Ứng dụng kỹ thuật One-Step RT-PCR chẩn đoán bệnh cứng trái do vi rút (East Asian Passiflora Virus - EAPV) gây bệnh trên chanh leo ở Việt Nam

Chia sẻ: Kethamoi5 Kethamoi5 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

56
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tại Việt Nam cũng đã xác định được 4 loài vi rút gây bệnh trên chanh leo, trong đó bệnh cứng trái (hóa bần vỏ trái) do East Asian Passiflora virus (EAPV) được coi là bệnh hại nguy hiểm nhất trên chanh leo tại Việt Nam. Bệnh gây hại nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng quả, nhiều vườn trồng chanh leo tại Tây Nguyên bị bệnh nặng đã phải hủy vườn. Do vậy, xác định phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác bệnh cứng trái do EAPV gây ra là yêu cầu cấp thiết để góp phần quản lý bệnh đạt hiệu quả cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật One-Step RT-PCR chẩn đoán bệnh cứng trái do vi rút (East Asian Passiflora Virus - EAPV) gây bệnh trên chanh leo ở Việt Nam

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 7. de Silva D. P. P., Jones, P. and Shaw, M. W. of Piper yellow mottle virus (PYMoV). Arch Virol, 159: ,2002. Identification and transmission of Piper yellow 385-388. mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black 10. Lockhart B. E. L., Kittisak Kiratiya-Angul, Jones pepper (Piper nigrum) in Sri Lanka. Plant Pathol., 51: P., Lily Eng, De Silva D. P. P., Olszewski N.E., 537–545. Lockhart N., Deeshma N. and Sangalang J., 1997. 8. Deeshma K. P and Bhat A. I. , 2017. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug- Occurrence of endogenous Piper yellow mottle virus in transmitted badnavirus infecting Piper spp. In black pepper. Virus Diseases, 28: 213-217. Southeast Asia. Eur. J. Plant Pathol., 103: 303–311. 9. Hany U., Adams I. P., Glover R., Bhat A. I., Boonham N., 2014. The complete genome sequence Phản biện: TS. Trịnh Xuân Hoạt ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ONE-STEP RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH CỨNG TRÁI DO VI RÖT (East Asian Passiﬂora Virus - EAPV) GÂY BỆNH TRÊN CHANH LEO Ở VIỆT NAM One-step RT-PCR for Detection of Passionfruit Woodiness Disease Caused by East Asian Passiﬂora Virus (EAPV) in Viet Nam Đỗ Duy Hƣng, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Nam Dƣơng, Phạm Thị Dung, Ngô Thị Thanh Hƣờng, Lê Mai Nhất và Hà Minh Thanh Viện Bảo vệ thực vật Ngày nhận bài: 16.08.2018 Ngày chấp nhận: 29.09.2018 Abstract East Asian Passiﬂora virus (EAPV) is the third pathogenic potyvirus species that induces “passionfruit woodiness disease” to be identiﬁed recently in East Asia, after Passion fruit woodiness virus (PWV) in Australia, Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) in Brazil. One-step RT-PCR was optimized for detection of East Asian Passiﬂora virus (EAPV) strain AO and IB on passion fruit in Taiwan. Three pairs of primer were used for detection of both EAPV-AO and EAPV-IB from the infected samples collected from Nghe An and Dak Nong provinces of Viet Nam. Among the tested samples, EAPV-AO was detected from 14 samples from Nghe An and 4 samples from Dak Nong; meanwhile, EAPV-IB was detected only from 4 samples collected from Nghe An but not from Dak Nong. Different parts of infected passion fruit plant including fresh and fried tissues except the old leaf could be used for the detection of EAPV-AO and EAPV-IB. This protocol was used routinely at Plant Protection Research Institute for detection of EAPV-AO and EAPV-IB on passion fruit collected from different areas in Viet Nam. Keywords: EAPV, passion fruit, RT-PCR, detection 1. ĐẶT VẤN ĐỀ khó khăn do sâu, bệnh hại đặc biệt là các loại bệnh do vi rút gây ra. Trên thế giới, đã phát hiện Chanh leo (Passiflora spp.) là cây trồng có được 23 loài vi rút gây hại trên chanh leo. Trong giá trị kinh tế cao được ưa chuộng ở nhiều nước đó, ở một số nước như Đài Loan, Trung Quốc, trên thế giới. Ở Việt Nam, chanh leo đã và đang Nhật Bản, Thái Lan đã phát hiện 6 loài vi rút bao trở thành cây trồng chủ lực tại nhiều vùng trong gồm: Euphorbia leaf curl virus (EuLCV) and cả nước như các tỉnh Tây Nguyên, Nghệ An, Papaya leaf curl Guangdong virus (PaLCuGDV) Sơn La, Hòa Bình…(Nguy n Tuấn Lộc và cs, (Cheng et al., 2016); Cucumber mosaic virus 2017). Tuy nhiên, sản xuất chanh leo gặp nhiều 63
BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học (CMV); East Asian Passiflora virus (EAPV) (gồm Các cặp mồi AOCP1/AOCP2, chủng AO và IB) (Fukumoto et al., 2012, Hang et AOHC1/AOHC2 và IBCP1/IBCP2 từ phòng thí al., 2018); Passionfruit woodiness virus (PWV) và nghiệm vi rút thực vật trường Đại học quốc Telosma mosaic virus (TelMV) (Pissawan gia Chung Hsing - Đài Loan (bảng 1, Chong et Chiemsombat et al., 2014) al., 2018). Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao trong chẩn đoán một số loài 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu RNA vi rút ở Việt Nam như vi rút gây bệnh lùn 2.2.1. Thu mẫu: sọc đen phương Nam trên lúa (Hoang et al., Mẫu lá, quả chanh leo được thu thập tại các 2011), Papaya Ring Spot Virus (PRSV) gây bệnh vùng trồng chính ở 2 tỉnh Nghệ An và Đắk Nông. đốm hình nhẫn đu đủ (Revill et al., 2004) Mẫu lá, quả tươi được bảo quản trong túi nhựa Tại Việt Nam cũng đã xác định được 4 loài vi PE ở nhiệt độ 4°C; mẫu lá khô được bảo quản rút gây bệnh trên chanh leo, trong đó bệnh cứng trong túi nhựa PE chứa Silicagel ở nhiệt độ trái (hóa bần vỏ trái) do East Asian Passiﬂora phòng. virus (EAPV) được coi là bệnh hại nguy hiểm 2.2.2. Tách chiết RNA tổng số bằng Trizol nhất trên chanh leo tại Việt Nam. Bệnh gây hại Các bước cơ bản và thành phần hóa chất nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản và chất lượng quả, nhiều vườn trồng chanh leo xuất (Invitrogen): 0,1g mẫu tươi hoặc 0,03g mẫu tại Tây Nguyên bị bệnh nặng đã phải hủy vườn. khô được nghiền với nitơ lỏng bằng chày cối sứ. Do vậy, xác định phương pháp chẩn đoán Chuyển mẫu vào 1 ống ly tâm 1,5ml, bổ sung nhanh, chính xác bệnh cứng trái do EAPV gây ra 1ml Trizol, lắc mạnh sau đó tiến hành ly tâm là yêu cầu cấp thiết để góp phần quản lý bệnh 12000 vòng trong 10 phút. Sau khi ly tâm phần đạt hiệu quả cao. dịch trong phía trên (khoảng 900 l) được 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU chuyển sang 1 ống khác và bổ sung 300 µl Chloroform, lắc mạnh trong 30 giây sau đó ly tâm 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12000 vòng trong 10 phút. Chuyển dịch trong Mẫu lá, quả chanh leo thu thập tại Nghệ An phía trên sang 1 ống khác và bổ sung 250 µl và Đắk Nông. Isopropanol, 250 µl 0,8M Sodium Citrate, 250 µl Các hóa chất gồm: Trizol, Chloroform, 1,2 M NaCl, lắc nhẹ và ly tâm 12000 vòng trong Isopropanol, 0,8M Sodium Citrate, 1,2M NaCl, 15 phút ở nhiệt độ 4°C. Loại bỏ phần dịch trong One-Step RT-PCR kit (Affymetrix-USA). và rửa phần kết tủa 2 lần với cồn 75º. Làm khô Các dụng cụ và máy móc chuyên dùng: kết tủa ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan kết tủa bằng Pippet, hệ thống điện di ngang, hệ thống chụp 80 µl RNase-free H2O. ảnh gel, máy li tâm, máy li tâm lạnh, máy vortex, 2.2.3. Kỹ thuật One-step RT-PCR để chẩn máy PCR… đoán EAPV-AO, EAPV-IB Bảng 1. Một số Primer sử dụng trong nghiên cứu (Chong et al., 2018) Tên Primer Trình tự mồi Kích thước sản phẩm AOCP1(EAPV-AO CP fwd) CCCATGGTATTCAGCAGTCCA AAGAG 527bp AOCP2(EAPV-AO CP rev) GGGAATTCATACCCA AAAGGGTGT IBCP1(EAPV-IB CP fwd) GAAAAGAACAGGAACTCTGGCAA 615bp IBCP2(EAPV-IB CP rev) GTTTTGGATGTGACCTCATAAAAGTC AOHC1(EAPV –AO HC GGCCAGAGGAAACTTGCTATTGGC Pro fwd) 620bp AOHC2(EAPV –AO HC CCCAGTAGATCATTTGATGC Pro rev) 64
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 Quá trình phiên mã ngược được thực hiện 3.1 Triệu chứng bệnh cứng trái do East trong 30 phút tại 42°C. Tiếp theo, quá trình Asian Passiﬂora virus (EAPV) gây ra khuếch đại sản phẩm PCR được thực hiện lần Triệu chứng bệnh cứng trái do EAPV gây ra lượt với 95°C trong 3 phút, 40 vòng (95°C trong rất đa dạng với nhiều dạng triệu chứng khác 30 giây, 54°C trong 30 giây, 72°C trong 60 giây), nhau gồm: 1) Quăn và chùn ngọn; 2) Khảm vàng 72°C trong 3 phút và kết thúc ở 15°C. Thành trên lá non; lá già, lá nhăn nheo, phồng rộp; 3) phần hóa chất trong mỗi tuýp phản ứng (50µl) Quả nhỏ, vỏ quả hóa bần, quả biến dạng, vỏ quả gồm: 1X RT-PCR buffer, 0,2 mM dNTPs, 4 units chuyển màu từ màu sang sang màu trắng. RNase Inhibitor, 1 unit RT-PCR Enzyme Mix, 0,2 Chủng EAPV – AO gây triệu chứng khảm lá, mM forward primer, 0,2 mM reverse primer. Nồng phồng rộp lá non, cứng trái, quả nhỏ, dịch quả ít, độ agarose 1% được sử dụng để chạy điện di ở vỏ quả biến màu. dòng điện 110 Vol bằng dung dịch 0,5X TAE. Chủng EAPV – AO và IB gây triệu chứng Dựa vào thang chuẩn của marker ở 100 bp DNA quăn lá, khảm lá, vỏ quả hóa bần tuy nhiên mức (Norgen-Canada) để so sánh sản phẩm. độ bệnh của chủng EAPV – IB nhẹ hơn so với 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chủng EAPV – AO. Hình 1. Các triệu chứng bệnh do EAPV gây ra trên chanh leo: A. Quăn ngọn, biến dạng lá non; B, C. Khảm, phồng lá non; D. Quả nhỏ, biến dạng, vỏ cứng; E,F,G: Vỏ quả hóa bần, sần sùi, biến màu; H,I. Lá và quả khỏe 3.2 Chẩn đoán East Asian Passiﬂora virus thước sản phẩm tương ứng là 527 và 620 bp đã (EAPV) gây bệnh trên chanh leo được sử dụng để xác định chủng AO của East Asian Passiﬂora virus (EAPV) (Chong et al., Trong nghiên cứu này hai cặp mồi 2018). Tương tự cặp mồi IBCP1/IBCP2 với kích AOCP1/AOCP2 và AOHC1/AOHC2 với kích thước sản phẩm là 615 bp đã được sử dụng 65
BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học nhằm xác định chủng IB của EAPV. Cả 3 cặp thấy có sự xuất hiện của cả 2 chủng EAPV-AO mồi này đã được kiểm tra độ nhạy và tính đặc và EAPV-IB tại Nghệ An và chủng EAPV-AO tại hiệu trên các mẫu EAPV-AO và EAPV-IB tại Đài Đắk Nông. Trong năm 2018 đã có 120 mẫu Loan (Chong et al., 2018). chanh leo được chẩn đoán sử dụng các cặp mồi Các mẫu chanh leo có triệu chứng vàng lá, nói trên đều cho kết quả nhanh, chính xác, ổn khảm lá thu thập tại Nghệ An và Đắk Nông đã định (bảng 2). được giám định bằng 3 cặp mồi trên, kết quả cho Bảng 2. Kết quả giám định virus một số mẫu chanh leo tại Nghệ An và Đắk Nông (Viện BVTV, 2018) Số mẫu nhi m virus STT Địa điểm thu mẫu Tổng số mẫu giám định EAPV-AO EAPV-IB 1 Nghệ An 90 14 4 2 Đắk Nông 30 4 0 Tổng cộng 120 18 4 Tỷ lệ - 15% 3,33% Kết quả bảng 2 cho thấy trong 120 mẫu giám định có 18 mẫu nhi m EAPV-AO chiếm tỷ lệ 15% và 4 mẫu nhi m EAPV-IB chiếm 3,33%. Hình 2. Kết quả giám định EAPV-AO với 2 cặp Hình 3. Kết quả giám định EAPV-IB với cặp mồi AOCP1/AOCP2 và AOHC1/AOHC2. Giếng mồi IBCP1/IBCP2. Giếng 1: 100-bp DNA 1: 100-bp DNA ladder; Giếng 2: Đối chứng cây ladder; Giếng 2: Đối chứng cây khỏe; khỏe, Giếng 3,5: Mẫu NA1 (thu tại Nghệ An); Giếng 3: Mẫu NA2. Giếng 4,6: Mẫu ĐN1 (thu tại Đắc Nông) Ghi chú: Mẫu NA1, NA2 thu thập tại huyện Quế Phong- Nghệ An. Mẫu ĐN1 thu thập tại thị xã Gia Nghĩa – Đắc Nông. Đánh giá độ nhạy và tính đặc hiệu của quy EAPV-AO thu thập tại Nghệ An với các loại mẫu trình, các loại mẫu khác nhau đã được thử khác nhau được giám định bằng phương pháp nghiệm bao gồm: (i) lá non, lá già, là đài, vỏ quả; RT-PCR (bảng 3). (ii): mẫu tươi và mẫu đã ép khô. 10 mẫu nhi m 66
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 Bảng 3. Đánh giá độ nhạy, tính đặc hiệu của quy trình giám định trên một số loại mẫu khác nhau nhiễm EAPV-AO thu thập tại Nghệ An (Viện Bảo vệ thực vật, 2018) STT Chủng loại mẫu Tỷ lệ phân tích chính xác bằng RT-PCR (mẫu) 1 Lá non 10/10 2 Lá già 0/10 3 Lá đài 10/10 4 Vỏ quả 10/10 5 Lá non đã ép khô 10/10 Kết quả cho thấy, trên cùng một cây dương TÀI LIỆU THAM KHẢO tính với vi rút, các mẫu trên lá non, vỏ quả, lá đài cho kết quả dương tính, rõ nét trong khi mẫu lấy 1. Nguy n Tuấn Lộc, Nguy n Huy Khánh, Hà Viết trên lá già cho kết quả âm tính. Các mẫu lá non Cường, Nguy n Văn Liêm, Võ Thị Dung và cs., được ép khô sau 3 tháng cho kết quả dương tính 2017. Kết quả nghiên cứu bước đầu vê thành phần rõ nét. sâu, bệnh hại cây chanh leo tại huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 4, tr 17-26. 2. Hoang, A. T., Zhang, H. M., Yang, J., Chen, J. P., Hébrard, E., Zhou, G. H., & Cheng, J. A. , 2011. Identification, characterization, and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Viet Nam. Plant Disease, 95(9), 1063-1069. 3. Chang, 1992. Characterization and Comparison Hình 4. Kết quả đánh giá độ nhạy của of Passionfruit Mottle Virus, a Newly Recognized phản ứng RT-PCR với một số bộ phận của Potyvirus, with Passionfruit woodiness virus. cây chanh leo. M: Ladder 100bp; H: Đối Phytopathology 82:1358-1363. chứng cây khỏe; P: Đối chứng cây bệnh; 4. Cheng, Y. H., Deng, T. C., Chen, C. C., A: Mẫu lá non; B: Mẫu lá đài; C: Mẫu vỏ quả; Chiang, C. H., & Chang, C. A., 2016. First Report of D: Lá non ép khô; E: Mẫu lá già. Euphorbia leaf curl virus and Papaya leaf curl Guangdong virus on Passion Fruit in Taiwan. Plant 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Disease, 100(4), 865-865. 5. Chong, Y. H., Cheng, Y. H., Cheng, H. W., 4.1 Kết luận Huang, Y. C., & Yeh, S. D., 2018. The virus causing - Quy trình One-step RT-PCR sử dụng 2 cặp passionfruit woodiness disease in Taiwan is mồi AOCP1/AOCP2 và IBCP1/IBCP2 cho kết reclassified as East Asian passiflora virus. Journal quả rõ nét, ổn định để giám định 2 chủng EAPV- of General Plant Pathology, 84(3), 208-220. AO và EAPV-IB với kích thước sản phẩm tương 6. Fukumoto, T., Nakamura, M., Rikitake, M., & ứng là 527bp và 615bp. Iwai, H., 2012. Molecular characterization and - Trong số 120 mẫu chanh leo ở Nghệ An và specific detection of two genetically distinguishable Đắk Nông có 18 mẫu nhi m EAPV-AO và 4 mẫu strains of East Asian Passiflora virus (EAPV) and nhi m EAPV-IB. their distribution in southern Japan. Virus genes, - Các bộ phận của cây chanh leo như lá non, 44(1), 141-148. quả, lá đài đều cho kết quả chẩn đoán rõ nét. 7. Iwai H, Yamashita Y, Nishi N, Nakamura M, Không sử dụng lá già trong chẩn đoán và giám 2006. The potyvirus associated with the dappled fruit định vi rút EAPV. of Passiﬂora edulis in Kagoshima prefecture, Japan is the third strain of the proposed new species East 4.2 Đề nghị Asian Passiﬂora virus (EAPV) phylogenetically Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán distinguished from strains of Passion fruit woodiness bệnh cứng trái (EAPV) gây hại trên chanh leo. virus”, Arch Virol 151: 811–818. 67