Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ PHA LOÃNG, NHIỆT ĐỘ, pH VÀ ÁP SUẤT<br /> THẨM THẤU LÊN HOẠT LỰC TINH TRÙNG CÁ MÚ CỌP<br /> (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775)<br /> EFFECTS OF DILUTION RATIO, TEMPERATURE, pH AND OSMOLALITY<br /> ON SPERM MOTILITY IN TIGER GROUPER (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775)<br /> Lê Minh Hoàng1, Hoàng Thị Hiền2, Phạm Phương Linh3, Phạm Quốc Hùng4<br /> Ngày nhận bài: 30/7/2013; Ngày phản biện thông qua: 18/9/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra tỷ lệ pha loãng, nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu tối ưu cho hoạt lực tinh trùng<br /> cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775). Tinh trùng cá mú cọp được pha loãng ở các tỷ lệ 1:25, 1:50, 1:100<br /> và 1:200 (tinh dịch: nước biển nhân tạo). Tiến hành xác định tỷ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt lực tinh trùng cá mú, sau đó tỷ<br /> lệ này được sử dụng cho các thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ (10, 20, 30, 400C), pH (6, 7, 8, 9) và áp suất thẩm thấu<br /> (200, 300, 400, 500 mOsm/kg). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả cho thấy tinh trùng cá mú cọp hoạt lực tốt nhất<br /> khi được kích hoạt trong môi trường với tỷ lệ pha loãng 1:100, nhiệt độ 200C, pH = 7 và áp suất thẩm thấu là 500 mOsm/kg.<br /> Từ khoá: Cá mú cọp, tỷ lệ pha loãng, áp suất thẩm thấu, hoạt lực tinh trùng<br /> <br /> ABSTRACT<br /> The aims of present study were to find the optimal dilution rate, temperature, pH and osmolality for sperm motility of<br /> tiger grouper (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775). Tiger grouper semen was diluted at ratios of 1:25, 1:50; 1:100 or<br /> 1:200 (semen: artificial seawater). Determining optimal dilution ratio for sperm motility of tiger grouper, then it was used<br /> for further experiments that effect of temperature (10, 20, 30 or 400C), pH (6, 7, 8 and 9) and osmolality (200, 200, 400 and<br /> 500 mOsm.kg-1). All experiments were replicated three times. The results indicated that tiger grouper sperm was the highest<br /> when activating in solution with dilution rate 1:100, 200C, pH=7 and osmolality 500 mOsm.kg-1.<br /> Keywords: Tiger grouper, dilution rate, osmolality, sperm motility<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tinh trùng của hầu hết các loài cá bất hoạt trong<br /> buồng sẹ và dịch tương. Hoạt động của chúng xảy<br /> ra ngay sau khi phóng thích ra ngoài môi trường<br /> nước (sinh sản tự nhiên) hoặc trong môi trường<br /> thích hợp (sinh sản nhân tạo). Một trong những<br /> thông số quan trọng để đánh giá chất lượng tinh<br /> dịch và khả năng thụ tinh của tinh trùng cá là hoạt<br /> lực của chúng [13], [15], [18]. Tuy nhiên, hoạt lực<br /> của tinh trùng cá bị ảnh hưởng của một vài thông số<br /> trong môi trường hoạt động của chúng như nồng độ<br /> các cation (K+, Na+, Ca2+, Mg2+), áp suất thẩm thấu,<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> <br /> nhiệt độ, pH và tỉ lệ pha loãng [4], [5], [16], [18], [19].<br /> Hiểu biết các thông số này có thể giúp tạo ra được<br /> môi trường hoạt lực tối ưu cho tinh trùng của cá,<br /> giúp quá trình sinh sản nhân tạo được tốt hơn [13].<br /> Có nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên tinh<br /> trùng cá đù vàng [16], tinh trùng cá chẽm [3], cá bò<br /> da [17], cá hồi Đại Tây Dương [9]…<br /> Cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal,<br /> 1775) là đối tượng nuôi biển có giá trị kinh tế cao.<br /> Hiện nay, chúng đang được nuôi nhiều ở khu vực<br /> của châu Á như Đài Loan, Singapore, Philippines. Ở<br /> Việt Nam, loài cá này đang được nuôi ở một số tỉnh<br /> <br /> TS. Lê Minh Hoàng, 3 ThS. Phạm Phương Linh, 4 TS. Phạm Quốc Hùng: Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br /> Hoàng Thị Hiền: Cao học Nuôi trồng thủy sản 2011 – Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 19<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> như Quảng Ninh, Phú Yên, Khánh Hòa và Bà Rịa Vũng Tàu [1, 2]. Mặc dù trong những năm gần đây,<br /> việc sinh sản nhân tạo cá mú cọp đã được thực hiện<br /> nhưng hiệu quả kinh tế mang lại chưa cao do thiếu<br /> thông tin về tối ưu hóa các điều kiện cần thiết cho<br /> sinh sản nhân tạo như đặc điểm sinh sản của loài,<br /> môi trường tối ưu cho tinh trùng hoạt động và khả<br /> năng thụ tinh với trứng… Chính vì vậy, nghiên cứu<br /> này nhằm kiểm tra ảnh hưởng của các yếu tố tỉ lệ pha<br /> loãng, nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu lên hoạt lực<br /> tinh trùng cá mú cọp làm tiền đề cho các nghiên cứu<br /> tiếp theo về bảo quản tinh trùng cá mú cọp.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Quản lý cá đực và vuốt tinh<br /> Cá đực được chăm sóc và nuôi dưỡng tại lồng<br /> nuôi (3x3x5 m) Vũng Ngán – Nha Trang cho đến<br /> khi cá thành thục sinh dục tốt. Thức ăn được sử<br /> dụng là cá tạp với khẩu phần ăn là 5% khối lượng<br /> cơ thể. Cá mú cọp đực trưởng thành có khối lượng<br /> 4,4 ± 0,53 kg và chiều dài 46,7 ± 2,81 cm, màu sắc<br /> tươi sáng, hoạt động tốt, không xây sát dị tật và không<br /> bị bệnh được sử dụng để tiến hành vuốt lấy tinh<br /> dịch. Trước khi tiến hành vuốt tinh, cá đực được gây<br /> mê bằng Methylene Glycol (Merck, Đức) 200 ppm.<br /> Sau đó dùng khăn lau sạch xung quanh lỗ sinh dục<br /> giúp tránh việc lẫn tạp nhằm thu được mẫu đạt chất<br /> lượng. Dùng tay vuốt nhẹ bụng cá từ từ cho tinh<br /> dịch chảy ra vào eppendof tube 1,5 ml đã được vô<br /> trùng và khô. Cẩn thận khi vuốt tinh không để lẫn<br /> máu, nước tiểu để thu được tinh có chất lượng tốt.<br /> Tinh thu xong được giữ trên đá bào và tiến hành<br /> nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.<br /> 2. Đánh giá chất lượng tinh<br /> Tinh dịch được pha loãng trong nước biển nhân<br /> tạo với tỷ lệ 1:100 (1µl tinh dịch và 99µl nước biển<br /> nhân tạo), sau đó dùng micropipette hút 1µl hỗn hợp<br /> trên đặt lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi<br /> có kết nối với camera. Những mẫu có trên 85% tinh<br /> trùng hoạt động được đưa vào nghiên cứu.<br /> 3. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực<br /> tinh trùng cá mú cọp<br /> Kiểm tra ảnh hưởng của các yếu tố: tỉ lệ pha<br /> loãng, nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu lên hoạt<br /> lực tinh trùng cá mú cọp. Mẫu được thu trên 3 con<br /> cá đực, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.<br /> Đầu tiên, hoạt lực của tinh trùng được xác định<br /> sau khi pha loãng tinh dịch với nước biển nhân tạo<br /> (gồm 27 g NaCl; 0,5g KCl; 1,2g CaCl2; 4,6g MgCl2;<br /> 0,5g NaHCO3 trong một lít nước cất và pH 7,8) ở các<br /> tỷ lệ 1:25; 1:50; 1:100; 1:200 (tinh dịch: nước biển<br /> <br /> 20 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 1/2014<br /> nhân tạo). Quan sát hoạt lực tinh trùng và xác định<br /> được tỉ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt lực của tinh<br /> trùng là 1:100. Tỉ lệ này được sử dụng cho các thí<br /> nghiệm tiếp theo.<br /> Kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt lực<br /> tinh trùng bằng cách pha loãng các mẫu tinh dịch<br /> với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ 1:100 và được điều<br /> chỉnh ở các nhiệt độ khác nhau: 10; 20; 30; 40 (0C).<br /> Ảnh hưởng của pH lên hoạt lực tinh trùng được<br /> kiểm tra bằng cách pha loãng các mẫu tinh dịch với<br /> nước biển nhân tạo ở các mức pH khác nhau: 6; 7;<br /> 8; 9 với tỉ lệ 1:100. Để đạt được các mức pH theo<br /> mong muốn tiến hành bằng cách sử dụng dung dịch<br /> NaOH 0,01N và HCl 0,01N để điều chỉnh.<br /> Muối NaCl được sử dụng để pha các dung dịch<br /> có nồng độ áp suất thẩm thấu khác nhau 200; 300;<br /> 400; 500 mOsm/kg. Kiểm tra ảnh hưởng của áp<br /> suất thẩm thấu đối với vận động của tinh trùng bằng<br /> cách cho tinh dịch vào các dung dịch có các mức độ<br /> áp suất thẩm thấu khác nhau với tỉ lệ 1:100.<br /> Hoạt lực của tinh trùng được quan sát dưới kính<br /> hiển vi ở độ phóng đại 400X. Kính hiển vi này được<br /> kết nối với máy tính thông qua camera. Hoạt lực<br /> của tinh trùng (phần trăm hoạt lực, vận tốc của tinh<br /> trùng và thời gian hoạt lực) được phân tích bằng<br /> phần mềm CASA.<br /> Các số liệu thu thập được xử lý trên phần mềm<br /> SPSS 16.0 và Excel 2003. Ảnh hưởng của tỉ lệ pha<br /> loãng, nhiệt độ, pH và áp suất thẩm thấu lên hoạt<br /> lực của tinh trùng được so sánh theo phương pháp<br /> phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA).<br /> So sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các<br /> đại lượng trên phân tích phương sai (Post Hoc Test)<br /> bằng phương pháp kiểm định Duncan’s với mức ý<br /> nghĩa P < 0,05. Mối quan hệ giữa các đại lượng<br /> được phân tích theo phương pháp hồi quy. Các giá<br /> trị được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai<br /> số chuẩn (Mean ± SE).<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên hoạt lực<br /> tinh trùng<br /> Tỉ lệ pha loãng là yếu tố quan trọng để kích<br /> thích sự hoạt động và duy trì khả năng thụ tinh của<br /> tinh trùng. Tỉ lệ pha loãng tối ưu có thể giúp chúng ta<br /> kiểm soát sự đồng nhất của tinh trùng về khả năng<br /> vận động [5], [8]. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của<br /> tỉ lệ pha loãng lên hoạt lực tinh trùng cá mú cọp cho<br /> thấy, tỉ lệ pha loãng 1:200 có phần trăm tinh trùng<br /> hoạt động là cao nhất (97,1 ± 1,05%), tiếp sau đó<br /> với 95,3 ± 0,71% tinh trùng hoạt động ở tỉ lệ 1:100;<br /> tuy nhiên, thời gian hoạt lực dài nhất ở tỉ lệ 1:100<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> (538,2 ± 15,48s). Tinh trùng vận động với vận tốc<br /> tương đương nhau ở các tỉ lệ pha loãng. Phân tích<br /> số liệu thống kê cho thấy, tỉ lệ pha loãng là 1:100 và<br /> 1:50 không có sai khác giữa phần trăm và thời gian<br /> <br /> Số 1/2014<br /> hoạt lực (P>0,05). Tuy nhiên, hai tỉ lệ này có sự sai<br /> khác (P < 0,05) so với hai tỉ lệ còn lại. Xét chung các<br /> thông số hoạt lực thì thấy ở tỉ lệ 1:100 cho kết quả<br /> tốt nhất trong các tỉ lệ phân tích (hình 1).<br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên hoạt lực tinh trùng cá mú cọp<br /> <br /> Hoạt lực tinh trùng cá sau khi phóng thích ra<br /> ngoài môi trường tự nhiên hoặc môi trường thụ<br /> tinh nhân tạo là một trong những yếu tố quan trọng<br /> quyết định đến kết quả thụ tinh [6, 8, 18]. Tỉ lệ pha<br /> loãng nằm trong khoảng tối ưu sẽ kích hoạt đồng bộ<br /> tất cả tinh trùng hoạt động và kéo dài thời gian hoạt<br /> lực, trong khi tỉ lệ pha loãng thấp hoặc cao sẽ ảnh<br /> hưởng đến khả năng bơi của tinh trùng do nó phải<br /> cạnh tranh cao trong một không gian hẹp hoặc phải<br /> hoạt động nhiều trong một khoảng không gian quá<br /> rộng sẽ khiến cho tinh trùng tiêu hao năng lượng lớn<br /> và nhanh chết hơn. Do đó, nếu tinh trùng được pha<br /> loãng với một tỉ lệ thích hợp sẽ cho kết quả hoạt lực<br /> là tối ưu nhất [8], [18].<br /> Bên cạnh đó, tỉ lệ pha loãng đối với các loài<br /> cá khác nhau thì khác nhau. Kết quả trong nghiên<br /> cứu này tương tự với nghiên cứu của Le và ctv [16]<br /> trên cá đù vàng, Morisawa và ctv [19] trên cá vàng,<br /> Tan-Fermin và ctv [21] trên cá da trơn châu Á. Trong<br /> khi đó ở cá tầm Iran và cá rô châu Âu tỉ lệ 1:50 [5], [8],<br /> cá mú đen và cá đối mục lại là tỉ lệ 1:10 cho hoạt lực<br /> cao nhất [10], [12].<br /> <br /> 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt lực tinh trùng<br /> Kết quả quan sát hoạt lực tinh trùng cá mú cọp<br /> cho thấy có sự sai khác ý nghĩa giữa phần trăm, vận<br /> tốc và thời gian hoạt lực ở các nhiệt độ thí nghiệm<br /> (P0,05), tuy<br /> nhiên lại có sự sai khác ý nghĩa về thời gian hoạt<br /> lực của tinh trùng (P