Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG

TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG TÁC

NHÂN GÂY BỆNH VÀ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ

BỆNH RỄ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY

HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI TÂY NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – 2022

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS. Nguyễn Anh Dũng

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Lê Thị Ánh Hồng

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …

Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp

Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng

… năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và

xuất khẩu cao của Việt Nam. Sản lượng hạt tiêu của Việt Nam chiếm

tới 40% tổng sản lượng hạt tiêu toàn cầu. Theo quy hoạch đến năm

2020, tầm nhìn đến 2025, diện tích hồ tiêu của cả nước là 50.000 ha,

nhưng chỉ trong vài năm gần đây, riêng Tây Nguyên đã có tới gần

93.000 ha, nâng tổng diện tích hồ tiêu cả nước lên 150.000 ha. Năm

2020, xuất khẩu hạt tiêu ước đạt 288 nghìn tấn, trị giá 665 triệu USD,

tăng 1,2% về lượng, nhưng giảm 6,8% về trị giá so với cùng kỳ năm

2019 [1]. Trong những năm gần đây, trước tình trạng diện tích hồ tiêu

phát triển quá nhanh, nhiều vườn hồ tiêu được đầu tư thâm canh cao

độ, dịch bệnh được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn đến việc

nhiều vườn tiêu bị phá hủy. Hiện tượng hồ tiêu chết hàng loạt ở nhiều

vùng trên cả nước đặc biệt là Tây Nguyên đã ảnh hưởng rất lớn đến sự

phát triển bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam. Theo số liệu thống

kê, diện tích hồ tiêu đạt cao điểm vào năm 2017 là 151.982 ha, sau đó

giảm dần qua từng năm 2018 và 2019 còn 140.000 ha, giảm 11.900 ha

qua hai năm do dịch bệnh. Nguyên nhân diện tích giảm do dịch bệnh

chủ yếu là bệnh chết nhanh và bệnh vàng lá chết chậm. Bệnh chết

nhanh do Phytophthora capsici và bệnh vàng lá chết chậm do tuyến

trùng ký sinh thực vật Meloidogyne kết hợp với nấm Fusarium sp.

được xem là bệnh rễ phổ biến và nghiêm trọng nhất trên cây hồ tiêu

hiện nay [2-8].

Ba biện pháp được sử dụng nhiều nhất trong quản lý bệnh chết nhanh

và bệnh vàng lá chết chậm trên cây hồ tiêu gồm sử dụng các giống kháng,

biện pháp canh tác và dùng các thuốc hóa học để diệt nấm [9-11]. Tuy

nhiên, việc sử dụng các thuốc hoá học diệt nấm, tuyến trùng sẽ gây ô

nhiễm môi trường, giảm chất lượng sản phẩm, giảm sự đa dạng vi sinh

vật đất và tăng sự đề kháng của tác nhân gây bệnh [12]. Gần đây, các

nghiên cứu sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học thân thiện với môi

trường đang được ưu tiên hàng đầu trong các chương trình quản lý dịch

hại tổng hợp nhằm thay thế cho hóa chất nông nghiệp. Các tác nhân kiểm

soát sinh học như nấm đối kháng, vi khuẩn nội sinh, vùng rễ kháng nấm

bệnh, tuyến trùng và kích thích sinh trưởng bộ rễ [13-14]. Trong đó, vi

khuẩn vùng rễ (Rhizobacteria) kháng nấm bệnh, kháng tuyến trùng và

thúc đẩy sinh trưởng thực vật đang được nhiều nghiên cứu quan tâm [15-

17]. Vi khuẩn vùng rễ cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh tại vùng rễ để

làm giảm nguồn bệnh phát sinh từ đất và thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật

một cách trực tiếp dựa trên hoạt tính cố định N, phân giải P khó tan và

sinh tổng hợp IAA. Sử dụng vi khuẩn vùng rễ làm chế phẩm vi sinh được

coi là xu hướng trong tương lai vì nó làm giảm đáng kể việc sử dụng hóa

chất, phân bón hoá học từ đó góp phần làm tăng năng suất, chất lượng sản

phẩm, góp phần phát triển hồ tiêu một cách bền vững [3], [18-26]. Hướng

nghiên cứu về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng

sinh trưởng và kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu còn được ít quan tâm ở

Việt Nam và chưa có nghiên cứu nào một cách hệ thống trên cây hồ

tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Tuyển chọn,

nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm

phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu

(Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên” là rất cần thiết.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Tuyển chọn, xác định được đặc tính kháng Phytophthora,

Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ

của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây

Nguyên.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu

tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng

Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh

rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên.

2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora,

Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng

được tuyển chọn.

3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ

các chủng vi khuẩn tuyển chọn.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu

1.1.1. Vị trí phân loại

Hồ tiêu có tên khoa học là Piper nigrum L., thuộc giới Plantae, lớp

Equisetopsida, bộ Piperales, họ Piperaceae.

1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây hồ tiêu

1.2. Thực trạng sản xuất hồ tiêu của Việt Nam và các tỉnh Tây

Nguyên

1.2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu ở các tỉnh Tây Nguyên

Đắk Lắk: Diện tích hồ tiêu năm 2019 là 36.396 ha (bảng 1.2). Năm

2020 diện tích hồ tiêu là 34.500 ha giảm 1.896 ha so với năm 2019, sản

lượng 75.818 tấn, tăng 1.696 tấn so với năm 2019 [31]; Đắk Nông: Diện

tích hồ tiêu năm 2019 là 32.286 ha (bảng 1.2), tăng lên 34.957 ha (năm

2020), sản lượng đạt 44.750 tấn [30]; Gia Lai: Năm 2019, diện tích hồ

tiêu toàn tỉnh đạt 13.731 ha, tuy nhiên đến năm 2020, diện tích hồ tiêu

toàn tỉnh đạt 14.682 ha, sản lượng đạt 45.287 tấn [30].

1.2.2. Tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ở Tây Nguyên

Đắk Lắk: Năm 2020, bệnh vàng lá chết chậm có diện tích nhiễm là

86,8 ha (giảm 423,8 ha so với năm 2019); Bệnh chết nhanh có diện tích

nhiễm là 20,3 ha (giảm 766,3 so với năm 2019) [31]; Đắk Nông: Năm

2018, Diện tích nhiễm bệnh chết chậm là 1.289,9 ha, diện tích nhiễm

bệnh chết nhanh là 1.026,4 ha và diện tích nhiễm bệnh đen lá là 352.6

ha [32]; Gia Lai: Năm 2020, bệnh vàng lá chết chậm có diện tích nhiễm

là 2.281,2 ha (giảm 639 ha so với năm 2019); Bệnh chết nhanh có diện

tích nhiễm là 244,7 ha (giảm 1.007,2 so với năm 2019) [33].

1.3. Bệnh hại rễ cây hồ tiêu

Hai loại bệnh hại rễ chính trên cây hồ tiêu bao gồm bệnh chết

nhanh do Phytophthora sp. và bệnh vàng lá chết chậm do tuyến trùng

kết hợp với nấm Fusarium.

Phytophthora sp. là một trong những loại nấm gây hại chính ở rễ

tiêu. Quá trình xâm nhập hại rễ và gốc thân diễn ra ở trong đất, tương

đối khó theo dõi và phát hiện. Nấm có thể tấn công bất kỳ vị trí nào ở

gốc thân và rễ tạo thành vết biến màu và ướt, dần dần vết bệnh ngày

càng lan rộng. Tuyến trùng là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng

suy thoái về chất dinh dưỡng và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với hầu

hết các loại cây trồng. Sau khi nở từ trứng, tuyến trùng non xâm nhập

vào hệ thống rễ cây đang phát triển, sử dụng các chất dinh dưỡng từ

cây và làm hư hại bộ rễ tạo điều kiện cho các sinh vật có hại trong đất

tấn công vào bộ rễ. Tuyến trùng Meloidogyne có quan hệ mật thiết với

nấm Fusarium. Tuyến trùng chích hút, tạo vết thương vùng rễ tiêu và

tạo cơ hội cho nấm Fusarium tấn công rễ, gây bệnh cho cây hồ tiêu.

1.4. Các giải pháp tổng hợp để kiểm soát dịch bệnh trên cây hồ tiêu

và sản xuất bền vững

Hiện tại không có biện pháp đơn lẻ nào có thể phòng trừ bệnh chết

nhanh, chết chậm một cách hiệu. Vì vậy, quản lý bệnh hại tổng hợp là

cách duy nhất để hạn chế tác hại của bệnh gây ra. Kiểm soát sinh học

là biện pháp đem lại hiệu quả nhất để vượt qua áp lực trong kiểm soát

bệnh ở thực vật với mục đích bảo vệ cây trồng an toàn hơn. Nhiều

nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh vi khuẩn vùng rễ (PGPR) có

khả năng kiểm soát bệnh đồng thời kích thích sinh trưởng ở thực vật.

1.5. Vai trò của các chủng vi khuẩn vùng rễ trong kiểm soát sinh

học

1.5.1. Vùng rễ và vi sinh vật vùng rễ

Lớp đất mỏng bao quanh rễ cây đóng vai trò cực kỳ quan trọng và

tích cực cho hoạt động của rễ và sự trao đổi chất được gọi là

rhizosphere. Trong vùng rễ, quần thể vi sinh vật có thể dao động từ vài

nghìn đến hàng triệu tế bào. Tương tác giữa vi sinh vật vùng rễ và thực

vật mang lại nhiều tác động có lợi đối với sự sinh trưởng và phát triển

của thực vật của thực vật, ức chế bệnh, tăng sức đề kháng đối với stress

phi sinh học và sinh học. Một số lượng lớn các vi sinh vật như vi khuẩn,

nấm, động vật nguyên sinh và tảo cùng tồn tại trong rhizosphere.

1.5.2. Sự phân bố của vi khuẩn vùng rễ

Các vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật ngoại bào

sống ở vùng rễ, trên rễ hoặc trong khoảng không gian giữa các tế bào

rễ. Nhóm này bao gồm các chi Agrobacterium, Arthrobacter,

Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter,

Chromobacterium, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcous,

Pseudomonas và Serratia.

1.5.2. Cơ chế kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu của vi khuẩn vùng rễ

Cơ chế trực tiếp bao gồm sản xuất kháng sinh, enzyme và gây kích

kháng hệ thống của thực vật.

Cơ chế gián tiếp: Vi sinh vật vùng rễ thúc đẩy sinh trưởng thực vật

bằng cách sản xuất các phytohormone (auxins, cytokines, ethylene, và

các hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác) và siderophore, cải

thiện sự hấp thu / sẵn có chất dinh dưỡng cho cây bằng cách cố định

đạm, hòa tan phốt phát và khoáng hóa các hợp chất hữu cơ.

1.6. Tình hình nghiên cứu hiện nay về vi sinh vật vùng rễ kháng

bệnh rễ trên cây hồ tiêu

1.6.1. Trên thế giới

Theo Li và cộng sự (2016) tất cả các thành phần dinh dưỡng của

đất và các chỉ số đa dạng vi sinh vật trong đất tại vùng rễ cây hồ tiêu

đều cao hơn so với đất không phải tại vùng rễ. Các vi sinh vật tại vùng

rễ trong đó có vi khuẩn vùng rễ được xem là đối tượng lý tưởng để sử

dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học. Vùng rễ như là tuyến đầu bảo

vệ cho rễ chống lại sự tấn công của mầm bệnh.

Nhiều nghiên cứu khác nhau được tiến hành nhằm đánh giá khả

năng đối kháng nấm bệnh cũng như tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne

sp.) của các chủng vi sinh vật vùng rễ đặc biệt là chi Bacillus và

Pseudomonas trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có cây hồ

tiêu trong điều kiện in vitro cũng như trong điều kiện nhà lưới và ngoài

đồng ruộng (Diby, 2005, Dinu, 2007, Aravind, 2010, Yu, 2011, Ann,

2012, Zhang, 2016, Toh, 2016 và Senthikumar 2018).

1.3.2. Trong nước

Gần đây, do tình hình dịch bệnh gây hại nghiêm trọng trên các diện

tích hồ tiêu đã có một số nghiên cứu về xác định các đối tượng gây hại,

nghiên cứu canh tác bền vững và tình hình sử dụng các giống hồ tiêu

hiện nay ở Việt Nam. Tuy nhiên, hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của

các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng sinh trưởng và kháng

Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. đang

còn ít được quan tâm và chưa tiến hành một cách hệ thống trên cây hồ

tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì vậy, nghiên cứu được tiến hành nhằm

giải quyết vấn đề này.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu nghiên cứu

+ Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại 3 tỉnh Tây Nguyên bao gồm Gia

Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông.

+ Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu.

+ Nấm bệnh Phytophthora capsici. và Fusarium oxysporium. do

Viện CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên cung cấp, đã được định danh và bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ -80oC.

+ Tuyến trùng Meloidogyne sp. được thu nhận trực tiếp từ rễ cây

hồ tiêu bị u sưng.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng

rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng

kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne

gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên

* Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu rễ cây hồ tiêu: Mẫu rễ

được thu ở các vườn hồ tiêu sinh trưởng khỏe, năng suất cao, ổn định,

ít bị bệnh rễ hoặc tại các cây tiêu khỏe mạnh trên vườn tiêu bệnh. Thu

rễ ở cây hồ tiêu 3 đến 10 năm tuổi. Chọn mẫu rễ non và rễ tơ vì đây là

nơi có nhiều vi sinh vật tập trung. Thu rễ phần rìa ngoài cách trụ tiêu

bán kính khoảng 1,0 - 1,5 m; độ sâu rễ từ 10 - 20 cm, lấy khoảng 10

cm từ đầu nút của rễ vào. Mẫu rễ sau đó sẽ được giữ trong túi

polyethylen vô trùng, chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập ngay. Nếu chưa kịp xử lý, cần bảo quản trong tủ lạnh ở 5 oC cho đến khi tiến hành phân lập.

* Phân lập các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu: Phương pháp

phân lập vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu được thực hiện theo qui trình của

White (2015) có cải tiến cho phù hợp với đối tượng cây trồng.

Phương pháp quan sát và mô tả đặc điểm hình thái vi khuẩn (Nguyễn

Lân Dũng, 2009): Mô tả các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng

vi khuẩn và làm tiêu bản tế bào quan sát trên kính hiển vi.

* Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng

kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ

ở cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn

vùng rễ có hoạt tính kháng nấm Phytophthora và Fusarium trong điều

kiện in vitro theo phương pháp của của Toh và cộng sự (2016) và Dinu

và cộng sự (2007). Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt

tính kháng tuyến trùng trong điều kiện in vitro được thực hiện theo

phương pháp của Aravind cải tiến (2010).

* Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng

kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ

ở cây hồ tiêu trong điều kiện vườn ươm

+ Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng kháng

Phytophthora capsici trong điều kiện vườn ươm: Chuẩn bị cây hồ tiêu giống có 4-5 lá. Chuẩn bị tế bào vi khuẩn đạt mật độ 107 CFU/ ml được coi là dịch khuẩn gốc, Phytophthora với mật độ đạt 107CFU/ml được

coi là dịch gốc. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được tiến hành trong

nhà lưới, thí nghiệm được bố trí theo kiểu đầy đủ ngẫu nhiên. Tổng số

cây thí nghiệm: 9 nghiệm thức (7 nghiệm thức xử lý với các chủng vi

khuẩn RB.CS1, RB.CP15, RB.DS29, RB.EK2, RB.EK4, RB.BH15 và

RB.CJ35, 2 nghiệm thức đối chứng) x 15 cây/nghiệm thức x 3 lần nhắc

lại = 405 cây. Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu sinh trưởng bao gồm số

lá/ cây, chiều cao cây (cm), đường kính thân (mm), khôi lượng tươi

của cây (g), Khối lượng rễ tươi (g), chiều dài rễ (cm), hàm lượng diệp

lục tố (mg/g). Các chỉ tiêu về bệnh bao gồm: tỉ lệ rễ bệnh, tỉ lệ chết và

mật độ Phytophthora trong đất.

+ Tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng nấm

Fusarium trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm: Chuẩn bị, bố

trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi tương tự như thực hiện đối với

Phytophthora. Thí nghiệm có 8 nghiệm thức (6 nghiệm thức xử lý với vi

khuẩn bao gồm RB.DC16, RB.EK2, RB.CJ4, RB.CJ41, RB.CJ12,

RB.CJ27 và 2 nghiệm thức đối chứng) x 15 cây/ nghiệm thức x 3 lần nhắc

lại = 360 cây.

+ Tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng tuyến trùng

trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm: Chuẩn bị thí nghiệm

tương tự như thực hiện đối với Phytophthora. Thí nghiệm có 8 nghiệm

thức (6 nghiệm thức xử lý với vi khuẩn bao gồm RB.BH11, RB.EK2,

RB.CJ4, RB.CS30, RB.DS33, RB.EK7 và 2 nghiệm thức đối chứng), 10

cây/ nghiệm thức x 3 lần nhắc lại = 240 cây. Chủng nhiễm 350 tuyến

trùng/ lần/ 3 lần, mỗi lần cách nhau 5 ngày vào mỗi bầu. Các chỉ tiêu

theo dõi: Chỉ tiêu sinh trưởng tương tự như thực hiện đối với

Phytophthora. Chỉ tiêu về bệnh bao gồm số u sưng, tỷ lệ rễ u sưng,

mật độ tuyến trùng trong đất (con/50g đất), mật độ tuyến trùng trong

rễ (con/5g rễ) của cây hồ tiêu vườn ươm.

* Định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu

Chủng có khả năng đối kháng cao nhất với Phytophthora,

Fusarium và tuyến trùng trong điều kiện vườn ươm được gửi Trung

tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên

Tp. Hồ Chí Minh để định danh sinh hóa và sinh học phân tử.

2.2.2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng

Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng

vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn

* Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn vùng

rễ tuyển chọn: Phương pháp nghiên cứu điều kiện nhân nuôi được thực

hiện với các yếu tố một cách tuần tự bao gồm môi trường, pH, thời

gian, nhiệt độ, tốc độ lắc. Kết quả nghiên cứu của yếu tố trước sẽ được

sử dụng trong nghiên cứu yếu tố tiếp theo.

* Phương pháp xác định đặc tính kháng nấm Phytopthora,

Fusarium và tuyến trùng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

+ Xác định đặc tính kháng nấm nấm Phytopthora, Fusarium của

các chủng vi khuẩn tuyển chọn: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn

có bổ sung bào tử Phytophthora, Fusarium, casein, chitin, β-glucan

đến khả năng ức chế nấm Phytophthora, Fusarium được thực hiện

bằng cách trải dịch lọc trên đĩa môi trường PGA và cấy Phytophthora,

Fusarium vào giữa. Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm bệnh; Xác định

thành phần hóa học trong dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn vùng rễ

khả năng kháng Phytophthora/Fusarium bằng phân tích LC-MS và

GC-MS: được gửi phân tích tại Phòng phân tích trung tâm, Trường ĐH

Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.

+Xác định đặc tính kháng tuyến trùng của chủng vi khuẩn tuyển

chọn: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng,

casein, chitin đến khả năng kháng tuyến trùng: được thực hiện với 200

μl dịch nuôi cấy bổ sung khoảng 30 tuyến trùng theo dõi số tuyến

trùng chết trong các ống eppendorf ở các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 48

giờ và 72 giờ. Sử dụng môi trường và nước cất làm đối chứng. Xác

định thành phần hóa học trong dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn vùng

rễ có khả năng kháng tuyến trùng bằng phân tích LC-MS VÀ GC-MS:

được gửi phân tích tại Phòng phân tích trung tâm, Trường ĐH Khoa

học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.

* Phân tách, xác định cấu trúc và hoạt tính kháng tuyến trùng, kháng

nấm của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi sinh vật tuyển chọn

Dịch nuôi cấy của chủng RB.EK7 trong điều kiện thích hợp sau

khi loại bỏ vi khuẩn được cô cạn đạt khối lượng 199 g tiến hành trích

ly rắn lỏng với các dung môi, hệ dung môi n-hexane, chloroform, ethyl

acetate, ethyl acetate: methanol (90:10), ethyl acetate: methanol (60

:40), methanol thu được các dịch trích ly và được cô quay thu hồi dung

môi dưới áp suất thấp, thu được các loại cao. Cao chiết thô được sử

dụng để đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng trong điều kiện in vitro.

Các cao chiết thô có hoạt tính kháng cao, khối lượng nhiều được phân

tách, tinh sạch và xác định cấu trúc bằng các phổ NMR, HMBC và

HSQC tại phòng Phân tích Trung tâm, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên

Tp. Hồ Chí Minh. Các hợp chất tinh sạch được xác định hoạt tính

kháng tuyến trùng, kháng Phytophthora và nấm Fusarium.

2.2.3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng

từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Dung dịch vi khuẩn được nuôi cấy trong bioreactor 15 L (Bioflo,

NewBrunswick Bioflo, Eppendoft, USA) sử dụng làm chế phẩm cùng

các vật liệu phụ gia khác nhau. Chỉ tiêu theo dõi: Xác định mật độ vi

khuẩn và hoạt tính trong thời gian 06 tháng bảo quản.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm xử lý thống kê SAS 9.1.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ

tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng

Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây

bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên

Luận án đã phân lập và mô tả hình thái 269 chủng vi khuẩn vùng

rễ; trong đó Đắk Lắk 120 chủng, Gia Lai 72 chủng và Đắk Nông 77

chủng. Các chủng chủ yếu được phân lập tại tại vùng rễ của hồ tiêu

giống Vĩnh Linh trên nền đất đỏ bazan và được sử dụng làm vật liệu

cho các nghiên cứu tuyển chọn tiếp theo.

3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm

năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây

bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro

Tuyển chọn được 07 chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng

Phytophthora cao bao gồm RB.BH15, RB.EK2, RB.CP15, RB.CJ35,

RB.CS1, RB.EK4 và RB. DS29 với hiệu suất đối kháng nấm từ 62,67%

đến 65,33%.

Tuyển chọn được 06 chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng

nấm Fusarium bao gồm RB.DC16, RB.EK2, RB.CP15, RB.CJ35,

RB.CS1, RB.EK4 và RB. CJ27 với hiệu suất đối kháng nấm từ 41,25%

đến 66,25%.

Tuyển chọn được 06 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng

tuyến trùng Meloidogyne sp. cao là RB.EK7, RB.CJ4, RB.EK2,

RB.DS33, RB.BH11, RB.CS30 với tỷ lệ tử vong trên 90%.

3.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện vườn ươm 3.1.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng kháng n Phytophthora capsici trong điều kiện vườn ươm

Kết quả bảng 3.8 cho thấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn đều ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng của cây hồ tiêu trong vườn ươm và tỷ lệ bệnh rễ giảm từ 23,68% (ĐC2) xuống 14-16%, tỷ lệ chết giảm từ 33,3% (ĐC2) xuống 9,0-26,6% và mật độ nấm Phytophhtora trong đất giảm từ 17,10 x101 CFU/g xuống 2,12 – 16,80 x101 CFU/g ở các công thức có xử lý chủng. Trong bảy chủng thử nghiệm, chủng RB.DS29 có hoạt tính vượt trội hơn so với các chủng còn lại. Vì vậy, chủng này được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn vùng rễ đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora

Mật độ

Nghiệm

Chiều cao cây

Số rễ

Tỷ lệ rễ bệnh (%)

Tỷ lệ chết (%)

Phytophthora

thức

(cm)

(x101 CFU/g)

RB.EK4 RB.CJ35 RB.EK2 RB.CP15 RB.DS29 RB.CS1 RB.BH15 ĐC 1 ĐC2

41,30±4,99a 31,50±9,34ab 33,90±5,26ab 35,40±8,65ab 42,80±3,49a 32,70±6,42ab 38,70±6,71a 29,37±8,31ab 19,33±7,49b

4,67±0,59a 3,33±0,64bc 4,67±0,07a 4,33±0,30ab 5,00±0,37a 4,00±1,12ab 5,00±1,17a 4,33±0,54ab 2,33±0,89c

16,00±0,03b 24,33±0,13a 15,67±0,02b 15,67±0,05b 14,33±0,03bc 16,33±0,06b 15,33±0,01b 11,33±0,10b 23,68±0,22a

20,00±0,07bc 37,67±0,04a 13,00±0,04cd 26,67±0,07ab 9,00±0,04cd 33,33±0,07ab 11,00±0,04cd 4,33±0,08d 33,33±0,07ab

2,12 4,76 11,00 2,03 10,50 16,80 8,02 2,34 17,10

CV%

1,09

11,17

25,32

Ghi chú: ĐC1: Đối chứng không lây nhiễm tiêu con với Phytophthora sp.;

ĐC2: lây nhiễm nấm Phytophthora sp. * Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức

p<0,05, ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01, các chữ cái giống

nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo

trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test. 3.1.2.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng nấm Fusarium trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm

Kết quả bảng 3.11 cho thấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn đều ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng của cây hồ tiêu trong vườn ươm với chiều cao cây tăng từ 4,91% đến 30,05%, số rễ tăng từ 30,37% đến 42,8 % và tỷ lệ bệnh rễ giảm từ 8,23% (ĐC2) xuống 2,06 – 5,88% và mật độ nấm Fusarium sp. trong đất giảm từ 8,9x103 CFU/g (ĐC2) xuống 0,28-1,29 CFU/g ở các nghiệm thức có xử lý chủng. Trong sáu chủng thử nghiệm, chủng RB.CJ41 có hoạt tính vượt trội hơn so với các chủng còn lại. Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu sau 120 ngày lây nhiễm nấm Fusarium

Mật độ nấm

Nghiệm

Chiều cao

Tỉ lệ rễ bệnh

Fusarium sp.

Số rễ

thức

cây (cm)

(%)

(×103CFU/g đất)

RB.EK 2

55,57±4,80a

8,00±1,54 ab

3,42±0,004 c-e

0,83

RB.DC16

48,67±7,12ab

7,33±0,25ab

5,88±0,007b-d

1,21

RB.CJ 4

53,27±7,53a

8,00±0,43ab

4,10±0,006c

0,91

RB.CJ 12

52,27±10,54ab

10,00±0,25a

3,41±0,008c-e

1,29

RB.CJ 27

49,67±6,15ab

8,67±1,95ab

4,28±0,007bc

0,89

RB.CJ 41

54,63±6,46a

9,67±0,58ab

2,06±0,002de

0,78

ĐC 1

52,97±7,77ab

7,67±1,38ab

1,63±0,006e

0,08

ĐC 2

42,73±5,75b

7,00±0,78b

8,23±0,014a

8,9

CV%

13,74

17,23

1,42

Ghi chú: ĐC1: Đối chứng không lây nhiễm tiêu con với Fusarium sp.;

ĐC2: bổ sung Fusarium. * Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,05, **

Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01, các chữ cái giống nhau trên

cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm

phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test.

3.1.2.3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng tuyến

trùng trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm

Kết quả bảng 3.14 cho thấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn đều tác

động lên số rễ tăng từ 4,95% - 14,99% so với đối chứng ĐC1 và ĐC2.

Tỷ lệ rễ bị u sưng giảm từ 31,46% (ĐC1) xuống 13,37% - 25,16%, mật

độ tuyến trùng trong đất giảm từ 54,48% - 74,50% và mật độ tuyến

trùng trong rễ giảm từ 34-58% ở các nghiệm thức xử lý các chủng.

Trong các chủng thử nghiệm, chủng RB.EK7 có hoạt tính mạnh nhất

so với các chủng nghiên cứu. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến một số chỉ tiêu bệnh trên cây hồ tiêu trong vườn ươm

Nghiệm thức

Số u sưng/rễ

Tỷ lệ rễ bị u sưng (%)

1,39±0,36a

16,88±0,06bc

RB.EK2

Mật độ tuyến trùng trong đất (con/50g đất) 657,00±197,48c

Mật độ tuyến trùng trong rễ (con/5g rễ) 186,7±1,55c

1,56±0,22a

13,37±0,03cd

RB.EK7

865,33±68,26bc

160,0±3,60d

1,64±0,15a

27,93±0,10ab

RB.CJ4

1106,67±134,82b

233,3±11,55c

1,54±0,15a

19,16±0,07a-c

RB.CS30

620,00±58,12c

230,0±3,55c

1,53±0,07a

25,16±0,07a-c

RB.BH11

755,67±66,78c

230,0±2,00c

1,67±0,17a

22,69±0,03a-c

RB.DS33

748,67±147,45c

283,3±2,00b

1,69±0,17a

31,46±0,04a

ĐC1

2431,00±53,89a

356,7±5,74a

0,00±0,00b

0,00±0,00d

ĐC2

186,67±30,55d

0,00±0,00e

12,45

27,07

12,27

6,72

CV%

P

Ghi chú: ĐC 1: chủng nhiễm tuyến trùng; ĐC 2: không chủng nhiễm

tuyến trùng. Số liệu được chuyển đổi sang dạng log (X+0,5) (số u sưng) trước

khi xử lý thống kê.; ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01; các chữ

cái giống nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống

kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test.

3.1.3. Định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora,

Fusarium, kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu

Các chủng vi khuẩn vùng rễ RB.DS29 kháng nấm Phytophthra,

chủng RB.CJ41 kháng nấm Fusarium và chủng RB.EK7 kháng tuyến

trùng đã được định danh bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân

tử (giải trình tự gen 16S rRNA). Các chủng tuyển chọn được định danh

với tên khoa học là Bacillus velezensis RB.DS29, Bacillus subtilis

RB.CJ41 và Bacillus velezensis RB.EK7 (Hình 3.14).

Hình 3.14. Cây phân loại thể hệ mối liên quan giữa chủng RB.DS29,

RB.CJ41 và RB.EK7 với các loài gần gũi dựa trên trình tự 16S rRNA

3.2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng

Phytophthora/Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng

vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn

3.2.1. Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn

vùng rễ tuyển chọn

Đã nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để nhân nuôi các

chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn trong điều kiện in vitro như sau:

Chủng RB.DS29 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong môi trường

LB có pH = 7, thời gian nhân giống là 24 giờ, lên men 8 giờ, ở nhiệt độ là 35oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút.

Chủng RB.CJ41 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong điều kiện môi trường có thành phần (D-glucose 2 g/l, Pepton 3 g/l, cao thịt 5 g/l (NH4)2SO4 4 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6,5, nhiệt độ 37oC, thời gian nhân giống 36 giờ, thời gian lên men 6 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút.

Chủng RB.EK7 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong điều kiện môi trường M2 có thành phần D-glucose 2 g/l, Pepton 3 g/l, (NH4)2SO4 4 g/l, cao nấm men 5 g/l, KH2PO4 6 g/l, pH 7, nhiệt độ 37 oC, thời gian nhân giống 24 giờ, thời gian lên men 10 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút.

3.2.2. Xác định đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium của chủng

vi khuẩn tuyển chọn

3.2.2.1. Xác định đặc tính kháng nấm Phytopthora của chủng vi

khuẩn tuyển chọn

Thành tế bào Phytophthora có chứa chitin, protease và tới 90% β-

glucan nên sẽ bị các enzyme phân giải do vi khuẩn tổng hợp phá hủy.

Mặt khác, việc bổ sung bào tử nấm cũng có thể coi là chất cảm ứng để

vi khuẩn tổng hợp enzyme và một số hợp chất khác.

Kết quả bảng 3.23 cho thấy Ở nghiệm thức MT + bào tử

Phytophthora có hiệu suất đối kháng cao nhất (24,2%) gấp từ 1,32

đến 5,9 lần so với nghiệm thức MT+ chitin (16,7%), MT + β-glucan

(10,7%), MT + casein (18,3%). Khi bất hoạt các dịch nuôi cấy bổ sung chất cảm ứng (100 oC trong 1 giờ), hiệu suất đối kháng nấm

của các nghiệm thức giảm từ 2,3% - 10,8% (MT + bào tử

Phytophthora). Điều này chứng tỏ, hoạt tính kháng nấm

Phytophthora của chủng RB.DS29 có thể do enzyme cũng như các

hợp chất thứ cấp tác động.

Bảng 3.23. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng

RB.DS29

Hoạt tính

Hoạt

Hoạt tính

HSĐK

HSĐK (%)

enzyme

tính

enzyme β-

(%) dịch

dịch nuôi

Nghiệm thức

protease

enzyme

glucanase

nuôi cấy

cấy bất

(UI/ml)

chitinase

(UI/ml)

không

hoạt

(UI/ml)

bất hoạt

4,1±1,44d

2,5±0,00b

MT + bào tử

2,74±0,05

0,08±0,01

0,03±0,01

24,2±0,76a

10,8±0,76a

Phytophthora

MT + casein

18,3±1,76b

2,3±1,44b

0,14±0,02

3,23±0,04

16,7±0,76b

4,2±1,50b

MT + chitin

MT + β-

10,7±1,04c

2,5±1,44b

0,07±0,01

glucan

CV%

10,7

18,5

Ghi chú: HSĐK: hiệu suất đối kháng (%); MT: môi trường. Các chữ

cái giống nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống

kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test; ** Khác biệt

có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01.

Kết quả phân tích GC–MS từ dịch nuôi cấy chủng RB.DS29

(Bacillus velezensis) được thể hiện qua bảng 3.24 cho thấy các hợp

chất có khả năng bay hơi do chủng Bacillus velezensis RB.DS29 tiết

ra trong dịch nuôi cấy có bổ sung bào tử Phytophthora bao gồm:

Silane, diethyldodecyloxy (3-phen-, Disulfide, methyl 1-(methylthio),

Propanoic acid, 2-methyl-, decyl.., 2-Oxoacetic acid, ethyl ester,

Ethanol, 2-(2-butoxyethoxy). Kết quả phân tích LC-MS (Bảng 3.25)

cho thấy, các hợp chất không có khả năng bay hơi do chủng RB.DS29

tiết ra trong dịch nuôi cấy có bổ sung bào tử Phytophthora bao gồm

Metronidazole-oh, Sulfadiazin.

3.2.2.2. Xác định đặc tính kháng nấm Fusarium của chủng vi khuẩn

tuyển chọn

Theo Schoffelmeer và cộng sự (1999) thành tế bào nấm Fusarium

được cấu tạo bởi chitin, α-1,3-glucan và β-1,3-glucan ngoài ra còn có

protein. Kết quả bảng 3.32 cho thấy, nếu bổ sung chất cảm ứng nào thì

hoạt tính enzyme phân giải chất cảm ứng đó được tổng hợp và chỉ có

một loại enzyme tương ứng với chất cảm ứng. Riêng nghiệm thức bổ

sung bào tử nấm Fusarium thì vi khuẩn tổng hợp cả ba enzyme là

protease, chitinase và β-glucanase. Tổ hợp ba enzyme này cùng tấn

công phân hủy sợi nấm, làm sợi nấm đứt gãy thành đoạn, hoặc bị teo

lại (Hình 3.16A).

Kết quả phân tích GC–MS xác định dịch nuôi cấy chủng RB.CJ41

có 39 hợp chất có khả năng bay hơi . Trong đó chủ yếu là

Cyclotrisiloxane, hexamethyl; Pentasiloxane, dodecamethyl;

Cyclohexasiloxane, dodecamethyl; 3-Isopropoxy-1,1,1,7,7,7-

hexamethyl;1,3,4-Dihydroxyphenylglycol,4TMS;Cyclononasiloxane,

octadecamethyl; Cyclotrisiloxane, hexamethyl; Octasiloxane. Kết quả

phân tích LC-MS cho thấy chủng RB.CJ41 tổng hợp các hợp chất

kháng nấm gồm có Nilicdic acid và Metronidazole.

Bảng 3.26. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng RB.CJ41

Hoạt tính

HSĐK (%)

HSĐK

enzyme

enzyme β-

dịch nuôi

(%) dịch

Nghiệm thức

protease

chitinase

glucanase

cấy không

nuôi cấy

(UI/ml)

bất hoạt

MT + casein

0,36±0,03

18,3a

4,2a

MT+ chitin

3,96±0,08

18,3a

0,0b

MT + β-

0,41±0,04

20,8a

5,0a

glucan

MT + bào tử

0,15±0,01

1,32±0,05

0,29±0,02

20,8a

6,7a

nấm Fusarium

3,3b

0,0b

CV%

9,0

30,6

Ghi chú: HSĐK (%): hiệu suất đối kháng; MT: môi trường; ** Khác

biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01. Các chữ cái giống nhau trên cùng

một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm phân

hạng Duncan’s Multiple Rang Test.

Hình 3.16. Hệ sợi nấm Fusarium dưới tác động của dịch nuôi cấy vi

khuẩn RB.CJ41 khi bổ sung bào tử nấm Fusarium sp (A) Sợi nấm tại đĩa đối kháng (B) sợi nấm tại đĩa đối chứng.

3.2.2.3. Xác định đặc tính kháng tuyến trùng Meloidogyne sp. của

chủng vi khuẩn ngoại sinh vùng rễ tuyển chọn

Kết quả bảng 3.29 và 3.30 cho thấy, enzyme chitinase có thể tác

động đến tỉ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24 giờ. Enzyme

chitinase tác động lên tỉ lệ nở của trứng tuyến trùng vào 3 thời điểm 24

giờ, 48 giờ và 72 giờ. Nguyên nhân là do cả trứng và da tuyến trùng

tuổi 2 thành phần cấu tạo có chitin và chịu tác động phân giải bởi

chitinase (hình 3.19). Enzyme protease chỉ tác động vào thời điểm 72

giờ.

Bảng 3.29. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng RB.EK7 đến tỷ lệ tử

vong (%) tuyến trùng Meloidogyne sp.

Hoạt tính enzyme(UI/ml)

12 giờ

24 giờ

48 giờ

Nghiệm

thức

Chitinase Protease KBH BH KBH BH KBH BH

0,089±0,001

1,79±0,07

83,67 ±1,41a

78,33 ±12,82a

88,33 ±2,11a

93,67 ±5,95a

95,67 ±4,31a

100,0 ±0,000a

MT+ tuyến trùng

MT+

0,2±0,02

71,00 ±4,17a

82,67 ±6,61a

82,00 ±5,51a

92,00 ±1,73a

100,0 ±0,000a

97,67 ±2,07a

casein

4,5±0,10

MT+chitin

79,333 ±8,98a

68,33 ±6,47a

81,00 ±3,80a

78,00 ±4,83b

93,67 ±5,53a

96,67 ±5,77a

ĐC nước

4,33 ±1,32b

6,33 ±0,87b

7,67 ±3,15c

7,33 ±1,34d

8,00 ±1,42c

8,00 ±2,47c

12,00 ±4,48ab

23,00 ±1,80b

29,67 ±5,19b

22,67 ±0,53c

23,67 ±1,61b

29,33 ±3,57b

ĐC môi trường P CV %

- -

** 16,90

** 14,70

** 7,20

** 5,19

** 4,45

** 5,55

Ghi chú: MT: môi trường, KBH (Không bất hoạt enzyme); BH (Bất hoạt

enzyme), ĐC: đối chứng. ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01, các

chữ cái giống nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa

thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test.

Bảng 3.30. Ảnh hưởng của chủng RB.EK7 đến tỷ lệ nở của trứng tuyến

trùng

12 giờ

24h

48h

72h

Hoạt tính enzyme (UI/ml)

Nghiệm thức

Chitinase

Protease

1,79±0,07 0,089±0,001

MT+tuyến trùng

MT+casein

0,2±0,02

MT+chitin

4,5±0,10

ĐC nước

ĐC môi trường P CV %

- -

KBH 13,67 ±4,94b 6,67 ±3,06c 2,33 ±2,04c 28,67 ±1,71a 32,00 ±1,28a ** 15,02

BH 0,00 ±0,00c 0,00 ±0,00c 0,00 ±0,00c 28,67 ±1,71b 32,00 ±1,28a ** 7,45

KBH 19,00 ±1,51b 7,33 ±2,73c 10,00 ±2,37bc 55,33 ±5,03a 52,00 ±4,19a ** 12,16

BH KBH 20,67 6,33 ±1,00b ±1,90c 16,00 2,33 ±5,58b ±4,28c 14,00 20,67 ±2,31b ±8,08b 77,67 55,33 ±1,66a ±5,03a 78,33 52,00 ±5,34a ±4,19a 9,27 13,17

BH KBH 25,33 10,67 ±1,28b ±3,15b 15,33 7,33 ±6,70b ±3,98b 17,67 21,00 ±4,36b ±8,59b 88,67 77,67 ±4,07a ±1,66a 86,67 78,33 ±4,78a ±5,34a 10,11 13,62

BH 12,00 ±1,62b 19,67 ±0,44b 22,33 ±7,73b 88,67 ±4,07a 86,67 ±4,78a ** 10,24

Ghi chú: MT: môi trường, KBH (Không bất hoạt enzyme); BH (bất hoạt

enzyme), ĐC: đối chứng. Các chữ cái giống nhau trên cùng một cột thể hiện

sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s

Multiple Rang Test; ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01.

Hình 3.19. Tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến quá trình nở của

Ghi chú: (A), (B): trứng tuyến trùng bình thường; (C): tuyến trùng nở bình

thường; (D) tuyến trùng sống; (E), (F), (G), (H) trứng tuyến trùng bị phá

hủy nguyên sinh chất và nhân; (I), (K) tuyến trùng chết.

trứng tuyến trùng và gây chết tuyến trùng trưởng thành

Kết luận: Đối với chủng RB.DS29 và RB.CJ41 xác định được hợp

chất kháng Phytophthora và Fusarium bao gồm Sulfadiazin, Nalidixic

acid và Metronidazole. Đối với chủng RB.EK7 chưa xác định rõ hợp

chất kháng tuyến trùng vì thế nghiên cứu tiếp tục xác định hợp chất

kháng tuyến trùng bằng phương pháp sắc ký cột.

3.2.3. Phân tách, xác định cấu trúc và hoạt tính kháng tuyến trùng,

kháng nấm của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi sinh vật tuyển chọn

Bằng phương pháp sắc ký cột đã tách chiết, tinh sạch được ba hợp

chất là VK01, VK04 và VK05. Xác định được cấu trúc của ba hợp chất

này bằng phổ NMR, HMBC và HSQC lần lượt là dẫn suất Uracil

(VK01), dẫn suất Thymine (VK04) và hexahydropyrrolo [1,2-a]

pyrazine-1,4-dione (VK05) từ dịch nuôi cấy của chủng RB.EK7. Bảng 3.33. Ảnh hưởng của dẫn xuất của Uracil đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng

Nồng độ

Tỷ lệ tử vong tuyến trùng (%)

3 giờ

6 giờ

9 giờ

12 giờ

24 giờ

Tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng (%)

2,5mg/ml

5,0mg/ml

18,86±1,35d 25,42±1,01c

28,88±0,93d 38,90±0,12c

39,26±0,46d 49,38±0,33c

49,42±0,52d 58,69±0,37c

58,36±0,34d 69,53±0,13c

59,71±1,10b 35,06±1,75c

10mg/ml

20mg/ml

ĐC DMSO

37,35±1,07b 47,77±1,17a 0,00±0,00e

49,48±0,93b 65,16±1,03a 0,00±0,00e

64,59±0,82b 78,65±0,68a 0,00±0,00e

74,56±0,32b 88,24±0,78a 1,37±0,26e

89,36±0,41b 100,00±0,00a 3,26±0,17e

23,58±1,32d 13,79±1,01e 87,63±0,41a

ĐC nước

0,00±0,00e

0,00±0,00f

88,93±0,49a

CV%

4,48

2,37

1,13

0,94

0,38

2,32

*Ghi chú: ** Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,01, các chữ cái giống

nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê theo

trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test.

Kết quả khảo sát nồng độ dẫn xuất của Uracil đến tỷ lệ tử vong

tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng ở bảng 3.33 cho thấy, có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức với p<0,01. Với

nồng độ 2,5-20,0 mg/mL, dẫn xuất của Uracil làm tử vong 58,3-100%

tuyến trùng tuổi 2 sau 24 giờ xử lý và tỷ lệ nở của trứng chỉ còn 13,7-

59,7% so với 88,9% (ĐC nước).

Ngoài ra, các dẫn xuất của Uracil, dẫn xuất của Thymine và

hexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione cũng có hoạt tính kháng

Phytophthora trung bình đạt lần lượt 45,56 %, 41,11 % và 32,22. Hợp

chất VK01 và VK04 có hoạt tính kháng nấm Fusarium trung bình đạt

lần lượt 43,33 % và 43,89 %.

3.3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng

từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Xây dựng được qui trình nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn vùng

rễ tuyển chọn trong bioreactor 15 L và phát triển được ba chế phẩm

sinh học kháng nấm, tuyến trùng cho cây hồ tiêu:

1. Chế phẩm Bacillus velezensis RB.DS 29 dạng bột. Sau 06 tháng bảo quản với mật độ vi khuẩn vẫn đạt 0,59x107 CFU/g và khả năng đối

kháng Phytophthora sp. đạt 53,67%.

2. Chế phẩm Bacillus subtilis RB.CJ41 dạng bột. Cao lanh là chất mang tốt nhất sau 06 tháng bảo quản với mật độ vi khuẩn đạt 0,18x107

CFU/g và khả năng đối kháng nấm Fusarium sp. đạt 51,67%.

3. Chế phẩm Bacillus velezensis RB.EK7 dạng bột. Bột talc là chất mang tốt nhất sau 06 tháng bảo quản với mật độ vi khuẩn đạt 3,6x107

CFU/g và gây tỷ lệ tử vong tuyến trùng đạt 92,67%.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Kết luận

Tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có khả năng

kháng mạnh Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne sp. và

kích thích sinh trưởng cho cây hồ tiêu. Chủng kháng Phytophthora là

Bacillus velezensis RB.DS29, chủng kháng nấm Fusarium là Bacillus

subtilis RB.CJ41 và chủng Bacillus velezensis RB.EK7 kháng tuyến

trùng Meloidogyne sp. từ 269 chủng vi khuẩn đã phân lập từ vùng rễ

cây hồ tiêu ở Tây Nguyên.

Đã xác định được đặc tính kháng nấm và tuyến trùng của các chủng

tuyển chọn bao gồm chủng Bacillus velezensis RB.DS29 kháng

Phytophthora bằng cách tổng hợp enzyme phân giải chitinase, protease,

β-glucanase vừa tổng hợp được các hợp chất thứ cấp để kháng nấm bao

gồm Metronidazole-oh, Sulfadiazin; Chủng Bacillus subtilis RB.CJ41

kháng nấm Fusarium bằng cách tổng hợp enzyme phân giải chitinase,

β-glucanase và hợp chất thứ cấp để kháng nấm bao gồm

Metronidazole, Nalidixic acid; Chủng Bacillus velezensis RB.EK7

kháng tuyến trùng Meloidogyne sp. bằng cách tổng hợp enzyme

chitinase và protease và tổng hợp các hợp chất thứ cấp kháng tuyến trùng

là dẫn xuất của Uracil, dẫn xuất của Thymine và hexahydropyrrolo

[1,2-a] pyrazine-1,4-dione. Các hợp chất này gây tỷ lệ tử vong tuyến

trùng in vitro lần lượt đạt 100%, 100% và 64,2%.

Đã xây dựng được qui trình nuôi cấy 3 chủng tuyển chọn trên

bioreactor 15 L và phát triển thành chế phẩm sinh học kháng nấm,

kháng tuyến trùng cho cây hồ tiêu. Sau thời gian bảo quản 6 tháng, chế phẩm Bacillus velezensis RB.DS29 có mật độ 0,59 x 107CFU/g và khả

năng đối kháng Phytophthora sp. in vitro đạt 53,67%; Chế phẩm Bacillus subtilis RB.CJ41 có mật độ 0,18 x 107CFU/g và khả năng đối

kháng nấm Fusarium sp. đạt 51,67% in vitro; Chế phẩm Bacillus velezensis RB.EK7 có mật độ 3,6 x 107CFU/g và gây tử vong 92,67% tuyến trùng trong điều kiện in vitro.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính kháng

tuyến trùng từ các phân đoạn cao chiết thô còn lại.

Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn ngoại sinh vùng rễ đến

khả năng kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu vườn ươm.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Tuyển chọn được chủng Bacillus velezensis RB.DS29 kháng

Phytophthora capsici, chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 kháng nấm

Fusarium oxysporum và chủng Bacillus velezensis RB.EK7 kháng

tuyến trùng Meloidogyne sp. có tiềm năng để sản xuất chế phẩm vi

sinh vật phòng trừ bệnh chết nhanh, chết chậm trên cây hồ tiêu;

2. Xác định được cơ chế kháng nấm dựa trên hoạt tính enyme thủy

phân và một số hợp chất thứ cấp kháng nấm P. capsici và F. oxysporum

của hai chủng Bacillus velezensis RB.DS29 và Bacillus subtilis

RB.CJ41. Xác định được cơ chế kháng tuyến trùng dựa trên hoạt tính

enzyme thủy phân và hợp chất thứ cấp kháng tuyến trùng là

Hexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione từ chủng Bacillus

velezensis RB.EK7;

3. Bước đầu tạo được chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh rễ cây hồ tiêu

hiệu quả cao, hoạt tính ổn định sau 6 tháng bảo quản.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Thi Huyen Trang Trinh, Quang Huong Ngo, Thi Phuong Khanh Vo, Anh Dzung Nguyen (2018). Effect of plant growth promoting rhizobacteria on the growth and biocontrol of black pepper (Piper nigrum L.) under the green house condition. Hội thảo Nông nghiệp Quốc tế Malaysia, p 202-205.