Ưu, nhược điểm và ứng dụng của phương pháp PCR
Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR
Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được
một trình tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực
hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện
đồng thời). Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu
vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).
Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để
có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại.
Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm
lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase khoảng
104 (sai sót cho một lần sao chép).
Phạm vi sử dụng
- Sản xuất mẫu dò đánh dấu phóng xạ (dầu dò) với khối lượng lớn, phù hợp
với phương pháp lai giữa DNA và DNA, RNA và DNA.
- Khuếch đại số lượng RNA, do lượng mRNA nhỏ dưới mức cho phép nên
người ta dùng phương pháp RT-PCR để tăng nồng độ mRNA đến một giới
hạn phát hiện bằng cách phiên mã ngược: mRNA → cDNA. Từ cDNA, ta
đánh giá được mRNA.
- Khuếch đại DNA và RNA ngay tại hệ mô: Gọi là kỹ thuật insitu, kỹ thuật
này được tiến hành ngay trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame trong thiết
bị PCR có bộ phận tạo nhiệt cho lame.
- Trong nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật PCR được dùng để nghiên cứu những
thay đổi ở mức độ DNA của các dòng mô nuôi cấy và các cây tái sinh từ mô
sẹo, để nghiên cứu sự có mặt của các gen ngoại lai trong các cây biến nạp.
- Định lượng DNA: Khi nồng độ DNA thấp, dùng phương pháp PCR nhân
lên đến mức xác định. Người ta xác định được số lượng bản mẫu ban đầu qua
tính toán dựa vào sản phẩm cuối cùng và số chu kỳ nhân. Điều quan trọng là
số chu kỳ nhân không được vượt quá giai đoạn đầu của phản ứng, khi mà số
lượng bản sao còn tỷ lệ thuận với số lượng bản mẫu ban đầu.
Ứng dụng: Trong pháp y, chuẩn đoán những bệnh di truyền, nghiên cứu mẫu
khảo cổ, bảo tồn và duy trì những gen quí.
Tách và thu nhận gen
Ngày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng
ba phương pháp: tách các đoạn DNA từ bộ gen; tổng hợp gen bằng phương
pháp hoá học; sinh tổng hợp từ mRNA.
1. Tách các đoạn DNA từ bộ gen
Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển
kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt
nhỏ thành những đoạn có kích thước 1,5 → 2kb bằng restriction
enzyme (RE). Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết, sau đó gắn
vào vector chuyển gen, tạo plasmid DNA tái tổ hợp.
Nhược điểm là tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn
sử dụng để tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).
2. Sự tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học
Năm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu
Khorama, đó là gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin)
ở nấm men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì
không có các trình tự điều hoà.
Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa
cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng
200 cặp nucleotide.
Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng
hợp hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. và từ
đó, nòi E. Coli mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta
tổng hợp hóa học gen mã hóa hormone tăng trưởng của người dài 584pb.
Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn
tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen
insuline được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó,
được nối lại nhờ enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và
286bp mã hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30
aminoaxit.
Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng
hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin
ở protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp.
3. Sinh tổng hợp gen từ mRNA
Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có
mặt của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase). Sau đó, cDNA
(complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng
cDNA.
Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA
Ưu điểm là: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những
trình tự không mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã
hoá tổng hợp globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt
bò, ovalbumine (protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm.
Vào năm 1992 các nhà khoa học Mỹ đã tạo được dòng cDNA của 2.375 gen
của bộ não người. Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát
triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực.