50 Đối chứng âm DMSO5% Gentamycin 10μg/đĩa

Các kí tự in hoa, in thường khác nhau trong cùng một cột, một hàng khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05, G: Gentamycin; XD: gồm GA-DMSO 5%.

Bảng 3.19 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun GA 10%

Đối với bột sấy phun GA 10%, ở nồng độ 400 mg/mL toàn bộ vi khuẩn đều bị kháng

(trừ Shigella không thấy xuất hiện đường kính vòng kháng), MIC của Shigella spp.

là 800 mg/mL, B. cereus là 400 mg/mL, Lysteria spp., E. coli, S. typhimurium là 200

mg/mL và S. aureus là 100 mg/mL.

A: S. aureus; B: B. cereus; C: Listeria sp; D: Shigella sp; E: E. coli; F: S. typhimuriumi; G: gentamycine.

Các số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tương ứng với nồng độ (mg/mL) 800, 400, 200, 100, 50, maltodextrin, DMSO 5%.

Hình 3.25 Đường kính vòng kháng khuẩn của bột sấy phun GA 10%

Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của bột sấy phun thấp hơn cao chiết. Nguyên

nhân qua quá trình sấy phun, các hợp chất có hoạt tính sinh học bị thay đổi hoặc hao

hụt do nhiệt độ sấy cao (1500C), polyphenol bị biến đổi thành dạng polymer hóa giảm

hoạt tính sinh học (Mishra và ctv, 2014). Cùng nồng độ chất kháng, đường kính vòng

kháng của mỗi loại vi khuẩn là khác nhau do cấu tạo, đặc điểm và khả năng thích ứng

riêng của từng loại vi khuẩn. Thành tế bào đóng vai trò rất quan trọng giúp duy trì

hình thái tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao, giúp tế bào kháng áp suất thẩm

thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân

tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với thực khuẩn

thể (Navarre và Schneewind, 1999). Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào là một

lớp peptidoglycan dày 14-18 nm giúp giảm tiếp xúc với môi trường bên ngoài, do đó

ít bị ảnh hưởng bởi những yếu tố bất lợi. Trong khi đó, vi khuẩn Gram âm chỉ có lớp

peptidoglycan dày khoảng 10 nm dẫn đến dễ mẫn cảm, bị phá vỡ bởi những thay đổi

gây ra bởi ngoại cảnh.

Ngoài ra, khả năng kháng khuẩn còn phụ thuộc vào hình dạng hạt bột sấy phun, bột

sấy phun có hình tròn, nhẵn sẽ bảo vệ tốt các thành phần có hoạt tính sinh học của

cao chiết tránh được các tác động nhiệt độ, ánh sáng, ẩm v.v. và hòa tan dễ dàng trong

dung môi. Cấu trúc hạt bột sấy phun lồi lõm, không đều hoặc gãy vỡ làm thất thoát

các thành phần kháng khuẩn, gây khó khăn trong quá trình hòa tan.

Khả năng kháng khuẩn dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta cao có thể do nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học như: tannin, saponin, steroid, terpenoid, coumarin v.v. Do tannin

liên kết với thành tế bào vi khuẩn, gây ứ đọng enzyme protease (Omojate Godstime

và ctv, 2014), ức chế enzyme ngoại bào làm mất cân bằng các chất nền cần thiết cho

sự phát triển của vi sinh vật hoặc tác động trực tiếp lên quá trình chuyển hóa của vi

sinh vật thông qua ức chế quá trình phosphoryl oxy hóa ở ty thể, ngăn cản sự vận

chuyển điện tử trong tế bào vi khuẩn, từ đó làm suy yếu tế bào đến chết (Buzzini và

ctv, 2008).

Saponin ức chế sự phát triển vi sinh vật bằng cách tác động sự thay đổi thành tế bào

của vi khuẩn (Akinpelu và ctv, 2014).

Steroid tác động đến bề mặt tế bào vi khuẩn theo hai mô hình: mô hình 'thảm' và

'nòng súng' (Shai, 1999). Trong mô hình thảm, steroid liên kết với bề mặt tế bào thông

qua tương tác ion và khi đạt nồng độ, toàn bộ các mảng của màng bị loại bỏ. Còn mô

hình nòng súng, steroid tập hợp lại thành các bó trong màng giống như các nòng súng,

tạo thành nhiều lỗ nhỏ trong màng, làm tăng tốc độ khử cực màng. Từ đó, màng tế

bào vi khuẩn dần vỡ ra, nguyên sinh chất tràn ra ngoài và làm chết vi khuẩn (Omojate

Godstime và ctv, 2014).

Coumarin có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn như S. aureus, E. coli, S.

typhimurium…là nhờ vào sự ức chế một số DNA của vi khuẩn (Yang và ctv,

2008). Coumarin ức chế enzyme DNA gyrase của vi khuẩn, ngăn cản quá trình sao

chép DNA, xúc tác quá trình thủy phân ATP.

Bên cạnh đó, coumarin và terpenoid cũng có khả năng kháng khuẩn cao. Terpenoid

tác động lên màng plasma của vi khuẩn, một số quá trình trao đổi chất của vi khuẩn

và quá trình truyền tín hiệu gây ra sự xáo trộn màng tế bào dẫn đến phá vỡ màng

(Omojate Godstime và ctv, 2014).

3.8. Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh

3.8.1. Ảnh hưởng nồng độ polyphenol dịch chiết đến khối lượng tôm

Thay đổi khối lượng là một trong những tính chất vật lý ảnh hưởng cấu trúc và tính

chất cảm quan của thực phẩm (Wang và ctv, 2018). Độ hao hụt khối lượng của tôm

9.0

8.0

D d

7.0

được lưu trữ ở 4 ± 10C được thể hiện Hình 3.33.

)

6.0

%

(

5.0

AdAd

4.0

g n ợ ư

3.0

D b

2.0

ABa

AB Ac c

1.0

l i ố h k m ả i g

0.0

ộ Đ

6 9 Thời gian (ngày)

(M:Mẫu đối chứng không nhúng chitosan; M0:Mẫu ngâm dịch nhúng chitosan 1,5%; M1, M2, M3 và M4

:Mẫu ngâm dịch nhúng chitosan 1,5% bổ sung 100mg, 200mg, 300mg và 400mg GAE/L dịch chiết từ vỏ quả

mãng cầu ta)

Hình 3.26 Sự thay đổi khối lượng của các mẫu theo thời gian bảo quản

Độ giảm khối lượng tôm tăng dần theo thời gian bảo quản và có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê giữa các mẫu (p<0,05). Sau 12 ngày bảo quản, mẫu đối chứng (M)

không nhúng chitosan và mẫu nhúng chitosan (M0) có độ giảm khối lượng cao hơn

so với các mẫu có sử dụng màng bao chitosan bổ sung dịch chiết chứa polyphenol.

Đặc biệt, mẫu M có tốc độ giảm nhanh nhất từ 2,27 ± 0,37% (ngày 0) lên 8,04 ±

0,01% (ngày 12). Ngày thứ 12, độ giảm khối lượng mẫu M1, M2, M3, M4 lần lượt

là 5,00 ± 0,64%; 5,03 ± 0,01%; 3,83 ± 0,03% và 3,83 ± 0,01% so với khối lượng ngày

0. Trong đó, M3 và M4 có độ giảm khối lượng ít nhất do dịch chiết từ vỏ mãng cầu

có nhiều hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển vi sinh vật, quá trình oxy hóa và

thủy phân nên hạn chế sự giảm khối lượng của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo

quản lạnh (Mohan và ctv, 2012). Sau ngày 12 bảo quản, mẫu M3 có tỷ lệ giảm khối

lượng 37,44% so với mẫu đối chứng, tương đồng với sự giảm khối lượng (32%) cá

tuyết phủ chitosan 360 cP sau 12 ngày bảo quản (Jeon và ctv, 2002) và bảo quản tôm

có lớp phủ chitosan-gelatin (Farajzadeh và ctv, 2016).

3.8.2. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến giá trị pH

Sự thay đổi pH phản ánh chất lượng thực phẩm (Na và ctv, 2018). Chỉ số pH các mẫu

ở ngày 0 và ngày 3 không có sự khác biệt và không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Từ

ngày 6 trở đi, giá trị pH bắt đầu tăng theo thời gian bảo quản và giữa các mẫu có sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Giá trị pH các mẫu tôm tăng dần từ 6,44 ± 0,05 (ngày 0) đến 8,47 ± 0,03 (ngày 12)

do các hợp chất trimethylamin, dimethylamin tạo thành từ các phản ứng của enzyme

nội tại và vi sinh vật; pH sản phẩm từ acid yếu sang trung tính hoặc kiềm (Limbo và

ctv, 2009). Sau 6 ngày bảo quản các mẫu tôm vẫn đạt chất lượng nhất (pH <7,70).

Tuy nhiên, tôm sau 9 ngày bảo quản giá trị pH mẫu M và M0 vượt quá giới hạn chấp

nhận là 7,95 và sau 12 ngày bảo quản, tất cả các mẫu đều có vượt qua giới hạn (pH >

7,95), chứng tỏ mẫu tôm đã hư hỏng. Sau ngày 12, pH các mẫu nhúng có bổ sung

dịch chiết polyphenol chênh lệch không nhiều (pH dao động trong khoảng 8,03 -8,47)

trong thời gian bảo quản. Kết quả nghiên cứu tương đồng với sử dụng màng chitosan

kết hợp với chiết xuất vỏ lựu để bảo quản tôm thẻ chân trắng (Yuan và ctv, 2016);

pH của tôm sau 10 ngày của mẫu đối chứng và mẫu khảo sát lần lượt là 8,40 và 8,22.

8.5

Ad Ad

7.5

AB Cc c

AB c

H p

AbAb

AaAa

6.5

6 Thời gian (ngày)

Hình 3.27 Sự thay đổi giá trị pH của các mẫu theo thời gian bảo quản

Kết quả nghiên cứu tương đồng với sử dụng lớp phủ kháng khuẩn từ gelatin da cá da

trơn để duy trì chất lượng và kéo dài thời hạn sử dụng của tôm thẻ chân trắng (Jiang

và ctv, 2011). Từ đó, ta có thể thấy việc bổ sung dịch chiết polyphenol có ảnh hưởng

đến pH, làm chậm sự hư hỏng sản phẩm trong quá trình bảo quản. Tuy thay đổi nhỏ

về pH nhưng lại có tính chất quan trọng trong bảo quản, biểu thị sự thay đổi cấu trúc

và giảm chất lượng sản phẩm. Với tôm nhúng vào dung dịch có nồng độ 300 và 400

mg GAE/L mang lại giá trị pH thấp hơn so với các mẫu còn lại sau thời gian bảo quản

lạnh.

3.8.3. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số PV

Sự oxy hóa lipid là một trong những tác nhân gây suy giảm chất lượng của tôm thông

qua phản ứng tự oxy hóa và phản ứng có enzyme xúc tác như lipoxygenase,

peroxidase (Nirmal và Benjakul, 2009). Giá trị PV (meq O2/kg) của các mẫu trong

thời gian bảo quản 12 ngày được trình bày trong Hình 3.35

Giá trị PV của 6 mẫu đều tăng dần trong quá trình bảo quản lạnh và có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu (p<0,05). Trong đó, mẫu đối chứng không nhúng

chitosan (M) có chỉ số PV tăng mạnh nhất từ 0,65 ± 0,05 (meq/kg, ngày 0) lên 8,03

± 0,15 (meq/kg, ngày 12), tiếp theo là mẫu chỉ được nhúng chitosan (M0) tăng từ 0,63

± 0,04 (meq/kg, ngày 0) lên 6,73 ± 0,25 (meq/kg, ngày 12). Chỉ số PV của các mẫu

khảo sát có bổ sung dịch chiết polyphenol nhìn chung đều có tốc độ tăng chậm hơn

và phụ thuộc vào nồng độ polyphenol bổ sung; và mẫu M3, M4 thấp nhất, kết quả lần

9.0

8.0

7.0

6.0

lượt như sau 4,93 ± 0,15 ; 4,90 ± 0,10 (meq/kg).

) g k

/

5.0

Bd

q e m

(

4.0

V P

BC c

3.0

Ac Ac

2.0

AaAa

1.0

0.0

6 Thời gian (ngày)

Hình 3.28 Sự thay đổi chỉ số PV của các mẫu theo thời gian bảo quản

Giá trị PV tăng lên trong quá trình bảo quản tôm là do sự oxy hóa các acid béo hình

thành hydroperoxide hoặc peroxide (Nirmal và Benjakul, 2009). Tuy nhiên, giá trị

này có thể giảm vì các hợp chất hydroperoxide không bền, dễ bị phân hủy thành các

hydrocarbon mạch ngắn hơn như aldehydes (Nirmal và Benjakul, 2011). Lớp phủ

chitosan hạn chế sự thẩm thấu oxy giữa bề mặt tôm với môi trường xung quanh, làm

chậm sự khuếch tán oxy (Farajzadeh và ctv, 2016). Với mẫu M3 và M4 chỉ số PV tốt

nhất sau 12 ngày bảo quản và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Kết quả

tương đồng với nghiên cứu bảo quản tôm bằng dịch lá dứa có chỉ số PV thấp hơn

mẫu đối chứng sau 9 ngày bảo quản lạnh (Thủy và Thơm, 2018); phi lê cá trắm cỏ

(Ctenopharyngodon idellus) bảo quản bằng màng bao chitosan bổ sung 1% dịch chiết

polyphenol từ táo non có sự ức chế rõ rệt đối với sự gia tăng giá trị PV giữa mẫu khảo

sát và sử dụng màng so với mẫu đối chứng của (Sun và ctv, 2018). Qua đó, cho thấy

dịch chiết từ các nguyên liệu có các hợp chất polyphenol khác nhau dẫn đến hiệu quả

bảo quản khác nhau. Ngoài ra, tăng nồng độ chất chống oxy hóa cũng giảm chỉ số

PV, kết quả trên cũng phù hợp với bảo quản fillet cá mòi ở 40C nhúng trong dịch chiết

dạ thảo hương (Rosmarinus officinalis) tăng nồng độ dịch chiết từ 1% đến 2% thì giá

trị PV 10,73 meq/kg xuống 9,51 meq/kg, trong đó mẫu đối chứng tăng từ 14,28

meq/kg sau 20 ngày bảo quản (Ozogul và ctv, 2011).

3.8.4. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số TVB–N

Giá trị TVB–N (mg N/100g) là một trong những chỉ tiêu hóa học quan trọng để đánh

giá sự thủy phân thủy sản do vi sinh vật hoặc các enzyme nội sinh. TVB–N gồm

amoniac; amin bậc một, bậc hai, bậc ba và các sản phẩm phân hủy protein, đã được

sử dụng để đánh giá chất lượng thủy sản (Yuan và ctv, 2016). Sự thay đổi chỉ số

Ae Be

TVB–N của các mẫu theo thời gian bảo quản được thể hiện Hình 3.36

) g 0 0 1 / N g m

(

-

N B V T

Dc BCc

AcCc

Bb AbBb

BaBa

Aa Ba Aa

Thời gian (ngày)

Hình 3.29 Chỉ số TVB-N của các mẫu theo thời gian bảo quản

Giá trị TVB–N của các mẫu đều tăng dần theo thời gian bảo quản và sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê giữa các mẫu (p<0,05). Giá trị TVB–N của mẫu đối chứng (M) tăng

nhanh từ 5,88 ± 0,28 (mg N/100g, ngày 0) lên 49,94 ± 0,43 (mg N/100g, ngày 12);

mẫu tôm được nhúng chitosan và bổ sung dịch chiết polyphenol (M1, M2, M3, M4)

thấp hơn đáng kể so với mẫu chỉ được nhúng chitosan (M0) ở ngày bảo quản thứ 6,

9 và 12. Đối với các mẫu nhúng màng chitosan có bổ sung dịch chiết polyphenol

(M1, M2, M3, M4) giá trị TVB–N tăng chậm hơn trong suốt quá trình bảo quản. Ngày

6, giá trị TVB–N của tất cả các mẫu đều thỏa mãn < 30mg N/100g phù hợp với tiêu

chuẩn tôm và tôm đông lạnh (TIS, 1986). Tuy nhiên, vào ngày 9 và ngày 12, chỉ có

mẫu M3 vẫn đạt chất lượng (26,25 ± 0,43 mg N/100g, ngày 9 và 28,39 ± 0,43 mg

N/100g, ngày 12), trong khi đó giá trị TVB-N của các mẫu còn lại đều vượt quá giới

hạn cho phép.

Sau 12 ngày bảo quản, mẫu khảo sát (M1, M2, M3, M4) có phủ chitosan và

polyphenol từ vỏ mãng cầu có giá trị TVB–N thấp hơn so với mẫu đối chứng lần lượt

là 11,23%; 14,77%; 43,19% và 25,24%. Kết quả tương đồng với nghiên cứu bảo quản

cá tuyết Đại Tây Dương (G. morhua) (Jeon và ctv, 2002) và phi lê cá trích (Clupea

harengus) phủ chitosan ở thời gian lưu trữ 12 ngày chỉ số TVB–N giảm 33-50% đối

với mẫu đối chứng. Mẫu bổ sung dịch chiết với nồng độ 300mg GAE/L (M3) đạt giá

trị TVB–N tốt nhất sau 12 ngày bảo quản lạnh.

3.7.5. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số TBARs

Chỉ số TBARS được sử dụng để đánh giá quá trình oxy hóa lipid và hoạt tính chống

oxy hóa trong thực phẩm. Giá trị TBARs của các mẫu theo thời gian bảo quản 12

ngày được trình bày trong Hình 3.30

Ngày 0, giá trị TBARs của 6 nghiệm thức dao động trong khoảng 0,52-0,56 mg

MDA/kg và không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Sau đó, tất cả các mẫu có chỉ số

TBARs có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê từ ngày 3 (p<0,05). Sau 12 ngày bảo quản

lạnh, giá trị TBARs tăng nhiều nhất ở mẫu đối chứng (M), mẫu chỉ được nhúng

chitosan (M0) nhưng các mẫu có bổ sung dịch chiết vào dịch nhúng (M1, M2, M3,

M4) tăng chậm hơn. Trong đó, mẫu M3 tăng chậm nhất từ 0,52 ± 0,03 (mg/kg, ngày

0) đến 1,73 ± 0,06 (mg/kg, ngày 12). Tiếp đó, mẫu M4 cũng có giá trị và tốc độ tăng

gần như tương đương M3, tăng từ 0,52 ± 0,03 (mg/kg, ngày 0) đến 1,75 ± 0,09

(mg/kg, ngày 12). Như vậy, nồng độ bổ sung dịch chiết cao hơn (300 mg GAE/L và

400 mg GAE/L) cho kết quả TBARs thấp hơn so với mẫu khác. Kết quả bảo quản

tôm có bổ sung dịch chiết từ vỏ mãng cầu mang lại hiệu quả tốt hơn so với bảo quản

tôm có bổ sung chiết xuất vỏ quả lựu và chitosan (Basiri và ctv, 2015) sau 10 ngày

bảo quản bằng đá, hàm lượng TBARs giảm khoảng 30% khi so sánh mẫu đối chứng

(Pan và ctv, 2019). Dịch chiết có các hợp chất sinh học như flavanoid, saponin và

tannin có tác dụng chống oxy hóa mạnh (Sharma và ctv, 2013). Thêm vào đó, chitosan

cũng có khả năng chống oxy hóa của nhờ các nhóm amin cơ bản, tạo thành một

fluorosphere ổn định với các aldehyde dễ bay hơi như malondialdehyde – có nguồn

3.50

3.00

2.50

gốc từ sự phân hủy chất béo trong quá trình oxy hóa (Alishahi và Aïder, 2012).

/

2.00

) g k A D M g m

1.50

Ac Ac

BbBb

( s R A B T

1.00

AaAaAa

0.50

0.00

6 Thời gian (ngày

Hình 3.30 Sự thay đổi chỉ số TBARs của các mẫu theo thời gian bảo quản

3.7.6. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến giá trị màu sắc

Màu sắc là yếu tố cảm quan quan trọng nhất của người tiêu dùng đối với thủy sản.

Các giá trị về màu sắc bao gồm L*, a*, b*, E* được thể hiện lần lượt dưới các Hình

3.31, 3.32, 3.33, 3.34. Trong cùng thời gian bảo quản, tất cả các giá trị màu sắc của

F e

E d D

E eD e

C e

A e

B e

B d

F E c D c c

F b E

d C dC d A d

b D b

C c

B c

A c

F a

tôm giữa các mẫu có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

* L

C b B A b b

E a

B a

D a C a A a

6 Thời gian (ngày)

Hình 3.31 Sự thay đổi giá trị L* của các mẫu theo thời gian bảo quản

L* là thành phần biểu thị độ sáng trên thang điểm 0 (tối) đến 100 (sáng) (Yuan và

ctv, 2016). Giá trị L* của tất cả các mẫu đều giảm đáng kể trong thời gian bảo quản

và sự khác biệt giữa các mẫu có ý nghĩa thống kê (p <0,05). Từ ngày 0 đến ngày 12,

giá trị L* có tốc độ giảm nhanh nhất thuộc về mẫu đối chứng (M) và mẫu được nhúng

chitosan nhưng không bổ sung dịch chiết polyphenol (M0). Ở ngày 12, giá trị L* của

M và M0 lần lượt là 43,61 ± 0,02 và 43,09 ± 0,02; nhưng mẫu khảo sát giảm chậm

hơn. Trong đó, mẫu M3 có giá trị L* thấp nhất (41,45 ± 0,02) sau 12 ngày bảo quản

lạnh do chitosan và polyphenol trong dung dịch đã ngăn ngừa sự giảm độ sáng (light)

ở tôm do làm giảm các phản ứng oxy hóa, hình thành các đốm đen ở bề mặt tôm.

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

* a

1.0

AeEb

0.5

EbDbCb

Cc Dc

DaCaCaBa BaAa

BCb

0.0

Ad B d

-0.5

-1.0

-1.5

Thời gian (ngày)

AdCd

Hình 3.32 Sự thay đổi giá trị a* của các mẫu theo thời gian bảo quản

* b

EbDbCb Bb

CcCcDc Bc

EaDaDa

Ca AaBa

6 Thời gian (ngày)

Hình 3.33 Sự thay đổi giá trị b* của các mẫu theo thời gian bảo quản

Các thành phần màu sắc gồm a* thể hiện sự khác nhau giữa màu xanh lá (-a*) và màu

đỏ (+a*); b* thể hiện sự khác nhau giữa màu xanh dương (-b*) và màu vàng (+b*)

(Farajzadeh và ctv, 2016). Hai giá trị này của tôm đều tăng lên trong thời gian bảo

quản lạnh ở 4 ± 10C và sự khác biệt giữa các mẫu có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Vào

ngày 12, mẫu đối chứng (M) có giá trị màu đỏ cao nhất 2,92 ± 0,06; tiếp theo là các

mẫu khảo sát có phủ chitosan có giá trị là 13,14 ± 0,07; trong khi đó các mẫu khảo

sát được nhúng chitosan và bổ sung dịch chiết polyphenol từ vỏ mãng cầu M1, M2,

M3, M4 có giá trị a* lần lượt là 12,61 ± 0,03; 8,39 ± 0,05 và 10,24 ± 0,07. Tương tự,

100

giá trị b* của mẫu đối chứng có màu vàng cao nhất 14,04 ± 0,08; tiếp theo là mẫu

phủ chitosan M0 13,14 ± 0,07 và các mẫu khảo sát phủ chitosan và dịch chiết

polyphenol của các mẫu M1, M2, M3, M4 lần lượt là 12,61 ± 0,03; 11,11 ± 0,05; 8,39

± 0,05 và 10,24 ± 0,07. Các mẫu khảo sát có bổ sung polyphenol sở hữu màu sắc tốt

hơn. Các giá trị a* và b* tăng trong thời gian bảo quản do quá trình oxy hóa chất béo,

thủy phân carotenoid bởi protease nội sinh và giải phóng ra khỏi protein của cơ thịt

(Bindu và ctv, 2013). Do vậy, lớp phủ chitosan và bổ sung dịch chiết có thể góp phần

BcCc

AB c

CbDb

vào duy trì các giá trị màu của tôm trong suốt thời gian lưu trữ.

* E ∆

EaDa

CDa Aa

6 9 Thời gian (ngày)

Hình 3.34 Sự thay đổi giá trị E* của các mẫu theo thời gian bảo quản

Giá trị ΔE* là một chỉ số thể hiện sự khác biệt tổng thể về màu sắc. Nhìn chung, ΔE*

của tôm thẻ chân trắng tăng dần theo thời gian bảo quản và có ý nghĩa thống kê giữa

các mẫu (p<0,05). Ở mẫu khảo sát, giá trị E* thấp hơn đáng kể (p <0,05) so với

mẫu đối chứng; Cụ thể, ΔE* của mẫu đối chứng tăng nhanh nhất từ 5,24 ± 0,06 (ngày

0) lên 12,10 ± 0,06 (ngày 12). Đối với các mẫu khảo sát và mẫu chỉ nhúng chitosan,

E* tăng chậm hơn lần lượt từ 4,59 ± 0,05 (ngày 0) lên 10,59 ± 0,10 (ngày 12) và

từ 5,47 ± 0,09 (ngày 0) đến 11,27 ± 0,12 (ngày 12). Trong đó mẫu M3 có giá trị E*

nhỏ nhất so với các mẫu còn lại, đạt 7,59 ± 0,09 (ngày 12).

Mẫu khảo sát có ΔE* tăng chậm hơn do dịch nhúng có nhiều hợp chất có hoạt tính

sinh học ức chế sự thay đổi màu sắc ở tôm trong quá trình bảo quản. Các hợp chất

101

phenolic ức chế hoạt động của polyphenol oxidase (enzyme tổng hợp melanin) nên

làm chậm quá trình tạo hắc tố trong bảo quản lạnh (Wang và ctv, 2018). Tóm lại, mẫu

khảo sát nhúng chitosan có bổ sung dịch chiết polyphenol giá trị màu sắc tốt hơn sau

12 ngày bảo quản.

3.7.7. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến cấu trúc theo thời gian

bảo quản

Độ chắc là một đặc tính rất quan trọng của thủy sản, thời gian bảo quản càng dài độ

cứng và độ đàn hồi của tôm sẽ giảm đáng kể (Wang và ctv, 2018). Sự thay đổi về độ

AdAd

AdAd Ae

Ac AcAc Ad

chắc của các mẫu được thể hiện Hình 3.35

)

N

DaCa

( s s e n d r a H

CD b

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2

6 Thời gian (ngày)

Hình 3.35 Độ chắc các mẫu theo thời gian bảo quản

Độ cứng và độ đàn hồi của các mẫu ở ngày 0 không có sự khác biệt và không có ý

nghĩa thống kê giữa các mẫu (p>0,05) (Hình 3.35 và 3.36). Từ ngày thứ 6 trở đi, độ

cứng và độ đàn hồi của sáu mẫu đã có sự khác biệt đáng kể và giữa các mẫu có ý

nghĩa thống kê (p<0,05).

Ngày 12, độ cứng của mẫu M thấp nhất (giảm nhanh nhất) từ 10,73 ± 1,26 (ngày 0)

còn 3,09 ± 0,18 N (ngày 12), tiếp theo là mẫu M0 (nhúng chitosan ) đạt giá trị 3,42 ±

0,18 N (ngày 12). Trong khi đó các mẫu tôm được nhúng chitosan bổ sung dịch chiết

102

polyphenol có kết cấu chắc chắn hơn và kết quả là mẫu M3 giữ được độ cứng cao

nhất, đạt 5,00 ± 0,12 N (ngày 12).

Về độ đàn hồi, ngày 0, độ đàn hồi tôm dao động trong khoảng 0,69-0,75 mm; tuy

nhiên khi số ngày bảo quản càng tăng, độ đàn hồi của các mẫu giảm dần theo thời

gian, trong đó mẫu đối chứng (M) và mẫu chỉ nhúng chitosan (M0) giảm nhanh nhất,

còn các mẫu khảo sát bổ sung dịch chiết có tốc độ giảm chậm hơn. Mẫu M có độ đàn

hồi thấp vào ngày 12, từ 0,74 ± 0,02 mm (ngày 0) còn 0,24 ± 0,04 mm (ngày 12).

Ngược lại, các mẫu tôm được nhúng chitosan bổ sung dịch chiết polyphenol có kết

cấu chắc chắn hơn (M1: 0,35 ± 0,03 mm; M2: 0,36 ± 0,03 mm; M3: 0,52 ± 0,02 mm;

M4: 0,47 ± 0,02 mm) (Hình 3.43). Điều này cho thấy, độ đàn hồi của tôm được xử lý

bằng chitosan và chitosan kết hợp dịch chiết polyphenol từ vỏ mãng cầu ta ở ngày

thứ 9 và 12 quá trình bảo quản đã được cải thiện đáng kể. Kết quả nghiên cứu của

nhóm tương đồng với sử dụng dịch chiết xuất hạt nho và trà nhằm kéo dài thời hạn

sử dụng và cải thiện chỉ số cấu trúc cá hồng Mỹ (Sciaenops ocellatus) (Li và ctv,

2013); và thẻ chân trắng nhúng vào dung dịch chitosan kết hợp với dịch chiết vỏ quả

lựu cũng được cải thiện đáng kể so với mẫu tôm đối chứng bảo quản bằng nước đá

0.9

ABd

0.8

AB Ad ABe Abd c

Ab c Ad

Ab c AcAd

0.7

BbBc

0.6

(Yuan và ctv, 2016).

)

ABb Ac

0.5

m m

0.4

( s s e n

0.3

i g n

0.2

i r p S

0.1

0.0

6 Thời gian (ngày)

Hình 3.36 Độ đàn hồi của các mẫu theo thời gian bảo quản

103

Dựa vào các kết quả trên cho thấy việc sử dụng dịch chiết vỏ mãng cầu ta giàu

polyphenol bổ sung vào dung dịch chitosan 1,5% có tác dụng như một chất chống

oxy hóa, ngăn cản sự phát triển vi sinh vật, hạn chế các phản ứng gây hư hỏng, sẫm

màu và duy trì chất lượng sản phẩm là cần thiết. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các

mẫu có bổ sung dịch chiết vỏ mãng cầu ta đã hạn chế được tốc độ oxy hóa lipid, duy

trì chất lượng cảm quan của tôm thể hiện qua chỉ số PV, TBARs, TVB-N so với mẫu

đối chứng chỉ nhúng chitosan.

3.9. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu ta và ứng dụng dịch chiết vỏ

mãng cầu ta trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột

3.9.1. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu ta

3.9.1.1. Phản ứng hành vi và ngoại hình chung

Nghiên cứu độc tính cấp, chuột uống dịch chiết mãng cầu ở liều cao nhất 7000 mg/kg

liên tục trong 7 ngày được quan sát đến 14 ngày; với độc tính mãn, chuột uống dịch

chiết với liều 700 mg/kg trong 60 ngày được quan sát đến 90 ngày, kết quả cho thấy

chuột không có hiện tượng bất thường đối với phản ứng hành vi (chuột thí nghiệm

không có dấu hiệu nhiễm độc). Các thông số như bồn chồn, run, di chuyển, lông,

quằn quại, chảy nước bọt và tử vong không khác biệt nhiều, dấu hiệu vận động hơi

chậm, run nhẹ v.v. được phát hiện chủ yếu là do hoạt động tập tính của chuột. Các

kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng liều uống 7000 mg/kg (cấp tính) và 700

mg/kg (bán mãn tính) không cho thấy bất kỳ triệu chứng nhiễm độc hoặc tử vong nào

ở chuột trong suốt thời gian thử nghiệm. Kết quả trên tương tự với nghiên cứu của

khảo sát độc tính chiết xuất lá A. squamosa L. trên chuột Swiss albino (Ahmad, 2017).

3.9.1.2. Khối lượng cơ thể, lượng thức ăn và nước uống tiêu thụ

Sau 7 ngày (cấp tính) và 60 ngày (bán mãn tính) chuột uống dịch chiết mãng cầu,

lượng thức ăn và nước uống tiêu thụ của chuột không bị ảnh hưởng nhiều. Lượng

thức ăn, nước uống tiêu thụ hàng ngày của chuột uống dịch chiết liều cao có tăng so

với đối chứng (độc tính cấp). Trong khi đó, nhóm thử độc tính bán mãn tính sự khác

biệt giữa nhóm uống dịch chiết và nhóm đối chứng không đáng kể (độc tính mãn).

104

Tuy nhiên, lượng thức ăn và nước uống tiêu thụ hàng ngày của chuột vẫn nằm trong

giới hạn nhu cầu ăn, uống của chuột Swiss albino bình thường (Yamasaki và ctv,

2002). Điều đó cho thấy dịch chiết không gây ức chế thèm ăn, hoạt động sinh lý, trao

đổi chất của chuột thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với khảo sát độc tính chiết

xuất ethanol của vỏ quả A. muricata L. trên chuột Swiss albino (Faleye và Dada,

2016).

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của dịch chiết mãng cầu đến lượng thức ăn, nước uống tiêu

Khối lượng cơ thể

Thí nghiệm

Lượng thức ăn (g/ngày)

Lượng nước uống (mL/ngày)

Khối lượng thực tế (g)

Mức tăng trọng (%)

Thử nghiệm độc cấp tính

Đối chứng

4,25 ± 1,1a

4,79 ± 1,3a

24,02 ± 0,8a

0,11± 0,02a

1000 mg/kg

4,29 ± 0,9a

4,78 ± 1,2a

0,12± 0,01ab

24,08  0,9a

3000 mg/kg

4,39 ± 1,4a

4,81 ± 1,5a

0,13 ± 0,01ab

24,13  1,1a

5000 mg/kg

4,42 ± 1,2a

4,83 ± 1,4a

0,15 ± 0,02b

24,49  0,7a

7000 mg/kg

4,41 ± 1,5a

4,8a ± 1,2a

0,15 ± 0,02b

24,51  0,8a

Thử nghiệm độc bán mãn tính

Đối chứng

4,47± 1,3a

4,85± 1,2a

27,98 ± 1,2a

0,59 ± 0,01a

100 mg/kg

4,49± 1,6a

4,84 ± 1,4a

0,61 ± 0,02a

28,51  0,9a

300 mg/kg

4,51 ± 1,4a

4,79 ± 1,5a

0,65 ± 0,02b

28,53  0,8a

500 mg/kg

4,47 ± 1,2a

4,81 ± 1,6a

0,66 ± 0,01b

28,98  1,1a

700 mg/kg

4,83 ± 1,3a

0,71 ± 0,01c

4,48  1,2a

28,99  0,9a

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột (của mỗi thử nghiệm) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

ở p < 0,05.

thụ và khối lượng cơ thể chuột

Chuột uống dịch chiết mãng cầu có khối lượng cơ thể tăng đáng kể sau thời gian thử

nghiệm (Bảng 3.21). Nhóm đối chứng, khối lượng chuột và mức tăng trọng lần lượt

là 24,02 ± 0,8g và 0,11% (cấp tính); 27,98 ± 1,2g và 0,59% (bán mãn tính). Đến ngày

thứ 14 (cấp tính) và ngày 90 (mãn tính) sau khi uống dịch chiết. Sự gia tăng khối

lượng chuột sau khi uống dịch chiết có thể do saponin trong dịch chiết do saponin

được chuyển thành sapogenin aglycon (steroit hoặc tritecpen) có tác dụng kích thích

105

các trung tâm nuôi dưỡng trong não chuột, thay đổi chất dẫn truyền thần kinh, ảnh

hưởng đến tiêu thụ thực phẩm như là các tác nhân ảnh hưởng đến hệ thống

seratoninergic hoặc dopaminergic trung ương, làm tăng cảm giác ngon miệng (Restell

và ctv, 2014). Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp khảo sát độc tính của chiết xuất lá

A. squamosa L. trên chuột (Utami, 2018).

3.8.1.3. Huyết học và sinh hóa máu

Các thông số huyết học, sinh hóa máu thường dùng để đánh giá tình trạng sinh lý,

bệnh lý của động vật vì nó phản ánh hoạt động của tủy xương, các tác động nội mạch

là những chỉ số quan trọng nhất để ước tính độc tính dịch chiết (Voigt và Swist, 2011).

Thông qua những thay đổi về huyết học, sinh hóa của chuột khi uống dịch chiết với

liều 7000 mg/kg/ngày (cấp tính) và liều 700 mg/kg/ngày (mãn tính) có thể đánh giá

tác động của dịch chiết mãng cầu.

Phân tích huyết học của chuột có sự tăng nhẹ các chỉ số RBC, HBG, WBC nhưng

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.21) có thể do tác dụng của các

hợp chất hoạt tính sinh học như hợp chất phenolic, saponin, tannin v.v. có mặt trong

dịch chiết (El-Ishaq và ctv, 2020). Tuy nhiên, chỉ số huyết học vẫn nằm trong khoảng

giới hạn bình thường của chuột Swiss albino (Restell và ctv, 2014), chứng tỏ những

thay đổi trung gian về huyết học do tác dụng của dịch chiết là không đáng kể về mặt

độc tính. Kết quả nghiên cứu của nhóm tương đồng với khảo sát độc tính của chiết

xuất lá A. squamosa L. (Utami, 2018).

Các thông số sinh hóa huyết thanh có ý nghĩa trong đánh giá lâm sàng về tình trạng

sức khỏe động vật. Khảo sát biến động các chỉ số ALT, AST và ALP huyết thanh

chuột nhằm đánh giá hoạt động của gan (Pari và Murugan, 2011). Chuột sau khi uống

dịch chiết, lượng ALT, AST và ALP có tăng nhưng không có sự khác biệt (Bảng

3.22), cho thấy dịch chiết không có tác dụng độc cho gan. Đó là kết quả của việc ổn

định màng sinh chất do bảo tồn tính toàn vẹn cấu trúc của tế bào cũng như sửa chữa

các tổn thương mô gan (Cockcroft, 2010). Thay đổi về hàm lượng protein, glucose,

106

triglixerit huyết thanh phản ánh tình trạng dinh dưỡng, được sử dụng để chẩn đoán

các trạng thái bệnh lý của tim, thận, gan, dạ dày (Pari và Murugan, 2011).

RBC (x106tb/mm3)

HGB (g/dl)

PLT (x103tb/mm3)

WBC (x103tb/mm3)

Lymphocyte (%)

Monocyte (%)

Granulocytes (%)

Thí nghiệm Đối chứng 7,79

± 0,33a 7,81 ± 0,29a 7,95 ± 0,26a 8,17 ± 0,31a 8,21 ± 0,29 a

1000 mg/kg 3000 mg/kg 5000 mg/kg 7000 mg/kg Đối chứng 7,99

597,81 ± 35,14a 601,29 ± 31,28 a 642,34 ± 39,24 ab 676,15 ± 41,03bc 688,42 ± 29,78 bc 603,11 ± 34,22a 606,23 ± 41,04 a 669,43 ± 35,04ab

5,81 ± 0,39 a 5,94 ± 0,19 a 6,06 ± 0,25 a 6,14 ± 0,22 a 5,84 ± 0,29 a 5,59 ± 0,23 a 5,77 ± 0,37 a 5,82 ± 1,33a

100 mg/kg 300 mg/kg 500 mg/kg

± 0,21a 8,06 ± 0,32 a 8,25 ± 0,42 b 8,39 ± 0,34ab

11,32 ± 0,73a 11,48 ± 0,65a 11,87 ± 0,71a 12,28 ± 0,81a 12,44 ± 0,78a 12,12 ± 0,52 a 12,19 ± 0,43a 12,57 ± 0,38a 12,66 ± 0,26a

2,61 ± 0,29 a 2,72 ± 0,36a 2,08 ± 0,25b 3,15 ± 0,31c 3,18 ± 0,38 c 2,78 ± 0,34 a 2,82 ± 0,41a 2,98 ± 0,39 a 3,17 ± 0,29 a

40,43 ± 1,41a 39,82 ± 2,13 a 41,64 ± 2,28a 39,88 ± 2,31a 41,77 ± 1,98 a 39,92 ± 1,32 a 39,99 ±1,26 a 40,12 ± 1,35 a 40,74 ± 1,80 a

52,76 ± 2,43a 54,14 ± 1,99 a 52,53 ± 2,24 a 53,98 ± 2,19 a 52,39 ± 1,98 a 54,49 ± 2,46 a 54,24 ± 2,55 a 54,06 ± 2,42 a 53,73 ± 1,69 a

684,55 ± 37,32b

5,52 ± 1,49a

700 mg/kg

8,41 ± 0,22 ab

12,79 ± 0,33a

698,26 ± 36,08b

3,21 ± 0,24 a

41,01 ± 1,62 a

5,62 ± 1,56 a

53,37 ± 2,61a

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột (của mỗi thử nghiệm) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của dịch chiết đến thành phần huyết học máu ngoại vi chuột

Sự thay đổi không đáng kể về tổng lượng protein 6,89±0,39 (700 mg/kg); 6,18± 0,27

g/dl (đối chứng) thử độc bán mãn tính); lượng glucose 63,97± 3,91 (7000 mg/kg);

62,78 ± 3,22 mg/dl (đối chứng) thử độc cấp tính (Bảng 3.22) có sự khác biệt nhưng

không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) ở chuột được uống không cho thấy có dấu hiệu

dịch chiết làm suy giảm chức năng tim, thận, gan, dạ dày (Thierry và ctv, 2011). Urê

và creatin là hai chỉ số quan trọng trong máu giúp đánh giá tỷ lệ lọc cầu thận và chức

năng thận. Urê là sản phẩm cuối cùng trong quá trình chuyển hóa các hợp chất chứa

nitơ, được lọc qua thận vào nước tiểu dưới dạng chất thải. Creatin là sản phẩm phân

hủy của creatin photphat trong cơ và được bài tiết qua thận cùng với các phế phẩm

khác. Sự cân bằng của nồng độ creatin giữa quá trình bài tiết được thận duy trì với

tốc độ khá ổn định (Yudhani và ctv, 2019). Các thông số huyết học, sinh hóa máu

chuột trong thử nghiệm độc tính cấp, bán mãn tính, không vượt ngoài khoảng giới

hạn về tỷ lệ huyết học và sinh hóa máu ở chuột Swiss albino bình thường (Wolford

107

và ctv, 1986). Đồng thời, kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với khảo sát độc tính chiết

xuất ethanol từ lá A, squamosa L, trên chuột Swiss albino (Onwusonye và ctv, 2014).

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của dịch chiết mãng cầu đến thành phần sinh hóa máu ngoại

Thí nghiệm

Protein tổng (g/dl)

Glucose (mg/dl)

Tryglicer it (mg/dl)

ALT (U/L)

AST (U/L)

ALP (U/L)

Creatin (mg/dl)

Thử nghiệm độc cấp tính

Đối chứng

1000 mg/kg 3000 mg/kg 5000 mg/kg 7000 mg/kg

5,98 ± 0,44 a 6,06 ± 0,35a 6,22 ± 0,28 a 6,61 ± 0,25 a 6,68 ± 0,33 a

62,78 ± 3,22 a 62,94 ± 5,11 a 63,35 ± 4,51a 63,74 ± 4,33 a 63,97 ± 3,91 a

96,68 ± 5,73 a 97,05 ± 3,99 a 98,75 ± 4,89 a 99,11 ± 4,43 a 99,66 ± 3,56 a

68,99 ± 2,12 a 69,23 ± 2,43 a 70,19 ± 2,32 a 71,44 ± 2,45 a 72,77 ± 2,31 a

97,74 ± 2,22 a 98,26 ± 3,51 ab 99,47 ± 2,62 b 101,12 ± 3,11 bc 102,76 ± 2,77 c

121,78 ± 5,66 a 128,52 ± 5,92 ab 139,33 ± 4,99 b 141,78 ± 4,67 b 142,65 ± 5,02 b

0,47 ± 0,11 a 0,49 ± 0,24 a 0,51 ± 0,33 a 0,55 ± 0,14 a 0,56 ± 0,19 a

Thử nghiệm độc bán mãn tính

Đối chứng

100 mg/kg 300 mg/kg 500 mg/kg 700 mg/kg

6,18 ± 0,27 a 6,24 ± 0,31 a 6,41 ± 0,24 a 6,85 ± 0,37 a 6,89 ± 0,39 a

62,45 ± 2,34 a 62,81 ± 3,24 a 64,31 ±3,55 a 65,19 ± 2,44 a 65,85 ± 3,61 a

95,31 ± 2,42 a 96,62 ± 2,73 a 97,99 ± 3,55a 99,01 ± 4,25 a 99,62 ± 2,67 a

69,88 ± 2,86 a 70,22 ± 1,44 a 71,47 ± 2,54 a 72,88 ± 2,71 a 72,97 ± 2,62 a

98,18 ± 2,44 a 99,23 ± 2,97 a 101,37 ± 3,15 b 102,51 ± 2,88 bc 104,06 ± 2,77 c

125,02 ± 4,89 b 128,78 ± 4,39 b 138,65 ± 4,66 c 142,59 ± 5,12 a 145,13 ± 5,26 c

0,46 ± 0,22 a 0,47 ± 0,42 a 0,51 ± 0,36 a 0,55 ± 0,41 a 0,56 ± 0,12 a

Urê (mg/dl) 11,76 ± 2,22 a 12,68 ± 2,03 a 13,55 ± 2,28 a 13,88 ± 2,45 a 14,19 ± 2,27 a 12,06 ± 2,32 a 12,51 ± 1,88 a 13,38 ± 2,33 a 14,16 ± 2,54 a 14,77 ± 2,68 a

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột (của mỗi thử nghiệm) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

vi chuột

3.9.1.4. Khối lượng cơ quan

Sự thay đổi khối lượng nội tạng là một chỉ số nhạy cảm để đánh giá độc tính của thảo

dược (Kim và ctv, 2004). Tim, gan, thận và dạ dày đóng vai trò quan trọng trong quá

trình trao đổi chất nên thường xuyên bị các hợp chất độc hại tấn công (Leach, 2014).

Trong nghiên cứu này, khối lượng tuyệt đối và tương đối của tim, gan, thận và dạ dày

được ghi nhận lúc giải phẫu chuột thí nghiệm (Bảng 3.23).

Nhóm chuột uống dịch chiết khác biệt không lớn so với nhóm đối chứng và vẫn trong

giới hạn bình thường về khối lượng các cơ quan chuột. Kết quả nghiên cứu phù hợp

với khảo sát độc tính của chiết xuất lá A. squamosa L. trên chuột (Utami, 2018).

108

Thí nghiệm

ROW (%) M (g)

Khối lượng dạ dày ROW (%)

Khối lượng tim M (g)

ROW (%)

Khối lượng gan M (g)

Đối chứng

1000 mg/kg 3000 mg/kg 5000 mg/kg 7000 mg/kg

0,17 ± 0,01a 0,16 ± 0,03 a 0,17 ± 0,04 a 0,17 ± 0,03 a 0,18 ± 0,05 a

0,69 ±0,02 a 0,67 ± 0,04 a 0,71 ± 0,05 a 0,69 ± 0,03 a 0,72 ± 0,02 a

1,05 ± 0,02 a 1,09 ± 0,04 a 1,11 ± 0,03 a 1,15 ± 0,02 a 1,12 ± 0,05 a

0,65 ± 0,14 a 0,66 ± 0,13 a 0,68 ± 0,14 a 0,71 ± 0,11 a 0,71 ± 0,13 a

2,69 ± 0,14 a 2,78 ± 0,12 a 2,81 ± 0,18 a 2,87 ± 0,17 a 2,88 ± 0,11 a

Đối chứng

0,21 ± 0,05 a

100 mg/kg 0,23

± 0,03 a

300 mg/kg 0,24

± 0,02 a

500 mg/kg 0,26

± 0,04 a

700 mg/kg 0,26

± 0,02 a

0,73 ± 0,04 a 0,79 ± 0,03 b 0,83 ± 0,02 bc 0,88 ± 0,05 cd 0,89 ± 0,03d

Khối lượng thận M (g) Thử nghiệm độc cấp tính 0,25 4,75 1,14 ± 0,03 a ± 0,13 a ± 0,3 a 4,72 1,14 0,26 ± 0,04 a ± 0,22 a ± 0,2 a 0,27 4,79 1,16 ± 0,03 a ± 0,14 a ± 0,5 a 0,28 5,02 1,23 ± 0,05 a ± 0,23 a ± 0,4 a 0,27 5,04 1,24 ± 0,5 a ± 0,04 a ± 0,21 a Thử nghiệm độc bán mãn tính 4,69 1,31 ± 0,23 a ± 0,17 a 4,71 1,34 ± 0,18 a ± 0,11 a 4,79 1,34 ± 0,16 a ± 0,14 a 4,82 1,39 ± 0,31 a ± 0,17 a 4,85 1,41 ± 0,22 a ± 0,15 a

0,29 ± 0,06 a 0,31 ± 0,04 a 0,32 ± 0,05 a 0,34 ± 0,04 a 0,35 ± 0,03 a

1,07 ± 0,01 a 1,09 ± 0,04 a 1,11 ± 0,03 a 1,19 ± 0,06 b 1,22 ± 0,05 b

0,83 ± 0,18 a 0,85 ± 0,16 a 0,85 ± 0,14 a 0,86 ± 0,15 a 0,87 ± 0,17 a

2,96 ± 0,17 a 2,97 ± 0,22 a 2,99 ± 0,19 a 3,02 ± 0,09 a 3,01 ± 0,17 a

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột (của mỗi thử nghiệm) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của dịch chiết mãng cầu đến khối lượng cơ quan chuột

3.9.1.5. Phân tích nước tiểu

Thể tích, trọng lượng riêng, pH nước tiểu chuột của nghiên cứu độc tính cấp và độc

tính mãn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm đối chứng (p>0,05).

Kết quả nghiên cứu phù hợp với khảo sát độc tính chiết xuất ethanol lá và hạt A.

squamosa L. trên chuột (Banna và ctv, 2016).

109

Glucose

Protein

Thể xeton

Tế bào máu

Thí nghiệm

Trọng lượng riêng

(mg/dl)

(Tế bào/µl)

Thể tích (mL)

Thử nghiệm độc cấp tính

Đối chứng

17,6 ± 3,2 a

1,011 ± 0,002 a 6,9 ± 0,03

Không

1000 mg/kg

17,3 ± 6,5 a

1,012± 0,001 a

6,9 ± 0,01a

Không

3000 mg/kg

16,8 ± 4,5 a

1,013 ± 0,003 a 6,8± 0,02a

Không

5000 mg/kg

16,6 ± 5,7 a

1,014 ± 0,004 a 6,9 ± 0,03 a Không

Không

7000 mg/kg

16,7± 7,1 a

1,014 ± 0,001 a 6,9± 0,02 a

Không

Thử nghiệm độc bán mãn tính

Đối chứng

16,2 ± 5,3 a

1,012 ± 0,005 a 6,9 ± 0,04 a Không

Không

100 mg/kg

16,1 ± 6,2 a

1,012± 0,003 a

6,9 ± 0,03 a Không

Không

300 mg/kg

15,9 ± 4,9 a

1,013 ± 0,002 a 6,9 ± 0,02 a Không

Không

500 mg/kg

15,8 ± 3,1 a

1,013± 0,004 a

7,0 ± 0,01 a Không

Không

700 mg/kg

15,6 ± 6,4 a

1,014 ± 0,001 a 6,9 ± 0,02 a Không

Không

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột (của mỗi thử nghiệm) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 3.24 Ảnh hưởng dịch chiết mãng cầu đến thành phần nước tiểu chuột

3.9.1.6. Kiểm tra mô bệnh cơ quan

Kiểm tra vĩ mô đối với tất cả các cơ quan nội tạng như dạ dày, ruột non, ruột già, lá

lách, gan, tim và thận không thấy bất kỳ thay đổi nào về vị trí, hình dạng, kích thước,

màu sắc, kết cấu tổng thể khi so sánh với các cơ quan của nhóm uống dịch chiết và

nhóm đối chứng. Các nghiên cứu mô học cho thấy không có bất thường trong mô

gan, thận, tim, dạ dày ở những con chuột được uống dịch chiết mãng cầu với liều

lượng cấp tính và bán mãn tính so với nhóm chuột đối chứng (Hình 3.37).

Tóm lại, dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta A. squamosa L, không tạo ra tác dụng phụ đối

với hành vi và bệnh lý tổng quát của chuột ở các liều điều trị. Do đó, LD50 qua đường

miệng của dịch chiết mãng cầu lớn hơn 7000 mg/kg, nghiên cứu độc tính bán mãn

tính (700 mg/kg) cho kết quả dịch chiết mãng cầu không ảnh hưởng xấu đến khối

110

lượng cơ thể, khối lượng và mô bệnh học tim, gan, thận, dạ dày, các thông số huyết

học, sinh hóa máu, nước tiểu ở các liều thử nghiệm.

Đối chứng

Uống dịch chiết

Hình 3.37 Hình thái ngoài tim, gan, thận và dạ dày của chuột thí nghiệm

3.9.2. Ứng dụng dịch chiết vỏ mãng cầu ta trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở

chuột

Viêm khớp dạng thấp thường xảy ra ở các khớp gây tổn thương màng hoạt dịch, sụn

khớp và đầu xương dưới sụn, diễn biến mạn tính dẫn đến tình trạng dính và biến dạng

khớp và ảnh hưởng đến khoảng 1% dân số thế giới, tỷ lệ mắc bệnh xảy ra ở trẻ em

rất cao chiếm khoảng 0,008 đến 0,266 trên 1000 trẻ em mỗi năm (Manners và Bower,

2002).

Sự xâm nhập của tác nhân gây viêm sẽ khởi phát chuỗi phản ứng miễn dịch, tế bào

lympho T giải phóng các cytokine kích thích tế bào lympho B sản xuất phức hợp

immunoglobulin lắng đọng ở khớp, làm tổn thương sụn khớp, dẫn đến xơ hóa, dính

và biến dạng khớp (Manners và Bower, 2002).

3.9.2.1 Trọng lượng cơ thể chuột

Trọng lượng cơ thể của chuột bình thường tăng dần từ 32,34 ± 0,7g đến 33,84 ± 0,2

g; trong khi trọng lượng cơ thể của chuột bị gây viêm khớp dạng thấp chuột thay đổi

đáng kể. Trong ba ngày đầu tiên, trọng lượng chuột là giảm mạnh (từ 33,85 ± 0,3g

xuống 30,12 ± 0,4g) và tăng nhẹ trong các ngày tiếp theo đến 32,11 ± 0,3g (ngày 12).

111

Chuột được tiêm FCA tế bào T CD4 + thâm nhập vào màng hoạt dịch tế bào và bắt

đầu quá trình viêm. Quá trình viêm làm giảm độ pH, làm rối loạn chuyển hóa glucid,

lipid, protein (Billiau và Matthys, 2001). Kết quả nghiên cứu sự tăng cân của chuột ở

nhóm bình thường cao hơn so với nhóm được điều trị bằng FCA tương đồng với

nghiên cứu Halliday và ctv, (2004).

Trọng lượng cơ thể của những con chuột được điều trị bằng chiết xuất vỏ mãng cầu

tăng lên đáng kể so với những con chuột không được điều trị (Hình 3.28). Cụ thể, sự

gia tăng cơ thể chuột điều trị với liều 400 mg/kg tương tự với sự gia tăng trọng lượng

cơ thể của chuột được điều trị bằng mobic (40,010,10g) (đối chứng dương, p <0,05).

Do polyphenol được vận chuyển qua kênh protein của màng tế bào đến vị trí viêm,

ức chế hoạt động của enzyme cyclooxygenase và lipoxygenase, kích hoạt phản ứng

chống lại các tác nhân gây viêm làm giảm cytokine, TNF-α, IL -6 ngừng hoạt động,

của yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB), ức chế sự hình thành prostaglandin (PG), COX

chuyển Aicd Arachidonic thành PG và lipoxygenase (LOX) thành leukotrienes. Các

hợp chất phenol ức chế con đường của cyclooxygenase và 5-lipoxygenase để khử

acid arachidonic. Khi các con đường viêm nhiễm bị ức chế, hoạt động sinh lý của cơ

thể trở lại bình thường, chuyển hóa vật chất trong cơ thể tăng lên (Yoon và Baek,

2005).

112

Không xử lý

g n ợ ư l g n ọ r T

FCA

Ngày 0 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12

Thời gian

b bc b

Hình 3.38 Trọng lượng cơ thể ở chuột đối chứng và chuột tiêm CFA trong 12 ngày

) g (

Không xử lý

g n ợ ư

ASL

l

ASM

g n ọ r T

ASH

Mobic

4 tuần

6 tuần

8 tuần

10 tuần

Thời gian

Hình 3.39 Ảnh hưởng dịch chiết đến trọng lượng chuột

3.9.2.2. Số lượng các loại bạch cầu máu ngoại vi

* *

Tổng số lượng bạch cầu ngoại vi của chuột trong nhóm viêm khớp dạng thấp cao hơn

so với chuột bình thường (4,5x103 so với 5,88x103 tế bào/mm3) sau 12 ngày. Tổng số

tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt ở các mô hình viêm khớp dạng thấp

tăng đáng kể sau 12 ngày (5,42 ± 0,02, 0,086 ± 0,005, 0,033 ± 0,002 x103 tế bào/

mm3, tương ứng), trong khi số lượng tổng số loại bạch cầu của nhóm bình thường ổn

định trong quá trình thí nghiệm (Bảng 3.25).

113

Bảng 3.25 Thay đổi lượng bạch cầu trong máu ngoại vi của chuột bình thường

Leukocytes (103 cells/mm3)

Nhóm

Ngày 0

Ngày 3

Ngày 6

Ngày 9

Ngày 12

Normal

4,520,09a

4,580,13a

4,560,16a

4,560,11a

4,520,13a

FCA

4,550,09a

6,120,26b

6,860,16c

7,210,06d

8,380,07d

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

và viêm khớp dạng thấp

Bảng 3.26 Thay đổi lượng bạch cầu máu ngoại vi của chuột bình thường và viêm

Nhóm

Lymphocytes (x103cell/mm3)

Monocytes (x103cell/mm3)

Granulocytes (x103cell/mm3)

FCA

Bình thường

FCA

Bình thường

FCA

Bình thường

khớp dạng thấp

Ngày 0

4,090,07a

4,060,06a

0,0570,003a

0,0580,003a

0,1160,001a

0,1190,003a

Ngày 3

4,220,07a

5,60,07b

0,0610,003a

0,0920,007a

0,1180,002a

0,0360,002b

Ngày 6

4,190,17a

5,550,09b

0,0590,003a

0,0880,006a

0,1120,004a

0,0340,002b

Ngày 9

4,180,08a

5,490,09bc

0,0590,005a

0,0870,005a

0,1170,003a

0,0330,001b

Ngày12 4,160,07aA

5,420,02cB

0,0580,004aA 0,0860,005aB 0,1190,003aA 0,0330,002bB

+ xâm nhập của trong màng hoạt dịch,

Các kí tự in thường, in hoa khác nhau trong cùng một cột, hàng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05. Các kí tự, in hoa khác nhau giữa các nhóm ở ngày thứ 12 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05. Viêm khớp được kích hoạt bởi tế bào T CD4

Lympho T sản xuất các cytokine hoạt hóa đại thực bào làm tăng biểu hiện của phân

tử HLA, kích thích tế bào lympho B tăng sinh và biệt hóa thành tế bào sản xuất kháng

thể. FCA tác động đến hệ thống miễn dịch, thay đổi bạch cầu, tăng thực bào, bài tiết

cytokine và tăng sinh CD4 + (Pearson, 1956). Mycobacterium trong FCA thu hút các

đại thực bào làm tăng phản ứng miễn dịch. Trong giai đoạn đầu của quá trình viêm,

bạch cầu trung tính và đại thực bào di chuyển đến vùng viêm. Sau đó, một lượng lớn

bạch cầu đơn nhân chuyển từ máu vào mô, thay đổi đặc tính, phình to, tăng sự di

chuyển của amip về phía mô bị tổn thương. Các tế bào này tiết ra cytokine, interferon,

các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu thúc đẩy quá trình viêm (McInnes và Schett,

2011).

114

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của chiết xuất vỏ mãng cầu ta trên tổng số bạch cầu ngoại vi

Tổng số bạch cầu ngoại vi (x103 cells/mm3)

Nhóm

Không chữa

ASL

ASM

ASH

Mobic

Tuần 4

31,390,29a

31,560,29a

31,550,3a

31,510,33a

31,570,18a

Tuần 6

31,080,29a

32,860,28b

33,780,22b

33,820,32b

33,160,17b

Tuần 8

31,010,16b

34,290,4c

35,160,22c

36,020,18c

36,390,12c

Tuần 10

28,070,24cA

38,090,12dB

38,240,36dB

39,23C0,23dC

40,010,13dD

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột, hàng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Các kí tự in hoa khác nhau giữa các nhóm ở tuần thứ 10 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

ở chuột viêm khớp dạng thấp

Không chữa

Chỉ tiêu

Mobic

Tuần

ASH

ASL

5,570,23a

5,270,14a

5,260,12d

5,270,08d

5,260,08d

Lymphocytes

5,530,15a

5,110,23ab

5,090,1c

4,680,17c

4,630,16c

(x103cell/mm3)

5,510,23a

4,970,19c

4,950,08b

4,530,12b

4,450,12b

5,410,06 bA

4,650,21dB

4,930,14aC

4,180,17aD

4,06D0,1aD

0,0920,011a

0,0930,009d

0,0910,011a

0,0910,007a

0,0920,09a

Monocytes

0,090,008a

0,0890,007cd

0,0870,007b

0,0760,013ab

0,0740,008ab

(x103cell/mm3)

0,0870,006a

0,0750,009bc

0,0730,015

0,0680,017bc

0,0610,019bc

0,0830,007aA

0,068BC0,015a

0,065BC0,016a

0,055CD0,012d

0,052E0,011d

0,3470,004a

0,3480,004a

0,3470,003a

0,3460,009a

Granulocytes

0,3460,005a

0,3420,005ab

0,330,004b

0,3350,002a

0,2760,003b

(x103cell/mm3)

0,3420,005a

0,3390,003c

0,3210,006c

0,2620,003b

0,1980,003c

0,34A0,001a

0,297BC0,009d

0,28BC0,001d

0,129DE0,004c

0,119DE0,001d

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột, hàng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Các kí tự in hoa khác nhau giữa các nhóm ở tuần thứ 10 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của dịch chiết xuất lên các loại bạch cầu ngoại biên ở chuột viêm khớp dạng thấp ASM

Bạch cầu là một thành phần chính của hệ thống miễn dịch của cơ thể, là chỉ định cho

các bệnh truyền nhiễm và viêm nhiễm. Các vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào cơ thể

sẽ kích thích hệ thống miễn dịch dẫn đến tăng bạch cầu. Dịch chiết mãng cầu ức chế

viêm, giảm số lượng bạch cầu. Một lượng lớn flavonoid, polyphenol ức chế sự biểu

hiện của các cytokine gây viêm, kết hợp để tăng cường các cytokine chống viêm. Các

hợp chất phenolic của chiết xuất vỏ mãng cầu có đặc tính ức chế miễn dịch, làm giảm

số lượng bạch cầu (tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạ. Các hợp chất

115

phenolic kích thích tăng trưởng tế bào và sản xuất IL-10 (cytokine chống viêm). Ở

những con chuột được điều trị với liều 400 mg/kg, tác dụng ức chế miễn dịch tốt đã

hỗ trợ bạch cầu đạt được trạng thái khỏe mạnh (Noble, 1996).

3.9.2.3. Nhiệt độ và đường kính khớp cổ chân chuột

Nhiệt độ tại khớp cổ chân ở nhóm gây viêm khớp cho thấy sự gia tăng nhiệt độ đáng

kể so với đối chứng (p <0,01 và p <0,05, tương ứng) (Bảng 3.29). Chênh lệch nhiệt

độ trung bình giữa nhóm bình thường và nhóm FCA lần lượt là 27,4°C và 30,4°C.

Kết quả này tương tự với kết quả báo cáo của nhiều tác giả Snekhalatha và ctv, (2012).

Nhóm

Nhiệt độ (0C)

Ngày 0

Ngày 3

Ngày 6

Ngày 9

Ngày 12

Bình thường

27,30,18a

27,80,15a

27,60,15a

27,50,22a

27,40,22aA

FCA

27,40,19a

31,20,22b

30,70,24c

30,60,16cd

30,40,19dB

Các kí tự in thường khác nhau trong cùng một cột, hàng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Các kí tự in hoa khác nhau giữa các nhóm ở ngày thứ 12 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 3.29 Nhiệt độ khớp cổ chân của chuột bình thường và viêm khớp dạng thấp

FCA là kháng nguyên kích hoạt đại thực bào, tăng tiết cytokine, giải phóng chất trung

gian hóa học, làm rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa trong cơ thể chuột (Stils Jr,

2005).

Sau 12 ngày, nhóm chuột bình thường đường kính khớp cổ chân không thay đổi;

nhóm FCA, đường kính khớp cổ chân tăng có ý nghĩa (p <0,05) trong 3 ngày đầu,

sau đó giảm nhẹ. Sự khác biệt về hình thái mắt cá chân giữa chuột ở nhóm bình

thường và nhóm FCA giống với nghiên cứu của (Snekhalatha và ctv, 2012).

Nhiệt độ tại khớp cổ chân chuột bị viêm khớp dạng thấp sau khi được uống dịch chiết

vỏ mãng cầu ta đã dần giảm dần và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

(Bảng 3.30). Sau 10 tuần khảo sát, nhiệt độ khớp cổ chân chuột ở các nhóm uống dịch

chiết và mobic dần trở về trạng thái bình thường (ASL 28,20C; ASM 28,10C; ASH

27,60C; Mobic 27,50C) thấp hơn so với nhóm không điều trị (29,50C).

116

)

m m

3.21

ĐC

í

FCA

( i ố g p ớ h k h n k g n ờ ư Đ

0 ngày

3 ngày

9 ngày

12 ngày

6 ngày Thời gian

Hình 3.40 Đường kính mắt cá chân của chuột viêm khớp dạng thấp (FCA) và chuột

bình thường

Nhiệt độ (0C)

Nhóm

Untreat

ASL

ASM

ASH

Mobic

Tuần 4

30,20,09b

30,50,01d

30,30,07d

30,40,02d

30,50,09d

Tuần 6

30,10,07b

29,50,04c

29,90,02c

29,40,07c

29,60,06c

Tuần 8

29,80,01ab

28,80,05b

29,10,01b

28,30,05b

28,40,06b

Tuần 10

29,50,06aA

28,20,01aB

28,10,01aB

27,60,02aC

27,50,07aC

Các kí tự in thường trong cùng một cột có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

Các kí tự in hoa khác nhau giữa các nhóm ở tuần thứ 10 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 3.30 Nhiệt độ khớp cổ chân ở chuột viêm khớp dạng thấp được điều trị bằng dịch chiết AS

Đường kính khớp cổ chân dưới tác dụng của dịch chiết vỏ mãng cầu có thay đổi (Hình

3.31). Đường kính khớp cổ chân của chuột không được điều trị tăng đáng kể trong

suốt thời gian nghiên cứu từ 4,690,06 mm ở 4 tuần và đã tăng lên 5,08±0,03mm vào

tuần 10 (p <0,05). Ngược lại, tất cả các khớp cổ chân chuột ở các nhóm được điều trị

bằng dịch chiết vỏ quả mãng cầu và mobic kích thước đường kính đã giảm đáng kể

(4,18±0,02mm, ASL; 4,01±0,11mm, ASM; 3,95±0,12mm, ASH; và 3,72±0,19 mm

Mobic, p <0,05).

117

)

m m

ĐC

ASL

ASM

í

ASH

Mobic

( i ố g p ớ h k h n k g n ờ ư Đ

4 tuần

6 tuần

8 tuần

10 tuần

Thời gian Hình 3.41 Đường kính mắt cá chân của chuột viêm khớp dạng thấp (FCA) và chuột

bình thường

Polyphenol có thể ức chế các enzyme gây viêm như cyclooxygenase, lipoxygenase

và sự suy giảm cytokine. Sự giải phóng acid arachidonic từ màng phospholipid được

kích hoạt bởi hoạt động của một enzyme phospholipase A2 đặc hiệu (Hussain và ctv,

2016). Khi các con đường gây viêm bị ức chế hoàn toàn nhờ uống dịch chiết vỏ quả

mãng cầu ta, phản ứng viêm có xu hướng giảm và cấu trúc mô khớp được phục hồi.

3.9.2.4. Hình thái và mô học khớp cổ chân

Sau 12 ngày tiêm FCA, hình thái khớp mắt cá chân và hiện tượng sưng phù bàn chân

của chuột bình thường và chuột FCA khác nhau đáng kể (Hình 3.42). Nhóm chuột

bình thường, chứa tế bào sụn vùi trong chất căn bản, sắp xếp có trật tự, có định hướng,

lớp ngoài màng sụn có những lá xơ và sợi chun, ít tế bào sợi hơn lớp trong. Nhóm

chuột không được điều màng khớp bị dày lên, có sự xuất hiện tế bào viêm trong chất

căn bản, tế bào sợi tăng sinh nhiều, hình thành các mảng sợi che phủ bề mặt sụn khớp

làm sụn cách ly khỏi nguồn nuôi dưỡng từ dịch khớp, tích tụ dịch khớp và các tế bào

đơn nhân trong không gian khớp (Hình 3.42). Phân tích mô học cho thấy sụn ở khớp

cổ chân đã phát triển thành viêm mãn tính với tiên lượng xấu trong quá trình điều trị.

Phát hiện này giống với kết quả từ nghiên cứu của (Shen và ctv, 2013).

Khi FCA gây viêm, bạch cầu xâm nhập vào mô và kích hoạt viêm nhiễm, tế bào

Lympho T sản xuất các cytokine, kích thích sự vận chuyển bạch cầu trung tính vào

118

màng hoạt dịch. Cytokine, chemokine và các chất trung gian gây viêm qua trung gian

lipid (prostaglandin, leukotrienes) làm tăng hoạt động dị hóa của tế bào chondrocyte,

giải phóng các enzyme tiêu hóa protein (aggrecanases, matrix metalloproteinase), phá

hủy sụn, chất cơ bản, gây viêm màng hoạt dịch và tiết dịch vào khớp (Billiau và

Matthys, 2001). Tế bào viêm làm tăng tính thấm của mạch máu để mở rộng màng,

xâm lấn và phá hủy sụn và xương (Hitchon và El-Gabalawy, 2011). Khi quá trình

viêm kéo dài, các nguyên bào sợi phá hủy, Chondrocytes kích thích sản xuất protease,

các yếu tố tăng trưởng và các cytokine gây viêm tiếp tục kéo dài sự phá hủy chất nền

ngoại bào (Im và ctv, 2012).

Tuần thứ 10 sau khi uống chiết xuất vỏ quả mãng cầu ta và mobic, hình dạng khớp

mắt cá chân chuột dần trở lại bình thường và khác với nhóm chuột không điều trị

(Hình 3.42). Những con chuột không điều trị (sau 10 tuần) mức độ viêm mở rộng, gia

tăng đáng kể. Những con chuột điều trị nồng độ dịch chiết (200 mg/kg) cho thấy sụn

thoái hóa nhẹ, xâm nhập các tế bào viêm giảm, chỉ còn tế bào lympho và phục hồi

hình dạng sụn; với nồng độ dịch chiết 300mg/kg và 400mg/kg, tình trạng viêm giảm,

cấu trúc sụn, chất cơ bản được cải thiện mà không có dấu hiệu tổn thương và ức chế

sự xói mòn của sụn. Kết quả tương tự là như nhóm chuột điều trị bằng thuốc mobic.

Đánh giá mô bệnh học đã chứng minh với nồng độ dịch chiết vỏ mãng cầu ta 200,

300, 400mg/kg làm giảm đáng kể sự xâm nhập của tế bào miễn dịch, xói mòn của

sụn giống với nghiên cứu của (Shen và ctv, 2013).

Khi chuột được điều trị bằng dịch chiết vỏ mãng cầu ta giàu các hợp chất như:

ankaloid, acid phenolic, phenol, flavonoid và những hợp chất này được thủy phân bởi

các enzyme, hệ vi khuẩn của đường ruột, sau đó được hấp thu vận chuyển vào máu

đến các tế bào, mô, cơ quan cơ thể chuột. Polyphenol sẽ được vận chuyển qua kênh

protein hấp thụ qua màng vào khoang viêm, kích hoạt các phản ứng của tế bào chống

các tác nhân gây viêm bằng cách ức chế các yếu tố gây viêm và cytokine ức chế sự

hình thành các prostaglandin, làm giảm sự giải phóng acid arachidonic (Mir và

Agrewala, 2008). Tế bào sụn bị tổn thương làm tăng biểu hiện của phân tử kết dính

tế bào. Nhiều polyphenol là những chất thúc đẩy cân bằng nội môi, chống viêm,

119

chống oxy hóa, chống lại việc sản xuất các enzyme phân giải protein gây tổn thương

sụn, chống oxy hóa, điều hòa hệ thống miễn dịch bao gồm tế bào B, T, đại thực bào,

tế bào mast và bạch cầu trung tính (Loeser, 2006).

Hình 3.42 Hình thái ngoài khớp cổ chân chuột bị viêm khớp dạng thấp do FCA sau

2 tuần

Hình 3.43 Hình thái ngoài khớp cổ chân chuột bị viêm khớp dạng thấp với tác dụng

của AS sau 10 tuần

120

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1. Kết luận

Nghiên cứu đã xác định phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng, dịch chiết vỏ mãng

cầu ta có hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa có trong cao hơn các

pháp trích ly khác. Mô hình tối ưu hóa đã áp dụng và dự đoán được điều kiện tối ưu

để trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong vỏ mãng cầu ta với các thông

số độ ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/25 (g/mL), thời gian 5 phút, công

suất 214 W thu được dịch chiết có hàm lượng TPC 100,15 mg GAE/g CK, hoạt tính

kháng oxy hóa 673,0 mol TE/g CK (DPPH) và 1409,6 mol TE/g CK (ABTS).

Nghiên cứu đã xác định maltodextrin 12%, gum arabic 10% sấy phun hiệu quả dịch

chiết vỏ mãng cầu ta thu được bột sấy phun có độ ẩm phù hợp, giữ được hàm lượng

polyphenol và hoạt tính oxy hóa cao. Cả dịch chiết và bột sấy phun điều có nhiều hợp

chất có hoạt tính sinh học như alkaloid, tanin, saponin, courmarine ….và kháng được

Staphylococus aureus (ATCC 29213), Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia

coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella spp, và

Lysteria spp. phân lập từ thịt gà và fillet cá basa của Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí

Minh. Bên cạnh đó, dịch chiết vỏ mãng cầu ta với nồng độ 300 mg GAE/l hòa tan

trong chitosan 1,5% đã hạn chế được tốc độ oxy hóa lipid, duy trì được chất lượng

cảm quan tôm thẻ chân trắng trong 12 ngày bảo quản lạnh 4 ±10C.

Với chất mang gum arabic bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta có hiệu suất thu

hồi, hàm lượng polyphenol, hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với maltodextrin.

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã xây dựng mô hình dự đoán shelf – life của dịch

chiết, bột sấy phun để dự đoán sự giảm hàm lượng lượng polyphenol và hoạt tính

kháng oxy hóa theo nhiệt độ bảo quản.

Nghiên cứu cũng đã xác định dịch chiết vỏ mãng cầu ta không tạo ra tác dụng phụ

đối với hành vi và bệnh lý tổng quát của chuột ở nghiên cứu độc tính mãn và độc tính

cấp (LD50 7000 mg/kg), và có khả năng phòng và trị viêm khớp dạng thấp.

121

4.2. Đề xuất

Phân tích định lượng một số thành phần phenolic quan trọng trong dịch trích sau

xử lý bằng vi sóng, enzyme để biết được sự biến đổi cũng như tác động của các

phương pháp xử lý đến tính chất và hàm lượng của các thành phần này trong dịch

trích.

Nghiên cứu sự kết hợp pectinase, cellulase với phương pháp vi sóng, siêu âm để xem

hiệu quả trích ly các chất chống oxy hóa trong dịch trích vỏ mãng cầu có được cải

thiện hơn không (?)

Nghiên cứu thêm một số ứng dụng dịch chiết vỏ mãng cầu tạo màng bao trong bảo

quản thịt, cá, trái cây và khả năng ứng dụng của sản phẩm sấy phun.

Xác định các chỉ tiêu chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của cao chiết và sản phẩm

sấy phun; Xây dựng tiêu chuẩn cho cao chiết định chuẩn để có thể sử dụng cho nghiên

cứu ứng dụng….

122

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Trang Nguyen Thi, Phuong Nhung Tran Thi, Quynh Ha Truong Tu, Huan

Phan Tai. Effect of chitosan coating combined with custard apple (Annona

squamosa L.). peel extract on the quality of pacific white shrimp during cold

storage. Annals of the University Dunarea de Jos of Galati Fascicle VI – Food

Technology (2022), 46(1), 108-124. (WoS/Scopus Q4) (ISSN: 1843-5157,

2068259X) https://doi.org/10.35219/foodtechnology.2022.1.09

2. Nguyễn Thị Trang, Trần Thị Phương Nhung, Phan Tại Huân, Trần Thị Anh

Thy, Nguyễn Thị Tư. Tính chất hóa lý, hoạt tính kháng oxy hóa và kháng

khuẩn của bột sấy phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta (Annona squamosa L.).

Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM, Số

49 (2021), 57 – 66. (ISSN: 2525-2267)

https://doi.org/10.46242/jstiuh.v49i01.1889

3. Trang Nguyen Thi, Phuong Nhung Tran Thi, Huan Phan Tai. Evaluation of

the anti-inflammatory effect of fruit peel extracts of Annona squamosa L. on

mouse models of rheumatoid arthritis. Journal of Microbiology,

Biotechnology and Food Sciences (2021), 11(2), e2075. (WoS/Scopus Q3)

(ISSN: 1338-5178) https://doi.org/10.15414/jmbfs.2075

4. Thi, T. N., & Tai, H. P. (2023). Microwave-assisted extraction of custard

apple (Annona Squamosal L.) Peel. Carpathian Journal of Food Science &

Technology, 15(1), 220 -231, (WoS/Scopus Q4, ISSN-L 2066-6845).

https://doi.org/10.34302/crpjfst/2023.15.1.16

5. Nguyen, T. T., & Phan, T. H. (2023, March). Stirred maceration extraction of

custard apple (Annona squamosa L.) peel. 2023 IOP Conf. Ser.: Earth

Environ. Sci. 1155 012016 (Scopus). https://doi.org/10.1088/1755-

1315/1155/1/012016

123

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Acosta-Estrada, B. A., Gutiérrez-Uribe, J. A., & Serna-Saldívar, S. O. (2014).

Bound phenolics in foods, a review. In Food Chemistry (Vol. 152, pp. 46–55)..

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.11.093

2. Ahmad, M. (2017). Anti-diabetic and acute toxicity studies of Annona

squamosa L. ethanolic leaves extract. International Journal of Phytomedicine, 9(4),

642–647.

3. Aida, W. et al. (2011). Effect of ethanol concentration, extraction time and

extraction temperature on the recovery of phenolic compounds and antioxidant

capacity of Orthosiphon stamineus extracts. In International Food Research Journal

(Vol. 18, Issue 4).

4. Ajila, C. M., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D., Godbout, S., & Valéro, J.

R. (2011). Extraction and Analysis of Polyphenols: Recent trends. In Critical Reviews

in Biotechnology (Vol. 31, Issue 3, pp. 227–249).

5. Akhavan Mahdavi, S., Jafari, S. M., Assadpoor, E., & Dehnad, D. (2016).

Microencapsulation optimization of natural anthocyanins with maltodextrin, gum

Arabic and gelatin. International Journal of Biological Macromolecules, 85, 379–

385. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.01.011

6. Akinpelu, B. A., Igbeneghu, O. A., Awotunde, A. I., Iwalewa, E. O., &

Oyedapo, O. O. (2014). Antioxidant and antibacterial activities of saponin fractions

of Erythropheleum suaveolens (Guill. and Perri.) stem bark extract. Scientific

Research and Essays, 9(18), 826–833.

7. Akowuah, Mariam, A., & Chin, J. (2009). The effect of extraction temperature

on total phenols and antioxidant activity of Gynura procumbens leaf. Pharmacognosy

Magazine, 5(17), 81.

8. Akramas, L., Leonavičienė, L., Vasiliauskas, A., Bradūnaitė, R., Vaitkienė,

D., Zabulytė, D., & Jonauskienė, I. (2015). Anti-inflammatory and anti-oxidative

effects of herbal preparation EM 1201 in adjuvant arthritic rats. Medicina, 51(6),

368–377.

124

9. Al-Farsi, M., Lee, C. Y., & Al-Farsi, M. A. (2008). Optimization of phenolics

and dietary fibre extraction from date seeds Dates Antioxidants View project Invited

Review View project Optimization of phenolics and dietary fibre extraction from date

seeds. Elsevier. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.12.009

10. Alishahi, A., & Aïder, M. (2012). Applications of Chitosan in the Seafood

Industry and Aquaculture: A Review. Food and Bioprocess Technology, 5(3).

https://doi.org/10.1007/s11947-011-0664-x

11. Alupului, A., alinescu, I., & Lavric, V. (2012). Microwave extraction of active

principles from medicinal plants. UPB Science Bulletin, Series B, 74(2), 1454–2331.

12. Alzoreky, N. S., & Nakahara, K. (2003). Antibacterial activity of extracts from

some edible plants commonly consumed in Asia. International Journal of Food

Microbiology, 80(3), 223–230.

13. Amin, N. A. S., & Anggoro, D. D. (2004). Optimization of direct conversion

of methane to liquid fuels over Cu loaded W/ZSM-5 catalyst. Fuel, 83(4–5), 487–

494.

14. Anand, P., Singh, B., & Singh, N. (2012). A review on coumarin as

acetylcholinesterase inhibitors for Alzheimer’s disease. Bioorganic & Medicinal

Chemistry, 20(3), 1175–1180.

15. Ankli, A., Heilmann, J., Heinrich, M., & Sticher, O. (2000). Cytotoxic

cardenolides and antibacterial terpenoids from Crossopetalum gaumeri.

Phytochemistry, 54(5), 531–537.

16. Arepally, D., & Goswami, T. K. (2019). Effect of inlet air temperature and

gum Arabic concentration on encapsulation of probiotics by spray drying. Lwt, 99,

583–593. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.10.022

17. Ashok Sharma, Ashish K. Sharma, Tara Chand, Manoj Khardiya, & Suresh

Agarwal. (2013). Preliminary Phytochemical Screening of Fruit Peel Extracts of

Annona Preliminary Phytochemical Screening of Fruit Peel Extracts of Annona

Squamosa Linn. In Current Pharma Research (Vol. 4, Issue 1). www.jcpronline.in

125

18. Ayoola, G. A., Coker, H. A., Adesegun, S. A., Adepoju-Bello, A. A.,

Obaweya, K., Ezennia, E. C., & Atangbayila, T. O. (2008). Phytochemical screening

and antioxidant activities of some selected medicinal plants used for malaria therapy

in Southwestern Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7(3), 1019–

1024.

19. Azarakhsh, N., Osman, A., Ghazali, H. M., Tan, C. P., & Mohd Adzahan, N.

(2012). Optimization of alginate and gellan-based edible coating formulations for

fresh-cut pineapples. International Food Research Journal, 19(1), 279–285.

20. Azmir, J., Zaidul, I. S. M., Rahman, M. M., Sharif, K. M., Mohamed, A.,

Sahena, F., Jahurul, M. H. A., Ghafoor, K., Norulaini, N. A. N., & Omar, A. K. M.

(2013). Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A

review. Journal of Food Engineering, 117(4), 426–436.

21. Bach, L. G., van Muoi, N., Pham, T. N., Nguyen, V. T., Toan, T. Q., Cang, M.

H., Giang Bach, L., & Muoi, N. van. (n.d.). Effects of Various Processing Parameters

on Polyphenols, Flavonoids, and Antioxidant Activities of Codonopsis javanica Root

Extract. Natural Product Communications, 15(9), 1–12.

22. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G., & Tordoff, M. G. (2002).

Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains.

Behavior Genetics, 32(6), 435-443.

23. Bae, E. K., & Lee, S. J. (2008). Microencapsulation of avocado oil by spray

drying using whey protein and maltodextrin. Journal of Microencapsulation, 25(8),

549–560.

24. Bagchi, D., Sen, C. K., Bagchi, M., & Atalay, M. (2004). Anti-angiogenic,

antioxidant, and anti-carcinogenic properties of a novel anthocyanin-rich berry

extract formula. Biochemistry (Moscow), 69(1), 75–80.

25. Ballou, S. P., & Lozanski, G. (1992). Induction of inflammatory cytokine

release from cultured human monocytes by C-reactive protei. Cytokine, 4(4), 361–

368.

126

26. Banna, E., Ramadan, A., & Sayed, H. (2016). Some pharmacological and

toxicological activities of Annona squamosa linn. Ethanolic extract. WORLD J

Pharm Pharm Sci S SJIF Impact Factor, 5(12), 188–202.

https://doi.org/10.20959/wjpps201612-8147.

27. Bayer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., & Turck, M. (1966). Antibiotic

susceptibility testing by a standardized single disc method. Am J Clin Patho, 45(4),

493-496.

28. Bhardwaj, A., Satpathy, G., & Gupta, R. K. (2014). Preliminary screening of

nutraceutical potential of Annona squamosa, an underutilized exotic fruit of India and

its use as a valuable source in functional foods. Journal of Pharmacognosy and

Phytochemistry, 3(2).

29. Billiau, A., & Matthys, P. (2001). Modes of action of Freund’s adjuvants in

experimental models of autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology, 70(6),

849–860.

30. Bindu, J., Ginson, J., Kamalakanth, C. K., Asha, K. K., & Srinivasa Gopal, T.

K. (2013). Physico-chemical changes in high pressure treated Indian white prawn

(Fenneropenaeus indicus) during chill storage. Innovative Food Science & Emerging

Technologies, 17. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2012.10.003

31. Buzzini, P., Arapitsas, P., Goretti, M., Branda, E., Turchetti, B., Pinelli, P., &

Romani, A. (2008). Antimicrobial and antiviral activity of hydrolysable tannin. Mini-

Reviews in Medicinal Chemistry, 8(12), 1179.

32. Caban, M., Chojnacka, K., Owczarek, K., Laskowska, J., Fichna, J., Podsedek,

A., Sosnowska, D., & Lewandowska, U. (2020). Spent hops (Humulus lupulus L.)

extract as modulator of the inflammatory response in lipopolysaccharidee stimulated

raw 264.7 macrophages. Journal of Physiology and Pharmacology, 71(1).

https://doi.org/10.26402/jpp.2020.1.05

33. Cacace, J. E., & Mazza, G. (2003). Mass transfer process during extraction of

phenolic compounds from milled berries. Journal of Food Engineering, 59(4), 379–

389. https://doi.org/10.1016/S0260-8774(02)00497-1

127

34. Cal, K., & Sollohub, K. (2010). Spray drying technique. I: Hardware and

process parameters. Journal of Pharmaceutical Sciences, 99(2), 575–586.

35. Camel, V. (2001). Recent extraction techniques for solid matrices—

supercritical fluid extraction, pressurized fluid extraction and microwave-assisted

extraction: their potential and pitfalls. Analyst, 126(7), 1182–1193.

36. Capecka, E. , Mareczek, A. , & Leja, M. (2005). Antioxidant activity of fresh

and dry herbs of some Lamiaceae species. Food Chemistry, 93(2), 223–226.

37. Carlson, R. v, Boyd, K. M., & Webb, D. J. (2004). British Journal of Clinical

Pharmacology The revision of the Declaration of Helsinki: past, present and future.

Ncbi.Nlm.Nih.Gov, 57(6), 695–713. https://doi.org/10.1111/j.1365-

2125.2004.02103.x

38. Chegini, G. R., & Ghobadian, B. (2005). Effect of spray-drying conditions on

physical properties of orange juice powder. Drying Technology, 23(3), 657–668.

https://doi.org/10.1081/DRT-200054161

39. Chew, K., Khoo, M., Ng, S., & YY Thoo. (2011). Effect of ethanol

concentration, extraction time and extraction temperature on the recovery of phenolic

compounds and antioxidant capacity of Orthosiphon. International Food Research

Journal; Selangor, 18(6), 1427–1435.

40. Chiou, D., Langrish, T. A. G. (2007). Development and characterisation of

novel nutraceuticals with spray-drying technology. Journal of Food Engineering, 82,

84–91.

41. Chojnacka, K., & Lewandowska, U. (2021). The influence of polyphenol-rich

extracts on the production of pro-inflammatory mediators in macrophages. In Journal

of Physiology and Pharmacology (Vol. 72, Issue 2). Polish Physiological Society.

42. Chronakis, I. S. (1998). On the molecular characteristics, compositional

properties, and structural-functional mechanisms of maltodextrins: a review. Critical

Reviews in Food Science and Nutrition, 38(7), 599–637.

43. Chuang, C. C., & McIntosh, M. K. (2011). Potential mechanisms by which

polyphenol-rich grapes prevent obesity-mediated inflammation and metabolic

128

diseases. Annual Review of Nutrition, 31, 155–176. https://doi.org/10.1146/annurev-

nutr-072610-145149

44. Cockcroft, D. W. (2010). Direct Challenge Tests: Airway

Hyperresponsiveness in Asthma: Its Measurement and Clinical Significance. Chest,

138(2), 18S-24S. https://doi.org/10.1378/CHEST.10-0088

45. Contini, M., Baccelloni, S., Massantini, R., & Anelli, G. (2008). Extraction of

natural antioxidants from hazelnut (Corylus avellana L.) shell and skin wastes by long

maceration at room temperature. Food Chemistry, 110(3), 659–669.

46. Cör, D., Knez, Ž., & Knez Hrnčič, M. (2018). Antitumour, antimicrobial,

antioxidant and antiacetylcholinesterase effect of Ganoderma lucidum terpenoids and

polysaccharidees: A review. Molecules, 23(3), 649.

47. Cravotto, G. , B. L. , M. S. , P. P. ,ogadro, M., & Cintas, P. (2008). Improved

extraction of vegetable oils under high-intensity ultrasound and/or microwaves.

Ultrasonics Sonochemistry, 15(5), 898–902.

48. Crozier, A., Jaganath, I. B., & Clifford, M. N. (2009). Dietary phenolics:

Chemistry, bioavailability and effects on health. Natural Product Reports, 26(8),

1001–1043. https://doi.org/10.1039/b802662a

49. Ćujić, N., Šavikin, K., Janković, T., Pljevljakušić, D., Zdunić, G., & Ibrić, S.

(2016). Optimization of polyphenols extraction from dried chokeberry using

maceration as traditional technique. Food Chemistry, 194, 135–142.

50. Daglia, M. (2012b). Polyphenols as antimicrobial agents. Current Opinion in

Biotechnology, 23(2), 174–181. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2011.08.007

51. Deng, G. F., Xu, D. P., Li, S., & Li, H. bin. (2015). Optimization of ultrasound-

assisted extraction of natural antioxidants from sugar apple (Annona squamosa L.)

peel using response surface methodology. Molecules, 20(11), 20448–20459.

https://doi.org/10.3390/molecules201119708

52. Deng, M., Deng, Y., Dong, L., Ma, Y., Liu, L., Huang, F., Wei, Z., Zhang, Y.,

Zhang, M., & Zhang, R. (2018). Effect of storage conditions on phenolic profiles and

129

antioxidant activity of Litchi pericarp. Molecules, 23(9), 2–13.

https://doi.org/10.3390/molecules23092276

53. Desobry, S. A., Netto, F. M., & Labuza, T. P. (1997). Comparison of spray-

drying, drum-drying and freeze-drying for β-carotene encapsulation and preservation.

Journal of Food Science, 62(6), 1158–1162. https://doi.org/10.1111/J.1365-

2621.1997.TB12235.X

54. Dũng, N. Đ., & Hường, V. T. (2019). Tối ưu hóa điều kiện trích ly hợp chất

polyphenol từ vỏ mãng cầu ta (annona squamosal l.) sử dụng enzyme celluclast 1,5l

(Vol. 18, Issue 2).

55. Ehsan, K., & Hawa, Z. E. (2011). Phytochemical Analysis and Antimicrobial

Activities of Methanolic Extracts of Leaf, Stem and Root from Different Varieties of

Labisa pumila Benth. Molecules, 16, 4438–4450.

56. El-Ishaq, A., Alshawsh, M. A., Mun, K. S., & Chik, Z. (2020). Biochemical

and toxicological effects of methanolic extract of Asparagus africanus Lam in

Sprague-Dawley rats. Peer J, 8, e9138.

https://doi.org/http://dx.doi.org/10.7717/peerj.9138

57. El-Shourbagy, G. A., & El-Zahar, K. M. (2014). Oxidative stability of ghee as

affected by natural antioxidants extracted from food processing wastes. Annals of

Agricultural Sciences, 59(2), 213–220. https://doi.org/10.1016/J.AOAS.2014.11.008

58. Ersus, S., & Yurdagel, U. (2007). Microencapsulation of anthocyanin

pigments of black carrot (Daucus carota L.) by spray drier. Journal of Food

Engineering, 80(3), 805–812. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2006.07.009

59. Faleye, O., & Dada, E. (2016). Effects of ethanol extract of unripe Annona

Muricata (L.) fruits on the Haematological and Histopathological parameters in Swiss

albino rats infected with salmonella Typhi. Br. J. Pharm. Res, 9, 1–13.

https://doi.org/10.9734/BJPR/2016/19971.

60. Fantini, M., Benvenuto, M., Masuelli, L., Frajese, G. V., Tresoldi, I., Modesti,

A., & Bei, R. (2015). In vitro and in vivo antitumoral effects of combinations of

polyphenols, or polyphenols and anticancer drugs: Perspectives on cancer treatment.

130

In International Journal of Molecular Sciences (Vol. 16, Issue 5, pp. 9236–9282).

https://doi.org/10.3390/ijms16059236

61. Farajzadeh, F., Motamedzadegan, A., Shahidi, S.-A., & Hamzeh, S. (2016).

The effect of chitosan-gelatin coating on the quality of shrimp ( Litopenaeus

vannamei) under refrigerated condition. Food Control, 67.

https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.02.040

62. Feng, X., Bansal, N., & Yang, H. (2016). Fish gelatin combined with chitosan

coating inhibits myofibril degradation of golden pomfret (Trachinotus blochii) fillet

during cold storage. Food Chemistry, 200, 283–292.

63. Fernandes, L. P., Candido, R. C., & Oliveira, W. P. (2012). Spray drying

microencapsulation of Lippia sidoides extracts in carbohydrate blends. Food and

Bioproducts Processing, 90(3), 425–432.

64. Fu, B., & Labuza, T. P. (1993). Shelf-life prediction: theory and application.

Food Control, 4(3), 125–133. https://doi.org/10.1016/0956-7135(93)90298-3

65. Fu, B., & Labuza, T. P. (1997). Shelf-Life Testing: Procedures and Prediction

Methods. Quality in Frozen Foods, 377–415. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-

5975-7_19

66. Fu, L., Xu, B. T., Xu, X. R., Gan, R. Y., Zhang, Y., Xia, E. Q., & Li, H. Bin.

(2011). Antioxidant capacities and total phenolic contents of 62 fruits. Food

Chemistry, 129(2), 345–350. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.04.079

67. G.A Macedo et al. (2021). Integrated microwave- and enzyme-assisted

extraction of phenolic compounds from olive pomace. LWT - Food Science and

Technology, 138. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.110621

68. Gallardo, C., Jimenez, L., Phẩm, M. G.-C.-H. học thực, & 2006, U. (2006).

Hydroxycinnamic acid composition and in vitro antioxidant activity of selected grain

fractions. Elsevier, 99(3), 455–463.

https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.07.053

131

69. Gate, S., BANDAWANE, D., Beautikumari, S., & Patel, A. (2014). Tannin

Rich Fraction of Punica granatum Linn. Leaves Ameliorates Freund’s Adjuvant

Induced Arthritis in Experimental Animals. Pharmacologia, 5, 19–31.

70. Geldart, D., Abdullah, E. C., Hassanpour, A., Nwoke, L. C., & Wouters, I.

(2006). Characterization of powder flowability using measurement of angle of repose

(Vol. 4, Issue 1990).

71. Georgetti, S. R., Casagrande, R., Souza, C. R. F., Oliveira, W. P., & Fonseca,

M. J. V. (2008). Spray drying of the soybean extract: effects on chemical properties

and antioxidant activity. LWT-Food Science and Technology, 41(8), 1521–1527.

72. Ghandahari Yazdi, A. P., Barzegar, M., Sahari, M. A., & Ahmadi Gavlighi,

H. (2019). Optimization of the enzyme-assisted aqueous extraction of phenolic

compounds from pistachio green hull. Food Science and Nutrition, 7(1), 356–366.

https://doi.org/10.1002/fsn3.900

73. Gharsallaoui, A., Roudaut, G., Chambin, O., Voilley, A., & Saurel, R. (2007).

Applications of spray-drying in microencapsulation of food ingredients: An

overview. Food Research International, 40(9), 1107–1121.

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2007.07.004

74. Giftson, J. S., Jayanthi, S., & Nalini, N. (2010). Chemopreventive efficacy of

gallic acid, an antioxidant and anticarcinogenic polyphenol, against 1,2-dimethyl

hydrazine induced rat colon carcinogenesis. Investigational New Drugs, 28(3), 251–

259. https://doi.org/10.1007/s10637-009-9241-9

75. Godghate, A., & Sawant, R. (2013). Qualitative phytochemical analysis of

chloroform extract of leaves of Adhatoda vasica Nees. Rasayan J Chem, 6(2), 107–

110.

76. Gómez-García, R., Martínez-A´Vila, G, G. C., & Aguilar, C. N. (2012).

Enzyme-assisted extraction of antioxidative phenolics from grape (Vitis vinifera L.)

residues. Springer Link, 2, 297–300. https://doi.org/10.1007/s13205-012-0055-7

77. Goubet, I., le Quere, J. L., & Voilley, A. J. (1998). Retention of aroma

compounds by carbohydrates: influence of their physicochemical characteristics and

132

of their physical state. A review. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46,

1981– 1990.

78. Goula, A. M., & Adamopoulos, K. G. (2004). Spray drying of tomato pulp:

Effect of feed concentration. Drying Technology, 22(10), 2309–2330.

https://doi.org/10.1081/DRT-200040007

79. Goula, A. M., Adamopoulos, K. G., & Kazakis, N. A. (2004). Influence of

spray drying conditions on tomato powder properties. Drying Technology, 22(5),

1129–1151. https://doi.org/10.1081/DRT-120038584

80. Griffioen, M. A., Dernetz, V. H., Yang, G. S., Griffith, K. A., Dorsey, S. G.,

& Renn, C. L. (2015). Evaluation of dynamic weight bearing for measuring

nonevoked inflammatory hyperalgesia in mice. Nursing Research, 64(2), 81–87.

81. Halldorsdottir, H. D., Jonsson, T., Thorsteinsson, J., & Valdimarsson, H.

(2000). A prospective study on the incidence of rheumatoid arthritis among people

with persistent increase of rheumatoid factor. Annals of the Rheumatic Diseases,

59(2), 149-151.

82. Halliday, L. C., Artwohl, J. E., Bunte, R. M., Ramakrishnan, V., & Bennett,

T. B. (2004). Effects of Freund’s complete adjuvant on the physiology, histology, and

activity of New Zealand white rabbits. Journal of the American Association for

Laboratory Animal Science, 43(1), 8–13.

83. Han, E. H., Lim, M. K., Lee, S. H., Rahman, M., & Lim, Y. H. (2019). An oral

toxicity test in rats and a genotoxicity study of extracts from the stems of Opuntia

ficus-indica var. saboten. BMC Complementary and Alternative Medicine, 19(1), 1-

10.

84. HemLatha, K., & Satyanarayana, D. (2015). Anti-inflammatory activity of

Annona squamosa Linn. Biomedical and Pharmacology Journal, 2(2), 17–20.

85. Herodež, Š. S., Hadolin, M., Škerget, M., & Knez, Ž. (2003). Solvent

extraction study of antioxidants from Balm (Melissa officinalis L.) leaves. Food

Chemistry, 80(2), 275–282. https://doi.org/10.1016/S0308-8146(02)00382-5

133

86. Hitchon, C. A., & El-Gabalawy, H. S. (2011). Suppl 1: the synovium in

rheumatoid arthritis. The Open Rheumatology Journal, 5, 107–114.

87. Hong, Y. H., Jung, E. Y., Park, Y., Shin, K. S., Kim, T. Y., Yu, K. W., Chang,

U. J., & Suh, H. J. (2013). Enzymatic improvement in the polyphenol extractability

and antioxidant activity of green tea extracts. Bioscience, Biotechnology and

Biochemistry, 77(1), 22–29. https://doi.org/10.1271/bbb.120373

88. Hu, Q., Yuan, B., Xiao, H., Zhao, L., Wu, X., Rakariyatham, K., & Yang, W.

(2018). Polyphenols-rich extract from Pleurotus eryngii with growth inhibitory of

HCT116 colon cancer cells and anti-inflammatory function in RAW264. 7 cells.

Food & Function, 9(3), 1601–1611.

89. Huang, M. T., Ma, W., Yen, P., Xie, J. G., Han, J., Frenkel, K., Grumberger,

D., & Conney, A. H. (1996). Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE)

on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced tumor promotion in mouse skin

and the synthesis of DNA, RNA and protein in HeLa cells. Carcinogenesis, 17(4),

761–765. https://doi.org/10.1093/carcin/17.4.761

90. Huidobro, A., Mendes, R., & Nunes, M. (2001). Slaughtering of gilthead

seabream (Sparus aurata) in liquid ice: influence on fish quality. European Food

Research and Technology, 213(4–5). https://doi.org/10.1007/s002170100378

91. Huntley, A. L. (2009). The health benefits of berry flavonoids for menopausal

women: Cardiovascular disease, cancer and cognition. In Maturitas (Vol. 63, Issue

4, pp. 297–301). Elsevier. https://doi.org/10.1016/j.maturitas.2009.05.005

92. Hussain, T., Tan, B., Yin, Y., Blachier, F., Tossou, M. C., & Rahu, N. (2016).

Oxidative stress and inflammation: what polyphenols can do for us? Oxidative

Medicine and Cellular Longevity, 2016.

93. Im, H. J. , L. X., Chen, D., & Yan, D. (2012). Biological effects of the plant‐

derived polyphenol resveratrol in human articular cartilage and chondrosarcoma

cells. Journal of Cellular Physiology, 227(10), 3488–3497.

134

94. Jagtap, U. B., & Bapat, V. A. (2013). Antioxidant activities of various solvent

extracts of custard apple (Annona squamosa L.) fruit pulp. Nutrafoods, 11(4), 137–

144. https://doi.org/10.1007/s13749-012-0053-8

95. Jeon, Y. J., Kamil, J. Y. V. A., & Shahidi, F. (2002). Chitosan as an edible

invisible film for quality preservation of herring and Atlantic cod. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 50(18), 5167–5178.

https://doi.org/10.1021/jf011693l

96. Jiang, M., Liu, S., & Wang, Y. (2011). Effects of Antimicrobial Coating from

Catfish Skin Gelatin on Quality and Shelf Life of Fresh White Shrimp (Penaeus

vannamei). Journal of Food Science, 76(3). https://doi.org/10.1111/j.1750-

3841.2011.02056.x

97. Johnson, I. T., Williamson, G., & Musk, S. R. R. (1994). Anticarcinogenic

Factors in Plant Foods: A New Class of Nutrients? Nutrition Research Reviews, 7(1),

175–204. https://doi.org/10.1079/nrr19940011

98. Jovanović, A. A., Đorđević, V. B., Zdunić, G. M., Šavikin, K. P.,

Pljevljakušić, D. S., Gođevac, D. M., & Bugarski, B. M. (2017). Optimization of the

extraction process of polyphenols from Thymus serpyllum L. herb using maceration,

heat-and ultrasound-assisted techniques. Separation and Purification Technology,

179, 369–380.

99. Ju, Z. Y., & Howard, L. R. (2003). Effects of solvent and temperature on

pressurized liquid extraction of anthocyanins and total phenolics from dried red grape

skin. In Journal of Agricultural and Food Chemistry (Vol. 51, Issue 18, pp. 5207–

5213). https://doi.org/10.1021/jf0302106

100. Kalidindi, N., Thimmaiah, N. v, Jagadeesh, N. v, Nandeep, R., Swetha, S., &

Kalidindi, B. (2015). Antifungal and antioxidant activities of organic and aqueous

extracts of Annona squamosa Linn. leaves. Journal of Food and Drug Analysis,

23(4), 795–802.

135

101. Khazaei, K. M., Jafari, S. M., Ghorbani, M., Kakhki, A. H., & Sarfarazi, M.

(2016). Optimization of anthocyanin extraction from saffron petals with response

surface methodology. Food Analytical Methods, 9(7), 1993–2001.

102. Kifayatullah, M., Mustafa, M. S., Sengupta, P., Sarker, M. M. R., Das, A., &

Das, S. K. (2015). Evaluation of the acute and sub-acute toxicity of the ethanolic

extract of Pericampylus glaucus (Lam.) Merr. in BALB/c mice. Journal of Acute

Disease, 4(4), 309–315. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.joad.2015.06.010

103. Kim, A. N., Kim, H. J., Chun, J., Heo, H. J., Kerr, W. L., & Choi, S. G. (2018).

Degradation kinetics of phenolic content and antioxidant activity of hardy kiwifruit

(Actinidia arguta) puree at different storage temperatures. Lwt, 89(November 2017),

535–541. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.11.036

104. Kim, J. C., Shin, D. H., Kim, S. H., Kim, J. K., Park, S. C., Son, W. C., Lee,

H. S., Suh, J. E., Kim, C. Y., Ha, C. S., & Chung, M. K. (2004). Subacute toxicity

evaluation of a new camptothecin anticancer agent CKD-602 administered by

intravenous injection to rats. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 40(3), 356–

369. https://doi.org/10.1016/J.YRTPH.2004.09.002

105. Kim, K. W., Kim, B. M., Moon, H. W., Lee, S. H., & Kim, H. R. (2015).

RRole of C-reactive protein in osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis

Research & Therapy, 17(1), 1–12.

106. King, P. J., Ma, G., Miao, W., Jia, Q., McDougall, B. R., Reinecke, M. G.,

Cornell, C., Kuan, J., Kim, T. R., & Robinson, W. E. (1999). Structure-activity

relationships: Analogues of the dicaffeoylquinic and dicaffeoyltartaric acids as potent

inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 integrase and replication. Journal

of Medicinal Chemistry, 42(3), 497–509. https://doi.org/10.1021/jm9804735

107. Kossah, R., Nsabimana, C., & Zhang, H. (2010). Optimization of Extraction

of Polyphenols from Syrian Sumac (Rhus coriaria L.) and Chinese Sumac (Rhus

typhina L.) Fruits. Article in Research Journal of Phytochemistry.

https://doi.org/10.3923/rjphyto.2010.146.153

136

108. Kothari, V., Punjabi, A., & Gupta, S. (2009). Optimization of Microwave

Assisted Extraction of Annona Squamosa Seeds. The Icfai University Journal of Life

Sciences, 3(1), 55–60.

109. Krishnaiah, D., Sarbatly, R., & Nithyanandam, R. (2012). Microencapsulation

of Morinda citrifolia L. extract by spray-drying. Chemical Engineering Research and

Design, 90(5), 622–632.

110. Kuppusamy, S., Thavamani, P., Megharaj, M., & Naidu, R. (2015).

Bioremediation potential of natural polyphenol rich green wastes: A review of current

research and recommendations for future directions. Environmental Technology and

Innovation, 4, 17–28. https://doi.org/10.1016/j.eti.2015.04.001

111. Labuza et al. (1979). Open Shelf-Life Dating of Food August 1979.

112. Lahoti, A., Kalra, B. S., & Tekur, U. (2014). Evaluation of the analgesic and

anti-inflammatory activity of fixed dose combination: non-steroidal anti-

inflammatory drugs in experimental animals. Indian Journal of Dental Research,

25(5), 551–554.

113. Landis-Piwowar, K. R., Huo, C., Chen, D., Milacic, V., Shi, G., Tak, H. C., &

Dou, Q. P. (2007). A novel prodrug of the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-

3-gallate as a potential anticancer agent. Cancer Research, 67(9), 4303–4310.

https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-4699

114. Leach, M. (2014). Interpretation of the full blood count in systemic disease–a

guide for the physician. R Coll Physicians Edinb, 44(1), 36–41.

https://doi.org/10.4997/JRCPE.2014.109

115. LEE, J.-D., Kim, S. Y., Kim, T. W., Lee, S. H., Yang, H. I., Lee, D. I., & Lee,

Y. H. (n.d.). Anti-inflammatory effect of bee venom on type II collagen-induced

arthritis. The American Journal of Chinese Medicine, 32(03), 361-367.

116. Li, T., Li, J., Hu, W., & Li, X. (2013). Quality enhancement in refrigerated red

drum (Sciaenops ocellatus) fillets using chitosan coatings containing natural

preservatives. Food Chemistry, 138(2–3).

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.11.092

137

117. Liao, X., Su, Y., Liu, D., Chen, S., Hu, Y., Ye, X., Wang, J., & Ding, T. (2018).

Application of atmospheric cold plasma-activated water (PAW) ice for preservation

of shrimps (Metapenaeus ensis). In Food Control (Vol. 94, pp. 307–314).

https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.07.026

118. Limbo, S., Sinelli, N., Torri, L., & Riva, M. (2009). Freshness decay and shelf

life predictive modelling of European sea bass (Dicentrarchus labrax) applying

chemical methods and electronic nose. LWT - Food Science and Technology, 42(5).

https://doi.org/10.1016/j.lwt.2008.12.011

119. Linn, S., Linn, S., Sharma, A., Sharma, A. K., Chand, T., & Khardiya, M.

(2013). Preliminary Phytochemical Screening of Fruit Peel Extracts of Annona.

120. Loeser, R. F. (2006). Molecular mechanisms of cartilage destruction:

mechanics, inflammatory mediators, and aging collide. Arthritis and Rheumatism,

54(5), 1357–1360.

121. Maghami, M., Motalebi, A. A., & Anvar, S. A. A. (2019). Influence of

chitosan nanoparticles and fennel essential oils (Foeniculum vulgare) on the shelf life

of Huso huso fish fillets during the storage. Food Science & Nutrition, 7(9), 3030–

3041.

122. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., & Jiménez, L. (2004).

Polyphenols: Food source and bioavailability. American Journal of Clinical

Nutrition, 79(5), 727–747.

123. Mandal, P., Mateu, C. G., Chattopadhyay, K., Pujol, C. A., Damonte, E. B., &

Ray, B. (2007). Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the

brown seaweed Cystoseira indica. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 18(3),

153-162.

124. Manners, P. J., & Bower, C. (2002). Worldwide prevalence of juvenile arthritis

why does it vary so much? The Journal of Rheumatology, 29(7), 1520–1530.

125. Mantena, S. K., Baliga, M. S., & Katiyar, S. K. (2006). Grape seed

proanthocyanidins induce apoptosis and inhibit metastasis of highly metastatic breast

138

carcinoma cells. Carcinogenesis, 27(8), 1682–1691.

https://doi.org/10.1093/carcin/bgl030

126. Maqsood, S., Abushelaibi, A., Manheem, K., al Rashedi, A., & Kadim, I. T.

(2015). Lipid oxidation, protein degradation, microbial and sensorial quality of camel

meat as influenced by phenolic compounds. LWT-Food Science and Technology,

63(2), 953-959.

127. Masuelli, L., Benvenuto, M., Fantini, M., ….,Modesti, A., & Bei, R. (2013).

Curcumin induces apoptosis in breast cancer cell lines and delays the growth of

mammary tumors in neu transgenic mice. Journal of Biological Regulators and

Homeostatic Agents, 27(1), 105–119.

128. McInnes, I. B., & Schett, G. (2011). The pathogenesis of rheumatoid arthritis.

New England Journal of Medicine, 365(23), 2205–2219.

129. Mierziak, J., Kostyn, K., & Kulma, A. (2014). molecules Flavonoids as

Important Molecules of Plant Interactions with the Environment. Molecules, 19,

16240–16265. https://doi.org/10.3390/molecules191016240

130. Minh, N. P., Thi, D., & Dao, A. (2013). Effect of Different Antioxidant Ratios

Supplemented into Mixture of Gac (Momordica cochinchinensis Spreng) Seed

Membrane-carrier to Total Carotene; Accelerated Temperature to Shelf-life of Gac

Powder. 2(11), 1005–1018.

131. Min-Kyung Park and Cherl Hyun Kim(2009). Extraction of Polyphenols from

Apple Peel Using Cellulase and Pectinase and Estimation of Antioxidant Activity.

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 38(5), 535–540.

https://doi.org/https://doi.org/10.3746/jkfn.2009.38.5.535

132. Mir, M. A., & Agrewala, J. N. (2008). Dietary polyphenols in modulation of

the immune system. Polyphenols and Health: New and Recent Advances. Nova

Publishers.

133. Mishra, P., Mishra, S., & Mahanta, C. L. (2014). Effect of maltodextrin

concentration and inlet temperature during spray drying on physicochemical and

139

antioxidant properties of amLa (Emblica officinalis) juice powder. Elsevier, 92(3),

252–258.

134. Mishra, P., Mishra, S., & Mahanta, C. L. (2014). Effect of maltodextrin

concentration and inlet temperature during spray drying on physicochemical and

antioxidant properties of amLa (Emblica officinalis) juice powder. Food and

Bioproducts Processing, 92(3), 252–258. https://doi.org/10.1016/j.fbp.2013.08.003

135. Mohammad, N. A., Abang Zaidel, D. N., Muhamad, I. I., Abdul Hamid, M.,

Yaakob, H., & Mohd Jusoh, Y. M. (2019). Optimization of the antioxidant-rich

xanthone extract from mangosteen (Garcinia mangostana L.) pericarp via

microwave-assisted extraction. Heliyon, 5(10), e02571.

https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e02571

136. Mohammadalinejhad, S., Almasi, H., & Moradi, M. (2020). Immobilization

of Echium amoenum anthocyanins into bacterial cellulose film: A novel colorimetric

pH indicator for freshness/spoilage monitoring of shrimp. Food Control, 113.

https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020.107169

137. Mohan, C. O., Ravishankar, C. N., Lalitha, K. V., & Srinivasa Gopal, T. K.

(2012). Effect of chitosan edible coating on the quality of double filleted Indian oil

sardine (Sardinella longiceps) during chilled storage. Food Hydrocolloids, 26(1).

https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2011.05.005

138. Moreira, G. E. G., Costa, M. G. M., de Souza, A. C. R., de Brito, E. S., de

Medeiros, M. D. F. D., & de Azeredo, H. M. (2009). Physical properties of spray

dried acerola pomace extract as affected by temperature and drying aids. Food

Science and Technology, 42(2), 641-645.

139. Moure, A., Franco, D., Sineiro, J., Domínguez, H., Núñez, M. J. ., & Lema, J.

M. (2000). Evaluation of extracts from Gevuina avellana hulls as antioxidants.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(9), 3890–3897.

140. Müller-Ladner, U., Pap, T., Gay, R. E., Neidhart, M., & Gay, S. (2005).

Mechanisms of disease: the molecular and cellular basis of joint destruction in

rheumatoid arthritis. Nature Clinical Practice Rheumatology, 1(2), 102–110.

140

141. Muoi, N. van, & Quoc, L. P. T. (2018). The shelf-life of total polyphenol

content and the antioxidant capacity of the polygonum multiflorum (Thunb.) root

extract and its spray dried powder according to the Q10 method. Bulletin of the

Transilvania University of Brasov, Series II: Forestry, Wood Industry, Agricultural

Food Engineering, 11(60), 147–158.

142. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Vining, G. G., Borror, C. M., & Kowalski,

S. M. (2004). Response surface methodology: a retrospective and literature survey.

Journal of Quality Technology, 36(1), 53–77.

143. Na, S., Kim, J.-H., Jang, H.-J., Park, H. J., & Oh, S.-W. (2018). Shelf life

extension of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) using chitosan and ε-

polylysine during cold storage. International Journal of Biological Macromolecules,

115. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.04.180

144. Naczk, M., & Shahidi, F. (2004). Extraction and analysis of phenolics in food.

In Journal of Chromatography A (Vol. 1054, Issues 1–2, pp. 95–111). Elsevier.

https://doi.org/10.1016/j.chroma.2004.08.059

145. Navarre, W. W., & Schneewind, O. (1999). Surface proteins of gram-positive

bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiology

and Molecular Biology Reviews, 63(1), 174–229.

https://doi.org/10.1128/MMBR.63.1.174-229.1999

146. Naviglio, D., Scarano, P., Ciaravolo, M., & Gallo, M. (2019). Rapid solid-

liquid dynamic extraction (RSLDE): A powerful and greener alternative to the latest

solid-liquid extraction techniques. In Foods (Vol. 8, Issue 7, p. 245).

Multidisciplinary Digital Publishing Institute. https://doi.org/10.3390/foods8070245

147. Nirmal, N. P., & Benjakul, S. (2009). Effect of ferulic acid on inhibition of

polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus

vannamei) during iced storage. Food Chemistry, 116(1).

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.02.054

148. Nirmal, N. P., & Benjakul, S. (2011). Retardation of quality changes of Pacific

white shrimp by green tea extract treatment and modified atmosphere packaging

141

during refrigerated storage. International Journal of Food Microbiology, 149(3).

https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.07.002

149. Nishad, J., Selvan, C. J., Mir, S. A., & Bosco, S. J. D. (2017). Effect of spray

drying on physical properties of sugarcane juice powder (Saccharum officinarum L.).

Jurnal of Food Science and Technology, 54(3), 687–697.

150. Noble, S. (1996). Balfour JA. Meloxicam. Drugs, 51, 424–432.

151. Objectives, L. (2021). 18.6: Enzyme Activity. 5–7.

152. Okeke, M. I., Iroegbu, C. U., Eze, E. N., Okoli, A. S., & Esimone, C. O.

(2001). Evaluation of extracts of the root of Landolphia owerrience for antibacterial

activity. Journal of Ethnopharmacology, 78(2–3), 119–127.

https://doi.org/10.1016/S0378-8741(01)00307-5

153. Olaya, M. D. P., Lozano, M. C., Botero, L., Rincón, J., & Guerrero, M. F.

(2010). Evaluation of the acute and subchronic oral toxicity of ethanol extract from

Valeriana pavonii species in Wistar rats. Colombia Médica, 41(3), 256–266.

154. Omojate Godstime, C., Enwa Felix, O., Jewo Augustina, O., & Eze

Christopher, O. (2014). Mechanisms of antimicrobial actions of phytochemicals

against enteric pathogens–a review. J Pharm Chem Biol Sci, 2(2), 77–85.

155. Onwusonye, J. C., Uwakwe, A., Patrick, A., & Iwuanyanwu, K. C. (2014).

Acute and sub-acute toxicity studies of methanol leaf extracts of Annona squamosa

Linn. In mice. Sky J Biochem Res, 3(7), 53–59.

156. Ozogul, Y., Durmuş, M., Balıkcı, E., Ozogul, F., Ayas, D., & Yazgan, H.

(2011). The effects of the combination of freezing and the use of natural antioxidant

technology on the quality of frozen sardine fillets (Sardinella aurita). International

Journal of Food Science & Technology, 46(2), 236–242.

157. Pal, D. K., & Sampath Kumar, P. (1995). Changes in the physico-chemical

and biochemical compositions of custard apple (Annona squamosa L.) fruits during

growth, development and ripening. Journal of Horticultural Science, 70(4), 569–572.

142

158. Pan, C., Chen, S., Hao, S., & Yang, X. (2019). Effect of low-temperature

preservation on quality changes in Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei: a

review. In Journal of the Science of Food and Agricultu, 99(14), 6121–6128).

159. Pandey, N., & Barve, D. (2011). Phytochemical and pharmacological review

on Annona squamosa Linn. International Journal of research in pharmaceutical and

biomedical sciences, 2(4), 1404-1412.

160. Papuc, C., Goran, G. V., Predescu, C. N., Nicorescu, V., & Stefan, G. (2017).

Plant polyphenols as antioxidant and antibacterial agents for shelf‐life extension of

meat and meat products: Classification, structures, sources, and action

mechanisms. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 16(6), 1243-

1268. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12298

161. Pardio, V. T., Waliszewski, K. N., & Zuñiga, P. (2011). Biochemical,

microbiological and sensory changes in shrimp (Panaeus aztecus) dipped in different

solutions using face-centred central composite design. International Journal of Food

Science and Technology, 46(2), 305–314. https://doi.org/10.1111/j.1365-

2621.2010.02474.x

162. Pari, L., & Murugan, P. (2011). Protective role of tetrahydrocurcumin against

erythromycin estolate-induced hepatotoxicity. Elsevier, 49(5), 481–486.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661803003712

163. Park, M. K., & Kim, C. H. (2009). Extraction of polyphenols from apple peel

using cellulase and pectinase and estimation of antioxidant activity. Journal of the

Korean Society of Food Science and Nutrition, 38(5), 535–540.

164. Pearson, C. M. (1956). Development of arthritis, periarthritis and periostitis in

rats given adjuvants. Proceedings of the Society for Experimental Biology and

Medicine, 91(1), 95–101.

165. Pereira, A. L. F., Almeida, F. D. L., Lima, M. A., da Costa, J. M. C., &

Rodrigues, S. (2014). Spray-drying of probiotic cashew apple juice. Food and

Bioprocess Technology, 7(9), 2492–2499.

143

166. Phan, T. H., & Nguyễn, M. H. (2019). Tối ưu hoá quá trình lên men rượu dịch

quả mãng cầu ta bằng Saccharomyces cerevisiae sử dụng phương pháp bề mặt đáp

ứng. Tạp Chí Nông Nghiệp và Phát Triển, 18(5), 70–78.

167. Phú, T. M., Duyên, H. T. K., Hagiwara, T., Hạ, N. T. N., Đào, N. L. A., &

Thịnh, N. Q. (2020). Ảnh hưởng của dịch chiết cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus

Schum. et Phonn) đến chất lượng cá bớp phi lê (Rachycentron canadum) trong điều

kiện bảo quản lạnh. Tạp Chí Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ, 56(CĐ Thủy sản),

255–265. https://doi.org/10.22144/ctu.jsi.2020.062

168. Piljac-Žegarac, J., & Šamec, D. (2011). Antioxidant stability of small fruits in

postharvest storage at room and refrigerator temperatures. Food Research

International, 44(1), 345–350. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2010.09.039

169. Puri, M., Sharma, D., & Colin, J. B. (2012). Enzyme-assisted extraction of

bioactives from plants. Elsevier, 30(1), 37–44.

170. Quek, S. Y., Chok, N. K., & Swedlund, P. (2007). The physicochemical

properties of spray-dried watermelon powders. Chemical Engineering and

Processing: Process Intensification, 46(5), 386–392.

171. Quiles-Carrillo, L., Mellinas, C., Garrigos, M. C., Balart, R., & Torres-Giner,

S. (2019). Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Phenolic Compounds

with Antioxidant Activity from Carob Pods. Food Analytical Methods, 12(11), 2480–

2490. https://doi.org/10.1007/s12161-019-01596-3

172. Quoc, L. P. T., & Muoi, N. v. (2018). Physicochemical properties of

Polygonum multiflorum Thunb. root powder produced with different carrier agents.

Chemical Industry and Chemical Engineering Quarterly, 24(2), 93–100.

173. Restell, T. I., Porfirio, L. C., Souza, A. S. D., & Silva, I. S. (2014). Hematology

of Swiss mice (Mus musculus) of both genders and different ages. Acta Cirurgica

Brasileira, 29(05), 306–312. https://doi.org/https://doi.org/10.1590/S0102-

86502014000500004

174. Routray, W., & Orsat, V. (2012). Microwave-Assisted Extraction of

Flavonoids: A Review. Food and Bioprocess Technology, 5(2), 409–424.

144

175. Roy, N., & Sasikala, S. (2016). Influence of pre-treatment on secondary

metabolites and hypo-glycemic activity of custard apple (Annona Squamosa) peel.

Malaysian Journal of Nutrition, 22(3), 433–442.

176. Sathishkumar R, Vijayakumar R, Ranjithkumar R, Veerappan C, Ramya P,

Dina P, Jagannathan S, & Rahul G. P. (2012). Effect of Elaeocarpus sphaericus in

freund’s complete adjuvant (fca) induced rheumatoid arthritis in albino rats. Indo-

Global Research Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(3), 378–382.

177. Sato, M., Ramarathnam, N., Suzuki, Y., Ohkubo, T., Takeuchi, M., & Ochi,

H. (1996). Varietal Differences in the Phenolic Content and Superoxide Radical

Scavenging Potential of Wines from Different Sources. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 44(1), 37–41. https://doi.org/10.1021/jf950190a

178. Sattler, W., Esterbauer, H., Glatter, O., & Steiner, W. (1989). The effect of

enzyme concentration on the rate of the hydrolysis of cellulose. Biotechnology and

Bioengineering, 33(10), 1221–1234. https://doi.org/10.1002/bit.260331002

179. Savage, P. B., Li, C., Taotafa, U., Ding, B., & Guan, Q. (2002). Antibacterial

properties of cationic steroid antibiotics. FEMS Microbiology Letters, 217(1), 1–7.

https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2002.tb11448.x

180. Saxena, S., Mishra, B. B., Chander, R., & Sharma, A. (2009). LWT - Food

Science and Technology Shelf stable intermediate moisture pineapple ( Ananas

comosus ) slices using hurdle technology. LWT - Food Science and Technology,

42(10), 1681–1687. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2009.05.009

181. Scalbert, A., Johnson, I. T., & Saltmarsh, M. (2005). Polyphenols:

antioxidants and beyond. The American Journal of Clinical Nutrition, 81(1), 215S-

217S.

182. Sewald, B. M., & Devries, J. (n.d.). Food product shelf life.

183. Shai, Y. (1999). Mechanism of the binding, insertion and destabilization of

phospholipid bilayer membranes by α-helical antimicrobial and cell non-selective

membrane-lytic peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,

1462(1–2), 55–70. https://doi.org/10.1016/S0005-2736(99)00200-X

145

184. Sharma, A., Sharma, A. K., Chand, T., Khardiya, M., & Agarwal, S. (2013).

Preliminary Phytochemical Screening of Fruit Peel Extracts of Annona Squamosa

Linn. Current Pharma Research, 4(1), 1038–1043.

185. Shen, L., Wang, P., Guo, J., & Du, G. (2013). Anti-arthritic activity of ethanol

extract of Fagopyrum cymosum with adjuvant-induced arthritis in rats.

Pharmaceutical Biology, 51(6), 783–789.

186. Shi, J., Arunasalam, K., Yeung, D., Kakuda, Y., Mittal, G., & Jiang, Y. (2004).

Saponin from edible legumes: chemistry, processing, and health benefits. Journal of

Medicinal Food, 7(1), 67–78. https://doi.org/10.1089/109662004322984734

187. Silva, E. M., Rogez, H., & Larondelle, Y. (2007). Optimization of extraction

of phenolics from Inga edulis leaves using response surface methodology. Separation

and Purification Technology, 55(3), 381–387.

188. Simić, V. M., Rajković, K. M., Stojičević, S. S., Veličković, D. T., Nikolić,

N., Lazić, M. L., & Karabegović, I. T. (2016). Optimization of microwave-assisted

extraction of total polyphenolic compounds from chokeberries by response surface

methodology and artificial neural network. Separation and Purification Technology,

160, 89–97. https://doi.org/10.1016/j.seppur.2016.01.019

189. Snekhalatha, U., Anburajan, M., Teena, T., Venkatraman, B., Menaka, M., &

Raj, B. (2012). Thermal image analysis and segmentation of hand in evaluation of

rheumatoid arthritis. In 2012 International Conference on Computer Communication

and Informatics, 1–6.

190. Sousa, A. S. D., Borges, S. v, Magalhães, N. F., Ricardo, H. v, & Azevedo, A.

D. (2008). Spray-dried tomato powder: reconstitution properties and colour.

Brazilian Archives of Biology and Technology, 51, 607-614.

191. Spigno, G., Tramelli, L., & Dante Marco, D. F. (2007). Effects of extraction

time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc

phenolics. Elsevier, 81(1), 200–208.

https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2006.10.021

146

192. Sripakdee, T., Sriwicha, A., Jansam, N., Mahachai, R., & Chanthai, S. (2015).

Determination of total phenolics and ascorbic acid related to an antioxidant activity

and thermal stability of the Mao fruit juice. International Food Research Journal,

22(2), 618–624.

193. Stils Jr, H. F. (2005). Adjuvants and antibody production: dispelling the myths

associated with Freund’s complete and other adjuvants. ILAR Journa, 46(3), 280–

293.

194. Sun, L., Sun, J., Liu, D., Fu, M., Yang, X., & Guo, Y. (2018). The preservative

effects of chitosan film incorporated with thinned young apple polyphenols on the

quality of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) fillets during cold storage:

Correlation between the preservative effects and the active properties of the film.

Food Packaging and Shelf Life, 17. https://doi.org/10.1016/j.fpsl.2018.04.006

195. SVGK Dowluru, K., Rao Duddukuri, G., sastry Yarla, N., Kaladhar, D., &

Sastry Yarla, N. (2015). Phytochemical analysis, antioxidant and antimicrobial

activities from raw fruit peel crude extracts of annona squamosa linn.

196. Takeoka, G. R., & Dao, L. T. (2003). Antioxidant constituents of almond hulls.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(2), 496–501.

197. Thakur, A., Singla, R., & Jaitak, V. (2015). Coumarin as anticancer agents: A

review on synthetic strategies, mechanism of action and SAR studies. European

Journal of Medicinal Chemistry, 101, 476–495.

198. Thierry, A., Tchatchou, D., Nana, P., Kamtchouing, P., Asonganyi, T., Acha,

A. E., Paulin, N., Aphrodite, C., Pierre, K., & Tazoacha, A. (2011). Subacute toxicity

study of the aqueous extract from Acanthus montanus., 7(1), 11–15.

199. Thủy, L. T. M., & Thơm, N. V. (2018). Nghiên cứu sự ảnh hưởng của dịch

chiết lá dứa (Pandanus amaryllifolius) đến chất lượng tôm sú (Penaeus monodon) tẩm

bột bảo quản lạnh. In Can Tho University, Journal of Science.

200. TIS. (1986). Thai Industrial Standard for Quick Frozen Shrimps or Prawns.

TIS 115-2529, Bangkok, Thailand.

147

201. Tolun, A., Altintas, Z., & Artik, N. (2016). Microencapsulation of grape

polyphenols using maltodextrin and gum arabic as two alternative coating materials:

Development and characterization. Journal of Biotechnology, 239, 23–33.

202. Tonon, R. v, Brabet, C., & Hubinger, M. D. (2010). Anthocyanin stability and

antioxidant activity of spray-dried açai (Euterpe oleracea Mart.) juice produced with

different carrier agents. Food Research International, 43(3), 907–914.

203. Tonon, R. v, Brabet, C., Pallet, D., Brat, P., & Hubinger, M. D. (2009).

Physicochemical and morphological characterisation of açai (Euterpe oleraceae

Mart.) powder produced with different carrier agents. International Journal of Food

Science & Technology, 44(10), 1950-1958. https://doi.org/10.1111/j.1365-

2621.2009.02012.x

204. Tonon, R. v, Freitas, S. S., & Hubinger, M. D. (2011). Spray drying of açai

(Euterpe oleraceae Mart.) juice: effect of inlet air temperature and type of carrier

agent. Journal of Food Processing and Preservation, 35(5), 691–700.

205. Trio, P. Z., You, S., He, X., He, J., Sakao, K., & Hou, D. X. (2014).

Chemopreventive functions and molecular mechanisms of garlic organosulfur

compounds. Food & Function, 5, 833-844.

206. Trung, M. T., Van, N. V. T., & Hà, N. C. (2014). Nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng đến khả năng trích ly dịch quả sơ ri (Magnolyophyta glabra) bằng enzyme.

Tạp Chí Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ, 42, 11–18.

207. Tuan, P. M., Anh, H. T. Van, Thi, L., District, G. V., ..,Chi, H., Phu, T. (2016).

Extraction and encapsulation of polyphenols from guava leaves. 17(1).

208. Tuyen, C. K., Nguyen, M. H., & Roach, P. D. (2010). Effects of spray drying

conditions on the physicochemical and antioxidant properties of the Gac (Momordica

cochinchinensis) fruit aril powder. Journal of Food Engineering, 98(3), 385–392.

209. Utami, A. D. (2018). Study on Acute Oral Toxicity of Ethanolic Extract of

Annonasquamosa Leaves in Mice (Musmusculus). Indonesian Journal of

Pharmaceutical and Clinical Research, 1(1), 56–63.

148

210. Vanharanta, M., Voutilainen, S., Lakka, T. A., Van Der Lee, M., Adlercreutz,

H., & Salonen, J. T. (1999). Risk of acute coronary events according to serum

concentrations of enterolactone: A prospective population-based case-control study.

Lancet, 354(9196), 2112–2115. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(99)05031-X

211. Voigt, G. L., & Swist, S. L. (2011). Hematology techniques and concepts for

veterinary technicians. John Wiley & Sons.

212. Vyas, K., Manda, H., Sharma, R. K., & Singhal, G. (2012). AN UPDATE

REVIEW ON ANNONA SQUAMOSA. International Journal of Pharmacy &

Therapeutics, 3(2), 107.

213. Wang, J., Sun, B., Cao, Y., Tian, Y., & Li, X. (2008). Optimisation of

ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran. Food

Chemistry, 106(2), 804–810. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.06.062

214. Wang, L., & Weller, C. L. (2006). Recent advances in extraction of

nutraceuticals from plants. Trends in Food Science & Technology, 17(6), 300–312.

215. Wang, Q., Lei, J., Ma, J., Yuan, G., & Sun, H. (2018). Effect of chitosan-

carvacrol coating on the quality of Pacific white shrimp during iced storage as

affected by caprylic acid. International Journal of Biological Macromolecules, 106,

123–129. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.07.180

216. Wang, Y., Lu, Z., Lv, F., & Bie, X. (2009). Study on microencapsulation of

curcumin pigments by spray drying. European Food Research and Technology,

229(3), 391-396.

217. Webster, S. H., & Liljegren, E. J. (1955). Organ: Body‐weight ratios for

certain organs of laboratory animals. III. White Swiss mouse. American Journal of

Anatomy, 97(1), 129–153.

218. Wiegand, I., Hilpert, K., & Hancock, R. E. (2008). Agar and broth dilution

methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial

substances. Nature Protocols, 3(2), 163-175.

219. Wolford, S. T., Schroer, R. A., Gohs, F. X., Gallo, P. P., Brodeck, M., Falk,

H. B., & Ruhren, R. (1986). Reference range data base for serum chemistry and

149

hematology values in laboratory animals. Journal of Toxicology and Environmental

Health, 18(2), 161–188. https://doi.org/10.1080/15287398609530859

220. Wong, L.-W., Loke, X.-J., Chang, C.-K., Ko, W.-C., Hou, C.-Y., & Hsieh, C.-

W. (2020). Use of the plasma-treated and chitosan/gallic acid-coated polyethylene

film for the preservation of tilapia (Orechromis niloticus) fillets. Elsevier.

221. Wong, R. W. K., Hägg, U., Samaranayake, L., Yuen, M. K. Z., Seneviratne,

C. J., & Kao, R. (2010). Antimicrobial activity of Chinese medicine herbs against

common bacteria in oral biofilm. A pilot study. International Journal of Oral and

Maxillofacial Surgery, 39(6), 599–605. https://doi.org/10.1016/j.ijom.2010.02.024

222. Wong-Paz, J. E., Muñiz-Márquez, D. B., Aguilar-Zárate, P., Ascacio-Valdés,

J. A., Cruz, K., Reyes-Luna, C., Rodríguez, R., & Aguilar, C. N. (2017). Extraction

of Bioactive Phenolic Compounds by Alternative Technologies. Elsevier, , 89 (2)),

229–252). https://doi.org/10.1016/b978-0-12-811521-3.00005-3

223. Xiao, Y. (2000). Modelling temperature-dependency in biology by

generalizing temperature coefficient Q10. Ecological Modelling, 127(2–3), 283–290.

224. Yam, K. L., & Papadakis, S. E. (2004). A simple digital imaging method for

measuring and analyzing color of food surfaces. Journal of Food Engineering, 61(1).

225. Yamasaki, K., Sawaki, M., Noda, S., Imatanaka, N., & Takatsuki, M. (2002).

Subacute oral toxicity study of ethynylestradiol and bisphenol A, based on the draft

protocol for the “Enhanced OECD Test Guideline no. 407.” Archives of Toxicology,

76(2), 65–74. https://doi.org/10.1007/S00204-001-0319-1

226. Yang, C. S., Sang, S., Lambert, J. D., & Lee, M. J. (2008). Bioavailability

issues in studying the health effects of plant polyphenolic compounds. Molecular

Nutrition and Food Research, 52(1), 139–151.

227. Yap, J. Y., Hii, C. L., Ong, S. P., Lim, K. H., Abas, F., & Pin, K. Y. (2020).

Effects of drying on total polyphenols content and antioxidant properties of Carica

papaya leaves. Journal of the Science of Food and Agriculture, 100(7), 2932–2937.

150

228. Yasuko, K., Tomohiro, N., Sei-Itsu, M., Ai-Na, L., Yasuo, F., & Takashi, T.

(1984). Caffeic acid is a selective inhibitor for leukotriene biosynthesis. Biochimica

et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism, 792(1), 92–97.

229. Yoon, J. H., & Baek, S. J. (2005). Molecular targets of dietary polyphenols

with anti-inflammatory properties. Yonsei Medical Journal, 46(5), 585–596.

230. Youssef, D., & El-Adawi, H. (2006). Study on grape seeds extraction and

optimization: An approach. Journal of Applied Sciences, 6(14), 2944–2947.

231. Yuan, G., Lv, H., Tang, W., Zhang, X., & Sun, H. (2016). Effect of chitosan

coating combined with pomegranate peel extract on the quality of Pacific white

shrimp during iced storage. Food Control, 59.

232. Yudhani, R. D., Pesik, R. N., Azzahro, S., Anisa, A. F., & Hendriyani, R.

(2019). Renal function parameter on acute toxicity test of kapulaga (Amomum

cardamom) seed extract in rat. Materials Science and Engineering, 578(1), 012053.

233. Zembower, T. R., Noskin, G. A., Postelnick, M. J., Nguyen, C., & Peterson,

L. R. (1998). The utility of aminoglycosides in an era of emerging drug resistance.

International Journal of Antimicrobial Agents, 10(2), 95–105.

234. Zhang, B., Yang, R., & Liu, C. Z. (2008). Microwave-assisted extraction of

chlorogenic acid from flower buds of Lonicera japonica Thunb. Separation and

Purification Technology, 62(2), 480–483.

235. Zhang, W., Zhang, J., Zhang, M., & Nie, L. (2014). Protective effect of

Asarum extract in rats with adjuvant arthritis. Protective Effect of Asarum Extract in

Rats with Adjuvant Arthritis, 8(5), 1638-1642.

236. Zhang, Z., Li, D., Wang, L., Ozkan, N., … X. C.-S. and, & 2007, undefined.

(n.d.). Optimization of ethanol–water extraction of lignans from flaxseed. Elsevier.

237. Zhao, C. N., Zhang, J. J., Li, Y., Meng, X., & Li, H. bin. (2018). Microwave-

assisted extraction of phenolic compounds from melastoma sanguineum fruit:

Optimization and identification. Molecules, 23(10).

151

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Sấy vỏ mãng cầu ta

Nhiệt độ (0C)

Thời gian

(giờ)

68,23±3,58l

68,23±3,58p

68,23±3,58v

0,5

50,45±1,45k

54,33±0,68o

60,44±0,6u

62,05±0,17u

45,51±0,57i

49,70±0,65n

53,46±0,67t

57,45±1,00t

1,5

36,52±0,8h

44,68±0,61m

49,75±0,81p

52,83±1,16p

28,33±1,16g

38,42±0,4l

41,92±0,67o

43,59±1,51o

2,5

16,81±0,14f

30,99±0,29k

32,85±0,95n

37,57±0,44n

11,48±0,47e

24,48±0,63i

29,63±0,8m

32,38±0,46m

3,5

8,43±0,24d

17,78±0,28h

25,96±0,87l

26,40±1,44l

5,59±0,57c

12,30±1,08g

19,66±0,76k

20,26±0,47k

4,5

2,80±0,21b

9,57±0,86f

15,60±0,42f

15,72±0,29j

1,60±0,1a

8,24±0,08e

12,34±0,34e

13,85±0,84i

5,5

1,45±0,08a

6,60±0,25d

8,54±0,43d

11,62±0,45h

2,44±0,06c

5,56±0,56c

10,09±0,88g

6,5

1,84±0,07b

2,19±0,24b

9,22±0,14f

1,51±0,05a

1,63±0,22a

8,18±1,19ef

7,5

1,51±0,01a

1,44±0,16a

7,45±0,21e

1,31±0,12a

6,33±0,33d

8,5

4,98±0,42c

3,94±0,07b

9,5

2,45±1,25a

1,39±0,15a

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng 1.1. Độ ẩm nguyên liệu theo thời gian sấy (%)

152

Bảng 1.2 Hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxy hóa theo nhiệt độ sấy

50 70 80 60

Nhiệt độ sấy (0C)

34,00±0,3a 48,26±0,45b 46,32±0,52c 44,36±0,58d TPC (mg GAE/g CK)

193,45 ±0,67a 240,22±1,10b 224,42±0,49c 191,34±1,00d

TEAC (umol TE/g CK, DPPH)

Các giá trị trong một hàng có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

TEAC (umol TE/g CK, ABTS) 292,74±2,25a 366,31±2,75b 349,12±0,51c 300,33±0,84d

Phụ lục 2. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ khuấy từ

Bảng 2.1. Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính

kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa Thời gian Hàm lượng TPC (mol TE/g CK) (phút) (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

30 84,19 ±1,1a 511,97 ± 12,55a 903,80 ± 29,45a

40 86,44 ± 1,11b 511,70± 9,32a 968,21 ± 24,42bc

50 91,15 ± 1,45c 531,58±3,74b 989,51 ± 25,45c

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05.

60 87,04 ± 0,75b 500,45 ±5,98a 928,21 ± 34,34ab

153

Bảng 2.2. Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính

kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa Nồng độ Hàm lượng TPC (mol TE/g CK) ethanol (mg GAE/g CK) (%) DPPH ABTS

40 85,88 ± 2,12a 486,16 ± 14,0a 815,10 ± 15,46a

50 93,71 ± 2,07b 529,03 ± 13,52b 968,67 ± 10,63b

60 88,09 ± 2,34a 466,84 ± 13,57a 793,06 ± 18,83a

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

70 86,99 ± 1,77a 476,26 ± 10,34a 778,98 ± 17,54a

Bảng 2.3. Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol và hoạt

tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa Tỉ lệ NL/DM Hàm lượng TPC (mol TE/g CK) (g/mL) (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

1 : 15 87,54a  2,12a 450,70  14,53a 642,35  14,32a

1 : 20 91,56  0,99b 451,59  6,90a 740,96  18,31b

1 : 25 95,60  0,51c 541,01  9,73b 896,92  17,92c

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

1 : 30 89,18  2,91ab 453,77  9,19a 799,21  11,03d

154

Bảng 2.4. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy

hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa Nhiệt độ Hàm lượng TPC (mol TE/g CK) (oC) (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

40 85,80  1,41a 479,51  11,42a 814,17 12,47a

50 90,19  1,54b 479,85  9,41a 899,94 12,89b

60 95,47  2,19c 527,82  14,40b 1080,91 24,53c

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

70 93,66  2,93bc 509,63  4,83b 970,65  13,09d

Phụ lục 3. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE)

Bảng 3.1. Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa (mmol TE/g CK)

Nồng độ ethanol (%) Hàm lượng TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

40 82,06 ±2,07a 489,90± 6,65a 1119,52 ±7,05a

50 91,39 ±1,17b 536,04 ± 20,25b 1159,12 ± 24,84a

60 96,27± 0,74c 589,46± 17,39c 1242,98 ±21,79b

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

70 89,06 ± 0,57b 582,21± 55,65c 1122,48 ± 42,14a

155

Bảng 3.2. Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa

Tỉ lệ nguyên liệu - dung môi (g/mL) Hàm lượng TPC (mg GAE/g CK) Hoạt tính kháng oxy hóa (mmol TE/g CK)

1 : 20 92,09 ± 1,92a DPPH 550,22 ± 25,57a ABTS 1267,39 ± 21,69a

1 : 25 96,12 ± 0,21b 617,35± 15,54b 1361,38 ± 19,91b

1 : 30 91,16 ± 2,13ac 587,55 ± 13,57b 1298,38 ± 9,07a

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

1 : 35 88,94± 0,61c 546,99 ± 4,37a 1261,69± 30,99a

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa (mmol TE/g CK) Thời gian (phút) Hàm lượng TPC (mg GAE/g CK) DPPH ABTS

1 92,13±0,56 a 549,03 ±4,38a 1159,24 ±13,72a

3 95,02±0,74 b 561,38 ±9,00a 1236,51 ±8,29b

5 98,63c ±1,05c 603,02±18,73b 1283,58 ±11,52c

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

7 95,37b ±0,83b 587,59d ± 6,91b 1180,64±15,47a

156

Bảng 3.4 Ảnh hưởng công suất trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa

Công suất (W) Hàm lượng TPC (mg GAE/g CK) Hoạt tính kháng oxy hóa (mmol TE/g CK)

90,07± 1,06a DPPH 518,29 ± 6,94 a ABTS 1009,40±5,44 a 95

91,40 ± 1,67a 573,94 ± 11,41b 1198,78± 11,32 b 166

97,62 ± 1,72b 613,15 ± 13,89c 1279,37 ± 60,61 c 214

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,0

91,76±1,89a 463,51± 2,21d 1121,40 ± 11,75 c 284

Bảng 3.5. số liệu xử lý thống kê của mô hình tối ưu hóa trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ vi sóng

Least Squares Fit Response Y1 Actual by Predicted Plot

0.968259 0.956865 0.696132 94.40519 54

Summary of Fit RSquare RSquare Adj Root Mean Square Error Mean of Response Observations (or Sum Wgts)

157

DF Sum of Squares 576.53318 14 18.89937 39 595.43255 53

Mean Square 41.1809 0.4846

F Ratio 84.9794 Prob > F <.0001*

DF Sum of Squares 12.994039 10 5.905333 29 18.899372 39

Mean Square 1.29940 0.20363

F Ratio 6.3811 Prob > F <.0001* Max RSq

Analysis of Variance Source Model Error C. Total Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error Response Y2 Actual by Predicted Plot

0.92794 0.902073 28.12368 520.135 54

DF Sum of Squares 397225.34 14 30846.72 39 428072.05 53

Mean Square 28373.2 790.9

F Ratio 35.8727 Prob > F <.0001*

DF Sum of Squares 27154.247 10 3692.469 29 30846.715 39

Mean Square 2715.42 127.33

F Ratio 21.3265 Prob > F <.0001* Max RSq

Summary of Fit RSquare RSquare Adj Root Mean Square Error Mean of Response Observations (or Sum Wgts) Analysis of Variance Source Model Error C. Total Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error

158

Response Y3 Actual by Predicted Plot

0.915536 0.885215 20.65585 1292.281 54

DF Sum of Squares 180365.09 14 16639.91 39 197005.00 53

Mean Square 12883.2 426.7

F Ratio 30.1952 Prob > F <.0001*

DF Sum of Squares 15159.730 10 1480.179 29 16639.909 39

Mean Square 1515.97 51.04

F Ratio 29.7013 Prob > F <.0001* Max RSq

Summary of Fit RSquare RSquare Adj Root Mean Square Error Mean of Response Observations (or Sum Wgts) Analysis of Variance Source Model Error C. Total Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error

159

Phụ lục 4. Xây dựng mô hình shelf – life của dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta

Bảng 4.1. Sự suy giảm TPC của dịch chiết theo nhiệt độ

Hàm lượng polyphenol tổng (TPC), (mgGAE/gDW) Ngày TPC – 60 % TPC – 60 TPC – 70 % TPC – 70

94,49 ± 0,23 a 100,00 94,49± 0,23 a 100,00 0

95,02 ± 0,18b 100,56 92,75 ± 0,57 b 98,15 1

90,33± 11c 95,60 - - 2

87,31 ± 0,50d 92,40 75, 02± 0,27 c 79,39 3

69,78± 0,31d 73,85 - - 4

74,87 ± 0,37e 79,23 - - 5

62,32± 0,61e 65,96 - - 6

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

65,73± 0,53f 69,56 60,33± 0,12f 63,85 7

Bảng 4.2. Sự suy giảm TEAC theo DPPH của dịch chiết

Hoạt tính kháng oxy hóa (TEAC – DPPH) (𝜇mol TE/g DW) Ngày TEAC – 60 % TEAC – 60 TEAC – 70 % TEAC – 70

624,59± 2,36 a 100 624,59 ± 2,36a 100,00 0

627,71± 1,97a 100,50 579,08± 1,2b 92,71 1

568,69 ± 1,54b 91,05 - - 2

509,52± 1,63c 81,58 424,95± 1,84c 68,04 3

416,23 ± 4,04d 66,64 - - 4

413,87 ± 1,23 d 66,26 - - 5

360,51 ± 2,05e 57,72 - - 6

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

359,23± 1,09e 57,52 335,75 ± 3,78f 53,75 7

160

Bảng 4.3. Sự suy giảm TEAC theo ABTS của dịch chiết theo nhiệt độ

Hoạt tính kháng oxy hóa (TEAC – ABTS) (𝜇mol TE/g DW) Ngày TEAC – 60 % TEAC – 60 TEAC – 70 % TEAC – 70

1325,81 ± 5,44 a 100 1325,81± 5,44 a 100 0

1359,25 ± 4,81b 100,48 1253,96 ± 2,42b 92,69 1

1255,38 ± 6,02 c 92,80 - - 2

1096,57 ± 3,06d 81,06 1025,43 ± 0,42 c 75,80 3

- 879,90 ± 6,46 d 65,04 - 4

973,61 ± 2,10e 71,97 - - 5

- 837,96 ± 7,76 e 61,94 - 6

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

902,10± 2,03f 66,68 766,98± 1,24 f 56,70 7

Phụ lục 5. Xây dựng mô hình shelf – life cho bột sấy phun vỏ mãng cầu ta

Bảng 5.1 Sự suy giảm TPC của bột sấy phun GA 10% theo nhiệt độ

Hàm lượng polyphenol tổng (TPC), (mgGAE/gDW) Ngày TPC – 60 % TPC – 60 TPC – 70 % TPC – 70

66,27 ± 0,06 a 100,00 66,27± 0,06 a 100,00 0

67,40 ± 0,58 b 101,71 66,17 ± 0,09 a 99,84 1

63,55 ± 0,58 c 95,89 - - 2

61,52 ± 0,41 d 92,84 60,29 ± 0,05b 90,98 3

57,14 ± 0,09 c 86,22 - 4

- - 56,39 ± 0,17 e 85,10 5

51,35 ± 0,12d 77,49 - 6

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

50,53 ± 0,11e 76,25 55,17± 0,28 f 83,25 7

161

Bảng 5.2 Sự suy giảm TEAC theo DPPH bột sấy phun GA 10% theo nhiệt độ

Hoạt tính kháng oxy hóa (TEAC – DPPH) (𝜇mol TE/g DW) Ngày TEAC – 60 % TEAC – 60 TEAC – 70 % TEAC – 70

480,59 ± 4,50 a 100,00 480,59 ± 4,50a 100,00 0

485,13 ± 0,88ab 100,94 454,35 ± 2,10b 94,54 1

480,97 ± 2,95a 100,08 - - 2

464,32± 4,04c 96,61 437,08 ± 0,58 c 90,95 3

- 430,06 ± 1,55 d 89,49 - 4

441,57 ± 1,44d 91,88 - - 5

- 391,33 ± 1,9 e 81,43 - 6

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

408,65± 0,82e 85,03 375,63 ± 0,80 f 78,16 7

Bảng 5.3 Sự suy giảm TEAC theo ABTS bột sấy phun GA 10% theo nhiệt độ

Hoạt tính kháng oxy hóa (TEAC – ABTS) (𝜇mol TE/g DW) Ngày TEAC – 60 % TEAC – 60 TEAC – 70 % TEAC – 70

754,32 ± 3,69 a 100,00 754,32 ± 3,69 a 100,00 0

761,39 ± 0,34b 100,94 744,69 ± 4,86 b 98,72 1

737,65 ± 1,84c 97,79 - - 2

725,20 ± 4,35 d 96,14 671,52 ± 5,35 c 89,02 3

- 646,08 ± 2,01 d 85,65 - 4

671,24 ± 24,19 e 88,99 - - 5

- 609,35 ± 1,45 e 80,78 - 6

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

640,14 ± 2,69 f 84,86 587,51 ± 1,56 f 77,89 7

162

Phụ lục 6. Ứng dụng dịch chiết bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh

(4±10C)

Bảng 6.1. Sự thay đổi khối lượng (%) của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày) Mẫu khảo sát

M 3 2,27±0,37 Da 6 5,90± 0,01 Eb 9 6,84± 0,01 Ec 12 8,04 ± 0,01 Dd

M0 1,57± 0,25 Ca 2,63 ± 0,38 Db 6,15 ± 0,01 Dc 6,66 ± 0,04 Cd

M1 1,15 ± 0,01Ba 2,33 ± 0,14 Cb 4,13 ± 0,65 Cc 5,00 ± 0,64 Cd

M2 0,83± 0,01Ba 0,74 ± 0,01 Ab 3,04 ± 0,05 Bc 5,03 ± 0,01 Bd

M3 0,64± 0,02Aa 0,74 ± 0,01 Ac 2,04 ± 0,01Ac 3,83 ± 0,03 Ad

Các giá trị cùng một cột có ký tự in hoa khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05; Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

M4 0,79± 0,06Aa 1,49 ± 0,01 ABc 2,72 ± 0,25 Bc 3,83± 0,01 Ad

Bảng 6.2. Sự thay đổi giá trị pH của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày)

0 6,47 ± 0,04 Aa 6,48 ± 0,03 Aa 6,44 ± 0,05 Aa 6,47 ± 0,08 Aa 6,46± 0,01 Aa 6,47 ± 0,02 Aa 3 7,07 ± 0,05 Ab 6,96± 0,06 Ab 7,04 ± 0,09 Ab 7,05 ± 0,13 Ab 7,00 ± 0,04 Ab 7,05 ± 0,04 Ab 6 7,54 ± 0,02 Ec 7,47 ± 0,02 Dc 7,37 ± 0,02 Cc 7,34 ± 0,01 ABc 7,30 ± 0,04 Ac 7,34± 0,02 ABc 9 8,19 ± 0,06 Cd 7,97 ± 0,02 Bd 7,87 ± 0,02 Bd 7,73± 0,04 Ad 7,64 ± 0,10 Ad 7,65± 0,07 Ad 12 8,47± 0,03 De 8,33 ± 0,04 Ce 8,20± 0,01 Be 8,16± 0,02 Be 8,03± 0,04 Ae 8,05 ± 0,05 Ae Mẫu khảo sát M M0 M1 M2 M3 M4

163

Bảng 6.3 Sự thay đổi chỉ số PV (meq O2/kg) của các mẫu theo thời gian bảo quản

Mẫu khảo sát

0 0,65 ± 0,05 Aa

3 3,6 ± 0,09 Db

6 5,30 ± 0,10 Dc

9 6,77 ± 0,25 Dd

12 8,03 ± 0,15 De

0,63± 0,04 Aa

2,71± 0,48 Cb

3,65± 0,35 Cc

5,67 ± 0,29 Cd

6,73 ± 0,25 Ce

0,68 ± 0,03 Aa

2,12 ± 0,03 Bb

3,60 ± 0,02 BCc

4,32 ± 0,25 Bd

5,73± 0,49 Be

0,67 ± 0,06 Aa

2,17± 0,18 Bb

3,32 ± 0,03 Bc

4,27 ± 0,25 Bd

5,73 ± 0,25 Be

0,65 ± 0,05 Aa

1,28 ± 0,03 Ab

2,35 ± 0,15 Ac

3,33 ± 0,16 Ad

4,93 ± 0,15 Ae

0,65 ± 0,05 Aa

1,57 ± 0,06 Ab

2,42± 0,16 Ac

3,5± 0,43 Ad

4,90± 0,10 Ae

M M0 M1 M2 M3 M4

Thời gian bảo quản (ngày)

Bảng 6.4 Sự thay đổi chỉ số TVB–N (mg N/100g) của các mẫu theo thời gian bảo

Thời gian bảo quản (ngày)

Mẫu khảo sát

0 5,88 ± 0,28 Ba

3 10,18Eb ± 0,43

6 20,08Ec ± 0,43

9 47,07Fd ± 0,56

12 49,97Fe ± 0,43

5,32 ± 0,28 Ba

9,06Db ± 0,58

18,12Dc ± 0,16

44,46Ed ± 0,43

46,32Ee ± 0,43

5,23 ± 0,43 Ba

8,13Cb ± 0,28

16,53BCc ±0,28

41,56Dd ± 0,43

44,36De ± 0,43

4,48 ± 0,28 Aa

6,92Bb ± 0,16

16,90Cc ± 0,58

39,79Cd ± 0,56

42,59Ce ± 0,56

4,01 ± 0,58 Aa

5,79Ab ± 0,32

15,41Ac ± 0,28

26,25Ad ± 0,43

28,39Ae ± 0,43

5,32 ± 0,28 Ba

6,54Bb ± 0,33

16,16Bc ± 0,16

34,18Bd ± 0,56

37,36Be ± 0,43

quản

164

Bảng 6.5 Sự thay đổi chỉ số TBARs (mg MDA/kg) của các mẫu theo thời gian bảo

Thời gian bảo quản (ngày)

Mẫu khảo sát

M M0 M1 M2 M3 M4

0 0,54± 0,06Aa 0,54 ± 0,06Aa 0,56 ± 0,03Aa 0,52 ± 0,09Aa 0,52± 0,03Aa 0,52 ± 0,03Aa

6 3 2,43 ± 0,09 Cd 3,04 ± 0,06 Ad 1,30 ± 0,09 Cb 2,11 ± 0,09 Ec 2,86± 0,10 Ce 0,96 ± 0,07 Bb 1,79 ± 0,06 Dc 2,36 ± 0,06 Cd 2,43 ± 0,03 Be 2,15± 0,14 Bd 0,88 ± 0,06 Bb 1,54 ± 0,03 Dc 1,41 ± 0,03 Bc 0,88 ± 0,06 Bb 2,47± 0,06 Be 2,02 ± 0,12 Bd 0,86 ± 0,03 Ac 1,45 ± 0,10 Ad 1,73 ± 0,06 Ae 0,73 ± 0,03Ab 1,50 ± 0,10 Ad 1,75 ± 0,09 Ae 0,88 ± 0,06 Ac 0,73± 0,03Ab

quản

Bảng 6.6 Sự thay đổi giá trị L* của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày)

9 6 3 0

Mẫu khảo sát M M0 M1 M2 M3 M4 12 48,54± 0,02 Fe 47,63± 0,01 Ed 46,19 ± 0,01Fc 45,59± 0,01Fb 43,61± 0,02Fa 47,13± 0,02 Ee 46,88± 0,02 Ed 46,01± 0,01Ec 44,59± 0,01Eb 43,09± 0,02Ea 46,27± 0,02 De 45,81± 0,02 Cd 45,69 ± 0,01Dc 44,27± 0,02Db 42,79± 0,02 Da 46,11± 0,02 De 45,79± 0,02 Cd 44,21± 0,01 Cc 43,98± 0,02Cb 41,94 ± 0,02 Ca 45,57± 0,03 Ae 45,27± 0,02 Ad 43,77± 0,02 Ac 43,02 ± 0,02Ab 41,45± 0,02 Aa 45,65± 0,01Ae 45,45± 0,02 Bd 43,96 ± 0,02Bc 43,48± 0,02Bb 41,84± 0,02 Ba

Bảng 6.7 Sự thay đổi giá trị a* của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày)

0 3 6 9 12

Các giá trị cùng một cột có ký tự in hoa khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05;

Mẫu khảo sát M M0 M1 M2 M3 M4 -0,67± 0,03 Da -0,82± 0,04 Ca 0,83± 0,01 Ca -0,93± 0,03 Ba -1,03± 0,03 Aa -0,93± 0,03 Ba 0,04 ± 0,03 Eb -0,37 ± 0,04 Db -0,65± 0,03Cb -0,70± 0,04 BCb -0,87± 0,03 Ab -0,71 ± 0,03 Bb 0,15 ± 0,05 Ec 0,25 ± 0,04 Ed -0,15± 0,04 Dc 0,03± 0,03 Dd -0,44 ± 0,03 Cc -0,48 ± 0,02 Cc -0,64± 0,03 Ac -0,57± 0,04 Bc 2,92 ± 0,06 Fe 2,78± 0,03 Ee -0,23± 0,05 Cd 2,62 ± 0,03 De -0,45± 0,03 Bc 1,34 ± 0,03 Cd -0,55± 0,04 Ad 0,50 ± 0,03 Ae -0,46± 0,04 Bd 0,77 ± 0,03 Be

165

Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Bảng 6.8 Sự thay đổi giá trị b* của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày)

0 3 6 9 12

3,60 ± 0,03 Ea 3,25± 0,05 Da 3,22± 0,07 Da 2,72 ± 0,03 Ca 2,21 ± 0,06 Aa 2,52 ± 0,04 Ba 4,40± 0,05 Eb 5,34± 0,05 Ec 4,69 ± 0,07 Dc 4,39 ± 0,03 Eb 4,21 ± 0,07 Db 4,44 ± 0,06 Cc 4,04± 0,06 Cb 4,39± 0,03 Cc 2,35 ± 0,06 Ab 3,93 ± 0,05 Ac 3,77± 0,04 Bc 3,65 ± 0,06 Bb 9,60± 0,06 Fd 14,04 ± 0,08 Fe 9,34 ± 0,06 Ed 13,14± 0,07 Ee 8,73± 0,03 Dd 12,61± 0,03 De 8,31± 0,03 Cd 11,11 ± 0,05 Ce 8,39± 0,05 Ae 8,10± 0,03 Ad 10,24± 0,07 Be 8,11± 0,03 Bd Mẫu khảo sát M M0 M1 M2 M3 M4

Bảng 6.9 Sự thay đổi giá trị E* của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày) Mẫu khảo sát

Các giá trị cùng một cột có ký tự in hoa khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05;

Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

M M0 M1 M2 M3 M4 3 6 5,24 ± 0,06 Da 8,94 ± 0,07 Fb 8,75 ± 0,07 Eb 5,47 ± 0,09 Ea 5,16 ± 0,06 CDa 8,32 ± 0,09 Db 6,97 ± 0,08 Cb 4,59 ± 0,05 Aa 5,51 ± 0,09 Ab 5,05 ± 0,10 Ca 6,78 ± 0,10 Bb 4,75 ± 0,04 Ba 9 12 6,76 ± 0,06 Dc 12,10 ± 0,06 Fd 11,27 ± 0,12 Fd 6,65 ± 0,09 Dc 5,89 ± 0,09 Ac 10,59 ± 0,10 Dd 9,64 ± 0,02 Dd 6,00 ± 0,03 Ac 7,59 ± 0,09 Ad 6,44 ± 0,07 Cc 8,77 ± 0,10 Ad 6,01± 0,06 Bc

Bảng 6.10 Sự thay đổi độ cứng (N) của các mẫu theo thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày)

10,59± 1,27 Ad

9,22 ± 0,17 Ac

7,12± 0,15 Ab

4,50 ± 0,29 Ba

3,42 ± 0,18 Ba

10,92 ± 0,78 Ad

8,81± 0,22 Ad

7,20± 0,27 Ac

5,09 ± 0,20 Cb

3,73 ± 0,15 Ca

10,72± 1,58 Ad

8,76± 0,66 Ac

7,20 ± 0,13 Ab

5,28 ± 0,10 Ca

3,95± 0,13 Ca

11,07± 1,34 Ad

9,25 ± 0,11 Ac

7,64 ± 0,04 Bb

5,58 ± 0,13 Da

5,00 ± 0,12 Ea

11,21± 0,63 Ad

8,95 ± 0,35 Ad

7,28 ± 0,23 Ac

5,35 ± 0,06 CDb

4,39 ± 0,07 Da

0 10,73 ± 1,26 Ad 3 8,71± 0,62 Ac 6 7,03± 0,08 Ab 9 4,13 ± 0,09 Aa 12 3,09± 0,18 Aa

Các giá trị cùng một cột có ký tự in hoa khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05;

Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Mẫu khảo sát M M0 M1 M2 M3 M4

166

Bảng 6.11 Sự thay đổi độ đàn hồi (mm) của các mẫu theo thời gian bảo quản

0,74 ± 0,02 ABe 0,62 ± 0,03 Ad

6 0,49 ± 0,02 Ac

9 0,34 ± 0,02 Ab

12 0,24 ± 0,04 Aa

Thời gian bảo quản (ngày)

0,75 ± 0,03 Ad

0,63± 0,05 Ac

0,51 ± 0,01 ABb 0,37 ± 0,03 Aa

0,32 ± 0,02 Ba

Mẫu khảo sát M

0,69 ± 0,02 Abd

0,66 ± 0,02 Ad

0,56 ± 0,05 Bc

0,45 ± 0,04 Bb

0,35 ± 0,03 Ba

0,74 ± 0,06 ABc 0,69 ± 0,07 Abc

0,56 ± 0,03 Bb

0,51± 0,04 Cb

0,36 ± 0,03 Ba

0,76 ± 0,02 Bc

0,71 ± 0,07 Abc

0,65 ± 0,01 Cb

0,55 ± 0,03 Ca

0,52 ± 0,02 Ca

0,74 ± 0,04 ABd

0,71± 0,05 Ad

0,63 ± 0,04 Cc

0,55 ± 0,01 Cb

0,47 ± 0,02 Da

Các giá trị cùng một cột có ký tự in hoa khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05;

Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05.

Phụ lục 7. Ứng dụng dịch chiết mãng cầu trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột

Bảng 7.1 Trọng lượng cơ thể chuột đối chứng và chuột tiêm CFA trong 12 ngày

Trọng lượng cơ thể (g) Ngày

FCA Đối chứng

33,85 ±2,8a 0 32,34±1,8a

30,12±2,1a 3 32,95 ±2,0a

30,78 ±2,3a 6 33,34 ±1,5a

31,28 ±1,7a 9 33,73 ±2,3a

32,11±1,6a 12 34,83±1,8a

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

167

Bảng 7.2 Biến động trọng lượng cơ thể chuột thí nghiệm giai đoạn chữa bệnh

Tuần Trọng lượng cơ thể (g)

31,49±5,4a

31,56±0,35a

31,55±0,4a

31,51±5,3a

31,57±5,9a

Untreat ASL ASM ASH Mobic

31,08±6,6a

32,86±2,9a

33,78±3,6a

33,82±3,7a

33,16±5,4b

30,01±4,6a

34,29± 5,7a

35,16±5,6bc

36,02±8,2b

36,39±8,5c

28,07±6,0a

38,09±0,14b

38,24±6,0c

39,23±5,1b

40,01±4,0d

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng 7.3 Ảnh hưởng của dịch chiết đến đường kính khớp cổ chân của chuột

Đường kính khớp gối

Tuần

4,69±0,06a

4,53±0,02a

4,55±0,01a

4,56±0,04a

4,52±0,01a

4,78±0,01b

4,39±0,05b

4,32±0,02b

4,35±0,1b

4,32±0,02b

4,85±0,09c

4,28±0,05c

4,18±0,03c

4,22±0,03c

4,07±0,09c

5,08±0,03d

4,18±0,02d

4,01±0,06d

3,95±0,04d

3,72±0,01d

Các giá trị trong một cột có ký tự in thường khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Untreat ASL ASM ASH Mobic

168

Hình 7.1 Mô bệnh học tim, gan, thận và dạ dày (H&E, 200x) của chuột thí nghiệm độc cấp tính sau 14 ngày

Hình 7.2 Mô bệnh học tim, gan, thận và dạ dày (H&E, 200x) của chuột thí nghiệm độc bán mãn tính sau 90 ngày