Ứng dụng kỹ thuật Droplet Digital PCR để phát hiện đột biến gene KRAS của DNA khối u lưu hành trong máu ở bệnh nhân ung thư tuỵ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài này nhằm hai mục tiêu: (1) Xác định đột biến gene KRAS của ctDNA (mutKRAS ctDNA) ở bệnh nhân ung thư tuỵ và các bệnh lý tuỵ lành tính bằng kỹ thuật ddPCR. (2) Khảo sát mối liên quan của mutKRAS ctDNA và giai đoạn lâm sàng ung thư tuỵ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật Droplet Digital PCR để phát hiện đột biến gene KRAS của DNA khối u lưu hành trong máu ở bệnh nhân ung thư tuỵ

Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 Ứng dụng kỹ thuật Droplet Digital PCR để phát hiện đột biến gene KRAS của DNA khối u lưu hành trong máu ở bệnh nhân ung thư tuỵ Hà Thị Minh Thi1*, Ngô Thị Diệu Hương1, Lê Phan Tưởng Quỳnh1, Trương Xuân Long1, Trần Văn Huy1, Nguyễn Thị Mai Ngân1, Nguyễn Thị Thanh Thoả1, Lê Tuấn Linh1, Phạm Anh Vũ1, Nguyễn Minh Thảo1, Vĩnh Khánh1, Đặng Công Thuận1, Nguyễn Văn Cầu1, Phạm Nguyên Cường2, Hồ Hữu Thiện2, Đặng Ngọc Hùng2 (1) Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế (2) Bệnh viện Trung ương Huế Tóm tắt Đặt vấn đề: Đề tài này nhằm hai mục tiêu: (1) Xác định đột biến gene KRAS của ctDNA (mutKRAS ctDNA) ở bệnh nhân ung thư tuỵ và các bệnh lý tuỵ lành tính bằng kỹ thuật ddPCR. (2) Khảo sát mối liên quan của mut KRAS ctDNA và giai đoạn lâm sàng ung thư tuỵ. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 49 bệnh nhân ung thư tuỵ và 47 bệnh nhân bệnh tuỵ lành tính được xác định mutKRAS ctDNA bằng kỹ thuật ddPCR. Kết quả: Tỷ lệ bệnh nhân mutKRAS ctDNA (+) trong nhóm ung thư tuỵ là 69,4%, cao hơn nhóm u nang tuỵ lành tính (21,1%) và viêm tuỵ mạn (7,1%), p
Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 thư tuỵ được chẩn đoán khá muộn, khoảng 85% - Nhóm ung thư tuỵ: 49 bệnh nhân. được chẩn đoán ở các giai đoạn tiến triển hoặc di - Nhóm bệnh lý tuỵ lành tính: 47 bệnh nhân, căn, điều này làm giảm hiệu quả điều trị và tăng tỷ trong đó có 28 bệnh nhân viêm tuỵ mạn và 19 bệnh lệ tử vong [3]. nhân u nang tuỵ lành tính (u tuỵ, u đặc giả nhú, u Nghiên cứu về sinh học phân tử đã chứng minh nang thanh dịch, u nhú nhầy nội ống, nang tuỵ, nang sự xuất hiện và phát triển của bệnh ung thư là kết giả tuỵ). quả của sự tích tụ các đột biến di truyền trong DNA. • Tiêu chuẩn chọn vào nhóm nghiên cứu: Các mảnh DNA mang đột biến từ tế bào khối u đã - Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh lý tuỵ dựa vào phóng thích và lưu hành trong máu, được gọi là các tiêu chuẩn chẩn đoán như sau: ctDNA (circulating tumor DNA) [4]. Các ctDNA phản + Đối với nhóm ung thư tuỵ, có cả hai tiêu chuẩn: ánh toàn cảnh cấu trúc di truyền của khối u nên xét * Có hình ảnh tổn thương tuỵ gợi ý ung thư nghiệm phân tích ctDNA trong máu ngoại vi được qua siêu âm nội soi và/hoặc chụp cắt lớp vi tính xem là kỹ thuật sinh thiết lỏng. CtDNA là một thành (computerized tomography scan: CT scan) và/hoặc phần của DNA ngoại bào (cell-free DNA: cfDNA) lưu chụp cộng hưởng từ (magnetic resonance imaging: hành trong máu, đó là những đoạn DNA nhỏ được MRI). phóng thích từ những tế bào chết theo chương trình * Kết quả mô bệnh học xác định ung thư biểu mô (apoptosis) hoặc do quá trình hoại tử [5]. Đáng lưu tuyến tuỵ. ý, ctDNA có kích thước nhỏ (dưới 170 bp) và chỉ + Đối với nhóm bệnh lý u nang tuyến tuỵ, có cả chiếm một tỷ lệ rất ít, có thể dưới 1%, trong toàn bộ hai tiêu chuẩn: cfDNA của máu ngoại vi [6]. Vì vậy, để phát hiện đột * Có hình ảnh tổn thương tuỵ qua siêu âm nội biến của ctDNA cần phải phân tích mẫu cfDNA trong soi và/hoặc chụp cắt lớp vi tính (computerized huyết tương bằng các kỹ thuật sinh học phân tử tomography scan: CT scan) và/hoặc chụp cộng tiên tiến có độ nhạy cao như PCR kỹ thuật số vi giọt hưởng từ (magnetic resonance imaging: MRI). (droplet digital PCR: ddPCR) hoặc giải trình tự thế hệ * Kết quả mô bệnh học kết luận lành tính. mới (next-generation sequencing: NGS). Trong đó, + Đối với nhóm viêm tuỵ mạn: có hình ảnh tổn ddPCR cho phép phát hiện các đột biến đặc hiệu với thương điển hình viêm tuỵ mạn tính trên siêu âm nội tỷ lệ allele đột biến (mutant allele fraction: MAF) ở soi (theo tiêu chuẩn Rosemont) hoặc CT scan hoặc mức rất thấp, có thể từ 0,01% hoặc thậm chí thấp MRI (theo tiêu chuẩn M-ANNHEIM) [8–10]. hơn [6]. - Bệnh nhân được lấy 10 ml mẫu máu ngoại vi KRAS là một trong những gene bị đột biến thường trong ống chống đông chuyên dụng cho tách chiết gặp nhất ở ung thư tụy, khoảng 75 - 95% bệnh nhân cfDNA( Streck Cell-Free DNA BCT® CE) trước khi ung thư tuỵ có mang đột biến gene này trong khối u được điều trị bằng phẫu thuật và/hoặc hoá trị liệu [4]. Nhiều tác giả trên thế giới đã phát hiện được đột và/hoặc xạ trị. biến gene KRAS của DNA khối u lưu hành trong máu • Tiêu chuẩn loại trừ: (mutKRAS ctDNA) ở phần lớn bệnh nhân ung thư tuỵ + Mẫu cfDNA tách từ huyết tương không đạt số [7]. Vì vậy, phát hiện mutKRAS ctDNA bằng kỹ thuật lượng và chất lượng để thực hiện xét nghiệm tìm đột ddPCR được kỳ vọng là một chỉ điểm sinh học mới biến KRAS của ctDNA. giúp chẩn đoán sớm, theo dõi và tiên lượng ung thư + Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu. tụy. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài này 2.2. Phương pháp nghiên cứu nhằm hai mục tiêu: (1) Xác định đột biến gene KRAS 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu của ctDNA ở bệnh nhân ung thư tuỵ và các bệnh lý Nghiên cứu mô tả cắt ngang. tuỵ lành tính bằng kỹ thuật ddPCR. (2) Khảo sát mối 2.2.2. Thu thập thông tin liên quan của đột biến gene KRAS của ctDNA và giai Bệnh nhân các nhóm ung thư tuỵ và bệnh tuỵ đoạn lâm sàng ung thư tuỵ. lành tính được thu thập thông tin chung (tuổi, giới), triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nhóm ung thư tuỵ được phân giai đoạn theo 2.1. Đối tượng nghiên cứu hệ thống TNM (tumor, node, metastasis) của Hiệp Bệnh nhân có bệnh lý tuỵ được khám và điều trị hội Ung thư Hoa kỳ (American Joint Commission on tại Bệnh viện Trường Đại học Y - Dược Huế và Bệnh Cancer: AJCC), phiên bản lần thứ 8 [11]. viện Trung ương Huế trong thời gian từ tháng 07 2.2.2. Tách chiết cfDNA năm 2022 đến tháng 11 năm 2024, gồm có hai nhóm - Mỗi bệnh nhân được lấy 10 ml máu tĩnh mạch như sau: ngoại vi trong ống Streck Cell-Free DNA BCT® CE 94 HUE JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY ISSN 3030-4318; eISSN: 3030-4326
Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 (Streck, Hoa Kỳ). Chuyển ngay ống mẫu đến phòng thí chứa sản phẩm không đột biến, giọt chứa cả sản nghiệm Di truyền phân tử (Bộ môn Di truyền Y học, phẩm đột biến và không đột biến, giọt không có sản Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế) để tách huyết phẩm, được phát hiện dựa trên các giá trị ngưỡng tương. Nếu chưa tách chiết cfDNA ngay thì mẫu huyết của biên độ (amplitude) theo phân phối Poisson. tương được giữ âm sâu -80oC cho đến khi thực hiện. Phải có ít nhất hai giọt dương có đột biến mới được - Tách chiết cfDNA từ 2 ml huyết tương mỗi mẫu xác định dương tính mutKRAS ctDNA [12]. bằng kít QIAamp ccfDNA/RNA (Qiagen, Đức) theo + Xác định số bản sao tương ứng allele đột biến protocol của nhà sản xuất. (A) và không đột biến (B) trong mỗi 20 ml phản ứng. - Mẫu DNA sau khi tách chiết được đo nồng độ + Tỷ lệ allele đột biến MAF (mutant allele fraction) bằng máy đo huỳnh quang Quantus Fluorometer được tính theo công thức: (Promega, Hoa Kỳ) với bộ kit hoá chất QuantiFluor® MAF (%) = A/(A + B) ONE dsDNA System (Promega, Hoa Kỳ). Nồng độ Các kỹ thuật tách chiết cfDNA từ huyết tương và DNA được đo theo đơn vị ng/ml. phát hiện mutKRAS ctDNA bằng kỹ thuật ddPCR được 2.2.3. Xác định đột biến gene KRAS của ctDNA thực hiện tại Bộ môn Di truyền Y học, Trường Đại học (mutKRAS ctDNA) trong mẫu cfDNA tách từ huyết Y - Dược, Đại học Huế. tương bằng kỹ thuật ddPCR 2.2.4. Xử lý số liệu - Sử dụng kít KRAS G12/G13 Screening (Bio-Rad, Kết quả xét nghiệm mutKRAS ctDNA được ghi nhận Hoa Kỳ) gồm ống Supermix 2´ và ống Assay mix 20´ dương tính hoặc âm tính, nếu dương tính thì kết tương ứng. Bộ sinh phẩm này phát hiện được 7 loại quả được biểu diễn bằng MAF theo tỷ lệ %. Tỷ lệ đột biến trên hai codon 12 và 13 của gene KRAS, bao phát hiện được xác định cho mỗi nhóm ung thư tuỵ, gồm G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V và G13D. u/nang tuỵ lành tính, viêm tuỵ mạn. So sánh các tỷ - Thành phần phản ứng: tổng thể tích 22 ml, bao lệ phát hiện bằng kiểm định Chi bình phương hoặc gồm 11 ml Supermix 2´, 1,1 ml Assay mix, 9,9 ml cfDNA. Fisher’s exact (nếu có hơn 20% các tần số < 5). Xác - Tạo vi giọt (droplet) bằng máy QX200 Droplet định giá trị chẩn đoán ung thư tuỵ của xét nghiệm Generator, sau đó chuyển vào đĩa ddPCR và dán mut KRAS ctDNA thông qua tính độ nhạy, độ đặc hiệu, bằng máy PX1 PCR Plate Sealer (BioRad, Hoa Kỳ). giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm và độ - Thực hiện phản ứng ddPCR trên máy luân nhiệt chính xác. Đối với nhóm ung thư tuỵ, tính trung bình C1000 Touch (BioRad, Hoa Kỳ), điều kiện nhiệt độ MAF của gene KRAS trong ctDNA (KRAS MAF) cho như sau: hoạt hoá enzyme 95oC 10 phút; tiếp theo mỗi phân nhóm theo hệ thống TNM bao gồm giai là 40 chu kỳ với mỗi chu kỳ gồm biến tính ở 94oC đoạn I-II, III và IV. Trị trung bình MAF được so sánh 30 giây, gắn mồi và kéo dài ở 55oC 1 phút, bất hoạt giữa mỗi hai phân nhóm bằng t-test one-tailed để enzyme ở 98oC 10 phút; cuối cùng giữ ở 4oC cho đến kiểm định giả thuyết giá trị trung bình MAF càng khi đọc kết quả. cao ở nhóm giai đoạn càng tăng. Các kiểm định - Đọc kết quả bằng phần mềm QuantaSoft trên được thực hiện trên phần mềm thống kê trực máy vi tính được kết nối với máy đọc QX200 Droplet tuyến VassarStats. Vẽ đường cong ROC theo KRAS Reader (BioRad, Hoa Kỳ). MAF để xác định giá trị tiên đoán giai đoạn muộn + Các giọt phản ứng được chia thành 4 nhóm, (giai đoạn IV) của ung thư tuỵ bằng phần mềm SPSS bao gồm giọt chỉ chứa sản phẩm đột biến, giọt chỉ version 26.0. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của các nhóm nghiên cứu Bảng 1. Phân bố tuổi và giới Đặc điểm Ung thư tuỵ U nang tuỵ lành Viêm tuỵ mạn p (n = 49) tính (n = 19) (n = 28) Giới Nam (%) 22 (44,9) 9 (47,4) 23 (82,1) 0,005 Nữ (%) 27 (55,1) 10 (52,6) 5 (17,9) Tuổi (X ± SD) 64,7 ± 10,8 45,1 ± 17,4 51,5 ± 16,4
Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 3.2. Phát hiện mutKRAS ctDNA bằng kỹ thuật ddPCR Hình 1. Kết quả xét nghiệm mutKRAS ctDNA bằng kỹ thuật ddPCR (A. Âm tính, B. Dương tính) Bảng 2. Phân bố mut KRAS ctDNA ở các nhóm bệnh lý tuỵ KRAS ctDNA mut Ung thư tuỵ (%) U nang tuỵ Viêm tuỵ mạn (%) p lành tính (%) Dương tính 34 (69,4) 4 (21,1) 2 (7,1) < 0,0001 Âm tính 15 (30,6) 15 (78,9) 26 (92,9) Tổng 49 19 28 Tỷ lệ có đột biến KRAS trong ctDNA huyết tương ở nhóm bệnh nhân ung thư tuỵ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với hai nhóm lành tính (u nang tuỵ lành tính và viêm tuỵ mạn). Giá trị chẩn đoán được xác định dựa trên nhóm 49 bệnh nhân ung thư tuỵ và 47 bệnh nhân bệnh tuỵ lành tính (bao gồm u nang tuỵ lành tính và viêm tuỵ mạn) như sau: - Độ nhạy: 69,4% - Giá trị tiên đoán âm: 73,2% - Độ đặc hiệu: 87,2% - Độ chính xác: 78,1% - Giá trị tiên đoán dương: 85,0% 3.3. Mối liên quan của mutKRAS ctDNA với giai đoạn ung thư tuỵ Bảng 3. Tỷ lệ có mutKRAS ctDNA ở các nhóm giai đoạn ung thư tuỵ theo hệ thống TNM mut KRAS ctDNA Giai đoạn I-II (%) Giai đoạn III (%) Giai đoạn IV (%) p Dương tính 6 (46,2) 14 (77,8) 14 (77,8) 0,144 Âm tính 7 (53,8) 4 (22,2) 4 (22,2) Tổng 13 18 18 Sự khác biệt về tỷ lệ dương tính với mut KRAS ctDNA trong các nhóm giai đoạn ung thư tuỵ không có ý nghĩa thống kê. Biểu đồ 1. Trung bình tỷ lệ allele đột biến KRAS MAF trong ctDNA của các nhóm giai đoạn ung thư tuỵ theo hệ thống TNM Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về giá trị trung bình KRAS MAF trong ctDNA giữa các nhóm ung thư tuỵ. Trung bình KRAS MAF tăng dần theo các giai đoạn ung thư tuỵ. 96 HUE JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY ISSN 3030-4318; eISSN: 3030-4326
Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 Biểu đồ 2. Đường cong ROC của giá trị KRAS MAF trong ctDNA trong tiên đoán giai đoạn IV ở bệnh nhân ung thư tuỵ Chú thích: Khảo sát trên 34 bệnh nhân có đột biến KRAS trên ctDNA huyết tương. Giá trị diện tích dưới đường cong AUC = 0,739 và p < 0,05 cho thấy KRAS MAF có giá trị mức độ trung bình trong tiên đoán bệnh nhân ung thư tuỵ ở giai đoạn IV, với giá trị ngưỡng là MAF > 5,55%. 4. BÀN LUẬN đa số là đột biến tại codon 12 [7]. Trong nghiên cứu Ung thư tuỵ là bệnh lý ác tính đường tiêu hoá này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật ddPCR với đa mồi được dự báo sẽ có tỷ lệ tử vong tăng cao, đứng hàng đặc hiệu với 7 đột biến tại các codon 12 và 13 gene thứ hai trên toàn cầu trong 10 năm sắp đến do khó KRAS để phát hiện mutKRAS ctDNA ở các mẫu cfDNA chẩn đoán sớm, điều trị kém hiệu quả, sự gia tăng tỷ được tách từ huyết tương của bệnh nhân ung thư lệ mới mắc ở mọi lứa tuổi và hai giới [3]. Chúng tôi đã tuỵ hoặc bệnh tuỵ lành tính (Hình 1). Qua đó bước khảo sát các bệnh nhân bệnh lý tuỵ bao gồm nhóm đầu đánh giá giá trị chẩn đoán và tiên lượng ung thư ung thư tuỵ và hai nhóm bệnh tuỵ lành tính là u/ tuỵ của xét nghiệm này ở bệnh nhân Việt Nam. Kết nang tuỵ lành tính và viêm tuỵ mạn. Kết quả ở Bảng quả nghiên cứu ở Bảng 2 cho thấy tỷ lệ phát hiện 1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tuổi mut KRAS ctDNA là 69,4% ở nhóm ung thư tuỵ, cao trung bình và phân bố giới tính ở các nhóm bệnh lý hơn có ý nghĩa thống kê so với hai nhóm lành tính tuỵ. Đáng chú ý là nam giới chiếm đa số ở nhóm viêm là u/nang tuỵ lành tính (21,1%) và viêm tuỵ mạn tuỵ mạn, đến 82,1%. Điều này phù hợp với nguyên (7,1%), p
Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 quả này cho thấy chúng tôi có tỷ lệ phát hiện tương ± 2,4% và 1,1 ± 1,6%. Nghiên cứu của Wang (Trung đối cao so với hầu hết các nghiên cứu khác [3,16]. Quốc, 2019) cũng cho thấy KRAS MAF có liên quan Đáng chú ý, trong nhóm bệnh tuỵ lành tính, chúng với các giai đoạn ung thư tuỵ, với MAF của nhóm giai tôi phát hiện có 6 trường hợp dương tính với mutKRAS đoạn IV cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm ctDNA (Bảng 2). Theo Yang, đột biến gene KRAS và khác, tác giả ghi nhận nhóm giai đoạn I-II có MAF tình trạng viêm có thể cùng xuất hiện trong giai đoạn nhỏ hơn 2%, tương tự nghiên cứu của chúng tôi [4]. khởi đầu rất sớm của ung thư tuỵ và có vai trò thúc Ngoài ra, Biểu đồ 2 cho thấy đường cong ROC có đẩy sự tác động lẫn nhau, gây mất ổn định genome diện tích dưới đường cong 0,739, p
Tạp chí Y Dược Huế - Trường Đại học Y - Dược, Đại học Huế - Số 1, tập 15/2025 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bailey P, Chang DK, Nones K, Johns AL, Patch AM, Y, Takayama Y, et al. Longitudinal monitoring of KRAS- Gingras MC, et al. Genomic analyses identify molecular mutated circulating tumor DNA enables the prediction subtypes of pancreatic cancer. Nature. 2016 Mar of prognosis and therapeutic responses in patients with 3;531(7592):47–52. pancreatic cancer. PLoS One. 2019 Dec 1;14(12):e0227366. 2. Yadav DK, Bai X, Yadav RK, Singh A, Li G, Ma T, et al. 13. Moshayedi N, Escobedo AL, Thomassian S, Osipov Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new A, Hendifar AE. Race, sex, age, and geographic disparities in era. Oncotarget. 2018;9(42):26900–33. pancreatic cancer incidence. Journal of Clinical Oncology. 3. Buscail L, Bournet B, Cordelier P. Role of oncogenic 2022 Feb 1;40(4_suppl):520–520. KRAS in the diagnosis, prognosis and treatment of 14. Gehrels AM, Wagner AD, Besselink MG, Verhoeven pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2020 RHA, van Eijck CHJ, van Laarhoven HWM, et al. Gender Mar 1;17(3):153–68. differences in tumor characteristics, treatment allocation 4. Wang ZY, Ding XQ, Zhu H, Wang RX, Pan XR, Tong and survival in stage I–III pancreatic cancer: a nationwide JH. KRAS Mutant Allele Fraction in Circulating Cell-Free study. Eur J Cancer. 2024 Jul 1;206:114117. DNA Correlates With Clinical Stage in Pancreatic Cancer 15. Samaan JS, Abboud Y, Oh J, Jiang Y, Watson R, Patients. Front Oncol. 2019 Nov 29;9:1295. Park K, et al. Pancreatic Cancer Incidence Trends by Race, 5. Qi T, Pan M, Shi H, Wang L, Bai Y, Ge Q. Cell-Free Ethnicity, Age and Sex in the United States: A Population- DNA Fragmentomics: The Novel Promising Biomarker. Int J Based Study, 2000–2018. Cancers (Basel). 2023 Feb Mol Sci. 2023 Jan 1;24(2):1503. 1;15(3):870. 6. Diaz LA, Bardelli A. Liquid biopsies: Genotyping 16. Huerta M, Roselló S, Sabater L, Ferrer A, Tarazona circulating tumor DNA. Journal of Clinical Oncology. 2014 N, Roda D, et al. Circulating tumor dna detection by digital- Feb 20;32(6):579–86. droplet PCR in pancreatic ductal adenocarcinoma: A 7. Kim MK, Woo SM, Park B, Yoon KA, Kim YH, Joo systematic review. Cancers (Basel). 2021 Mar 1;13(5):1–14. J, et al. Prognostic Implications of Multiplex Detection 17. Hadano N, Murakami Y, Uemura K, Hashimoto Y, of KRAS Mutations in Cell-Free DNA from Patients with Kondo N, Nakagawa N, et al. Prognostic value of circulating Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clin Chem. 2018 Apr tumour DNA in patients undergoing curative resection for 1;64(4):726–34. pancreatic cancer. Br J Cancer. 2016 Jun 28;115(1):59–65. 8. Gardner TB, Adler DG, Forsmark CE, Sauer BG, 18. Earl J, Garcia-Nieto S, Martinez-Avila JC, Montans Taylor JR, Whitcomb DC. ACG Clinical Guideline: Chronic J, Sanjuanbenito A, Rodríguez-Garrote M, et al. Circulating Pancreatitis. American Journal of Gastroenterology. 2020 tumor cells (Ctc) and kras mutant circulating free Dna Mar 1;115(3):322–39. (cfdna) detection in peripheral blood as biomarkers in 9. Shimizu K, Ito T, Irisawa A, Ohtsuka T, Ohara H, patients diagnosed with exocrine pancreatic cancer. BMC Kanno A, et al. Evidence-based clinical practice guidelines Cancer. 2015 Oct 24;15(1):797. for chronic pancreatitis 2021. J Gastroenterol. 2022 Oct 19. Yang F, Li L, Kong XY. The Positive Feedback Loop 1;57(10):709–24. Between Inflammation and Mutant KRAS Genes Promotes 10. Anaizi A, Hart PA, Conwell DL. Diagnosing Chronic Malignant Transformation in Chronic Pancreatitis. Cancer Pancreatitis. Dig Dis Sci. 2017 Jul 1;62(7):1713–20. Screening and Prevention. 2022 Dec 2;1(1):39–46. 11. Amin MB, Edge SB, Greene FL, Byrd DR, Brookland 20. Cheng H, Luo G, Jin K, Fan Z, Huang Q, Gong Y, et RK, Washington MKay, et al. AJCC Cancer Staging Manual. al. Kras mutation correlating with circulating regulatory T 8th edition. New York: Springer; 2017. cells predicts the prognosis of advanced pancreatic cancer 12. Watanabe F, Suzuki K, Tamaki S, Abe I, Endo patients. Cancer Med. 2020 Mar;9(6):2153–9. HUE JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY ISSN 3030-4318; eISSN: 3030-4326 99