Xác định Epitop tiềm năng trên protein fliC và OmpN3 của Edwardsiella ictaluri in silico để hướng đến ứng dụng làm vaccin phòng bệnh gan thận mủ

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> XÁC ĐỊNH EPITOP TIỀM NĂNG TRÊN PROTEIN FLIC VÀ OMPN3<br /> CỦA EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO ĐỂ HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG<br /> LÀM VACCIN PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ<br /> Nguyễn Thị Linh Giang*, Nguyễn Anh Minh*, Huỳnh Xuân Yến*, Trần Cát Đông*, Vũ Thanh Thảo*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá da trơn. Một số protein kháng<br /> nguyên tiềm năng của E. ictaluri đã được nghiên cứu như OmpN3 và fliC nhằm ứng dụng trong việc tạo<br /> vaccin tái tổ hợp để phòng bệnh. Để các vaccin này có thể chủng ngừa qua đường niêm mạc, kháng nguyên<br /> cần được cố định lên giá mang như Bacillus subtilis để tăng hiệu quả tác động.<br /> Mục tiêu: Xác định vùng mang tính kháng nguyên của trình tự fliC và OmpN3, đồng thời trình tự<br /> nucleotide mã hóa cho các vùng này cũng được tối ưu hóa để biểu hiện trong Bacillus subtilis.<br /> Phương pháp: 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh gan thận mủ được định danh bằng phản ứng<br /> sinh hóa và giải trình tự 16S rDNA. Các gen fliC và OmpN3 được khuếch đại và giải trình tự để so sánh độ<br /> tương đồng. Vùng mang tính kháng nguyên của fliC và OmpN3 được xác định bằng chương trình Imed,<br /> EpiC và Swiss-Model. Quá trình tối ưu hóa vùng có tính kháng nguyên để biểu hiện trên Bacillus subitlis<br /> được thực hiện với chương trình ATGme.<br /> Kết quả: 30 chủng E. ictaluri MS-17-156 đã được phân lập và định danh thành công. Nghiên cứu đã<br /> xác định và tối ưu hóa thành công đoạn gen mã hóa cho vùng kháng nguyên gồm 60 acid amin của protein<br /> fliC và OMPN3 với chỉ số CAI của trình tự sau tối ưu hóa lần lượt đạt 0,825 và 0,811.<br /> Kết luận: Trình tự đoạn nucleotide mã hóa cho vùng kháng nguyên của gen fliC và OmpN3 đã tối ưu<br /> hóa in silico dự đoán có khả năng gây miễn dịch đặc hiệu đối với bệnh gan thận mủ, làm tiền đề cho các<br /> nghiên cứu phát triển vaccin tái tổ hợp.<br /> Từ khóa: fliC, OmpN3, epitope, E. ictaluri<br /> ABSTRACT<br /> IDENTIFICATION OF POTENTIAL EPITOPES ON OMPN3 AND FLIC PROTEIN<br /> FROM EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO TO SERVE<br /> AS VACCINE CANDIDATES AGAINST SEPTICEMIA<br /> Nguyen Thi Linh Giang, Nguyen Anh Minh, Huynh Xuan Yen, Tran Cat Dong, Vu Thanh Thao<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 32 – 39<br /> <br /> Introduction: Edwardsiella ictaluri is the causative agent of Enteric septicemia in catfish (ESC).<br /> OmpN3 and fliC protein from this bacteria have been proved to be potential vaccine candidates against<br /> ESC. Therefore, in an attempt to develop recombinant mucosal vaccine, epitopes on these proteins are<br /> identified and presented on the flagella of Bacillus subtilis to induce effective immune responses.<br /> Method: 30 bacterial strains were isolated from catfish with ESC and identified based on their<br /> biochemical profiles and 16S rDNA sequences. fliC and OmpN3 genes of these strains were amplified,<br /> sequenced and aligned. Their immunogenic regions were then identified and analyzed by bioinformatics<br /> software such as Imed, EpiC and Swiss-Model. Besides, the coding sequence of the chosen immunogenic<br /> region for expression in Bacillus subtilis was optimized by using ATGme program.<br /> *<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS. Vũ Thanh Thảo ĐT: 02838295641 – 127 Email: vuthanhthao@ump.edu.vn<br /> 32 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Result: Collected strains are identified to be E. ictaluri MS-17-156. The study has successfully<br /> determined and optimized the nucleotide sequence encoding for 60 amino acids which has highest<br /> immunogenicity for fliC and OMPN3 candidate protein. The CAI values of the optimized fliC and OmpN3<br /> coding sequences are 0.825 and 0.811, respectively.<br /> Conclusion: The chosen antigenic regions of fliC and OMPN3 prove to be potential epitopes for<br /> development of recombinant vaccines against ESC.<br /> Key words: fliC, OmpN3, epitope, E. ictaluri<br /> MỞĐẦU cho cá(3). Gần đây, Panangala và cs. đã xác<br /> định trên E. ictaluri có hai flagellin 35 và 37<br /> Edwardsiella ictaluri là trực khuẩn Gram (-)<br /> kDa được mã hóa bởi 4 gen fliC1, fliC2, fliC3 và<br /> thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh gan thận<br /> fliC4(6) có tính kháng nguyên và thể ứng dụng<br /> mủ ở cá da trơn, đặc biệt là cá tra. Bệnh ảnh<br /> làm vaccin gan thận mủ.<br /> hưởng lên cá ở mọi giai đoạn, phát triển<br /> nhanh chóng, lây lan mạnh và gây tỷ lệ chết Sự phát triển của tin sinh học kết hợp với<br /> cao(1). Điều trị với kháng sinh chỉ hiệu quả những tiến bộ trong công nghệ DNA tái tổ<br /> trong giai đoạn đầu khi cá mới nhiễm bệnh. hợp, kiến thức về đáp ứng miễn dịch của vật<br /> Do đó, biện pháp thích hợp nhất để dự phòng chủ và vật liệu di truyền của tác nhân gây<br /> bệnh cho cá là sử dụng vaccin. Các nghiên cứu bệnh đã mở ra một hướng đi mới cho sản xuất<br /> trong giai đoạn đầu chủ yếu sử dụng vaccin vi<br /> vaccin. Các phần mềm dự đoán vùng mang<br /> khuẩn bất hoạt. Tuy nhiên, khả năng gây miễn<br /> tính kháng nguyên in silico từ trình tự amino<br /> dịch ở cá không được kéo dài(8). Sau đó, các<br /> nghiên cứu hướng đến việc sử dụng vaccin acid được phát triển dựa trên nhiều yếu tố,<br /> giảm độc lực để chủng ngừa cho cá. Các bao gồm cấu trúc biểu hiện trên bề mặt dự<br /> vaccin dạng này thường dùng dưới dạng tiêm đoán, tính linh động của cấu trúc và các nhân<br /> phúc mô vì vậy không thể áp dụng với số tố trong trình tự gen có liên quan đến tính gây<br /> lượng cá thể lớn. Do đó, việc phát triển vaccin miễn dịch như epitope của tế bào T và tế bào<br /> tái tổ hợp có thể chủng ngừa qua đường niêm<br /> B(9). Hiện nay, phương pháp thông dụng nhất<br /> mạc sẽ giúp khắc phục các nhược điểm này.<br /> để dự đoán cấu trúc protein là mô phỏng<br /> Đối với các vaccin tái tổ hợp, việc lựa chọn<br /> kháng nguyên có tính chất quyết định hiệu tương đồng. Trong đó, trình tự protein đích<br /> quả chủng ngừa của vaccin. Trong số các được so sánh với cơ sở dữ liệu Protein Data<br /> kháng nguyên của E. ictaluri, protein màng Bank, từ đó tìm ra trình tự nào đã được xác<br /> ngoài (Outer membrane protein - Omp), và định cấu trúc bằng thực nghiệm tương đồng<br /> protein tiêm mao được chứng minh có khả với trình tự mục tiêu. Dựa trên trình tự này,<br /> năng gây đáp ứng miễn dịch tốt, đây là các<br /> các phần mềm sẽ xây dựng cấu trúc dự đoán<br /> ứng viên tiềm năng trong việc tạo vaccin tái tổ<br /> của protein mục tiêu. Bên cạnh đó, gen mục<br /> hợp. Omp là protein màng ngoài được nhận<br /> diện cao bởi kháng thể trong huyết thanh của tiêu cần được tối ưu hóa cho sự biểu hiện bởi<br /> cá nhiễm E. ictalurid(7). Trong ba loại OmpN đã chủng tái tổ hợp dự kiến nhằm tránh hiện<br /> được xác định ở E. ictaluri, OmpN3 có khả tượng dị biệt codon. Tần suất sử dụng các<br /> năng gây đáp ứng miễn dịch ở cá tốt nhất(11). codon đồng nghĩa thường có sự khác biệt giữa<br /> Đối với protein tiêm mao, gen mã hóa cho các loài, và đây thường được xem như một<br /> protein fliC của E. tarda tái tổ hợp vào E. coli<br /> trong những nguyên nhân chính tác động đến<br /> được sử dụng để tạo vaccin DNA phòng bệnh<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 33<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> mức độ biểu hiện protein(10). Chỉ số tương VẬT LIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> thích codon (Codon Adaption Index - CAI) và Vikhuẩn<br /> số lượng codon hoạt động hiệu quả (Effective<br /> 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra bị<br /> number of codon - ENc) là hai chỉ số thường gan thận mủ ở Đồng bằng sông Cửu Long<br /> được quan tâm khi tiến hành tối ưu hóa. được cung cấp bởi công ty Vemedim. E.<br /> Nghiên cứu tiến hành xác định và tối ưu hóa ictaluri medium (EIM) là môi trường chọn lọc<br /> đoạn nucleotide mã hóa vùng mang tính để phân lập vi khuẩn. Kit API 20E<br /> kháng nguyên của protein OmpN3 và fliC của (BioMerieux) dùng để khảo sát các đặc điểm<br /> E. ictaluri. Các trình tự mang tính kháng sinh hóa của vi khuẩn.<br /> <br /> nguyên này sẽ được chèn vào vùng biến động Định danh các chủng vi khuẩn<br /> (acid amin 144-217) ở giữa cấu trúc tiêm mao Vi khuẩn thu nhận được cấy trên môi<br /> trường EIM, quan sát và mô tả đặc điểm của<br /> hag của B. subtilis nhằm hướng đến ứng dụng<br /> khuẩn lạc.<br /> làm vaccin niêm mạc phòng bệnh gan thận mủ<br /> ở cá tra.<br /> Bảng 1: Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu<br /> Gen mục tiêu Tên Trình tự 5’-3’ Kích thước<br /> 16S rDNA 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1492 bp<br /> 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT<br /> fliC4 fliC4_F TTTTCACTATGGGTGCCGATAG 1227 bp<br /> fliC4_R GCCAATCGGCCATATACACTGG<br /> OmpN3 OmpN3_F AAAAAGCAACGCCGTTGCTC 1269 bp<br /> OmpN3_R AGCATAGGGTATCAGAGGGTATC<br /> Các chủng vi khuẩn được định danh dựa của E. ictaluri, có trình tự acid amin trên cơ sở<br /> trên đặc điểm sinh hóa thông qua kit API 20E. dữ liệu NCBI tương ứng lần lượt là<br /> Đồng thời, các chủng vi khuẩn được định AVZ83421.1, AVZ83422.1, AVZ83423.1 và<br /> danh ở cấp độ phân tử bằng giải trình tự gen AVZ83424.1(6). Các trình tự acid amin này<br /> 16S rDNA (Bảng 1). Mỗi mẫu được giải trình được gióng hàng cho thấy vùng bảo tồn thuộc<br /> tự với 2 phản ứng sử dụng mồi 27F và 1492R, acid amin 1-160 ở đầu tận N và 74 acid amin<br /> thực hiện bởi công ty Base I (Malaysia). Trình<br /> cuối ở đầu tận C, tương ứng với domain<br /> tự thu được từ các phản ứng này được lắp ráp<br /> D0/D1 của cấu trúc flagella vi khuẩn Gram<br /> lại dựa trên vùng gối đầu của các trình tự<br /> âm. Domain D0/D1 sẽ gấp cuộn và tương tác<br /> bằng chương trình SeqMan (Lasergene 7.0).<br /> với Toll-like Receptor 5 gây đáp ứng miễn<br /> Trình tự được đưa lên NCBI nBLAST để so<br /> sánh với dữ liệu DNA của GenBank. Các loài dịch. Vì vậy, lựa chọn trình tự mang tính<br /> có giá trị E thấp nhất và vùng Query Coverage kháng nguyên trên vùng biến động của gen để<br /> cao nhất là tương đối gần nhất với các chủng tạo được miễn dịch đặc hiệu đối với E. ictaluri.<br /> giải trình tự. Khi so sánh vùng biến động của các trình tự<br /> Xác định trình tự mang tính kháng nguyên fliC1-fliC4, nhận thấy vùng biến động trong<br /> của fliC và OmpN3 của trình tự acid amin quy định bởi gen fliC4<br /> biểu hiện trên bề mặt của phân tử protein<br /> Nghiên cứu của Panangala và cs. đã xác<br /> (theo kết quả mô phỏng cấu trúc của protein<br /> định và giải trình tự được 4 gen fliC1, fliC2,<br /> từ chương trình Swiss-Model), do đó sẽ có khả<br /> fliC3 và fliC4 cùng quy định cho tiêm mao fliC<br /> <br /> <br /> 34 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> năng tạo miễn dịch tốt hơn(2). Cụ thể, một trình SnapGene để thu nhận protein hag.NFC<br /> trình tự biểu hiện lên bề mặt sẽ tương tác và hag.NOC. Các protein tái tổ hợp được kiểm<br /> được với kháng thể hiệu quả hơn (hoạt động tra lại tính kháng nguyên và sự biểu hiện lên<br /> như B-cell epitope). Vì vậy, nhóm nghiên cứu bề mặt tiêm mao của đoạn kháng nguyên chèn<br /> lựa chọn gen fliC4 là gen đích để xác định bằng chương trình Imed và Swiss-Model.<br /> vùng mang tính kháng nguyên đặc hiệu đối Tối ưu hóa các gen cho sự biểu hiện bởi<br /> với E. ictaluri. Neema và cs. đã ứng dụng tin Bacillus subtilis<br /> sinh học xác định cấu trúc và chức năng của<br /> Quá trình tối ưu hóa được thực hiện bằng<br /> OmpN. Kết quả, ở E. ictaluri có 3 OmpN<br /> cách thay thế các codon hiếm và rất hiếm của<br /> (OmpN1, OmpN2 và OmpN3)(5). Yang và cs. đã<br /> trình tự mang tính kháng nguyên thành các<br /> tạo dòng và biểu hiện thành công rOmpN để<br /> codon tối ưu cho B. subtilis (dựa trên bảng mã<br /> thử nghiệm khả năng bảo vệ chống lại E.<br /> tần suất sử dụng codon của B. subtilis subsp.<br /> ictaluri. Kết quả cho thấy chủng ngừa bằng<br /> subtilis str. 168), tuy nhiên, nếu codon hiếm<br /> protein rOmpN3 có phần trăm sống sót tương<br /> hoặc rất hiếm đó có xuất hiện trong gen hag<br /> đối là 67,5%, cao hơn so với rOmpN1 và<br /> nguyên thủy thì không thay thế. Mục tiêu đạt<br /> rOmpN2(11). Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa<br /> được chỉ số CAI tương đương với CAI của<br /> chọn gen OmpN3 là gen đích để xác định vùng<br /> vùng biến động gen hag là 0,812. Sau khi đạt<br /> mang tính kháng nguyên.<br /> được trình tự tối ưu cho B. subtilis, tiến hành<br /> Trình tự fliC4 và OmpN3 được khuếch đại kiểm tra sự tối ưu của trình tự này trên E. coli<br /> bằng phản ứng PCR với DNA nhiễm sắc thể B ( giúp biểu hiện các protein có tính kháng<br /> của 30 chủng E. ictaluri phân lập được sau đó nguyên ở dạng vaccin tiểu đơn vị để so sánh<br /> được tinh chế và giải trình tự với cặp mồi với các vaccin tái tổ hợp trên Bacillus subtilis<br /> tương ứng (Bảng 1), đưa lên NCBI BLASTx để trong các nghiên cứu tiếp theo) và thay đổi<br /> so sánh với dữ liệu của GenBank và so sánh độ codon rất hiếm hoặc không sử dụng (nếu<br /> tương đồng bằng phần mềm MegAlign có), chỉ số CAI cần đạt được khoảng 0,5-0,6.<br /> (Lasergene 7.0). Trình tự mang tính kháng Trình tự sau tối ưu hóa được tổng hợp tại<br /> nguyên được dự đoán bằng chương trình công ty Genscript® dưới dạng plasmid<br /> Imed (imed.med.ucm.es) và EpiC pUC57.FNG.<br /> (bioware.ucd.ie/epic) với tiêu chí: có tính kích<br /> KẾT QUẢ<br /> thích miễn dịch mạnh, quy định cho chuỗi 60<br /> acid amin và nằm trên bề mặt của protein fliC Định danh các chủng vi khuẩn<br /> hoặc OmpN3 của E. ictaluri (kiểm tra với Trên môi trường EIM, E. ictaluri là những<br /> chương trình Swiss-Model). khuẩn lạc tròn, trơn, lồi, có màu xanh lá,<br /> Mô phỏng cấu trúc protein tái tổ hợp hag đường kính từ 1-2 mm sau 48 giờ ở 28 oC<br /> mang các kháng nguyên khảm<br /> (Hình 1A). Thử nghiệm trên kit API 20E (Hình<br /> Các trình tự mang tính kháng nguyên của<br /> 1B) cho kết quả mã của tất cả 30 chủng<br /> fliC và OmpN3 sau khi lựa chọn thành công<br /> được tiến hành tái tổ hợp giả định bởi chương 4004000, là E. ictaluri.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 35<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> (A) (B)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Hình thái khóm và các phản ứng sinh hóa trên kit API 20E.<br /> Gen 16S rDNA được khuếch đại thành về hình thái, sinh hóa và trình tự 16S rDNA, có<br /> công với cặp mồi 27F/1492R (giếng 1-30, Hình thể kết luận các chủng vi khuẩn phân lập từ cá<br /> 2). Kết quả giải trình tự cho thấy độ tương bệnh là các chủng E. ictaluri MS-17-156.<br /> đồng 100% với trình tự tham chiếu<br /> (CPCP028813.1) từ GenBank. Từ các kết quả<br /> M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 1500 bp 1500 bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Sản phẩm PCR trình tự 16S rDNA của 30 chủng vi khuẩn.<br /> Xác định và tối ưu hóa trình tự mang tính thông qua BLASTx nhận thấy sự tương đồng<br /> kháng nguyên của fliC 99-100% với trình tự quy định flagellin C của<br /> Gen fliC4 (1.227 bp) được thu nhận thành chủng E. ictaluri MS-17-156, Accession ID<br /> công từ DNA nhiễm sắc thể của E. ictaluri AVZ83424.1. 30 trình tự fliC4 này cũng giống<br /> bằng phản ứng PCR. Kết quả giải trình tự fliC4 nhau khi so sánh bằng công cụ Clustal W của<br /> so sánh với dữ liệu DNA trong GenBank phần mềm MegAlign.<br /> (A) (B)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> (C)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Kết quả dự đoán vùng mang tính kháng nguyên trên trình tự fliC AVZ83424.1. (A). Vùng mang<br /> tính kháng nguyên xác định bằng Imed; (B). Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng EpiC; (C). Mô<br /> phỏng tương đồng fliC bằng Swiss-Model<br /> Trình tự mang tính kháng nguyên của fliC thu nhận được trình tự nằm từ acid amin 201<br /> được xác định dựa trên trình tự acid amin đến 259 (Hình 3A và 3B). Khi tiến hành mô<br /> flagellin C, GenBank Accession ID phỏng tương đồng cấu trúc protein fliC của E.<br /> AVZ83424.1 bằng chương trình Imed và EpiC, ictaluri dựa trên khuôn mẫu protein 3K8V<br /> <br /> <br /> 36 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> bằng chương trình Swiss-Model nhận thấy OmpN3 quy định cho porin của E. ictaluri MS-<br /> vùng acid amin 201 đến 259 biểu hiện trên bề 17-156, Accession ID WP_081167023.1.<br /> mặt của protein fliC (vùng màu đỏ, Hình 3C). Vùng mang tính kháng nguyên trên<br /> Xác định trình tự mang tính kháng nguyên OmpN3 được xác định bằng chương trình<br /> của OmpN3. Imed và EpiC dựa trên trình tự<br /> Gen OmpN3 (1.269 bp) được thu nhận WP_081167023.1, kết quả cho thấy đoạn acid<br /> thành công từ DNA NST của E. ictaluri. Kết amin có giá trị dự đoán cao nhất trong toàn bộ<br /> quả so sánh các trình tự này với nhau nhờ phân tử protein là đoạn 50 acid amin từ vị trí<br /> công cụ Clustal W của phần mềm MegAlign 258 đến 308 (Hình 4A và 4B). Kết quả mô<br /> cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen mã phỏng tương đồng OMPN3 của E. ictaluri<br /> hóa protein OMPN3 được bảo tồn ở các chủng bằng chương trình Swiss-Model cho thấy cấu<br /> và không ghi nhận vùng biến động trên các trúc vùng acid amin 258-308 khá rộng, dễ<br /> trình tự. Kết quả BLASTx cho thấy trình tự tương tác không gian với các phân từ khác<br /> (Hình 4C).<br /> (A) (B)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> (C)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4: Kết quả dự đoán vùng mang tính kháng nguyên của OMPN3. (A). Vùng mang tính kháng nguyên<br /> xác định bằng Imed; (B). Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng EpiC; (C). Mô phỏng tương đồng<br /> OMPN3 bằng Swiss-Model<br /> Mô phỏng cấu trúc protein tái tổ hợp mang OMPN3 được sử dụng để tái tổ hợp giả định<br /> kháng nguyên khảm với fragment N-terminal và C-terminal của<br /> Trình tự DNA quy định cho vùng mang gen hag để thu nhận protein hag.NFC và<br /> tính kháng nguyên dự đoán của fliC và hag.NOC.<br /> (A) (B) (C)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 5WJZ 5WJT<br /> hag.NFC hag.NOC<br /> Hình 5: Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên trên protein hag.NFC và hag.NOC (A). Kiểm tra vùng mang<br /> tính kháng nguyên của protein hag.NFC bằng Imed; (B). Kiểm tra vùng mang tính kháng nguyên của protein<br /> hag.NOC bằng Imed; (C). Bề mặt protein hag.NFC và hag.NOC mô phỏng tương đồng bằng Swiss-Model<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 37<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Trình tự acid amin của các protein khảm CTT AAA CCT TCA CTT GCA TAT CTT AAC<br /> này được kiểm tra với phần mềm Imed, nhận GGA<br /> thấy tính kháng nguyên của đoạn chèn vào Các giá trị tham số của quá trình tối ưu<br /> vùng biến động của gen hag vẫn được bảo tồn hóa được trình bày trong Bảng 2.<br /> (Hình 5A và 5B), vùng mang tính kháng Bảng 2: Các giá trị tham số của quá trình tối ưu hóa<br /> nguyên này cũng biểu hiện lên bề mặt protein Bacillus subtilis Escherichia<br /> hag.NFC và hag.NOC khi mô phỏng tương Trình tự coli B<br /> đồng bằng Swiss-Model dựa trên khuôn mẫu CAI ENc CAI<br /> Vùng biến động gen hag 0,812 41<br /> subunit flagella filament 5WJT và 5WJZ của B.<br /> fliC sau tối ưu hóa 0,825 34 0,569<br /> subtilis (vùng màu đỏ, Hình 5C). OmpN3 sau tối ưu hóa 0,811 32 0,583<br /> Tối ưu hóa các trình tự mang tính kháng Giá trị CAI của trình tự mã hóa kháng<br /> nguyên của OmpN3 và fliC nguyên fliC và OmpN3 đã đạt mục tiêu đề ra,<br /> Các codon hiếm và rất hiếm xuất hiện xấp xỉ 0,812 của vùng biến động gen hag, dựa<br /> trong trình tự mã hóa vùng mang tính kháng trên tần suất sử dụng codon của B. subtilis. Hệ<br /> nguyên fliC và ompN3 được xác định bằng số CAI của cả 2 trình tự mã hóa vùng mang<br /> chương trình ATGme như ACT, TCC, GTC, tính kháng nguyên trên E. coli là khoảng 0,55.<br /> ACC, GCT, TAC và các codon có mức độ biểu<br /> BÀNLUẬN<br /> hiện trung bình GAG, GGT, CAG, GCA, GAT,<br /> AAG, AGC được thay thế bằng các codon có Trong số các kháng nguyên, fliC và<br /> mức độ biểu hiện cao nhằm đạt được chỉ số OMPN3 là các ứng viên tiềm năng cho vai trò<br /> CAI tương dương với gen hag trong B. subtilis. tác nhân trị liệu. FliC là một protein tiêm mao<br /> Trình tự DNA mã hóa vùng mang tính kháng của vi khuẩn Gram âm đã được chứng minh<br /> nguyên của fliC và ompN3 sau khi tối ưu hóa có liên quan đến độc lực của nhiều tác nhân<br /> được trình bày dưới đây với các codon tối ưu gây bệnh ở cá như Vibrio anguillarum, V.<br /> được in đậm. fischeri, Aeromonas hydrophila, E. tarda. Các<br /> nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng<br /> Trình tự mang tính kháng nguyên của fliC<br /> flagellin C như một tá dược miễn dịch(3)<br /> sau khi tối ưu hóa có CDS 180 bp:<br /> nhưng chưa có nghiên cứu ứng dụng fliC làm<br /> GCT ACA GGC TCT TTG GAA CTG ACA<br /> tác nhân gây miễn dịch đặc hiệu như trong<br /> AAA GGA CAA ACA CTG GTT TCA GGA<br /> nghiên cứu này. Việc nhóm nghiên cứu lựa<br /> ACA GAT GCT ACA GGA GCT GCG ACA<br /> chọn vùng biến động của gen fliC4 của E.<br /> TAT TAT CTG AAG GGT GTT GAC GCA<br /> ictaluri thể hiện nhiều đặc tính của một kháng<br /> GCA ACA GGT AAA GTA ACA TAT TCA<br /> nguyên hiệu quả: thân nước, đặc hiệu đối với<br /> TCT GTT AAA TTT ACT GTT GAT GCA<br /> E. ictaluri và có khả năng kích thích miễn dịch<br /> AAA GAT GCA ACA AAA GTT ACT GTT<br /> mạnh. Protein màng ngoài đã được ứng dụng<br /> GCG GCA GAT AAA<br /> trong nhiều nghiên cứu sản xuất vaccin chống<br /> Trình tự mang tính kháng nguyên của lại các bệnh nhiễm ở cá(4). Nghiên cứu đã thực<br /> OmpN3 sau khi tối ưu hóa có CDS 174 bp: hiện mô phỏng cấu trúc 3D của protein<br /> CTT GCA CGC TAT GAT AAC CAC AAT OMPN3 và dự đoán vùng mang tính kháng<br /> GTA TAT CTT GCA GCA ATC TAT GGT nguyên mạnh trên phân tử. Từ đó, lựa chọn<br /> GAA GTA AAG AAT ATG CAC TAT ATT vùng 51 acid amin (258-308) của OMPN3,<br /> GGT AAA CAG GAT GGA TTC GCA CCT nhằm mục đích tăng đáp ứng miễn dịch vì<br /> AAG GCA CGT GGA TAT GAG CTT CTT vùng này dễ dàng được nhận diện bởi hệ<br /> GCA CAG TAT CAG TTC GAC TGC GGT thống miễn dịch của cá.<br /> <br /> <br /> 38 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> membrane proteins (OMPs) of Flavobacterium columnare",<br /> KẾT LUẬN<br /> Aquaculture and Fisheries. 1, pp.1-8.<br /> Nghiên cứu đã định danh được 30 chủng 5. Neema NM, Karunasagar I, et al. (2011), Structural and<br /> functional characterization of outer membrane protein N in<br /> vi khuẩn phân lập từ cá bệnh ở vùng đồng Edwardsiella ictaluri: A bioinformatic approach. Vol. 2.<br /> bằng sông Cửu Long là E. ictaluri bằng giải 6. Panangala VS, Russo R, Santen VLV, et al. (2009),<br /> "Organization and sequence of four flagellin‐encoding genes of<br /> trình tự 16S rDNA và phản ứng sinh hóa.<br /> Edwardsiella ictaluri", Aquaculture Research. 40(10), pp.1135-1147.<br /> Trình tự của vùng mang tính kháng nguyên 7. Park SB, Jang HB, Nho SW, et al. (2011), "Outer Membrane<br /> của các ứng viên tiềm năng fliC và OmpN3 Vesicles as a Candidate Vaccine against Edwardsiellosis",<br /> Plos One. 6(3), e17629.<br /> được xác định và tối ưu hóa in silico cho sự 8. Shoemaker CA, Klesius P H (1997), "Protective<br /> biểu hiện bởi B. subtilis. immunity against enteric septicaemia in channel<br /> catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), following<br /> Lời cảm ơn: Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài số<br /> controlled exposure to Edwardsiella ictaluri", Journal of<br /> 240/2017/HĐ-SKHCN do Sở Khoa học và Công nghệ TP.Hồ<br /> Fish Diseases. 20(5), pp.361-368.<br /> Chí Minh cấp cho Vũ Thanh Thảo. 9. Soria-Guerra RE, Nieto-Gomez R, Govea-Alonso DO, et al.<br /> (2015), "An overview of bioinformatics tools for epitope<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO prediction: Implications on vaccine development", Journal<br /> 1. Crumlish M, Dung TT, Turnbull JF, et al. (2002), of Biomedical Informatics. 53, pp.405-414.<br /> "Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased 10. Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, et al. (2006), "Gene<br /> freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial<br /> cultured in the Mekong Delta, Vietnam", Journal of Fish DNA segments", BMC Bioinformatics. 7, pp.285.<br /> Diseases. 25(12), pp.733-736. 11. Yang Q, Pan YL, Wang KY, et al. (2016), "OmpN, outer<br /> 2. Hopp TP, Woods KR (1981), "Prediction of protein membrane proteins of Edwardsiella ictaluri are potential<br /> antigenic determinants from amino acid sequences", Proc vaccine candidates for channel catfish (Ictalurus<br /> Natl Acad Sci U S A. 78(6), pp.3824-3828. punctatus)", Molecular Immunology. 78, pp.1-8.<br /> 3. Jiao XD, Zhang M, Hu YH, et al. (2009), "Construction and<br /> evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda<br /> antigens", Vaccine. 27(38), pp.5195-5202. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018<br /> 4. Luo Z, Fu J, Li N, et al. (2016), "Immunogenic proteins and<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018<br /> their vaccine development potential evaluation in outer<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 39<br />