Xạ khuẩn Streptomyces chartreusis CP23X9 sinh xylanase: đặc điểm sinh học và phân loại

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50<br /> <br /> XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 SINH XYLANASE:<br /> ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI<br /> Vũ Văn Lợi, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Thị Hồng Liên,<br /> Phạm Thị Bích Hợp, Phan Thị Hồng Thảo*<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *pthongthao@ibt.ac.vn<br /> TÓM TẮT: Xylan là thành phần chính của hemicellulose, được cấu tạo từ các phân tử D-xylopyranose<br /> thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên. Sự phân hủy xylan bởi xylanase được nghiên cứu nhiều ở vi<br /> sinh vật, đặc biệt là nấm và xạ khuẩn. Hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả<br /> năng sinh xylanase cao được quan tâm bởi tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chúng trong nhiều lĩnh vực<br /> khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp giấy và bột giấy. Trong nghiên cứu này, chủng CP23X9 có khả<br /> năng phân hủy xylan đã được mô tả đặc điểm sinh học và phân loại. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ<br /> khuẩn xanh và vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử trên<br /> từng chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng CP23X9 sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, ở điều kiện nhiệt<br /> độ, pH khá rộng (nhiệt độ 15-45oC; pH = 5-10) và chịu được nồng độ muối NaCl đến 6%. Xạ khuẩn<br /> CP23X9 có khả năng đồng hoá nhiều loại đường như D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và Lrhamnose. Đặc biệt, chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase),<br /> có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) và không sinh cellulase. Đối chiếu các đặc điểm phân loại của<br /> chủng với khóa phân loại xạ khuẩn ISP, khóa phân loại của Bergey và kết quả phân tích trình tự gen mã<br /> hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 có đặc điểm tương đồng cao (99%) với loài Streptomyces<br /> chartreusis. Hoạt tính xylanase của Streptomyces chartreusis CP23X9 có thể ứng dụng trong tẩy trắng bột<br /> giấy.<br /> Từ khóa: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, đặc điểm sinh học, phân loại xạ khuẩn, xylanase.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Xylan là thành phần chính của<br /> hemicellulose, chiếm 20-35% khối lượng chất<br /> khô. Thành phần của xylan bao gồm mạch<br /> chính được cấu tạo bởi đường D-xylopyranose<br /> thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên Oacetyl, α-L-arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl.<br /> Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự tham<br /> gia hoạt động của tổ hợp xylanase [4]. Đến nay,<br /> xylanase từ vi sinh vật được quan tâm chú ý<br /> mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng trong nhiều<br /> lĩnh vực như bột giấy, thức ăn chăn nuôi,<br /> chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học và công<br /> nghiệp đồ uống.<br /> Xylanase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài<br /> vi sinh vật khác nhau như vi nấm, vi khuẩn, xạ<br /> khuẩn (Penicillium janthinellum, Arthrobacter<br /> sp.,<br /> Streptomyces<br /> cyaneus,<br /> S.<br /> albus,<br /> S. Chromofuscus và S. chartreusis) [2, 5, 8].<br /> Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn được công bố<br /> có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và không có<br /> hoạt tính cellulase [8]. Sử dụng xylanase trong<br /> tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lượng chlorine<br /> <br /> (Cl2) và hypochlorine (ClO2) dùng trong trong<br /> tẩy trắng, đồng thời giảm lượng hóa chất thải ra<br /> môi trường. Đến nay, xylanase từ S. albus và S.<br /> chromofuscus đã được ứng dụng thành công<br /> trong tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ<br /> chủng S. albus giúp độ sáng của bột giấy tăng<br /> 4% và xylanase từ S. chromofuscus có hiệu quả<br /> tẩy trắng tăng 9,1% so với không xử lý [8].<br /> Trong bài này, chúng tôi nghiên cứu đặc điểm<br /> sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn<br /> CP23X9 sinh xylanase cao nhằm ứng dụng<br /> trong tẩy trắng bột giấy.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Các chủng xạ khuẩn và vi sinh vật kiểm<br /> định:<br /> Bacillus<br /> subtilis<br /> ATCC<br /> 6633,<br /> Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea,<br /> Escherichia coli PA2, Staphylococcus aureus<br /> 208P và Candida albicans nhận từ bộ sưu tập<br /> giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện<br /> Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và<br /> Công nghệ Việt Nam.<br /> <br /> 45<br /> <br /> Vu Van Loi et al.<br /> <br /> Môi trường nuôi cấy và phân loại: các môi<br /> trường theo ISP (International Streptomyces<br /> Project). Môi trường GI (g/l): Oat spelts xylan<br /> 5; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5;<br /> NaCl 0,5; FeSO4.H2O 0,0; pH 7,2-7,5. Môi<br /> trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20; K2HPO4<br /> 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5;<br /> FeSO4.H2O 0,01; pH 7,2-7,5. Môi trường Gause<br /> II (g/l): Glucose 10; pepton 5; cao thịt 0,5; NaCl<br /> 5; pH 7,2-7,5.<br /> Phương pháp<br /> Phương pháp xác định hoạt tính xylanase<br /> Hoạt tính xylanase được xác định bằng đo<br /> lượng đường khử giải phóng ra từ 0,5% (w/v)<br /> oat spelts xylan, sử dụng 3,5- Dinitrosalicylic<br /> acid (DNS) là chất phản ứng [3] và D-xylose<br /> làm đường chuẩn. Một đơn vị hoạt tính enzyme<br /> xylanase được định nghĩa là lượng enzyme cần<br /> để giải phóng ra 1µmol xylose từ oat spelts<br /> xylan 0,5% (w/v) trong điều kiện thí nghiệm<br /> [7].<br /> Phân loại CP23X9 bằng quan sát đặc điểm hình<br /> thái, phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA<br /> Nghiên cứu đặc điểm sinh học theo phương<br /> pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại Bergey<br /> [6, 12]. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC),<br /> khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tan tiết ra<br /> môi trường được đánh giá theo Shirling và<br /> Gottlieb (1966) trên bảng màu của Tresner &<br /> Backus [10, 11]. Hình dạng cuống sinh bào tử<br /> và bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính<br /> <br /> hiển vi điện tử JSM-5000.<br /> Phân tích trình tự gen 16S rDNA<br /> DNA tổng số của chủng CP23X9 được tách<br /> chiết theo phương pháp của Sambrook &<br /> Russell (2001) [9]. Gen mã hóa 16S rRNA của<br /> chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng<br /> PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi GF1 (5'TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và GR1<br /> (5’-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’) theo<br /> chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình<br /> (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC<br /> trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở<br /> 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân<br /> tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100<br /> Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm<br /> SeqAssem version 01/2005 và Sequencher<br /> version 4.0.5. Mức độ tương đồng gen 16S<br /> rDNA của chủng nghiên cứu được so sánh với<br /> các trình tự gen 16S rDNA trong Genbank.<br /> Mức độ tương đồng di truyền của các chủng<br /> được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX<br /> 2.0.11.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Tuyển chọn xạ khuẩn sinh xylanase<br /> Từ các mẫu mùn gỗ mục đã phân lập được<br /> 12 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp<br /> xylanase. Trong số đó, chủng CP23X9 sinh tổng<br /> hợp xylanase mạnh nhất (42,70 U/ml) được lựa<br /> chọn để định tên đến loài nhằm sử dụng trong<br /> các nghiên cứu tiếp theo (bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Hoạt tính xylanase của một số chủng xạ khuẩn tuyển chọn<br /> Chủng<br /> CP5X1<br /> CP6X5<br /> CP12X7<br /> CP13X8<br /> CP13X11<br /> CP16X6<br /> <br /> Xylanase (U/ml)<br /> 36,75<br /> 27,33<br /> 21,34<br /> 22,79<br /> 30,86<br /> 33,25<br /> <br /> Chủng<br /> CP18X3<br /> CP18X21<br /> CP20X2<br /> CP22X6<br /> CP23X9<br /> CP25X11<br /> <br /> Chủng xạ khuẩn tuyển chọn có hoạt tính<br /> xylanase tương đương với hoạt tính xylanase<br /> thu nhận từ các chủng xạ khuẩn được một số tác<br /> giả công bố trên thế giới như Streptomyces<br /> chartreusis L1105 (45,16 U/ml), S. albus (32,53<br /> U/ml), S. chromofuscus (43,01U/ml) [2, 8].<br /> 46<br /> <br /> Xylanase (U/ml)<br /> 34,38<br /> 23,32<br /> 36,07<br /> 25,59<br /> 42,70<br /> 24,13<br /> <br /> Đặc điểm sinh học của chủng CP23X9<br /> Đặc điểm nuôi cấy<br /> Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn vàng<br /> xám, sinh trưởng tốt trên các môi trường ISP13, ISP5-7, Gause I, Gause II và sinh trưởng yếu<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50<br /> <br /> trên môi trường ISP4 và Gause I. Khuẩn ty khí<br /> sinh có màu vàng trên môi trường ISP1 và ISP6,<br /> màu xanh trên ISP2-ISP5, Gause I và Gause II.<br /> Trên các môi trường ISP1, ISP4, ISP5, ISP6 và<br /> a<br /> <br /> Gause I, khuẩn ty cơ chất có màu vàng và có<br /> màu xám trên ISP2, ISP3, ISP7 và Gause II.<br /> Chủng CP23X9 không tạo sắc tố melanin trên<br /> các môi trường nghiên cứu (hình 1a, 1b).<br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> d<br /> <br /> Hình 1. Khuẩn lạc mặt trước (a), mặt sau (b), bề mặt bào tử (c)<br /> và cuống sinh bào tử (d) của chủng CP23X9.<br /> Đặc điểm bào tử dưới kính hiển vi điện tử<br /> Chủng CP23X9 được nuôi trên môi trường<br /> ISP2 sau 5 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi<br /> điện tử JSM-5000 ở độ phóng đại 5000 lần cho<br /> thấy, cuống sinh bào tử của chủng CP23X9 có<br /> dạng xoắn (S) (hình 1d), trên một chuỗi có<br /> khoảng 10-50 bào tử. Ở độ phóng đại 10000<br /> lần, bề mặt bào tử dạng gai (sp) (hình 1c).<br /> Đặc điểm sinh lý sinh hóa<br /> Nghiên cứu khả năng đồng hóa các nguồn<br /> đường là chỉ tiêu quan trọng để tiến hành phân<br /> loại xạ khuẩn theo khóa phân loại của<br /> Nomomura trong ISP (1974) [6]. Kết quả cho<br /> thấy chủng CP23X9 có khả năng đồng hoá<br /> nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi<br /> trường có bổ sung D-glucose, D-xylose,<br /> D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose, phát<br /> triển yếu trên môi trường có lactose, D-fructose<br /> và saccharose nhưng không phát triển trên môi<br /> <br /> trường có sorbitol. Xạ khuẩn CP23X9 có thể<br /> sinh trưởng được ở điều kiện nhiệt độ từ 1545C, pH 5-10 và chịu được nồng độ muối<br /> NaCl tới 6% w/v. Dịch nuôi cấy từ chủng<br /> CP23X9 có khả năng ức chế một số chủng vi<br /> khuẩn kiểm định như Bacillus subtilis 6630,<br /> Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus<br /> aureus 208P. Tuy nhiên, chủng này lại không<br /> có khả năng ức chế Sarcina lutea, Escherichia<br /> coli PA2 và nấm Candida albicans. Chủng có<br /> hệ enzyme ngoại bào phong phú như ligninase,<br /> protease, amylase, nhưng không sinh tổng hợp<br /> cellulolase.<br /> Định tên đến loài chủng CP23X9<br /> Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng<br /> nghiên cứu theo các khóa định tên loài xạ khuẩn<br /> trong ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey,<br /> chúng tôi xác định chủng CP23X9 có thể xếp<br /> vào nhóm xạ khuẩn Streptomyces. Tuy nhiên,<br /> để phân loại chủng CP23X9 đến loài, cần kết<br /> 47<br /> <br /> Vu Van Loi et al.<br /> <br /> hợp kết quả về đặc điểm sinh hóa và trình tự<br /> gen 16S rDNA.<br /> Từ kết quả xác định trình tự cho thấy, gen<br /> 16S rDNA của chủng CP23X9 có độ tương<br /> đồng cao (98-99%) với các gen tương ứng của<br /> một số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình<br /> 2): S. chartreusis XSD08102, S. chartreusis<br /> DA10203,<br /> S.<br /> chartreusis<br /> HA10304,<br /> S.<br /> chartreusis<br /> DSM41255<br /> (99%),<br /> <br /> S. flavovariabilis 1184, S. phaeoluteigriseus<br /> ISP5182, S. bobili NBRC13199, S. galilaeus<br /> JCM 4757, S. pseudovenezuelae HBUM174623<br /> (98%). Như vậy, kết quả phân loại cho thấy<br /> chủng xạ khuẩn CP23X9 có đặc điểm rất gần<br /> gũi và có độ tương đồng cao với loài<br /> Streptomyces chartreusis nên chủng xạ khuẩn<br /> này được đặt tên là Streptomyces chartreusis<br /> CP23X9.<br /> <br /> Hình 2. Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces chartreusis CP23X9<br /> với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA<br /> Khả năng sinh tổng hợp xylanase<br /> Trong những năm gần đây, khả năng sinh<br /> tổng hợp xylanase từ các chủng xạ khuẩn cũng<br /> được nhiều tác giả công bố như S. cyaneus [5],<br /> S. albus, S. chromofuscus [8], Streptomyces sp.<br /> Lb24 [7], S. chartreusis [2] và Streptomyces<br /> AMT-3 [40]. Theo Li et al. (2011) [2], chủng<br /> S. chartreusis L1105 sinh xylanase đạt cực đại<br /> (45,16 U/ml) sau 7 ngày trên môi trường sử<br /> dụng oat spelt xylan làm nguồn cacbon. Chủng<br /> xạ khuẩn CP23X9 trong công bố này thể hiện<br /> khả năng sinh tổng hợp xylanase cao (42,70<br /> U/ml) không sinh tổng hợp cellulose và qua<br /> phân loại cho thấy đây là một trong những loài<br /> xạ khuẩn có ý nghĩa trong việc ứng dụng xử lý<br /> 48<br /> <br /> tẩy trắng bột giấy đã được nhiều tác giả công<br /> bố. Thí dụ, sau quá trình ủ bột giấy với xylanase<br /> từ S. chartreusis L1105, S. Thermoviolaceus và<br /> Streptomyces sp. QG-11-3 hệ số kappa (thể hiện<br /> mức độ khử lignin) giảm lần lượt là 12,2; 16 và<br /> 23% [2]. Sử dụng xylanase từ chủng S. albus<br /> giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% so với không<br /> xử lý. Trong khi đó, hiệu quả tăng độ sáng của<br /> bột giấy nhận được là 9,1% khi sử dụng<br /> xylanase từ S. chromofuscus [8]. Khả năng sinh<br /> tổng hợp xylanase của Streptomyces chartreusis<br /> CP23X9 trong nghiên cứu này đạt tới 42,70<br /> U/ml cho thấy là đây là một trong những chủng<br /> xạ khuẩn bản địa quí, có triển vọng trong xử lý<br /> tẩy trắng bột giấy.<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Chủng CP23X9 phân lập từ gỗ mục, sinh<br /> trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, trong<br /> khoảng nhiệt độ và pH khá rộng (nhiệt độ 1545oC; pH 5-10) và chịu được nồng độ NaCl đến<br /> 6%. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn<br /> xanh hoặc vàng xám, có chuỗi bào tử dạng<br /> xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử<br /> trên từng chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng có hệ<br /> enzyme ngoại bào phong phú (ligninase,<br /> protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao<br /> (42,7 U/ml) và không sinh cellulase. Đối chiếu<br /> các đặc điểm phân loại của chủng nghiên cứu<br /> theo các khóa phân loại ISP, so sánh với khóa<br /> phân loại Bergey và kết hợp với kết quả phân<br /> tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy,<br /> chủng CP23X9 thuộc loài Streptomyces<br /> chartreusis với độ tương đồng 99%.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 1. Bajai B. K., Razdan K., Sharma A., 2010.<br /> Thermoactive<br /> alkali-stable<br /> xylanase<br /> production from a newly isolated<br /> Streptomyces sp. SU9. Indian J. Chem.<br /> Technol., 17: 375-380.<br /> 2. Li X., Sun B., Zhao J., Lv Y., Song H., Li<br /> E., Zhu Y., 2011. Production and improved<br /> bleaching abilities of a thermostable<br /> xylanase<br /> from<br /> a<br /> newly<br /> isolated<br /> Streptomyces chartreusis strain. Afr J.<br /> Biotechnol., 10(64): 14132-14142.<br /> 3. Miller L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid<br /> reagent for determination of reducing sugar.<br /> Anal. Chem., 31: 426-431.<br /> 4. Nascimento R. P., Coelho R. R. R.,<br /> Marques S., Alves L., Gírio F. M., Bon E.<br /> P. S., Amaral-Collaco M. T., 2002.<br /> Production and partial characterisation of<br /> xylanase from Streptomyces sp. strain<br /> <br /> AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil.<br /> Enzyme Microb. Technol., 31: 549-555.<br /> 5. Ninawe S., Kapoor M., Kuhad R. C., 2008.<br /> Purification and characterization of<br /> extracellular xylanase from Streptomyces<br /> cyaneus SN32. Bioresour. Technol., 99:<br /> 1252-1258.<br /> 6. Nomomura H., 1974. Key for classification<br /> and identification of 458 species of the<br /> Streptomyces included in ISP. J. Ferment.<br /> Technol., 52(2): 78-92.<br /> 7. Rawashded R., Saadoun I., Mahasneh A.,<br /> 2005. Effect of cultural conditions on<br /> xylanase production by Streptomyces sp.<br /> (strain Ib 24D) and its potential to utilize<br /> tomato pomace. Afr. J. Biotechnol., 4(3):<br /> 251-255.<br /> 8. Rifaat H. M., Nagieb Z. A., Ahmed Y. M.,<br /> 2005. Production of xylanase by<br /> Streptomyces species and their bleaching<br /> effect on rice straw pulp. Appl. Ecol.<br /> Environ. Res., 4(1): 151-160.<br /> 9. Sambrook J., Russell D. W., 2001.<br /> Molecular cloning. A laboratory manual,<br /> 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,<br /> Cold Spring Harbor, New York.<br /> 10. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966.<br /> Cooperative description of type culture of<br /> Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol.,<br /> 19(4): 391-512.<br /> 11. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966. Methods<br /> for characterisation of Streptomyces species.<br /> Int. J. Sys. Bacteriol., 16(3): 313-340.<br /> 12. Wilkins W., 1989. Bergey’s Manual of<br /> Systematic Bacteriology. Vol. 2, Vol. 3,<br /> Vol. 4. Publisher Springer-Verlag, New<br /> York.<br /> <br /> 49<br /> <br />