Xác định các loài Toxocara spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở miền Nam Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh Toxocariasis là bệnh động vật truyền sang người, thường do 02 loài chính gây ra là Toxocara canis (ký sinh trên chó) và Toxocara cati (ký sinh trên mèo). Bài viết trình bày việc xác định các loài Toxocara spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở miền Nam Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định các loài Toxocara spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở miền Nam Việt Nam

Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 175-180 INSTITUTE OF COMMUNITY HEALTH DETERMINATION THE PRESENCE OF TOXOCARA SPP BY MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES IN SOUTHERN VIET NAM Le Thanh Dong, Do Thi Phuong Linh, Pham Nguyen Thuy Vy*, Hoang Anh, Nguyen Thi Van Anh, Dang Trinh Minh Anh, Nguyen Huynh To Nhu Institute of Malarialogy-Parasitology-Entomology Ho Chi Minh City - 685 Tran Hung Dao, 1 ward, 5 district, Ho Chi Minh City, Vietnam Received 16/12/2022 Revised 12/01/2023; Accepted 10/02/2023 ABSTRACT Objective: Toxocariasis is a zoonotic disease transmitted from animals to humans, usually caused by two main species, Toxocara canis from dogs and Toxocara cati from cats. The following recent studies provide that Toxocara malaysiensis species parasitize on cats and capable of causing desease in humans to be studied and clarified. Methods: In this study, molecular biology techniques were applied through amplification of the atp6 gene, sequencing and constructing a phylogenetic tree to identify Toxocara spp. Results: The results showed the sample collected in Dong Thap have sequence Toxocara canis homology with Toxocara canis Srilanka (JN593098); Toxocara canis China (AM411106) with distance identify 98,4% -99,6% and initial detection the presence of Toxocara malaysiensis similarity 100% with Toxocara malaysiensis China (AM412316) that in cats collected in Ho Chi Minh City. Conclustion: This result is similar to the study that spoted T.malaysiensis species in Hanoi, not yet discovered T.cati in Vietnam. The question of whether the strain T.malaysiensis is the dominant species in Vietnam. Key word: T.malaysiensis, Toxocara canis , Toxocariasis, Cats, Dogs, Ho Chi Minh City. *Corressponding author Email address: thuyvy83.pntv@gmail.com Phone number: (+84) 983 092 900 175
P.N.T. Vy et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 175-180 XÁC ĐỊNH CÁC LOÀI TOXOCARA SPP. BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ở MIỀN NAM VIỆT NAM Lê Thành Đồng, Đỗ Thị Phượng Linh, Phạm Nguyễn Thúy Vy*, Hoàng Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Đặng Trịnh Minh Anh, Nguyễn Huỳnh Tố Như Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP. HCM - 685 Đ. Trần Hưng Đạo, phường 1, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Ngày nhận bài: 16 tháng 12 năm 2022 Chỉnh sửa ngày: 12 tháng 01 năm 2023; Ngày duyệt đăng: 10 tháng 02 năm 2023 TÓM TẮT Mục tiêu: Bệnh Toxocariasis là bệnh động vật truyền sang người, thường do 02 loài chính gây ra là Toxocara canis (ký sinh trên chó) và Toxocara cati (ký sinh trên mèo). Tuy nhiên theo một số nghiên cứu hiện nay, loài Toxocara malaysiensis còn được ghi nhận ký sinh trên mèo và khả năng gây bệnh của loài này trên người hiện là vấn đề cần được nghiên cứu làm rõ. Phương pháp nghiên cứu: Trong nghiên cứu này đã áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử thông qua khuếch đại đoạn gen atp6, giải trình tự và xây dựng cây phân loại để định danh loài Toxocara spp thu thập được tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Kết quả: Ghi nhận các mẫu thu thập ở Đồng Tháp có chủng T.canis tương đồng với chủng Toxocara canis Srilanka (mã JN593098); Toxocara canis Trung Quốc (mã AM411106) với khoảng cách di truyền cho thấy mức độ tương đồng từ 98,4% -99,6% và bước đầu ghi nhận có sự hiện diện của Toxocara malaysiensis mức độ tương đồng 100% với loài Toxocara malaysiensis Trung Quốc ( mã AM412316) trên mèo thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh. Kết luận: Kết quả này tương đồng với nghiên cứu phát hiện loài T.malaysiensis tại Hà Nội, chưa phát hiện loài T.cati tại Việt Nam. Câu hỏi đặt ra liệu chủng T.malaysiensis có phải là loài chiếm ưu thế tại Việt Nam hay không. Từ khóa: T.malaysiensis, Toxocara canis, Toxocariasis, mèo, chó, Hồ Chí Minh. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ biệt thành phần loài Toxocara spp. lưu hành, kí sinh và gây bệnh hầu như chưa được xác định một cách có hệ Bệnh Toxocariasis là bệnh động vật truyền sang người, thống, hầu hết được xét nghiệm bằng huyết thanh học thường do 02 loài chính gây ra là Toxocara canis được sử dụng ELISA với độ chính xác không cao. Hiện nay, ghi nhận ký sinh trên chó và Toxocara cati được ghi nhận một quan điểm mặc định được cho là T. canis chiếm ký sinh trên mèo, thuộc họ Toxocaridae, lớp Nematoda. ưu thế ở chó và T. cati ở mèo, nhưng rất ít nghiên cứu Ở Việt Nam, dịch tễ học của bệnh toxocariasis ở chó, được tiến hành ở động vật nuôi để xác định chính xác mèo và người còn chưa được biết một cách chi tiết, đặc phân loại Toxocara trên chó và mèo ở Việt Nam [1]. *Tác giả liên hệ Email: thuyvy83.pntv@gmail.com Điện thoại: (+84) 983 092 900 176
P.N.T. Vy et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 175-180 Năm 1998, theo nghiên cứu Zhu và cộng sự đã sử dụng học tại Labo Sinh học phân tử của Viện Sốt rét - KST - kỹ thuật sinh học phân tử chứng minh loài giun đũa CT Tp. Hồ Chí Minh. được phát hiện trong mèo tại Malaysia đại diện cho một 2.5. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu loài riêng biệt với T. canis và T. cati với đặc điểm bề ngoài được cho là Toxocara sp. cf. canis, tuy nhiên loài 2.5.1. Kỹ thuật định danh bằng hình thái học này khác với T. canis một số điểm như ở hình dạng Mẫu giun trưởng thành thu thập được định danh hình của các alae cổ tử cung ở mặt cắt ngang, chiều dài ống thái học bằng kính hiển vi quang học để xác định loài và cấu trúc môi. Nó cũng khác biệt với các loài khác Toxocara spp. được gán cho Toxocara và được đặt tên là Toxocara 2.5.2. Kỹ thuật định danh bằng gen học malaysiensis. Năm 2006, tại Trung Quốc cũng ghi nhận có loài giun đũa trên mèo có hình thái học giống Kỹ thuật tách chiết: Mẫu được nghiền nát, sau đó được Toxocara malaysiensis có đặc tình di truyền giống loài ngâm trong 180 µl lysis buffer và 25 µl Proteinkinase ở Malaysia. Đây là báo cáo đầu tiên phát hiện loài T. trước khi thực hiện tách chiết theo yêu cầu của nhà malaysiensis trên mèo ở Trung Quốc. Tại Việt Nam, tác sản xuất giả Lê Thanh Hòa và cộng sự (2016) công bố nghiên Kỹ thuật phân tích mẫu: Áp dụng quy trình được công cứu 15 chủng Toxocara spp trên mèo của ở miền Bắc bố của tác giả Lê Thanh Hòa và công sự khuếch đại Việt Nam có mức độ đồng nhất đạt 99,3-100% với loài đoạn gen atp6; sản phẩm khuếch đại được giải trình Toxocara malaysiensis. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh tự để phân tích đa chuỗi. Sử dụng chương trình Blast của các loài này trên người hiện là vấn đề cần được của Ngân hàng gen bank (NCBI) để so sánh trình tự nghiên cứu làm rõ hiện nay. Trước tình hình thực tế như nucleotide, từ đó định danh loài Toxocara spp thu được. trên, chúng tôi thực hiện xác định các loài Toxocara spp. từ mẫu giun đũa trưởng thành bằng sinh học phân 2.5.3. Phân tích chuỗi gen và xử lý số liệu tử thu thập tại Miền Nam Việt Nam Trình tự Nucleotide được xử lý bằng phần mềm Bioedit; sau đó sử dụng trình tự atp6 của Toxocara cati Ấn Độ (KJ777175); Toxocara cati Trung Quốc 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (AM411622); Toxocara canis Srilanka (JN593098); Toxocara canis Trung Quốc (AM411106); Toxocara 2.1. Đối tượng nghiên cứu vitulorum Ấn Độ (KJ777178); Toxocara leonina Trung Tiêu chuẩn mẫu chọn: những mẫu giun trưởng thành Quốc (KC902750) và Toxocara malaysiensis Trung thu được từ chó, mèo. Quốc (AM412316) trong cơ sở dữ liệu GenBank, xây 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: dựng cây phả hệ trên phần mềm MEGA11, thể hiện mối quan hệ về loài. Cây phả hệ này được xây dựng Nghiên cứu được thực hiện tại các khu vực miền Nam dựa vào phương pháp Maximum Likelihood được lặp Việt Nam. lại bootstrap 1000 lần, khoảng cách di truyền sử dụng Thời gian: từ tháng 05/2020 đến tháng 05/2022 phương pháp Kimura 2-parameter. 2.3. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu ngang mô tả 2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu y sinh học 2.4. Phương pháp thu thập mẫu Đề tài được Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Viện Sốt rét - KST - CT TP. HCM phê duyệt về Thu thập mẫu giun trưởng thành thông qua hoạt động khía cạnh đạo đức vì chỉ tẩy sổ giun cho mèo, không “Xét nghiệm và xổ giun miễn phí cho chó, mèo khu vực can thiệp về vấn đề khác. miền Nam Việt Nam” tại Viện Sốt rét - KST - CT TP. HCM. Các trường hợp chó, mèo có kết quả xét nhiệm mẫu phân dương tính với Toxocara spp sẽ được tiến 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU hành tẩy, xổ để thu thập giun trưởng thành và thu thập có chủ đích từ trại chó mèo tại các tỉnh Nam Bộ. 3.1. Kết quả thu thập mẫu giun đũa chó mèo Mẫu giun trưởng thành sau khi tiến hành định danh Các loài chó, mèo được xét nghiệm thông qua hoạt bằng hình thái học tại Labo Ký sinh trùng; được bảo động “Xét nghiệm và xổ giun miễn phí cho mèo tại quản trong dung dịch ethanol ở -200C và phân tích gen khu vực miền Nam Việt Nam” tại Viện Sốt rét - KST - 177
P.N.T. Vy et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 175-180 CT TP. HCM từ thời gian 10/05/2020 đến 10/06/2021. tẩy xổ ở chó. Trong quá trình triển khai đã xét nghiệm được mẫu 3.2. Kết quả xét nghiệm hình thái học mẫu giun đũa phân 16 con mèo (07 loài mèo ta, 09 loài mèo nhập) chó mèo bằng kỹ thuật xét nghiệm Kato-Katz; kết quả 04 con mèo nhiễm Toxocara spp. Tất cả 04 trường hợp mèo Mẫu giun trưởng thành thu được có các đặc điểm: dạng hình trụ, màu trắng, đầu và đuôi thon nhọn. Soi dưới nhiễm Toxocara spp. đều là mèo ta và được tiến hành kính hiển vi soi nổi ta thấy miệng có 3 môi bao quanh, xổ giun thuốc Drontal 1v/4kg. Kết quả xổ thành công xếp cân đối, 1 môi lưng, 2 môi bụng, ở giữa là miệng 01 trường hợp thu được 05 con giun trưởng thành. 3 cạnh. Hai diềm từ đầu chạy dọc xuống cổ thon phía Trong nghiên cứu này, việc thu thập có chủ đích từ trại đầu và phình to dưới cổ như hình quả lê (Hình 1). Qua chó mèo chỉ thực hiện được tại Đồng Tháp với tổng số đặc điểm hình thái khẳng định mẫu giun thu được thuộc mẫu thu thập được là 04 mẫu giun trưởng thành từ việc chủng Toxocara spp. Hình 1. Mẫu giun trường thành thu được và hình ảnh soi dưới KHV soi nổi 3.3. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử mẫu xổ từ 01 con mèo tiến hành định danh gen học bằng giun đũa chó mèo khuếch đại đoạn gen trên vùng gen ty thể atp6. Kết Trong tổng số 09 mẫu giun trưởng thành thu được có: quả thu được 09 sản phẩm khuếch đại PCR kích thước 04 mẫu được tẩy xổ từ các con chó vả 05 mẫu được tẩy khoảng 800 bp (Hình 2). Hình 2. Kết quả sản phẩm PCR vùng ADN chứa đoạn gen atp6 Những mẫu khuếch đại thành công được đem giải 05 chủng Toxocara spp được tẩy xổ từ mèo xác định trình tự. Sau khi xử lý, tinh chỉnh và so sánh trình tự tương đồng 100% Toxocara malaysiensis, tương đồng chuỗi nucleotide atp6 được khuếch đại của 09 mẫu trên từ 89,58% -89.83% với Toxocara cati; tương đồng từ ngân hàng gen (genbank) cho thấy kết quả định danh 87,78%-87,90% với Toxocara canis; tương đồng từ 178
P.N.T. Vy et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 175-180 87,22 %- 87,48 % với Toxocara vitulorum ; 04 chủng Quốc (AM412316), 05 chuỗi trình tự atp6 thu thập từ Toxocara spp được tẩy xổ từ chó được xác định tương mèo tại Tp. Hồ Chí Minh (mã Tx4.2, Tx4.3, Tx 4.4, Tx đồng 99-100% T. canis, khoảng 89,65% là T.cati; 4.5, Tx 4.6), 04 chuỗi trình tự atp6 thu thập từ chó ở 87,7% là T.maylaysiensis; 89,2 % T.vitulorum. Đồng Tháp (mã Tgtt08; Tgtt09; Tgtt11; Tgtt12) Mối quan hệ phả hệ về loài giữa các loài Toxocara Dựa vào cây phả hệ trên chuỗi gen atp6 cho thấy các tìm được ở Miền Nam Việt Nam và thế giới chủng phân thành 05 nhóm riêng biệt, trong đó: các mẫu giun đũa mã Tgtt8, Tgtt9 thu thập ở Đồng Tháp Phân tích chuỗi gen theo cây phả hệ đọan gen atp6 trên cùng nhánh với loài T.canis ở Srilanka (mã JN593098 phần mềm MEGA11, thể hiện mối quan hệ về loài của ) và mẫu giun đũa mã Tgtt11,Tgtt12 cùng nhánh với 16 chủng Toxocara spp bao gồm 07 loài tham chiếu đại loài T.canis ở Trung Quốc(AM411106); 05 mẫu giun diện cho các loài trên thế giới bao gồm loài Toxocara trưởng thành thu thập trên mèo ở Tp. Hồ Chí Minh tập cati Ấn Độ (KJ777175); Toxocara cati Trung Quốc hợp cùng nhóm với loài Toxocara malaysiensis Trung (AM411622); Toxocara canis Srilanka (JN593098); Quốc (AM412316). Điều này khẳng định 04 mẫu thu Toxocara canis Trung Quốc (AM411106); Toxocara thập trên chó tại Đồng Tháp thuộc loài Toxocara canis vitulorum Ấn Độ (KJ777178); Toxocara leonina Trung và 05 mẫu thu thập trên mèo tại Tp. Hồ Chí Minh thuộc Quốc (KC902750) và Toxocara malaysiensis Trung loài Toxocara malaysiensis. (hình 3). Hình 3: Cây phân loại được xây dựng dựa vào đoạn gen atp6 4. BÀN LUẬN những bằng chứng đáng tin cậy về chỉ thị di truyền để xác định T. canis, T. cati và T. leonina (Jacobs et al., Theo báo cáo của Lê Thanh Hòa và cộng sự [1] cho 1997; Zhu et al., 2000; Li et al., 2007). Các trình tự này thấy đã phát hiện loài T.malaysiensis từ giun đũa trưởng khác nhau từ ~26 – 50 % giữa các loài. Bằng chứng thành thu thập từ mèo tại Hà Nội dựa trên đoạn gen atp6 phân tử cũng chỉ ra rằng Toxocara sp. cf. canis từ mèo và theo công bố của tác giả Lê Thanh Hòa và cộng sự, ở Malaysian phân biệt với các loài Toxocara khác và cũng như trong công bố của nghiên cứu này, chưa phát được đặt tên là T. malaysiensis có trình tự di truyền hiện loài T.cati tại Việt Nam. Câu hỏi đặt ra liệu loài tương tự T. cati hơn T. canis (Gibbons et al., 2001). T.malaysiensis có phải là loài chiếm ưu thế trên mèo tại Việc phát hiện T. malaysiensis đã làm dấy lên nghi ngờ Việt Nam hay không? về việc định danh cụ thể của loài giun tròn T. canis từ mèo ở các vùng địa lý khác (Gasser và cộng sự, 2006) Hiện nay trên thế giới đã định danh nhiều loài và cung cấp một thông tin về đặc điểm di truyền của Toxocara như Toxocara canis, Toxocara cati, các loài Toxocara từ động vật với các nguồn gốc địa lý Toxocara malaysiensis và Toxascaris leonina, là những khác nhau trên thế giới (Li et al., 2006). loài giun đũa lây qua đường tiêu hóa từ động vật có vú sang người thuộc họ Canidae và Felidae. Rất nhiều Từ những kết quả nghiên cứu có thể thấy định danh nghiên cứu khác nhau cho thấy đoạn ITS cung cấp bằng các chỉ thị phân tử sẽ cung cấp dữ liệu chính xác 179
P.N.T. Vy et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue (2023) 175-180 hơn trong việc định danh loài Toxocara so với việc định ascaridoid parasites of the dog, fox and cat”. Acta danh dựa trên vật chủ. Tropica. Volume 68, Issue 2, November 1997, Pages 191-200, 2016. 5. KẾT LUẬN [2] Gibbons LM, Jacobs DE, Sani RA, “Toxocara malaysiensis n.sp. (Nematoda: Ascaridoidea) Dựa vào kết quả phân tích trình tự atp6 của 09 mẫu from the domestic cat Felis catus Linnaeus,” J Toxocara spp thu thập trên chó, mèo tại miền Nam Parasitol 2001. 87:660., 2001. Việt Nam có 04 mẫu thu thập trên chó tại Đồng Tháp [3] Khademvatan S(1), Rahim F, “PCR-Based thuộc loài Toxocara canis với tỷ lệ tương đồng 99- Molecular Characterization of Toxocara 100% T. canis Trung Quốc và T. canis Srilanka và 05 spp. Using Feces of Stray Cats: A Study from mẫu thu thập trên mèo tại Tp. Hồ Chí Minh thuộc loài Southwest Iran” PLoS One. 2013; 8(6): e65293. Toxocara malaysiensis với tỷ lệ tương đồng 100% với [4] Ming-Wei Li, “The occurrence of Toxocara loài Toxocara malaysiensis Trung Quốc (AM412316), malaysiensis in cats in China, confirmed by chưa phát hiện ra Toxocara cati trên mèo trong nghiên sequence-based analyses of ribosomal DNA” cứu này. Parasitol;99(5):554-7. doi: 10.1007/00436-006- 0194-z, 2006. TÀI LIỆU THAM KHẢO [5] O. A. MAHDY1, “Molecular characterization and phylogenetic analysis ofToxocara [1] Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Khuê, ”Xác định bệnh species in dogs, cattle and buffalo in Egypt”, giun đũa ở mèo (toxocariasis) tại việt nam do loài HELMINTHOLOGIA, 57, 2: 83 – 90, 2020 DOI mới Toxocara malaysiensis gây ra bằng phương 10.2478/helm-2020-0013, 2020. pháp so sánh chuỗi gen và phân tích phả hệ. “Tạp [6] X. Q. ZHU”, D. E. JACOBS, “Molecular chí Khoa học và Phát triển 2016, tập 14, số 1: characterization of a Toxocara variant from cats 54-62 Denis, Ejacobsab, và cs 1997”. PCR-based in Kuala Lumpur, Malaysia” Parasitology, 117, methods for identification of potentially zoonotic 155–164, 1998. 180